Universitatea „Lucian Blaga” Sibiu
Facultatea de Ştiinţe Agricole, Inginerie Alimentară şi
Protecţia Mediului
TEZĂ DE DOCTORAT
REZUMAT
Coordonator ştiinţific,
Prof. Univ. Dr. Ing. Ovidiu Tiţa
Doctorand,
Adina Frum
Sibiu
2017
Universitatea „Lucian Blaga” Sibiu
Facultatea de Ştiinţe Agricole, Inginerie Alimentară şi
Protecţia Mediului
Analiza compușilor biologic activi din unele
produse vegetale și utilizarea lor la obținerea
de suplimente alimentare
MENȚIUNE
Activități de cercetare din această lucrare au fost realizate în cadrul proiectului
POSDRU/159/1.5/133675 “Inovare și dezvoltare în structurarea si reprezentarea cunoașterii prin
burse doctorale și postdoctorale (IDSRC -doc postdoc)”, cofinanţat de Uniunea Europeană şi
Guvernul României din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Coordonator ştiinţific:
Prof. Univ. Dr. Ing. Ovidiu Tiţa
Doctorand,
Adina Frum
Sibiu
2017
2
CUPRINS I
LISTA NOTAȚIILOR ȘI SIMBOLURILOR UTILIZATE IX
LISTA FIGURILOR XI
LISTA TABELELOR XVII
DIN PARTEA AUTORULUI XIX
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE ȘTIINȚIFICE ALE TEZEI DE DOCTORAT XXI
INTRODUCERE XXII
PARTEA I - STUDIU BIBLIOGRAFIC
CAPITOLUL I
Analiza situației existente pe plan internațional în ceea ce privește compușii activi din
produsele vegetale
1
1.1. Compuși fenolici 1
1.1.1. Acizi fenolici 1
1.1.2. Flavonoide 2
1.1.3. Taninuri 3
1.1.4. Lignani 5
1.1.5. Stilbene 5
1.2. Modificările în compoziția materialului vegetal sub acțiunea Botrytis cinerea 6
1.3. Radicali liberi și specii reactive de oxigen 6
1.4. Compuși cu efect antioxidant 7
1.5. Antioxidanți endogeni 8
1.6. Protecție împotriva stresului oxidativ 8
1.7. Afecțiuni umane corelate cu stresul oxidativ 8
CAPITOLUL II
Prezentarea materiilor prime vegetale ce fac obiectul studiului 9
2.1. Produse vegetale 9
2.1.1. Rubus idaeus L. 9
2.1.2. Vaccinium myrtillus L. 9
2.2.2. Ribes rubrum L. 10
2.2.3. Vitis vinifera L. 11
2.2. Culegerea fructelor 12
2.2.1. Afine 12
2.2.1.1. Culegere 12
2.2.1.2. Tratament înaintea depozitării 12
2.2.1.3. Depozitare 13
2.2.2. Zmeura 13
2.2.2.1. Culegere 13
2.2.2.2. Tratament înaintea depozitării 13
2.2.2.3. Depozitare 13
2.2.3. Coacăze roșii 13
2.2.3.1. Culegere 13
2.2.3.2. Tratament înaintea depozitării 13
2.2.3.3. Depozitare 14
2.2.4. Struguri 14
2.2.4.1. Culegere 14
2.2.4.2. Prelucrarea strugurilor și obținerea vinurilor 14
2.2.4.3. Tratament înaintea depozitării 16
2.2.4.4. Depozitare 16
2.3. Valorificarea produselor secundare din industria vinului 18
2.3.1. Recuperarea unor compuși volatili 19
3
2.3.1.1.Alcooli 19
2.3.1.2. Esteri 19
2.3.1.3. Aldehide 19
2.3.2. Producerea acidului tartric și sărurilor sale 20
2.3.3. Producerea uleiului alimentar din semințe de struguri 20
2.3.4. Surse de nutrienți 20
2.3.5. Enocolorantul 21
2.3.6. Polifenoli 21
2.4. Conservarea fructelor 21
2.4.1. Conservarea prin refrigerare sau congelare 21
2.4.2. Conservarea cu substanțe antiseptice 22
2.4.3. Conservarea sub presiune de dioxid de carbon 23
2.4.4. Conservarea prin uscare 23
2.5. Mărunțirea produselor vegetale 24
CAPITOLUL III
Importanța suplimentelor alimentare în menținerea stării de sănătate a organismului 25
3.1. Suplimente alimentare 25
3.2. Acțiunea polifenolilor în domeniul sănătății 26
3.2.1. Acid galic 26
3.2.2. Acid siringic 27
3.2.3. Acidul cinamic 27
3.2.4. Resveratrol 28
3.2.5. Catechina 29
3.2.6. Acid clorogenic 29
3.2.7. Acid cafeic 30
3.2.8. Acid ferulic 30
3.2.9. Quercetin 31
3.2.10. Rutin 31
PARTEA a II-a CERCETARE EXPERIMENTALĂ
CAPITOLUL IV
Pregătirea produselor vegetale pentru analiză 34
4.1. Produsele vegetale care fac obiectul studiului 34
4.2. Pregătirea probelor 34
4.2.1. Pregătirea fructelor 34
4.2.1.1. Conservare prin congelare, apoi uscare 35
4.2.1.2. Conservare prin uscare 35
4.2.2. Pregătirea tescovinei 35
CAPITOLUL V
Metode de extracție 36
CAPITOLUL VI
Analiza extractelor obținute 38
6.1. Metode de analiză 38
6.1.1. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali 38
6.1.2. Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici printr-o metodă HPLC
proprie 38
6.2. Rezultate și discuții 40
6.2.1. Analiza extractelor obținute din fructe conservate prin intermediul
congelării 40
4
6.2.1.1. Organizarea determinărilor 40
6.2.1.2. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali 41
6.2.1.3. Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC 43
6.2.1.4. Concluzii 50
6.2.2. Analiza extractelor obținute din fructe conservate prin intermediul uscării 51
6.2.2.1. Organizarea determinărilor 51
6.2.2.2. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali 51
6.2.2.3. Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC 52
6.2.2.4. Concluzii 56
6.2.3. Analiza comparativă a metodelor de conservare a fructelor 57
6.2.3.1. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali 57
6.2.3.2. Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC 57
6.2.3.3. Concluzii 59
6.2.4. Analiza extractelor obținute din produse secundare ale procesului de
vinificație 60
6.2.4.1. Organizarea determinărilor 60
6.2.4.2. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali 60
6.2.4.3. Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC 61
6.2.4.4. Concluzii 64
CAPITOLUL VII
Descrierea și alegerea variantei optime în obținerea suplimentelor alimentare cu un
conținut optim de compuși fenolici.
65
CAPITOLUL VIII
Realizarea suplimentului alimentar 66
8.1. Obținerea materiei prime 66
8.2. Analiza materiei prime 66
8.2.1. Distribuția mărimii particulelor 66
8.2.2. Proprietățile de curgere ale pulberii 68
8.2.3. Dozarea polifenolilor totali 69
8.2.3.1. Organizarea determinărilor 69
8.2.4. Dozarea compușilor fenolici 70
8.3. Obținerea produsului finit 71
8.3.1. Încapsularea 71
8.4. Analiza produsului finit 72
8.4.1. Masa medie și uniformitatea masei 72
8.4.2. Dezagregare 74
8.4.3. Dozare polifenoli totali 75
8.4.4. Dozare compuși fenolici 75
8.5. Raport de validarea al metodei de analiză a compușilor fenolici 77
8.5.1. Introducere 77
8.5.2. Scop 77
8.5.3. Descrierea metodei analitice 77
8.5.4. Validarea metodei analitice 77
8.5.4.1. Specificitatea metodei 78
8.5.4.2. Precizia 79
8.5.4.3. Linearitatea 87
8.5.4.4. Testarea conformității sistemului cromatografic 98
8.5.4.5. Stabilitatea soluțiilor 99
8.5.4.6. Robustețea metodei 103
8.6. Suplimentul alimentar obținut în raport cu alte produse cu efect antioxidant 104
5
CAPITOLUL IX
Concluzii și perspective 105
9.1. Concluzii finale 105
9.2. Contribuții personale 106
9.3. Perspective de continuare a cercetărilor 107
Bibliografie 108
Anexe i
Curriculum vitae lxvii
Lista lucrărilor publicate și a participărilor la conferințe pe parcursul elaborării tezei de
doctorat lxx
CUVINTE CHEIE: produse vegetale, subproduse vinicole, polifenoli, compuși fenolici,
suplimente alimentare
DIN PARTEA AUTORULUI
Prezenta teză de doctorat își propune să ofere informații despre compușii biologic activi cu
proprietăți antioxidante din produse vegetale autohtone, astfel valorificându-se și produse secundare
obținute în industria vinificației prin obținerea de suplimente alimentare cu potențial bioactiv.
