Izolarea culturilor pure de microorganisme

Procedee de izolare a culturilor pure- metode bazate pe principiul separării fizico-mecanică a celulelor;- metode biologice

Procedee fizice de izolare a culturilor pure

I. Metode prin răspândire – sunt larg folosite deoarece sunt uşor de executat, având ca principiu răspândirea celulelor, aflate în populaţii eterogene în medii naturale, prin diluare în medii lichide sau răspândire mecanică pe suprafaţa mediilor sterile solidificate.

II. Metodele de diluare presupun diluarea probei în ser fiziologicsteril prin tehnica diluţiilor decimale, astfel încât numărul de celule într-o micropicătură din ultima diluţie să fie redus.

Metode prin răspândire

1. Metoda Koch 2. Metoda de strii3. Metoda Drigalski4. Metoda de

răspândire în plăci

Tehnica de izolare a culturilor pure prin răspândire (metodaKoch)

Bacteriile formează colonii cu următoarele aspecte:

tip S (smooth – neted lucios)

tip R (rough – rugos, aspru, cutat)

tip M (aspect mucoid).

Caracterele coloniale

Metode scarificate de izolare

Obţinerea culturilor pure prin răspândire pe suprafaţa mediului cu geloză

Metode scarificate de izolare

Obţinerea culturilor pure prin răspândire pe suprafaţa mediului cu geloză

Tehnica striurilor

Metode de diluare

1.Metoda Lindner (micropicături pe lamele)2. Metoda Naumov (micropicături fixate în agar)3.Inundarea suprafeţei mediului solidificat4.Izolare cu ajutorul micromanipulatorului

Metode biologice de izolare

•Metoda Burri asigură separarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen pentru desfăşurarea funcţiilor vitale (tipul respirator). •Folosirea mediilor selective, medii cu o compoziţie care favorizează dezvoltarea unui grup restrâns de microorganisme aparţinând aceluiaşi gen sau aceleiaşi specii.•Izolare în bază de termorezistenţă

Izolarea culturilor pure prin metode biologice

Metodele de conservare a bacteriilor în CNMN

.

Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene

• Tema:

Valorificarea şi conservarea resurselor microbieneprin biotehnologii competitive clasice şi moderne

• Etapa 2006: Standardizarea procedurii de conservare

a tulpinilor de fungi păstrate în CNMNExecutant responsabil: dr.Sîrbu Tamara

Scopul cercetărilor: Crearea condiţiilor corespunzătoare standardelor internaţionale de conservare şi valorificare a fondului genetic microbian, în special al

micromicetelor din Colecţie

Sarcini specifice:- Selectarea metodelor optime de conservare a fungilor microscopici.- Selectarea mediilor de protecţie necesare pentru liofilizarea tulpinilor de fungi depozitate în CNMN.- Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a micromicetelor- Selectarea mediilor de regenerare a culturilor supuse liofilizării.- Studiul influenţei păstrării de lungă durată asupra viabilităţii şi stabilităţii proprietăţilor tulpinilor de fungi de interes biotehnologic.

Selectarea mediilor de protecţie optime pentru

liofilizarea micromicetelor

Mediul optim pentru liofilizarea micromicetelor din genurile

Aspergillus şi Penicillium

lapte degresat + 7% glucoză

0 20 40 60

peptona lactozata

lapte degr.+7%gluc.

lapte degresat

gelatina1%+zaharoza 10%

glucoza 20%

zaharoza 20%

Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a fungilor microscopici

Temperatura de congelare:majoritatea culturilor studiate manifestă un procent mai mare al viabilităţii în cazul aplicării temperaturii de congelare de –400C. Exemplele cele mai elocvente sunt rezultatele experienţelor cu Penicillum corylophilum, Penicillium vermiculatum şi Aspergillus flavus.

0

30

60

90

t= -40 C t= -20 C

Determinarea parametrilor optimi de liofilizare a fungilor microscopici

Diferenţa dintre viabilitatea sporilor în cazul concentraţiei iniţiale de 1012 şi 1013 este foarte elocventă. Ex: mărirea concentraţiei sporilor de Aspergillus flavus de la 2,44 x 1012 la 1,4 x 1013 scade viabilitatea sporilor de la 83,6% la 10,7%.Se recomandă concentraţia sporilor de 1010- 1012 cel/ml.

0

20

40

60

80

100

A.flavus P.expansum P.verrucosum

Selectarea mediilor optime de regenerare a

culturilor liofilizate de fungi. Regenerarea culturii

Penicillium expansum 1- cultură pe malţ-agar

regenerată în mediul Czapec, 2- cultură pe malţ-agar

regenerată în malţ 3- cultură pe mediul solid Czapec

regenerată în mediul Czapec4- cultură pe malţ-agar

regenerată în apă distilată

4

12

3

Evaluarea viabilităţii şi stabilităţii proprietăţilor tulpinilor de micromicete în procesul păstrării

La tulpinile din genul Penicillium se observă păstrarea peste 1 an al nivelului de viabilitate înregistrat îndată după liofilizare, pe cînd tulpinile din genul Aspergillus manifestă o scădere lentă a viabilităţii.

