POSIBILITĂŢI DE TERAPIE ÎN BOLILE GENETICE

Se cunosc peste 5000 boli genetice, Sunt identificate foarte multe dintre mutaţiile care

determină afecţiunile monogenice. ! Foarte important consultul genetic stabileşte

diagnosticul, conduita terapeutică, informând familia asupra riscului recurenţei bolii în generaţii.

! Foarte important - îmbunătăţirea testelor pentru diagnosticul prenatal o bună profilaxie genetică.

Un pas decisiv în corectarea bolilor genetice îl va reprezenta transferul de gene.

IngineriIngineria a geneticăgenetică

Tehnicile de genetică moleculară sunt aplicate în tratamentul diferitelor afecţiuni datorită posibilităţii sintezei unor proteine sau vaccinuri prin inginerie genetică.

Metodele utilizate: Exprimarea genelor cu structură normală, clonate, în

vederea sintezei unor cantităţi mari de produşi genici Producerea de anticorpi care pot fi utilizaţi ca agenţi

terapeutici Producerea de vaccinuri, inclusiv vaccinuri noi pentru

anumite forme de cancere.

IngineriIngineria a geneticăgenetică

Clasele majore de afecţiuni care pot beneficia Clasele majore de afecţiuni care pot beneficia de aceste modalităţi terapeutice:de aceste modalităţi terapeutice: Bolile infecţioaseBolile infecţioase Bolile neoplaziceBolile neoplazice Bolile ereditare monogeniceBolile ereditare monogenice Bolile sistemului imunitar (inclusiv alergii, Bolile sistemului imunitar (inclusiv alergii,

inflamaţii, boli autoimune)inflamaţii, boli autoimune)

TRATAMENTUL ÎN BOLILE TRATAMENTUL ÎN BOLILE MULTIFACTORIALEMULTIFACTORIALE

În general, În general, factorii cunoscuţi ca nocivi pot fi evitaţifactorii cunoscuţi ca nocivi pot fi evitaţi . . Ex. Ex. evitarea fumevitarea fumatului la atului la persoanele cu deficit de alfa-persoanele cu deficit de alfa-1- antitripsină, scade riscul tulburărilor respiratorii şi 1- antitripsină, scade riscul tulburărilor respiratorii şi al complicaţiilor hepatice.al complicaţiilor hepatice.

În unele anomalii congenitale multifactorialeÎn unele anomalii congenitale multifactoriale: : defectele congenitale de cord, despicăturile labio-palatine, stenoza pilorică ş.a.,

tratamentul chirurgicaltratamentul chirurgical rezolvă defectul; în peste rezolvă defectul; în peste 50% din cazuri, corectarea chirurgicală este salutară 50% din cazuri, corectarea chirurgicală este salutară printr-o unică intervenţie.printr-o unică intervenţie.

TRATAMENTUL ÎN BOLILE TRATAMENTUL ÎN BOLILE MULTIFACTORIALEMULTIFACTORIALE

În alte boli multifactoriale ca: În alte boli multifactoriale ca:

hipertensiunea arterială, boala coronariană, diabetul zaharat, schizofrenia, psihozele majore

exista exista doar doar terapii de ameliorareterapii de ameliorare..

TRATAMENTUL ÎN BOLILE MONOGENICE

recuperarea recuperarea integrala integrala este posibilă în aproximativ 15% din este posibilă în aproximativ 15% din totalul acestora. totalul acestora.

adaptarea socialăadaptarea socială - - 6%. 6%. Rezultate bune sunt consemnate însă în bolile în care defectul Rezultate bune sunt consemnate însă în bolile în care defectul

biochimic este cunoscut.biochimic este cunoscut.

Obiectivele tratamentului:Obiectivele tratamentului: Identificarea mutaţiei genice, pentru efectuarea

tratamentului etiologic:În boli ca fibroza chistică şi miodistrofia Duchenne, au În boli ca fibroza chistică şi miodistrofia Duchenne, au

fost identificate genele patologice şi proteinele deficientefost identificate genele patologice şi proteinele deficiente sunt necesare în continuare studii ample sunt necesare în continuare studii ample pentru pentru corectarea lor.corectarea lor.