Cercetările s-au desfășurat în perioada 2013-2017, rezultatele fiind sintetizate în prezenta lucrare
care conține 119 pagini, 44 de tabele și 101 figuri.
Aceasta este structurată în două părți: o parte de documentare bibliografică, unde se evidențiază
cercetări anterioare despre compuși biologic activi determinați în produse vegetale autohtone și
importanța acestora în ceea ce privește menținerea stării de sănătate, și o parte experimentală, unde se
determină conținutul în astfel de compuși a produselor vegetale autohtone și a produselor secundare
obținute din procesul de vinificație și obținerea unui supliment alimentar cu proprietăți antioxidante.
Partea experimentală s-a desfășurat în cadrul Universității ”Lucian Blaga” din Sibiu, în
laboratoarele Facultății de Științe Agricole, Industrie Alimentară și Protecția Mediului și în Laboratorul
Fizico-Chimic din cadrul companiei Polisano Pharmaceuticals din Sibiu.
Teza mai cuprinde și anexe cu cromatograme, spectre de absorbție și tabele cu date brute,
referințe bibliografice, liste cu notații și abrevieri folosite și listele figurilor și a tabelelor întâlnite în
text.
Realizarea acestei teze de doctorat nu ar fi fost posibilă fără îndrumarea și sprijinul
conducătorului de doctorat, domnul Prof. Univ. Dr. Ing. Ovidiu Tița, căruia doresc să îi mulțumesc pe
această cale.
De asemenea, doresc să mulțumesc pentru ajutorul acordat de către comisia de îndrumare,
constituită din: doamna Prof. Univ. Dr. Farm Felicia Gligor, domnul Conf. Dr. Ing. Ioan Mironescu,
și domnul Prof. Univ. Dr. Ing. Dan Chicea, care pe parcursul elaborării tezei m-au susținut și m-au
îndrumat spre realizarea acesteia.
Doresc să le mulțumesc pentru ajutorul acordat, pentru sfaturi și pentru susținere doamnelor
Prof. Univ. Dr. Farm Felicia Gligor și Conf. Dr. Ing. Cecilia Georgescu, care mi-au fost alături la
fiecare pas în vederea finalizării tezei de doctorat.
Un real ajutor am primit de la doamna Șef lucrări. Dr. Ing. Ecaterina Lengyel și de la doamna
Dr. Ing. Diana Stegăruș căror doresc să le mulțumesc pe această cale.
Mulțumirile mele se îndreaptă și spre Ing. Laurenția Tiniș, care m-a susținut pe tot parcursul
cercetării mele.
De asemenea doresc să mulțumesc colectivului din cadrul companiei Polisano Pharmaceuticals
care mi-au pus la dispoziție laboratorul pentru a-mi efectua cercetările și mi-au oferit sfaturi neprețuite.
6
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE ȘTIINȚIFICE ALE TEZEI DE DOCTORAT
Teza de doctorat are drept scop analiza calitativă și cantitativă a compușilor biologic activi din
produse vegetale, extracția și utilizarea lor în alimentație sub formă de suplimente alimentare. În
vederea atingerii acestui scop s-au propus a fi realizate următoarele obiective științifice:
1. Identificarea metodelor de analiză şi control
2. Punerea la punct a unui sistem eficient de extracţie
3. Analiza cantitativă si calitativă a principiilor active extrase
4. Identificarea schemei tehnologice de utilizare a compuşilor activi izolați în obţinerea de
suplimente alimentare
5. Analiza suplimentelor alimentare obţinute
Capitolul I - Analiza situației existente pe plan internațional în ceea ce privește
compușii activi din produsele vegetale
Substanțele chimice extrase din plante pot fi clasificate în metaboliți primari și secundari
(Yanez, și alții 2013).
Metaboliții primari au o răspândire largă în natură și sunt folosiți de către plante pentru
dezvoltarea lor fiziologică. Metaboliții secundari sunt derivați din metaboliții primari, distribuția lor
este limitată în plante. Aceștia, de obicei, au un rol ecologic. Spre exemplu intră în răspunsul de
apărare al plantelor, sunt compuși de adaptare a plantelor împotriva factorilor de stres, sunt
sintetizați în celule specializate în stadii diferite ale dezvoltării plantelor, în timpul îmbolnăvirii
acestora sau pot fi induse de lumină (Yanez, și alții 2013).
Polifenolii extrași din plante prezintă o diversitate structurală largă. Structura polifenolilor
naturali variază de la molecule simple cum ar fi acizii fenolici până la molecule cu grad mare de
polimerizare, cum ar fi taninurile (Baruah 2011).
Aceștia sunt divizați în mai multe subclase de substanțe în funcție de structura lor chimică.
Astfel putem evidenția acizii fenolici, flavonoidele, lignanii și stilbenele (Xu 2012).
Creșterea cantității de substanțe capabile să apere plantele împotriva infecțiilor se poate
realiza prin infectarea acestora cu fungul Botrytis cinerea (Pour Nikfardjam, Laszlo și Dietrich
2006).
Antioxidanții, ca și constituenți ai alimentelor, funcționează ca un factor de protejare a
sănătății, reducând riscul de afecțiuni cronice incluzând bolile cardio-vasculare sau cancerul (Mehta
2015).
Capitolul II - Prezentarea materiilor prime vegetale ce fac obiectul studiului
Compușii cu efect antioxidant se găsesc în diverse specii de plante. Dintre acestea o parte au
fost studiate mai amănunțit și s-a observat aplicabilitatea lor.
Fructele de zmeur (Rubus idaeus L.) sunt consumate crude sau sub formă de suc, compot,
marmeladă, jeleu, cremă, lichior sau coloranți naturali (Pârvu 2006).
Fructele de afin (Vaccinium myrtillus L.) sunt consumate în stare crudă sau sub formă de
marmeladă, sirop, suc sau băuturi alcoolice (afinată) (Pârvu 2006).
În alimentaţie, fructele de coacăz roșu (Ribes rubrum L.) se consumă proaspete sau servesc
la fabricarea de marmeladă, jeleu, dulceaţă, gem, pastă, compot, sirop, suc (Pârvu 2006).
Industrial, strugurii (Vitis vinifera L.) reprezintă materie primă în procesul de vinificație, din
care se obțin vinuri de diferite sortimente, distilate, musturi și sucuri naturale sau concentrate
7
necesare industriei. Strugurii sunt folosiți în fabrici de conserve, compoturi, marmelade, dulcețuri,
stafide (Pârvu 2006).
Pentru valorificarea acestor produse vegetale trebuie să se cunoască modalitățile de culegere,
de depozitare și de tratament înaintea depozitării pentru a le putea menține proprietățile perioadă cât
mai îndelungată.
În industria vinului, în afara produselor de bază, rezultă și alte produse care se numesc
produse secundare și reprezintă aproximativ 25% din cantitatea de struguri prelucrați. Valorificarea
acestora este de un real interes în cercetare datorită produselor obținute care se dovedesc utile în
numeroase sectoare industriale. Din produsele secundare procesului de vinificație se pot extrage
compuși biologic activi (enzime, vitamine, polifenoli) și nu în ultimul rând se evită poluarea
mediului (Tița 2002).
