UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA
FACULTATEA DE MEDICINĂ
TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT
METODE DE FACILITARE A RECUPERĂRII POSTISCHEMICE LA NIVELUL SISTEMULUI
NERVOS CENTRAL
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. univ. dr. Maria Iancău
DOCTORAND Bălşeanu Tudor-Adrian
CRAIOVA 2011
2
3
INTRODUCERE Accidentul vascular cerebral (AVC) se regăseşte printre cauzele
principale ale morţii şi invalidităţii ce afectează populaţia vârstnică din ţările dezvoltate, reprezentând una dintre cauzele majore de boală, pentru care nu există încă un tratament specific. Chiar dacă este a treia cauză de deces, după afecţiunile cardiace şi diferitele tipuri de neoplasme, din punct de vedere al costului social, accidentul vascular cerebral se situează pe primul loc.
Asimilarea cunoştinţelor despre diferitele procese biochimice de la nivel celular şi molecular, din timpul producerii leziunilor ischemice cerebrale, nu a permis încă dezvoltarea unor strategii terapeutice cu efecte benefice, la pacienţii care au suferit un accident vascular cerebral ischemic, iar terapiile existente sunt încă limitate.
Din punct de vedere terapeutic, putem găsi ţinte la nivelul fiecărei etape care face parte din cascada de evenimente caracteristice ischemiei cerebrale, iar terapia cu agenţi neuroprotectori şi-a dovedit efectele benefice în cadrul testele preclinice, care folosesc animale de laborator. Totuşi, în momentul trecerii spre trialuri clinice, aceste terapii s-au dovedit greu de aplicat la subiecţii umani. Explicaţiile acestor eşecuri pot fi multiple, printre ele subliniind abordările greşite în ceea ce priveşte doza administrată, precocitatea şi durata terapiei, dar şi folosirea în testele preclinice a animalelor de laborator tinere, deşi accidentul vascular cerebral ischemic este apanajul vârstei înaintate.
În acest context, mi-am propus să studiez două abordări diferite, în ceea ce priveşte facilitarea recuperării postischemice, la nivelul sistemului nervos central.
În primul experiment, mi-am propus să testez ipoteza conform căreia administrarea de factori de creştere (factorul de stimulare a coloniilor granulocitare) determină un efect terapeutic benefic, în ceea ce priveşte recuperarea după accidentele vasculare cerebrale, la animalele bătrâne.
De asemenea, în al doilea experiment, mi-am propus să confirm ideea că hipotermia pe termen lung (48 de ore) reprezintă o metodă neuroprotectivă, mai eficace în tratamentul accidentelor vasculare cerebrale decât hipotermia pe termen scurt (4 ore), folosită, până în prezent, asupra şobolanilor bătrâni.
4
Mulţumirile mele se îndreaptă către Doamna Profesor Doctor Maria
Iancău, pentru stăruinţa şi răbdarea cu care m-a călăuzit în finalizarea acestei
lucrări.
De asemenea, Domnului Profesor Doctor Aurel Popa-Wagner îi
mulţumesc pentru îndrumarea şi sprijinul acordat pe parcursul perioadei de
cercetare.
Ţin să mulţumesc celor care, pe parcursul celor patru ani de cercetare,
m-au ajutat şi susţinut în demersul meu şi, în special, colegilor din cadrul
Disciplinei de Fiziologie a Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova.
În final, doresc să mulţumesc tuturor persoanelor care de-a lungul
timpului m-au ajutat în formarea mea profesională şi personală, soţiei şi
părinţilor mei.
5
CUPRINS
PARTEA I - STADIUL CUNOAŞTERII 1. Caracteristici morfofuncţionale ale circulaţiei cerebrale ....................... 6
2. Mecanismele moleculare ale lezării creierului ischemic ........................ 7
3. Neuroprotecţia în terapia accidentului vascular cerebral ischemic...... 8
PARTEA II – CONTRIBUŢII PERSONALE
4. Scopul şi obiectivele lucrării ................................................................... 10
5. Material şi metode .................................................................................... 11
6. Rezultate obţinute..................................................................................... 13
7. Discuţii ....................................................................................................... 20
8. Concluzii.................................................................................................... 25
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ......................................................................... 26
CUVINTE CHEIE: accident vascular cerebral ischemic, reabilitare,
neuroprotecţie, hipotermie, factror de stimulare a coloniilor granulocitare G-CSF, ischemie cerebrală
6
PARTEA I - STADIUL CUNOAŞTERII 1. CARACTERISTICI MORFOFUNCŢIONALE ALE CIRCULAŢIEI
CEREBRALE Creierul este un organ complex şi heterogen, fiind strict dependent de
afluxul sanguin. În consecinţă, faptul că perfuzia diferitelor regiuni ale creierului este specifică, particulară şi foarte bine reglată nu surprinde pe nimeni. Pentru a înţelege mai bine mecanismele care reglează circulaţia şi metabolismul cerebral, trebuie integrate cunoştiinţe interesând ştiinţe ca biochimia, fiziologia, biologia celulară, histologia, implicând şi anatomia microscopică a vascularizatiei.
În comparaţie cu alte organe, creierul poate fi considerat unic, având o circulaţie arterială particulară, astfel că sângele este furnizat prin intermediul a patru artere mari, care converg într-un colector comun, pentru a forma un sistem de distribuţie egalizată a fluxului, cunoscut sub numele de poligonul lui Willis. Aceste artere primare sunt reprezentate de cele două artere carotide interne (carotid - a ameţi, derivat din greacă) şi cele două artere vertebrale, care se unesc intracranial, pentru a forma artera bazilară. Acest aranjament specific permite, în circumstanţe normale, o perfuzie adecvată pentru toate regiunile creierului, în ciuda ocluziei sau obstruării uneia dintre cele patru artere primare (Edvinsson et al., 2001).
La om, arterele carotide interne sunt mult mai importante, din punct de vedere al debitului sanguin furnizat, faţă de alte mamifere, fiecare dintre cele două artere contribuind cu câte 40 % la perfuzia totală a creierului. Artera carotidă internă îşi are originea în artera carotidă comună, la nivelul sinusului carotidian, desprinzându-se lateral, în timp ce artera carotidă externă se distribuie medial. La nivelul foramen lacerum pătrunde în cutia craniană (în acest loc fiind sensibilă ocluziei), săpând un şanţ la nivelul proceselor laterale ale osului sfenoid şi se împarte în patru mari ramuri:
artera cerebrală anterioară, artera cerebrală medie, artera coroidală anterioară, artera comunicantă posterioară.
Arterele vertebrale pătrund în cutia craniană prin foramen magnum, unde, după ce traversează porţiunea anterolaterală a trunchiului cerebral, fuzionează la nivelul şanţului bulbopontin, pentru a forma artera bazilară. Traiectul arterei bazilare este scurt, între punte şi pedunculii cerebrali divizându-se în cele două artere cerebrale posterioare, care apoi se anastomozează cu arterele comunicante posterioare, pentru a completa poligonul lui Willis.
