Home > Documents > Tehnici de Laborator in Micologia Medicala - Dr. Mihai Mares

Tehnici de Laborator in Micologia Medicala - Dr. Mihai Mares

Date post: 21-Jul-2015
Category:
Author: aloisia13
View: 240 times
Download: 9 times
Share this document with a friend
Embed Size (px)
of 264 /264
  Sub re Dr. Şef de  Depart Univer  Labora Public Univer “Ion Io Editura Iaşi, R  Te în m acţia: ihai Mar ucr ări mentul de M itatea “Petre orul de Mico , Facultatea itatea de Ştii escu de la B  PIM mânia nici de icologi ş icrobiologie, Andrei”, Iaşi logie – Micot e Medicină ţe Agricole ad”, Iaşi 200 labora  medi Facultatea de oxicologie, eterinar ă, i Medicină 7 or ală Medicină D epartamentul eterinar ă ntar ă, de Sănătate
Transcript

Sub redDr. Mef de lDepartaUniversLaboratPublicUniversIon IonEdituraIai, Ro Tehn mdacia: Mihai Marelucrri amentul de Msitatea Petre torul de Mico, Facultatea dsitatea de tiinnescu de la Br a PIM omnia hnici de icologiae icrobiologie, Andrei, Iailogie Micotde Medicin Vne Agricole rad, Iai 200laborata medicFacultatea de toxicologie, DVeterinar,i Medicin V7 torcal Medicin DeDepartamentulVeterinarentar, l de Sntate CSsaSad EowIaCopyright 20ocietatea Rom Nici o pau difuzat n .R.M.M.M. Tdresate n scriSocietaOP 6, CIai R Editor ving. Ion ComenzSocietaOP 6, CIai Re-mail: www.fu ditura PIM os. tefan celwww.pimcopyai Romnia DescrTehni I. Mar 543.0582.2007mn de Micparte a acesteiorice form sToate cererile dis pe adresa:atea Romn dCP 1356Romnia volum i designu Ailinci zi la: atea Romn dCP 1356Romnia [email protected] Marenr. 11.ro rierea CIP a Bici de laboratMihai MareBibliogr. Index. ISBN 978-9re, Mihai (ed6 8 IIcologie Medici publicaii nusau prin orice de reproducerde Micologie Mgn copert: de Micologie Mngi.ro Bibliotecii Nator n micoloe. Iai : PIM973-716-677-d.) cal i Micotou poate fi repromijloace, frre a materialelMedical i MMedical i Maionale a Roogia medicalM, 2007 7 oxicologie odus, transm acordul scrislor publicate vMicotoxicologMicotoxicologomniei / sub red.: mis, stocat s al vor fi gie gie III Autori Ingrid Cezara Apetrei Doctor medic veterinar, doctorand Laboratorul de Microbiologie Imunologie Departamentul de Sntate Public Facultatea de Medicin Veterinar Universitatea de tiine Agricole i Medicin VeterinarIon Ionescu de la Brad, Iai Olimpia Bazgan Doctor medic veterinar, doctor n Medicin Veterinar Profesor universitar Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie Departamentul de Sntate Public Facultatea de Medicin Veterinar Universitatea de tiine Agricole i Medicin VeterinarIon Ionescu de la Brad, Iai Petru Cazacu Doctor medic veterinar, doctorand Laboratorul de Histologie Departamentul de tiine Fundamentale Facultatea de Medicin Veterinar Universitatea de tiine Agricole i Medicin VeterinarIon Ionescu de la Brad, Iai Maria Dan Doctor medic, doctor n Medicin Laboratorul de MicrobiologieInstitutul de Boli Cardiovasculare G. Georgescu Iai Bogdan Doroftei Doctor medic, doctor n MedicinPreparator universitar Clinica II Obstetric - Ginecologie Facultatea de MedicinUniversitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai IV Luminia - Iuliana Malic Doctor medic veterinar, doctorand Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie Departamentul de Sntate Public Facultatea de Medicin Veterinar Universitatea de tiine Agricole i Medicin VeterinarIon Ionescu de la Brad, Iai Magdalena Mare Medic dentist, doctorand Preparator universitar Departamentul de Protetic Facultatea de Medicin Dentar Universitatea Petre Andrei, Iai SC Dentomedica SRL Mihai Mare Medic dentist, doctor medic veterinar, doctor n Medicin ef de lucrri Departamentul de Microbiologie Facultatea de Medicin Dentar Universitatea Petre Andrei, Iai Laboratorul de Micologie Micotoxicologie Departamentul de Sntate Public Facultatea de Medicin Veterinar Universitatea de tiine Agricole i Medicin VeterinarIon Ionescu de la Brad, Iai V Volum editat cu sprijinul BRD-GSG VI Cuprins Cap. 1 Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice ............................................................................................... 1 1.1. Sngele ..................................................................................................... 2 1.1.1. Recoltarea sngelui pentru hemocultur ................................... 3 1.1.2. Numrul de hemoculturi i momentul prelevrii ...................... 4 1.1.3. Volumul de snge ce urmeaz a fi nsmnat .......................... 4 1.1.4. Medii de cultur ........................................................................ 4 1.1.5. Durata incubrii i prelucrarea hemoculturilor ......................... 7 1.1.6. Semnificaia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioi ........ 8 1.2. Mduva osoas hematogen ..................................................................... 8 1.3. Lichidul cefalo-rahidian ........................................................................... 8 1.4. Raclatul cornean ....................................................................................... 9 1.5. Prelevatul otic .......................................................................................... 9 1.6. Fluidele intraoculare ................................................................................ 9 1.7. Firele de pr ............................................................................................. 9 1.8. Fragmentele unghiale i scuamele cutanate ............................................. 9 1.9. Secreiile respiratorii joase ..................................................................... 10 1.10.Aspiratul pulmonar ................................................................................ 11 1.11.Biopsia pulmonar ................................................................................. 11 1.12.Alte fluide organice normal sterile ......................................................... 11 1.13.Secreiile purulente din abcese subcutanate sau din plgi deschise ....... 12 1.14.Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale................................. 12 1.15.Urina ...................................................................................................... 12 1.16.Secreiile vaginale .................................................................................. 14 1.17.Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin ................... 15 1.18.Fragmentele tisulare biopsice ................................................................. 15 1.19.Tehnica aspiraiei cu ac fin .................................................................... 15 Bibliografie selectiv ............................................................................. 18 Cap. 2 Tehnici de microscopie direct ................................................................. 21 2.1.Coloraia negativ cu tu de India .......................................................... 22 2.2. Coloraia negativ cu mercurochrom 2% i tu de India ....................... 232.3. Coloraia cu lactofenol i albastru de anilin ......................................... 242.4. Coloraia cu hidroxid de potasiu i cerneal Parker ............................... 252.5. Clarificarea cu hidroxid de potasiu i dimetil sulfoxid .......................... 252.6. Coloraia cu calcofluor alb i KOH 10% ............................................... 262.7. Coloraia Gram ....................................................................................... 28 2.8. Coloraia Gram - calcofluor alb ............................................................. 30 2.9. Coloraia Giemsa.................................................................................... 31 2.10.Coloraia May-Grunwald-Giemsa .......................................................... 32 2.11.Coloraia Wright .................................................................................... 34 2.12.Coloraia cu mucicarmin Southgat ......................................................... 35 2.13.Coloraia Musto ..................................................................................... 36 Bibliografie selectiv ............................................................................. 39 VII Cap. 3 Medii de cultivare ...................................................................................... 41 3.1.Generaliti ............................................................................................. 41 3.2.Compoziia mediilor de cultur .............................................................. 423.3.Prepararea i sterilizarea mediilor .......................................................... 43 3.4.Controlul de calitate i pstrarea mediilor ............................................. 44 Medii de cultivare .................................................................................. 46 Bibliografie selectiv ............................................................................. 96 Cap. 4 Tehnici de nsmnare i transplantare ............................................... 101 4.1. Tehnici uzuale ...................................................................................... 101 4.2. Tehnici speciale.................................................................................... 103 4.2.1. Tehnica de purificare a izolatelor levurice .............................. 103 4.2.2.Tehnica nsmnrii levurilor pe Agarul cu fin de porumb i tween 80 ......................................................... 105 4.2.3.Tehnica de cultivare pe suporturi transparente ...................... 105 4.2.4.Tehnica de cultivare n pictur suspendat ....................... 106 4.2.5.Tehnica de cultivare pe bloc de geloz................................. 106 4.3. Tehnici de transplantare ....................................................................... 107 Bibliografie selectiv ........................................................................... 108 Cap. 5 Tehnici deexaminare microscopic a fungilor din culturi ................. 109 5.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin(levuri).............................................................................................. 109 5.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin(fungi filamentoi) ............................................................................ 110 5.3. Preparatul extemporaneu cu band adeziv ......................................... 110 5.4. Lutarea preparatelor extemporanee ...................................................... 111 Bibliografie selectiv ........................................................................... 112 Cap. 6 Tehnici de histopatologie ........................................................................ 113 6.1. Obinerea probelor ............................................................................... 113 6.2.Examenul macroscopic ........................................................................ 113 6.3. Fixarea .............................................................................................. 1136.3.1. Formolsoluie 10% tamponat pH 6,8 ................................ 1156.3.2. Fixatorul Bouin ..................................................................... 116 6.3.3. Fixatorul Hollande ................................................................ 116 6.4. Procesarea esuturilor ........................................................................... 117 6.4.1. Deshidratarea ........................................................................ 1186.4.2. Clarificarea ........................................................................... 1196.4.3. Impregnarea cu parafin ....................................................... 119 6.4.4. Includerea ............................................................................. 1206.4.5. Secionarea............................................................................ 1206.4.6. Etalarea seciunilor ............................................................... 1216.4.7. Colorarea .............................................................................. 1236.5. Montarea .............................................................................................. 148Index VIII 6.6. Etichetarea i arhivarea ........................................................................ 150Bibliografie selectiv ........................................................................... 151 Cap. 7 Tehnici de seromicologie ......................................................................... 153 7.1 Fungitell ........................................................................................... 153 7.1.1. Principiul testului .................................................................. 1537.1.2. Materiale furnizate mpreun cu testul Fungitell .................. 1547.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul .......... 154 7.1.4. Atenionri i precauii ......................................................... 