Capitolul III - Importanța suplimentelor alimentare în menținerea stării de sănătate
a organismului
”Alimentul înseamnă orice substanță sau produs, indiferent dacă este prelucrat, parțial
prelucrat sau neprelucrat, destinat consumului uman, cu excepția tutunului, produselor medicinale,
narcoticelor și a substanțelor psihotrope care sunt controlate de Statele Membre și care sunt supuse
condițiilor internaționale” (Banu 2010).
Suplimentele alimentare sunt definite ca produse alimentare al căror scop este de a
suplimenta regimul alimentar și care reprezintă surse concentrate de nutrienți sau alte substanțe cu
efect nutritiv sau fiziologic, singure sau în combinație, comercializate sub formă de doză, respectiv
în forme de prezentare cum ar fi capsulele, pastilele, comprimatele, pilulele sau alte forme similare,
cașete cu pulbere, fiole de lichid, flacoane cu picurător și alte forme similare de lichide și prafuri
destinate să fie luate în cantități mici dozate individual (Directiva 2002/46/CE 2002).
Studii arată că un consum regulat de fructe și legume poate asigura protecție împotriva
dezvoltării sau progresiei a unor afecțiuni cronice, cum ar fi: cancer, diabet, afecțiuni neuro-
degenerative sau afecțiuni cardiovasculare (Pandey și Rizvi 2011).
Polifenolii sunt metaboliți activi ai plantelor, aceștia fiind constituenți importanți dintr-o
dietă echilibrată. Consumul de polifenoli s-a demonstrat a fi invers proporțional cu dezvoltarea sau
progresul unor afecțiuni cronice (Pandey și Rizvi 2011).
Capitolul IV - Pregătirea produselor vegetale pentru analiză
Probele folosite pentru analize au fost afinele (Vaccinium myrtillus L.), zmeura (Rubus
idaeus L.), coacăza roșie (Ribes rubrum L.), culese din jud. Sibiu și tescovina fermentată, varietatea
Cabernet Sauvignon și Fetească Neagră (Vitis vinifera L.), struguri culeși din jud. Alba.
Fructele au fost culese în luna iulie, aceasta fiind perioada în care ajung la maturitate (Fig.
25), iar conservarea acestora a fost realizată prin congelare și apoi uscare sau prin uscare și
conservare la temperatura camerei până în momentul analizei.
Prin analiza acestor moduri de conservare se poate concluziona stabilitatea polifenolilor
din fructele analizate la conservare prin congelare.
În ceea ce privește tescovina fermentată, după procesarea strugurilor, în vederea obținerii
vinului, tescovina obținută a fost uscată, mărunțită și apoi congelată și păstrată timp de 6 luni.
8
Capitolul V - Metode de extracție
Metodele de extracție propuse pentru acest studiu sunt metode folosite pentru extracția
diferiților compuși fenolici din produse vegetale. Acestea au fost adaptate pentru a nu inactiva
compușii termolabili și pentru a eficientiza extracția, astfel obținându-se un randament cât mai bun
cu un consum cât mai redus de resurse materiale sau de timp.
Pentru realizarea probelor, s-au folosit 4 tipuri de extracții. Extracția numărul 1 fiind o
extracție la pâlnie de separare cu solvenți organici, iar extracțiile 2-4 sunt realizate cu ajutorul
ultrasunetelor și a temperaturii, solvenții cu ajutorul cărora s-au efectuat acestea fiind diferiți.
Capitolul VI - Analiza extractelor obținute
Metode de analiză
Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali
Dozarea polifenolilor a fost realizată prin intermediul metodei Folin- Ciocâlteu adaptată
după Farmacopeea Europenă ediția 8.0.
Rezultatele obținute la citirea absorbanțelor probelor la spectrofotometru au fost
extrapolate din curba de calibrare obținută prin citirea absorbanțelor concentrațiilor crescătoare de
acid galic și reprezentarea grafică a acestora.
Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici printr-o metodă HPLC proprie
Metoda a fost adaptată după metoda lui Iacopini și colab., utilizată pentru analiza
resveratrolului, rutinului și quercetinului din coajă de struguri (Iacopini 2008), pentru a identifica și
cuantifica 10 compuși fenolici de interes.
Rezultate și discuții
Analiza extractelor obținute din fructe conservate prin intermediul congelării
Concentrația maximă de polifenoli totali exprimați în mg acid galic/g p.v. regăsită în toate
probele analizate s-a înregistrat pentru extracția 4, aceasta fiind urmată de extracția 3, apoi extracția
2 și concentrația cea mai mică s-a regăsit pentru extracția 1 (Fig. 1).
Concentrațiile de polifenoli totali, deși diferite pentru fiecare produs în parte, acestea
urmăresc un model în ceea ce privește metodele de extracție. Astfel se observă faptul că extracția
polifenolilor este proporțională, indiferent de produsul vegetal analizat.
Figura 1. Concentrația polifenolilor totali a fructelor conservate prin intermediul congelării
0
2
4
6
8
10
12
14
Afine Zmeură Coacăze roșii
Co
nce
ntr
ație
(m
g/g
pv)
Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
9
Concentrația maximă de polifenoli totali exprimați în mg acid galic/g p.v. regăsită în toate
probele analizate s-a înregistrat pentru extracția 4, aceasta fiind urmată de extracția 3, apoi extracția
2 și concentrația cea mai mică s-a regăsit pentru extracția 1.
Concentrațiile de polifenoli totali, deși diferite pentru fiecare produs în parte, acestea
urmăresc un model în ceea ce privește metodele de extracție. Astfel se observă faptul că extracția
polifenolilor este proporțională, indiferent de produsul vegetal analizat.
Afinele prezintă cea mai mare cantitate de polifenoli totali extrași, urmate de zmeură, și apoi
de coacăzele roșii indiferent de extracția folosită, astfel afinele prezintă o concentrație de 2,29 mg
polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. determinată pentru analiza extracției 1 și o
concentrație de 12,16 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. determinată pentru analiza
extracției 4, aceste valori fiind minimul respectiv maximul de polifenoli totali (exprimați în acid
galic)/g p.v. determinate pentru extractele de afine. Zmeura prezintă un minim de 2,09 mg
polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. și un maxim de 9,61 mg polifenoli totali (exprimați
în acid galic)/g p.v., valori obținute pentru extracția 1 respectiv extracția 4, iar pentru coacăzele
roșii valorile de minim și maxim sunt întâlnite pentru aceleași extracții ca și celelalte două fructe,
minimul fiind de 0,56 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. iar maximul de 2,95 mg
polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v (Fig. 1).
Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC
Majoritatea compușilor fenolici analizați au înregistrat cantitatea maximă extrasă cu
ajutorul extracției 4. Restul compușilor prezentând cantitatea maximă extrasă cu ajutorul extracției
1. Pentru compușii extrași majoritar prin intermediul extracție 4 se poate observa o tendință de
creștere a cantității de compuși fenolici de la extracția 1 spre extracția 4 iar pentru cei extrași
majoritar cu extracția 1, o descreștere în aceeași ordine (Fig. 2).
Figura 2. Concentrația compușilor fenolici din probele de afine conservate prin intermediul
congelării
În ceea ce privește extractele de afine, dintre compușii fenolici analizați cantitatea cea mai
mare a fost înregistrată de acidul clorogenic pentru care s-a obținut o valoare de 93,96 mg/100g
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
10
p.v., urmată de acidul ferulic și de rutin cu valori de 39,79 mg/100g p.v. respectiv 37,74 mg/100g
p.v. Valori cuprinse între 10 și 20 mg/100g p.v. s-au obținut pentru acidul galic, (+)-catechină și
acidul cafeic, acidul siringic înregistrând o valoare de 9,66 mg/100g p.v. Aceste valori au fost
obținute prin analiza compușilor de interes cu ajutorul extracției 4, aceasta fiind extracția care a
oferit cantitatea cea mai importantă din compușii enumerați. Prin intermediul acestei extracții
quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul au prezentat valori subunitare dar prin intermediul
extracției 1: 8,45 mg/100g p.v., 2,62 mg/100g p.v. respectiv 1,21 mg/100g p.v. astfel considerându-
se extracțiile propice compușilor fenolici analizați din afine (Fig. 2).
