UNIVERSITATEA bdquoAL I CUZArdquo IAŞI

FACULTATEA DE FIZICĂ

Rezumatul tezei de doctorat

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME

HIBRIDE DE POLIMERI HIDROSOLUBILI

ŞI MEDICAMENTENANOPARTICULE CU APLICAŢII

IcircN BIOMEDICINĂ

Conducător ştiinţific

Prof Dr Dana Ortansa Dorohoi

Doctorand

Daniela Angelica Bicircndar (căs Pricop)

Iași ndash 2012

Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iaşi

Icircn atenția

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Vă facem cunoscut că icircn data de 18 februarie 2012 ora 10 icircn

amfiteatrul L1 doamna Daniela Angelica Bicircndar (căs Pricop)

va susține icircn ședință publică teza de doctorat

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME HIBRIDE DE POLIMERI

HIDROSOLUBILI ŞI MEDICAMENTENANOPARTICULE CU APLICAŢII IcircN

BIOMEDICINĂ

icircn vederea obținerii titlului științific de doctor icircn domeniul fundamental

Științe Exacte domeniul Fizică

Comisia de examinare a tezei

Prof Univ Dr Dumitru LUCA

Președinte

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iaşi

Prof univ dr Dana ndash Ortansa DOROHOI

Conducător științific

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iași

CP I Dr Valeria Harabagiu Referent

Institutul de Chimie Macromoleculară bdquoPetru Ponirdquo Iași

Prof Univ Dr Viorica ȘIMON

Referent

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoBabeş-Bolyairdquo Cluj-Napoca

Prof univ dr Viorel MELNIG

Referent

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iași

Vă invităm pe această cale să participați la ședința publică de susținere

a tezei de doctorat

Cuprins Introducere

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere inteligente şi a

obţinerii de nanoparticule

Bibliografie

Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice suprafeţelor si filmelor

II1 Voltametrie ciclică

II2 Determonarea distribuțiilor de dimensiuni prin icircmprăștierea dinamică a

luminii

II3 Determinarea potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

II4 Microscopie electronică de transmisie

II5 Microscopia de forţă atomică AFM

II6 Microscopie optică

II7 Difracţia radiaţiei X

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrale

Bibliografie

Cap IIIObţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de lipidă şi

chitosan

III1 Icircncapsularea unor medicamente specifice icircn vezicule lipidice

III11 Icircncapsularea clorurii de magneziu icircn vezicule lipidice

III12 Icircncapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice

II13 Icircncapsularea dexketoprofenului icircn vezicule lipidice

II14Icircncapsularea tramadolului icircn vezicule lipidice

II15 Icircncapsularea hidrocloridului hidrat icircn vezicule lipidice

III2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de către sistemele de

vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan și compararea cu eliberarea in vivo

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapaţi cu

medicament

IV31 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)

IV32 Testarea biocompatibilității medicamentelor icircncorporate icircn vezicule

IV33 Cercetarea efectelor medicamentelor icircncorporate icircn vezicule pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile icircn

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan icircn raport cu

diferiți factori

IV31 Analiza stabilității icircn timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au

IV32 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircncălzite

IV33 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircnghețate

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea unor activatori

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea radiației din spectrul vizibil

IV4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV41 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe

diferite medii de cultură

IV42 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrări publicate

1

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili icircn icircnțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă icircn consecință Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină se ocupă cu icircmbunătățirea eficacității

medicamentelor icircn medii biologice folosind nanotehnologia icircn scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor Icircn

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici icircn eliberarea controlată a

medicamentelor și icircn aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile Interesul medical icircn potențialul acestor nanomateriale este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele Și icircntr-

un caz și icircn celălat nu există icircncă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului icircnconjurător

Răspunsul transportatorilor de medicamente la stimulii mediului biologic

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin

Această stabilitate depinde de icircmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc icircntre aceștia procese

repulsive Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale atacirct sub formă de

vezicule lipidice cacirct și sub formă de nanoparticule este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul temperatura forța ionică dimensiunea particulei etc ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc icircntre polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită icircn acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze

urmacircnd să precipite sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea icircn medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule avacircnd dimensiuni nanometrice este mai puțin

toxică Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină icircn soluţie apoasă Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie Pentru a obține vezicule

filmul lipidic de fosfatidilcolină este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

Icircn atenția

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip

Vă facem cunoscut că icircn data de 18 februarie 2012 ora 10 icircn

amfiteatrul L1 doamna Daniela Angelica Bicircndar (căs Pricop)

va susține icircn ședință publică teza de doctorat

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNOR SISTEME HIBRIDE DE POLIMERI

