Subiecte rezolvate genetica

1. Structura primară a ADN.

ADN este un polimer de dezoxiribonucleotide. Unitatea structurală a ADN este

dezoxiribonucleotidul, având în componenţă trei elemente distincte: o pentoză, o bază azotată

şi grupul fosfat

a) Pentoza este un glucid cu 5 atomi de carbon, reprezentat de dezoxiriboză, care

prezintă o grupare OH în poziţia 3'.

b) Baza azotată poate fi purinică - adenina (A) şi guanina (G)- sau pirimidinică -

citozina (C) şi timina (T). Baza azotată se leagă printr-o legătură N-glicozi-dică de carbonul 1'

al dezoxiribozei, formînd un nucleozid.

c) Grupul fosfat (P) se ataşează la carbonul 5' al pentozei, formând un nucleotid.

Radicalul de acid fosforic conferă moleculei un caracter acid. În ADN există patru tipuri de

dezoxiribonucleotide: acid dezoxiadenilic (dAMP), dezoxicitidilic (dCMP), dezoxiguanilic

(dGMP) şi dezoxtimidilic (dTMP), deosebite numai prin baza azotată.

Nucleotidele din ADN se leagă între ele prin legături covalente 3'-5' fosfodiester,

stabilite între OH 5' al dezoxi-ribozei unui nucleotid şi OH 3' al dezoxiribozei nucleotidului

următor. Se constituie, astfel, un lanţ polinucleotidic continuu, liniar, lung, care repre-zintă

structura primară a ADN.

În structura polinucleotidului (catenei), complexul fosfat-dezoxiriboză este constant,

iar baza azotată este variabilă.

În catena de ADN, nu există o restricţie cu privire la aşezarea nucleotidelor, acestea

putând ocupa orice poziţie a catenei. Succesiunea nucleotidelor în lungul moleculei de ADN

reprezintă informaţia genetică codificată, pe baza căreia este stabilită ordinea aminoacizilor

în proteine. Această informaţie este citită în sensul 5' - 3', deoarece capetele polinucleotidului

(în poziţia 5' un radical fosfat, iar în poziţia 3' un radical OH) sunt libere.

2. Structura secundară a ADN

Molecula de ADN este constituită din două catene polinucleotidice care formează un

dublu helix. Catenele sunt conectate între ele prin intermediul legăturilor de hidrogen: două

între A şi T şi trei între G şi C. Formarea legăturilor de hidrogen este posibilă numai între o

bază purinică de pe o catenă şi o bază pirimidinică de pe catena opusă, din cauza dimensiunii

moleculare a bazelor. Astfel, cele două catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare.

Legea complementarităţii bazelor azotate stă la baza realizării funcţiilor genetice ale ADN:

replicarea, transcrierea, repararea, etc.

În ADN numărul de adenine este egal cu numărul de timine, iar numărul de guanine

egal cu numărul de citozine, respectiv raportul lor este întotdeauna unitar (A/T = 1; G/C = 1);

iar raportul sumelor bazelor purinice şi pirimidinice este întotdeauna unitar (A+G/T+C=1),

indiferent de specie. În schimb, raportul A+T/G+C nu este unitar, fiind o caracteris-tică de

specie (la om, raportul A+T/G+C = 1,7).

Cele două catene din structura dublului helix au o orientare antiparalelă (în sensurile

5' - 3', respectiv 3' - 5'), ca urmare a legăturilor dintre bazele complementare. Catenele,

asemănătoare cu două panglici, sunt răsucite dextrogir una în jurul alteia, şi ambele în jurul

unui ax imaginar, de la stânga la dreapta

Se formează, astfel, o dublă spirală helicoidală, asemănătoare unei scări în spirală, în

care axele glucidofosforice reprezintă marginile, iar perechile de baze treptele scării.

Bazele azotate sunt dispuse în interiorul helixului, perpendicular pe axul glucido-

fosforic; fiecare pereche de baze (pb) este deviată cu aproximativ 36º faţă de pb vecine.

Fiecărui tur complet al spirei îi corespund 10 pb. Distanţa dintre bazele suprapuse este de 0,34

nm, astfel că unui tur de helix (10 pb) (pasul elicei) îi corespunde o lungime de 3,4 nm.

Diametrul dublului helix este de 2 nm. La exteriorul helixului sunt vizibile două

şanţuri: un şanţ mare, important pentru fixarea pe molecula de ADN a proteinelor reglatoare,

şi un şanţ mic, necesar fixării histonelor.

Modelul descris corespunde formei B a ADN care, în condiţii fiziologice, este forma

predominantă. Dintre celelalte variante structurale ale ADN celular, cele mai bine cunoscute

sunt formele A şi Z, care pot fi prezente pe distanţe scurte. Forma A este mai compactă decât

forma B şi este adoptată la concentraţii saline mari. Forma Z este un helix levogir, mai lax ca

forma B, cu pasul de răsucire în zig-zag. Formele C, D, E, dextrogire, par să nu existe in vivo.

Modelul dublu catenar al ADN asigură stabilitatea informaţiei genetice.

3. Tipuri de ADN nuclear

Sunt descrise mai multe clase de ADN, diferite prin repetiţia secvenţelor nucleotidice:

► ADN nerepetitiv reprezintă circa 60% din lungimea totală a genomului uman şi

este alcătuit din secvenţe unice per genom sau în număr foarte mic de exemplare (familii

multigenice). Este dispus printre secvenţele repetitive, în regiunile eucromatice.

Sub 10% (circa 2%) din secvenţele nerepetitive reprezintă regiunile codante ale

genelor care codifică proteine (exonii); aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza II

(gene de clasă II). Restul ADN-ului nerepetitiv (peste 90%) este necodant, prezent în

interiorul genelor (introni) şi în regiunile dintre gene, iar funcţia sa este încă necunoscută (unii

autori consideră că aceste secvenţe reprezintă gene represate).

► ADN moderat repetitiv (ADN repetitiv dispersat)

ADN moderat repetitiv reprezintă circa 30% din genomul uman şi este alcătuit din

secvenţe scurte, de 300-1000 pb, repetate de zeci şi sute de mii de ori şi dispersate în genom.

Majoritatea acestor secvenţe sunt transcrise în ARN şi cuprind: genele repetate în tandem care

codifică ARNr şi ARNt, secvenţele LINEs şi SINEs.

Genele pentru ARNr sunt secvenţe repetate în tandem (150-200 copii), localizate pe

braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici, în regiunile organizatorilor nucleolari (NOR-

nucleolar organizer regions), care formează nucleolii în nucleul interfazic (genele pentru

ARNr 28S, 18S şi 5,8S); genele pentru ARNr 5S sunt situate în vecinătatea telomerului, pe

braţul lung al cromozomului 1. Genele ribozomale sunt transcrise de ARN-polimeraza I (gene

de clasă I).

Genele pentru ARNt (şi alte molecule mici de ARN)

Genele pentru ARNt sunt gene repetate în tandem, localizate mai ales la nivelul

cromozomilor 1 şi 6. Aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza III (gene de clasă III).

Secvenţele LINEs (long interspersed nuclear elements) au lungimea de 1-6 Kb şi sunt

dispersate în întregul genom, numărul de copii fiind de circa 500.000 (3-5% din genom). Până

acum, sunt cunoscute două familii: L1 şi The 1. Rolul probabil al acestor secvenţe este de a

asigura împerecherea corectă a cromozomilor omologi în meioză, esenţială pentru schimbul

egal de segmente cromozomiale.

Secvenţele SINEs (short interspersed nuclear elements) sunt secvenţe scurte de 150-

300 pb, dispersate în cromozomi în circa 100.000 de copii. Sunt reprezentate de familia Alu;

funcţiile acestei familii sunt necunoscute, dar se presupune că ar avea rol în iniţierea replicării

în diferite puncte ale ADN. Secvemţele Alu pot fi transpozate.

Cele mai multe secvenţe repetitive sunt rezultatul transpoziţiei, majoritatea având

originea într-un ARN viral care, sub acţiunea unei revers-transcriptaze, va forma o copie

ADN ce va fi integrată în alt loc din genom.

► ADN înalt repetitiv

ADN înalt repetitiv reprezintă 10% din genom şi este alcătuit din secvenţe foarte

scurte (2-200 pb), repetate de în tandem de milioane de ori. Secvenţele înalt repetitive, care

nu sunt transcrise, sunt reprezentate de:

- sateliţi (ADN satelit), prezenţi în heterocromatina constitutivă din anumite regiuni

cromozomiale - centromer (banda C), telomere (secvenţa TTAGGG), constricţii secundare,

benzi G, precum şi din cromozomul Y (corpusculul fluorescent); ADN satelit are deci rol

structural.

- minisateliţii sunt secvenţe foarte scurte, de circa 15 pb, repetate în tandem şi

dispersate în toţi cromozomii (cu excepţia cromozomilor X şi Y), unde ocupă situsuri

specifice.

Minisateliţii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală, cu o secvenţă identică, şi regiuni

periferice variabile. Numărul de copii ale secvenţei unui minisatelit, precum şi variantele

secvenţelor acestuia variază de la o persoană la alta; minisateliţii sunt denumiţi şi regiuni

hipervariabile (VNTR - variable number of tandem repeats) şi reprezintă markeri genetici ai

individului: amprenta ADN (DNA fingerprinting) sau profilul ADN; probabilitatea de a

întâlni doi indivizi neînrudiţi identici este mai mică de 10-20.

- microsateliţii sunt secvenţe de 1-13 pb, cel mai frecvent dinucleotidice (STR - short

tandem repeats sau VNDR - variable number of dinucleotides repeats), distribuite neuniform

la nivelul genomului.

Mini- şi microsateliţii sunt localizaţi în regiunile de eucromatină, şi anume în ADN

extragenic şi introni. Aceste secvenţe repetitive sunt, cel mai probabil, rezultatul unor defecte

ale împerecherii (slippage = alunecare) în timpul procesului de replicare a ADN.

4. ADN mitocontrial(Genomul mitocondrial)

Genomul mitocondrial are o lungime de 16,6 Kb. Conţine un singur tip de ADN

circular, dublu catenar. Cele două catene ale ADN mitocondrial (ADNmt) se deosebesc prin

conţinutul lor în baze azotate: una este bogată în guanină (catena grea - H), iar catena

complementară bogată în citozină (catena uşoară - L). Există o regiune mică, numită bucla D

(displace-ment loop), în care ADN este format din trei catene.

În fiecare celulă umană există câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt).

Genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci este moştenit numai de la

mamă.

ADNmt diferă de cel nuclear şi prin următoarele:

1) nu formează complexe cu proteine;

2) procentul de ADN codant este mare – circa 97%;

3) conţine foarte puţin ADN repetitiv;

4) este lipsit de introni;

5) replicarea este unidirecţională şi începe în puncte de origine diferite pentru cele

două catene;

6) transcrierea este continuă, fără întrerupere, în direcţii diferite pe cele două catene,

rezultând un transcript multigenic de dimensiune mare;

7) lipsesc unele mecanisme de reparare a leziunilor ADN, astfel că mutaţiile se

acumulează rapid;

8) conţine 37 de gene, care codifică ARNr de dimensiuni reduse, ARNt şi

polipeptide;

9) are 4 codoni stop, din care doi sunt codoni sens în ADN nuclear, iar codonul stop

UGA din ADN nuclear este codon sens în ADNmt.

5. Cromatina

Cromatina reprezintă complexul format din ADN nuclear şi proteine. Ea se prezintă microscopic sub două aspecte, diferite ca structură şi funcţie: eucromatina şi heterocromatina.

► Eucromatina este mai puţin condensată şi slab colorată cu coloranţi bazici; reprezintă cromatina activă genetic (transcripţională); se replică precoce în faza S a ciclului celular; conţine mai mult ADN nerepetitiv (în care predomină perechile de baze G-C) şi proteine nehistonice. Eucromatina poate fi evidenţiată în cromozomii metafazici sub forma benzilor R.

► Heterocromatina este puternic condensată sub formă de cromocentri şi colorată mai intens cu coloranţi bazici; este cromatina inactivă genetic; se replică tardiv în faza S; conţine mai mult ADN repetitiv (în care predomină perechile de baze A-T) şi histone. Heterocromatina este de două tipuri: constitutivă şi facultativă.

- Heterocromatina constitutivă rămâne sub formă condensată pe tot parcursul ciclului celular. Nu conţine gene funcţionale şi este formată din ADN înalt repetitiv. La nivel cromozomial, heterocromatina constitutivă se găseşte în la nivelul centromerului, a telomerelor, la nivelul constricţiilor secundare, pe braţul lung al cromozomului Y şi pe braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici. Ea ocupă poziţii identice pe cromozomii omologi şi poate fi evidenţiată în cromozomii metafazici sub forma benzilor C. Se presupune că heterocromatina constitutivă are rol în stabilizarea centromerelor şi telomerelor, precum şi în sinapsa dintre cromozomii omologi meiotici.

- Heterocromatina facultativă este o formă de cromatină care a fost sau va fi activă într-un stadiu al dezvoltării ontogenetice şi care intervine probabil în reglarea genelor; conţine secvenţe de ADN nerepetitiv. Exemplul cel mai caracteristic îl constituie cromatina sexuală X, unul dintre cei doi cromozomi X inactivaţi în celulele somatice feminine.

Cromatina sexuală

Cromatina sexuală reprezintă un cromocentru distinct, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) şi a anomaliilor numerice ale cromozomilor sexuali.

Cromatina sexuală diferă la sexul feminin şi masculin, deoarece rezultă prin mecanisme diferite.

Cromatina X

La femei (XX), cromatina sexuală rezultă în urma inactivării unuia din cei doi cromozomi X. Cromozomul X condensat (heterocromatinizat) este vizibil sub formă de corpuscul Barr în majoritatea ţesuturilor (figura 1.8) sau sub formă de apendice nuclear (drumstick - băţ de tobă) pe frotiuri de sânge, în polimorfonuclearele neutrofile (figura 1.9). Astfel, atât la femeie cât şi la bărbat, un singur cromozom X rămâne activ, iar cromozomii X suplimentari sunt inactivaţi prin heterocromatinizare. Conform principiului Lyon, inactivarea cromozomului X este totală, se produce precoce în perioada embrionară şi este definitivă; inactivarea cromozomului X se produce la întâmplare, în unele celule fiind inactivat cromozomul X de origine paternă, iar în altele cel de origine maternă.

Numărul de corpusculi Barr este egal cu suma cromozomilor X – 1.

Cromatina Y

La bărbaţi (XY), cromatina sexuală este reprezentată de heterocromatina de la nivelul celor 2/3 distale ale braţului lung al cromozomului Y; poate fi vizualizată, prin coloraţia cu quinacrină şi examinare microscopică în lumină ultravioletă, sub forma unui corpuscul intens fluorescent, denumit şi cromatină Y sau corpuscul F.

Numărul de corpusculi F este egal cu numărul cromozomilor Y.

6. Structura supramoleculara a cromatinei(ADN)

Împachetarea succesivă a ADN, care realizează o scurtare de circa 10.000 de ori a

moleculei de ADN, permite atât adaptarea materialului genetic la volumul mic al nucleului,

cât şi controlul exprimării genelor de pe cromozomi.

1. Primul nivel de organizare supramoleculară a cromatinei este filamentul nucleozomic (figura 1.11b) cu un diametru de 10 nm, denumit şi fibra de 10 nm. Nucleozomul (figura 1.10) este un complex ADN – histone: un segment de ADN se înfăşoară de 1¾ ori în jurul unui octamer histonic, de formă cilindrică, alcătuit din câte două molecule din histonele H2A, H2B, H3, H4. Nucleozomii sunt legaţi între ei printr-un segment de ADN numit ADN de legătură (ADN linker), care este asociat cu histona H1. Se constituie astfel filamentul nucleozomic, asemănător cu un „şirag de mărgele”. Această structură reduce lungimea dublului helix ADN (2 nm) de circa 10 ori.

2. Al doilea nivel de organizare a cromatinei este fibra de cromatină de 30 nm

(figura 1.11c), care rezultă din spiralizarea sub formă de solenoid a fibrei de 10 nm. Această

structură, care reduce lungimea dublului helix de 40 de ori, este stabilizată de histona H1 şi

conţine 6 nucleozomi per tur de helix. Cromatina din nucleul interfazic are ca unitate de

organizare fibra de cromatină de 30 nm.