TRATAMENTUL ÎN BOLILE MONOGENICE

Identificarea proteinelor deficiente şi a mecanismelor care determină instalarea simptomatologiei clinice:

În fenilcetonurie - deşi mutaţia genică În fenilcetonurie - deşi mutaţia genică este cunoscută, acţiuneste cunoscută, acţiunea ea nocivnocivaa a a concentratiei concentratiei ↑ ↑ de fenilalanină asupra dezvoltării encefaluluide fenilalanină asupra dezvoltării encefalului este incomplet elucidataeste incomplet elucidata..

Efectuarea tratamentului pe termen lung, chiar permanent:

Ex. în galactozemie, trebuie evitată acumularea

galactozei, pentru că aceasta poate duce permanent la instalarea tulburărilor.

În cistinoză (acumularea de cisteină în lizozomi), lipsa tratamentului instalarea tulburărilor renale.

în hemofilie e nevoie de substitutie permanenta in talasemie sunt necesare transfuzii periodice de

sânge; pacienţii trebuie urmăriţi permanent pentru a se evita supraîncărcarea cu fier.

Diferenţierea terapiei în raport cu heterogenitatea genetică a bolii:

ex. deşi în talasemie şi anemia sicklică (hemoglobinopatia S) mutaţia interesează aceeaşi pereche alelică, tratamentul este diferenţiat, în funcţie de tipul mutaţiei şi al expresiei genice.

Urmărirea în timp a pacienţilorex. in retinoblastom, tratamentul chirurgical

este salutar, dar pacienţii trebuie urmăriţi în timp, existând riscul dezvoltării ulterioare a altor tumori maligne.

Prevenirea instalării bolii prin diagnostic precoce şi iniţierea timpurie a terapiei

ex. in fenilcetonurie stabilirea diagnosticului imediat după naştere previne instalarea manifestărilor clinice severe. Dg. precoce dietă evitarea tulburărilor (oligofrenia) instalate încă din prima lună de viaţă, ireversibile.

Conduite terapeuticeConduite terapeutice

DietaDieta: : dieta restrictivădieta restrictivă dieta instituită imediat după naşteredieta instituită imediat după naştere (fenilcetonurie) (fenilcetonurie) În alte afecţiuni poate fi necesară În alte afecţiuni poate fi necesară administrarea unui administrarea unui

anumit produsanumit produs: : administrarea de colesterol în administrarea de colesterol în sindromul Smith-Lemli-Opitz previne sindromul Smith-Lemli-Opitz previne demielinizarea.demielinizarea.

Conduite terapeuticeConduite terapeutice

Administrarea unor vitamine poate îmbunătăţi Administrarea unor vitamine poate îmbunătăţi prognosticul unor bolnaviprognosticul unor bolnavi. .

Ex. :Ex. : în homocistinurie administrarea vit în homocistinurie administrarea vit. . B6B6 ↓↓ concentraţi concentraţiaa plasmatic plasmaticaa a homocisteinei a homocisteinei

Vitamina E este benefică în unele afecţiuni Vitamina E este benefică în unele afecţiuni neurologiceneurologice ( (ataxia pseudo-Friedrichataxia pseudo-Friedrich))..

ElectrostimulareaElectrostimularea: se utilizează în bolile : se utilizează în bolile neuromusculare cu scopul de a creşte gradul de neuromusculare cu scopul de a creşte gradul de mobilitate şi de a reduce spasmele musculare şi mobilitate şi de a reduce spasmele musculare şi durerea.durerea.

Administrarea produsului deficitar

Ex. iEx. in hipotiroidismul congenital (aproximativ 15% sunt n hipotiroidismul congenital (aproximativ 15% sunt forme genetice) este necesară administrarea încă din forme genetice) este necesară administrarea încă din perioada neonatală a preparatelor de tiroidă. perioada neonatală a preparatelor de tiroidă.

În hemofilie, administrarea periodică de perfuzii cu În hemofilie, administrarea periodică de perfuzii cu fracţiuni de plasmă bogată în factorii VIII sau IX ai fracţiuni de plasmă bogată în factorii VIII sau IX ai coagulării (în funcţie de tipul hemofiliei) reduce starea coagulării (în funcţie de tipul hemofiliei) reduce starea hemoragipară.hemoragipară.

Administrarea produsului deficitar În deficienţa pentru alfa-1-antitripsină, administrarea În deficienţa pentru alfa-1-antitripsină, administrarea

periodică a enzimei, împiedică efectul distructiv al periodică a enzimei, împiedică efectul distructiv al elastazei asupra epiteliului alveolar pulmonar. elastazei asupra epiteliului alveolar pulmonar.