HIDROSOLUBILI ŞI MEDICAMENTENANOPARTICULE CU APLICAŢII IcircN

BIOMEDICINĂ

icircn vederea obținerii titlului științific de doctor icircn domeniul fundamental

Științe Exacte domeniul Fizică

Comisia de examinare a tezei

Prof Univ Dr Dumitru LUCA

Președinte

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iaşi

Prof univ dr Dana ndash Ortansa DOROHOI

Conducător științific

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iași

CP I Dr Valeria Harabagiu Referent

Institutul de Chimie Macromoleculară bdquoPetru Ponirdquo Iași

Prof Univ Dr Viorica ȘIMON

Referent

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoBabeş-Bolyairdquo Cluj-Napoca

Prof univ dr Viorel MELNIG

Referent

Facultatea de Fizică Universitatea bdquoAl I Cuzardquo Iași

Vă invităm pe această cale să participați la ședința publică de susținere

a tezei de doctorat

Cuprins Introducere

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere inteligente şi a

obţinerii de nanoparticule

Bibliografie

Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice suprafeţelor si filmelor

II1 Voltametrie ciclică

II2 Determonarea distribuțiilor de dimensiuni prin icircmprăștierea dinamică a

luminii

II3 Determinarea potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

II4 Microscopie electronică de transmisie

II5 Microscopia de forţă atomică AFM

II6 Microscopie optică

II7 Difracţia radiaţiei X

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrale

Bibliografie

Cap IIIObţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de lipidă şi

chitosan

III1 Icircncapsularea unor medicamente specifice icircn vezicule lipidice

III11 Icircncapsularea clorurii de magneziu icircn vezicule lipidice

III12 Icircncapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice

II13 Icircncapsularea dexketoprofenului icircn vezicule lipidice

II14Icircncapsularea tramadolului icircn vezicule lipidice

II15 Icircncapsularea hidrocloridului hidrat icircn vezicule lipidice

III2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de către sistemele de

vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan și compararea cu eliberarea in vivo

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapaţi cu

medicament

IV31 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)

IV32 Testarea biocompatibilității medicamentelor icircncorporate icircn vezicule

IV33 Cercetarea efectelor medicamentelor icircncorporate icircn vezicule pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile icircn

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan icircn raport cu

diferiți factori

IV31 Analiza stabilității icircn timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au

IV32 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircncălzite

IV33 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircnghețate

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea unor activatori

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea radiației din spectrul vizibil

IV4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV41 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe

diferite medii de cultură

IV42 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrări publicate

1

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili icircn icircnțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă icircn consecință Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină se ocupă cu icircmbunătățirea eficacității

medicamentelor icircn medii biologice folosind nanotehnologia icircn scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor Icircn

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici icircn eliberarea controlată a

medicamentelor și icircn aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile Interesul medical icircn potențialul acestor nanomateriale este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele Și icircntr-

un caz și icircn celălat nu există icircncă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului icircnconjurător

Răspunsul transportatorilor de medicamente la stimulii mediului biologic

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin

Această stabilitate depinde de icircmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc icircntre aceștia procese

repulsive Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale atacirct sub formă de

vezicule lipidice cacirct și sub formă de nanoparticule este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul temperatura forța ionică dimensiunea particulei etc ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc icircntre polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită icircn acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze

urmacircnd să precipite sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea icircn medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule avacircnd dimensiuni nanometrice este mai puțin

toxică Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină icircn soluţie apoasă Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie Pentru a obține vezicule

filmul lipidic de fosfatidilcolină este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

Cuprins Introducere

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere inteligente şi a

obţinerii de nanoparticule

Bibliografie

Cap II Metode de caracterizare a materialelor nanofazice suprafeţelor si filmelor

II1 Voltametrie ciclică

II2 Determonarea distribuțiilor de dimensiuni prin icircmprăștierea dinamică a

luminii

II3 Determinarea potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

II4 Microscopie electronică de transmisie

II5 Microscopia de forţă atomică AFM

II6 Microscopie optică

II7 Difracţia radiaţiei X

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrale

Bibliografie

Cap IIIObţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de lipidă şi

chitosan

III1 Icircncapsularea unor medicamente specifice icircn vezicule lipidice

III11 Icircncapsularea clorurii de magneziu icircn vezicule lipidice

III12 Icircncapsularea ketoprofenului in vezicule lipidice

II13 Icircncapsularea dexketoprofenului icircn vezicule lipidice

II14Icircncapsularea tramadolului icircn vezicule lipidice

II15 Icircncapsularea hidrocloridului hidrat icircn vezicule lipidice

III2 Caracterizarea in vivo a cineticii de eliberare a medicamentelor de către sistemele de

vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan și compararea cu eliberarea in vivo