Comportamentul compușilor fenolici extrași din fructele de zmeur, în funcție de tipul de
extracție este similar cu a afinelor, astfel vor fi amintite valorile maxime obținute în funcție de tipul
de extracție identificat.
Figura 3. Concentrația compușilor fenolici din probele de zmeură conservate prin intermediul
congelării
Astfel dintre compușii fenolici analizați, cantitatea de acid siringic s-a dovedit a fi cea mai
importantă, urmată de acidul galic și quercetin. Cantitate subunitară a fost înregistrată în cazul
acidului cinamic, resveratrolului și acidului ferulic. Rutinul, acidul cafeic, (+)-catechina și acidul
clorogenic nu au fost regăsiți în compoziția extractelor de zmeură în nici un extract analizat. Datele
prezentate au fost obținute prin intermediul extracției 1 pentru quercetin, acid cinamic și resveratrol
și prin intermediul extracției 4 pentru restul compușilor cuantificați (Fig. 3).
Se poate observa că determinarea resveratrolului și a acidului cinamic a fost imposibilă în
extractele 3 și 4, resveratrolul fiind nedetectabil și în extractul 2. De asemenea se poate observa și
tendința de creștere a cantității acidului galic, acidului siringic și a acidului ferulic de la extracția 1
spre extracția 4. Tendința quercetinului și a acidului cinamic fiind inversă, astfel cantitatea cea mai
mare a fost înregistrată în extractul 1, apoi extractul 2, apoi 3 și cantitatea cea mai mică fiind
înregistrată în extractul 1 (Fig. 3).
Cantitatea cea mai însemnată de compus fenolic din extractele de coacăze roșii a fost
înregistrată de (+)-catechină care a fost urmată de acidul siringic. Valorile acestora fiind 43,37
mg/100g p.v. respectiv 32,66 mg/100g p.v. Pentru restul compușilor analizați valorile înregistrate
au fost sub 10 mg/100g p.v. după cum urmează: rutinul 9,61 mg/100g p.v., acidul clorogenic 3,99
mg/100g p.v., acidul ferulic 1,20 mg/100g p.v. iar quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul au
prezentat valori subunitare, acidul galic și acidul cafeic nefiind detectate (Fig. 4).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.) Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
11
Figura 4. Concentrația compușilor fenolici din probele de coacăze roșii conservate prin intermediul
congelării
Din punct de vedere al extracțiilor propice pentru analiza compușilor fenolici s-au
identificat extracția 1 și extracția 4, acestea fiind extracțiile care au prezentat valorile cele mai mari
a diferiților compuși. Extracția 1 a reprezentat extracția propice pentru quercetin, acid cinamic și
resveratrol. Se poate observa o scădere a cantității de compus de interes de la extracția 1 spre
extracția 4. Restul compușilor analizați pentru care s-a determinat cantitatea cea mai mare în
extractul 4 prezintă o tendință de creștere a cantității extrase de la extracția 1 spre extracția 4 (Fig.
4).
Se poate observa că afinele prezintă cea mai mare concentrație de compuși fenolici
analizați, urmate de coacăzele roșii și apoi de zmeură (Fig. 5).
Rezultatele folosite au fost reprezentate de cele obținute cu ajutorul extracției 1 pentru
quercetin, acid cinamic și resveratrol și cu ajutorul extracției 4 pentru rutin, acid galic, acid siringic,
acid cafeic, acid ferulic, (+)-catechină și acid clorogenic, acestea reprezentând valorile cele mai
mari obținute pentru fiecare compus fenolic în parte.
Figura 5. Concentrația compușilor fenolici din probele de fructe conservate prin intermediul
congelării
05
101520253035404550
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
0102030405060708090
100
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Afine
Zmeură
Coacăze roșii
12
Cantitățile cele mai importante de quercetin, rutin, acid galic, acid cafeic, acid cinamic,
acid ferulic, resveratrol și acid clorogenic au fost întâlnite în afine, dar acidul siringic și (+)-
catechina au prezentat valori maximale în analiza coacăzelor roșii (Fig. 5).
În extractele de zmeură s-au găsit compușii fenolici menționați mai sus, mai puțin rutinul,
acidul cafeic, (+)-catechina și acidul clorogenic. Coacăzelor roșii lipsindu-le acidul galic și acidul
cafeic (Fig. 5).
Concluzii
Dintre cele trei fructe analizate cantitatea cea mai mare atât de polifenoli totali cât și de
compuși fenolici totali analizați a fost determinată în extractele de afine. Din punct de vedere al
polifenolilor totali ca și cantitate urmează zmeura și apoi coacăzele roșii, deși totalitatea compușilor
fenolici determinați în coacăzele roșii a prezentat o valoare mai mare decât în zmeură.
Cantitatea cea mai mare de polifenoli totali a fost extrasă cu ajutorul extracției 4, urmată de
extracția 3, apoi 2 iar cantitatea cea mai mică a fost determinată prin extracția 1, aceasta fiind cea
mai selectivă.
S-a observat că pentru quercetin, acid cinamic și resveratrol extracția propice pentru a
continua analiza este extracția 1 și pentru rutin, acid galic, acid siringic, acid cafeic, acid ferulic,
(+)-catechină și acid clorogenic, extracția 4.
Analiza extractelor obținute din fructe conservate prin intermediul uscării
Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali
Din figura 6 se poate observa că afinele prezintă cantitatea cea mai mare de polifenoli
totali extrași, urmate de zmeură și apoi de coacăzele roșii. Afinele prezintă o concentrație de 2,34
mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. determinată pentru analiza extracției 1 și o
concentrație de 12,44 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. determinată pentru analiza
extracției 4. Zmeura prezintă un minim de 2,03 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v. și
un maxim de 9,60 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g p.v., valori obținute pentru
extracția 1 respectiv extracția 4, iar pentru coacăzele roșii minimul fiind de 0,60 mg polifenoli totali
(exprimați în acid galic)/g p.v. iar maximul de 2,99 mg polifenoli totali (exprimați în acid galic)/g
p.v. (Fig. 6).
Figura 6. Concentrația polifenolilor totali a fructelor conservate prin intermediul uscării
0
2
4
6
8
10
12
14
Afine Zmeură Coacăze roșii
Co
nce
ntr
ație
(m
g/ g
p.v
.)
Extracția 1
Extracția 4
13
Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC
Acidul clorogenic este compusul fenolic determinat din extractele de afine care prezintă
cantitatea cea mai mare, 94,00 mg/100g p.v., urmat de acidul ferulic care prezintă o cantitate de
38,80 mg/100g p.v. și apoi de rutin cu 34,43 mg/100g p.v. Acidul galic, (+)-catechină și acidul
cafeic prezintă cantități cuprinse între 10 și 20 mg/100g p.v., iar valori mai mici de 10 mg/100g
p.v.: acidul siringic, quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul.
Valorile exprimate mai sus sunt obținute cu ajutorul extracției 1 pentru quercetin, acid
cinamic și resveratrol, iar restul compușilor fenolici cu ajutorul extracției 4.
Figura 7. Concentrația compușilor fenolici din afinele conservate prin intermediul uscării
În cazul extractelor de zmeură, s-a observat ca acidul siringic prezintă cantitatea cea mai
mare dintre compușii fenolici analizați, urmat de quercetin și de acidul galic. Pentru ceilalți compuși
s-au determinat valori subunitare, excepție făcând rutinul, acidul cafeic, acidul clorogenic și (+)-
catechina, compuși care nu au fost detectați în acest produs (Fig. 7).
Figura 8. Concentrația compușilor fenolici din zmeura conservată prin intermediul uscării
Compusul fenolic predominant în fructele de coacăz roșu este (+)-catechina, în cantitate de
40,38 mg/100g p.v., urmată de acidul siringic, acesta fiind în cantitate de 31,57 mg/100g p.v. rutinul
prezintă o cantitate de 10,08 mg/100g p.v. Acidul ferulic și acidul clorogenic au prezentat valori
0102030405060708090
100
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Extracția 1
Extracția 4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Extracția 1
Extracția 4
14
inferioare a 10 mg/100g p.v. iar quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul au prezentat valori
subunitare. Acidului galic și a acidului cafeic, au fost nedetectabili (Fig. 8).