Au fost descrise, în literatura specifică domeniului, trei particularităţi ale vascularizaţiei arteriale cerebrale: pernuţele sau amortizoarele intimei (intimal cushions), protruziunile valvular-like şi sfincterele vasculare. Întrebarea dacă entităţile de mai sus reprezintă una şi aceeaşi structură poate fi legitimă.
Organizarea reţelei microvasculare a creierului a fost timp îndelungat un subiect de studiu, cu scopul de a stabili bazele vasculare ale determinării
7
ierarhiilor de vulnerabilitate ale diferitelor arii corticale, în condiţii patologice. La nivel macroscopic, această abordare a avut parte de succes; organizarea anatomică a arterelor cerebrale majore reprezintă baza localizării şi vulnerabilităţii zonelor arteriale de graniţă, cu vascularizaţie colaterală, în timpul hipoperfuziei cerebrale (Mogoanta et al., 2010).
Cea mai mare parte a sângelui ce perfuzează creierul este colectat prin intermediul sinusului transvers, care, împreună cu sinusul pietros inferior, formează venele jugulare interne. O mică parte a fluxului sanguin cerebral (FSC), în principal cel colectat de sinusul occipital, dreneză sângele în plexul vertebral intern.
Circulaţia cerebrală, deşi are loc în spaţiul închis al cutiei craniene inextensibile, este unul dintre teritoriile circulaţiei locale foarte bine reglate. Variaţii mari ale presiunii sanguine sistemice, între 60-180 mmHg, se soldează cu modificări minime ale presiunii şi fluxului sanguin cerebral, graţie sistemelor de autoreglare a circulaţiei cerebrale. Consecinţă a faptului că, în creier, venele îndeplinesc doar un rol de conducte, nu şi de rezervor sanguin, balanţa cantităţilor de sânge care pătrunde şi respectiv părăseşte teritoriul intracranian este în echilibru, evitându-se astfel fenomenele de colaps sau compresiune cerebrală.
În timp ce drenajul venos este favorizat de gravitaţie, expansiunea sistolică a arterelor cerebrale şi aspiraţia toracică, circulaţia arterială este defavorizată de poziţia ortostatică, de traseul anevoios carotidian şi de amortizarea realizată de poligonul lui Willis, astfel presiunea efectivă de perfuzie este redusă cu 20-25 mmHg, faţă de aortă (Hăulică et al., 2007).
2. MECANISMELE MOLECULARE ALE LEZĂRII CREIERULUI
ISCHEMIC Ultimii 20 de ani de cercetări intense asupra mecanismelor lezării
creierului ischemic au condus la cunoaşterea în detaliu a modului cum ţesutul cerebral reacţionează la ischemie şi la identificarea unor mecanisme, care contribuie la moartea celulară.
Rezultatele fundamentale, care au fost obţinute până în acest moment, au furnizat bazele conceptului uzual al penumbrei ischemice şi ale cercetărilor pentru tratamentul stroke-lui.
Mai mult, descoperirile de bază, importante, făcute cu 30 de ani înainte, fundamentează multe concepte ale reacţiei tisulare la stres şi lezare. Kleihues şi Hossmann, 1971, citat de Edvinsson 2001, au demonstrat că, după ischemie, sinteza proteică globală în creier a scăzut, concomitent cu pierderea poliribozomilor. S-a descris implicarea arahidonatului, a prostanoidelor şi radicalilor liberi în ischemie.
În 1980, ionii de Ca2+ au fost incriminaţi ca potenţial agent al morţii celulare şi s-a formulat ipoteza implicării ionilor de Ca2+ în lezarea cerebrală ischemică; De asemenea, s-a demonstrat că glutamatul are efecte excitotoxice şi poate produce moartea neuronilor in vivo, acelaşi efect fiind identificat şi în culturi neuronale. Ipoteza a fost susţinută experimental, prin injectare locală de blocant de receptor NMDA şi lezarea aferenţelor
8
glutamatergice, care scad gradul de lezare al neuronilor respectivi, în modelul animal de ischemie globală. S-au iniţiat cercetări, ale căror rezultate obţinute pe modele animale de ischemie cerebrală, au prefigurat ideea că tratarea stroke-lui poate fi bazată pe antagoniştii de Ca2+, blocanţi ai receptorilor glutamatergici sau eradicarea radicalilor liberi. Niciun medicament care, în modelele experimentale ischemice a fost neuroprotector, nu a avut succes în trialurile clinice. Explicaţia constă, probabil, în protocoalele puţin conturate, în variabilitatea leziunilor ischemice cerebrale la om şi necesitatea unei posibile politerapii (Lees et al., 2000).
3. NEUROPROTECŢIA ÎN TERAPIA ACCIDENTULUI VASCULAR
CEREBRAL ISCHEMIC Tratamentul unui accident vascular cerebral ischemic acut implică trei
abordări majore: restabilirea sau îmbunătăţirea fluxului sanghin cerebral prin tromboliză, în cazul unei tromboze; inhibarea cascadei biochimice şi metabolice ce urmează ischemiei, pentru a preveni moartea neuronală (neuroprotecţia); monitorizarea variabilelor fiziologice de bază (exemplu: presiunea arterială, temperatura corporală, nivelul gazelor respiratorii, glicemiei, balanţa hidrică) şi corectarea lor în caz de deviere de la valoarea normală (tot acest tratament fiind administrat în unităţile medicale strict specializate – stroke units).
Datele ştiinţifice şi experimentele pe animale conduc la o mai bună înţelegere a mecanismelor intracelulare şi extracelulare ale lezării cerebrale ischemice şi a neuromediatorilor care sunt implicaţi. Multe abordări diferite, în încercarea de a influenţa cascada patologică, au fost dezvoltate în modele animale cu lezare ischemică cerebrală. Aproape toate abordările conduc la o scădere dramatică a volumului stroke-ului, în experimentele pe animale; totuşi. studiile pe subiecţi umani sunt insuficiente sau de cele mai multe ori au eşuat (Edvinsson et al., 2001).
Ischemia cerebrală declanşază eliberarea presinaptică excesivă a glutamatului, neuromediator excitator şi, energia ,,necuplată”, previne îndepărtarea activă a glutamatului din spaţiul sinaptic. Excesul de glutamat suprastimulează receptorii postsinaptici, ca receptorul pentru NMDA (N-metil D-aspartat), prin aceasta deschizându-se canalele ionice asociate şi, ca urmare, ionii de Na+ şi Ca2+ intră în celulă, în timp ce ionii de K+ ies în exterior. Influxul de Ca2+ activează proteazele intracelulare şi iniţiază o cascadă de consumare a energiei în exces, în final declanşându-se procesele letale. Eliberarea glutamatului după stroke, la oameni, a fost confirmată ca fiind permanentă timp de câteva ore şi posibil zile (Dávalos et al., 1997).