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili trapaţi cu

medicament

IV31 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)

IV32 Testarea biocompatibilității medicamentelor icircncorporate icircn vezicule

IV33 Cercetarea efectelor medicamentelor icircncorporate icircn vezicule pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile icircn

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan icircn raport cu

diferiți factori

IV31 Analiza stabilității icircn timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au

IV32 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircncălzite

IV33 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircnghețate

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea unor activatori

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea radiației din spectrul vizibil

IV4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV41 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe

diferite medii de cultură

IV42 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrări publicate

1

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili icircn icircnțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă icircn consecință Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină se ocupă cu icircmbunătățirea eficacității

medicamentelor icircn medii biologice folosind nanotehnologia icircn scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor Icircn

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici icircn eliberarea controlată a

medicamentelor și icircn aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile Interesul medical icircn potențialul acestor nanomateriale este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele Și icircntr-

un caz și icircn celălat nu există icircncă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului icircnconjurător

Răspunsul transportatorilor de medicamente la stimulii mediului biologic

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin

Această stabilitate depinde de icircmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc icircntre aceștia procese

repulsive Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale atacirct sub formă de

vezicule lipidice cacirct și sub formă de nanoparticule este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul temperatura forța ionică dimensiunea particulei etc ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc icircntre polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită icircn acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze

urmacircnd să precipite sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea icircn medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule avacircnd dimensiuni nanometrice este mai puțin

toxică Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină icircn soluţie apoasă Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie Pentru a obține vezicule

filmul lipidic de fosfatidilcolină este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

IV31 Cinetica de fixare si eliberare controlată a compuşilor sintetizaţi (in vivo)

IV32 Testarea biocompatibilității medicamentelor icircncorporate icircn vezicule

IV33 Cercetarea efectelor medicamentelor icircncorporate icircn vezicule pe modele

nociceptive

Bibliografie

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale nobile icircn

medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

IV1 Sinteza nanoparticulelor de platina

IV2 Sinteza nanoparticulelor de argint

IV3 Sinteza nanoparticulelor de aur

IV2 Caracterizarea structural a nanoparticulelor obținute

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan icircn raport cu

diferiți factori

IV31 Analiza stabilității icircn timp a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de au

IV32 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircncălzite

IV33 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

icircnghețate

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea unor activatori

IV34 Analiza comportamentului soluțiilor de chitosan cu nanoparticule de aur

sub acțiunea radiației din spectrul vizibil

IV4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule de metale nobile

IV41 Evaluarea proprietăților antibacteriene ale nanoparticulelor in vivo pe

diferite medii de cultură

IV42 Efecte induse de nenoparticulele de metale nobile

Bibliografie

Concluzii generale

Lucrări publicate

1

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili icircn icircnțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă icircn consecință Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină se ocupă cu icircmbunătățirea eficacității

medicamentelor icircn medii biologice folosind nanotehnologia icircn scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor Icircn

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici icircn eliberarea controlată a

medicamentelor și icircn aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile Interesul medical icircn potențialul acestor nanomateriale este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele Și icircntr-

un caz și icircn celălat nu există icircncă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului icircnconjurător

Răspunsul transportatorilor de medicamente la stimulii mediului biologic

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin

Această stabilitate depinde de icircmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc icircntre aceștia procese

repulsive Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale atacirct sub formă de

vezicule lipidice cacirct și sub formă de nanoparticule este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul temperatura forța ionică dimensiunea particulei etc ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc icircntre polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită icircn acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze

urmacircnd să precipite sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea icircn medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule avacircnd dimensiuni nanometrice este mai puțin

toxică Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină icircn soluţie apoasă Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie Pentru a obține vezicule

filmul lipidic de fosfatidilcolină este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

1

Cap I Stadiul actual al cunoaşterii icircn domeniul materialelor polimere

inteligente şi a nanoparticulelor metale nobile

Medicina modernă a făcut pași considerabili icircn icircnțelegerea necesității

compatibilizării medicamentului cu țesutul Practica a arătat că de multe ori corpul

percepe medicamentul ca pe un dușman și se comportă icircn consecință Un domeniu

de interes pentru aplicațiile din biomedicină se ocupă cu icircmbunătățirea eficacității

medicamentelor icircn medii biologice folosind nanotehnologia icircn scopul

dimensionării acestora la nivel nanometric și creșterea bio-disponibilității lor Icircn

ultimii ani au fost dezvoltate o varietate de tehnici icircn eliberarea controlată a