3. Al treilea nivel de organizare a cromatinei este reprezentat de buclele de

cromatină (fibra pliată în bucle laterale) cu un diametru de 300 nm, care rezultă prin

plierea fibrei de cromatină de 30 nm. Fiecare buclă este ataşată prin anumite regiuni din

structura fibrei de ADN (bogate în AT) la un schelet proteic central. Scheletul proteic central

este format din proteine nehistonice. Fixarea buclelor la scheletul central este neregulată, ele

formând, din loc în loc, mici aglomerări de bucle, denumite cromomere. În cromozomii

condensaţi, cromomerele formează grămezi, vizibile sub forma benzilor G intens colorate.

Buclele de cromatină se spiralizează şi condensează puternic la începutul diviziunii,

alcătuind cromatida unui cromozom (figura 1.11e) care, în metafază, are un diametru de 700

nm şi care atinge cel mai înalt grad de condensare a fibrei elementare de cromatină de 30 nm.

Fiecare cromatidă a unui cromozom conţine deci o singură moleculă de ADN cu grade

succesive de împachetare. La sfârşitul diviziunii, cromozomii se despiralizează.

Histonele sunt proteine mici bazice, bogate în arginină şi lizină, care se fixează de ADN la nivelul şanţului mic. Sunt codificate de gene lipsite de introni, situate pe cromozomii 1, 6 şi 12. Se deosebesc cinci tipuri de histone: H1, H2A, H2B, H3, H4, cu rol important în organizarea supramoleculară a ADN. Histonele H2A, H2B, şi mai ales H3 şi H4, au o structură conservată în evoluţie. În diferite stadii ale ciclului celular, histonele sunt supuse unor transformări chimice care le conferă importante proprietăţi funcţionale: acetilarea lor determină activarea unor gene, metilarea produce represia genelor, iar fosforilarea histonei H1

este urmată de condensarea fibrelor de cromatină în cromozomi şi declanşarea mitozei.

Proteinele nehistonice sunt proteine acide şi neutre, de diferite tipuri, prezente în

număr redus în structura cromatinei. Ele se fixează de ADN la nivelul şanţului major.

Majoritatea proteinelor nehistonice au diferite roluri funcţionale, reglând activitatea genelor.

Unele proteine nehistonice formează scheletul cromozomilor, având deci rol structural.

7.Clasificarea cromozomilor umani

Cromozomii sunt identificaţi pe baza morfologiei lor. Ei sunt clasificaţi conform Sistemului internaţional de nomenclatură citogenetică umană (International System of Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN), adoptat în 1995.

Pe baza taliei şi poziţiei centromerului, cromozomii au fost clasificaţi în 7 grupe, notate de la A la G; fiecare cromozom somatic este desemnat printr-un număr de la 1 la 22. Se obţine astfel o aranjare sistematizată a cromozomilor unei celule numită cariotip .

● Cromozomi mari sunt cromozomii grupei A (perechile 1-3), metacentrici (cromozomul 2 este mai submetacentric) şi cromozomii grupei B (perechile 4-5), submetacentrici;

● Cromozomi mijlocii sunt cromozomii grupei C (perechile 6-12 şi cromozomul X), submetacentrici, cromozomii grupei D (perechile 13-15), acrocentrici şi cromozomul 16 (aparţine grupei E ), metacentric;

● Cromozomi mici sunt cromozomii grupei F (perechile 19-20), metacentrici, perechile 17-18 (aparţin grupei E), submetacentrici şi cromozomii grupei G (perechile 21-22 şi cromozomul Y), acrocentrici.

Conform ISCN, pentru a desemna un cariotip normal sau anormal, se menţionează în următoarea ordine şi separaţi prin virgule: numărul de cromozomi, constituţia cromozomilor sexuali şi anomaliile numerice sau structurale ale cromozomilor somatici (atunci când sunt prezente). Prezenţa unui mozaic cromozomial se notează menţionând cariotipurile liniilor celulare componente, separate printr-o diagonală (/) (pentru detalii – vezi Caiet lucrări practice).

8.Heteromorfismul cromozomilor

Termenul de heteromorfism cromozomial defineşte variaţiile în morfologia cromozomilor omologi la un individ sau la persoane diferite, iar cromozomul deosebit morfologic de omologul său este considerat a fi cromozom marker.

Fiecare individ are cel puţin un cromozom marker pe care îl transmite, de obicei, neschimbat la descendenţii săi (poate fi folosit în stabilirea paternităţii).

Regiunile cromozomiale heteromorfice sunt regiuni de heterocromatină alcătuite din ADN repetitiv inactiv genetic, astfel încât nu determină modificări fenotipice şi sunt considerate variante morfologice normale. Cele mai cunoscute tipuri de heteromorfism cromozomial sunt:

• dimensiunea braţului scurt al cromozomului Y

• dimensiunea heterocromatinei centromerice (banda C)

• dimensiunea sateliţilor

• situsurile fragile induse de inhibitori ai acidului folic

9.Principiul tehnicii de clonare in vivo

Clonarea ADN constă în producerea unui număr mare de copii ale unei secvenţe de

ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare

celulară), când este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelulară), prin

reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).

Clonarea ADN in vivo se realizează în mai multe etape.

1) Obţinerea fragmentelor de ADN

● Fragmentele de ADN care vor fi amplificate şi analizate ulterior pot fi obţinute prin

secţionarea ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie.

Enzimele de restricţie (ER) sunt endonucleaze bacteriene care scindează moleculele

ADN (prin hidroliza legăturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul unor zone strict

specifice generând fragmente de lungimi variabile, denumite fragmente de restricţie (FR). O

caracteristică esenţială a enzimelor de restricţie o constituie specificitatea acţiunii lor: o ER îşi

exercită activitatea endonucleazică numai asupra unei anumite secvenţe nucleotidice (cu

lungime de câteva perechi de baze), denumită situs de restricţie (SR) sau situs de

recunoaştere şi clivare.

Pentru fiecare ER există în genom numeroase SR, iar distanţa care separă aceste situsuri este foarte diferită. In urma acţiunii unei anumite ER vor rezulta, deci, o multitudine de FR de lungimi variate, ce pot fi separate electroforetic.

Secţiunile pe care le efectuează cele mai multe dintre ER nu sunt situate, de obicei, la

acelaşi nivel pe cele două catene ale moleculei de ADN; ca urmare, pe o porţiune de câteva

nucleotide cape-tele fragmentelor vor fi monocatenare: la unul dintre capete vor fi

desperecheate nucleo-tidele unei catene, iar la celălalt - nucleotidele catenei opuse. Acest mod

de acţiune are o importanţă practică deosebită, deoarece fragmentele ADN generate de o

aceeaşi ER, având capete coezive, pot fi făcute să se sudeze între ele, pe bază de

complementaritate, chiar dacă au origini complet diferite, rezultând o moleculă hibridă de

ADN recombinant.

● O altă metodă de a obţine fragmente de ADN sau gene utilizează ARN mesager,

produsul de transcripţie al genei. Molecula monocatenară de ARNm, extrasă dintr-o celulă

care îl sintetizează în cantităţi mari, serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene de ADN

complementar (ADNc) sub acţiunea enzimei transcriptaza inversă; prin complementaritate,

se sintetizează şi cea de-a doua catenă, obţinându-se astfel o moleculă de ADNc bicatenar

care corespunde exonilor genei.

2) Formarea moleculelor de ADN recombinant

După obţinerea fragmentelor de ADN uman, este necesară multiplicarea fragmentului.

În acest scop, fragmentele sunt inserate în vectori de clonare şi cu ajutorul lor sunt introduse

într-o celulă-gazdă (bacterie etc.), unde se vor multiplica. Unirea a două fragmente de ADN

de origini diferite produce o moleculă de ADN recombinant. Pentru aceasta, moleculele de

ADN din cele două surse sunt secţionate cu aceeaşi ER, producând capete identice, care se

unesc pe bază de complementaritate, iar fragmentele sunt unite cu ajutorul unei ADN-ligaze.

a. Vectorii sunt molecule naturale de ADN utilizate pentru a transporta sevenţele de

ADN de analizat şi care au capacitatea de a se replica independent de genomul gazdei.

Principalele tipuri de vectori utilizaţi sunt plasmidele, bacteriofagii şi cosmidele.

▫ Plasmidele sunt componente ale bacteriilor, făcându-le rezistente la diferite

antibiotice. Sunt alcătuite dintr-o moleculă mică de ADN circular, dublu catenar

extracromozomial, a cărei replicare se produce independent de cromozomul bacterian.

▫ Bacteriofagii sunt virusuri care infectează şi distrug bacteriile, replicându-se de

asemenea, independent şi rapid; sunt alcătuiţi din ADN dublu catenar liniar. În tehnicicle de

clonare cel mai frecvent se utilizează bacteriofagul lambda (λ) care atacă E. coli.

▫ Cosmidele sunt vectori artificiali - hibrizi formaţi dintr-un plasmid şi situs cos al

bacteriofagului λ.

Vectorii în care s-a introdus un fragment de ADN exogen se numesc vectori

recombinanţi.

3) Transformarea şi amplificarea

Moleculele de ADN recombinant sunt transferate în celule-gazdă (cel mai frecvent

bacterii nepatogene modificate) în care vectorii recombinanţi se vor multiplica independent de

cromozomul bacterian, producând mai multe copii identice. Introducerea unui vector într-o

celulă bacteriană se numeşte transformare.

Bacteriile transformate sunt multiplicate. In cazul utilizării vectorilor plasmidici,

celulele bacteriene sunt însămânţate pe o placă de agar, în care se plasează şi o genă de

rezistenţă la antibiotic, precum şi antibioticul faţă de care s-a indus rezistenţa. Bacteriile

transformate devin rezistente şi îşi continuă multiplicarea, fiecare dintre ele formând o colonie

sau clonă (populaţie de celule identice, provenite dintr-o singură celulă). Totalitatea

coloniilor, respectiv a fragmentelor de restricţie clonate, care conţin şi ADN de analizat,

formează o aşa-numită bancă sau bibliotecă de clone ADN (DNA library). In funcţie de

colecţia de FR pe care o conţin, acestea sunt biblioteci de ADNc (care cuprind numai

secvenţele nucleotidice ale genelor active transcripţional) şi biblioteci genomice.

Intrucât clona conţinătoare a FR de interes nu are nici un caracter distinctiv

(bibliotecile sunt „fără catalog”), se procedează la screening-ul sistematic al tuturor coloniilor

sau plăcilor de liză. Secvenţa căutată poate fi identificată direct (prin hibridizare cu sonde

complementare) sau indirect (prin purificarea proteinelor produse de clonele bacteriene şi

recunoaşterea lor cu anticorpi monoclonali).

Amplificarea prin clonare rămâne însă o procedură laborioasă, complicată şi mare

consumatoare de timp.

10. Clonarea ADN in vitro (metoda PCR)

Clonarea ADN constă în producerea unui număr mare de copii ale unei secvenţe de

ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare

celulară), când este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelulară), prin

reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).

Clonarea ADN prin reacţia polimerizării în lanţ (PCR - polymerase chain reaction)

este o metodă al cărei principiu se bazează pe procesul replicării semiconservative in vitro şi

prin care se realizează amplificarea selectivă şi rapidă a unei secvenţe scurte de ADN sau

ARN (a cărei structură nucleotidică este parţial cunoscută). Procedura este extrem de simplă,

economică şi în întregime automatizată.

Eşantionul ADN, într-o cantitate foarte mică (care poate proveni dintr-o singură

celulă), este introdus într-un tub conţinând următorii reactivi: o ADN - polimerază

termostabilă – Taq (extrasă din bacteria termofilă Thermus aquaticus), cele patru

dezoxiribonucleotide trifosfat şi două oligonucleotide sintetice denumite amorse sau

primeri. Amorsele, a căror secvenţă nucleotidică trebuie să fie complementară cu secvenţele

ADN care flanchează capetele segmentului ce urmează să fie amplificat, constituie punctele la

nivelul cărora se iniţiază activitatea ADN polimerazei. Într-o primă etapă, segmentul de ADN

de amplificat este denaturat termic (la 95°C), rezultând un amestec de fragmente

monocatenare. În al doilea timp, prin răcire uşoară, amorsele se poziţionează şi hibridizează

cu secvenţele complementare (situate la capătul 3’) de pe fiecare catenă. În a treia etapă,

pornind de la amorse, ADN-polimeraza începe să adauge dezoxiribonucleotide în sensul 5’-3’

pe matriţele reprezentate de monocatenele segmentului ţintă. Reîncălzirea mediului determină

iniţierea unei noi reacţii de polimerizare. Procesul se desfăşoară ciclic: la sfârşitul a n cicluri,

în mediul de reacţie vor exista 2n molecule de ADN dublu catenar, copii ale secţiunii ADN

aflată între amorse.

Cantitatea optimă este obţinută după mai puţin de 30 cicluri de reacţie, când în tub vor

exista câte 109 copii ale secvenţei iniţiale. Durata unui ciclu fiind de 5 minute, rezultă că

această cantitate va fi obţinută în aproximativ 3 ore.

Metoda acceptă ADN provenit din cele mai variate surse (celule din frotiuri, pete de

sânge, spermă sau foliculi piloşi etc.). Dezavantajele majore ale metodei sunt necesitatea

cunoaşterii secvenţelor capetelor ADN-ţintă (pentru fabricarea amorselor), cantitatea foarte

mică de produs şi frecvenţa destul de mare a erorilor de împerechere.

Metoda PCR este aplicată şi pentru molecule de ADN complementar: RT-PCR

(reverse transcriptase PCR).

11. Analiza ADN genomic uman prin tehnica Southern blot

Cele câteva sute de mii de fragmente de restricţie care rezultă din digestia genomului

uman cu enzime de restricţie (ER) pot fi separate prin metoda electroforezei în gel.

Moleculele ADN au o încărcătură electrică negativă, migrând astfel către anod, cu o viteză

invers proporţională cu greutatea lor moleculară. Fragmentele de restricţie separate

electroforetic se dispun într-un ansamblu reproductibil de benzi ADN care sunt invizibile în

gelul de agaroză; evidenţierea lor se realizează prin impregnarea gelului cu un colorant

specific pentru ADN (bromura de etidiu) care în lumina ultravioletă devine fluorescent.

Analiza structurii fragmentelor rezultate prin digestie cu ER se realizează prin metoda

marcării radioactive a ADN, cunoscută sub numele de Southern blot. Ea se desfăşoară în

mai multe etape (figura 2.4):

1) fragmentarea ADN genomic extras din celule, prin clivarea cu o enzimă de restricţie

corespunzătoare;

2) separarea fragmentelor de restricţie prin electroforeză, pe baza dimensiunii lor;

3) denaturarea chimică a fragmentelor ADN bicatenare incluse în gel;

4) transferarea prin capilaritate (blotting) a monocatenelor de pe gelul de agaroză pe o

membrană de nailon sau de nitroceluloză; se obţine, astfel, o replică a modelului de benzi din

gelul de agaroză;

5) hibridizarea moleculelor ADN de pe membrană cu o sondă ADN sau ARN marcată

radioactiv, complementară cu secvenţa urmărită; se vor forma complexe dublu catenare

stabile în zonele membranei în care se află secvenţele complementare;

6) detectarea autoradiografică a complexelor dublu catenare (după contactul

membranei cu un film foto).

Prin această tehnică se poate evidenţia prezenţa sau absenţa unui fragment de ADN-

ţintă, obţinut din ADN genomic. Importanţa majoră pentru medicină a analizei Southern

blotting constă în capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii fragmentelor de

restricţie (restriction fragment length polymorphisms - RFLPs) şi, prin aceasta, de a funcţiona

ca instrument de diagnostic ADN indirect.

Aceeaşi procedură poate fi aplicată şi pentru ARN, purtând denumirea de Northern Blot, iar pentru proteine - Western Blot.

12. Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice alelelor (allele specific

oligonucleotides - ASO).

ASO reprezintă o metodă importantă de diagnostic a bolilor monogenice produse de

mutaţii a căror bază moleculară este cunoscută. Metoda utilizează ca sonde două sau mai

multe oligonucleotide sintetice (15-20 pb), dintre care unul corespunde (în sensul

complementarităţii bazelor) secvenţei genice normale, iar celelalte secvenţelor modificate prin

mutaţie.

Metoda ASO este larg utilizată în diagnosticul prenatal al unor afecţiuni produse de

mutaţii punctiforme. Un exemplu de boală genetică al cărei diagnostic poate fi stabilit în

primul trimestru al sarcinii prin analiza ASO este cel al anemiei drepanocitare. Boala are drept

cauză o mutaţie punctiformă interesând codonul 6 – GAG – al genei care codifică lanţurile

β -globinice ale hemoglobinei. In urma mutaţiei, codonul GAG se transformă în GTG,

consecinţa fiind substituirea acidului glutamic cu valina în poziţia 6 a lanţului aminoacidic al

β -globinei. Diagnosticul presupune utilizarea unei sonde complementare cu secvenţa

specifică genei normale (sonda conţine în porţiunea centrală tripleta CTC) şi a unei sonde în a

cărei secvenţă se află tripleta CAC (aceasta va interacţiona specific cu codonul alterat al genei

patologice). Dacă ADN extras din celulele lichidului amniotic hibridizează numai cu sonda

specifică mutaţiei, afectarea fătului este certă; hibridizarea cu ambele sonde relevă starea de

heterozigot, iar reacţia negativă cu sonda pentru gena patologică exclude prezenţa bolii.