1557.1.5. Pstrarea reactivilor .............................................................. 1557.1.6. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor ............................ 1557.1.7.Tehnic de lucru ................................................................... 1557.1.8. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 157 7.1.9. Controlul calitii .................................................................. 1587.1.10.Limite ................................................................................... 158 7.1.11.Interferarea cu alte substane ................................................ 159 7.1.12.Valori ateptate ..................................................................... 159 7.2. Platelia Aspergillus ............................................................................ 160 7.2.1. Principiul testului .................................................................. 160 7.2.2. Materiale furnizate odat cu kitul ......................................... 160 7.2.3. Materiale necesare, dar nefurnizate odat cu kitul ............... 161 7.2.4. Conservarea reactivilor desigilaii a celor reconstituii ............................................................ 161 7.2.5. Tehnica de lucru ................................................................... 162 7.2.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 164 7.3. Platelia Candida Ac ............................................................................ 165 7.3.1. Introducere ............................................................................ 165 7.3.2. Principiul testului .................................................................. 165 7.3.3. Materiale furnizate mpreun cu kitul ................................... 165 7.3.4. Materiale necesare dar nefurnizate impreun cu kitul .......... 166 7.3.5.Tehnica de lucru ................................................................... 166 7.3.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 167 7.4. Platelia Candida Ag ........................................................................... 169 7.4.1. Introducere ............................................................................ 169 7.4.2. Principiul testului .................................................................. 169 7.4.3. Materiale furnizate odat cu kitul ......................................... 169 7.4.4. Materiale necesare dar nefurnizate odat cu kitul ................ 1697.4.5. Tehnica de lucru ................................................................... 170 7.4.6. Maniera de calcul i interpretarea rezultatelor ...................... 171 7.5. Identificarea speciei Candida dubliniensisprin latex-aglutinare .............................................................. 172 Bibliografie selectiv ........................................................................... 173 Cap. 8 Teste biochimice i fiziologice ................................................................. 179 8.1. Fermentarea zaharurilor ...................................................................... 179 8.2. Capacitatea de asimilare a surselor de carbon ..................................... 180 8.3. Capacitatea de asimilare a surselor de azot ......................................... 180 IX 8.4.Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la levuri ................ 180 8.5. Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la dermatofii ........ 181 8.6.Testarea rezistenei la cicloheximid ................................................... 181 8.7. Producerea de fenol-oxidaz ................................................................ 182 8.8. Testarea producerii altor enzime .......................................................... 182 8.9. Testul de depistare a necesitilor nutritive speciale ............................ 182 8.10.Testul de cultivare pe Agar BCP-lapte-glucoz. .................................. 183 8.11.Testul de perforare a firului de pr in vitro. ......................................... 184 8.12.Testul de cultivare pe boabe de orez .................................................... 185 8.13.Testul de filamentare (testul de blastez sau germ-tube test) ............... 185 8.14.Testul de termotoleran / termostimulare ........................................... 186 Bibliografie selectiv ........................................................................... 188 Cap. 9 Tehnici de micologie molecular ............................................................ 191 9.1. Extracia ADN-ului pentru PCR .......................................................... 191 9.2. Extracia ADN-ului cu ajutorul kit-uluiHigh Pure Template Preparation Kit (levuri) .................................... 191 9.3. Extracia ADN-ului prin crioprecipitare (fungi filamentoi) ............... 192 9.4. Controlul calitii acizilor nucleici extrai ........................................... 193 9.5. Identificarea speciei Candida dubliniensis prin PCR duplex ............... 194 9.6. Identificarea molecular a levurilor prin PCR isecvenializarea regiunilor ITS ......................................................... 196 9.7. Reactivi utilizai n tehnicile de biologie molecular ........................... 200 Bibliografie selectiv ........................................................................... 201 Cap. 10 Tehnici de evaluare a sensibilitii la antifungice ............................... 203 10.1.Tehnica de lucru pentru levuri ............................................................. 203 10.2.Tehnica de lucru pentru fungi filamentoi ........................................... 206 10.3.Testarea sensibilitii la antifungice prin metodadifuzimetric Kirby-Bauer ................................................................ 208 Bibliografie selectiv ........................................................................... 210 Cap. 11 Tehnici de aeromicologie ...................................................................... 211 11.1.Caseta AIR-O-CELL ........................................................................ 212 11.2.Caseta MICRO-5.................................................................................. 214 11.3.Caseta CYCLEX-D .............................................................................. 215 11.4.Caseta BIOCELL ................................................................................. 215 11.5.Caseta LARO 100 ................................................................................ 216 11.6.Impactorul Zefon Z-A6 ........................................................................ 217 11.7.Dispozitivul CIP 10M .......................................................................... 219 11.8.Aprecierea ncrcturii fungice aeropurtate ......................................... 224 11.9.Tehnici de recoltare/examinare direct a probelor ............................... 225 11.9.1. Banda adeziv BIO TAPETM (Zefon International) ............ 225 11.9.2. Recoltarea fragmentelor inerte .............................................. 226 11.9.3. Recoltarea cu ajutorul tamponului tip exsudat ...................... 226 Bibliografie selectiv ........................................................................... 227 Index X Cap. 12 Norme generale de biosecuritate nlaboratoarele de micologie medical ................................................ 229 12.1.Clasificarea fungilor n funcie de clasele de risc biologic .................. 229 12.2.Norme generale de biosecuritate .......................................................... 230 12.2.1. Tehnici de laborator folosite n zona de lucru ....................... 232 12.3.Metode de protecie primar ................................................................ 232 12.3.1. Hote de protecie biologic ................................................... 232 12.4.Substane decontaminante folosite nlaboratoarele de micologie medical ................................................. 233 12.5.Msuride protecie mpotriva substanelor chimice ........................... 235 Bibliografie selectiv ........................................................................... 236 Anex .................................................................................................................... 237 Index ..................................................................................................................... 245 XI Prefa Fungiimicroorganismefamiliaretuturorprinomniprezenaidiversitatea lor, au fost considerai mult timp inofensivi pentru om, singurele manifestri induse de acetiacandidozelesuperficialeidermatofitozeleavndunprognosticvital favorabil. Odat cu individualizarea micologiei medicale ca tiin de sine stttoare n cadrulmicrobiologiei,nprimajumtateasecoluluitrecut,iintensificrii investigaiilornacestdomeniu,auaprutdatedincencemaicerteprivind implicareafungilorntr-oseriedeentitinosologicecarepotfigrupatenmicoze (superficiale, profunde, sistemice), micotoxicoze i alergoze.ncondiiileactuale,cndorganismeleumanesuntsupuseintervenieia numeroifactoriagresivicareledestabilizeazhomeostaziaileinducmodificri reactivedetrimentale,referindu-nelaposibilitateaimplicriiuneispeciifungicesaua alteia n determinarea unor entiti morbide, aseriunea c practic, putem ntlni orice, oriundeestectsepoatedeveridic.Limitadintrepatogeninepatogen,dintre colonizare i oportunism, este extrem de labil, neexistnd practic o delimitare strict. Fungiconsideraicucca.12deceniinurmcanepatogeni,existndnmediul ambiantdoarcabanalicontaminani,suntastzirecunoscuicaagenipatogeni redutabilincazulgazdelorimunocompromise.Fungiipatogenireprezintastzio provocarepentrulumeamedical,attdinpunctdevedereepidemiologic (augmentareaincideneimicozelorinvazive),ctidiagnosticsauterapeutic.Se considercaproximativ5%dintredeceseleintraspitalicetisedatoreazuneicauze saucomplicaiifungice.Micozeprecumaspergilozainvaziv,zygomicozelesau scedosporiozele sunt responsabile de un numr crescnd de decese prin diagnosticarea adeseori dificil i terapia extrem de costisitoare i de multe ori ineficace. Scopul prezentului volum este de a pune la dispoziia medicului de laborator i clinicianuluiosuitdetehniciutilendiagnosticareaimanagementululterioral micozelor.Amncercatprezentareaacestoransuccesiunealorlogic,ntr-omanier ctmaicomprehensibil,urmrindtoateetapeledemersuluidiagnostic,dela prelevareaprobelorpnlatesteledesensibilitatelaantifungice.Deasemenea,am imprimatlucrriiuncaracterdeghidpractic,reducndlamaximconsideraiile teoretice.Inevitabil,uneletehnicisauproceduriaufostomise,fiepentruanu suprancrcatextulcuinformaieredundant,fiedincauzaperformanelorreduseale acestora. Bineneles, varianta propus este perfectibil, iar sugestiile cititorilor avizai vor sta la baza unei eventuale noi ediii. Sperananoastr,aautorilor,estecaacestghidsaducoviziuneunitarn micologia clinic din Romnia i s contribuie la ameliorarea capacitii de diagnostic icontrolamicozelor,attacelorsuperficiale,darmaialesacelorinvazive,cu prognosticinfaust.Salvareaiameliorareacalitiivieiipacienilorcritici,printr-un diagnosticetiologiccorectiomonitorizareriguroasaterapieiantifungice,au reprezentat argumentele primordiale ale acestui demers publicistic. Autorii Iai, iulie 2007 Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 1 Capitolul1 Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare ecoltareasauprelevareaprobeloresteoaciunedeosebitdeimportant pentrudiagnosticuldiverselormicozeinternesausuperficiale,eafiindo etap critic a acestui demers. Modul de prelevare a probelor i operaiunile ulterioare la care acestea vor fi supuse sunt specifice fiecrui situs de recoltare i pot reprezenta tot atia factori limitativi pentru un diagnostic eficient n cazul executrii lor incorecte. Serecomandcaprelevareaprobelorsfierealizatdepersonalullaboratoruluide micologie, special instruit n acest scop. Cantitatea / volumul prelevatului trebuie s fie suficientdemarepentruapermiteefectuareaexamenuluimicroscopicdirect, cultivareaieventualexamenulhistopatologicpebiopsie.Procesareaprobelorva ncepe ct mai curnd posibil dup recoltare, fr a depi timpul maxim de ateptare. Formularul de cerere pentru analize microbiologice Probeleprelevatevorfinsoiteobligatoriudeunformulardecererepentru analizemicrobiologicecarevacuprindedateledeidentificarealepacientului,tipul prelevatului,orarecoltriiiexameneledelaboratornecesare.Uneledateanamnetice (profesie,cltoriinzoneendemiceetc.)caiuneleinformaiiclinicerelevantesunt importantepentrumediculdelaboratornprocesareaoptimaprobelorivorfi furnizatedectrecliniciannacelaiformular.Formularuldecererevaconinei numele medicului, numrul de telefon, clar indicate, pentru a fi contactat n cazul unor rezultatele critice sau urgente. Tratamentele recente cu antifungice trebuie imperios specificate pentru a ajuta microbiologullainterpretarearezultatelortestelorilaefectuareaantifungigramei. Rezultateleserologiceiculturaleanterioaretrebuiedeasemeneaspecificatedacau fost efectuate. Precauii 1.Seurmeazprecauiilestandardpentrurecoltareaimanipulareaproduselor biologice. Se trateaz toate probele ca fiind potenial periculoase. 