În deficienţa enzimatică a adenozin diaminazei (ADA), În deficienţa enzimatică a adenozin diaminazei (ADA), absenţa enzimei perturbă limfocitele B şi limfocitele T absenţa enzimei perturbă limfocitele B şi limfocitele T imunodeficienţă gravăimunodeficienţă gravă.. Administrarea de extract de Administrarea de extract de enzimă ADA corectează deficitul imunitar. enzimă ADA corectează deficitul imunitar.

În boala Gaucher - deficit enzimatic cu stocare de În boala Gaucher - deficit enzimatic cu stocare de cerebrozide în lizozomii SRE - se administrează enzima cerebrozide în lizozomii SRE - se administrează enzima deficitară, împiedicându-se astfel stocarea lipidelor deficitară, împiedicându-se astfel stocarea lipidelor complexe şi consecinţele acesteia.complexe şi consecinţele acesteia.

Metodele farmacologice Metodele farmacologice convenţionale au ca scop:convenţionale au ca scop:

Înlocuirea unei funcţii: : administrarea de melatonină în sindroame cu administrarea de melatonină în sindroame cu

tulburări ale ritmului circadiantulburări ale ritmului circadian Protejarea unei funcţii:

în ataxia Friedrich (boală mitocondrială în ataxia Friedrich (boală mitocondrială degenerativă care afectează SNC şi inima) degenerativă care afectează SNC şi inima) administrarea de anti-oxidanţi (coenzima Q 10) a administrarea de anti-oxidanţi (coenzima Q 10) a ameliorat funcţia cardiacă, dar nu a avut efect ameliorat funcţia cardiacă, dar nu a avut efect asupra SNC. asupra SNC.

Metodele farmacologice Metodele farmacologice convenţionale au ca scop:convenţionale au ca scop:

Reexprimarea unei funcţii: în : în HbHb S se S se administrează hidroxiuree care stimulează administrează hidroxiuree care stimulează expresia genei pentru specificarea globinei gama expresia genei pentru specificarea globinei gama în scopul producerii HbF ca supleant al absenţei în scopul producerii HbF ca supleant al absenţei globinei beta; prin aceasta se ameliorează simţitor globinei beta; prin aceasta se ameliorează simţitor procesul hemolitic. procesul hemolitic.

Inhibarea unei funcţii:: biofosfonaţii se biofosfonaţii se administrează în administrează în OIOI

Rectificarea procesului de translaţie:: în fibroza în fibroza chistică administrarea unui anumit antibiotic chistică administrarea unui anumit antibiotic determină corectarea splicing-ului aberantdetermină corectarea splicing-ului aberant

Administrarea unor medicamente care reduc nivelul plasmatic al produsului nemetabolizat

Hipercolesterolemia familială (mai ales forma Hipercolesterolemia familială (mai ales forma heterozigotă)heterozigotă): : administrarea unor medicamente administrarea unor medicamente stimulează producerea de receptori pentru stimulează producerea de receptori pentru lipoproteine, în scopul legării colesterolului liber. lipoproteine, în scopul legării colesterolului liber. În paralel, se administrează şi medicamente care să În paralel, se administrează şi medicamente care să inhibe sinteza colesterolului hepatic (endogen).inhibe sinteza colesterolului hepatic (endogen).

TransplantulTransplantul Terapia genicăTerapia genică

TERAPIA PRIN MODIFICAREA TERAPIA PRIN MODIFICAREA GENOMULUI SOMATICGENOMULUI SOMATIC

Transplantul. Celulele transplantate păstrează genomul Celulele transplantate păstrează genomul

donorului, astfel că transplantul poate fi socotit donorului, astfel că transplantul poate fi socotit drept o formă de terapie prin transfer de gene.drept o formă de terapie prin transfer de gene.

TERAPIA PRIN MODIFICAREA TERAPIA PRIN MODIFICAREA GENOMULUI SOMATICGENOMULUI SOMATIC

Pentru bolile genetice, metoda transplantului Pentru bolile genetice, metoda transplantului se indică în scopul:se indică în scopul: de a transfera gene funcţionalede a transfera gene funcţionale în vederea sintezei în vederea sintezei

de proteine care sunt deficitare sau lipsesc; exde proteine care sunt deficitare sau lipsesc; ex. . transplantul de celule hepatice, ectopic, în transplantul de celule hepatice, ectopic, în hipercolesterolemie, forma homozigotă;hipercolesterolemie, forma homozigotă;

de a înlocui un organ întreg nefuncţionalde a înlocui un organ întreg nefuncţional; ex; ex. . transplantul de ficat în stadiul de ciroză al transplantul de ficat în stadiul de ciroză al deficienţei de alfa-1-antitripsină. deficienţei de alfa-1-antitripsină.