Complexul canal ionic-receptor NMDA are câteva locuri de legare a liganzilor, care sunt răspunzători de activare. Ionii de Mg2+ produc un bloc voltaj-dependent al canalului ionic activat de NMDA. Deschiderea canalelor ionice poate fi blocată necompetitiv, prin administrarea de droguri ca aptiganel, antagonist necompetitiv. Antagoniştii competitivi, inclusiv selfotel, acţionează la situsul de recunoaştere şi legare a glutamatului. Glicina este un coagonist principal pentru glutamat şi, astfel, antagoniştii glicinei, ca gavestinel, previn
9
indirect activarea canalului ionic. Eliberarea iniţială a glutamatului este prevenită prin blocanţi ai canalului de Na+, ca sipatrigin şi lubelozol (Muir et al., 1998). Proteoliza Ca-dependentă şi sinteza oxidului nitric (NO) pot fi, de asemenea, vizate direct. Drogurile ca lubelozolul pot acţiona la câteva niveluri în această cascadă (Maiese et al., 2010, Popescu et al., 2007).
Ischemia şi reperfuzia ulterioară creează condiţii ideale pentru generarea radicalilor liberi înalt reactivi, care exacerbează afectarea membranară. Repararea membranară poate fi răspunzătoare de pătrunderea în celulă a unor molecule precursoare, ca citicolina.
De la câteva ore la 5-7 zile, după debutul ischemiei, este generat un răspuns inflamator, cu infiltrarea consecutivă a neutrofilelor. Deşi este parte a procesului de reorganizare, acest fapt pare, de asemenea, să contribuie la extinderea infarctului (Popa-Wagner et al., 2007).
În condiţii experimentale, tratamentul administrat după debutul ischemiei cu epuratori de radicali liberi, antagonişti ai glutamatului sau diferite strategii antiinflamatorii poate limita mărimea infarctului, conducând la concluzia că aceste strategii pot avea un rol clinic (Edvinsson et al., 2001).
Eşecurile în dezvoltarea de strategii terapeutice noi sunt frecvente, în special în ceea ce priveşte o nouă nişă terapeutică; din acest punct de vedere, deşi acest fapt poate prezenta aspecte descurajatoare, rezultatele unui trial recent, chiar şi negativ, pot prezenta importanţă informativă.
Trei motive primare pentru insuccesul trialului pot fi incriminate şi anume: alegere neadecvată a drogului; un dozaj eronat; un design deficitar al trialului.
10
PARTEA A II-A – CONTRIBUŢII PERSONALE 4. SCOPUL ŞI OBIECTIVELE LUCRĂRII Vârsta înaintată reprezintă un factor de risc bine cunoscut pentru
accidentul vascular cerebral ischemic (Barnett et al. 2002). Majoritatea studiilor, în ceea ce priveşte recuperarea după stroke, au fost realizate folosind animale de experienţă tinere şi, în consecinţă, nu au fost relevante în totalitate, în momentul folosirii rezultatelor în trialurile clinice, ce investighează pacienţi bătrâni. Având în vedere acest fapt, modelul de stroke ce foloseşte animale bătrâne este mult mai adecvat pentru clinică, atât din punct de vedere al reabilitării funcţionale, cât şi în ceea ce priveşte răspunsul celular (Popa-Wagner et al., 2006).
De asemenea, în ciuda multiplelor studii preclinice care au dovedit eficienţa unor metode terapeutice, în stroke, pe model animal, în momentul trecerii spre trialurile clinice, majoritatea au fost sortite eşecului. În acest sens, vom prezenta două alternative la terapia convenţională a accidentului cerebral ischemic şi anume, terapia cu factor de stimulare a coloniilor granulocitare (G-CSF) şi hipotermia indusă de hidrogenul sulfurat.
În primul experiment, ne-am propus să testăm ipoteza conform căreia administrarea de G-CSF are un efect terapeutic benefic, în ceea ce priveşte recuperarea după accidentele vasculare cerebrale, la animalele bătrâne.
În al doilea experiment, ne-am propus să confirmăm ideea că hipotermia pe termen lung (48 de ore) reprezintă o metodă neuroprotectivă mai eficace în tratamentul accidentelor vasculare cerebrale decât hipotermia pe termen scurt (4 ore), la şobolanii bătrâni.
11
5. MATERIAL ŞI METODE Experimentele pentru acest studiu au fost efectuate în Laboratorul de
Neurobiologie Moleculară, din cadrul Clinicii de Neurologie a Universităţii Ernst-Moritz-Arndt din Greifswald, Germania, în perioada noiembrie 2007 – septembrie 2009. Aprobarea pentru derularea tuturor experimentelor a fost garantată de către Comisia de Etică a Experimentelor pe Animale a Universităţii susmenţionate, în concordanţă cu cerintele legislaţiei germane şi europene (Federal Animal Care Comitee), în ceea ce priveşte experimentele pe animale. În tot acest timp, experimentele au fost supervizate de către Prof. univ. dr. Aurel Popa-Wagner.
Acest studiu a fost efectuat folosind un lot de 51 de şobolani, de sex masculin, din rasa Sprague Dawley, bătrâni (vârsta între 19-20 luni), ţinuţi în condiţii stricte de laborator, fiind împărţiţi în două grupuri, pentru fiecare dintre cele două experimente efectuate în acest studiu (Tabel nr. 1.).
Tabel nr. 1. Distribuţia animalelor pe subgrupuri experimentale
Grup Subgrup Număr
Trataţi 15 G-CSF
Placebo 14
Trataţi 14 Hipotermie
Placebo 8
Total 51
Modelul experimental de ocluzie transcraniană a arterei cerebrale medii
(OACM) folosit în acest studiu, presupune întreruperea tranzitorie a fluxului sanghin prin aceasta, aşa cum a fost descris anterior (Badan et al, 2003; Popa-Wagner et al, 1998).
După repermeabilizarea arterei cerebrale medii, şobolanii din grupul G-CSF au fost trataţi zilnic, timp de două săptămâni, cu G-CSF (Neupogen, Amgen, S.U.A.), în doză de 15 µg/Kgc, începând cu prima doză, administrată la o oră după interveţia chirurgicală şi revenirea din anestezie.
În ceea ce priveşte subgrupul de şobolani supus hipotermiei, fiecare şobolan a fost introdus într-o cuşcă, special construită pentru expunerea la o atmosferă ce conţine 80 ppm hidrogen sulfurat şi 20% oxigen, timp de 48 de ore.
Pentru a marca celulele de proliferare, şobolanii au fost injectaţi intraperitoneal cu 5-brom-2-deoxiuridină (BrdU, Sigma, Germania), un analog timidinic care este introdus în ADN-ul celulelor nou-născute, cu o doză de 50mg/Kg corp.
Evaluarea statusului neurologic şi comportamental a fost realizată începând cu ziua a treia după stroke (intervenţia chirurgicală), pentru a elimina erorile cauzate de stresul anestezic şi operator, modificările funcţiei neurologice fiind monitorizate până la finalul experimentului, frecvenţa testărilor fiind specifică fiecărui experiment în parte.
12
Tabel nr. 2. Programul evaluărilor statusului neurologic şi comportamental
Grup Test Ziua testului
Plan înclinat 3, 6, ,9, 12, 15, 21, 27
Labirint radial 3, 6, ,9, 12, 15, 21, 27 G-CSF
Rotarod 3, 6, ,9, 12, 15, 21, 27
Plan înclinat 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14
Labirint în T 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14 Hipotermie
Rotarod 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14
După 14 sau 28 de zile de supravieţuire, în funcţie de experiment (14
zile, grupul supus hipotermiei şi 28 de zile, grupul G-CSF) şobolanii au fost sacrificaţi, în vederea prelevării creierului.