13.Hibridizarea in situ

Hibridizarea in situ reprezintă o tehnică în care, după hibridizare cu secvenţele

specifice din moleculele ADN sau ARN, sondele marcate izotopic sau chimic sunt vizualizate

direct pe preparatele celulare sau cromozomiale. Datorită rezoluţiei insuficiente şi perioadei

lungi de timp necesară obţinerii rezultatelor, tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv

tind să fie complet abandonate, în locul lor fiind utilizată tehnica denumită FISH

(fluorescence in situ hibridization) sau hibridizare in situ prin marcare fluorescentă, relativ

simplă şi nu foarte costisitoare. Fluorocromii utilizaţi sunt acidul 7-amino-4-metilcumarin-3

acetic (AMCA) (fluorescenţă albastră), fluoresceina (fluorescenţă verde) sau Texas red

(fluorescenţă roşie).

Tehnica FISH este aplicată în citogenetica moleculară pentru:

- analiza cromozomilor metafazici sau a nucleilor interfazici cu sonde ADN;

- „pictarea” cromozomilor (chromosome painting), care detectează cromozomi

singulari sau numai părţi componente (centromer, telomere);

- detectarea întregului genom – de exemplu M-FISH (Multicolor-FISH: 24 culori)

14. Fenomenul de înlănţuire genică (linkage) şi încrucişare cromozomială

(crossing-over)

Fiecare cromozom este alcătuit din mai multe gene nealele, care ocupă fiecare un

locus distinct. Ele au o dispoziţie liniară în cromozom, una după alta. Înlănţuirea fizică a

locilor aflaţi pe acelaşi cromozom se numeşte sintenie.

Genele situate pe acelaşi cromozom au tendinţa de a se transmite grupat (odată cu

cromozomul respectiv) de la părinţi la descendenţi, prin gameţi. Fenomenul în care genele

nealele situate aproape una de alta pe acelaşi cromozom nu segregă în meioză şi au tendinţa

de a se transmite împreună în succesiunea generaţiilor se numeşte înlănţuire genică (linkage)

(fenomenul se referă la loci, nu şi la alele). Genele dintr-o regiune cromozomială transmise

împreună formează un grup de înlănţuire (linkage group) sau haplotip.

Numai genele situate foarte aproape una de alta se transmit totdeauna împreună,

înlănţuite. De exemplu, genele C, D şi E care determină grupul sanguin Rhesus (Rh),

localizate pe cromozomul 1, se transmit înlănţuite.

Genele situate mai la distanţă una de alta pe acelaşi cromozom pot fi separate prin

crossing-over.

În profaza primei diviziuni meiotice, cromozomii omologi se împerechează (sinapsă)

pe întreaga lor lungime, formând unităţi alcătuite din patru cromatide denumite tetrade

(excepţie fac cromozomii sexuali X şi Y, care se alătură prin capetele braţelor scurte). La

locul de contact (chiasmă) dintre cromatidele dispuse central ale unei tetrade (una aparţinând

cromozomului patern, iar cealaltă cromozomului matern) se produc apoi fenomene de

crossing-over, constând în schimburi reciproce (încrucişate) şi egale de gene. Pentru că o genă

trece astfel de pe un cromozom pe omologul său, producând o schimbare a poziţiei genelor

parentale, fenomenul este numit recombinare genetică.

Recombinarea genică intracromozomială produsă prin crossing-over este

întâmplătoare şi nu poate fi prevăzută. Probabilitatea de producere a crossing-over-ului între

două gene este direct proporţională cu distanţa fizică dintre ele: cu cât genele sunt mai

apropiate, şansa de recombinare este mai mică şi invers.

Distanţa dintre două gene de pe acelaşi cromozom se exprimă în centiMorgan (1cM =

1Mb = 106 pb) sau procent de recombinare.

15. Cadrul de citire

Cadrul de citire, aflat în regiunea centrală a genei, reprezintă regiunea transcrisă, sub

acţiunea ARN-polimerazei II, în ARN mesager precursor (ARN premesager). El este alcătuit

din secvenţe codante numite exoni şi secvenţe necodante numite introni.

Exonii sunt secvenţele codante ale genei, care codifică anumite regiuni ale proteinei

numite domenii. Regiunea centrală a genelor începe şi se termină cu exoni, ceea ce înseamnă

că orice genă are n exoni şi n-1 introni. Numărul exonilor variază de la o genă la alta, fiind

cuprins între 2 şi câteva zeci. Există gene mici cu un singur exon - genele ADN mitocondrial,

genele histonelor, genele interferonilor, gena SRY, gena receptorului angiotensinei II, etc..

Lungimea exonilor variază în limte largi (lungimea medie este de 150 pb) (de exemplu genele

insulinei – 150 pb, gena distrofinei – 180 pb).

Intronii sunt secvenţele care, în general, nu codifică nici un produs specific şi care

sunt transcrise iniţial în ARNm precursor, dar nu se regăsesc în ARNm matur. Numărul

intronilor variază de la 2 la genele insulinei, la 79 la genele distrofinei. Lungimea intronilor

este variabilă (între câteva sute şi câteva mii de pb), de obicei mult mai mare ca a exonilor.

Majoritatea intronilor încep cu dinucleotidul 5'GT (situs donor) şi se termină cu

dinucleotidul 3'AG (situs acceptor). Aceste secvenţe dinucleotidice au rolul de semnale

pentru decuparea corectă a intronilor în timpul procesului de matisare (splicing).

Rolul intronilor nu este încă bine cunoscut. Iniţial se considera că funcţia intronilor ar

consta în separarea exonilor, dar mai recent se acceptă că ei au rol în autoclivarea ARN,

respectiv în reglarea expresiei genelor, iar în unele cazuri au chiar funcţii codificatoare.

Cadrul de citire al genei începe cu situsul de iniţiere (start) al transcrierii. Situsul de

iniţiere este urmat de o regiune netradusă numită 5'UTR (untranslated region), care conţine o

secvenţă consens (prezentă la toate genele) şi codonul start ATG (locul de iniţiere a translaţiei,

corespunzător primului aminoacid din lanţul polipeptidic). Urmează primul exon.

După ultimul exon din cadrul de citire există o secvenţă netradusă 3'UTR, care începe

cu unul dintre codonii stop (TGA, TAG, TAA); codonii stop reprezintă semnalul de oprire a

translaţiei. Regiunea 3'UTR se continuă cu secvenţa AATAAA care reprezintă situsul de

terminare al transcripţiei. La circa 20 de nucleotide în aval de situsul terminator se află

situsul de poliadenilare, denumit astfel, deoarece la acest nivel la ARNm se adaugă circa

200 de nucleotide cu adenozină; tot la acest nivel se produce şi desprinderea ARN-polimerazi

şi eliberarea moleculei ARN sintetizate.

16. Secvenţele de reglare a genei

Secvenţele de reglare a genelor sunt secvenţe netranscrise, dispuse de o parte şi de alta

a cadrului de citire. Majoritatea se află la capătul 5’ al genei.

a) Promotorul reprezintă o succesiune de secvenţe situată în amonte de cadrul de

citire, întinse pe o distanţă de circa 150 pb faţă de situsului de iniţiere a transcrierii.

Promotorul conţine mai multe secvenţe nucleotidice scurte, pe care se fixează nişte

proteine reglatoare numite factori de transcripţie (TF II – transcription factors). Factorii de

transcripţie au rolul a lega ARN-polimeraza II astfel ca transcripţia să înceapă exact la situsul

de iniţiere (cu primul nucleotid) şi de a activa enzima, deoarece ARN-polimeraza nu poate

recunoaşte direct promotorul şi nu poate iniţia singură transcripţia.

Promotorul cuprinde mai multe secvenţe:

(1) Boxa (cutia) TATA (Hogness) este secvenţa TATAAA, situată la 25-35 pb în

amonte faţă de situsul de iniţiere a transcrieii.

Boxa TATA reprezintă locul la care se fixează ARN-polimeraza II prin intermediul

factorului de transcripţie TFIID. Această secvenţă este necesară pentru iniţierea corectă a

procesului de transcriere (în punctul de start) şi asigură expresia genei la un nivel bazal.

Mutaţia secvenţei permite iniţierea transcripţiei, dar deplasează punctul de start faţă de

normal.

Boxa TATA este prezentă la majoritatea genelor specifice unui anumit tip de ţesut

(specific tisulare). La genele comune („housekeeping genes”) este prezentă, în locul boxei

TATA, secvenţa GC (insulele CG).

(2) Boxa CAAT (secvenţa GGCCAATCT) şi boxa GC (secvenţa GGGCGG) sunt

secvenţe situate în amonte de boxa TATA, la circa 70-80 pb, respectiv 90 pb faţă de situsul de

iniţiere, de care se fixează alţi factori de transcripţie şi având rolul de a creşte eficienţa

transcrierii.

În regiunea proximală a promotorului se mai află o serie de secvenţe ADN care, după

fixarea anumitor FT, stimulează intens sau, dimpotrivă, blochează transcripţia. Ele determină

astfel specificitatea expresiei unei gene în funcţie de ţesut şi de stadiul dezvoltării:

(3) Secvenţele octamerice (ATTTGCAT) sunt secvenţe care determină expresia

specifică a anumitor gene în funcţie de tipul de celulă sau de stadiul dezvoltării ontogenetice.

(4) Secvenţele (elementele) de răspuns (response elements) sunt secvenţe care

determină transcripţia temporară a anumitor gene în funcţie de anumite semnale extracelulare

(temperatură, concentraţia unor ioni, substanţe nutritive, hormoni, morfogeni); aceste semnale

activează anumiţi FT care se fixează pe secvenţele de răspuns.

b) Intensificatorii (activatorii) (enhancers) sunt secvenţe ADN care cresc nivelul

bazal al transcripţiei, amplificând activitatea promotorului (de zeci-mii ce ori). Activatorii

sunt situaţi în amonte faţă de promotor, adesea la sute sau mii de pb faţă de situsul de iniţiere.

O serie de intensificatori funcţionează predominant sau exclusiv în anumite ţesuturi, ceea ce

sugerează rolul lor în diferenţierea celulară.

c) Atenuatorii (silencers) sunt secvenţe ADN situate, de asemenea, în amonte de

promotor şi care reduc sau uneori chiar reprimă (blochează) transcripţia unor gene.

17. ELEMENTE GENETICE MOBILE

În general, genele au o poziţie fixă în genom. Unele secvenţe de ADN se pot deplasa

uneori dintr-o poziţie cromozomială în alta, fenomen numit transpoziţie; secvenţele

respective se numesc elemente transpozabile sau transpozoni.

În funcţie de mecanismele realizare a transpoziţiei, elementele transpozabile se împart

în transpozoni şi retrotranspozoni.

(1) Transpozonii sunt elemente care se deplasează ca atare, adică sub forma de

secvenţe ADN. Transpozonii conţin în structura lor şi genele care codifică enzimele

(transpozaze) necesare exciziei şi inserţiei lor. Elementul transpozabil de origine îşi păstrează

de cele mai multe ori poziţia neschimbată şi doar copiile acestuia, realizate prin replicare, se

deplasează şi se integrează în altă poziţie din genom. La om, fenomenul de transpoziţie este

încă discutabil.

(2) Retrotranspozonii sunt elemente transpozabile a căror migrare se realizează prin

intermediul transcriptelor ARN. Denumirea provine de la faptul că mecanismele transpoziţiei

sunt asemănătoare celor prin care se realizează deplasarea retrovirusurilor. ARN este copiat,

sub acţiunea reverstranscriptazei, într-o moleculă de ADN care va fi integrată, la întâmplare,

într-o altă regiune a genomului.

Retrotranspozonii au originea în elemente retrovirale, care se integrează în genomul

celulelor germinale şi se transmit în stare latentă în succesiunea generaţiilor.

Retrotranspozonii reprezintă marea majoritate a elementelor transpozabile la om,

ocupă circa 10% din genom şi sunt reprezentate de două familii - LINEs şi SINEs, diferite

prin lungimea şi originea lor: LINEs sunt produşii transcripţiei efectuată de ARN-polimeraza

II, în timp ce SINEs derivă din transcriptele primare ale ARN-polimerazei III.

Existenţa elementelor genetice mobile demonstrează plasticitatea genomului.

18.TRANSCRIPŢIA

Transcripţia este procesul prin care informaţia genetică a unei gene este copiată într-o

moleculă de ARN complementară şi antiparalelă, numită ARN mesager (ARNm). Acest

proces are loc în nucleu.

Acidul ribonucleic (ARN) prezintă o serie de particularităţi structurale.

ARN este alcătuit din ribonucleotide. Fiecare ribonucleotid este format din riboză (o pentoză care prezintă câte o grupare OH în poziţiile 2’ şi 3’), o bază azotată (adenină – A, guanină – G, citozină – C sau uracil – U) şi un grup fosfat. Prin polimerizarea în sensul 5’→3’ a ribonucleotidelor rezultă o monocatenă, de obicei scurtă, de ARN.

Se deosebesc mai multe tipuri de ARN, cu funcţii diferite:

- ARNm sau mesager este codant, deoarece prin translaţie determină sinteza unui

polipeptid;

ARNr sau ribozomal participă la formarea ribozomilor;

- ARNt sau de transfer are rolul de a transporta aminoacizii la ribozomi;

- ARNsn (mic nuclear) şi ARNsno (mic nucleolar) intervin în procesarea intronilor,

respectiv a ARNr.

În cele ce urmează, este prezentată sinteza ARNm catalizată de ARN-polimeraza II.

Elemente implicate în transcripţie. Pentru a se realiza sinteza unui ARN mesager sunt necesare:

(1) Ribonucleotide activate. Prin ruperea legăturilor fosfat macroergice dintre fosfaţii

α şi β ai ribonucleozid-trifosfaţilor (adenozintrifosfat - ATP, guanozintrifosfat - GTP,

citidintrifosfat - CTP şi uridintrifosfat - UTP) se eliberează ribonucleotidele (ribonucleozid-

monofosfaţii) şi energia necesară polimerizării acestora.

(2) Matriţa este reprezentată de o singură catenă de ADN. Numai una dintre cele două

catene ale ADN (3’→5’) este transcrisă şi serveşte ca matriţă pentru sinteza moleculei

complementare şi antiparalele de ARNm (5’→3’); catena transcrisă este denumită şi catenă

antisens. Catena ADN netranscrisă, ale cărei secvenţe nucleotidice sunt identice cu cele ale

ARNm, este numită şi catenă sens . Cele două catene ale ADN se vor separa astfel temporar

şi pe lungimi scurte, pentru ca una din ele să servească drept matriţă pentru ribonucleotidele

complementare. Alegerea catenei transcrise depinde în mare parte de localizarea şi orientarea

promotorului.

(3) Enzima care catalizează tanscrierea ADN genic în ARNm este ARN-polimeraza II (transcriptază, ARN-polimeraza ADN-dependentă).

Etapele procesului de transcripţie

Pentru realizarea transcrierii, este necesară relaxarea (decondensarea) cromatinei, acetilarea histonelor şi intervenţia elementelor reglatoare din regiunea 5’ a genei (asupra cărora acţionează factorii de transripţie).

Procesul transcripţiei se desfăşoară în două mari etape:

- formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm sau transcript primar);

- procesarea (maturarea) ARN mesager precursor.

19. Formarea ARNm precursor

Formarea ARN mesager precursor (ARN premesager, transcript primar, ARN heterogen nuclear) începe prin decondensarea zonei din ADN care conţine gena sau genele ce vor fi transcrise. Acest proces intervin factori de transcripţie de clasa I (TF I), acetilarea histonelor şi deplasarea histonei H1.

ARNm precursor se formează în trei etape:

iniţiere

elongare

terminare.