Transplantul de măduvă hematopoetică are Transplantul de măduvă hematopoetică are efecte benefice şi se efectuează în efecte benefice şi se efectuează în imunodeficienţeimunodeficienţe (d (deficienţe ale enzimei ADAeficienţe ale enzimei ADA)), , boli de stocare a lipidelor complexe, talasemie boli de stocare a lipidelor complexe, talasemie

De câţiva ani s-a încercat implementarea de De câţiva ani s-a încercat implementarea de mioblaste în miodistrofia Duchenne, cu mioblaste în miodistrofia Duchenne, cu rezultate încurajatoare.rezultate încurajatoare.

TERAPIA PRIN TRANSFER DE GENETERAPIA PRIN TRANSFER DE GENE

Metodele utilizate pentru terapia genică: terapia genică clasică:: constă în introducerea genelor constă în introducerea genelor

în celulele ţintă cu scopul de a obţine o expresie în celulele ţintă cu scopul de a obţine o expresie optimă a genelor introduce. optimă a genelor introduce.

Genele astfel exprimate vor determina:Genele astfel exprimate vor determina: sinteza unui produs care lipseşte distrugerea directă a celulelor afectate, de ex. prin

producerea unor toxine activarea celulelor sistemului imunitar care vor ajuta la

distrugerea celulelor afectate

TERAPIA PRIN TRANSFER DE GENETERAPIA PRIN TRANSFER DE GENE

Metodele utilizate pentru terapia genică: terapia genică non-clasică: cu scopul

de a inhiba expresia unor gene asociate cu patogenia bolii, sau de a restaura expresia normală a genei.

Modalităţi de corectare a genelor cu Modalităţi de corectare a genelor cu mutaţii mutaţii

Inserarea unei gene cu structură normală într-o locaţie nespecifică

Gena defectivă poate fi înlocuită cu gena normală, prin recombinare omoloagă.

Gena defectivă poate fi reparată prin mutaţie inversă selectivă, care întoarce gena la funcţia sa normală.

Alterarea reglării unei anumite gene (gradul în care o genă este activată sau inhibată)

StrategiStrategia a transferultransferuluiui de gene de gene

locusul să fie identificat;locusul să fie identificat; gena să fie cunoscută din punct de vedere gena să fie cunoscută din punct de vedere

biochimic;biochimic; să fie posibilă clonarea ADN-ului;să fie posibilă clonarea ADN-ului; să se ia toate măsurile de prevedere ca să se ia toate măsurile de prevedere ca

introducerea genei în genomul bolnavului să introducerea genei în genomul bolnavului să nu producă risc pentru o nouă mutaţie;nu producă risc pentru o nouă mutaţie;

StrategiStrategia a transferultransferuluiui de gene de gene

să se poată păstra expresia genei transferate;să se poată păstra expresia genei transferate; să se găsească un vector adecvat şi desigur, să se găsească un vector adecvat şi desigur,

nepatogen;nepatogen; să se dezvolte şi perfecţioneze şi tehnologia să se dezvolte şi perfecţioneze şi tehnologia

pentru transfer de gene lung codante.pentru transfer de gene lung codante.

Genele pot fi transferate fie în celulele Genele pot fi transferate fie în celulele germinale, fie în celulele somaticegerminale, fie în celulele somatice

Transferul în celulele liniei germinale implică inserarea genei normale în aceste implică inserarea genei normale în aceste celule, astfel încât defectul genic va fi corectat celule, astfel încât defectul genic va fi corectat şi va fi transmis în manieră mendeliană de la o şi va fi transmis în manieră mendeliană de la o generaţie la alta. generaţie la alta.

Genele pot fi transferate fie în celulele Genele pot fi transferate fie în celulele germinale, fie în celulele somaticegerminale, fie în celulele somatice

Terapia prin transfer de gene în celule somatice se referă la inserarea genelor normale se referă la inserarea genelor normale numai în aceste celule, fără posibilitatea numai în aceste celule, fără posibilitatea transmiterii la generaţiile viitoare, fiind transmiterii la generaţiile viitoare, fiind modificat astfel doar genomul pacientului modificat astfel doar genomul pacientului respectiv. respectiv.