Prin compararea cantității de compuși fenolici existenți în fructele analizate (Fig. 9),
supuse uscării și mărunțirii imediat după culegere s-au putut identifica afinele ca deținând cea mai
mare cantitate de compuși fenolici totali analizați, urmate de coacăzele roșii și apoi de zmeură.
Datele folosite sunt atribuite extracțiilor care prezintă cea mai mare cantitate de compuși
fenolici, individual analizați.
Figura 9. Concentrația compușilor fenolici din fructele conservate prin intermediul uscării
Quercetinul, rutinul, acidul galic, acidul cafeic, acidul cinamic, acidul ferulic, resveratrolul
și acidul clorogenic sunt compușii fenolici pentru care a fost determinată cea mai mare cantitate
existentă în afine. Dintre aceștia rutinul, acidul cafeic și acidul clorogenic nu au putut fi identificați
în zmeură la fel ca acidul galic și acidul cafeic în coacăzele roșii.
Pentru acidul siringic și (+)-catechină s-a determinat cea mai mare cantitate existentă în
coacăzele roșii, (+)-catechina neregăsindu-se în zmeură.
Concluzii
Dintre cele trei fructe analizate, polifenolii totali au prezentat cea mai mare cantitate în
afine, urmate de zmeură și apoi coacăze roșii. Totalul compușilor fenolici analizați a fost determinat
în cantitatea cea mai mare în afine, fiind urmat de coacăze roșii și apoi zmeură. Deci, compușii
fenolici determinați în coacăzele roșii prezintă o pondere mai mare din polifenolii totali decât în
zmeură sau afine și zmeura prezintă ponderea cea mai mică de compuși fenolici analizați dintre cele
trei fructe analizate.
Extracțiile folosite au fost extracția 1 și extracția 4. Cantitatea cea mai mare de polifenoli
totali a fost extrasă prin extracția 4, extracția 1 fiind considerată mai selectivă. Din punct de vedere
al compușilor fenolici analizați, quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul au prezentat o cantitate
mai mare prin extracția 1, iar rutinul, acidul galic, acidul siringic, acidul cafeic, acidul ferulic, (+)-
catechina și acidul clorogenic prin extracția 4. Acestea fiind extracțiile propice pentru compușii
analizați.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Afine
Zmeură
Coacăze roșii
15
Analiza comparativă a metodelor de conservare a fructelor
Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali
Am comparat cantitatea de polifenoli totali obținută pentru conservarea fructelor prin
congelare apoi uscare respectiv uscare imediat după recoltare în funcție de tipul de extracție.
Din figura 10 se poate observa că în analiza afinelor pentru ambele extracții cantitatea de
polifenoli totali este mai mare în cazul conservării prin uscare imediat după recoltare decât prin
conservarea prin congelare și apoi uscare, diferențele dintre acestea nu depășesc 0,28 mg/g p.v. În
cazul zmeurei, se observă o ușoară creștere a cantității de polifenoli totali pentru ambele extracții
ale fructelor congelate și apoi uscate față de cele uscate imediat după recoltare, diferențele fiind mai
mici decât cele înregistrate în cazul afinelor, valoarea lor nedepășind 0,06 mg/g p.v. Coacăzele roșii
prezintă diferențe mai mici de 0,04 mg/g p.v., conservarea prin uscare imediat după recoltare
prezentând valorile superioare în cazul ambelor tipuri de extracții (Fig. 10).
Figura 10. Concentrația polifenolilor totali a fructelor în funcție de extracție și modul de conservare
Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC
Valorile utilizate pentru efectuarea comparației au fost cele identificate ca fiind propice
pentru cuantificarea fiecărui compus fenolic în parte prin intermediul analizelor efectuate.
Se poate observa că variațiile compușilor fenolici analizați în ceea ce privește cele două
metode de conservare utilizate sunt minore pentru toate cele trei fructe analizate (Fig. 11-13).
0
2
4
6
8
10
12
14
Afine Zmeură Coacăze roșii
Co
nce
ntr
ație
(m
g/ g
p.v
.)
Extracție 1 (Uscare)
Extracție 1 (Congelare + Uscare)
Extracție 4 (Uscare)
Extracție 4 (Congelare + Uscare)
16
Figura 11. Concentrația compușilor fenolici din afine în funcție de modul de conservare
Figura 12. Concentrația compușilor fenolici din zmeură în funcție de modul de conservare
Figura 13. Concentrația compușilor fenolici din coacăze roșii în funcție de modul de conservare
0102030405060708090
100
Qu
erce
tin
Ru
tin
Aci
d g
alic
Aci
d s
irin
gic
Aci
d c
afei
c
Aci
d c
inam
ic
Aci
d f
eru
lic
Cat
ech
ina
Res
vera
tro
l
Aci
d c
loro
gen
ic
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Congelare + Uscare
Uscare
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Congelare + Uscare
Uscare
05
101520253035404550
Qu
erce
tin
Ru
tin
Aci
d g
alic
Aci
d s
irin
gic
Aci
d c
afei
c
Aci
d c
inam
ic
Aci
d f
eru
lic
Cat
ech
ina
Res
vera
tro
l
Aci
d c
loro
gen
ic
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Congelare + Uscare
Uscare
17
Concluzii
Analiza a fost efectuată pentru polifenolii totali atât pentru extracția 1 cât și pentru
extracția 4 pentru a se putea observa similitudinea între rezultatele ambelor metode de conservare
pentru ambele extracții de interes. Valorile comparate pentru cele două metode de conservare în
cazul compușilor fenolici au fost cele specifice pentru metodele de extracție identificate ca fiind
propice pentru fiecare compus analizat.
În cazul polifenolilor totali, deși nu s-a putut identifica o concordanță între tipul de
extracție și metoda de conservare utilizate, se poate concluziona faptul că fructele de afine, zmeură
și coacăze roșii prezintă stabilitate ridicate la congelare datorită diferențelor foarte mici existente
între valorile obținute între cele două metode de conservare.
O concordanță între compusul fenolic analizat și metoda de conservare nu s-a putut
identifica nici în cazul compușilor fenolici identificați și cuantificați. De asemenea, diferențele
foarte mici dintre metodele de conservare determinate pentru fiecare compus fenolic în parte ne duc
la concluzia că din punct de vedere al compușilor fenolici determinați, fructele analizate sunt stabile
la procesul de congelare.
Analiza extractelor obținute din produse secundare ale procesului de vinificație
Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali
Concentrația maximă de polifenoli totali (exprimați în mg acid galic)/g p.v. regăsită în
probele analizate s-a înregistrat pentru extracția 4, aceasta fiind urmată de extracția 3, apoi extracția
2 și concentrația cea mai mică s-a regăsit pentru extracția 1 (Fig. 14).
Figura 14. Concentrația polifenolilor totali a tescovinei fermentate
Ambele tipuri de tescovină au prezentat valori între 3 și 5 mg polifenoli totali (exprimați în
mg acid galic)/g p.v. pentru extracția 1 și valori între 6 și 8 mg polifenoli totali (exprimați în mg
acid galic)/g p.v. pentru extracțiile 2, 3 și 4.
Varietatea de tescovină Cabernet Sauvignon a prezentat 4,10 mg polifenoli totali
(exprimați în mg acid galic)/g p.v. pentru extracția 1 și 7,99 mg polifenoli totali (exprimați în mg
acid galic)/g p.v. pentru extracția 4, iar varietatea Fetească Neagră 3,85 mg polifenoli totali
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Fetească Neagră Cabernet Sauvignon
Co
nce
ntr
ație
(m
g/g
pv)
Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
18
(exprimați în mg acid galic)/g p.v. pentru extracția 1 și 6,95 mg polifenoli totali (exprimați în mg
acid galic)/g p.v. pentru extracția 4 (Fig. 14).