2. Dup recoltare n recipiente adecvate, probele se introduc n pungi din plastic tip ziplock, cu buzunar lateral (pentru formularul de cerere). R1Tehnici de recoltare, transport iprocesare primar a prelevatelor clinice Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 2 Recoltarea 1.Cndesteposibil,probeleserecolteaznainteaadministrriiagenilor antimicrobieni. 2.Seidentificsursaprobeiisespecificcorectzona,astfelnctncursul procesrii n laborator s fie selectat mediul de cultur adecvat. 3. Se indic cnd un microorganism particular este cutat n mod special n prob. 4. Dac o prob este recoltat prin traversul pielii intacte, aceasta se va dezinfecta cualcooletilic70%,urmatdeosoluiepebazdeiod(1-2%tincturdeiod sau10%soluiedepovidon-iod).Excesuldetincturdeiodsendeprteaz cu ajutorul unui tampon mbibat n alcool, pentru a preveni eventualele iritaii.5. Pentru recoltarea din situsuri normal sterile se utilizeaz echipament sterilizat i tehnicasepticpentruaprevenicontaminareacumicroorganismentimpul procedurilor invazive. 6.Colectareaprobelorsevafacenrecipienteermetice,sterileirezistente,cu capac filetat, care nu permit crearea de aerosoli n momentul deschiderii. 7.Seeticheteazclarrecipientuldetransportcunumelepacientului,numrulde identificare, data i ora de colectare. 8. Probele obinute prin aspiraie cu ac fin trebuie transferate ntr-un tub steril sau flacon de transport nainte de a fi trimise la laborator.9. Dac din probele fluide s-au executat frotiuri imediat dup recoltare, acestea vor fiindividualizatecorespunztorprinnotarepecaptulmatallamei.Se recomandtrimitereaa1-5frotiuripentruevaluarecitologic.Acesteasevor fixa imediat prin pulverizarea frotiului cu un fixator citologic sau se introduc n etanol 95 % pentru 20 minute. 1.1. Sngele Hemoculturaesteoimportantmetoddediagnosticcarepoateorientasau reorienta terapia antimicrobian n cazul bolilor infecioase grave. Obiectivul major al tuturormetodelordehemoculturestereprezentatdedepistareaunuinumrmicde microorganismensnge,deaceeametodeledehemoculturvariazisuntaproape propriifiecruilaborator.Indiferentdemetodaaleas,esteesenialprelevarea sngelui n condiii strict aseptice, nsmnarea acestuia pe un mediu lichid, folosirea unormetodepentrudepistareacreteriimicroorganismelornmediulichidiofaz finaldesubcultivarepeunmediusolidpentruidentificareaitestareasesibilitiila antifungice.Printrefactoriicheiepecareefuldelaboratortrebuies-istabileascse numrimetodadehemocultur,cantitateaicompoziiamediuluidecultur, numrulimomentulprelevriihemoculturilor,volumuldesngecareurmeazafi nsmnat, frecvena subcultivrilor i interpretarea rezultatelor. PrelevareasefacedirectnflacoaneledehemoculturdetipulHemoline PerformanceDuo,BacT/ALERTFA(bioMrieux)sau,mairecomandat,BD BACTECTM -MycosisIC/FMedium(BDDiagnostics).ncazulsuspectriiunor infeciifungiceculocalizareintracelularamicroorganismului(e.g.Histoplasma Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 3 Capitolul1capsulatum),tehnicadeliz-centrifugareiutilizareaflacoanelorBDBACTECTM Myco/FLyticMedium(BDDiagnostics)crescesenialansadeizolareaagentului patogen. 1.1.1. Recoltarea sngelui pentru hemocultur Sngele pentru hemoculturi trebuie recoltat prin puncie venoas periferic, astfel: 1. Se dezinfecteaz flaconul de hemocultur cu alcool izopropilic 70%, se ateapt 1 minut; 2. Se palpeaz vena; 3.Seantiseptizeaztegumentulcualcool70%,apoicutincturdeiod1-2%(sau iodofori 10%), concentric, ncepnd din centru; 4. Se ateapt s se usuce i nu se mai palpeaz vena; 5.Serecolteazsngele,iarduppunciesenlturioduldepetegumentcu alcool (acest pas nu mai este necesar dac se utilizeaz iodofori). Recoltareasngeluiprindispozitiveintravasculare,arterialesauvenoase,esteo problemcontroversat.Unelestudiicomparativearatcnuexistdiferene semnificative ntre sensibilitatea i specificitatea hemoculturilor prelevate de pe cateter iprinpuncievenoasperiferic.Factoriicareinflueneazacestrezultatfavorabil suntduratascurtamenineriicateteruluiitehnicilestrictedeasepsie.Altestudii aratc,atuncicndrezultatelentreceledouprelevrisuntdiscordante, hemoculturileprelevateprinpuncieperifericsuntmaifidelenevidenierea bacteriemiilor/fungemiiloradevratefadeceleprelevatepecateter.Cutoate acestea,existunconsensasuprafaptuluicoricehemoculturpozitivnecesiti interpretareaclinicianului,iaracestatrebuieavertizatcuprivirelaparticularitile hemoculturilor pozitive prelevate pe cateter. Multedisputearidicatiproblema nlocuiriisaunuaaculuidupflebotomiepentruinoculareasngeluinflaconulde hemocultur.Majoritateastudiiloraratcnuexistniciodiferensemnificativ statistic ntre cele dou metode, astfel c schimbarea acului nu ar fi necesar, reducnd astfel i riscul accidentelor prin nepare. O antiseptizare atent a tegumentului este mai importantdectschimbareaacului.Ometa-analizastudiilorcareaucomparatrata contaminriihemoculturilorcuifrschimbareaaculuinaintedeinoculareaartat c aceast rat este de 2,0% cnd se schimb acul, fa de 3,7% cnd nu se realizeaz schimbareaacului.Pedealtparte,reducereacontaminriihemoculturilorprin schimbareaaculuiardeterminaoeconomiedeaproximativ85000$pentrufiecare 1000 de hemoculturi. La modul ideal, pentru recoltarea hemoculturilor, ar trebui s se apleze la personal special calificat (flebotomiti). Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 4 1.1.2. Numrul de hemoculturi i momentul prelevrii Majoritatea cercettorilor sunt de acord c peste treihemoculturi n 24 ore nu determin o cretere semnificativ a rezultatelor pozitive. Trei prelevri intermitente n 24ore,dinzonedepunciediferite,crescsensibilitateaizolriiaproapede100%. Hemoculturiletrebuieprelevatepectposibilnainteainstituiriiantibioticoterapiei (dac au fost administrate antibiotice, aceast informaie trebuie luat n consideraie la interpretarearezultatelor)iconformevoluieipredictiveacurbeifebrilesau/in momentul cnd bolnavul semnaleaz apariia frisoanelor. 1.1.3. Volumul de snge ce urmeaz a fi nsmnat Majoritateaautorilorrecomandsserecoltezelaaduli10-30mldesnge pentrufiecaresetdehemoculturi.nsmnareaa20,respectiv30mlsnge,crete sensibilitatea cu 38% i 68% fa de nsmnarea a 10 ml de snge. Recoltarea a peste 30mldesngepersetdehemoculturmbuntetefoartepuinsensibilitatea hemoculturiiicontribuielainstalareaanemieiiatrogene.Lacopiiestenecesarun volum mai mic de snge datorit bacteriemiilor cu un numr mai mare de UFC/ml fa de aduli. Se recomand 1-2 ml de snge per set la nou-nscui, 2-3 ml la sugari i 3-5 ml la copii.Oraieoptimdediluieasngeluinbulionnuafostncstabilit. Majoritateaautorilorrecomandcaaceastdiluiesfientre1:5i1:10,iaruniiau artatcunraportdediluiede1:10estesuperiorceluide1:5nceeaceprivete rapiditateaisensibilitateaizolrii.Majoritateasistemelordehemoculturconin polianetol sulfonat de sodiu, care pe lng efectul anticoagulant inactiveaz i anumii ageni antimicrobieni (e.g., aminoglicozidele, polimixinele). 1.1.4. Medii de cultur Mediile pentru hemocultur prezint variaii n compoziie i de aceea studiile comparative realizate sunt greu de interpretat. Sistemeledehemoculturautomateisemiautomatecomputerizatepentru detecia rapid a microorganismelor n hemoculturi sunt utilizate n multe laboratoare.Sistemul BACTEC (Becton Dickinson Intruments Systems, Sparks, MD, SUA) se bazeaz pe detecia direct a producerii de CO2 prin prelevare seriat de eantioane degazdinflaconuldecultur,iarncameradecitireprezenaCO2estedepistatcu ajutorulluminiiinfraroii,ultravioletesauradiometric.Ctevastudiicomparativeau artatcsistemulBACTECidentificogamlargdemicroorganisme,nspecial levuriifungidimorfici,ntimpscurt.ncomparaiecusistemulIsolator,mediile BACTEC pentru fungi (BACTEC MYCO/F Lytic bottle i BACTEC high-blood-volume fungal medium) au avantajul monitorizrii automate continue, dar timpii de izolare sunt echivaleni, cu excepia tulpinilor de Histoplasma capsulatum care au fost izolate doar n sistemul Isolator. nsistemulBacT/Alert(OrganonTeknikaCorp.,Durham,NC)cretereaeste semnalizat tot prin detecia CO2, dar cu ajutorul unui detector colorimetric. BACTEC Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 5 Capitolul1iBacT/Alert,similarencompoziiabulionuluipebazdetripticaz-soiaicazein, difernsuplimentelenutritiveinconcentraiadepolianetolsulfonatdesodiu. StudiilecomparativealecelordousistemeauartatcsistemulBacT/Alerteste superior n izolarea microorganismelor, n special a stafilococilor i levurilor.BACTEC este superior bulionului cu supliment de pepton i sistemului VITAL ndepistareabacteriemiilorifungemiilor,iaraceastsuperioritatenusedatoreazmetodei de detecie. Flacoanelespecialepentrufungiartrebuiluatenconsiderarenanumite situaiiparticulare(pacieniHIVinfectai),deoarecefungiifilamentoiidimorfici necesit o atenie special. Studii recente arat c flacoanele pentru izolarea bacteriilor sunt foarte potrivite pentru cultivarea levurilor genului Candida. Sistemul Oxoid Signal (Oxoid USA, Inc., Columbia, MD) este format dintr-un singur flacon de cultur, n care presiunea CO2 degajat de creterea microorganismelor, foreazfluiduldeculturstreacntr-uncompartimentsemnal,deundepoatefi examinat microscopic i subcultivat. Dei evalurile iniiale au fost favorabile, studiile ulterioareauartatcfurnizeazunnumrcrescutderezultatefalspozitiveiare dificultinsemnalizareacreteriibacteriiloranaerobe,amajoritiilevurilor,a Hemophillusinfluenzae,bacililorgram-negativinonfermentativi,Neisseria meningitidis,Nocardiaspp.,iCorynebacteriumjeikeium.Noilemodelecareau mbuntitcompartimentuldesemnalizare(cretereavolumului)ibeneficiazde agitare, au dovedit proprieti superioare n izolarea microorganismelor. Mediiledifazice(Septi-Chek:RocheDiagnosticSystems,Nutely,NJ; HemolinePerformanceDuo:BioMerieux,Vacutaineragarslant:BectonDickinson) suntdeasemenealargutilizate.Aucalitisuperioarebulionuluisuplimentatcu pepton,suntavantajoasepentruizolareamicobacteriiloribrucelelor.nsmnarea frecventapanteipoatesfurnizezecultursuficientpentrutestareasensibilitiii identificare,astfelncttimpuldedepistareamicroorganismelorpoateficomparabil cualsistemelorautomate.FolositenasociaiecusistemulBACTECs-aobservato creterecu25%adepistriiepisoadelorbacteriemice,fadefolosireaizolata sistemului BACTEC. Metodalizeicucentrifugare(denumitanteriorDuPontIsolatortube,n prezentestecomercializatdeWampoleLaboratories,Cranbury,NJ)izoleaz majoritateamicroorganismelor,daresteindicatnspecialpentrudepistarea fungemiilor,(maialescufungidimorfici,fungifilamentoi,Malasseziafurfur),a infeciilorcumicobacteriilapacieniicuSIDAiaoportunitilor(Bartonella henselae).Sngele,prelevatntuburiculiquoid(polietilenglicolisaponin)este lizat, apoi centrifugat, iar sedimentul este nsmnat pe medii solide adecvate. Metoda esteechivalentsistemuluidifazicnizolareafungilor(chiarsuperioarnizolarea Histoplasmacapsulatum),deasemeneainizolareabacteriilor(metodalizeicu centrifugare fiind mai rapid). Unii autori nu recomand aceast metod n investigaia derutinaepisoadelorfebrilelapacieniineutropenici,datoritrateicrescutede rezultate fals pozitive.Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 6 Hemoculturileanaerobe.Setulstandarddehemoculturiconineunflacon aerob i unul cu incubare anaerob. Deoarece exist o ans mic de a izola fungi sau bacteriistrictaerobenflaconulanaerob,folosireaderutinaflaconuluicuincubare anaerob poate determina scderea sensibilitii hemoculturii. Cteva studii au artat c nultimii20deanis-aprodusoscdereaincideneiinfeciilorsistemicedeterminate de bacteriileanaerobe; pe de alt parte, tot n aceast perioad s-a produs o creterea incidenei fungemiilor. Aceste schimbri n etiologia infeciilor sistemice au nceput s pun sub semnul ntrebrii utilitatea folosirii de rutin a flaconului anaerob. Uniiautoriauartatcfolosireaadouflacoaneaerobeidoarncazuri selecionate a flaconului anaerob, a dus la creterea cu 6% a izolrii microorganismelor cusemnificaieclinic,ncomparaiecupracticastandard(unflaconaerobiunul anaerob). Date asemntoare au fost gsite lacopii i avnd n vedere cantitateamic desngecaresepoaterecoltadeobiceidelaacetipacieni,esteindicatcantreaga cantitatessensmnezenflacoaneaerobeidoarncazurilecurisccrescutsse utilizeze flaconul anaerob.Pedealtparte,utilizareaflacoaneloranaerobedeterminocretere semnificativaizolriibacteriilorstrictanaerobe.nconcluzie,laoraactualeste indicatfolosireaadouflacoaneaerobepersetincircumstanebineselecionate (e.g.,afeciuniintraabdominale,infeciiorale,neutropenii,celulite,mucturdeom) i pe cea a flaconului anaerob. Neutralizareaiinactivareasubstanelorantimicrobiene.Datorit frecventeirecoltriasngeluipentruhemoculturidelapacieniaflaisubterapie antimicrobian,pepiaauaprutprodusecarencearcsnltureposibileleefecte inhibitorii ale creterii. Sistemul BacT/Alert are variante FAN pentru flacoanele aerobe i anaerobe. Utilizarea acestora a demonstrat mbuntirea izolrii microorganismelor ncomparaiecumediilestandard,iarnouaformulamediuluiaoptimizati microscopiadirectdinhemocultur.StudiilecomparativealesistemelorBacT/Alert FANiBACTECcurezinauartatcperformanelecelordoumediisunt echivalente.