Terapia genică în celulele germinale la şoareci

terapia genică în celulele liniei germinale la om terapia genică în celulele liniei germinale la om este interzisăeste interzisă

tehnica inserării unei gene străine, sau a unui tehnica inserării unei gene străine, sau a unui fragment de ADN (de exemplu, o transgenă) în fragment de ADN (de exemplu, o transgenă) în celulele germinale la şoarece este efectuată în celulele germinale la şoarece este efectuată în mod curentmod curent::

Terapia genică în celulele germinale la şoareci

Imediat după fecundare se colectează embrionul Imediat după fecundare se colectează embrionul de şoarece care este format dintr-o singură celulă. de şoarece care este format dintr-o singură celulă.

În acest stadiu pronucleul masculin este încă vizibil, În acest stadiu pronucleul masculin este încă vizibil, iar ADN-ul străin poate fi inserat în nucleu printr-o iar ADN-ul străin poate fi inserat în nucleu printr-o microinjecţie. microinjecţie.

După injectare, embrionii sunt plasaţi în uterul unei După injectare, embrionii sunt plasaţi în uterul unei femele pregătită hormonal (“pseudoînsărcinată”). femele pregătită hormonal (“pseudoînsărcinată”).

Prezenţa transgenei poate fi determinată după naştere, Prezenţa transgenei poate fi determinată după naştere, la şoarecii nou-născuţi, fie prin metoda Southern, fie la şoarecii nou-născuţi, fie prin metoda Southern, fie prin reacţia de polimerizare a catenelor (PCR).prin reacţia de polimerizare a catenelor (PCR).

Deoarece aceşti şoareci pot exprima genele străine, ei Deoarece aceşti şoareci pot exprima genele străine, ei au fost denumiţi au fost denumiţi transgenici.

Un exemplu în acest sens îl reprezintă Un exemplu în acest sens îl reprezintă transferul genei umane care specifică lanţul transferul genei umane care specifică lanţul beta-globinic, la şoareci bolnavi cu beta-beta-globinic, la şoareci bolnavi cu beta-talasemie (datorată unei deleţii a genei care talasemie (datorată unei deleţii a genei care specifică acest lanţ globinic la şoarece).specifică acest lanţ globinic la şoarece).

În urma acestui transfer s-a observat reglarea În urma acestui transfer s-a observat reglarea expresiei moleculelor beta-globinice la şoareci expresiei moleculelor beta-globinice la şoareci şi respectiv corectarea bolii. şi respectiv corectarea bolii.

Terapia genică în celulele somatice:

implică inserarea unei gene normale în celulele implică inserarea unei gene normale în celulele somatice, transferul de genă determinând somatice, transferul de genă determinând sinteza unei cantităţi suficiente de proteine sinteza unei cantităţi suficiente de proteine terapeutice, pentru a se corecta defectul terapeutice, pentru a se corecta defectul metabolic. metabolic.

Pentru introducerea genelor în celulele Pentru introducerea genelor în celulele somatice sunt utilizate două modalităţi: somatice sunt utilizate două modalităţi:

“ex vivo” şi “in vivo”

Terapia genică “ex vivo”Terapia genică “ex vivo”

implică extragerea celulelor de la pacient, implică extragerea celulelor de la pacient, introducerea genelor terapeutice folosind introducerea genelor terapeutice folosind anumiţi vectori virali sau nonvirali şi anumiţi vectori virali sau nonvirali şi transplantul autolog al celulelor corectate din transplantul autolog al celulelor corectate din punct de vedere genic, la pacientul respectiv.punct de vedere genic, la pacientul respectiv.

Terapia genică “in vivo”Terapia genică “in vivo”

se realizează prin introducerea directă a genei se realizează prin introducerea directă a genei terapeutice la nivelul siturilor ţintă pentru patologia terapeutice la nivelul siturilor ţintă pentru patologia unui anumit individ (de exemplu, infuzii unui anumit individ (de exemplu, infuzii intravenoase, intraarteriale etc.), fără a fi necesară intravenoase, intraarteriale etc.), fără a fi necesară extragerea şi cultivarea celulelor pentru a se realiza extragerea şi cultivarea celulelor pentru a se realiza inserarea genelor, într-un laborator.inserarea genelor, într-un laborator.

Gena cu structură normală este inserată în genom, Gena cu structură normală este inserată în genom, pentru a înlocui gena cu mutaţie. pentru a înlocui gena cu mutaţie.