Identificarea și cuantificarea compușilor fenolici prin metoda HPLC
Cantitatea cea mai mare de rutin, acid galic, acid siringic, acid cafeic, acid ferulic, (+)-
catechină și acid clorogenic a fost extrasă cu ajutorul extracției 4. Se poate observa o scădere a
cantității acestor compuși de la extracția 4 spre extracția 1, extracția 4 fiind extracția unde s-a extras
cea mai mare cantitate din acești compuși iar extracția 1, cantitatea cea mai mică (Fig. 15).
Quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul sunt compușii care au prezentat cea mai mare
cantitate cu ajutorul extracției 1. Pentru acești compuși se poate observa o scădere a cantității de
compus fenolic de la extracția 1 spre extracția 4.
Figura 15. Concentrația compușilor fenolici din tescovina fermentată varietatea Cabernet
Sauvignon
Tescovina fermentată varietatea Cabernet Sauvignon a prezentat o cantitate de 41,63
mg/100g p.v. de (+)-catechină și 13,57 mg/100g p.v. de rutin. Quercetinul, acidul galic, acidul
siringic, acidul ferulic, acidul cinamic și resveratrolul au prezentat cantități între 1 și 10 mg/100g
p.v. Acidul cafeic și acidul clorogenic nu au fost identificați în acest produs vegetal. Aceste valori
au fost determinate pentru extracția propice fiecărui compus.
Comportamentul compușilor fenolici extrași din tescovina roșie fermentată, varietatea
Fetească Neagră, în funcție de tipul de extracție, este similar cu a tescovinei fermentate varietatea
Cabernet Sauvignon, astfel vor fi amintite valorile maxime obținute în funcție de tipul de extracție
identificat.
(+)-Catechina este compusul cu cea mai mare cantitate din tescovina fermentată varietatea
Fetească Neagră. Acesta prezintă 49,96 mg/100g p.v. iar acidul galic 11,09 mg/100g p.v. Acidul
siringic, rutinul, quercetinul, acidul cinamic, acidul ferulic și resveratrolul au prezentat cantități mai
mici de 10 mg/100g p.v. Acidul cafeic și acidul clorogenic nu au fost identificați (Fig. 16).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Extracția 1
Extracția 2
Extracția 3
Extracția 4
19
Figura 16. Concentrația compușilor fenolici din tescovina fermentată
Din figura 16 se poate observa că ambele varietăți de tescovină fermentată nu prezintă acid
cafeic sau acid clorogenic. Quercetinul, rutinul, acidul ferulic și resveratrolul au prezentat valori
mai mari în tescovina fermentată varietatea Cabernet Sauvignon, iar acidul galic, acidul siringic,
acidul cinamic și (+)- catechina în varietatea Fetească Neagră.
Concluzii
Dintre cele două varietăți de tescovină fermentată analizate, cantitatea cea mai mare atât de
polifenoli totali cât și de compuși fenolici totali analizați a fost determinată în varietatea Cabernet
Sauvignon, valorile fiind apropiate.
Metodele de extracție propuse au fost utilizate pentru a o determina pe cea mai potrivită
pentru extracția polifenolilor totali, respectiv compușilor fenolici de interes din tescovina
fermentată. Astfel extracția 4 a fost determinată a fi propice pentru extracția polifenolilor totali din
tescovina fermentată, precum și a rutinului, a acidului galic, a acidului siringic, a acidului ferulic și
a (+)-catechinei. O scădere a cantității acestor compuși a fost observată de la extracția 4 spre
extracția 1, care a prezentat cantitatea cea mai mică din acești compuși.
În ceea ce privește quercetinul, acidul cinamic și resveratrolul, acești compuși au prezentat
cantitatea cea mai mare prin extracția 1, observându-se o scădere a cantității acestor compuși spre
extracția 4.
Acidul cafeic și acidul clorogenic nu au fost determinați în analiza tescovinei fermentate.
Capitolul VII - Descrierea și alegerea variantei optime în obținerea suplimentelor alimentare
cu un conținut optim de compuși fenolici.
Pentru a putea realiza un supliment alimentar care să satisfacă nevoile și cerințele
consumatorilor s-a efectuat un studiu pentru a se putea observa opinia publică în ceea ce privește
definirea suplimentelor alimentare, modul de administrare preferat, efectele benefice asupra
organismului uman și cunoștințele dobândite referitoare la efectele antioxidante și produsele care ar
putea exercita acest efect (Frum 2015).
0
10
20
30
40
50
60
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Cabernet Sauvignon
Fetească Neagră
20
Studiul a fost realizat cu ajutorul unui chestionar (Anexa 13) care a fost aplicat pe 144
persoane din medii sociale diferite iar interpretarea rezultatelor a fost făcută cu programul IBM
SPSS Statistics varianta 20 (Frum 2015).
În urma acestui studiu, s-a putut determina forma farmaceutică preferată a consumatorilor în
care va putea lua naștere suplimentul alimentar care urmează realizat. Astfel acest supliment
alimentar poate fi condiționat în capsule, pentru a asigura o complianță superioară a consumatorilor.
Din analizele efectuate pentru cele 3 tipuri de fructe și cele 2 tipuri de tescovină evidențiate
în capitolul 6, se poate determina varianta optimă de materie primă care urmează să fie folosită
pentru obținerea unui supliment alimentar cu efect antioxidant. Astfel am ales să asociem afinele,
coacăzele roșii și tescovina (ambele variante) în proporții egale pentru a beneficia atât de o varietate
mare de compuși fenolici individuali cât și o cantitate ridicată de polifenoli totali. Deși zmeura a
prezentat o cantitate mai mare de polifenoli totali decât coacăzele roșii aceasta beneficiază de o
varietate de compuși fenolici analizați mai restrânsă.
Capitolul VIII - Realizarea suplimentului alimentar
Obținerea materiei prime
Materia primă a fost obținută prin amestecarea produselor vegetale uscate și mărunțite.
Păstrarea produselor vegetale, până la formarea materiei prime, a fost făcută prin uscare în curent de
aer cald la 40º C pentru afine și coacăze roșii, iar tescovina roșie fermentată prin uscare la 20º C și
apoi mărunțite.
Amestecarea a fost efectuată prin agitare energică timp de 10 minute. Pulberea obținută
poate fi descrisă ca o pulbere roșie- maronie (Fig. 72), cu miros și gust caracteristic.
Materia primă obținută a fost supusă unor analize pentru a determina dacă aceasta este
adecvată pentru încapsulare.
Analiza materiei prime
Distribuția mărimii particulelor
Această analiză a fost efectuată cu ajutorul sitelor cu ochiuri de mărimi diferite. Aceasta
fiind una dintre cele mai folosite metode pentru clasificarea pulberilor prin intermediul distribuției
mărimii particulelor.
Tabel 1. Rezultate distribuția mărimii particulelor
Sita (µm) Masa (g) Masa (%)
710 4,25 4,27
224 94,93 95,36
125 0,37 0,37
90 0,00 0,00
63 0,00 0,00
Din analiza datelor obținute (Tab. 1), se poate concluziona că materia primă propusă este o
pulbere grosieră, datorită faptului că 95,36% din masa adăugată a trecut prin sita cu ochiuri de 710
µm și 0,37% prin sita cu ochiuri de 224 µm.
21
Proprietățile de curgere ale pulberii
Pentru determinarea proprietăților de curgere ale pulberilor se pot folosi mai multe metode.
Cea mai folosită este reprezentată de calcularea indicelui Carr sau indicele de compresibilitate și a
raportului Hausner.
Tabel 2. Rezultate proprietăți de curgere
Număr bătăi Volum citit (mL) Indice Carr Raport Hausner
0 208
14,71% 1,17 10 184
500 174
1000 174
Curgerea materiei prime analizate este considerată bună conform rezultatelor obținute
(Tab. 2). Acest parametru arată proprietatea curgerii materiei prime, astfel încapsularea poate fi
realizată fără a întâmpina probleme sau fără ca materia primă să fie amestecată cu excipienți care
îmbunătățesc aceste proprietăți.
Dozarea polifenolilor totali
Probele au fost realizate utilizând probe de materie primă, extrase prin intermediul
extracțiilor 1 și 4. Dozarea spectrofotometrică a polifenolilor totali a fost realizată
spectrofotometric.