medicamentelor și icircn aplicaţii legate de funcționalizarea nanoparticulelor de metale

nobile Interesul medical icircn potențialul acestor nanomateriale este motivat de

capacitatea lor de a interacționa individual cu biomoleculele și cu celulele Și icircntr-

un caz și icircn celălat nu există icircncă informaţii suficiente referitoare la impactul

acestora asupra sănătăţii organismelor şi a mediului icircnconjurător

Răspunsul transportatorilor de medicamente la stimulii mediului biologic

este condiționat de nivelul de stabilitate al soluțiilor coloidale care-i conțin

Această stabilitate depinde de icircmbunătățirea proprietăților de suprafață a

coloizilor realizată prin acoperirea cu polimeri și care induc icircntre aceștia procese

repulsive Dacă ținem cont că stabilitatea sistemelor coloidale atacirct sub formă de

vezicule lipidice cacirct și sub formă de nanoparticule este influențată de diferiți

factori cum ar fi pH-ul temperatura forța ionică dimensiunea particulei etc ne

putem aștepta ca interacțiunile ce au loc icircntre polimeri şi coloizi (vezicule sau

nanoparticule) să fie extrem de complexe Stabilirea nivelului de stabilitate a

soluţiilor coloidale este definită icircn acord cu valoarea medie a potenţialului Zeta

Acesta indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să aglomereze

urmacircnd să precipite sau prezintă acel nivel de dispersivitate care să la permită

interacțiunea cu mediul biologic

Obținerea veziculelor lipidice

Studiile au arătat că folosirea icircn medicații a transportatorilor de

medicamente sub formă de vezicule avacircnd dimensiuni nanometrice este mai puțin

toxică Veziculele sunt structuri sferice formate prin auto-asamblarea moleculelor

amfifile de fosfatidilcolină icircn soluţie apoasă Celula vie pare să-și fi autoansamblat

membrana dintr-un bistrat lipidic după aceeași strategie Pentru a obține vezicule

filmul lipidic de fosfatidilcolină este hidratat cu diferite soluţii (medicament) care

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

2

de altfel vor deveni conținutul veziculelor Trecerea sistemului din starea de

bistrat lamelar icircn starea de vezicule are loc ca urmare a creşterii entropiei

sistemului care le determină autoansamblarea icircmpachetacircndu-se unele icircn altele sub

formă de vezicule multilamelare de diferite dimensiuni

Fig 5 Formarea veziculelor lipidice din unităţi individuale de formă cilindrică

Pentru a produce mici vezicule unilamelare și cu dimensiuni nanometrice

(15 - 50 nm) se folosește o baie de ultrasunete (figura 5) Ultrasonarea

fragmentează aleatoriu veziculele multistrat icircn ceea ce am putea numi vezicule

unilamelare [24] a căror dimensiuni depind de amplitudinea semnalului ultrasonor

Adăugarea chitosanului icircn soluțiile de vezicule cu medicament conduce la

modificarea dimensiunii şi morfologiei veziculelor unilamelare provocacircnd

creșterea stabilității acestora

Obținerea nanoparticulelor de metale nobile

Metodele de sinteză a nanoparticulelor au fost inspirate din natură

utilizacircnd faze suport polimerice De exemplu este bine cunoscut că icircn procesele de

biomineralizare proteinele și polizaharidele pot acționa ca suport pentru

structurarea materialelor anorganice la nivel nanometric Aceste faze suport s-au

folosit pentru obținerea de nanoparticule bine definite și cu o distribuție icircngustă

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

3

Nanoparticulele din metale nobile se pot obține prin sinteza

electrochimică a nanostructurilor mono și bimetalice [33 - 35] și icircşi găsesc aplicaţii

icircn domenii ce includ cataliza [35] sisteme de stocare a datelor dispozitive

electronice noi chemo şi biosenzori electrochimici [34] senzori refractometrici şi

de fluorescenţă Folosirea efectului ultrasunetelor icircn electrochimie [37]

icircmbunătățește mult transportul de masă modificacircndu-i viteza şi de asemenea

modificacircnd mecanismul reacţiei electrochimice Sinteza nanoparticulelor de aur icircn

soluții apoase de chitosan a pus icircn evidență faptul că acesta devine agent de

stabilizare și reducere datorită controlului nucleației Dimensiunea nanoparticulelor

de aur formate variază icircn funcţie de concentraţia şi masa moleculară a chitosanului

Stabilitatea acestor soluții este asigurată prin adsorbția moleculelor de

polimer la suprafața nanoparticulelor producandu-se automat scăderea tensiunii

interfazice datorită interacţiunii icircntre faza dispersată şi mediul de dispersie