Terapia genică “in vivo”Terapia genică “in vivo”

In vederea introducerii genei terapeutice în In vederea introducerii genei terapeutice în celulele ţintă ale pacientului este necesară celulele ţintă ale pacientului este necesară legarea acesteia de un vector. legarea acesteia de un vector.

Cel mai frecvent se utilizează ca vector un Cel mai frecvent se utilizează ca vector un virus care a fost modificat genetic pentru a virus care a fost modificat genetic pentru a transporta ADN-ul uman normal. transporta ADN-ul uman normal.

Sistemele cele mai importante de vectori virali Sistemele cele mai importante de vectori virali şi nonvirali care se utilizează la ora actuală în şi nonvirali care se utilizează la ora actuală în terapia genică sunt:terapia genică sunt:

vectori virali: vectori virali: retrovirusuri;retrovirusuri; adenovirusuri;adenovirusuri; virusuri adeno-asociate;virusuri adeno-asociate; virusul herpeticvirusul herpetic

Sistemele de vectori virali

Vectorii retrovirali

PrimulPrimul sistem de vectori folosit, dar şi cel mai frecvent utilizat sistem de vectori folosit, dar şi cel mai frecvent utilizat pentru terapia genică. pentru terapia genică.

Avantajul vectorilor virali este de a avea genom scurt şi de a Avantajul vectorilor virali este de a avea genom scurt şi de a pătrunde în genomul tuturor celulelor primitorului. pătrunde în genomul tuturor celulelor primitorului.

Oricum, vectorii trebuie să fie în prealabil “prelucraţi” pentru Oricum, vectorii trebuie să fie în prealabil “prelucraţi” pentru a deveni incapabili de replicare şi să fie verificaţi pentru a nu a deveni incapabili de replicare şi să fie verificaţi pentru a nu avea efecte toxice, patogene. avea efecte toxice, patogene.

Vectorii adenovirali Vectorii adenovirali VirusuriVirusuri care au ca material genetic ADN dublu catenar care au ca material genetic ADN dublu catenar

şi infectează o mare varietate de tipuri de celule. şi infectează o mare varietate de tipuri de celule. Virusul nu se integrează în cromozomii umani, astfel Virusul nu se integrează în cromozomii umani, astfel

încât nu există riscul mutagenezei sau activării unor încât nu există riscul mutagenezei sau activării unor oncogene în cazul folosirii lor. oncogene în cazul folosirii lor.

Experimentele de transfer genic efectuate cu aceste Experimentele de transfer genic efectuate cu aceste tipuri de vectori au demonstrat o expresie eficientă, tipuri de vectori au demonstrat o expresie eficientă, dar de scurtă durată, fie a produşilor genei marker dar de scurtă durată, fie a produşilor genei marker (beta-galactozidaza în galactozemie), fie a proteinelor (beta-galactozidaza în galactozemie), fie a proteinelor reglatoare (în fibroza chistică).reglatoare (în fibroza chistică).

Sistemele de vectori virali

Virusurile adeno-asociate ClasăClasă de virusuri mici, cu ADN monocatenar, care îşi de virusuri mici, cu ADN monocatenar, care îşi

inseră materialul genetic într-un anumit loc de pe inseră materialul genetic într-un anumit loc de pe cromozomul 19.cromozomul 19.

Virusul herpetic Virusul herpetic este un virus cu ADN dublu catenar este un virus cu ADN dublu catenar care infectează neuronii. care infectează neuronii.

Aceste sisteme prezintă unele dezavantajeAceste sisteme prezintă unele dezavantaje:: sunt sunt necesare mai multe injectări, deci administrare necesare mai multe injectări, deci administrare repetată pentru menţinerea efectului terapeutic.repetată pentru menţinerea efectului terapeutic.

Sistemele de vectori virali

Sistemele de vectori non-virali

Cea mai simplă Cea mai simplă metodă este reprezentată de metodă este reprezentată de introducerea directă a ADN-ului terapeuticintroducerea directă a ADN-ului terapeutic în celulele ţintă. în celulele ţintă.

Este însă limitată ca aplicabilitate, deoarece Este însă limitată ca aplicabilitate, deoarece poate fi folosită numai la anumite ţesuturi şi poate fi folosită numai la anumite ţesuturi şi necesită cantităţi mari de ADN.necesită cantităţi mari de ADN.