Curba de calibrare și metoda de calcul folosite pentru interpretarea rezultatelor obținute
prin intermediul acestei analize sunt expuse la analiza polifenolilor totali din fructe.
Tabel 3. Dozarea polifenolilor totali din materie primă
Absorbanță Concentrație
(mg/1000mL)
Concentrație (mg/g
m.p.)
0,787 2,97 9,07
Rezultate: Materia primă obținută din amestecul de părți egale de afine, coacăze roșii și
tescovină fermentată (varietățile Fetească Neagră și cabernet Sauvignon 1:1), prezintă o
concentrație de polifenoli totali (exprimați în acid galic) de 9,07 mg/g materie primă (Tab. 3).
Dozarea compușilor fenolici
Extracția 1 a fost folosită pentru analiza quercetinului, acidului cinamic și resveratrolului.
Extracția 4 pentru analiza rutinului, acidului galic, acidului siringic, acidului cafeic,acidului ferulic,
(+)-catechinei și acidului clorogenic.
Cantitatea cea mai însemnată dintre compușii fenolici determinați în materia primă
obținută a reprezentat-o acidul clorogenic, având o cantitate de 33,37 mg / 100g materie primă
(m.p.). Valori între 10 și 20 mg/ 100g m.p. au prezentat rutinul, acidul ferulic și (+)-catechina cu
19,89 mg/100g m.p., 17,98 mg/100g m.p. respectiv 11,87 mg/100g m.p. Acidul galic, acidul
cinamic, resveratrolul, acidul siringic, quercetinul și acidul cafeic au prezentat valori sub 10
mg/100g m.p. (Fig. 17).
22
Figura 17. Compușii fenolici analizați din materia primă
Rezultate: Din cantitatea totală de compuși fenolici analizați acidul clorogenic a prezentat
33,53%, rutinul 19,98%, acidul ferulic 18,06%, (+)- catechina 11,93%, acidul galic 8,72%, acidul
cinamic 2,53%, resveratrolul 1,62%, acidul siringic 1,8%, quercetinul 1,43% și acidul cafeic
0,40%.
Obținerea produsului finit
Încapsularea
Pentru umplerea capsulelor tari se folosește un dispozitiv special pentru acest proces care
este format dintr-un schelet metalic pe care sunt fixate diferite plăci: placa de exercitare a presiunii,
placa de ghidare a capsulelor și placa de acoperire (Leucuța, și alții 2010).
Analiza produsului finit
Masa medie și uniformitatea masei
Cerințe:
Masa medie a capsulelor pline trebuie să se încadreze în intervalul 820,0 mg/cps. ± 7,5%
(758,5 – 881,5 mg/cps.).
Masa medie a conţinutului capsulelor trebuie să se încadrează în intervalul 700,0 mg/cps. ±
7,5% (647,5 - 752,5 mg/cps.).
Cel puţin 18 capsule au o abatere de maxim ± 7,5% faţă de masa medie determinată și cel
mult 2 capsule pot avea o abatere de maxim ± 15% faţă de masa medie determinată.
Tabel 4. Rezultatele analizei masei medii
Capsula plină (mg) Conținut capsulă (mg)
Medie 822,95 704,4
Rezultat: Capsulele analizate corespund din punct de vedere al masei medii și a
uniformității masei, rezultatele obținute încadrându-se în intervalele declarate (Tab. 4).
Dezagregare
Acest test este realizat pentru determinarea timpului necesar descompunerii capsulelor în
particule mici la introducerea acestora într-un mediu lichid, prezentând parametri indicați în
monografia capsulelor corespunzătoare (European Pharmacopoeia 2014).
05
101520253035
Co
nce
ntr
ație
(m
g co
mp
us
fen
olic
/1
00
g p
.v.)
Materie primă
23
Cerinţe:Testul este conform, dacă timpul de dezagregare este de maxim 30 minute, pentru
toate comprimatele (6 comprimate). Dacă 1 sau 2 comprimate nu s-au dezagregat complet, testul se
repetă pe încă 12 comprimate. Testul îndeplineşte criteriile de acceptanţă dacă minim 16 din 18
comprimate s-au dizolvat în 30 de minute.
Rezultat: Dezagregarea capsulelor s-a realizat în mai puțin de 3 minute, acestea fiind
conforme din punct de vedere al dezagregării.
Dozare polifenoli totali
500 mg pulbere produs finit, obținută prin triturarea conținutului a 20 de capsule se extrag
și se analizează spectrofotometric.
Rezultatele obținute se întâlnesc în tabelul 5.
Tabelul 5. Dozarea polifenolilor totali din materie primă
Absorbanță Concentrație
(mg/1000mL)
Concentrație
(mg/capsulă)
0,812 3,06 6,60
Cerințe: Cantitatea de polifenoli totali (exprimați în acid galic) trebuie să fie 6,50
mg/capsulă ± 10% (5,85 - 7,15 mg/capsulă).
Rezultate: Cantitatea de polifenoli totali (exprimați în acid galic) analizată în produsul
final este de 6,60 mg/capsulă, rezultatul fiind conform.
Dozare compuși fenolici
500 mg pulbere produs finit, obținută prin triturarea conținutului a 20 de capsule se extrag
conform extracțiilor 1 și 4 și se analizează prin metoda HPLC.
Rezultatele obținute sunt reprezentate în figura 18.
Figura 18. Compușii fenolici analizați din produsul finit
Extracția 1 a fost folosită pentru analiza quercetinului, acidului cinamic și resveratrolului.
Extracția 2 pentru analiza rutinului, acidului galic, acidului siringic, acidului cafeic,acidului ferulic,
(+)-catechinei și acidului clorogenic.
0
50
100
150
200
250
Co
nce
ntr
ație
(µ
gco
mp
us
fen
olic
/ca
psu
lă)
Produs finit
24
Cantitatea cea mai însemnată dintre compușii fenolici determinați în produsul finit obținut a
reprezentat-o acidul clorogenic, având o cantitate de 218,33 µg / capsulă. Valori între 100 și 200 µg
/ capsulă au prezentat rutinul și acidul ferulic cu 121,03 µg / capsulă, respectiv 107,75 µg / capsulă.
(+)-Catechina, acidul galic, acidul cinamic, resveratrolul, acidul siringic, quercetinul și acidul cafeic
au prezentat valori sub 100 µg / capsulă.
Cerințe: Din cantitatea totală de compuși fenolici analizați/ capsulă acidul clorogenic
trebuie să fie peste 30,00%, rutinul și acidul ferulic peste 15,00%, (+)- catechina și acidul galic
peste 7,00%, acidul cinamic, resveratrolul, acidul siringic și quercetinul peste 1,40% și acidul cafeic
peste 0,40%.
Rezultate: Din cantitatea totală de compuși fenolici analizați/ capsulă acidul clorogenic a
prezentat 34,51%, rutinul 19,13%, acidul ferulic 17,03%, (+)- catechina 12,04%, acidul galic
9,66%, acidul cinamic 2,54%, resveratrolul 1,65%, acidul siringic 1,50%, quercetinul 1,55% și
acidul cafeic 0,40%, rezultatele fiind conforme.
Raport de validarea al metodei de analiză a compușilor fenolici
Acest raport a fost realizat conform normelor în vigoare și certifică validitatea metodei de
analiză pentru identificarea și cuantificarea compușilor fenolici de interes (Bliesner 2006).
Parametri analizați au fost specificitatea metodei, precizie, liniaritate, testarea conformității
sistemului cromatografic, stabilitatea soluțiilor și robustețea metodei.
Suplimentul alimentar obținut în raport cu alte produse cu efect antioxidant
Produsul dezvoltat în această lucrare este un produs 100% natural, care nu conține
coloranți sau conservanți. De asemenea este un produs care nu conține lactoză, astfel fiind indicat și
persoanelor care prezintă intoleranță la acest compus.
Materia prima fiind constituită din fructe uscate și mărunțite, respectiv din produse
secundare a procesului de vinificație uscate și mărunțite, nu pune problema existenței unor solvenți
reziduali toxici care ar putea rămâne în produs în urma extracției principiilor active.