(1) Iniţierea transcripţiei. Deoarece ARN-polimeraza nu poate recunoaşte direct

promotorul şi nu poate iniţia singură transcripţia, sunt necesari o serie de factori de

transcripţie de clasă II (TFII), care se fixează pe secvenţele promotorului, dirijând şi

activând astfel enzima. Primul factor de transcripţie care se leagă de promotor - TFIID - are o

subunitate numită proteina de legare a TATA (TATA binding protein–TBP) care recunoaşte şi

se fixează de boxa TATA. TFIID atrage după sine şi alţi FT (în ordinea TFIIA, TFIIB, TFIIF,

TFIIE şi TFIIH), care permit fixarea ARN-polimerazei în regiunea promotor şi activarea

enzimei (fig. 4.2). Transcripţia începe (este iniţiată) la nivelul situsului de iniţiere a

transcripţiei; primul nucleotid transcris este numerotat convenţional „+1”.

(2) Transcripţia propriu-zisă (elongarea). După fixarea ARN-polimerazei pe

regiunea promotor, cele două catene ale ADN sunt separate prin acţiunea TFIIF, care are

acţiune de helicază, eliberându-se catena antisens, 3’→5’; catena antisens serveşte ca matriţă

pentru ataşarea complementară, în sensul 5’- 3’, a ribonucleotidelor activate (fig. 4.3); prin

polimerizarea ribonucleotidelor sub acţiunea ARN-polimerazei se formează ARNpre-m.

ARNm se desprinde treptat de pe catena transcrisă, iar cele două catene refac treptat dublul

helix.

(3) Terminarea transcripţiei se produce atunci când ARN-polimeraza întâlneşte

situsul de terminare a transcripţiei, unde pe catena antisens se află secvenţa AATAAA. La

15-30 pb în aval de această secvenţă, în dreptul situsului de poliadenilare, se va produce

secţionarea (sub acţiunea unei nucleaze) a ARNm. ARN-polimeraza şi factorii de transcripţie

se detaşează de matriţa ADN şi se eliberează molecula de ARNm precursor sau transcriptul

primar care conţine atât exonii, cât şi intronii genei copiate.

O genă poate fi transcrisă simultan de mai multe molecule de ARN-polimerază,

formându-se astfel mai multe copii de ARNm ce conţin aceeaşi informaţie genetică.

20 Procesarea (maturarea) ARNm precursor

Maturarea ARNm precursor are loc la nivel nuclear şi se realizează prin două procese:

(1) inserţia de secvenţe nucleotidice la extremităţile moleculei şi (2) matisarea ARN precursor

(fig. 4.4).

(1) Inserţia de secvenţe nucleotidice la cele două capete ale moleculei de ARNm

precursor facilitează creşterea stabilităţii moleculei, transportul spre citoplasmă, recunoaşterea

şi fixarea sa la subunitatea mică (40S) a ribozomilor.

La primul nucleotid al capătului 5’ al transcriptului primar se adaugă o moleculă de 7-

metil-guanozină, formând o structură denumită bonetă (cap).

La capătul 3’ se adaugă între 50-200 nucleotide cu adenină, formând o coadă

poliadenilică.

(2) Matisarea ARN precursor.

ARNm precursor conţine secvenţele compementare întregului cadru de citire, deci atât

exonii cât şi intronii. Matisarea (splicing) constă în decuparea şi eliminarea intronilor,

urmată de reunirea (legarea „cap la cap”) a exonilor, cu formarea ARNm matur.

Atât decuparea, cât şi reunirea sunt procese care trebuie să fie foarte precise şi care

depind de existenţa secvenţelor nucleotidice-semnal situate la limita dintre introni şi exoni

(situsuri de clivare) - 5’GU (situs donor) şi 3’AG (situs acceptor).

Matisarea (splicing) implică următoarele procese: (1) clivarea joncţiunii 5’GU; (2)

ataşarea nucleotidului G la nucleotidul A al situsului de legătură şi formarea unei bucle; (3)

secţionarea intronului la joncţiunea 3’AG; (4) îndepărtarea intronului şi sudarea secvenţelor

exonice .

Procesul de matisare este mediat de un complex format din ARN nuclear mic

(ARNsn) şi proteine numit spliceosome sau particule mici ribonucleoproteice (small

ribonucleotide particles - snurps). În cadrul procesului de matisare exonii sunt sudaţi, de cele

mai multe ori, în ordinea în care aceştia sunt dispuşi în interiorul genelor - matisare

constitutivă (constitutive splicing) (vezi Reglarea expresiei genelor).

21. TRANSLAŢIA

Translaţia (traducerea) reprezintă a doua etapă a expresiei genice şi constă în

decodificarea informaţiei genetice din ARNm care permite aranjarea specifică a

aminoacizilor şi polimerizarea lor într-un lanţ polipeptidic.

Procesul de translaţie necesită un „dicţionar” reprezentat de codul genetic şi un aparat

de translaţie, care cuprinde un „traducător”, reprezentat de moleculele de ARN de transfer

(ARNt), ribozomi, enzime şi cofactori proteici.

Codul genetic

Conform dogmei centrale a geneticii moleculare informaţia din structura unei gene,

stocată sub forma unei anumite secvenţe a celor patru tipuri de nucleotide (A, T, G, C) este

copiată (transcrisă) complementar (U, A, C, G) în ARNm şi apoi tradusă într-o anumită

secvenţă de aminoacizi, care vor forma un lanţ polipeptidic. Translaţia este efectuată cu

ajutorul codului genetic.

Codul genetic reprezintă relaţia de corespondenţă între o anumită secvenţă de trei

nucleotide numită codon şi un anumit aminoacid. Cele patru litere (nucleotide) pot forma

cuvinte alcătuie din trei litere, iar gena este un „mesaj coerent” format dintr-o înşiruire de

codoni (tabel 4.1).

Caracteristicile codului genetic.

(1) “Cuvintele” codului sunt reprezentate de grupuri de câte trei nucleotide, numite

codoni. Codul genetic este triplet.

Combinaţiile celor patru baze luate câte trei (43) realizează 64 de triplete de baze sau

codoni, dintre care 61 codifică un aminoacid (codoni sens).

(2) Codul genetic are un codon iniţiator (start) (AUG) şi trei codoni stop (UAA,

UAG, UGA) (codoni nonsens).

(3) Deoarece există 61 de codoni sens şi numai 20 de aminoacizi, înseamnă că unii

aminoacizi pot fi specificaţi de mai mulţi codoni; codonii diferiţi ce codifică acelaşi

aminoacid se numesc codoni sinonimi (diferiţi, de obicei, prin a treia bază), iar codul genetic

este degenerat (redundant). Cu excepţia metioninei şi a triptofanului, codificaţi fiecare de un

singur codon, ceilalţi 18 aminoacizi sunt codificaţi de doi sau mai mulţi codoni.

Caracterul degenerat al codului genetic constituie un avantaj pentru celulă, oferind

protecţie împotriva efectelor mutaţiilor (mutaţiile genice care produc codoni sinonimi nu

afectează structura proteinei codificate).

(4) Codul genetic este nesuperpozabil: codonii vecini nu au nici un nucleotid comun.

(5) Codul genetic prezintă continuitate (fără pauze): între codonii adiacenţi nu există

nucleotide cu rol de „virgulă”.

(6) Codul genetic este lipsit de ambiguitate: un codon specifică întotdeauna un

aminoacid, totdeauna acelaşi.

(7) Codul genetic este universal, acelaşi la toate organismele (bacterii, plante, animale

şi om). Cu toate acestea, codul genetic mitocondrial are câteva mici diferenţe faţă de cel

nuclear.

22. Aparatul de translaţie

Aparatul de translaţie este alcătuit din ARNm, ARNt, ribozomi, aminoacizi, factori de

iniţiere, factori de elongare, enzime, surse de energie (GTP, etc)

a) ARN de transfer (ARNt) transportă aminoacizii din citoplasmă la ribozomi, sediul

sintezei proteice, unde îi poziţionează în ordinea dictată de codonii din ARNm; ARNt are deci

rolul de „translator”.

ARNt este un poliribonucleo-tid monocatenar de dimensiuni mici (75-100 nucleotide), cu structură secundară „în trifoi”: prezintă trei regiuni scurte, dublu catenare numite tulpini, care se termină cu bucle monocatenare (fig. 4.6), structură care este identică la toate tipurile de ARN. ARNt conţine două secvenţe importante: (1) secvenţa CCA de la capătul 3’OH de care se leagă aminoacidul cu ajutorul enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza; (2) anti-codonul, o secvenţă de trei nucleotide situată în bucla opusă capătului 3’; anticodonul recunoaşte, prin complementaritate, codonul din ARNm corespunzător aminoacidului.

(b) Ribozomii sunt organite citoplasmatice în care are loc asamblarea aminoacizilor în

proteine pe baza informaţiei din ARNm. Sunt alcătuiţi din două subunităţi deosebite prin

constanta de sedimentare (S). În perioada în care nu sunt implicate în sinteză proteică, cele

două subunităţi sunt disociate şi libere în citoplasmă; ele se asociază la începutul translaţiei

formând ribozomul activ. Fiecare subunitate este alcătuită din ARN ribozomal (ARNr) şi

proteine. Subunitatea mică (40S) prezintă un situs de legare a capătului 5’ a ARNm.

Subunitatea mare (60S) prezintă două situsuri învecinate: situsul A (aminoacil) şi situsul P

(peptidil) unde se fixează moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizi (fig. 4.7).

(c) Enzimele implicate în procesul translaţiei sunt aminoacil-ARNt-sintetaza şi

peptidil-transferaza. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt 20 de enzime care recunosc şi leagă

fiecare atât un aminoacid, cât şi ARNt corespunzător. Peptidil-transferaza cata-lizează

formarea de legături peptidice între aminoacizi.

(d) Cofactorii proteici, reprezentaţi de factorii de iniţiere (IF), factorii de elongaţie

(EF) şi factorul de terminare, intervin în diferite etape ale translaţiei.

23. Procesul de translaţie

Translaţia se desfăşoară în trei faze succesive: iniţierea, elongarea şi terminarea

translaţiei.

(1) Iniţierea translaţiei este etapa în care primul aminoacid al proteinei (de la capătul

NH2-terminal) este poziţionat în dreptul codonului start AUG din ARNm (ce corespunde

metioninei) şi sunt asamblate cele două subunităţi.

Iniţial, ARNm se fixează cu „boneta” (cap) şi secvenţa 5’-AUG-3’ pe subunitatea

mică (40S) a ribozomului; apoi ARNm şi primul ARNt „încărcat” cu primul aminoacid

metionina (ARNt iniţiator) formează complexul de iniţiere; anticodonul ARNt-1 este în

contact cu codonul AUG al ARNm. Urmează fixarea subunităţii mari (60S), iar ribozomul

devine activ. ARNt-iniţiator ocupă situsul P al subunităţii mari, situsul A fiind liber (fig. 4.8).

(2) Elongarea este etapa în cursul căreia se formează legături peptidice între

aminoacizii aranjaţi pe baza ordinii codonilor din ARNm.

După pozionarea ARNt iniţiator în situsul P al ribozomului, pe situsul A liber se

plasează al doilea ARNt încărcat cu aminoacidul codificat de al doilea codon din ARNm. Sub

acţiunea peptidil-transferazei, se formează o legătură peptidică între primii doi aminoacizi;

rezultă astfel un dipeptid care este legat la cel de-al doilea ARNt. Apoi, sub acţiunea unui

factor de elongare, GTP şi a unei translocaze, ribozomul se deplasează cu trei nucleotide în

lungul ARNm, în direcţia 5’→3’. Astfel, ARNt iniţiator părăseşte situsul P, care va fi ocupat

de cel de-al doilea ARNt ce conţine dipeptidul. În situsul A eliberat se fixează a treilea ARNt

cu aminoacidul corespunzător, iar acest al treilea aminoacid se leagă de dipeptid (fig. 4.9).

Cele trei faze – ataşarea aminoacid-ARNt la ribozom, formarea legăturii peptidice şi

translocarea ribozomului – se repetă ciclic, determinând creşterea lanţului polipeptidic.

Pe măsură ce un ribozom avansează în lungul moleculei de ARNm, şi alţi ribozomi

pot începe citirea moleculei, formându-se astfel sute sau mii de polipeptide identice

(amplificare).

(3) Terminarea traducerii are loc în momentul când în situsul A ajunge un codon stop

(UAA, UAG sau UGA) (fig. 4.10). Deoarece nu există un ARNt corespunzător codonilor

stop, pe situsul A se ataşează factorii de terminare care leagă o moleculă de apă la nivelul

peptidului. Polipeptidul eliberat astfel din ribozom va suferi o serie de modificări şi va

dobândi forma tridimensională specifică.

24. PROCESAREA POSTTRANSLAŢIONALĂ A PROTEINELOR

(1) Fiecare proteină sintetizată va funcţiona într-un anumit compartiment al celulei sau

în spaţiul extracelular. Astfel proteinele sunt dirijate (targeting) spre o anumită destinaţie cu

ajutorul unor secvenţe semnal, prezente în structura acestora .

Într-o primă etapă sunt separate proteinele destinate celulei de cele care vor fi

eliminate la exteriorul acesteia. Astfel, proteinele care urmează a fi excretate prezintă la

capătul N-terminal o secvenţă de 10-30 de aminoacizi denumită peptid-semnal (signal

peptide), absent la proteinele destinate celulei.

În momentul în care secvenţa semnal devine vizibilă la suprafaţa ribozomului, de ea se

leagă o particulă de recunoaştere a semnalului (SRP-signal recognition particle), care

opreşte procesul de translaţie (SRP este o particulă ribonucleoproteică, alcătuită din şase

proteine diferite şi ARN 7S). Complexul ribozom-peptid semnal-SRP recunoaşte şi se fixează

de un receptor al particulei de recunoaştere a semnalului (docking protein sau signal

recognition particle receptor) aflat pe faţa citosolică a membranei reticulului endoplasmic

(RE). Odată fixat la RE, translaţia se reia, iar polipeptidul traversează membrana RE printr-un

canal de translocare (translocon); ajuns în lumenul RE, peptidul-semnal se desprinde de

proteină sub acţiune enzimatică (signal peptidase).

Mecanismul dirijării este asemănător pentru proteinele destinate nucleului,

complexului Golgi sau mitocondriilor.

Proteinele destinate lizozomilor – proteaze – conţin o secvenţă aminoacidică ce

determină ataşarea posttrans-laţională de manoză-6-fosfat.

(2) Pe măsura sintezei unui polipeptid, acesta se pliază în anumite regiuni realizând

structuri secundare (α-helix sau β-pliere) prin interacţiuni între diferiţi aminoacizi. Această

pliere este posibilă numai în prezenţa unor proteine numite chaperones. Astfel, la sfârşitul

sintezei, polipeptidul are o configuraţie tridimensională specifică funcţiei sale.

Polipeptidele suferă, de asemenea, diferite modificări permanente sau reversibile, care

fac proteina să devină activă.

Fosforilarea serinei (kinaze), acetilarea lizinei (histone) sunt exemple de modificări

chimice reversibile.

Modificările permanente sunt reprezentate de:

a) Clivarea proteolitică a lanţului polipeptidic

După sinteză are loc frecvent clivarea şi îndepărtarea metioninei iniţiale sau, la unele

proteine, a peptidului semnal de la extremitatea NH2.

Numeroase proteine sunt sintetizate sub formă de precursori inactivi (pro-hormoni,

pro-enzime); aceşti precursori sunt clivaţi proteolitic, rezultând proteina matură activă. De

exemplu, în cazul insulinei, din produsul genic rezultă mai multe lanţuri polipeptidice.

b) Glicozilarea are loc în RE sau în complexul Golgi în cazul glicoproteinelor

secretate.

c) Hidroxilarea unor aminoacizi, de exemplu a prolinei şi lizinei, este întâlnită în

cazul proteinelor ţesutului conjunctiv - colagen şi elastină (asigură integritatea structurală);

hidroxi-prolina este prezentă în structura acetilcolinesterazei şi a complementului.

e) Adăugarea de lipide caracterizează proteinele membranei celulare. Cele mai

frecvente sunt acilările (ataşarea de acizi graşi) şi prenilările. Dintre acizii graşi, cel mai

frecvent se adaugă acidul N-miristic la nivelul glicinei amino-terminale.

Proteinele pot fi alcătuite din unul sau mai multe polipeptide, de exemplu

hemoglobina, fibra de colagen, fiecare dintre ele fiind supusă modificărilor postranslaţionale.

25. Reglarea epigenetică (pretranscripţională) a expresiei genelor

Acest tip de reglare are ca scop expresia genelor în anumite organe, ţesuturi, tipuri de

celule sau celule individuale (deci organizarea lor spaţială). Pentru aceasta în celulele

embrionare diferenţiate sunt selectate anumite gene, care se vor exprima şi la descendenţii lor.

Aceste fenomene presupun modificarea structurii cromatinei, realizată în principal prin

mecanisme epigenetice.