Mediilehipertonecu10%sucrozsuntutilizatepentruacreaunmediu osmotic protector, mbuntind astfel izolarea bacteriilor i fungilor cu perete defectiv din sngele pacienilor care au primit antibioticoterapie. n general, aceste medii au fost evitate n laboratoarele care utilizeaz citirea vizual a creterii datorit rezultatelor fals pozitive date de efectul hemolitic, dar pe de alt parte producerea unor mari cantiti de gazdectreanumitebacterii,poatefiutilnevideniereacreterii.Valoareaacestor medii n depistarea bacteriemiilor i fungemiilor este controversat. Unele studii arat ombuntireaizolriistafilococilor,bacililorgram-negativi(Enterobacteriaceae, Pseudomonasaeruginosa)ifungilor,daroreducereiontrzierenizolarea bacteriilor anaerobe i a Neisseria gonorrhoeae. Noilemetoderapidedeidentificareitestareasensibilitiilaantibiotice (Vitek-bioMerieuxVitek,Hazelwood,MO,USA,autoSCAN-W/A-W/A;Dade BehringMicroscanInc.,WestSacramento,Calif.;BDPHOENIXAutomated MicrobiologySystem;PCR)amicroorganismelordirectdinhemoculturilepozitive, Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 7 Capitolul1furnizeazrezultatecorectenaproximativ2-6oreipotdeterminainiierea antibioticoterapiei, schimbarea terapiei de primointenie cu o terapie mai eficient sau maipuincostisitoare.Uniiautoriauestimatoeconomiedeaproximativ158$per pacient, apreciat la pacienii la care s-a administrat un antibiotic mai ieftin sau la care afostntreruptantibioticoterapia,prinprimirearezultatelorcu24-48deoremai devreme. Metodelemoleculareau o sensibilitate i o specificitate de aproximativ 100% n identificarea bacteriilor i levurilor din hemoculturile monomicrobiene i furnizeaz rezultatele n aproximativ 2 ore. 1.1.5. Durata incubrii i prelucrarea hemoculturilor Majoritatealaboratoarelorcareutilizeazsistemeautomate,incubeaz hemoculturile5-7zile.Laboratoarelecaredeservescspitalencarefungii, PseudomonasaeruginosaigrupulHACEKsuntizolaifrecventdinsngele pacienilor,artrebuisevaluezecuatenienecesitateasubcultivrilorterminale,iar hemoculturile ar trebui incubate peste 7 zile. Dacaparesemnalizareacreteriintimpulincubrii,probaesteexaminat microscopic(frotiucoloratGram)isubcultivatpemediisolidenfunciede categoriamicroscopicobservat.ncazulobservriifungiloresteindicat subcultivareapeAgarSabouraudcuincubarela30sau37C.nsituaiancarenu suntdepistatemicroorganismepefrotiu,trebuierealizatesubcultivrioarbe,iar flaconul reintrodus la incubat. Pentrusistemelemanualededepistareacreterii,ncazulsuspiciunii fungemiilor, ar trebui realizate subcultivri oarbe la 48 ore i apoi sptmnal, pn la 30 de zile, pe Agar Sabouraud, cu incubare la 30C.Examinareamicroscopicderutin,cuajutorulcoloraieiGram,a hemoculturilor negative macroscopic dup 24-48 ore de incubare este controversat i puin indicat, datorit numrului mic de microorganisme care pot fi detectate utiliznd frotiul colorat Gram (aproximativ 105 UFC/ml). Coloraia cu acridin orange este mai sensibil,detectndntre103i104UFC/ml.Uniiautoriaucomunicatocreterede 16,8%ndepistarearapidasepticemiilorprinexaminareacuacridinorangea hemoculturilor negative macroscopic.Pentru metoda lizei-centrifugare, sngele (7,5-10 ml) este recoltat n tuburi cu saponin(lizeazhematiileiglobulelealbe).Duprecoltare,tuburileseagitde ctevaoripentrulizacomplet,iarapoisecentrifugheaz15minutela3000rpm pentru concentrarea microorganismelor. Sedimentul este aspirat i nsmnat astfel: o placcuAgarsnge-ciocolatioplaccuAgartripticaz-soia,seincubeaz3zilela 37C,apoi18zilela30C;oplaccuAgarSabouraudiunacuAgarinfuziecord-creier, 4 sptmni la 30C. Rata contaminrilor accidentale poate fi controlat printr-o bun tehnic aseptic n incinta hotei de siguran microbiologic de clas II. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 8 1.1.6. Semnificaia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioi Aspergillusspp.reprezintceamaifrecventcauzainfeciilorfungice invazive, dar este rar izolat din snge. Pe de alt parte, Fusarium spp. este izolat n 60-70%dinhemoculturilepacienilorcufusariozdiseminat.Printrefungiiemergeni implicai tot mai des n infecii invazive, inclusiv n fungemii, se numr Scedosporium spp., Alternaria spp.i Paecilomyces spp. Cuexcepiafungemiilorasociatecuprezenacateterelorvenoasecentrale, determinareasemnificaieicliniceahemoculturilorpozitivecufungi,chiarila pacieniicuhemopatiimalignereprezintoprovocare.Celemaifrecventecauzede fungemii adevrate sunt determinate de Scedosporium spp., iar prezena leucemiei sau transplantului medular reprezint un factor de risc important.SemnificaiahemoculturilorpozitivecuAspergillusspp.estencneclar.n literatur sunt doar puine cazuri documentate din punct de vedere clinic, histologic i microbiologic pentru evidenierea aspergilozei invazive cu hemocultur pozitiv cert. Osingurhemoculturpozitiv,nsistemullizeicucentrifugare,reprezintnmod obinuitunindicatoralpseudoaspergilemiei,iarnfaauneiasemeneasituaiitrebuie cutateargumentelecliniceiradiologicepentrustabilireasemnificaieiclinicea izolatului.Totui,seconsiderchemoculturilepozitivepentruAspergillus,cureal semnificaie clinic, sunt foarte rare. Candidaspp(nparticularCandidaalbicans)estefrecventizolatn hemoculturi, reprezentnd pn la 10% dintre infeciile sistemice nosocomiale; cu toate acesteaaproximativ50%dinhemoculturirmnnegativelapacieniicucandidemie. ncazulhemoculturilorpozitivecuCandidaspp,trebuiedepistatposibilasursa infeciei,iarcatetereleintravascularenlocuite.Candiduriapoateaparesecundar candidemiei. 1.2. Mduva osoas hematogen Se recolteaz prin aspiraie cu sering heparinizat, calea de acces fiind creat prinpunciesternalsaupunciacresteiiliace.Punciaserealizeazrespectndcele maiseveremsurideasepsie.Aspiratulmedular,nvolumdeminim0,5-1ml,se transferntr-untubsterilcudopdecauciuciseexpediazlalaboratornmaxim2 ore.Pe parcursul acestui interval de timp, prelevatul se menine la temperatura camerei. 1.3. Lichidul cefalo-rahidian Lichidulcefalo-rahidian(fluidulcerebro-spinalsauLCR)serecolteazprin puncierahidiannspaiileintervertebraleL3-L4,L4-L5sauL5-S1.Punciase realizeazrespectndcelemaiseveremsurideasepsieidecontaminareazoneicu povidon-iod 2%. Dup poziionarea n spaiul subarahnoidian a cateterului de puncie, LCR se colecteaz prin curgere liber, n tuburi sterile, n volum de 3-5 ml. nainte de examinare,probaseconcentreazprincentrifugarela1500rpmtimpde10minute. Supernatantulsepstreazpentrutestareaantigenic,iarsedimentulpentruculturi microscopie direct. Timp de ateptare n vederea procesrii: maxim 15 minute. Nu se refrigereaz! Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 9 Capitolul11.4. Raclatul cornean Seinstileaz1-2picturideanestezictopic,apoicuajutorulunei microchiureteoftalmologice/spatuleKimurasterile,printr-omicarescurt,se racleazzonemultipledinsegmentululcerat.Prelevatulsensmneazdirectpe mediideculturcuajutorulinstrumentuluiderecoltare,prinnepare;totodat,se pregtescfrotiuripentruexamenulmicroscopicdirect.Timpmaximdeateptare:15 minute la temperatura camerei. 1.5. Prelevatul otic Dinconductulauditivexternsepotprelevaprobecuajutorultampoanelor sterile (secreiile) sau prin raclare cu o chiuret (scuamele). Timp maxim de ateptare: 2 ore la temperatura camerei sau 24 ore la 4C. 1.6. Fluidele intraoculare Serecolteazprinaspiraiecuunacfinsterilsauprinvitrotomie,apoise transfer la laborator n maxim 15 minute pentru procesare. Volumul recomandat este de cca. 0,5 ml. 1.7. Firele de pr Serecolteazcuajutoruluneipense,depreferatsubluminUV,ncamer obscur. Se expediaz la laborator n plicuri de hrtie. Timp maxim de ateptare: 72 ore la temperatura camerei. 1.8. Fragmentele unghiale i scuamele cutanate Fragmentele unghiale se recolteaz de la nivelul jonciunii esutului sntos cu celafectat,prinraclarecuochiuretsterilsauprin cuparecuajutorulunuifoarfece, duptoaletareazoneicuapispun.Nuserecomanddecontaminareacualcool deoarecediminueazansadeizolareadermatofiilorprincultivare.Raclarease realizeazdeobiceipeparteainferioaratableiunghiale,distalsaulateral,la jonciuneazoneinormalecuceamodificat.ncazulleziunilordeleuconichie superficial,raclareavainteresasuprafaasuperioaraunghiei.Materialulrecoltatse expediazlalaboratornplicuridehrtie.Timpmaximdeateptare:72orela temperatura camerei. Lapacieniisuspectaidetineasauimpetigo,unguentelesaualtepreparate aplicatenprealabiltrebuiendeprtateprintergerecualcool.Pentrurecoltare,seva utilizaunbisturiuneascuit,opens,ochiuretVidalsauuncareurectangularde mochet. Dac leziunile sunt multiple, se va alege pentru prelevarea de probe cea mai recent,deoareceraclareascuamelorvechi,ncursdedetaareesteadesea nesatisfctoarepentrudiagnostic.Scuameletegumentareserecolteazprinraclarea zoneiactivealeziunii(deobiceiceaperiferic)cuajutoruluneichiuretesterilesau printergereapsatirepetatcuuntamponsterilpreumezitnserfiziologicsteril. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 10 Recoltarea cu tamponul este recomandat n cazul leziunilor de epidermofiie circinat ipresupunensmnareaimediataprelevatuluipemediideizolare.Recoltareacu ajutorul mochetei este mai eficient deoarece asigur concomitent abrazarea leziunii i reinerea sporilor, crescnd astfel ansele de izolare n cultur. Careurile de mochet se aplicdirectpesuprafaamediuluidecultivare,selasncontactcuacestacca.5-10 minute, dup care se ndeprteaz . Cndleziunilesuntlocalizatelanivelulunorpliuri(axilar,fesier,mamar, cruraletc.)isuntumede/inflamate,recoltareasevafacecuajutorulunuitampon pentru exsudate umectat n prealabil cu ser fiziologic, recoltarea fiind indolor. LapacieniicuPityriasisversicolor,scuameleserecolteazcelmaibine utilizndunfragmentdebandadezivtransparent(tipscotch)cucarese amprenteazleziuneaicareapoiseetaleazpeolamdemicroscopie;nlaborator, pentruefectuareaexamenuluimicroscopicdirect,sevaadugantrelamibanda adeziv o pictur de colorant, de obicei lactofenol cu albastru de anilin. 