Creierul congelat la -70°C, a fost secţionat în sens coronar, în felii groase de 25 şi respectiv 50μm, folosind un criotom (Cryostat CM3000 Leica, Bensheim), la o temperatură de -30°C .
Pentru a putea determina volumul infarctului cerebral consecutiv ocluziei reversibilă a arterei cerebrale medii, fiecare a 20-a secţiune, care cuprinde infarctul cerebral, a fost marcată şi a fost supusă marcării cu un anticorp specific, anti-nucleu matur neuronal (anti-NeuN, Millipore, Germania) şi colorat cu diaminobenzidină.
Pentru detectarea încorporării BrdU (grupul G-CSF) în celulele nou-formate, am folosit metode histologice enzimatice şi cu imunofluorescenţă. Cuantificarea celulelor BrdU pozitive s-a realizat la nivelul a trei regiuni cerebrale: regiunea peri-infarct, zona subventriculară şi girusul dinţat, pentru fiecare dintre emisfere (ipsilaterală şi contralaterală).
S-a efectuat şi cuantificarea celulelor marcate prin dublă imunofluorescenţă (datorită colocalizării în acelaşi plan confocal, a două celule diferite, sau a aceleiaşi celule cu marcare dublă) prin reconstructie tridimensională.
De asemenea, au fost marcate cu anticorpi specifici celulele ce exprimă antigenul ED1 (macrofagic sau fenotip celular activat), în cazul şobolanilor din grupul hipotermic, realizându-se şi estimarea cantitativă a numărului de celule ED1 pozitive.
Analiza genomică a fost efectuată doar în cazul grupului supus hipotermiei, folosind probe tisulare recoltate din zona de penumbră, care au fost omogenizate în vederea izolării ARN-lui total, urmărind expresia unor gene implicate în inflamaţie: casp 12 (caspaza 12), NF-kB (factorul nuclear kapa, activator al celulelor B ) şi grp78 (proteina reglatoare de glucoză de 78 de kilodaltoni); pentru acest scop am utilizat tehnici de hibridizare microarray şi RT-PCR.
Analiza statistică a fost realizată folosind totalitatea datelor, parametrice şi nonparametrice, obţinute în studiu. Datele parametrice au fost prezentate exprimând media plus sau minus deviaţia standard, iar datele nonparametrice doar ca medie.
13
6. REZULTATE Experimentul G-CSF Unul dintre efectele remarcabile ale tratamentului cu factor de stimulare
a coloniilor granulocitare a fost reprezentat de scăderea semnificativă a ratei de mortalitate, în subgrupul tratat (p=0,007).
Figura nr.1. Efectul G-CSF asupra mortalităţii (curbă Kaplan-Meier)
În cazul testului planului înclinat, un efect benefic semnificativ al tratamentului cu G–CSF a fost evident între ziua a şasea şi a noua (p<0,05) după accidentul vascular cerebral ischemic (Figura nr. 2.).
Figura nr. 2. Gradul de recuperare apreciat prin testul planului înclinat
În ceea ce priveşte testul rotarod, după un declin abrupt al performanţelor în ziua a treia după accidentul vascular cerebral, grupul de animale tratate au atins pragul de recuperare de 90%, faţă de nivelul dinaintea operaţiei, în ziua a 28-a (Figura nr. 3.); şobolanii care au făcut parte din grupul de control au început recuperarea funcţiei vestibulo-motorie după o întârziere de nouă zile, comparativ cu grupul de animale tratate cu G-CSF (p<0,05).
Figura nr. 3. Recuperarea şobolanilor trataţi cu G-CSF la testul rotarod
14
Memoria spaţială, evaluată prin testul labirintului radial, s-a deteriorat progresiv, pe parcursul primelor nouă zile după accidentul vascular cerebral, în cazul grupului control (Figura nr. 4.); deşi şobolanii de control recuperează, într-o oarecare măsură, temporar această funcţie, între zilele a noua şi a cincisprezecea, analizând graficul, se observă că numărul de greşeli la acest test rămâne crescut în interiorul subgrupului (p<0,05).
Figura nr. 4. Rezultatele testului labirintului radial,în urma tratamentului cu G-CSF
În privinţa volumul infarctului (Figura nr. 5.), nu s-a observat nici un efect semnificativ al terapiei cu G-CSF, faţă de şobolanii trataţi placebo (control), prin utilizarea coloraţiei NeuN (p>0,3).
Volumul infarctului
0
50
100
150
200
250
300
350
G-CSF Control
mm
3
Figura nr. 5 Volumul infarctului cerebral la cele două subgrupuri studiate
Tratamentul cu G-CSF nu are un efect semnificativ în ceea ce priveşte creşterea numărului total de celule BrdU pozitive (p>0,03), la nivelul regiunii din jurul ariei infarctate, la subgrupul tratat cu G-CSF, comparativ cu subgrupul control (Figura nr. 6. stânga). Totuşi, la nivelul zonei subventriculare (ZSV), am observat o creştere semnificativă a numărului celulelor BrdU pozitive la subgrupul de animale tratat cu G-CSF, comparativ cu subgrupul control (p<0,03). Diferenţa între subgrupul tratat şi cel de control a fost şi mai evidentă (p=0,03) la nivelul emisferei infarctate (Figura nr. 6. dreapta).
Figura nr. 6. Dreapta: Cuantificare numărului de celule BrdU pozitive în zona peri-
infarct; Stânga: Cuantificare numărului de celule BrdU pozitive în zona suventriculară.
15
Cuantificarea neurogenezei, la nivelul girusului dinţat, a evidenţiat o creştere semnificativă a numărului de celule BrdU pozitive în emisfera ipsilaterală infarctului, în cazul şobolanilor trataţi cu G-CSF, comparativ cu şobolanii netrataţi (p=0,021), dar şi faţă de emisfera controlaterală infarctului, la acelaşi subgrup de şobolani. În cazul emisferei controlaterală infarctului, nu s-au înregistrat diferenţe semnificative între cele două grupe de şobolani (p>0,05) (Figura nr. 7.)
Figura nr. 7. Cuantificare numărului de celule BrdU pozitive la nivelul girusului dinţat, în
ambele emisfere Numărul de celule dublu marcate nu diferă foarte mult între subgrupul
control şi subgrupul tratat, în ceea ce priveşte zona peri-infarct (p>0,05) sau zona subventriculară a emisferei controlaterale (p>0,05). Totuşi, în ceea ce priveşte numărul de celule dublu marcate, acesta este semnificativ mai mare (p=0,01) la subgrupul tratat, faţă de control la nivelul zonei subventriculare ipsilaterală infarctului (Figura nr. 8.).