În nucleu, ADN formează cu histonele structuri cu diferite grade de compactare –

cromatina. Pentru ca o genă să poată fi transcrisă, factorii reglatori trebuie să aibă acces la

promotorul genei. Aceasta necesită o modificare a structurii cromatinei, mai ales a

eucromatinei, şi anume modificări ale histonelor şi metilarea ADN. Acestea sunt reversibile şi

sunt transmisibile ereditar.

a) Modificările histonelor au drept consecinţă modificarea cromatinei. De exemplu,

metilarea lizinei 4 din structura histonei H3 este asociată cu activarea expresiei genelor, în

timp ce metilarea lizinei 9 a aceleiaşi histone diminuă expresia lor. Acetilarea histonelor este

asociată cu relaxarea cromatinei, deci cu activarea transcripţiei genelor.

Cromatina inactivă (heterocromatina) este puternic condensată ca urmare a fixării

strânse a histonei H1. Cromatina activă (eucromatina) este mai relaxată datorită acetilării

histonelor din structura nucleozomului.

b) Metilarea ADN este datorată enzimei ADN-metiltransferaza, care introduce o

grupare metil în poziţia 5’ a citozinei secvenţelor CG şi GC, localizate în promotorul

majorităţii genelor. Metilarea ADN reprezintă cel mai important mecanism de represie a

transcripţiei.

Imediat după fecundare sunt activate numeroase gene prin demetilarea ambelor

genomuri parentale, cromatina se relaxează şi sunt activate astfel genele necesare dezvoltării

embrionare precoce. Pe măsură ce are loc diferenţierea celulară, unele dintre aceste gene vor

fi inactivate selectiv.

Metilarea ADN este responsabilă şi pentru fenomenul de amprentare genomică, care

constă în exprimarea diferenţiată a unei gene în funcţie de originea, maternă sau paternă, a

acesteia.

c) Se consideră că trecerea temporară de la configuraţia B la forma Z a ADN unor

gene face ca acestea să fie mai accesibile la factorii de transcripţie.

26. Reglarea transcripţională

Etapa principală a reglării expresiei genice are loc în toate celulele la nivelul iniţierii

transcripţiei, mai precis la reglarea activităţii ARN-polimerazei II, enzima care transcrie

genele care codifică proteine. Această reglare necesită interacţiunea proteinelor trans-

reglatoare (factorii de transcripţie) cu secvenţe specifice, cis-reglatoare, de ADN. Ca rezultat

al acestei interacţiuni, gene specifice sunt transcrise într-un anumit moment.

Secvenţele cis-reglatoare sunt secvenţe scurte de ADN la care se fixează factori

specifici de transcripţie; în acest fel este gena este recunoscută de către ARN-polimerază şi

este reglată specificitatea şi intensitatea transcripţiei în funcţie de necesităţile celulare.

Unele dintre aceste secvenţe au localizare precisă, la nivelul promotorului genei

(TATA, CAAT, GC). Alte secvenţe, situate în amonte, conferă genelor specificitate tisulară.

Secvenţele care reglează intensitatea transcripţiei (intensificatori, atenuatori) au localizare

variabilă.

În urma fixării factorilor de transcripţie pe aceste secvenţe, cromatina se

decondensează, ceea ce permite ataşarea ARN-polimerazei lângă situsul de iniţiere şi

declanşarea transcrierii.

Factorii de transcripţie

Factorii de transcripţie (transcription factors) (FT) sunt proteine trans-reglatoare care

recunosc şi se leagă de secvenţele de reglare (cis) ale ADN. Pentru transcrierea unei gene

umane este necesară interacţiunea mai multor FT (se cunosc sute de FT).

Toţi factorii de transcripţie conţin două domenii: un domeniu de activare (care

activează transcrierea) şi un domeniu de fixare la ADN; domeniul de fixare are o structură

particulară de aminoacizi ce formează un motiv structural; în funcţie de aceasta, se descriu

mai multe tipuri de FT:

• Proteine helix-buclă-helix (helix-loop-helix) la care domeniul de fixare este format

din două α-helixuri separate printr-o buclă scurtă ; acest model structural este prezent la FT

care stimulează sinteza de imunoglobuline.

• Proteine cu degete de zinc (zinc finger), în care aminoacizii se dispun în spaţiu sub

forma unor degete de mănuşă, la baza cărora se fixează un ion de zinc (Zn2+) (cel mai frecvent

de cisteină sau histidină) (fig. 4.11); acestea se întâlnesc în structura FT ai promotorului

genelor menajere

• Proteine cu fermoar de leucine (leucine zipper) sunt proteine dimerice; fiecare

monomer, α-helicoidal, conţine câte o leucină la fiecare şapte aminoacizi (fig. 4.13). Cele

două helixuri interacţionează strâns (ca un fermoar), mai ales prin legături între leucine. Acest

tip de FT se găsesc la unele protooncogene.

Deoarece aceste secvenţe sunt situate adesea la distanţe foarte mari, în amonte sau în

aval de situsul de iniţiere, se presupune că activatorul fixat pe secvenţa intensificatoare

interacţionează cu o componentă a complexului bazal de transcripţie, formând o buclă de

ADN care apropie cele două secvenţe.

Factorii de transcripţie sunt codificaţi de aşa-numitele gene reglatoare (master genes

sau selector genes), situate aproape sau la distanţă mare (40.000 pb) de genele pe care le

controlează.

Promotori alternativi

Unele gene umane au doi sau mai mulţi promotori. Prin folosirea lor alternativă

rezultă diferite izoforme ale unei proteine, cu proprietăţi diferite. Alegerea promotorilor nu se

face la întâmplare, ci prin acţiunea unor factori trans-reglatori, dintre care unii specific

tisulari. Selectarea promotorilor are loc, de exemplu, în cazul genei distrofinei, care are cel

puţin opt promotori. Patru promotori sunt situaţi în regiunea 5’ şi sunt specifici pentru

cortexul cerebral, cerebel, muşchi, limfocite; datorită folosirii unui prim exon diferit, produc

patru izoforme de distrofină, diferite prin capătul N-terminal. Ceilalţi patru promotori sunt

intragenici, în structura cadrului de citire; atunci când transcripţia începe la nivelul acestor

promotori sunt folosiţi numai o parte din exoni, rezultând izoforme mici de distrofină prezente

în retină, celulele Schwann, rinichi.

27. Reglarea postranscripţională

După transcripţie, reglarea expresiei genelor poate consta într-o modificarea calitativă

sau cantitativă a ARNm.

(1) În procesul de matisare exonii sunt reuniţi, de cele mai multe ori, în ordinea în care

sunt dispuşi în gene - matisare constitutivă (constitutive splicing)

La numeroase gene umane, din ARNm precursor sunt eliminaţi atât intronii, cât şi o

parte din exoni; moleculele de ARN matur conţin doar anumiţi exoni care păstrează ordinea în

care sunt dispuşi în genă. Prin acest proces de matisare alternativă (alternative splicing),

dintr-un transcript primar se formează molecule diferite de ARNm matur. În felul acesta o

genă poate determina sinteza mai multor proteine diferite.

Uneori, aceste proteine sunt izoforme, având funcţii similare. Alteori se produc

proteine complet diferite ca structură şi funcţie; de exemplu, gena calcitoninei produce în

celulele C din glanda tiroidă calcitonina (hormon cu rol în reglarea metabolismului fosfo-

calcic), iar în hipotalamus un peptid înrudit cu calcitonina (calcitonin-related peptide) (cu

funcţii neuromodulatoare şi trofice).

(2) Amestecarea exonilor (exon shuffling) reprezintă un alt proces prin care, din

aceeaşi genă, se obţin proteine cu structuri şi funcţii diferite: ARNm matur conţine toţi exonii,

dar într-o ordine diferită faţă de genă;

(3) Editarea ARN (RNA editing) este o formă rară de procesare a ARNm în care se

produce deleţia, inserţia sau substituţia unui nucleotid. În felul acesta, în ţesuturi diferite

acelaşi ARNm îşi modifică structura, producând proteine diferite ca lungime. La om,

fenomenul de editare a fost descris în gena pentru apolipoproteina B (apoB este un transportor

de grăsimi); în intestinul subţire, în codonul 2152 al ARNm pentru apo B, C este înlocuită cu

U, transformând un codon sens într-un codon stop, oprind astfel translaţia (varianta scurtată a

apo B leagă şi transportă grăsimile de origine alimentară); în ficat, acelaşi ARNm nu este

modificat, producând o proteină apo B mai lungă (transportă grăsimile sintetizate de către

ficat).

(4) Poliadenilarea alternativă

Genele care conţin la nivelul regiunii 3’UTR două sau mai multe situsuri de

poliadenilare pot suferi procese de adenilare alternativă, specifice pentru anumite ţesuturi.

(5) Modificarea stabilităţii (duratei de viaţă) a ARNm

Durata de viaţă a ARNm depinde de cantitatea acestuia. De exemplu, ARNm al

histonelor are o stabilitate crescută în timpul replicării ADN, când sinteza acestor proteine

este intensă, şi foarte scăzută în alte faze ale ciclului celular. ARNm al unor protooncogene

are o stabilitate anormal de crescută şi determină o sinteză excesivă a proteinelor

corepunzătoare.

(6) Modificarea stocajului ARNm

După transcripţie moleculele de ARNm pot fi stocate în nucleu sau citoplasmă printr-

un mecanism încă necunoscut. Unii hormoni pot produce o creştere rapidă a sintezei de

proteine prin eliberarea ARN stocat şi nu prin stimularea transcripţiei.

29. Elemente implicate în replicarea ADN

(1) Dezoxiribonucleotide activate (dezoxiribonucleozide trifosfat - dNTP):

dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxiguanozintrifosfat (dGTP), dezoxicitidintrifosfat

(dCTP) şi dezoxitimidintrifosfat (dTTP). Ruperea legăturilor fosfat macroergice dintre fosfaţii

α şi β eliberează două grupuri fosfat şi formează dezoxiribonucleotide activate.

(2) Matriţa (tipar) este reprezentată de fiecare catenă parentală de ADN.

(3) Enzimele care catalizează sinteza de ADN sunt numite ADN-polimeraze. La om

au fost identificate cinci ADN-polimeraze, notate α, β, γ, δ şi ε; replicarea ADN nuclear este

realizată de ADN-polimeraza δ, enzima majoră a replicării şi ADN-polimeraza α; ADN-

polimeraza γ realizează replicarea ADN mitocondrial, iar ADN-polimerazele β şi ε sunt

implicate în repararea ADN.

(4) ADN-helicazele catalizează desfacerea dublului helix de ADN (folosind energie

rezultată din ruperea legăturilor fosfat macroergice) şi eliberează monocatenele matriţă.

Helicazele acţionează în puncte specifice numite origini de replicare, asigurând apoi

înaintarea furcii de replicare prin ruperea legăturilor de hidrogen, despiralizarea şi deschiderea

moleculei, pentru a deveni accesibilă diferitelor proteine ale replicării.

(5) Proteinele de replicare A (RPA), numite şi proteine de legare a monocatenelor

ADN sau proteine SSBP (single-strand binding protein) menţin separate cele două catene

desfăcute de helicaze; SSBP se fixează la monocatenele ADN şi împiedică reîmperecherea

bazelor, deci respiralizarea.

(6) ADN-topoizomerazele I şi II. Despiralizarea dublului helix fără rotaţia acestuia

crează în aval de furca de replicare nişte superhelixuri (asemănător separării bruşte a firelor

răsucite dintr-o frânghie); topoizomerazele rup legăturile fosfodiester la nivelul uneia

(topizomeraza I) sau a ambelor catene (topizomeraza II), produc rotaţia liberă a capetelor

helixului şi apoi resudarea lor; în acest fel topoizomerazele detensionează (relaxează)

molecula de ADN.

(7) Primaza este o ARN-polimerază specifică implicată în sinteza primerului şi

replicarea catenei „întârziate”. ADN-polimerazele nu pot iniţia replicarea, o pot doar

continua. Astfel, sub acţiunea primazei se sintetizează primerul, un fragment scurt de ARN

(10-12 nucleotide), complementar cu catena matriţă; ADN-polimeraza α adaugă, la capătul

OH 3’ al primerului, circa 30 de dexoxiribonucleotide. Primaza şi ADN-polimeraza α sunt

apoi îndepărtate, sinteza lanţului continuând sub acţiunea ADN-polimerazei δ.

(8) Proteinele de replicare C (RPC) se leagă la joncţiunea dintre primer şi matriţă,

stabilizând interacţiunea ADN-polimerazei cu matriţa ADN.

(9) Antigenul nuclear de proliferare celulară (PCNA – Proliferating Cell Nuclear

Antigen) se leagă în imediata vecinătate a proteinelor C; ambele controlează pornirea sau

oprirea replicării.

(10) Ribonucleaza H1 (RNaza H1) îndepărtează primerul ARN, folosit pentru

iniţiera replicării; lacuna rămasă este completată de ADN-polimeraza δ, iar sudarea capetelor

este realizată de către o ADN-ligază, refăcând continuitatea catenei.

30.Mecanismul molecular al replicării ADN

Procesul de replicare începe în puncte specifice numite origini de replicare (ori) şi,

de aici, progresează în ambele direcţii, până ce ADN este complet duplicat . La nivelul

originilor de replicare, pe ADN se fixează enzimele replicării: topoizomerazele, helicazele,

primazele, ADN-polimerazele.

Dublul helix este despiralat sub acţiunea topoizomerazelor, iar catenele sunt separate

temporar de către helicaze, formând furca de replicare, o structură în formă de Y. Pe fiecare

catenă separată se fixează proteinele SSB (RPA), care împiedică reîmperecherea bazelor

complementare şi refacerea spontană a dublului helix.

Pe cele două catene matriţă, ADN-polimeraza δ ataşează secvenţial şi complementar

dezoxiribonucleotidele activate.

Polimerizarea nucleotidelor se face diferit pe cele două catene, care sunt antiparalele.

ADN-polimeraza nu poate începe sinteza prin legarea a două nucleotide; ea poate doar să

adauge nucleotide la capătul 3’OH al unui lanţ preexistent (ADN-polimeraza poate numai să

alungească catena în curs de sinteză); de aceea necesită utilizarea unui primer ARN, sintetizat

sub acţiunea primazei. Sinteza se poate efectua numai în sensul 5’-3’. Astfel numai una din

cele două catene, denumită catenă conducătoare sau directoare (leading strand) (catena

care are ca matriţă catena 5’-3’) poate fi sintetizată în mod continuu şi în sensul deplasării

furcii de replicare.

Cealaltă catenă - catena întârziată (lagging strand) (catena care are ca matriţă catena

3’-5’) - este sintetizată discontinuu şi mai lent, sub formă de secvenţe scurte (100-1000

nucleotide) denumite fragmente Okazaki; sinteza fiecărui fragment are loc în sens opus celui

în care se deplasează furca de replicare.

Primerul este eliminat prin hidroliză şi înlocuit cu secvenţe ADN, sub acţiunea ADN-

polimerazei δ, iar fragmentele sunt unite de către o ADN-ligază. Primerul este necesar numai

la începutul replicării pentru catena conducătoare, iar pentru catena întârziată la sinteza

fiecărui fragment Okazaki

31. Particularităţile replicării ADN la eucariote

(1) Datorită dimensiunii mari a genomului şi asocierii cu proteine, viteza de replicare

este mai redusă – circa 50 nucleotide/secundă (faţă de 500 nucleotide/secundă la procariote).

Replicarea începe în mai multe puncte de origine (secvenţe specifice de ADN) care

corespund unităţilor de replicare numite repliconi. Replicarea progresează bidirecţional

pentru fiecare replicon şi, după ce se termină, repliconii fuzionează treptat până ce întregul

cromozom este duplicat.

(2) Comportamentul proteinelor nucleozomale în timpul replicării încă nu este

cunoscut cu precizie; se ştie însă că, odată cu siteza ADN, în nucleu are loc şi o intensă

sinteză de histone, necesare formării de noi nucleozomi.

(3) Replicarea are loc în faza S a ciclului celular şi durează, în celulele umane, circa 8

ore (la un ciclu celular de 24 de ore). Deoarece acest timp este scurt pentru replicarea celor

peste 6 miliarde de pb din genomul uman, uneori pot apare erori.

Relicarea este reglată de o serie de proteine:

• diferite cicline asigură trecerea din faza G1 în faza S, precum şi progresia prin faza S;

• CDK4 este o protein-kinază activatoare

• anumiţi factori de transcripţie activează punctele de origine, iar alţii stimulează

expresia genelor necesare intrării în faza S;

• Inhibitorii kinazelor dependente de cicline - CKI - blochează intrarea şi progresia

prin faza S (prin inhibarea complexelor CDK-cicline şi PCNA) atunci când apar leziuni ale

ADN sau când un ţesut a încheiat diferenţierea.