Cap II Metode utilizate de caracterizare a materialelor nanofazice

suprafeţelor și filmelor

Una din caracteristicile fundamentale ale coloizilor de dimensiuni

nanometrice este raportul foarte mare suprafaţă-volum care duce la apariția unor

proprietăţi fizice sau chimice noi Problema care se pune este de a determina exact

aranjamentul icircn polimer și modificările ce apar la nivel local icircn cadrul

nanostructurilor Caracterizarea soluțiilor coloidale obținute a constat icircn analiză

structurală mezofazică nanofazică și a proprietăților optice și de stabilitate

II3 Determinarea Potenţialului Zeta pentru dispersiile coloidale

Analiza proprietății de stabilitate a soluțiilor coloidale s-a realizat prin

măsurarea potenţialului Zeta Această tehnică constă icircn icircmprăştierea unui fascicul

de lumină laser incident prin centrul unei celule ce conține proba sub un unghi de

aproximativ 13deg pentru a fi detectat și comparat cu fasciculul laser de referintă

Potenţialul Zeta se calculează din mobilitatea electroforetică a coloidului

a cărui spectru de frecvențe va fi analizat cu un software Stabilitatea soluţiilor

coloidale este definită icircn acord cu o valoare medie a potenţialului Zeta (tabelul 1)

care indică dacă particulele dintr-un lichid tind sau nu să floculeze [8] Particulele

care au potențialul Zeta mai pozitiv decacirct +30 mV sau mai negativ decacirct -30 mV

sunt icircn mod obișnuit considerate stabile Măsurarea distribuțiilor de dimensiune și

a stabilității soluțiilor coloidale a necesitat utilizarea unui aparat Malvern Zetasizer

Nano ZS model Zen-3500

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

4

II4 Microscopia electronică de transmisie (TEM) și Microscopia de forţă

atomică (AFM)

Imaginile micrografiilor TEM și AFM pentru nanoparticulele de Au Ag

și Pt au fost făcute cu un microscop Phylips CM 100 și icircn modul semicontact cu un

dispozitiv Solver pe filme subţiri Aceste analize au avut drept scop analiza

morfolofică a nanoparticulelor și evaluarea gradului de acoperire cu polimer

Icircn TEM tunul electronic trimite un fascicul de electroni accelerat spre

cele două lentile condensor unde este focalizat [11] Cacircmpul asociat unei lentile

electrostatice sub formă de diafragmă metalică circulară modifică viteza

electronilor atacirct icircn mărime cacirct şi icircn direcţie Pentru a putea concentra cacircmpul

magnetic icircn vecinătatea axei optice se utilizează lentilele magnetice sub formă de

solenoizi coaxiali cu fasciculul electronic Cacircmpul magnetic al lentilei modifică

direcţia mişcării electronilor icircnfăşuracircnd traiectoria lor icircn jurul axei optice fapt ce

produce rotaţia imaginii electronice icircn raport cu obiectivul Proba este plasată icircn

apropierea lentilei electromagnetice obiectiv Imaginea formată de obiectiv se

numește prima imagine intermediară și servește drept obiect pentru lentila

electromagnetică intermediară Apoi această ultimă imagine este mărită de lentila

electromagnetică proiector care va forma imaginea finală a obiectului pe un ecran

fluorescent

Icircn ceea ce privește realizarea schiţei topografice a suprafeţei probei

efectuată prin AFM s-a folosit un aparat Solver Pro 7M Imaginea este obţinută

prin măsurarea forţe de interacțiune icircn care forţa repulsivă este influenţată de

densitatea totală a electronilor din jurul unui atom Icircn timpul deplasării vacircrfului de-

a lungul suprafeţei probei forța de interacțiune pune ușor icircn mișcare un cantilever

Componentele de bază ale unui AFM sunt vacircrful ascuţit montat pe

cantilever sistemul de detecţie pentru măsurarea devierii cantileverului traductorul

piezoelectric pentru mişcarea sondei icircn raport cu proba sistemul de feedback

pentru menţinerea constantă a devierii prin reajustarea icircnălţimii sondei și sistemul

imagistic pentru convertirea punctelor icircnregistrate icircntr-o imagine Devierea

cantileverului este amplificată cu ajutorul unui fascicul laser ce cade pe spatele

cantileverului şi este reflectat spre un detector cu fotodiodă

II6 Microscopie optică Microscopie icircn cacircmp icircntunecat (DF)

Vizualizarea nanoparticulelor de metale nobile a fost posibilă prin DF

datorită efectului de plasmon care s-a creat la interacțiunea nanoparticulelor cu

lumina și care extinde dimensiunea aparentă a acestora cu peste 100 nm

Cacircmpul icircntunecat este obţinut prin iluminarea probei sub un unghi oblic

astfel icircncacirct razele nedifractate să nu poată fi colectate de lentilele obiectiv Efectul

de cacircmp icircntunecat poate fi obţinut rapid din cacircmpul luminos prin rotirea