Figura nr. 8. Stânga: Cuantificare numărului de celule care prezintă colocalizarea celor două
semnale (BrdU şi NeuN), la nivelul zonei peri-infarct şi a zonei subventriculare în ambele emisfere (PI – zona peri-infarct, ZSV – zona sub-ventriculară, CL – controlateral, IPSI – ipsilateral); Dreapta: Evidenţierea colocalizării celor două semnale (BrdU şi NeuN) într-o
regiune din zona subventriculară (G-CSF vs. Control). Experimentul hipotermic În acest experiment, în niciunul dintre cele două subgrupuri (hipotermic
sau control) nu s-au înregistrat decese până în ziua sacrificării. Rezultatele obţinute în cazul testului planului înclinat sunt următoarele:
pe tot parcursul studiului (14 zile), subgrupul supus hipotermiei a avut performanţe superioare subgrupului control (p<0,05) cu cel puţin 15%, în ceea
16
ce priveşte recuperarea activităţii motorii (Figura nr. 9.); adiţional, o îmbunătăţire superioară a fost observată în primele zile după accidentul ischemic cerebral (din ziua a 3-a până în ziua a 5-a), dar mai ales între zilele a 9-a şi a 11-a.
Figura nr. 9. Evoluţia recuperării apreciată prin testul planului înclinat în urma hipotermiei
De asemenea, din analiza rezultatelor testării recuperării funcţiei vestibulo-motorie (testul rotarod), s-a observat că, pe tot parcursul perioadei de supravieţuire, scorul şobolanilor din subgrupul supus hipotermiei a fost superior celor din grupul control (p<0,03) (Figura nr. 10.).
Figura nr. 10. Evoluţia recuperării funcţiei vestibulo-motorii, evaluată prin testul rotarod
Recuperarea memoriei, bazată pe învăţare spaţială (testul labirintului în T), nu evidenţiază diferenţe semnificative între cele două subgrupuri (p>0,05) (Figura nr. 11).
Figura nr. 11. Evoluţia recuperării memoriei spaţiale, în urma hipotermiei
Expunerea şobolanilor, după accidentul vascular, la o atmosferă ce conţine hidrogen sulfurat într-o concentraţie de 80 ppm, este urmată de o scădere progresivă a temperaturii interne a corpului temperatura stabilizându-se la 30,8 ± 0,7°C, după aproximativ 6 ore. (Figura nr. 12.).
17
Figura nr. 12. Evoluţia scăderii temperaturii interne a şobolanilor pe parcursul
expunerii la hidrogen sulfurat Doza totală de hidrogen sulfurat inhalată, calculată la o ventilaţie de
150ml/min, a fost de 16,7 µg/min; de asemenea, concentraţiile plasmatică şi tisulară ale hidrogenului sulfurat au fost relativ constante pe toată durata expunerii.
Calculând volumul infarctului, am evidenţiat prin coloraţia Nissl, o reducere semnificativă (p<0,01) a volumului infarctului (Figura nr. 13. centru, jos) la subgrupul de animale expuse hipotermiei (Figura nr. 13. stânga), faţă de cele din subgrupul control (Figura nr. 13.dreapta).
Volumul infarctului
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Control Hipotermie
Figura nr. 13. Zona de infarct cerebral. Dreapta şobolan din grupul hipotermic; Stânga: şobolan din grupul control; Jos: Volumul infarctului (mm3) reprezentat comparativ.
La analiza imunohistochimică, folosind markerul pentru nuclei neuronali
NeuN, care evidenţiază detalii fine ale ariei infarctului. (Badan et al., 2003), s-a observat faptul că zona de infarct cerebral pare să fie bine conturată la subgrupul de animale supuse hipotermiei. (Figura nr. 14. stânga), comparativ cu subgrupul control, la care zona de infarct prezintă, în general, un aspect dezintegrat (Figura nr. 14. dreapta).
18
Figura nr. 14. Aspectul zonei infarctului la un animal din grupul hipotermic (stânga), şi control
(dreapta), în coloraţie NeuN Folosind un anticorp monoclonal specific macrofagelor (fenotip celular
activat), am găsit două populaţii distincte de celule ED1 pozitive în aria infarctului. La grupul control am observat existenţa unui număr aproximativ egal (Figura nr. 17) de celule, care exprimă fenotip specific macrofagelor (Figura nr. 15), cu celule care exprimă fenotip specific microgliilor (Figura nr. 16, fereastră dreapta jos).
Figura nr. 15. Zonă de infract la un şobolan din grupul control. Se observă
predominanţa celulelor care exprimă fenotip macrofagic (exemplificare în fereastră)
Figura nr. 16. Zonă de infract la un şobolan din grupul hipotermic. Se observă predominanţa
celulelor care exprimă fenotip specific microgliei activate (exemplificare în fereastră)
Figura nr. 17. Cuantificarea celulelor ED1 pozitive, având cele două fenotipuri, în
subgrupurile hipotermic şi control
19
Determinarea nivelului ARN mesager (ARNm) s-a realizat pentru gene ce codifică proteine specifice reacţiei inflamatorii, precum casp 12 (caspaza 12), NF-kB (factorul nuclear kapa activator al celulelor B ) şi grp78 (proteina reglatoare de glucoză, cu greutate de 78 de kilodaltoni), în regiunea peri-infarct (Figura nr. 18.).
Figura nr. 18. Nivelul ARNm pentru genele specifice inflamaţiei, investigate, comparativ cu
gene considerate control
20
7. DISCUŢII Discuţii asupra rezultatelor experimentului cu G-CSF Factorul de stimulare a coloniilor granulocitare este o glicoproteină,
având masa moleculara 19 600 daltoni, cunoscută şi sub denumirea de colony-stimulating factor 3 (CSF 3), fiind produsă de diferite ţesuturi în scopul stimulării maduvei osoase hematogene, spre a produce granulocite şi celule stem şi a le elibera în circulaţia sanguină
În afara efectului exercitat asupra sistemului hematopoietic, G-CSF poate acţiona şi asupra celulelor neuronale, ca factor neurotrofic. Receptori pentru G-CSF au fost descoperiţi şi la nivelul sistemului nervos (creier şi măduva spinării). Acţiunea G-CSF, la nivelul sistemului nervos central (SNC), este reprezentată de: inducerea neurogenezei, creşterea neuroplasticităţii şi inhibiţia apoptozei. (Pitzer et al., 2008).
Studii anterioare, care folosesc modele animale diverse de provocare a unui accident vascular cerebral ischemic, au demonstrat că G-CSF prezintă o bună eficienţă în a reduce volumul infarctului şi a îmbunătăţi recuperarea funcţională (Minnerup et al., 2008).
Pentru prima dată, noi am putut demonstra o recuperare robustă funcţională la animalele bătrâne, pentru întreaga perioadă de testare de 28 de zile, în urma tratamentului cu G-CSF.
O recuperare semnificativ mai bună, pe toată perioada de supravieţuire, a şobolanilor trataţi, faţă de cei netrataţi, a fost evidentă în ceea ce priveşte funcţia vestibulo-motorie, evaluată prin testul rotarod.