Replicarea celor 20-80 de repliconi nu este sincronă şi se realizează într-o anumită

ordine, în funcţie de structura cromatinei: la începutul fazei S este replicată eucromatina, iar

la sfârşitul fazei S este replicată heterocromatina.

În mod normal, întregul genom este replicat în faza S o singură dată.

(4) Replicarea telomerelor

Telomerele sunt alcătuite din secvenţe hexamerice repetitive TTAGGG dispuse în

tandem pe o lungime de 5-20 kb. Un fenomen caracteristic telomerelor este pierderea de

secvenţe ADN la fiecare replicare, deoarece, la capătul 5’ al catenelor nou sintetizate

replicarea este incompletă, pierzându-se la fiecare ciclu celular între 25 şi 200 pb. Aceasta

duce la scurtarea progresivă a telomerelor şi, după un număr de replicări (maximum 80 la

celulele somatice, când este atinsă limita critică de circa 1,5 kb), la oprirea replicării şi a

diviziunii.

La nivelul celulelor germinale, în succesiunea generaţiilor, lungimea telomerelor rămâne nemodificată datorită acţiunii enzimei telomeraza. Telomeraza este o reverstranscriptază specială care conţine o secvenţă scurtă de ARN, complemetară secvenţelor repetitive telomerice; telomeraza adaugă secvenţe TTAGGG la capătul 3’, fără a necesita o matriţă (fig. 5.4.).

În majoritatea celulelor somatice, expresia genei telomerazei este inhibată încă din stadiul embrio-fetal. Dispariţia activităţii telomerazei după naştere determină scurtarea progresivă a telomerelor după fiecare diviziune, pe măsura înaintării în vârstă. Când este atinsă o lungime critică, diviziunea se opreşte şi începe senescenţa. Pierderea telomerelor produce, de asemenea, instabilitate genomică, urmată adesea de rearanjamente cromozomiale.

Telomeraza este reactivată în celulele canceroase (vezi Cap. Boala canceroasă).

(5) Procesul de replicare este realizat de către ADN-polimeraze cu mare fidelitate: rata erorilor de împerechere (mismatch) este de circa 1/109.

ADN-polimeraza are, în primul rând, capacitatea de a poziţiona corect bazele

complementare (probabil pe baza conformaţiei tridimensionale). În al doilea rând, ADN-

polimerazele δ şi ε au activitate de corectare (proofreading), înlăturând nucleotidele greşit

încorporate printr-o acţiune 3’-5’- exonucleazică.

Puţinele erori de împerechere care apar în prezenţa mecanismelor menţionate sunt

reparate.

32. Recombinarea genetică

Fenomenul recombinării genetice conduce la apariţia unor combinaţii genetice noi

(recombinanţi) prin rearanjarea (reasortarea şi redistribuirea) materialului genetic de la doi

genitori diferiţi. Procesul este foarte larg răspândit, asigurând, în limite naturale, variabilitatea

informaţiei ereditare.

Recombinarea genetică are loc în perioadele preconcepţională şi concepţională şi este

de două tipuri: cromozomială şi genomică.

1. Recombinarea cromozomială are loc în gametogeneză şi poate fi intra- şi

intercromozomială.

• Recombinarea intracromozomială (omoloagă) este reprezentată prin procesul de

crossing-over cromozomial, care se realizează în profaza primei diviziuni meiotice (vezi

Gametogeneza), în urma căruia are loc un amestec de gene între cromozomii omologi paterni

şi materni. Această recombinarea intragenică produce o genă hibridă (fuziune genică) ce

conţine fragmentul terminal dintr-o alelă şi restul de secvenţă din cealaltă alelă (fig. 6.1.).

• Recombinarea intercromozomială se realizează ca urmare a segregării bivalenţilor

din tetradă în anafaza meiozei primare, repartizarea unei perechi de omologi în celulele-fiice

fiind întâmplătoare şi independentă de celelalte perechi. Consecinţa segregării întâmplătoare

şi independente o reprezintă faptul că fiecare gamet dobândeşte o combinaţie diferită de

cromozomi paterni şi materni.

2. Recombinarea genomică are loc în fecundare prin reasortarea (amestecarea)

cromozomilor (genomilor) din cei doi gameţi (de la doi indivizi diferiţi), determinând apariţia

unor descendenţi care diferă genetic atât de cei doi genitori, cât şi între ei: pentru fiecare

gamet există 223= 8.388.608 variante de combinaţii cromozomiale, iar pentru fiecare zigot

există 246 posibilităţi (246 = 70.368.744.177.664).

Cele trei tipuri de recombinare au loc secvenţial, permiţând amplificarea diversificării

genetice a indivizilor dintr-o specie.

Recombinarea genetică duce, în timp, la diversificarea fondului genetic al speciei prin:

creşterea spectrului de genotipuri individuale, creşterea gradului de heterozigoţie şi apariţia

indivizilor mai viabili şi mai fertili.

Fiecare individ este un unicat genetic (la nivel molecular, celular, fiziologic,

morfologic şi psiho-comportamental). Individualitatea genică explică, printre altele,

capacitatea diferenţiată de adaptare, predispoziţia diferită la diversele boli, răspunsul diferit al

indivizilor la administrarea unui medicament, compatibilitatea sau incompatibilitatea grefelor

etc.

33. Mutaţiile: definitie, clasificare

Mutaţiile sunt modificări accidentale (nenaturale), permanente şi ereditare

(transmisibile în succesiunea generaţiilor) ale secvenţei de nucleotide din ADN. Aceste

modificări produc variante alelice ale secvenţei de ADN (genic sau extragenic).

Clasificarea mutaţiilor

a) În funcţie de mărimea materialului genetic interesat, se deosebesc trei categorii

de mutaţii: genice, cromozomiale şi genomice.

Mutaţiile genice interesează secvenţa de nucleotide a unei gene. Mutaţiile

cromozomiale produc modificări ale structurii cromozomilor şi, implicit ale ordinii genelor în

cromozomi (rearanjări sau remanieri cromozomiale). Mutaţiile genomice sunt modificări ale

numărului diploid al cromozomilor: aneuploidie – când sunt afectate 1-2 perechi, sau

poliploidie – când sunt afectaţi toţi cromozomii.

b) După tipul celular afectat: mutaţii somatice şi germinale. Mutaţiile somatice sunt

mai frecvente; nu se transmit la urmaşi, ci numai de la o celulă la alta, formând o clonă

celulară (populaţie celulară) anormală – mozaicism somatic; sunt răspunzătoare de apariţia

cancerului şi de accelerarea procesului de îmbătrânire. Mutaţiile germinale sunt mai rare şi

nu afectează individul, dar se transmit la urmaşi (sunt ereditare);.

c) În funcţie de cauză, mutaţiile se clasifică în spontane şi induse. Mutaţiile spontane

sunt mutaţii ale căror factori cauzali (de cele mai multe ori naturali) nu pot fi identificaţi (se

consideră adesea a fi rezultatul unor erori de copiere în cursul procesului de replicare).

Mutaţiile induse sunt mai frecvente şi sunt produse sub acţiunea unor factori fizici (radiaţii

ionizante), chimici sau biologici.

Modificarea informaţiei genetice nu este, obligatoriu, însoţită de modificarea

fenotipului. Majoritatea mutaţiilor germinale ale ADN extragenic nu se exprimă fenotipic, ele

fiind neutre; sunt responsabile de producerea unor variante alelice care formează

polimorfismul ADN. Mai rar, mutaţiile pot avea efecte benefice (avantajoase), determinând o

adaptare mai bună la mediu, la diferite agresiuni din mediul extern sau creşterea fitness-ului.

Alterori ele sunt dezavantajoase (detrimentale, patogene), implicate în producerea unor boli;

mutaţiile reprezintă, de altfel, cea mai importantă cauză de boală la om.

34. Substituţia - înlocuirea unei singure baze azotate - reprezintă cel mai frecvent tip

de mutaţie la om şi poate fi de două tipuri:

tranziţia, constând în înlocuirea unei baze purinice (A sau G) sau pirimidinice

(C sau T) cu o bază de acelaşi tip;

transversia, mai rar întâlnită, în care o bază purinică (A sau G) este înlocuită

cu o bază pirimidinică (C sau T) şi invers.

Consecinţele substituţiei asupra informaţiei genetice

Substituţia unui nucleotid poate avea consecinţe diferite în funcţie de localizarea

mutaţiei: secvenţe codante, necodante sau secvenţe reglatoare ale genei.

(1) În regiunile codante (exoni), substituţia poate interesa un codon sens sau non-

sens.

► Substituţia într-un codon sens poate produce:

a) un codon sens sinonim, care codifică acelaşi aminoacid; poplipeptidul codificat

rămâne neschimbat, deci mutaţia este neutră din punct de vedere fenotipic şi evolutiv şi se

numeşte mutaţie silenţioasă (mută) (silent mutation) sau sinonimă; circa 25% din mutaţiile

punctiforme sunt silenţioase.

GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

GUU AAA GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

b) un alt codon sens care va codifica un aminoacid diferit; aceste mutaţii sunt

nesinonime, deoarece modifică sensul unui codon şi sunt denumite mutaţii cu sens greşit

(missense mutations).

Substituţiile cu sens greşit pot fi clasificate în:

- conservative - când aminoacidul este înlocuit cu altul similar din punct de vedere

chimic şi funcţional (de exemplu, arginina şi lizina), astfel că efectul asupra funcţiei proteinei

este minim;

- neconservative - înlocuirea unui aminoacid cu un altul diferit din punct de vedere

chimic şi funcţional şi care modifică funcţia proteinei; aceste mutaţii sunt cele mai frecvente

în patologia umană (50%).

GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

GUU AAG GAU GCU → Val – Lys – Asp – Ala

ex. HbS din anemia drepanocitară (mutaţia GAG→GTG duce la înlocuirea acidului

glutamic cu valina).

c) un codon non-sens sau stop, care nu codifică nici un aminoacid; urmarea o

constituie terminarea prematură a procesului traducerii, cu formarea unui ARNm mai scurt,

iar dacă acesta este stabil, va rezulta o proteină de dimensiuni mai reduse, nefuncţională (de

obicei instabilă, mai alesa dacă mutaţia se produce la începutul genei); aceste mutaţii, numite

mutaţii fără sens (nonsens mutation), reprezintă circa 12% din mutaţiile produse la om; de

exemplu în talasemii (anemii hemolitice datorate producerii insuficente fie de lanţuri α, fie de

lanţuri β ale globinei).

► Substituţia într-un codon nonsens poate produce:

a) un codon sens, care codifică un aminoacid; astfel transcripţia va continua până la

următorul codon stop, formându-se un ARNm şi un poplipeptid anormal de lungi.

b) un alt codon stop (foarte rar), mutaţia fiind fără efect asupra proteinei.

(2) În regiunile necodante intragenice mutaţia interesează cel mai frecvent intronii

(10-15% din mutaţii). Substituţia se produce la nivelul situsurilor de clivare (splicing) a

intronilor (splice site mutation), adică situsul donor 5-GT sau acceptor AG-3’; mutaţia acestor

situsuri poate avea următoarele efecte:

- abolirea (pierderea) situsurilor de clivare a unui intron; clivarea se produce la

următorul exon şi astfel în ARNm matur se va găsi o secvenţă intronică sau va lipsi un exon

(exon skipping), în funcţie de situsul afectat;

- activarea unor situsuri criptice de clivare (secvenţe similare unui situs autentic); în

ARNm matur va fi prezent un fragment de intron sau va lipsi o parte din exon.

În ambele situaţii produsul matisării este nefuncţional.

(3) Mutaţiile secvenţelor reglatoare conduc la o funcţionare anormală a

mecanismelor de control ale expresiei unei gene normale. Astfel, gena se poate exprima într-

un ţesut neadecvat (unde în mod normal gena ar trebui să fie represată – exprimare ectopică)

sau la un moment nepotrivit. Aceste mutaţii afectează cantitatea de proteină sintetizată.

Mutaţiile promotorului modifică rata transcripţiei, iar cele ale situsului de poliadenilare

influenţează stabilitatea moleculei de ARNm.

GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

GUU UAG GAU GCU → Val – stop

35. Deleţii şi inserţii mici (microdeleţii, microinserţii)

Deleţia (pierderea) sau inserţia (introducerea) unuia sau a mai multor nucleotide

reprezintă circa 25% din totalul mutaţiilor la om.

• Dacă deleţiile sau inserţiile sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce pierderea

sau adăugarea unor aminoacizi în proteină.

GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

GUU ---- GCU GCU → Val – Ala – Ala

De exemplu, la europeni, circa 70% din cazurile de fibroză chistică sunt produse de

mutaţia F508del (prin deleţia a trei nucleotide din gena CF se pierde fenilalanina din poziţia

508 a proteinei CFTR)

• Dacă deleţiile sau inserţiile nu sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce o

decalare a cadrului de citire al genei de la locul în care s-a produs deleţia sau inserţia. Aceste

mutaţii, numite mutaţii cu modificarea cadrului de citire (frameshift mutations), alterează

întreaga secvenţă de aminoacizi în aval de locul mutaţiei.

GUU AAG GCU GCU → Val – Lys – Ala – Ala

GUU – AGG CUG CU → Val – Arg – Leu

36. Leziuni extinse (remanieri genice aberante)- crossing-over inegal

Leziunile extinse se produc prin schimburi între două secvenţe alelice sau nealelice de

ADN şi sunt mai rare în patologia umană. Cel mai important mecanism este recombinarea

omoloagă nealelică (RON) produsă între secvenţe similare situate în regiuni diferite ale

cromozomilor. Ea se produce cel mai frecvent în profaza meiozei primare (când are loc

împerecherea omologilor) şi constă într-un schimb reciproc inegal - crossing-over inegal ,

prin care se modifică ambele cromatide (unul dintre cromozomi va avea o duplicaţie a unei

secvenţe, iar celălalt o deleţie a aceleiaşi secvenţe).

37. Mutaţii dinamice (instabile)

Conform conceptului clasic, mutaţiile sunt modificări permanente, stabile, care se

transmit nemodificate la descendenţi. Recent (după 1991) a fost descoperită o nouă clasă de

mutaţii, complet diferită de mutaţia clasică, denumită mutaţie dinamică (instabilă, extensia

sau amplificarea repetărilor trinucleotidice)

Mutaţiile dinamice sunt reprezentate de creşteri ale numărului unor secvenţe repetitive

trinucleotidice (CAG, CTG, CGG sau GAA) dispuse în tandem în exoni, introni sau la

capetele genei. Caracteristica fundamentală a acestor mutaţii o constituie instabilitatea lor,

exprimată prin creşterea, cu ocazia diviziunilor celulelor purtătoare, a numărului de copii ale

respectivelor secvenţe repetitive. Până a deveni manifeste, se numesc premutaţii,

caracterizate doar prin instabilitate; odată depăşit numărul critic de repetări, mutaţia este

completă, se manifestă fenotipic şi se accentuează pe măsura creşterii repetărilor.

Ca urmare a extensiei (creşterii) progresive a repetărilor pe măsura diviziunii celulelor

liniei sexuale, bolile produse de mutaţii dinamice, transmise de obicei dominant, se

caracterizează prin fenomenul de anticipaţie: debutează mai precoce şi prezintă

simptomatologie mai severă în succesiunea generaţiilor. Formele cele mai severe se transmit

mai des prin unul din părinţi – efect parental.

În majoritatea lor, variaţiile numerice ale repetărilor trinucleotidice sunt lipsite de

efecte fenotipice. Sunt cunoscute, până în prezent, mai multe excepţii, reprezentative fiind:

- expansiunea CGG la nivelul promotorului genei FMR1 (Frax Mental Retardation)

de pe cromozomul X (Xq27.3) (6-50 repetări în gena normală, 50-200 în premutaţie) de la

230 la peste 1000. Mutaţia produce o metilare anormală a repetiţiilor CGG şi apariţia situsului

fragil pe Xq, asociat cu inhibarea expresiei genei FMR1 şi instalarea sindromului X fragil,

transmis XD.

- expansiunea CAG la nivelul exonului 1 al genei umane HD (codifică huntingtina) de

pe cromozomul 4p16.3; gena normală conţine un număr de repetări mai mic de 26; o creştere

a repetărilor peste 37 la nivelul genei produce boala Huntington, transmisă AD; expansiunea

modifică funcţia proteinei, generând o secvenţă poliglutamică anormală

- repetarea între 50 şi câteva mii de ori a secvenţei CTG din regiunea 3’ netradusă a

genei DMPK (codifică o protein-kinază) (alela normală conţine între 5 şi 30 de repetări)

determină apariţia distrofiei miotonice Steinert, transmisă AD.