1.9. Secreiile respiratorii joase Sputapoatefiprelevatprinexpectoraiespontan(neprovocat)iprin expectoraie indus (provocat). a)ncazulexpectoraieispontane,pacientulvafisftuits-iclteasccavitatea bucalcuapdistilatsterilsaucuosoluieslabantiseptic(apdegur) anteriorcolectriisputei.Deasemenea,pacientulvafiinstruitsnu expectoreze saliva. Colectarea probelor se va realiza prin tuse profund urmat deexpectorareasecreieintr-unrecipientsteril,cucapacetan.Volumul minim recoltat va fi de 2 ml. Proba se trimite la laborator n maxim 2 ore (dac semeninelatemperaturacamerei)saun24ore(dacestepastratla temperatura de refrigerare); b)ncazulexpectoraieiinduse,pacientulvafindrumats-iperiezedinii, mucoasalingualigingiile,apoisseclteascriguroscuap.Pentru inducereaexpectoraiei,pacientulvainhalaaproximativ30-50mldesoluie cloruro-sodic3-10%,aerosolizatprinintermediulunuinebulizator ultrasonic.Sputaobinutprinexpectoraiaastfelindussecolecteazntr-un recipient steril, cu capac filetat; c) Aspiratul traheostomic Canuladetraheostomieestecolonizatntr-unintervaldecca.24oredup inserie.Aspirareaprobelorserealizeazcucateteredesuciune,iarsputa astfel obinut se colecteaz n recipieni sterili. Rezultatele trebuie corelate cu datele clinice i imagistice; d) Aspiratul endotraheal Pentru recoltare, se utilizeaz un cateter de suciune nou, iar secreia aspirat se stocheazntr-uncaptatordesputsteril.Tubulendotrahealestefrecvent colonizatcubacteriiilevuri,deaceearezultateletrebuiesfiecorelatecu constatrile clinice i cu datele imagistice. Extremitile inferioare ale tuburilor endotraheale nu reprezint probe acceptabile;e) Prelevatele bronhoscopice Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 11 Capitolul1Acesteaincludlavajulbronhoalveolar(LBA),splturabronic,periajul bronic i probele biopsice transbronhiale;Principalele etape ale bronhoscopiei:- Bronhoscopul se introduce transnazal sau transoral la pacienii neintubai sau prin sonda endotraheal la pacienii intubai. Se nainteaz cu bronhoscopul pn la nivelulunei bronhiisegmentare(pentrusplturabronic)sauauneibronhii subsegmentare (pentru LBA); - Se instileaz fracionat soluie de NaCl 0,85% steril, de obicei n volum total de pn la 150 ml, cu o sering prin canalul bronhoscopului. Se aspir uor soluia salinntr-unrecipientsterilnainteaadministrriiurmtoareifracii.Se consider clavajul obinut reprezint secreiile de la nivelul a cca. un milion de alveole i bronhiolele aferente i conine aproximativ 1 ml secreie; - Probele recoltate n flacoane sterile, n volume suficiente, se trateaz cu substane mucolitice de tipul N-acetil-cisteinei i se centrifugheaz timp de 20 minute la 1500 rpm. Timpmaxim de ateptare: 2 ore la temperatura camerei sau 24 ore la 4C. 1.10. Aspiratul pulmonar Se recolteaz prin inserarea transtoracic a unui ac n infiltratul pulmonar, sub ghidajradiologicsaucomputer-tomografic.Seaspirmaterialuldinleziune.Dac leziuneaestededimensiunimarisaudacleziunilesuntmultiple,sevorcolectamai multeprobedinzonelereprezentative.Aspiratulsetransferntr-unrecipientsterili se expediaz imediat la laborator. 1.11. Biopsia pulmonar Se efectueaz n serviciile de chirurgie toracic i vizeaz obinerea unei piese de1-3cm3esut.Dacleziuneaestededimensiunimaimarisaudacsedeceleaz leziunimultiple,serecomandrecoltareamaimultorprobedinzonelereprezentative. Probele se trimit la laborator n recipieni sterili, fr formol, protejate ntr-o compres umectat cu ser fiziologic steril. Timp de ateptare: 15 minute la temperatura camerei. 1.12. Alte fluide organice normal sterile(pericardic, peritoneal, pleural, sinovial) Serecolteazprinpuncie,nvolumedeminim5-10ml,stocndu-sen flacoane sterile. Probele se concentreaz prin centrifugare, sedimentul nsmnndu-se pe medii solide de izolare sau se transfer ca atare n flacoane coninnd medii pentru hemocultur. Timp maxim de ateptare: 15 minute la temperatura camerei sau 24 ore la 4C. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 12 1.13. Secreiile purulente din abcese subcutanate sau din plgi deschise Se preleveaz fie prin aspiraie, fie prin tamponament profund. Se recomand folosireasistemelordetransportpentrutampoane,nvedereapreveniriidesicrii materialului patogen. De la pacienii cu suspiciune de micetom, se recolteaz puroi din leziunipentrustudiereaculoriigranulelor,examenulmicroscopicdirect icultur.De la pacienii suspeci de cromomicoz se recolteaz exsudat sau cruste din leziuni pentru efectuareadefrotiurisaupreparateextemporaneenvedereadecelriicorpilor fumagoiziprinexamenmicroscopicdirect.Delapacieniicusporothricozse recolteazprobeprinamprentarealeziunilorcuajutoruluneilamedemicroscopie, frotiul obinut colorndu-se Gram, Musto sau cu calcofluor alb. n cazul criptococozei diseminate sau a celei cutanate, se recomand recoltarea de probe biopsice sau raclate dinleziunilecutanatenvedereaefecturiidefrotiuripentruexamenulmicroscopic direct. n cazul ulcerelor i nodulilor se urmeaz paii: se decontamineaz suprafaa cu soluiedepovidon-iod,sendeprteazdetritusurilesuprapuseisechiureteazbaza ulcerelor sau a nodulilor. Dac exsudatul este prezent, acesta se colecteaz cu o sering sau cu un tampon steril. Timp maxim de ateptare: 2 ore la temperatura camerei. 1.14. Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale Serecolteazcuajutorulunuitamponsteril,preumezitnserfiziologic,prin trecerearepetataacestuia,deminim10ori,pestezoneleculeziuni.Alternativ,n cazul leziunilor pseudo-membranoase sau ulcerate, se poate recurge la raclarea uoar aacestoracuajutoruluneichiuretesterile.ncazulaparatelorproteticeamovibile, prelevareaprobelorserealizeazdepefaamucozalaacestorazonapredilectde apariieabiofilmelorlevurice.Dinpungileparodontaleprelevareaprobelorse efectueazcusondaparodontal,nzonelevestibular,oral,vestibulo-distal, vestibulo-mezial, oro-distal i oro-mezial. n endodontite, probele se preleveaz cu ajutorulconurilordehrtiesterile,dediferitediametre,funciededimensiunea canalelor radiculare. Timp maxim de ateptare: 2 ore la temperatura camerei. 1.15. Urina Tehnici de recoltare (fraciunea mijlocie n timpul miciunii spontane): a) la femei: -Persoanacarerecolteazprobatrebuies-iigienizezeminilen prealabil,prinsplarecuapispun.naintederecoltare,pacientul va fi instruit n detaliu asupra manoperelor ce vor urma; -Sendeprteazlenjeriaintim,setoaleteazzonavulvo-vaginali deschiderea uretrei cu ap i spun lichid, folosind un tampon de tifon, din fa ctre spate; -Secltetezonacuapsausetergecuuntifonumed,cuaceleai micridinfactrespate.Fiecaretamponseutilizeazosingur dat; - n timpul miciunii, labiile se ndeprteaz; Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 13 Capitolul1- Se eliminun volum de aproximativ 40-50 ml urin, fr ca pacienta s-i ntrerup apoi miciunea; - Se recolteaz apoi urina din jetul urinar mijlociu, ntr-un recipient steril, avndgrijcadeschidereaacestuiasnuvinncontactcusuprafee posibil contaminate; b) la brbai:-Persoanacarevarecoltaprobatrebuiesfiecorectigienizatprin splarea minilor cu ap i spun. Dac pacientul este cel ce colecteaz urina, el trebuie s primeasc n prealabil instruciuni detaliate; -Setoaleteazglandulpenisuluiimeatulurinarprinretractarea prepuului (dac nu este circumcis) i splare cu ap i spun lichid; -Meninndu-seprepuulretractat,sencepemiciunea,lsndscurg primii mililitri de urin. Pacientul nu-iva ntrerupe emisia de urin; - Se colecteaz apoi urina din jetul urinar mijlociu, ntr-un recipient steril. c) Recoltarea prin cateterizare vezical Inserareacateteruluipentrucolectareauneiprobedeurinestengeneral descurajat.Sepoatetotuiutilizacndurinasenusepoateobinealtfelsau cnd pacientul se afl n stare critic.- Se toaleteaz deschiderea uretrei pacientului i a zonei adiacente, cu ap i spun lichid, apoi se cltete ct mai riguros; - Se introduce cateterul pn n vezic prin tehnica recomandat, funcie de sexul pacientului; - Se ndeprteaz fraciunea iniial, de 30-50 ml urin; -Secolecteazurinadinfraciuneamijlociesauterminal,ntr-un recipient steril. d) Recoltarea pe cateter preexistent Trebuie de obicei evitat datorit colonizrii uneori masive cu microorganisme a cateterelor. - Se dezinfecteaz peretele cateterului cu alcool 70%; -Sepuncioneazcateterul,ncondiiideasepsie,cuajutorulunuiac ataatlaosering.Niciodatsevarecoltaurinadinpungade colectare ! - Se aspir urina i apoi se descarc seringa ntr-un recipient steril. e) Recoltarea prin puncie suprapubian Aspiraiasuprapubiansepracticpentrudiagnosticareainfeciilorurinarela aduli,ncazulncaresesuspecteazoinfecieirezultateleprocedurilorde rutin au fost nerelevante. Aspiraia suprapubian este de asemenea utilizat la pacienii pediatrici, atunci cnd probele de urin sunt dificil de obinut. -Seradepilozitateadinzonasuprapubian(dacestenecesar)ise dezinfecteaz tegumentul cu soluie de povidon-iod; -Sepuncioneazvezica,peliniamedian,ndreptulsimfizeipubiene superioare; - Se aspir prin acul de puncie cca. 50-100 ml urin i se descarc seringa ntr-un recipient steril. Timp maxim de ateptare: 2 ore la temperatura camerei. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 14 1.16. Secreiile vaginale Serecolteazcuocaziaexaminriipereilorvaginaliiaporiuniivaginalea coluluiuterin.Sevaefectuantotdeaunanainteatueuluivaginalpentruaevita modificarea secreiilor cervicale sau vaginale prin contaminare sau manevre septice. Se efectueazcupacientapemasaginecologic,npoziieginecologic(decubitdorsal, coapselenabducie,flexatepeabdomen,gambeleflexatepecoapseisprijiniten suporturi). Valvele se aleg n funcie de mrimea vaginului pacientei. Ele sunt inegale - unamaimareialtamaimic.Introducereavalvelornvagintrebuiesfieindolor. Nusefolosetelubrifiantdacserecolteazprobepentrufrotiucitobacteriologicsau cultur. Folosirea serului fiziologic steril ca lubrifiant poate fi util n cazul examinrii unorpacientecuvaginatrofic,deoarecefaciliteazintroducereavalvelorinu modific rezultatele testelor de laborator. Se ndeprteaz cu policele i indexul minii stngi labile mici i se introduce maintivalvaposterioarculamasituatvertical,apoiprintr-omicarederotaiei naintareseaducelamaorizontal,meninndu-setraciuneaasupravalvei.Valva anterioarseintroducedirectculamasituatorizontalpnnfunduldesacvaginal anterior.Seexercitotraciunedivergentasupravalvelorpentruampiedica prindereapereteluivaginalntrevalveipentruaevideniacolulifunduriledesac vaginale.Extragereavalvelorsefacenordineinversintroduceriilor,extrgndu-se iniial valva anterioar i ulterior valva posterioar.Vizualizarea pereilor vaginali se poate obine i prin folosirea unui speculum - instrumentginecologiccarepoateficonfecionatdinplasticsaudinmetalieste alctuitdindouvalvecaresuntarticulateprintr-unurubsauecartor.Suntdemai multetipuri,mari,mici,culameegale,culameinegale,cudiversedenumiri(Cusco, Graves,Pederson,Collin).Introducereaspeculumuluisefacefieculamelesituate orizontal(maiuorlamultipare),fieculamelevertical,imprimndu-seulterior