Îmbunătăţiri semnificative au putut fi observate şi în ceea ce priveşte recuperarea activităţii motorii coordinative, evaluată prin testul planului înclinat. Totuşi, acest efect benefic a fost menţinut doar în primele 12 zile de supravieţuire, cu un plus în perioada cuprinsă între zilele a 6-a şi a 9-a. La fel, recuperarea memoriei spaţiale, cuantificată prin testul labirintului radial, a fost semnificativ superioară, în primele 12 zile, fiind mai evidentă între zilele a 6-a şi a 12-a, interval ce corespunde perioadei de administrare a G-CSF.
Aceste rezultate sugerează faptul că, cel puţin la animalele bătrâne, este necesar un tratament mai intens şi pe o perioadă mai îndelungată, pentru a mări efectul recuperării funcţiilor neurologice după accidentele vasculare cerebrale.
Pe lângă o recuperare îmbunătăţită a funcţiilor motorii şi cognitive, tratamentul cu G-CSF reduce în mod clar şi mortalitatea la animalele bătrâne, după accidentele vasculare. Trei animale din grupul de control au murit în zilele 7, 10 şi 12, în schimb în grupul tratat cu G-CSF nu s-a înregistrat nici un deces. Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu studiile anterioare (Gibson et al., 2005; Six et al., 2003), efectuate pe animale tinere, unde o singură doză de G-CSF, administrată intravenos, reduce mortalitatea după ocluzia arterei cerebrale medii şi episodul ischemic consecutiv (Popa-Wagner et al., 2010).
În general, această capacitate crescută de supravieţuire a animalelor bătrâne, tratate cu G-CSF, poate fi în mod particular interpretată ca un efect
21
terapeutic puternic, deoarece este bine cunoscut că animalele bătrâne au o predispoziţie crescută la accidentele vasculare cerebrale ischemice, dar şi o mortalitate crescută în urma acestora (Balseanu et al., 2009; Popa-Wagner et al., 1998; Zhang et al., 2005).
Îmbunătăţirea funcţiilor neurologice, în urma tratamentului cu G-CSF după stroke, poate sugera un efect direct al factorului de creştere asupra recuperării funcţiei motorii, care poate fi similar cu descoperiri recente, care subliniază faptul că G-CSF este un important factor în dezvoltarea normală a mersului şi alergării, la şoareci tipul sălbatic (wild type) sau Genotip G-CSF -/- (Diederich et al., 2009). Un posibil mecanism este reprezentat de un schimb relativ, în favoarea activării neuronale (o supraexprimare a receptorilor NMDA, în paralel cu subexprimarea receptorilor GABA), care poate potenţa efectul G-CSF asupra recuperării funcţionale. De asemenea, administrarea factorului de stimulare a coloniilor granulocitare poate îmbunătăţi supravieţuirea neuronală şi astfel, indirect, poate avea un efect de reducere a apoptozei, creşterea angiogenezei şi o reducere a excitotoxicităţii, după un accident vascular cerebral ischemic (Han et al., 2008).
Aşa cum a fost recent demonstrat (Schneider et al., 2005), tratamentul cu G-CSF induce formarea unui număr substanţial de noi progenitori neuronali şi de neuroni imaturi, în regiunile subcorticale, adiacente ariei infarctate. De asemenea, G-CSF induce şi o intensificare a neurogenezei la nivelul hipocampusului (girusul dinţat) şi la nivelul zonei subventriculare.
Aceste efecte citoprotectoare şi citoregenerative, demostrate anterior pe animale tinere, au fost confirmate prin acest studiu, pe animale bătrâne. În actualul studiu, ce a fost realizat pe animale bătrâne, deşi am evidenţiat o creştere a numărului total de celule nou formate, la nivelul girusului dinţat al hipocampusului şi la nivelul zonei subventriculare, o creştere a populaţiei strict neuronale a fost observată doar la nivelul zonei subventriculare a emisferei lezate (ipsilateral infarctului), la subiecţii trataţi, comparativ cu cei netrataţi.
Din datele rezultate din cercetările noastre, putem spune că tratamentul cu G-CSF la şobolani bătrâni, reduce mortalitatea, îmbunătăţeşte recuperarea funcţiilor motorii, precum şi memoria de lucru şi determină apariţia unui număr crescut de celule proliferative şi neuroni nou formaţi la nivelul zonei subventriculare, ipsilaterală zonei infarctate.
Trebuie, de asemenea, menţionat faptul că siguranţa şi eficienţa administrării de G-CSF la pacienţi, în general, nu au fost pe deplin stabilite. Din cauza posibilităţii dezvoltării unor tumori, o anumită precauţie trebuie luată în calcul la folosirea acestuia, în special în prezenţa unor maladii maligne asociate (limfoame, leucemii mieloide), sau a unor procese premaligne (sindrom mielodisplazic); studiile clinice nu au stabilit încă dacă G-CSF influenţează progresia sindromului mielodisplazic către leucemia mieloidă (D'Souza et al., 2008).
Trebuie luate în calcul şi potenţialele efecte adverse date de administrarea G-CSF, printre cele mai frecvente fiind durerea osoasă şi musculară, splenomegalia şi trombocitopenia, dar şi cefalee şi diaree, care pot surveni la începutul tratamentului.
22
Totuşi, toate aceste reacţii adverse, descrise de producător (Amgen, S.U.A.) se întâlnesc în administrarea de G-CSF pentru o perioadă îndelungată (luni de zile), nefiind întâlnite înrtr-un program terapeutic de durata celui folosit de noi (14 zile).
Discuţii asupra rezultatelor din experimentul hipotermic În studii recente asupra ischemiei cerebrale focale, s-a demonstrat că
hipotermia pe o perioadă scurtă (6 ore) după stroke, reduce semnificativ volumul infarctului (Kollmar et al., 2007). Dar, o neuroprotecţie consistentă necesită o reducere a temperaturii corporale, pentru o perioadă mai îndelungată de timp. De aceea, un interval de timp de 48 de ore este suficient pentru a avea o reducere protectivă a fenomenelor inflamatoare, ce au loc la nivelul creierului ischemic.
Scăderea temperaturii creierului, determină o îmbunătăţire a recuperării funcţionale, după o leziune traumatică cerebrală (Kuo et al., 2010), la şobolani sau după ischemie focală la babuini (Schwartz et al., 2011). Totuşi, metodele descrise de aceşti autori sunt greu de implementat clinic, fiind relativ invazive. De aceea, o îmbunătăţire a tehnologiilor de răcire a temperaturii corpului şi a creierului în special este necesară pentru a asigura o protecţie optimă.
Este cunoscut efectul supunerii şobolanilor unei atmosfere conţinând hidrogen sulfurat într-o concentraţie de 80ppm, de a induce o stare asemănătoare hibernării, prin blocarea reversibilă şi temporară (mecanism de inhibiţie necompetitivă) a lanţului respirator; acest fapt se realizează probabil prin deprimarea activităţii citocromoxidazei c, dar şi scăderea activităţii complexului succinat-oxidază; doza de 80 ppm de hidrogen sulfurat nu este toxică, dar expunerea la o doză peste 500 ppm hidrogen sulfurat provoacă moartea. Blocarea reversibilă şi temporară a lanţului respirator determină o scădere a temperaturii corpului cu până la 10°C în primele 6 ore, în funcţie de temperatura mediului ambiant (Florian et al., 2008). Trebuie menţionat şi faptul că o expunere a şobolanilor la o atmosferă ce conţine 80ppm H2S, pentru un interval de timp de 90 de zile, nu arată nici un efect toxic la nivel hematologic sau prezenţa unei patologii majore. (Dorman et al., 2004).