Mecanismul de producere a expansiunii nu este cunoscut exact; se presupune că este

rezultatul alinieri greşite şi împerecheri decalate a repetărilor trinucleotidice - glisare

replicativă.

C. Cauzele mutaţiilor genice

Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale

procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi

mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice

modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în

activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),

respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN

sunt:

- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,

adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau

apirimidinice);

- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;

- rupturi monocatenare şi bicatenare.

38.Cauzele mutatiilor spontane

Cauzele mutaţiilor genice

Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale

procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi

mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice

modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în

activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),

respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN

sunt:

- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,

adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau

apirimidinice);

- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;

- rupturi monocatenare şi bicatenare.

Mutaţii spontane. Cele mai importante mecanisme de producere a mutaţiilor

spontane sunt:

(1) Erori ale procesului de replicare

• Modificări spontane de tipul formelor tautomere ale bazelor. Formele cetonică

(C=O) şi aminică (C-NH2) sunt mai stabile, adică mai „normale” din punct de vedere genetic,

dar pentru perioade scurte de timp bazele pot exista şi în formele enolică (C-OH), respectiv

iminică (C=NH), mult mai instabile; de exemplu, forma imino a adeninei nu formează

legături de hidrogen cu timina, ci cu citozina.

(2) Leziuni spontane pot apare prin dezaminare sau depurinare a bazelor.

• Citozina suferă adesea o dezaminare spontană, transformându-se în uracil (bază

anormală pentru ADN) şi astfel perechea de baze CG este transformată într-o pereche AT (U

se aseamănă structural cu T), deci s-a produs tranziţia C→T (fig. 6.3.). Această tranziţie este

frecventă la nivelul dinucleotidul CG din regiunea promotoare a genelor. Dezaminare

spontană poate suferi şi adenina, guanina sau 5-metilcitozina, transformându-se în

hipoxantină, xantină, respectiv timină.

• La temperaturi crescute sau scăderea pH-ului celular, legătura N-glicozidică dintre o

bază purinică şi dezoxiriboză poate fi scindată prin hidroliză - depurinare spontană,

rezultând un situs apurinic.

39.Cauzele mutatiilor induse(radiatiile)

Cauzele mutaţiilor genice

Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale

procesului de replicare) sau pot fi induse de agenţi din mediul extern sau intern numiţi

mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determină leziuni ADN, definite ca fiind orice

modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezintă semnalul pentru intrarea în

activitate a mecanismelor reparatorii; în lipsa refacerii structurii normale (reparării),

respectivele modificări se fixează sub formă de mutaţii. Principalele tipuri de leziuni ADN

sunt:

- modificări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări,

adiţii, substituţii sau pierderi de baze şi crearea de situsuri abazice (apurinice sau

apirimidinice);

- formarea de punţi intracatenare sau intercatenare;

- rupturi monocatenare şi bicatenare.

Mutaţii induse

Mutaţiile induse sunt produse de agenţi mutageni din mediul extern sau intern.

(1) Factorii mutageni din mediul extern (radiaţii ultraviolete, radiaţii ionozante,

agenţi chimici) produc diferite alterări ale structurii ADN.

• Cele mai frecvente sunt radiaţiile ultraviolete (componente ale radiaţiei solare) care

produc dimerizarea pirimidinelor adiacente (în special a timinelor adiacente) (fig. 6.4.).

• Agenţii carcinogeni - fum de ţigară, poluanţi atmosferici (agenţi alchilanţi sau

metilanţi, hidrocarburi policiclice în produşii de combustie), gudroane, medicamente

antitumorale, difeite metale – produc adiţii ale unor radicali chimici.

• Radiaţiile ionizante cuprind undele elecromagnetice cu lungime de undă foarte mică

(raze X şi raze gama) şi particule cu energie înaltă (particule alfa şi beta, neutroni). Sursele de

radiaţii la care sunt expuse populaţiile umane sunt naturale (radiaţii cosmice, materiale

radioactive) şi artificiale (radiologie diagnostică sau terapeutică, expunere profesională,

expunere accidentală). Cantitatea de radiaţii pătrunsă în ţesut se numeşte doză de

radiaţii şi se măsoară în doză absorbită de radiaţii – rad (radiation absorbed dose). Deoarece

oamenii sunt expuşi la mai multe surse, se foloseşte unitatea rem (roentgen equivalent for

man). Un rem de radiaţie este doza absorbită ce produce acelaşi efect biologic ca 1 rad de raze

X. 100 rem echivalează cu 1 Sievert (Sv). Doza medie de radiaţii primită de gonade este de

2,4 Sv pe an şi 72 Sv pe perioadă reproductivă (30 de ani) sau 6-7 rem pe an şi 30-80 rem

pe 30 de ani.

Radiaţiile ionizante (X, gama) produc mai ales rupturi mono- sau bicatenare ale

ADN-ului, dar dozele sunt foarte scăzute, permiţând sistemelor de reparare să remedieze

leziunile. Uneori, acestea sunt lipsite de eficienţă, putând apărea mutaţii, care sunt, de obicei,

sub formă recesivă.

Radiaţiile ionizante au efect cumulativ în timp, care depinde de doza totală încasată.

Riscul este mic la nivelul populaţiei generale, dar mai crescut la persoanele expuse

profesional.

• O serie de substanţe chimice au efect mutagen prin:

- interferare cu sinteza ADN: analogii bazelor azotate (au structură similară bazelor

normale, putând fi încorporate accidental în ADN): de exemplu 5-bromouracil, cofeina

(analogi ai timinei), 2-aminopurina (analog al adeninei)

- alterarea structurii ADN: azot iperita, acridinele, epoxizii

• Dintre factorii biologici, cei mai importanţi sunt virusurile:

- virusurile oncogene produc modificări structurale la nivelul cromozomilor (sesizat

pentru viruşii rubeolei, parotiditei epidemice, herpetici).

- la unii viruşi, efectul mutagen constă în inserţia lor în genomul celulei gazdă şi

decalarea cadrului de citire.

(2) Factorii mutageni din mediul intern. Cei mai importanţi sunt speciile reactive de

oxigen (peroxizi de hidrogen, radicali hidroxil) şi produşii de peroxidare a lipidelor

(acroleina, malodialdehida). Dacă sistemele antioxidante de reparare nu sunt eficiente, aceşti

agenţi produc substituţii de baze şi rupturi monocatenare.

40. Repararea erorilor de împerechere

Obişnuit, în cursul procesului de replicare ADN-polimerazele poziţionează

nucleotide activate pe baza complementarităţii. Uneori, însă, se produce o împerechere

greşită, necomplementară (mai ales G-T) (cu o probabilitate de 1:10.000), care crează

distorsiuni ale dublului helix, acestea acţionând ca semnal pentru îndepărtarea bazei inserate

greşit.

ADN-polimerazele pot interveni şi printr-un alt mecanism important – de

autocorectare (proofreading). Enzimele verifică dacă la capătul 3’OH nu s-a produs o

împerechere greşită; dacă a apărut o eroare, îndepărtează nucleotidul necomplementar prin

capacitatea 3’-5’ exonucleazică (ruperea legăturii fosfodiester de la capătul 3’) pe care o

posedă ADN-polimerazele δ şi ε.

Puţinele erori care apar în ciuda acestor mecanisme sunt supuse după replicare unor

mecanisme de reparare a erorilor de împerechere MMR (mismatch repair). Cele mai

importante enzime din sistemul MMR sunt codificate de genele Mut H, Mut L şi Mut S (la om

MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 şi PMS2). Produşii acesor gene recunosc împerecherile greşite

(care produc o distorsiune a catenei nou sintetizate); procesul de reparare constă în clivarea şi

degradarea exonucleazică a fragmentului (de peste 1-2 Kb) ce conţine eroarea şi refacerea

secvenţei normale (în care sunt implicate ADN-polimerazele δ şi ε). Mutaţiile genelor din

sistemul MMR sunt implicate în producerea cancerului non-polipozic colorectal ereditar.

41. Repararea bazelor modificate după replicare

Bazele azotate pot fi modificate postreplicativ sub acţiunea unor agenţi exogeni sau

endogeni.

(1) Mecanismul de reparare prin excizia bazei (base excision repair – BER)

intervine în cazul leziunilor produse de agenţi endogeni. O bază modificată chimic (cel mai

frecvent prin dezaminare spontană) este îndepărtată sub acţiunea unei ADN-glicozilaze, care

clivează legătura N-glicozil dintre baza azotată şi dezoxiriboză. Se produce astfel un situs

abazic (apurinic/apirimidinic) care este recunoscut de către endonucleaza APE1

(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1), enzima esenţială pentru acest tip de reparare la om.

Enzima clivează catena ADN la capătul 5’ al situsului abazic, după care intervine ADN-

polimeraza β care îndepărtează reziduul 5’-dezoxiribozo-fosfat, introduce nucleotidul

corespunzător, iar continuitatea catenei este refăcută de către o ligază.

(2) Reparare fără excizia bazei sau repararea directă monoenzimatică (base

excision repair – BER) intervine în cazul leziunilor produse de agenţi alchilanţi (endogeni sau

exogeni). Agenţii alchilanţi transferă gruparea metil în situsurile reactive ale bazelor azotate,

de exemplu în cel al guaninei rezultând o guanină metilată (care se poate împerechea cu

timina). Modificările produse de agenţii alchilanţi sunt reparate direct, fără a îndepărta bazele

azotate, de o enzimă specifică numită metilguanin metil-transferaza (MGMT); aceasta

transferă gruparea metil de la nivelul metilguaninei pe un reziduu propriu de cisteină formând

metilcisteina (care inactivează enzima). Astfel la fiecare reparare este distrusă o întreagă

enzimă, iar mecanismul de reparare nu poate face faţă atunci când leziunile sunt produse de

agenţi alchilanţi exogeni.

(3) Reparare prin excizia nucleotidelor (nucleotide excision repair – NER). Această

cale este utilizată pentru corectarea leziunilor care produc distorsiunea dublului helix, ca de

pildă dimerii de pirimidină produşi de radiaţiile ultraviolete sau modificările chimice produse

de aflatoxină sau benzpiren. Sistemul de reparare este complex şi cuprinde mai multe gene

(ale căror mutaţii au fost identificate în două afecţiuni rare: Xeroderma pigmentosum şi

sindromul Cockayne).

Modul de localizare a leziunii nu este pe deplin cunoscut. După recunoaştere, este

blocată activitatea helicazelor şi se formează un complex mare proteic care va produce incizia

dublă a catenei ce conţine leziunea; după îndepărtarea fragmentului cu leziune, este

resintetizat ADN-ul (cu ajutorul ADN-polimerazei δ sau ε) şi sunt legate capetele de către

ligază.

Mecanismele MMR, BER, NER reprezintă variante ale unui mecanism general de

reparare prin excizie-resinteză, care diferă prin tipul leziunii, modul de recunoaştere şi prin

moleculele reparatoare, şi care se realizează în mai multe etape:

- recunoaşterea leziunii de către enzime specifice;

- desfacerea dublului helix de către o helicază;

- excizia fragmentului lezat şi a unui segment învecinat sub acţiunea unei

endonucleaze;

- îndepărtarea şi degradarea fregmentului de către exonucleaze;

- resinteza componentelor lacunei, folosind ca matriţă catena complementară de

ADN, de către ADN-polimeraze;

- formarea legăturii fosfodiester între fragmentul nou sintetizat şi capetele libere ale

catenei de ADN de către o ADN-ligază.

42.ANOMALIILE CROMOZOMIALE

Când modificările cantitative sau calitative ale materialului genetic implică regiuni

cromozomiale suficient de mari pentru a fi vizibile la microscopul optic de rutină folosind

tehnici de analiză citogenetică (cariotiparea, bandarea, autoradiografia etc.), ele sunt denumite

mutaţii sau anomalii cromozomiale.

Anomaliile cromosomiale sunt modificări ale structurii sau numărului cromozomilor.

1. Clasificarea anomaliilor cromozomiale

a) După momentul producerii lor, se împart în constituţionale şi dobândite.

Anomaliile constituţionale se produc în cursul gametogenezei unuia din părinţi sau în primele

etape ale embriogenezi, fiind prezente la naştere. Anomaliile dobândite apar în cursul vieţii,

sub formă de clone celulare anormale.

b) După modul de afectare a cromozomilor, se împart în structurale şi numerice.

Anomaliile cromozomiale structurale se caracterizează prin modificarea structurii

normale a cromozomilor. În funcţie de efectul lor fenotipic, sunt împărţite în anomalii

structurale echilibrate şi neechilibrate. Anomaliile echilibrate (translocaţii şi inversii) sunt

caracterizate prin modificarea poziţiei unuia sau a mai multor segmente cromozomiale, deci

fără afectarea cantităţii de material genetic şi fără efecte fenotipice (în majoritatea cazurilor).

Anomaliile neechilibrate (deleţii, duplicaţii, cromozomii inelari, cromozomii dicentrici şi

izocromozomii) sunt caracterizate prin prezenţa suplimentară (trisomie parţială) sau absenţa

(monosomie parţială) a unei părţi din cromozom.

Anomaliile cromozomiale numerice sunt modificări ale numărului de cromozomi faţă

de numărul normal diploid (2n = 46). Ele se clasifică în poliploidii – prezenţa în plus a unuia

sau mai multor seturi haploide de cromozomi – şi aneuploidii – prezenţa în plus sau absenţa

unuia sau a ami multor cromozomi.

c) În funcţie de numărul de celule afectate, se împart în omogene şi în mozaic.

Anomaliile omogene se caracterizează prin prezenţa anomaliei în toate celulele individului,

iar cele în mozaic prin prezenţa a două sau mai multe linii celulare diferite prin numărul de

cromozomi (provenite din acelaşi zigot).

d) În funcţie de tipul de cromozom afectat, se clasifică în autozomale (interesează

cromozomii somatici), gonozomale (interesează cromozomii sexuali X sau Y) şi mixte (sunt

implicaţi şi autozomi şi cromozomi sexuali).

e) În funcţie de tipul de celulă afectată, se împart în somatice (care modifică

fenotipul individului afectat) şi germinale (care nu modifică fenotipul individului afectat, dar

se pot transmite prin gameţi la descendenţi)

43.Anomalii structurale intracromozomiale

Anomaliile cromozomiale structurale (mutaţii cromozomiale)

Modificările structurale sunt consecinţa ruperii cromozomilor şi reunirii anormale a

capetelor cromozomiale.

(1) Deleţiiile (del) sunt anomalii cromozomiale neechilibrate, care constau în

pierderea unui fragment cromozomial.

• Prezenţa unei singure rupturi determină apariţia unei deleţii terminale (fig. 6.5a);

fragmentul acentric se pierde, iar la capătul rupt se formează un nou telomer; deleţia terminală

poate fi observată doar prin tehnici de bandare (deleţie microscopică) sau de citogenetică

moleculară (FISH) (deleţie submicroscopică sau microdeleţie)

• Deleţia interstiţială (fig. 6.5b) se produce în prezenţa a două rupturi pe acelaşi braţ

cromozomial, cu eliminarea segmentului intermediar şi reunirea extremităţilor; deleţiile

interstiţiale sunt mai frecvente decât deleţiile terminale, deoarece nu implică formarea de noi

telomere (necesare pentru stabilizarea cromozomului).

Toate deleţiile produc o monosomie parţială (haploinsuficienţă) pentru genele situate

în regiunea cromozomială absentă. În funcţie de dimensiunea fragmentului absent, deleţia

permite sau nu supravieţuirea. Atunci când fragmentul absent depăşeşte 2% din mărimea

setului haploid, monosomia este incompatibilă cu viaţa postnatală. Deleţiile submicroscopice

(microdeleţiile) determină sindroame ale genelor contigue, în care manifestările fenotipice

sunt datorate pierderii mai multor gene învecinate.

Cele mai frecvente deleţii întâlnite în practică sunt sindromul Wolf-Hirschhorn

(del4p), sindromul cri du chat (del5p), sindromul velo-cardio-facial DiGeorge (del22q11),

sindroamele Prader-Willi şi Angelman (del 15q11-12) ş.a.

(2) Cromozomii inelari (r) sunt consecinţa a două rupturi produse pe braţe diferite ale

cromozomului; prin reunirea extremităţilor fragmentului cu centromer (centric) se formează

un cromozom inelar (fig. 6.6.), iar fragmentele acentrice (terminale) se vor pierde. Această

anomalie realizează o deleţie şi monosomie parţială a segmentelor terminale cromozomiale;

cromozomii inelari, de exemplu r(21), r(X), sunt mai rari în practică, deoarece sunt instabili.