Studiul particularităţilor morfologice ale culturilor liofilizate comparativ cu cele păstrate pe medii solidificate înclinate indică asupra păstrării particularităţilor morfo-culturale ale tulpinilor. Culturile liofilizate, după un an de păstrare, formează colonii identice cu cele iniţiale: de aceeaşi mărime, formă, grad de sporulare. Această afirmaţie este valabilă pentru tulpinile din diferite genuri: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trihoderma, Alternaria.

Evaluarea viabilităţii şi stabilităţii proprietăţilor tulpinilor de micromicete în procesul păstrării

Activitatea antimicrobiană a tulpinilor

Aspergillus alliaceus şi Aspergillus flavus Bacillus

subtilisXantomonas campestris

Schema procesului de conservare prin liofilizare şi regenerare a culturilor de micromicete

Pregătirea culturii şi acumularea biomasei la cultivare pe mediu malţ-agar solidificat înclinat timp de 14 zile

Pregătirea mediului protector: lapte degresat+7%glucoză

Suspendarea sporilor de micromicete în mediul protector în concentraţie de 1010- 1012 spori/ml şi distribuirea a câte 2 ml suspensie în fiole

Congelarea la to= - 400C,

Uscarea masei congelate în instalaţia de sublimare

Sudarea fiolelor Păstrarea fiolelor

la to= -4oC

Regenerarea culturii prin adăugarea a 2 ml de mediu lichid Czapec

Îmbogăţirea culturii prin trecerea

conţinutului fiolelor pe mediul malţ-agar

Fig. 10. Activitatea antimicrobiană a tulpinii Ps. aureofaciens B1249 faţă de cultura-test

Corynebacterium michiganense până şi după liofilizare.

Fig. 11. Activitatea antimicrobiană a tulpinii Ps. aureofaciens B-1249 faţă de cultura-test

Fusarium solani până şi după liofilizare.

Fig.12. Menţinerea tulpinilor de microorganisme din cadrul CNMN sub un strat de ulei mineral.

Studiul antagonismului microbian

Antagonismul bacterian

FACTORII CARE DETERMINĂ ACTIVITATEA MICROBIANĂ

-Compoziţia chimică a mediului;-Structura anatomică ;-Valoarea pH-ului-Indicele de activitate al apei (aw)

Valori limită de pH pentru creşterea microbianăGrupe de

Microorganisme

Valori minime Valori optime Valori maxime

Drojdii 1,5 – 3,5 4 – 6,5 8 – 8,5Mucegaiuri 1,5 – 3,5 4,5 – 6,8 8 – 11Bacterii 4,5 6,5 – 7,5 11Staphhylococcus aureus 4,2 7 – 7,5 9,3Escherichia coli 4,4 6 – 7 9,0Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6 – 7 8,0Bacillus sp. 5 - 6 6,8 – 7,5 9,4 – 10Clostridium botulinum 4,8 8,2Clostridium perfingens 5,5 6 – 7,6 8,5Clostridium sporogenes 5 – 5,8 6,8 – 7,5 9,4 – 10Acetobacter sp. 4 5,4 – 6,3 9,2Bacterii lactice 3,2 3,5 – 6,5 8Lactobacillus acidophilus 4 – 4,6 5,8 – 6,6 6,8Lactobacillus plantarum 3,5 5,5 – 6,5 8Leuconostoc cremoris 5 5,5 - 6 6,5

Valori minime pentru awLimite de aw

Microorganisme Produse alimentare

1 – 0,95 Bacterii gram negative, bacterii sporulate, unele drojdii

Produse cu 20% zahăr sau7% sare (salamuri, produse de panificaţie)

0,95 – 0,91 Micrococi, bacterii lactice, bacterii sporulate, forme vegetative, sare

Produse cu 55% zahăr sau12% sare (brânzeturi, salamuri afumate)

0,91 – 0,87 Majoritatea drojdiilor Produse cu 65% zahăr sau 15% sare

0,87 – 0,80 Majoritatea mucegaiurilor Făina, orez cu 15 – 17 % apă

0,80 – 0,70 Majoritatea bacteriilor halofile Alimente cu 26% sare

0,75 – 0,65 Mucegaiuri xerofite Produse cu 10% apă0,65 – 0,60 Dojdii osmofile Fructe uscate, cu 15 -20% apă.

0,50 Nu se dezvoltă

microorganisme

Caramele cu 8% apă

0,40 Nu se dezvoltă

microorganisme

Produse cu 3 – 5 % apă

0,20 – 0,30 Nu se dezvoltă

microorganisme

Produse cu umiditate < 5%