Studii recente au confirmat faptul că reducerea răspunsului inflamator, după ischemia cerebrală, limitează expansiunea leziunii şi creşte gradul de supravieţuire a neuroilor (Shichita et al., 2009).
În această lucrare am demonstrat că expunerea şobolanilor bătrâni, după un episod ischemic cerebral, la hipotermie, indusă cu ajutorul H2S, pentru o perioadă de 48 de ore, reduce aria infarctului cu 50%, la lotul hipotermic, faţă de lotul netratat, fără a avea efecte secundare neurologice semnificative.
Subgrupul de animale expuse hipotermiei prezintă o activitate normală la câteva minute după întoarcerea într-un mediu atmosferic normal, cu o temperatură optimă şi are un scor semnificativ mai bun la testele ce necesită aptitudini senzoriale şi motorii complexe, precum testul rotarod şi testul planului înclinat, sugerând un efect neuroprotector al hipotermiei şi o îmbunătăţire a recuperării funcţionale.
23
După primele şapte zile post accident vascular cerebral ischemic, şobolanii, menţinuţi în condiţii de hipotermie, încep să ia în greutate, mai devreme decât animalele de control, ceea ce denotă o recuperare mai bună şi a funcţiilor psihice.
Acţiunea fiziologică a hidrogenului sulfurat nu este încă pe deplin cunoscută; se ştie că este un potent vasodilatator endogen, produs la nivelul cordului şi endoteliului vascular. Se afirmă astăzi, din ce în ce mai frecvent, faptul că hidrogenul sulfurat este o importantă moleculă de semnalizare în ceea ce priveşte sistemul cardiovascular şi sistemul nervos (Jha et al., 2008).
În cazul modelului nostru pe animale bătrâne, hipotermia a avut un singur efect major clar şi anume o conservare ridicată a zonei viabile periinfarct, sugerând faptul că activitatea de fagocitoză a microgliei a fost redusă, la lotul de animale supus hipotermiei.
La nivel transcripţional, hipotermia a fost asociată cu reducerea nivelului de ARNm ce codifică markerii inflamaţiei: casp 12 (caspaza 12), NF-kB (factorul nuclear kapa activator al celulelor B ) şi grp78 (proteina reglatoare de glucoză de 78 de kilodaltoni).
Se ştie că familia de caspase are funcţii legate de apoptoză, cu excepţia caspazei 12 care, probabil, are un efect pro-inflamator şi este implicată în cascada citokinelor şi modularea inflamaţiei (Martinon et al., 2004).
Ipoteza noastră este că o reducere a nivelului caspazei 12 se însoţeşte şi de o scădere a nivelului altor mediatori ai inflamaţiei, precum NF-KB şi Grp78, fapt care vine în întâmpinarea afirmaţiei noastre, precum că numărul de celule fagocitare scade în zona de penumbră, la nivelul infarctului animalelor expuse hipotermiei.
Rezultatele cercetărilor recente, efectuate pe mamifere de mărimi diferite, sunt controversate. Recent, studiile preclinice ale efectului hipotermic al hidrogenului sulfurat asupra ratei metabolice la mamiferele mari, precum porcinele, pentru o perioadă de 90 de minute, la 80 ppmH2S, pare să acţioneze ca un stimulant metabolic şi hemodinamic. Fiindcă modelul hipotermic la şobolani este bine stabilit, ipoteza acestui fapt controversat este aceea că animalele mari au nevoie de mai mult timp pentru a îşi manifesta efectul metabolic (Li et al., 2009).
La oameni, hipotermia focală metabolică, indusă pe o perioadă de până la 6 ore, după un accident vascular cerebral ischemic, prin injectarea în carotidă a unei soluţii saline răcite sau prin răcirea suprafeţei corporale, a fost încercată în vederea reducerii volumului infarctului miocardic (De Georgia et al., 2004).
Din cauza numărului mic de pacienţi folosiţi în acest studiu şi datorită absenţei grupului de control, eficacitatea metodei este dificil de apreciat. În plus, hipotermia indusă prin metode fizice, determină la oameni apariţia tremorului, ceea ce interferă cu terapia (Den Hertog et al., 2007).
Una dintre problemele care pot apărea în privinţa trialurilor clinice ce folosesc hipotermia indusă cu hidrogen sulfurat, poate consta într-o reacţie a pacienţilor la mirosul total neplăcut al acestuia, fapt ce poate fi evitat prin folosirea unor substanţe injectabile, care pot potenţa efectul hipotermic al
24
hidrogenului sulfurat, scăzând astfel doza administrată şi, prin urmare, şi intensitatea mirosului neplăcut (Jha et al., 2008).
Studiul nostru demonstrează faptul că hipotermia este o metodă eficientă de neuroprotecţie, cu condiţia să fie aplicată cât mai devreme posibil şi pe o durată de timp cât mai lungă.
25
8. CONCLUZII Rezultatele studiului nostru au arătat, pentru prima dată, faptul că
tratamentul cu factor de stimulare a coloniilor granulocitare (G-CSF), la şobolanii bătrâni, după accidentul vascular cerebral ischemic, pentru o perioadă de două săptămâni, îmbunătăţeşte recuperarea funcţiilor neurologice (funcţia vestibulo-motorie, cea motorie propriu-zisă şi memoria spaţială).
De asemenea, administrarea G-CSF după episodul ischemic cerebral
creşte rata de supravieţuire, reducând nivelul mortalităţii la 0, în subgrupul animalelor tratate. Un efect important îl reprezintă şi amplificarea neurogenezei, prin producerea de noi neuroni, în special la nivelul zonei subventriculare a emisferei lezate (un număr cuantificat de aproximativ 1,5 ori mai mare, faţă de subgrupul netratat).
Aceste rezultate sunt importante pentru susţinerea aplicării factorului de
stimulare a coloniilor granulocitare în noi trialuri clinice, în vederea implementării acestei terapii, ce poate îmbunătăţi recuperarea şi supravieţuirea după accidentele vasculare cerebrale ischemice, la persoanele în vârstă.
Din aceste motive, considerăm că viitoarele studiile preclinice ar trebui
direcţionate către optimizarea tratamentului cu G-CSF în ischemia cerebrală, atât din punct de vederea al stabilirii dozei, dar şi din punct de vedere al duratei tratamentului, pentru ca pacienţii în vârstă trataţi să ajungă la un nivel cât mai mare de recuperare post stroke.
Datele rezultate în urma cercetărilor noastre demonstrează faptul că
hipotermia reprezintă o altă metodă eficientă de neuroprotecţie, cu condiţia să fie aplicată cât mai devreme posibil şi pe o durată de timp cât mai lungă (până la 48 de ore după episodul ischemic).