introduceriiomicarederotaieimpingere.Dupintroducereaspeculumului,se ndeprteazlamelelecuajutorulecartoruluiiseexamineazfunduriledesac vaginaleicolul.Extragereaspeculumuluisefaceapropiindlameleiefectund micarea n sens invers introducerii.Dupintroducereavalvelorsauaspeculumuluiseobservisenotezstarea mucoaseivaginaleiacolului.Normal,mucoasavaginalestedeculoareroz-trandafirie,uniform.Poatedeveniviolaceensarcinsaupalid,atrofiatdup menopauz.Semaiarenvederetroficitateamucoaseivaginale,eventualecicatrici, chisturi,noduliendometriozici,ulceraii,vegetaii,malformaiiinunultimulrnd secreiilepatologice.Acesteadifernfunciedeagentulpatogen;ncandidoze, secreiaestealb,grunjoas,ninfeciilecuTrichomonasestespumoas,aerat, abundent, iar gonococul produce o secreie galben-verzuie, fetid. Examenulcoluluivaobiectivasituarea,orientarea,forma,mrimea,aspectul exocolului, prezena unor secreii patologice, prezena unor leziuni. Normal, colul este deculoareroz,dupmenopauzestepalid,iarnsarcinestedeculoareviolacee (semnulJaquemier).ncazdeinflamaii,mucoasaestehiperemiat.Pesuprafaa colului se mai pot observa chiti Naboth, focare endometriozice sau noduli fibromatoi.Pentru a fi ct mai concludent, prelevarea trebuie s respecte anumite condiii:- prelevarea se face naintea instituirii tratamentului antimicrobian sau antifungic; Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 15 Capitolul1- nu se folosesc creme vaginale sau ovule cu cel puin 2 zile nainte; - nu se folosesc irigaii vaginale cu cel puin 24 de ore nainte; - prelevarea nu se realizeaz n prezena sngelui n vagin; - se folosesc recipiente sterile, pentru a preveni contaminarea probelor; - evitarea contactului cu substane antimicrobiene a produsului patologic; - n unele cazuri trebuie folosite medii de transport sau lichide conservante; -recipientele de transport se nchid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului i a personalului care manipuleaz produsul biologic; - produsul va fi nsoit de un bilet de trimitere completat corect; - probele vor fi etichetate i transportate la laborator n cel mai scurt timp posibil.Secreiaserecolteazcuajutorulvalvelorsauaspeculumului,nelubrifiate, folosindmicitampoanedevatmontatepepenseport-tamponsaupipeteabsorbante. Instrumentarultrebuiesfiesteril.Tampoaneledevatpotfiiniialumezitenser fiziologic.Primarecoltaresefacedinfunduldesacposterior.Produsulrecoltatse etaleazpeolamnstratsubire,seaplicopicturdeserfiziologic,eventualo picturdealbastrudemetileniapoiolamel.Adouaprelevareserealizeazn acelai mod, iar dup etalarea pe lam se aplic o pictur de KOH 10%, apoi lamela. A treia recoltare se realizeaz cu o baghet steril sau cu un tampon pentru exsudate i presupune tergerea fundului de sac posterior cu vrful acestora. Probeleseexpediazlalaboratornmaxim2ore(stocarelatemperatura camerei). 1.17. Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin naceastgrupincludemprelevatelebalano-prepuiale(pseudo-membranele candidozice),secreiaprostatic,aspiratulprostaticibiopsiatesticular.ncazul leziunilorbalano-prepuiale,recoltareaprobelorserealizeazfacilprintergere repetat cu un tampon steril de vat, umectat n prealabil cu ser fiziologic.Secreiaprostaticseobineprinefectuareaunuimasajdigitaltransrectal. Colectarea probelor se realizeaz n tuburi sterile sau cu ajutorul unui tampon steril i vafiprecedatobligatoriudetoaletareapenian.Detectareaecograficaabceselor prostatice permite recoltarea de probe prin aspiraie cu ac fin. Aspiratul de prostat se trimite n recipieni sterili. Biopsia testicular se efectueaz n servicii chirurgicale, n condiii de asepsie i antisepsie depline, iar probele se trimit la laborator n recipiente sterile (cele pentru cultur) sau coninnd fixator Bouin (cele pentru diagnostic histopatologic). 1.18. Fragmentele tisulare biopsice Serecolteazntimpulinterveniilorchirurgicaleisetransportnveliten tifon steril umectat cu ser fiziologic, n containere sterile. Timp maxim de ateptare: 15 minutelatemperaturacamerei.Fragmenteledeesutsuspectateaprovenidintr-un focar de zygomicoz nu se mojareaz, nu se tritureaz, deoarece se distruge miceliul i crete enorm riscul de a obine culturi negative. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 16 1.19. Tehnica aspiraiei cu ac fin Aspiraiacuacfin(AAF)esteutilpentrudiagnosticulleziunilorcaresunt uorpalpabile,cumarfiexcrescenelepielii,leziuniledeformantealeesutului subcutanat,tiroid,limfonoduri,glandesalivareisni.Aspiraiaghidatprintehnici imagisticecumarficomputer-tomografiasauultrasonografiapermiteobinereade probeincazulleziunilororganelorinternecapulmonul,organeleabdominalei retroperitoneale,prostataetc.Risculsczutalcomplicaiilorpermiteexecutareaein ambulatoriu.AAFesteindicatilapacieniidebilitai,culeziunimultiple,fiindo tehnic minim invaziv. Acelepentrupuncievoraveauncalibrustandardde22-24Gilungimede 2,5-4cm.Lungimeaicalibrulaculuitrebuiesfieadecvatemrimii,profunzimii, zonei i consistenei intei. Pentru leziunile subcutanate mici, acele de calibru 23G i lungime de 2,5 cm sunt ideale, dei n leziunile profunde sunt necesare ace mai lungi i cu diametru mai mare. Acele fine sunt de asemenea recomandate pentru copii, i pentru organele vascularizate, cum ar fi tiroida. Seringile recomandate n aceast tehnic sunt cele single-use, cu volum util de 10ml.Seringiletrebuiesfiedecalitate,capabilesproducopresiunenegativ adecvataspirrii.Seringilecucapacitatede5mlpotfiutilizatepentruorganele vascularizateprecumtiroida.Unfactorimportantesteadaptareaetanaaculuila captulseringii.Opotrivireneglijentaacestuiapoatecompromiteprocedura. Manipulareapistonuluiseringiiserealizeazcuomn,iarcucealaltsefixeaz leziunea. Tehnica aspiraiei naintea executrii aspiraiei trebuie urmate etapele: 1.Efectuareauneianamnezeriguroaseiaunuiexamenclinicdetaliat,cu revederea rezultatelor radiologice i stabilirea diagnosticul prezumtiv. Trasarea cu ajutorul unui marker a zonei corporale n care se va executa aspiraia; 2.Leziuneaceurmeazsfieaspiratestepalpatifixatpentruaaprecia punctul optim de abordare. Se va alege n consecin acul cel mai adecvat; 3.Proceduratrebuiesfieclarexplicatpacientuluiiconsimitdeacesta. Pacientul poate prezenta o stare de anxietate, fiind necesar o premedicaie cu tranchilizante.Pieleasedezinfecteazfermcuuntampondevatmbibatn soluie iodat. Anestezia local este uneori necesar; 4.naintedencepereaprocedurii,nevomasiguractotechipamentulnecesar, instrumentarul i accesoriilesunt disponibile; 5. Poziionarea pacientului: orice poziie poate fi aleas, inndu-se bineneles cont deconfortulpacientuluiiasigurareaciideabord.AAFestedeobicei executat cu pacientul aezat n decubit dorsal pe un pat de examinare; 6. Imobilizarea leziunii: leziunea este fixat ntre policele i indexul minii stngi, cupieleauortensionat.Sencearcevitareainterpuneriimaselormusculare importante;7.Penetrarealeziunii:sepuncioneazleziuneaprintr-omicareatentirapid, unghiuliprofunzimeapenetrriivariinddupcaz.Pentruformaiunilemici, Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 17 Capitolul1este indicat aspiraia din zona central . Pentru formaiunile mai mari, care pot aveanecroze,modificrichisticesauhemoragicecentrale,aspiraiapoatefi executatidelaperiferie.Dacseaspirnumaipuroisaumaterialnecrotic din leziunile mari, AAF poate fi repetat imediat, de la periferie. Dac acul se plaseaztangenialncazuluneiformaiunimicisaudacpenetreazdincolo de formaiune, materialul nu va putea fi recoltat. Not:DacsuprafaazoneideexecuieaAAFestelocalizatlngcutiatoracic (formaiuninodulareaxilaresausupraclaviculare),aspiraiasevaexecutantr-un planparalelfadecutiatoracicpentruaevitapenumotoraxul.nAAFlanivelul tiroidei, pacientul trebuie instruit s nu nghit sau s vorbeasc cnd acul este plasat n interiorul formaiunii. 8.Creareavacuumuluiiobinereamaterialuluibiologic:aspiraiaesteexecutat dup ptrunderea n leziune i se menine n timp ce acul este acionat viguros prinmultiplemicride,,du-te-vino,nctevadireciidiferitedar convergente.ntreagaprocedurtrebuiesdurezemaxim6-8secunde.Nuse rotete acul i nici nu se fac micri de pompare a pistonului seringii (nuntru-nafar).Rezultatulaspiraieiesteextragereadefragmentedeesuticelule dislocate de bizoul acului.9.Eliberareavacuumuluiiretragereaacului:cndmaterialulbiologiceste observatlabazaacului,procedurasentrerupe.naintearetrageriiacului,se elibereazdintensiunepistonulseringii,apoiaculsescoatedinformaiune, drept, fr al nclina. Pistonul revine singur, ncet (fr a fi mpins). O eliberare insuficientapresiuniinegativeninteriorulformaiuniivacauzaaspirarea materialuluibiologiclaintrareansering,ceeace-lvafacedificilde recuperat. n situaii excepionale, seringa i acul pot fi cltite cu ser fiziologic sau fixator care apoi se vacentrifuga pentru a prepara un frotiu. Imediat dup retragereaacului,pezonapuncionatseaplicuntamponmbibatcu dezinfectantisepreseazctevaminute,depreferatdectreunasistent. Aceasta se realizeaz cu scopul de a preveni formarea unui hematom n zonele intens vascularizate. Tehnici de recoltare, transport i procesare primar a prelevatelor clinice 18 Bibliografie selectiv 1.ArtalME(2004)-Diagnsticohistopatolgicodelasmicosis;Rev IberoamMicol; 21:1-9. 2.Bates D W, Cook E F, Goldman L, et al. (1990) - Predicting bacteremia in hospitalizedpatients:aprospectivelyvalidatedmodel;AnnInternMed; 113:495-500. 3.BrouquiP,RaoultD(2001)-EndocarditisDuetoRareandFastidious Bacteria; Clin Microbiol Rev; 24(1): 177-207. 4.Buiuc D, Negu M (1999) - Tratat de microbiologie clinic; Ed. Medical; Bucureti. 5.CicaleseL(1999)-Bacterialtranslocationinintestinaltransplant recipients; Transplantation; 67(9): S589. 6.Darby J M, Linden P, Pasculle W, et al. (1997) - Utilization and diagnostic yieldofbloodculturesinasurgicalintensivecareunit;CritCareMed; 25:989-994. 7.DebelianGJ(1998)-Anaerobicbacteremiaandfungemiainpatients undergoing endodontic therapy: an overview;AnnPeriodontol; 3(1):281-287. 8.DoernGV(1994)-Manualbloodculturesystemsandtheantimicrobial removal device; Clin Lab Med; 14:133-147. 9.EdgeworthJD,TreacherDF,EykynSJ(1999)-A25-yearstudyof nosocomialbacteremiainanadultintensivecareunit;CritCareMed; 27:1421-1428. 10.GolescuM(1997)-Diagnosticulitratamentulmicozelorinterne;Ed. Viaa Medical Romneasc; Bucureti. 11.GrillotR(1996)-Lesmycoseshumaines-dmarchediagnostique; Elsevier; Paris. 12.HamptonJR,HarrisonMJG(1964)-Sterilebloodculturesinbacterial endocarditis; QJ Med; 36:167-174. 