(3) Inversiile (inv) sunt determinate de prezenţa a două rupturi; înainte ca procesul de

reunire să aibă loc, segmentul dintre cele două puncte de ruptură suferă o rotaţie de 180o.

Atunci când ambele rupturi sunt localizate pe acelaşi braţ al cromozomului, iar fragmentul

rotit nu conţine centromerul, inversia este denumită paracentrică (fig. 6.7a). Inversiile

pericentrice includ şi centromerul, fiind produse prin rupturi pe ambele braţe (fig. 6.7b).

Inversiile paracentrice nu pot fi recunoscute cu ajutorul tehnicilor clasice de coloraţie,

deoarece nu modifică forma cromozomului; ele pot fi însă identificate prin metodele de

bandare, deoarece succesiunea benzilor este evident alterată. Inversiile pericentrice pot fi

detectate şi cu ajutorul tehnicilor uzuale, atunci când rupturile sunt localizate la distanţe

diferite faţă de centromer, deoarece se modifică poziţia centromerului

Inversiile sunt anomalii cromozomiale echilibrate, care nu determină modificări ale

cantităţii de material genetic, ci doar în ordinea genelor de pe segmentele cromozomiale

inversate. Ele produc, în schimb, tulburări ale procesului de crossing-over, gameţii formaţi

fiind neechilibraţi.

(4) Duplicaţia (dup) reprezintă dublarea unui segment cromozomial, care se poate

ataşa în tandem (păstrând succesiunea genelor) sau se roteşte cu 180° inversând ordinea

genelor (duplicaţie în tandem invers). Consecinţa o reprezintă apariţia unei trisomii parţiale

pentru segmentul duplicat. Duplicaţia poate avea ca origine un crossing-over inegal (cel mai

frecvent), o translocaţie echilibrată sau un izocromozom.

La om, duplicaţia este mai frecvent întâlnită comparativ cu deleţia, iar consecinţele

sale fenotipice sunt mai puţin severe; duplicaţiile produse la nivel molecular pot avea un

important rol în evoluţie, prin diversificarea genică. Cele mai frecvente duplicaţii sunt:

dup12q şi dup17q, care produc sindromul Pallister, respectiv sindromul Charcot-Marie-

Tooth.

(5) Izocromozomul (i) se formează prin clivarea anormală, transversală a

centromerului. In acest caz, rezultă un cromozom telocentric instabil, care poate fi transformat

într-un cromozom metacentric, ale cărui braţe au un conţinut genetic identic, denumit

izocromozom (alcătuit numai din braţe scurte sau numai din braţe lungi) (fig. 6.8).

Prezenţa unui izocromozom presupune existenţa unei monosomii pentru braţul pierdut

şi a unei trisomii pentru braţul implicat în formarea izocromozomului. Cel mai frecvent,

izocromozomul a fost identificat la circa 20% din cazurile de sindrom Turner i(Xq):

pacientele prezintă, alături de un cromozom X normal, un izocromosom pentru braţul lung al

celuilalt cromosom X (fig. 6.9).

44. Anomalii structurale intercromozomiale

Anomaliile cromozomiale structurale (mutaţii cromozomiale)

Modificările structurale sunt consecinţa ruperii cromozomilor şi reunirii anormale a

capetelor cromozomiale.

(1) Translocaţiiile constau în transferul unui fragment cromozomial între doi

cromozomi. Translocaţiile pot fi reciproce, robertsoniene şi nereciproce (inserţii).

● Translocaţia reciprocă (t) se caracterizează printr-un schimb reciproc de segmente

cromozomiale între doi cromozomi neomologi, care au suferit rupturi (fig. 6.10a). In funcţie

de lungimea segmentelor cromosomiale schimbate, translocaţiile reciproce pot fi egale sau

inegale. Translocaţiile reciproce au o importanţă deosebită pentru patologia umană, deoarece

purtătorii unei translocaţii echilibrate, normali fenotipic, pot da naştere unor descendenţi cu o

constituţie cromozomială anormală (translocaţie, trisomie sau monosomie parţială).

● Translocaţia robertsoniană (rob) sau fuziunea centrică este o translocaţie

reciprocă între doi cromozomi acrocentrici (excepţie cromozomul Y), omologi sau

neomologi, care suferă rupturi la nivelul braţelor scurte. In majoritatea cazurilor, rupturile se

produc la nivelul centromerelor sau pe braţele scurte, foarte aproape de centromer, rezultând

un cromozom monocentric sau dicentric şi două fragmente acentrice (ce conţin ambele braţe

scurte, care se pierd) (fig. 6.10b); pierderea braţelor scurte (conţin genele pentru ARN

ribozomal) este lipsită de efecte fenotipice, deoarece sunt suficiente genele rămase pe

cromozomii acrocentrici normali. Numărul de cromozomi din celulă se reduce de la 46 la 45.

Fuziunea centrică a cromozomilor 13 şi 14 – rob(13q14q) este cea mai frecventă de

translocaţie la om, fiind urmată, ca frecvenţă, de fuziunea centrică a cromozomilor 14 şi 21 -

rob(21q14q). Purtătorii unei translocaţii robertsoniene sunt normali fenotipic dar pot da

naştere unor descendenţi anormali; de exemplu, în cazul translocaţiei rob(21q14q), prin

fecundare cu gameţi normali pot rezulta şase tipuri de zigoţi: normal, cu translocaţie

robertsoniană, cu trisomie 14, cu monosomie 14, cu trisomie 21 şi monosomie 21.

● Inserţia (ins) este o translocaţie nereciprocă ce constă în inserţia unui segment

cromozomial în regiunea interstiţială a unui cromozom neomolog; este condiţionată de

prezenţa a trei rupturi (două pe un cromozom şi una pe celălalt cromozom) (fig. 6.11.), fiind

astfel o anomalie rară. Din nou, purtătorul inserţiei este sănătos, dar descendenţii săi pot fi

neechilibraţi genetic (cu monosomie sau trisomie parţială).

(2) Cromozomii dicentrici (dic) rezultă din deleţia regiunilor telomerice de la doi

cromozomi, urmată de fuzionarea lor telomerică (fig. 6.12.). Numărul de cromozomi din

celulă se reduce la 45. Dacă cei doi centromeri sunt suficient de îndepărtaţi unul de cealalt,

unul dintre ei se inactivează rezultând un cromozom pseudocentric, care se poate menţine pe

parcursul a mai multe generaţii celulare. Cromozomul dicentric cu ambele centromere active

este instabil şi va fi eliminat în timpul diviziunii.

45. Anomalii cromozomiale numerice

La om, celulele somatice normale sunt diploide (2n = 46 de cromozomi), iar celulele

sexuale normale sunt haploide (n = 23 de cromozomi). Anomaliile numărului de cromozomi

sunt de două tipuri: poliploidii şi aneuploidii, care pot fi omogene sau în mozaic.

a) Poliploidia reprezintă multiplicarea setului haploid (n) de cromozomi, de exemplu

3n, 4n, 5n etc. Singurele poliploidii identificate la om sunt triplodia şi tetraploidia.

(1) Un set haploid de cromozomi suplimentari determină apariţia unei celule triploide

(3n = 69 cromozomi); formula genetică pentru o astfel de celulă este 69,XXX, 69,XXY (cea

mai frecventă) sau 69,XYY.

Triploidia este incompatibilă cu viaţa postnatală, fiind observată frecvent la embrionii

avortaţi în primele săptămâni de sarcină. Majoritatea produşilor de concepţie triploizi care au

supravieţuit o anumită perioadă de timp au avut o constituţie cromozomială în mozaic 3n/2n,

cu prezenţa unui număr mare de celule diploide.

Triploidia poate fi consecinţa unor defecte din timpul:

● meiozei: lipsa diviziunii unuia din precursorii celulelor sexuale, ducând la apariţia

unui gamet diploid; este frecventă lipsa eliminării globulului polar din ovocitul II, urmată de

fecundarea cu un spermatozoid normal (diginie).

● mitozei: în cazul mozaicurilor (3n/2n)

● fecundării: fertilizarea ovulului de către doi spermatozoizi (dispermie);

Cercetările efectuate cu ajutorul tehnicilor de bandare sugerează că factorii paterni, şi

îndeosebi dispermia, sunt sursa predominantă a triploidiei la specia umană.

(2) Tetraploidia (4n = 92 cromozomi), multiplicarea de 4 ori a numărului haploid de

cromozomi (92,XXXX, 92,XXYY etc.), este extrem de rară şi întotdeauna letală. Poate fi

consecinţa fuzionării a doi gameţi anormali, nereduşi (2n), dar acest mecanism este

improbabil (sunt menţionate doar câteva cazuri în literatură). Este mai plauzibilă ipoteza

suprimării primei diviziuni de clivare a unui zigot diploid, după diviziunea cromozomilor, dar

înainte de diviziunea citoplasmei (absenţa citokinezei).

Poliploidia poate apare şi în decursul vieţii adulte, datorită unui accident mitotic -

absenţa citokinezei (endomitoza): cromozomii se comportă normal până în stadiul de telofază,

dar citokineza nu se produce, rezultând o celulă tetraploidă cu 4n cromozomi

monocromatidieni.

Celule poliploide se întâlnesc în unele ţesuturi şi în condiţii normale; astfel,

megacariocitele din măduva osoasă au de 8-16 ori numărul haploid de cromozomi. Celule

tetraploide sunt prezente, de asemenea, şi la nivelul ficatului în regenerare, ca urmare absenţei

citokinezei.

46.Cauzele aneuploidiilor omogene

Aneuploidia este modificarea numărului de cromozomi din una sau mai multe perechi;

pot exista unul sau mai mulţi cromozomi în plus sau în minus faţă de numărul normal.

Aneuploidia este înregistrată în populaţia umană mai frecvent comparativ cu

poliploidia, iar consecinţele sale sunt importante pentru patologia umană. Aneuploidia implică

modificări numerice atât la nivelul autozomilor, cât şi a cromozomilor sexuali (X sau Y).

Cauzele principale ale aneuploidiei omogene sunt erori produse în cursul meiozei: non-

disjuncţia (nedisjuncţia) şi pierderea de cromozomi datorită procesului de retardare

anafazică.

a) Non-disjuncţia meiotică

Non-disjuncţia reprezintă lipsa separării cromozomilor unei perechi de omologi în

anafaza meiozei I (non-disjuncţia cromozomială) sau a cromatidelor surori ale unui

cromozom meioza II (non-disjuncţia cromatidiană); datorită acestei erori, ambele elemente

(cromozomul sau cromatida) trec în una din celulele-fiice şi vor lipsi în cealaltă celulă-fiică.

Non-disjuncţia poate interesa cromozomii somatici sau cromozomii sexuali.

Non-disjuncţia din gametogeneză determină apariţia unor gameţi anormali, având

consecinţe diferite la bărbaţi şi la femei, din cauza particularităţilor gametogenezei la cele

două sexe. Astfel, la bărbat, dintr-un spermatocit primar rezultă patru spermatozoizi

funcţionali; fiecare diviziune meiotică fiind însoţită de eliminarea unui globul polar

Din acest motiv, la bărbat, nondisjuncţia în decursul primei meioze va determina apriţia unor

spermatozoizi disomici (n+1) şi nulisomici (n-1), în timp ce nondisjuncţia care survine în

decursul meiozei II va produce şi gameţi normali, alături de gameţi disomici şi nulisomici

(fig. 6.15.).

La femeie însă, non-disjuncţia survenită fie în decursul primei, fie a celei de a doua meioze,

nu poate produce decât ovule anormale, disomice sau nulisomice (fig. 6.16.).

După fecundarea cu un gamet normal, gameţii disomici şi nulisomici vor forma un zigot

trisomic sau monosomic. Posibilitatea ca un zigot anormal să fie consecinţa unei anomalii

survenite în timpul ovogenezei este astfel mai mare decât cea a unei anomalii similare apărute

în decursul spermatogenezei.

b) Retardarea (întârzierea) anafazică (fig. 6.13.) constă în deplasarea cu întârziere a unui cromozom (cromatidă) în cursul anafazei meiozei I sau II şi care, în momentul refacerii membranelor nucleare, va rămâne în afara celulelor-fiice. În consecinţă, apar gameţi nulisomici care, prin fecundare, vor forma zigoţi monosomici.

47.Cauzele aneuploidiilor in mozaic

Aneuploidia este modificarea numărului de cromozomi din una sau mai multe perechi;

pot exista unul sau mai mulţi cromozomi în plus sau în minus faţă de numărul normal.

Aneuploidia este înregistrată în populaţia umană mai frecvent comparativ cu

poliploidia, iar consecinţele sale sunt importante pentru patologia umană. Aneuploidia implică

modificări numerice atât la nivelul autozomilor, cât şi a cromozomilor sexuali (X sau Y).

Aneuploidiile în mozaic sunt de obicei consecinţa unei erori produse în cursul

mitozei zigotului.

a) Non-disjuncţia zigotică. Rezultatul non-disjunţiei zigotice este apariţia unui

mozaic (mixoploid), a cărui constituţie cromozomială depinde de momentul în care a avut loc

accidentul mitotic. Astfel, dacă non-disjuncţia interesează prima diviziune de clivare a unui

zigot normal, va rezulta un produs de concepţie care prezintă două linii celulare anormale: una

monosomică şi una trisomică pentru cromozomul în cauză . Dacă non-disjuncţia interesează a

doua diviziune de clivare a zigotului va rezulta un blastocist mixoploid alcătuit din trei linii

celulare: una normală (disomică), una trisomică şi una monosomică

b) Retardarea anafazică are drept rezultat apariţia unor clone celulare cu 2n-1/2n

cromozomi.

48. Consecinţele fenotipice ale anomaliilor cromozomiale

În funcţie de consecinţele fenotipice, anomaliile cromozomiale se împart în:

- anomalii echilibrate, în care cantitatea de material genetic rămâne nemodificată şi

fenotipul este normal;

- anomalii neechilibrate, în care cantitatea de material genetic se modifică (în plus

sau minus) şi fenotipul este anormal;

1) Consecinţele anomaliilor cromozomiale echilibrate

Anomaliile echilibrate (translocaţii reciproce, inversii) determină, în general, un

fenotip normal, dar au consecinţe asupra reproducerii:

- datorită prezenţei anomaliei structurale, sinapsa între cromozomii omologi este

anormală şi produce blocarea gametogenezei;

- producerea de gameţi anormali care, după fecundare, formează embrioni cu

monosomii sau trisomii parţiale (uneori complete), care de multe ori sunt eliminaţi prin avort

spontan (circa 1 din 250 de persoane aparent sănătoase are o anomalie cromozomială

echilibrată care poate da tulburări majore de reproducere).

2) Consecinţele anomaliilor cromozomiale neechilibrate

Anomaliile neechilibrate (poliploidii, aneuploidii, deleţii, duplicaţii, cromozomi

inelari, izocromozomi) sunt modificări cantitative ale materialului genetic (anomalii de dozaj

genic); întrucât informaţia genetică din cromozomii anormali nu este modificată calitativ,

fenotipul anormal este consecinţa excesului sau lipsei unei gene normale.

Anomaliile de dozaj genic se caracterizează printr-o serie de modificări comune:

tulburări de creştere pre- şi postnatală, dismorfie facială, anomalii congenitale majore

multiple, alterări ale structurii şi funcţiei sistemului nervos central (manifestate prin întârzieri

în dezvoltarea psiho-motorie), modificări ale dermatoglifelor, anomalii ale funcţiei gonadelor.

Factorii care influenţează gravitatea afectării fenotipice sunt:

(a) Mărimea dezechilibrului genetic. Poliploidiile, trisomiile cromozomilor mari şi

monosomiile autozomale sunt incompatibile cu viaţa; cu cât dimensiunea cromozomului este

mai mare, cu atât gravitatea trisomiilor autozomale este mai mare (tri 13 > tri 18 > tri 21).

(b) Tipul de anomalie. Monosomiile sunt mai grave decât trisomiile şi sunt letale

pentru toţi autozomii, dar şi a majorităţii cromozomilor X. Aneuploidiile cromozomilor

sexuali sunt mai puţin grave decât cele ale autozomilor, datorită inactivării parţiale a

cromozomilor X suplimentari.

(c) Conţinutul genic şi cantitatea de eucromatină/heterocromatină a cromozomului

implicat. Anomaliile care interesează regiunile eucromatice sunt mai grave decât cele care

interesează regiunile bogate în heterocromatină.

(d) Numărul celulelor afectate. Aneuploidiile omogene sunt mai grave decât cele în

mozaic.