Hipotermia, realizată prin inhalarea unui amestec gazos, ce conţine
hidrogen sulfurat într-o concentraţie de 80ppm, reduce volumul infarctului cu până la 50%, la şobolanii bătrâni, după accidentul vascular cerebral ischemic, fără a avea efecte secundare neurologice semnificative.
De asemenea, hipotermia indusă de hidrogen sulfurat, a scăzut
activitatea fagocitară a microgliei activate, la nivelul ariei peri-infarct, la şobolanii expuşi, comparativ cu şobolanii control, astfel realizându-se o mai bună conservare a ţesutului viabil în acea zonă.
La nivel transcripţional, hipotermia a fost asociată cu reducerea nivelului
de ARNm, ce codifică markerii inflamaţiei: casp 12 (caspaza 12), NF-kB
26
(factorul nuclear kapa activator al celulelor B ) şi grp78 (proteina reglatoare de glucoză de 78 de kilodaltoni).
Hipotermia indusă de hidrogenul sulfurat reprezintă o alternativă, demnă
de luat în seamă, la terapia convenţională a accidentului vascular cerebral ischemic, care ar trebui cât mai curând introdusă în trialurile clinice.
Cercetarea noastră, conform obiectivelor propuse, a realizat modelul
experimental pentru studiul unor metode de neuroprotecţie, pe animale bătrâne (19-20 de luni), având caracter de originalitate pentru G-CSF şi hipotermie. Modelul nostru este mult mai adecvat pentru aceste testări şi, astfel, capătă un grad mai mare de aplicabilitate pentru trecerea în faza următoare a trialurilor clinice. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Badan I., Platt D., Kessler C. et al., 2003, Temporal dynamics of degenerative
and regenerative events associated with cerebral ischemia in aged rats, Gerontology, 356-365.
2. Balseanu A.T., Buga A., Popa-Wagner A., 2009, Cellular response to cerebral ischemia during aging, Curr H Sci J, 1-35
3. Dávalos A., Castillo J., Alvarez-Sabín J. et al., 2002, Oral citicoline in acute ischemic stroke: an individual patient data pooling analysis of clinical trials, Stroke, 2850-2857.
4. De Georgia M.A., Krieger D.W., Abou-Chebl A., 2004, Cooling for Acute Ischemic Brain Damage (COOL AID): a feasibility trial of endovascular cooling, Neurology, 312-317
5. Den Hertog H., van der Worp B., van Gemert M. et al., 2007, Therapeutic hypothermia in acute ischemic stroke, Expert Review Neurotherapeutics, 155-164
6. Diederich K., Sevimli S., Dorr H. et al., 2009, The role of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) in the healthy brain: a characterization of G-CSF-deficient mice, J Neurosci, 11572–11581.
7. Dirnagl U., 2010, Oxygen maps in the brain, Nat Methods, 697-699. 8. Dorman D.C., Struve M.F., Gross E.A. et al., 2004, Respiratory tract toxicity of
inhaled hydrogen sulfide in Fischer-344 rats,Sprague-Dawley rats, and B6C3F1 mice following subchronic (90-day) exposure, Toxicol Appl Pharmacol, 29-39.
9. D'Souza A., Jaiyesimi I., Trainor L. et al., 2008, Granulocyte colony-stimulating factor administration: adverse events, Transfus Med Rev, 280-290.
10. Edvinsson L., Krause D., 2001, Cerebral Blood Flow and Metabolism, Second Edition, Lippincott Williams & Wilkins.
11. Florian B, Vintilescu R, Balseanu AT et al., 2008, Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia, Neurosci Lett, 180-185
12. Han J.L., Blank T., Schwab S. et al., 2008, Inhibited glutamate release by granulocyte-colony stimulating factor after experimental stroke, Neurosci Lett, 167–169.
13. Hăulică I., 2007, Fiziolologie umană, Ediţia a treia, Editura Medicală. 14. Jha S., Calvert J.W., Duranski M.R. et al., 2008, Hydrogen sulfide attenuates
hepatic ischemia-reperfusion injury: role of antioxidant and antiapoptotic signaling, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 801-806
27
15. Kollmar R., Blank T., Han J.L. et al., 2007, Different degrees of hypothermia after experimental stroke. short - and long - term outcome, Stroke, 1585-1589
16. Kuo J.R., Lo C.J., Chang C.P. et al., 2010, Brain cooling-stimulated angiogenesis and neurogenesis attenuated traumatic brain injury in rats, J Trauma, 1467-1472.
17. Less K.R., 2000, Neuroprotection, Br Med Bull, 401-412. 18. Li J., Zhang G., Cai S., 2008, Effect of inhaled hydrogen sulfide on metabolic
responses in anesthetized, paralyzed, and mechanically ventilated piglets, Pediatric Critical Care Medicine, 110-112.
19. Maiese K., 2009, Neurovascular Medicie Pursuing Cellular Longevity for Health Aging, Oxford University Press.
20. Minnerup J., Heidrich J., Wellmann J. et al., 2008, Meta-analysis of the efficacy of granulocyte-colony stimulating factor in animal models of focal cerebral ischemia, Stroke, 1855–1861.
21. MOBILIZE Boston study, Stroke, 635-640. 22. Mogoantă L., Pirici D., Pop O.T., Bălşeanu A.T. et al., 2010, Study of vascular
microdensity in areas of cerebral ischemia on experimental model, Rom J Morphol Embryol, 725-731.
23. Pitzer C., Krüger C., Plaas C. et al., 2008, Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis, Brain, 3335-3347.
24. Popa-Wagner A., Badan I., Vintilescu R. et al., 2006a, Premature cellular proliferation following cortical infarct in aged rats, Rom J Morphol Embryol, 215-228.
25. Popa-Wagner A., Carmichael S.T., Kokaia Z. et al., 2007, The response of the aged brain to stroke: too much, too soon?, Curr Neurovasc Res, 216-227.
26. Popa-Wagner A., Schröder E., Walker L.C. et al., 1998, beta-Amyloid precursor protein and ss-amyloid peptide immunoreactivity in the rat brain after middle cerebral artery occlusion: effect of age, Stroke, 2196-2202.
27. Popa-Wagner A., Stöcker K., Balseanu A.T. et al., 2010b, Effects of granulocyte-colony stimulating factor after stroke in aged rats, Stroke, 1027-1031.
28. Popescu F., Popescu F.D., Iancau M. et al., 2007, Visual evoked potentials in the in evaluation of the safety profile of levocetirizine, Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 722-728.
29. Schneider A., Krüger C., Steigleder T. et al., 2005, The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis, J Clin Invest, 2083-2098.
30. Schwartz A.E., Finck A.D., Stone J.G. et al., 2011, Delayed selective cerebral hypothermia decreases infarct volume after reperfused stroke in baboons, J Neurosurg Anesthesiol, 124-130
31. Shichita T., Sugiyama Y., Ooboshi H. et al., 2009, Pivotal role of cerebral interleukin-17-producing gammadeltaT cells in the delayed phase of ischemic brain injury, Nat Med, 946-950
32. Zhang R.L., Chopp M., Zhang Z.G. et al., 1997, A rat model of focal embolic cerebral ischemia, Brain Res, 83-92.