13.HarlodCN(1986)-CostEffectiveBloodCultures-IsItPossibleor Impossible to Modify Behavior? Infection Control; 7(1):32-33. 14.HoogGSde,GuarroJ,GenJ,FiguerasMJ(2000)-Atlasofclinical fungi;2ndedition;CentraalbureauvoorSchimmelcultures/Universitat Rovira i Virgili. 15.JaimesF,ArangoC,RuizGetal(2004)-PredictingBacteremiaatthe Bedside; Clinical Infectious Diseases; 38:357-362.16.LichtmanStevenM(2001)-BaterialTranslocationinHumans;Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition; 33(1):1-10. 17.LionaskisMS(2004)-Thesignificanceofbloodculturespositivefor emergingsaprophyticmouldsincancerpacients;ClinMicrobInfect;10 (10):922-926. 18.MaoxinW,DavidEB(2004)-FineNeedleAspiration,Cancer Investigation; 22(4). 19.PeeanuV,PeeanuV,BaltM(1997)-Exameneiinvestigaiin ginecologie i obstetric; Ed. Ex Ponto, Bucureti. Maria Dan, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Magdalena Mare, Mihai Mare 19 Capitolul120.RichardsonMD,WarnockDW(2003)-Fungalinfection-Diagnosis and Management; Blackwell Publishing.21.RonveauxO,JansB,SuetensC,CarasauwH(1998)-Epidemiologyof Bloodstream infections in Belgium 1992-1996; Eur J Clin Infect Dis; 17: 695-700. 22.SuttonDA(2003)-Specimencollection,transport,andprocessing: Mycology; In Murray P R et al. (eds.);Manualofclinicalmicrobiology; 8th edition; ASM Press; Washington D C; 2:1659-1667.23.VargheseC,VenkataramanK,BhagwatSetal.(2005)-Manualfor Cytology;DirectorateGeneralofHealthServicesMinistryofHealthand Family Welfare, India. 24.WarranD,ZackJ,ElwardA,CoxM,FraserV(2001)-Nosocomial primarybloodstreaminfectionsinintensivecareunitpatientsina nonteachingcommunitymedicalcenter:a21-monthprospectivestudy; Clin Infect Dis; 33:1329-1335. 25.Wingard J R (1999) - Fungal infections after bone marrow transplant; Biol Blood Marrow Transplant; 5(2):55-68. Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan 21 Capitolul2 Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan xamenul microscopic direct al produselor patologice recent recoltate poate orientadiagnosticulctreoinfeciefungiciuneoripoatechiaroferi indiciiimportanteprivindetiologiaacesteiaprinevideniereaunorformaiunisau elementecaracteristice.Elesteobligatoriupentruoricetipdeprelevatcuexcepia sngeluiiarevaloarediagnosticintrinsecdeoarecepermiteconfirmarearapida suspiciuniideinfeciemicoticiinformareatimpurieaclinicianului,cumulttimp nainte de pozitivarea culturii. Se efectueaz pe prelevate n stare proaspt, cu sau fr colorare prealabil (calcofluor, Giemsa etc.): lavaj bronhoalveolar (dup centrifugare), biopsii(frotiuriprinamprent),sput(duptratarecuN-acetil-cistein),hemoculturi, prelevate superficiale cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare. Produselepatologicepentrucareexistsuspiciuneacarconinefungisepot examina microscopic prin una dintre urmtoarele forme: -preparatextemporaneuntrelamilamel,cusoluie20%KOH(scuame, fragmenteunghiale,secreiilinguale,vaginale);sensibilitateametodeieste relativsczut,depinznddeabilitateaiexperienaanterioara examinatorului.nacestscop,seomogenizeazpeolamdemicroscopie volumeegaledinmaterialulpatologicisoluiaclarificant,dupcarese acoper cu o lamel, astfel nct s se evite formarea bulelor de aer. Decelarea formaiunilorfungicenprelevateestemultamelioratdaclasoluia clarificantseadauguncolorantnegruclorazol,cernealParkersauo substanfluorescentcuafinitatepentruglicanuldinperetelefungilor (Blankophor,Calcofluornproporiede0,1%).Utilizareasubstanelor fluorescente incumb examinarea preparatului la un microscop cu fluorescen. -preparatextemporaneucusoluie20%KOH+substanfluorescentsaufrotiu coloratcuaceeaisubstanfluorescent(Calcofluor,Blankophoretc.);este metodaoptimdedetecieafungilornprelevatedatorituneisensibilitii specificiti excelente, dar necesit microscopie n lumin ultraviolet (fig. nr. 2-1veziAnexa).Ctevafragmentedinprelevatulrecoltatdelapacientse depun pe o lam de sticl, ntr-o pictur de lichid clarificant (soluie 10-20% KOH cu adaos de calcofluor 0,1%) care prin digerarea keratinei i a celulelor somaticevapermiteobservarealamicroscopadiverselorformaiuni E2 Tehnici de microscopie direct Tehnici de microscopie direct 22 caracteristicefungilor.Dupuncontactdecca.10-15minute(eventualmai ndelungatncazulfragmentelorunghiale),lamaseacopercuolamelise examineazlamicroscop,cuobiectivele10,20i40,dupcaz.Aciunea lichiduluiclarificantpoatefiintensificatprinnclzirealameilaflacraunui becdegaz,frnsa-laducelafierbere.ngeneral,lamasepoateexamina cnd opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil. -frotiucoloratGram:punecuuurinnevidenfilamentele,pseudohifele, artrosporiiiblastosporiidedimensiunimari,nsesteinadecvatpentru detecia celulelor levurice de dimensiuni mici de exemplu, Candida glabrata (fig. nr. 2-2 vezi Anexa) -frotiupregtitpentruimunofluorescenprintratarecuanticorpimonoclonali cuplaicumarkerifluoresceni(nspecialpentrudeteciaPneumocystis jiroveci n prelevatele respiratorii) - preparat extemporaneu colorat cu tu de India: pune n eviden levurile capsulatedingenulCryptococcus,nsedimentulLCR,urinar,etc.(fig.nr.2-3vezi Anexa)-frotiucoloratMay-Grunwald-Giemsa:metodderutinpentrudepistarea levurilorintracelularedetipHistoplasma,darpoatefiutilizatipentru detectarea levurilor prin microscopie direct (fig. nr. 2-4 vezi Anexa) -frotiunecoloratsaucoloratcualbastrudemetilen3%:metodasepoatefolosi pentrudetectarealevurilordinhemoculturi,nsaltetehnicicuspecificitate mai ridicat sunt recomandate (fig. nr. 2-5 vezi Anexa)-preparatextemporaneucubandadeziv,coloratcualbastrudemetilenn lactofenol:metodexpeditivdediagnostictipone-stepaleziunilorde Pityriazis versicolor (fig. nr. 2-6 vezi Anexa) -frotiuriobinuteprinetalaresauamprent(porninddelaprelevatecaaspiratul bronic,LBAsaubiopsiile)careapoisecoloreazMustosaucucalcofluor i se examineaz n vederea decelrii aspectelor particulare care ar pleda pentru o zygomicoz, aspergiloz etc. Elementelemorfologiceidentificabileprinexamenmicroscopicdirectsunt levurile(burjeonatesaunu,intra-sauextracelulare,cusaufrcapsul),fragmentele hifale,septatesaunu,uneoriramificate,celulelefumagoide-celulecuaspect muriform,melanizate,de4-12mdiametru,septatelongitudinalitransversal, granulele (numite i scleroi - elemente sferice, dure, de cca. 1 mm diametru, formate la nivelul micetoamelor prin ntreeserea dens a hifelor), rar structurile de fructificare ale unor fungi filamentoi. 2.1. Coloraia negativ cu tu de India Scop SerecomandpentrudecelarealevuriloraparinndspecieiC.neoformansn sedimentul unor fluide biologice (LCR, urin, etc.). Echipamente Lame i lamele de microscopie, mnui de unic folosin, pipete Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan 23 Capitolul2 Reactivi Tu de India sau tip Parker Mod de lucru 1. Pe o lam de sticl degresat se depun i se amestec o pictur din sedimentul probei de analizat i o pictur tu de India; 2. Se acoper cu o lamel de sticl evitnd formarea bulelor de aer; 3. Preparatul extemporaneu astfel obinut se examineaz la microscop(x100, x400). Rezultatul colorrii Cryptococcusneoformansseprezintsubformdecelulelevuricerotunde, nmugurite sau nu, nconjurate de un halou clar, necolorat, facil de vizualizat pe fondul maron-negrualpreparatului.Datoritnecolorriicapsuleipolizaharidice,metodamai poart denumirea de coloraia negativ cu tu de India. 2.2. Coloraia negativ cu mercurochrom 2% i tu de India Scop Reprezintovariantmbuntitametodeianterioare,permind vizualizareaatreizonencomponenacapsuleiiaunorcorpusculininteriorul celulelorlevuricelaC.neoformans,ceeacecreteconsiderabilspecificitatea examenului microscopic direct. Echipamente Lame i lamele de microscopie, mnui de unic folosin, pipete ReactiviSoluie 2% mercurochrom (C20H8Br2HgNa2O6 sarea disodic a 2,7-dibrom-4-(hidroxomercurio)-fluoresceinei) Tu India (sau tu negru tip Parker) Mod de lucru 1.Peolamdesticldegresatsedepunsuccesiviseomogenizeazopictur dinsedimentulprobeideanalizat,opictursol.2%mercurochromio pictur tu de India; 2. Se acoper cu o lamel; 3. Se examineaz la microscop (x100, x400, x1000). Rezultatul colorrii Cryptococcusneoformansseprezintsubformdecelulelevuricerotunde, nmuguritesaunu,nconjuratedeocapsulclar,formatdin3zoneconcentrice;n interiorul celulelor levurice sunt adesea observabili corpusculi de form rotund. Tehnici de microscopie direct 24 2.3. Coloraia cu lactofenol i albastru de anilin (Lactophenol Cotton Blue) Scop Metod destinat colorrii i evidenierii prin microscopie a fungilor din unele prelevate clinice i culturi. Echipamente Lameilameledemicroscopie,curateidegresate,ansdensmnare, mnui de protecie, pahar Berzelius, plnie, hrtie de filtru, agitator magnetic. Reactivi Lactofenol cu albastru de anilin Albastru de anilin ......................................... 0,05 gFenol, cristale .............................................. 20,00 gGlicerol ...................................................... 40,00 mlAcid lactic .................................................. 20,00 mlAp distilat ............................................... 20,00 ml Prepararea acestei soluii dureaz cca. dou zile: 1. n prima zi, se dizolv albastrul de anilin n apa distilat. Se las peste noapte pentru decantarea colorantului insolubil; 2.AIIazi,purtndmnuideprotecie,seadaugcristaleledefenolnacidul lactic,ntr-unpaharBerzelius.Seomogenizeazapoifolosindunagitator magnetic pn la dizolvarea complet a fenolului; 3. Se adaugglicerolul; 4.Sefiltreazsoluiadealbastruldeaniliniseadaugnsoluiadefenol/ glicerol/acidlactic.Seamestecisepstreazlatemperaturacamerein flacoane cu dop picurtor. Mod de lucru 1.Se etaleaz pe o lam o cantitate suficient de prob; 2.Se adaug 1-2 picturi soluie de lactofenol i albastru de anilin; 3.Se omogenizeaz uor; 4.Se acoper cu o lamel i se examineaz la microscop. Rezultatul colorriiFungii albastru-nchis Not: Soluia de lactofenol i albastru de anilin este disponibil comercial: Merck, Remel, Becton-Dickinson (Lactophenol blue solution) Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan 25 Capitolul22.4. Coloraia cu hidroxid de potasiu i cerneal Parker Scop Evideniereaelementelorfungicenraclateletegumentare,prifragmente unghiale, prin examen microscopic direct. Echipamente Lame i lamele de microscopie, curate i degresate, ans de nsmnare, pens Reactivi Hidroxid de potasiu .......................................... 