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

5

condensorului astfel icircncacirct să fie captată de obiectiv doar lumina difractată de

probă [13] și s-a realizat utilizacircnd un microscop inversat Nikon Eclipse Ti

II7 Difracţia radiației X

Structura micro- şi nano- fazică ca și dimensiunile medii ale cristalitelor

au fost investigate pe pulberi liofilizate prin difracţie de radiaţie X cu un

difractometru Shimadzu XRD 6000 utilizacircnd radiaţia CuKα (154060 Aring) care

operează la 40 kV şi 30 mA Difracţia radiației X este o metodă folosită icircn

principiu pentru evaluarea constantei de reţea d a unei probe cristaline [14 15]

Datorită lungimii de undă mici relativ la cea din lumina vizibilă radiația

X poate interacţiona cu planele atomice din structura internă a materialelor

Picurile de difracţie a radiaţiei X sunt obţinute prin interferenţa constructivă a

fasciculului monocromatic icircmprăştiat [15] Utilizacircnd legea lui Bragg putem

prezice unghiurile de difracție Lărgimea picurilor este dată de ecuaţia lui Scherrer

[14]

II8 Determinări calitative și cantitative prin metode spectrofotometrice

Determinarea structurii moleculare prin spectroscopie IR

Pentru a confirma existenţa legăturilor icircntre polimer şi nanoparticule au

fost investigate spectrele FTIR ale sistemelor de nanoparticule din metale nobile icircn

cei doi polimeri Spectroscopia icircn domeniul (IR) este cea mai potrivită metodă de

identificare a prezenței grupărilor funcționale polare din structura moleculelor

compușilor organici Spectrometrul IR clasic este un aparat icircn care radiația

electromagnetică furnizată de o sursă este separată icircn două fascicule un fascicul de

referință și unul care trece prin probă [17] Măsuracircnd absorbţia radiaţiei ca funcţie

de frecvenţă se obţine spectrul de absorbţie ce poate fi considerat ca o bdquoamprentărdquo

moleculară şi care este utilizat pentru identificarea compuşilor şi grupărilor

funcţionale Spectrele FTIR au fost icircnregistrate icircntre 4000 şi 400 cm-1

cu un

spectrofotometru Tensor 10 Bruker

Amplificarea semnalului de spectroscopie Raman la suprafață (SERS)

Pentru a obţine informaţii despre structura moleculară şi dinamica stării

electronice excitate a nanoparticulelor de Au s-a folosit o tehnică de icircmprăştiere

Raman la rezonanţă Acest fenomen se obține pentru moleculele adsorbite pe

suprafața nanoparticulei și care determină amplificarea semnalului Raman

cunoscut icircn literatura de specialitate sub numele de SERS (spectroscopie Raman

amplificată de suprafaţă) Icircmprăștierea Raman la rezonanță are loc atunci cacircnd

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

6

fotonul incident are o energie egală cu energia unui nivel de vibrație al moleculei

aflate icircn stare excitată Icircn urma ciocnirii inelastice se vor produce linii Raman cu

intensități foarte mari (106) față de difuzia Raman normală Spectrele Raman au

fost obținute cu un microscop inVia Raman Renishaw avacircnd un laser cu o singură

lungime de undă (633 nm)

Identificarea unor specii moleculare prin spectroscopie UV-Vis

Analiza proceselor de icircmbătracircnire a soluțiilor de chitosan cu nanoparticule

de aur s-a realizat prin spectrofotometrie de absorbţie molecularǎ UV-Vis utilizacircnd

un spectrofotometru Hitachi Undash2001

Măsurătorile se bazeazǎ pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice icircn

domeniul de lungimi de undǎ 200 - 1100 nm de cǎtre speciile absorbante de

nanoparticule de aur icircn soluții de chitosan Spectroscopia de absorbție moleculară

constă icircn aceea că se iradiază proba de analizat cu radiații de lungimi de undă

diferite (UV -Vis) și se icircnregistrează spectrul de absorbție (intensitatea radiației

funcție de lungimea de undă) [33]