Sistemele de vectori non-virali

Liposomii vezicule compuse dintr-o membrană lipidică ce vezicule compuse dintr-o membrană lipidică ce

înconjoară un volum apos, având diametrul de înconjoară un volum apos, având diametrul de câteva zeci de microni.câteva zeci de microni.

prezintă un avantaj asupra vectorilor virali prezintă un avantaj asupra vectorilor virali pentru terapia genică “in vivo”, deoarece sunt pentru terapia genică “in vivo”, deoarece sunt relativ nontoxici şi determină mai puţine relativ nontoxici şi determină mai puţine reacţii imunologice. reacţii imunologice.

Plasmidele şi vectorii conjugaţi

Plasmidul reprezintă o moleculă circulară,

extracromozomială de ADN care se replică independent.

recent au fost puse la punct strategii pentru injectarea unor plasmide direct în celule, fără introducerea lor într-o particulă virală sau într-un liposom.

Plasmidele şi vectorii conjugaţi

Vectorii conjugaţi au fost utilizaţi pentru a se realiza transferul

genic la hepatocite şi celulele epiteliului respirator.

ADN-ul terapeutic poate fi introdus în celulele ţintă prin legarea chimică a ADN-ului de o moleculă care se va lega de receptori celulari speciali. Aceştia vor internaliza ADN-ul în celulele ţintă.

Cromozomul artificialCromozomul artificial

La ora actuală se fac cercetări pentru introducerea La ora actuală se fac cercetări pentru introducerea celui de-al 47-lea cromozom uman artificial în celui de-al 47-lea cromozom uman artificial în celulele ţintă. celulele ţintă.

Acest cromozom ar exista în mod autonom, alături de Acest cromozom ar exista în mod autonom, alături de cei 46 cromozomi standard, fără a afecta cei 46 cromozomi standard, fără a afecta funcţionalitatea lor şi fără a determina mutaţii. funcţionalitatea lor şi fără a determina mutaţii.

Dificultatea metodei constă însă în introducerea unei Dificultatea metodei constă însă în introducerea unei structuri atât de mari în nucleul celulei ţintă. structuri atât de mari în nucleul celulei ţintă.

Limitele terapiei genice

Natura de scurtă durată a terapiei geniceADN-ul terapeutic introdus în celulele ţintă trebuie să ADN-ul terapeutic introdus în celulele ţintă trebuie să

rămână funcţional şi stabil, pentru ca terapia genică să rămână funcţional şi stabil, pentru ca terapia genică să fie o modalitate eficientă de tratament. fie o modalitate eficientă de tratament.

Problemele legate de introducerea ADN-ului terapeutic Problemele legate de introducerea ADN-ului terapeutic în genom, precum şi diviziunea rapidă a unor celule în genom, precum şi diviziunea rapidă a unor celule împiedică obţinerea efectului terapeutic pe durată împiedică obţinerea efectului terapeutic pe durată lungă de timp. lungă de timp.

De aceea este necesară introducerea ADN-ului De aceea este necesară introducerea ADN-ului terapeutic de mai multe ori pe parcursul vieţii.terapeutic de mai multe ori pe parcursul vieţii.

Limitele terapiei genice

Răspunsul imun - ADN terapeutic introdus în - ADN terapeutic introdus în organism este perceput ca o structură non-self, organism este perceput ca o structură non-self, determinând apariţia unui răspuns imun. determinând apariţia unui răspuns imun. Riscul stimulării acestui răspuns reduce Riscul stimulării acestui răspuns reduce eficacitatea terapiei genice. eficacitatea terapiei genice.

Probleme legate de vectorii virali – Utilizarea – Utilizarea virusurilor poate determina toxicitate, virusurilor poate determina toxicitate, răspuns răspuns imun şi/sau inflamator, precum şi probleme imun şi/sau inflamator, precum şi probleme legate de controlul genic. legate de controlul genic.

În 1990În 1990

Prima terapie cu transplant de gene la 5 pacienţi cu melanom.

Metoda a constat în prelevarea de limfocite de la Metoda a constat în prelevarea de limfocite de la bolnav, cultivarea acestora şi introducerea prin bolnav, cultivarea acestora şi introducerea prin transfecţie (prin intermediul retrovirusurilor) a transfecţie (prin intermediul retrovirusurilor) a genelor antitumorale. genelor antitumorale.

După această “prelucrare”, limfocitele au fost După această “prelucrare”, limfocitele au fost infiltrate în tumoră, observându-se retrocedarea infiltrate în tumoră, observându-se retrocedarea tumorii pentru o perioadă de câteva luni.tumorii pentru o perioadă de câteva luni.