Conținutul atât în polifenoli totali, cât și în anumiți compuși fenolici, cum ar fi: acidul
galic, (+)-catechina, acidul siringic, acidul cinamic, resveratrolul, acidul clorogenic, acidul cafeic,
acidul ferulic, rutinul și quercetinul, este bine cunoscut, astfel putându-se identifica cu exactitate
doza ingerată din fiecare compus în parte.
Capitolul IX - Concluzii și perspective
Concluzii finale
Plantele au fost folosite încă de la începutul omenirii, acestea fiind singurele metode de a
întreţine starea de sănătate şi de a ameliora starea de boală. Folosirea remediilor naturiste în prezent
pentru profilaxia şi tratamentul anumitor afecţiuni arată eficacitatea mărită a produselor naturale în
creşterea calităţii vieţii.
Astfel s-au analizat trei tipuri de fructe: afinele (Vaccinium myrtillus L.), zmeura (Rubus
idaeus L.) și coacăza roșie (Ribes rubrum L.), și un produs secundar din procesul de vinificație:
tescovina roșie, fermentată, varietatea Cabernet Sauvignon și Fetească Neagră (Vitis vinifera L.).
Conservarea produselor vegetale a fost realizată prin congelare apoi uscare sau uscare
imediată după recoltare în cazul fructelor, iar tescovina a fost uscată, mărunțită și apoi congelată.
25
Astfel s-a determinat faptul că din punct de vedere al polifenolilor și compușilor fenolici analizați,
cele două tipuri de conservare aplicate fructelor nu influențează cantitatea acestora.
Izolarea compușilor de interes a fost efectuată prin intermediul a patru tipuri de extracții.
Astfel cantitatea cea mai mare de polifenoli totali a fost extrasă cu ajutorul extracției 4, urmată de
extracția 3, apoi 2 iar cantitatea cea mai mică a fost determinată prin extracția 1, aceasta fiind cea
mai selectivă.
În ceea ce privește compușii fenolici analizați s-a observat că pentru quercetin, acid
cinamic și resveratrol extracția propice este extracția 1 și pentru rutin, acid galic, acid siringic, acid
cafeic, acid ferulic, (+)-catechină și acid clorogenic, extracția 4.
Toate produsele analizate prezintă compuși cu proprietăți antioxidante și pot fi folosite
pentru efectele acestora benefice asupra organismului.
Pentru realizarea suplimentului alimentar propus s-au realizat o serie de operații și analize
premergătoare.
Materia primă utilizată a fost realizată din pulberi uscate de afine (Vaccinium myrtillus L.),
coacăze roșii (Ribes rubrum L.) și un amestec 1:1 de tescovină fermentată roșie varietatea Cabernet
Sauvignon și Fetească Neagră (Vitis vinifera L.). Aceasta a fost analizată din punct de vedere al
distribuției mărimii particulelor, proprietăților de curgere și dozare a polifenolilor totali și a
compușilor fenolici.
Încapsularea materiei prime a fost realizată în capsule tari, iar analiza acestora a constat în
analizele farmacotehnice: masa medie a capsulelor pline și a conținutului capsulelor și dezagregare
și dozarea polifenolilor totali și compușilor fenolici.
Metoda HPLC de dozare a compușilor fenolici a fost validată pentru analiza produsului
finit. Validarea metodei a fost realizată din punct de vedere al specificității, preciziei, linearității,
conformității sistemului, stabilității soluțiilor și a robusteții.
Suplimentul alimentar astfel obținut este comparabil cu suplimente alimentare deja
existente pe piața românească, avantajele majora ale acestuia fiind faptul că este 100% natural, nu
conține coloranți sau conservanți și poate fi administrat persoanelor care prezintă intoleranță la
lactoză.
Contribuții personale
Contribuțiile personale regăsite în această lucrare constau în:
Identificarea și cuantificarea unor compuși fenolici din produse vegetale autohtone.
Identificarea unor metode de extracție propice pentru compușii fenolici analizați.
Dezvoltarea unei metode de analiză HPLC, calitativă și cantitativă a zece compuși fenolici
cu potențial bioactiv regăsiți în produse vegetale autohtone.
Validarea metodei de analiză HPLC.
Obținerea unui supliment alimentar cu proprietăți bioactive 100% natural din produse
vegetale autohtone.
Valorificarea unor produse secundare din industria vinului pentru obținerea de suplimente
alimentare.
Aplicarea metodei de analiză HPLC pentru analiza suplimentului alimentar obținut.
26
Perspective de continuare a cercetărilor
În continuarea cercetărilor propun următoarele subiecte:
Înaintarea unui dosar de notificare în ceea ce privește suplimentul alimentar obținut, către
Institutul Național de Cercetare- Dezvoltare pentru Bioresurse Alimentare, în vederea
punerii pe piață a acestuia. Datele necesare întocmirii dosarului se regăsesc în această teză
de doctorat.
Analiza altor produse vegetale cu potențial bioactiv cu ajutorul metodelor descrise în
această teză.
Determinarea altor metode de analiză a potențialului bioactiv din produsele vegetale
propuse.
Valorificarea altor produse secundare pentru obținerea de suplimente alimentare cu
potențial bioactiv.
27
Bibliografie selectivă
- ***. European Pharmacopoeia. 8. Strasbourg Cedex: The Directorate for the Quality of
Medicines and HealthCare of the Council of Europe (EDQM), 2014.
- Banu, C. (coordonator). Alimente funcționale, suplimente alimentare și plante medicinale.
București: ASAB, 2010.
- Baruah, J.B. Chemistry of Phenolic Compounds. State of the Art. New York: Nova Science,
2011.
- Bliesner, D. Validating chromatographic methods, A Practical Guide. New Jersey: Wiley-
Interscience, 2006.
- Frum, A. „Percepția consumaorilor asupra suplimentelor alimentare și a efectelor
antioxidante.” În Proceedings of the International Conference "Humanities and Social Siences
Today. Classical and Contemporary Issues": Economics, de A.P., Gâlea, M. Haller, 53-76.
București: Pro-Universitaria, 2015.
- Iacopini, P., Baldi M., Stoechi P., Sebastian L. „Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and
resveratrol in red grape: Content, in vitro antioxidant activity and interactions .” Journal of
Food Composition and Analysis, nr. 21 (2008): 589-598.
- Leucuța, S., M. Achim, I. Tomuță, A. Porfire, și R. Iovanov. Tehnologie Farmaceutică
Industrială. Procedee de laborator. 2. Cluj-Napoca: Editura Medicală Universitară ”Iuliu
Hațieganu”, 2010.
- Mehta, A. Plants as a source of natural antioxidants. Editor N.K. Dubey. Croydon: CAB
International, 2015.
- Pandey, K.B., și S.I. Rizvi. „Biological Activity and Mechanism of Action of Plant
Polyphenols: Relevance to Human Health and Disease.” În Phytochemicals and Human Health.
Pharmacological and Molecular Aspects, de A.A. Farooqui și T. Farooqui, 483-500. New
York: Nova Science Publishers, 2011.
- Pârvu, C. Universul plantelor, Ediția a IV-a. București: ASAB, 2006.
- Pour Nikfardjam, M.S., G. Laszlo, și H. Dietrich. „Resveratrol-derivatives and antioxidative
capacity in wines made from botrytized grapes.” Food Chemistry 96 (2006): 74-79.
- Tița, O. Obținerea vinurilor speciale și a distilatelor din vin. Sibiu: Editura Universității
"Lucian Blaga", 2002.
- Xu, Z. Analysis of Antioxidant-Rich Phytochemicals. In: Important Antioxidant
Phytochemicals. Editor Z. Xu și L.R. Howard. Chichester: Wiley-Blackwell, 2012.
- Yanez, A.J., și alții. Flavonoid pharmacokinetics. Mthods of analysis, preclinical and clinical
pharmacokinetics, safety and toxicology. Editor N.M Davies și J.A. Yanez. Hoboken: John
Wiley and Sons, Inc., 2013.