CONTRIBUȚII PERSONALE

Scopul acestui studiu a vizat

1 Obținerea icircn condiții blacircnde a unor soluții coloidale de dimensiuni nanometrice

cu o bună dispersitate sub formă de

- vezicule lipidice icircncărcate cu medicament și stabilizate icircn chitosan

- nanoparticule din metale nobile sintetizate icircn polimeri biocompatibili

2 Evaluarea proprietăților acestor materiale atacirct sub acțiunea unor stimuli reactivi

(temperatura-icircncălzirerăcire pH-ul icircn procese de dializare activatori chimici

radiație luminoasă) cacirct și icircn studii in vivo icircn interacțiune cu țesutul biologic pe

medii de cultură la eliberarea icircn medii gastrice sau icircn sacircnge ca și la trecerea de

bariera hemato-encefalică

Cap III Obţinerea unor vezicule transportoare de medicamente pe bază de

lipidă şi chitosan

Obținerea icircn condiții blande a soluțiilor coloidale se referă la abilitatea

de a controla morfologia diferitelor domenii icircn copolomerii bloc prin reglarea

echilibrului hidrofilichidrofobic Icircn acest studiu s-a analizat obţinerea de vezicule

lipidice de dimensiuni nanometrice icircncărcate cu diferite medicamente care să

poată fi stabilizate cu un polimer care să suporte pH-ul fluxului sanguin și să

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

7

asigure un control optim al eliberării medicamentului Medicamentele icircncapsulate

icircn veziculele lipidice de fosfatidilcolină au fost clorura de magneziu ketoprofenul

dexketoprofenul U50488 (hidroclorid hidratul) și tramadolul

Prepararea s-a realizat prin hidratarea filmul lipidic uscat după

evaporarea solventului cu o soluţie de apă distilată şi medicament După ce a fost

supusă ultrasonării timp de 20 min pentru a obţine vezicule unilamelare soluţia de

lipidă a fost combinată cu o soluţie de 05 chitosan [5] Pentru a aduce soluţia de

vezicule lipidice cu medicament stabilizat icircn chitosan la un pH neutru aceasta a

fost dializată timp de 10 de ore

Fig 22 Etapele de preparare a veziculelor lipidice simple LV şi a veziculelor icirccărcate cu

ketoprofen și stabilizate icircn chitosan CKLV

S-a observat că formulele obținute nu au prezentat eliberări de

medicament icircn primele minute de după administrare ceea ce indică faptul că prin

ultrasonare icircntreaga cantitate de medicament a fost icircncapsulată icircn vezicule

Chitosanul a determinat rigidizarea membranelor și a permis icircncărcarea

lor cu sarcină pozitivă Ca urmare icircn toate sistemele analizate chitosanul a făcut

posibilă creșterea stabilității veziculelor corespunzacircnd criteriilor soluţiilor

suspendate Procesul de dializare necesar aducerii soluțiilor la un pH fiziologic a

condus la diminuarea stabilității veziculelor datorită proceselor de protonare

deprotonare

III3 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de polimeri hidrosolubili

icircncărcați cu medicament

Cinetica de eliberare a medicamentelor de către sistemele de vezicule

lipidice stabilizate cu chitosan a arătat că eliberarea ketoprofenului din vezicule

lipidice se face icircntr-un ritm mai lent față de creşterea concentraţiei la dizolvarea

unei cantităţi de cristale solide pure de ketoprofen icircn același mediu de eliberare

Și eliberarea icircn sacircnge a medicamentului din veziculele lipidicese se face

cu icircntacircrziere față de medicamentul neacircncorporat Icircn sacircnge concentrația maximă de

medicament eliberat din vezicule se menține cu cacircteva ore icircn plus și efectul se

prelungește față de medicamentul neancorporat

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

8

Fig 32 Profilul de eliberare in vitro a

ketoprofenului din veziculele stabilizate

comparativ cu un conţinut echivalent de

cristale solide pure de ketoprofen dizolvat

icircn același mediu de eliberare

Fig 33 Variaţia icircn timp a concentraţiei

de ketoprofen icircn sacircnge la şoarecii

trataţi atacirct cu vezicule cu medicament

cacirct și cu o soluție simplă de ketoprofen

Icircn studiile de biocompatibilitate nu s-au constatat modificări semnificative

la nivelul testelor hemoleucogramei pentru animalele care au primit veziculele

lipidice stabilizate cu chitosan și icircncărcate cu oricare din medicamentele utilizate

Graficele obținerii efectului maxim posibil pentru toate soluțiile

icircncorporate icircn vezicule lipidice stabilizate icircn chitosan au arătat că