Dupa Dupa 19901990

Tot limfocite au fost folosite pentru transfer de Tot limfocite au fost folosite pentru transfer de genă în deficienţa enzimatică ADA, cu genă în deficienţa enzimatică ADA, cu rezultate bune, efectul durând câteva luni, rezultate bune, efectul durând câteva luni, după care operaţiunea se poate repeta.după care operaţiunea se poate repeta.

Lupta continua……..Lupta continua……..

Până în prezent majoritatea cercetătorilor s-au Până în prezent majoritatea cercetătorilor s-au concentrat asupra transferului de gene cu concentrat asupra transferului de gene cu ajutorul retrovirusurilor în celulele stem ajutorul retrovirusurilor în celulele stem pluripotente din măduva hematogenă. pluripotente din măduva hematogenă.

Acestea sunt accesibile şi oferă oportunitatea Acestea sunt accesibile şi oferă oportunitatea generării unei varietăţi de elemente sanguine generării unei varietăţi de elemente sanguine sau macrofage pulmonare, în care se exprimă sau macrofage pulmonare, în care se exprimă genele transferate.genele transferate.

Lupta continua……..Lupta continua……..

Celulele stem infectate pot fi reintroduse la Celulele stem infectate pot fi reintroduse la pacient prin transplant autolog. pacient prin transplant autolog.

Celulele transplantate vor migra de la locul Celulele transplantate vor migra de la locul injectării şi vor exprima produşii genei nou injectării şi vor exprima produşii genei nou introduse.introduse.

Alte experimenteAlte experimente::

terapii genice la nivelul ficatului: boli în care defectul metabolic primar se oli în care defectul metabolic primar se

găseşte la nivel hepatic (de exemplu, găseşte la nivel hepatic (de exemplu, hipercolesterolemia, fenilcetonuria).hipercolesterolemia, fenilcetonuria).

Hepatocitele pot fi obţinute prin hepatectomie Hepatocitele pot fi obţinute prin hepatectomie parţială, după care sunt cultivate timp de parţială, după care sunt cultivate timp de câteva săptămâni, modificate genetic prin câteva săptămâni, modificate genetic prin intermediul vectorilor virali sau nonvirali şi intermediul vectorilor virali sau nonvirali şi apoi transplantate la animale. apoi transplantate la animale.

Alte experimenteAlte experimente::

terapii genice la nivelul ficatului: În urma unui astfel de experiment s-a observat În urma unui astfel de experiment s-a observat

că o parte din hepatocitele modificate şi că o parte din hepatocitele modificate şi introduse la şoareci prin injectare intra-introduse la şoareci prin injectare intra-splenică, au migrat în parenchimul hepatic şi splenică, au migrat în parenchimul hepatic şi au continuat să exprime produşi genici au continuat să exprime produşi genici specifici acestuia timp de un an.specifici acestuia timp de un an.

În fibroza chistică s-a reuşit cu succes s-a reuşit cu succes transferul de genă, prin intermediul unui transferul de genă, prin intermediul unui vector retroviral, în pereţii unei artere. vector retroviral, în pereţii unei artere.

Se speră ca în viitorul apropiat să se poată Se speră ca în viitorul apropiat să se poată introduce gena chiar în epiteliul alveolar introduce gena chiar în epiteliul alveolar pulmonar, pentru a împiedica tulburările pulmonar, pentru a împiedica tulburările pulmonare din cadrul bolii.pulmonare din cadrul bolii.

Alte experimenteAlte experimente::

În miodistrofia Duchenne, transferul de , transferul de gene este deocamdată doar parţial rezolvat, gene este deocamdată doar parţial rezolvat, pentru că gena pentru miodistrofină este foarte pentru că gena pentru miodistrofină este foarte lungă şi deci, greu, deocamdată, de inserat lungă şi deci, greu, deocamdată, de inserat într-un vector.într-un vector.

Alte experimenteAlte experimente::

E nevoie deE nevoie de perfecţionăriperfecţionări

RezultateleRezultatele actuale actuale sunt încurajatoaresunt încurajatoare

Exista Exista speranţa că în speranţa că în următorii ani să următorii ani să putem asista la putem asista la corectarea bolilor corectarea bolilor ereditare.ereditare.

Ce va urmaCe va urma??

VVă ă mulţumesc!mulţumesc!