10 g Glicerol ........................................................... 10 ml Cerneal Parker Quink Permanent Blue ......... 10 ml Ap distilat .................................................... 80 ml SedizolvKOHnap,apoiseadauggliceroli cernealaParker.Glicerolul previne cristalizarea reactivului i deshidratarea probei. Mod de lucru1.Seutilizeazoansdensmnaresaupenspentrundeprtareauneimici poriunidinprobadeesut,nspecialdinzonelenecroticesaupurulente. Aceasta se etaleaz ntr-o pictur de colorant, pe o lam de microscopie; 2. Se acoper cu o lamel i apoi se comprim preparatul cu ajutorul captului unei anse de nsmnare pentru ndeprtarea excesuluide fluid. Se nclzete uor preparatul prin trecerea acestuia de 2-3 ori prin flacr, evitndu-se fierberea;3. Dup clarificarea preparatelor (15-20 minute pentru raclatele pielii i cteva ore pentru raclatele unghiale), acestea se vor examina la microscop (x10, x20, x40) pentru punerea n eviden a elementelor fungice. Rezultatul colorrii Elementele fungice apar colorate n albastru pal. Not:1.Aceast tehnic este frecvent utilizat, dar timpul necesar pentru clarificarea i colorarea complet poate fi maindelungat. Preparatele se pot pstra pn cnd rezultatele culturii sunt cunoscute. 2.Probele negative la prima citire trebuie pstrate i reexaminate n ziua urmtoare pentru a evitaraportareaunorrezultatefalsnegative,datoritntrzieriiclarificriiicolorrii probei. 2.5. Clarificarea cu hidroxid de potasiu i dimetil sulfoxid Scop Evideniereaelementelorfungiceprinexamenulmicroscopicdirectal raclatelor tegumentare, pr i unghii (n special detecia dermatofitozelor). Tehnici de microscopie direct 26 Echipamente Lame i lamele de microscopie, curate i degresate, ans de nsmnare, pens Reactivi Dimetil sulfoxid (DMSO) ............................... 40 ml Ap distilat .................................................... 60 ml Hidroxid de potasiu .......................................... 10 g Se adaug dimetil sulfoxidul n apa distilat i apoi se dizolv KOHn soluia respectiv. Mod de lucru 1.Seutilizeazoansdensmnaresauopenspentrurecoltareauneimici poriuni din prelevat. Aceasta se etaleaz apoi ntr-o pictur de KOH-DMSO pe o lam de microscopie; 2. Se acoper cu o lamel, se comprim uor preparatul cu ajutorul captului unei ansedensmnareiapoisendeprteazexcesuldefluid.Preparatulnuse nclzete; 3.Seexamineazlamicroscop,cudiafragmasemideschispentuasurprindemai uor elementele fungice refringente, necolorate. Note:1.DMSOpermiteomacerareioclarificaremultmairapidedecthidroxiduldepotasiu singur. 2.Preparatele nu se vor pstra dup examinare. 2.6. Coloraia cu calcofluor alb i KOH 10% Scop Evideniereaelementelorfungicedindiverseprelevate,prinmicroscopiecu fluorescen. Echipamente Lameilameledemicroscopie,curateidegresate,ansdensmnare, pens. Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan 27 Capitolul2 Reactivi Soluia A

Hidroxid de potasiu .......................................... 10 g Glicerol ........................................................... 10 ml Ap distilat .................................................... 90 ml Se dizolv KOH n ap i apoi se adaug glicerolul. Soluie B Calcofluor alb .................................................. 0,1 g Ap distilat ............................................... 100,0 ml Se dizolv calcofluorul alb pulbere n apa distilat uor nclzit. Mod de lucru 1.Seamestecopicturdinfiecaresoluie(AiB)ncentruluneilamede microscopie; 2. Se etaleaz proba de esut n soluie i apoi se acoper cu o lamel, comprimnd preparatul cu captul unei anse de nsmnare. Excesul de lichid se elimin; 3.Alternativ,nfunciedenaturaprelevatuluisepotobineifrotiuriprin amprent sau tergere, care se trateaz apoi cu soluiile reunite menionate; 4. Se nclzete uor lama i se examineaz la microscopul cu fluorescen echipat cu filtre adecvate. Rezultatul colorrii Elementelefungiceprezentenpreparatvoraparecoloratenalbastru fluorescent sau verde-deschis, n funcie de filtrele utilizate. Note:1.Este o metod expeditiv i sensibil, totui este necesar ca microscopul cu fluorescena s fie dotat cu filtre care s determine o sensibilizare la lumina ultraviolet, cuo lungime de und joas, de cca. 400 nm.2.Calcofluorul alb (M2R pulbere - Polysciences sau Blankophor BA - Bayer) este utilizat ca agentdealbirenindustriahrtiei,legndu-seselectivdecelulozichitin.Esteun colorant fluorescent pentru fungi. Tehnici de microscopie direct 28 2.7. Coloraia Gram* Scop Identificareafungilorprinexamenulmicroscopicalfrotiurilorexecutatedin diverse lichide biologice. Fixator Metanol absolut Echipamente Lame de sticl pentru microscopie (25/75 mm) cu un capt mat, pipete Pasteur, ansedensmaremicrobiologic,acedeinoculare,recipientepentrudepozitareade deeuri biologice Materiale opionale, depinznd de sursa probelor i de protocolul laboratorului: a) plit nclzitoare, 60C; b) centrifug; c) agitator tip Vortex; d) tuburi sterile cu dop filetat; e) foarfece sterile, bisturie, pense. Reactivi Soluia de cristal violet Cristal violet ....................................................... 2 g Etanol 95% ..................................................... 20 ml Oxalat de amoniu ............................................. 0,8 g Ap distilat .................................................... 80 ml Se dizolv cristalul violet n etanol i oxalatul de amoniu n ap. Se las soluia de oxalat de amoniu peste noapte pentru solubilizare complet sau se nclzete uor pn la dizolvare. Se amestec cele dou soluii i apoi se filtreaz. Soluia iod-iodurat Gram (soluia Lugol) Iod ....................................................................... 1 g Iodur de potasiu ................................................ 2 g Ap distilat .................................................. 275 ml Seadaugiodulpesteioduradepotasiu,naproximativ25mlapdistilat. Cnd solubilizarea este complet se adaug restul de ap.Atenie! Iodul este coroziv. Se evit inhalarea, ingestia sau contactul cu pielea. * vezi coloraia Gram-calcofluor alb Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru Cazacu, Maria Dan 29 Capitolul2Soluia de alcool-aceton Etanol 95% ................................................... 100 ml Aceton ......................................................... 100 ml Seomogenizeazisepstreazntr-unrecipientbrun,etichetatcudata preparrii, la temperatura camerei. Soluia este stabil 1 an.Atenie! Etanolul i acetona sunt inflamabile. Safranin O 0,4 % Safranin O ......................................................... 1 g Ap distilat .................................................. 250 ml Mod de lucru 1. Frotiurile pot fi fixate prin nclzire sau cu metanol; 2.Frotiurilesepotuscan aersausemeninpeoplatinnclzitoareelectric,la 60C, pn la uscare:3. Dac frotiurile sunt uscate n aer se vor trece de dou sau trei ori printr-o flacr. Pentru a evita denaturarea frotiului, acesta nu se supranclzete. 4. Se las lama s se rcesc nainte de colorare; 5.Fixareacumetanolprevinelizaeritrocitelor.Deasemenea,fixareacumetanol esterecomandatpentrutoateprelevateleclinicelichide,nspecialpentru urin,deoareceprevinesplareaprobelorntimpulcolorrii.Metanolulse stocheaz n sticle brune cu dop etan. O cantitate de lucru poate fi pstrat n recipieni de plastic, dac aceasta se nlocuiete la fiecare 2 sptmni. Pentru fixare, se adaug cteva picturi de metanol pe lam, se las n contact timp de 1 minut, apoi se vars i se las lama s se usuce la aer; 6.Seinundfrotiulastfelfixat,cusoluiedecristalviolet.Selasncontact60 secunde; 7.Sevarssoluiadecristalvioletisecltetelamauorcuapderobinet. Atenie!Cltireaexcesivpoatedeterminandeprtareacristaluluivioletdin celulele gram-pozitive. Apa se vars pe unul din capetele lamei, oblic, pentru a asigura o curgere lent peste frotiu. 8. Se cltete apoi cu soluie Lugol, timp de 3 secunde; 9. Se inund frotiul cu soluie Lugol i se las n contact 30 secunde; 10. Se spal cu ap de robinet; 11. Se toarn soluie alcool-aceton peste frotiu, ntr-un capt al lamei, oblic, pn cnd soluia care se scurge la capatul opus devine clar. Timpul de decolorare variaz n funcie de grosimea frotiului (n general 8-10 secunde); 12. Se spal cu ap de robinet; 13. Se inund lama cu soluie de safranin 0,4 %, timp de 30 secunde;14. Se ndeprteaz colorantul (safranin 0,4%) cu un jet de ap de robinet ; 15. Se usuc lama n aer, n poziie vertical, iar apoi se terge reversul acesteia cu un erveel mbibat n alcool sau aceton. Tehnici de microscopie direct 30 Rezultatul colorrii Fungii sunt Gram-pozitivi, deci se vor colora n violet. Note: 1.Dacsoluiadecristalvioletprezintprecipitatsausediment,serefiltreaznaintede utilizare.Uniicolorani,nspecialsafranina,sepotcontamina.Cndsesuspecteaz acest lucru, se nlocuiesc. 2.Evaporareapoatealteraeficacitateareactivilor;soluiiledelucrutrebuieschimbate regulat. 3. Zilnic sau cnd se folosete un nou lot de reactivi se realizeaz controlul de calitate prin executareaunuifrotiudinEscherichiacoli(ATCC25922)iStaphylococcus epidermidis(ATCC12228)sauStaphylococcusaureus(ATCC25923).Acestase fixeaz i se coloreaz dup tehnica descris mai sus. Rezultatele colorrii frotiului de control: a) coco-bacili Gram-negativi: roz; b) coci Gram-pozitivi: violet intens.4.Ctevadintrecauzelecelemaifrecventecareduclaobinereaunorrezultate nesatisfctoare ale coloraiei Gram: a) utilizareaunorlamedemicroscopieinsuficientdegresate.Pentruacestlucru,se pstreazlamelentr-unpaharcuetanol95%.Excesuldealcoolse ndeprteaz prin tergerea sau flambarea lamelor nainte de utilizare; b) executarea unor frotiuri prea groase;c) supranclzirea frotiului cnd acesta este fixat prin cldur; d) splarea excesiv pe durata procedurii de colorare. 2.8. Coloraia Gram - calcofluor alb Scop Uneori,fungiinusepotdistingecuacurateenfrotiurilecolorateGramsau potrmnemascaidealtematerialedinprob.naceastsituaie,calcofluorulalb poatefiutilizatpentrusupracolorareafrotiurilorcolorateGramnvedereauneimai bune evidenieri a elementelor fungice. Echipamente Lameilamelepentrumicroscopie,hrtiedefiltru,beioaredinlemn, microscop cu fluorescen, sticlrie de laborator Reactivi Xilen Metanol absolut Soluie de hidroxid de potasiu 10 sau 20% Calcofluor alb Mod de lucru 1. Se coloreaz frotiul prin tehnica de colorare Gram; 2. Se aplic peste frotiul colorat Gram un fragment de hrtie absorbant, pentru a-l usca; Mihai Mare, Bogdan Doroftei, Petru


Recommended