- procesul de eliberare al medicamentelor se produce icircn același timp

- intensitatea efectului scade față de substanțele neacircncorporate

- maximul de efect se obține aproximativ icircn același timp (cam la 4

ore) după administrarea oricărei soluții

-efectul medicamentelor icircncorporate se prelungește icircn acelașii interval de

timp

Coroboracircnd efectele medicamentelor icircncorporate cu nivelul de

medicament eliberat icircn sacircnge la diferite momente de timp din testele de

comportament și testele de nocicepție s-a putut realiza o corelaţie relativă sub

aspect somatic

Tabel 17 Corelarea efectelor medicamentelor eliberate din vezicule lipidice

Vezicule

cu medicament

Atingerea

nivelului maxim

Menținerea nivelului

maxim

Prelungirea

eliberării

Ket eliberat icircn sacircnge 2 ore 4 ore 10 ore

Efect ket icircn tail flick 2 ore 6 ore 12 ore

Efect ket icircn writhes 3 ore 1 ora 8 ore

Efect magneziu 6 ore 2 ore 12 ore

Se observă o bună corelare icircntre obținerea concentrației maxime de

medicament icircn sacircnge și inducerea unui efect antinociceptiv semnificativ statistic

0 5 10 15 20 25 30 35 400

5

10

15

20

25C

on

cen

trat

ie m

ola

ra (m

ol

L)

x 1

05

Timp (ore)

CKL

Ket cristale

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

0

10

20

30

40

50

60

KET

CKL

Co

nce

ntr

atie

Pla

smat

ica

(

gm

L)

Timp (ore)

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

9

doar icircn testul tail-flick La nivel gastric icircn testul Writhes efectul icircntacircrzie o oră iar

la nivelul sistemului nervos din cadrul testului de comportament icircntarzie cu 4 ore

Fenomenul se datorează instabilității chitosanului ce acoperă veziculele

cu medicament la pH-urile specifice acestor medii de eliberare

Efectul produs de analgezice icircn sacircnge s-a menținut maxim cea mai lungă

perioadă de timp (6 ore) urmat de opioide la care efectul s-a menținut maxim (4

ore) deoarece chitosanul la pH-ul ridicat al sacircngelui devine mai puțin solubil

permițacircnd o mai lentă destrămare a veziculelor La nivel abdominal efectul

antinociceptiv al veziculelor cu medicament icircn testul Writhes s-a menținut maxim

(1 - 2 ore) indiferent de medicamentul folosit deoarece chitosanul devine mai

solubil permițacircnd eliberarea mai rapidă a medicamentului

Cap IVObţinerea și caracterizarea unor sisteme de nanoparticule metale

nobile icircn medii apoase de polimeri amfifilici hidrosolubili

Icircn acest capitol este prezentată sinteza caracterizarea și evaluarea in vivo

a proprietăților nanoparticulelor din platină argint și aur Aceste nanoparticule fac

obiectul unor aplicații medicale ce necesită obținerea lor printr-un proces de

nucleaţie icircn condiții blacircnde asiguranduli-se o bună dispersabilitate prin reducerea

icircn agenți de stabilizare Evaluarea proprietăților nanoparticulelor in vivo s-a făcut

urmărind efectul antibacterian pe culturi de bacterii și inducerea unor procese

neurotoxice la nivelul sistemului nervos

IV1 Sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Pentru sinteza nanoparticulelor de platină și argint s-a utilizat o celulă

electrochimică alcătuită din doi electrozi Prin reducere la catod se formează atomi

zero valenti proveniși din disoluția oxidativă a anodului Prezența electrolitului

alcătuit din soluția de precursor și polimer permite formarea de microdomenii de

reacţie restricţionată pentru nanoparticulele ce se formează

Nanoparticulele de platină acoperite cu poliamidhidroxiuretan PAmHU

s-au obținut printr-o metodă sonoelectrochimică [2 4] care are avantajul

controlului dimensiunii nanoparticulelor ce se formează icircn microdomeniile

polimerului

Nanoparticulele de argint acoperite cu poliamidhidroxiuretan s-au

sintetizat prin electrosinteză icircn regim galvanostatic pentru densităţi de curent de

625 mAcm2 (AgI) şi 156 mAcm

2 (AgII) la temperatura camerei sub agitare

puternică şi icircn atmosferă de azot Timpul optim pentru sinteză a fost de 15 min

Nanoparticulele de Au au fost obținute prin reducere icircn soluții de chitosan

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

10

cu diferite mase moleculare [7] Prepararea soluțiilor precursor pentru fiecare din

cele 4 tipuri de chitosan s-a făcut amestecacircnd 2 4 6 8 și 10 ml HAuCl4 3H2O 10-

3 M cu 38 36 34 32 și respectiv 30 ml de chitosan 01 sub agitație cu

ultrasunete

Caracterizarea structurală a nanoparticulelor a arătat că nanoparticulele de

platină au dimensiunile cristalitelor cuprinse icircn domeniul 10 - 42 nm și o stabilitate

situată pe pragul de dispersie pentru densităţi de curent 06 mAcm2 12 mAcm

2

Dimensiunile mai mari obținute prin AFM sugerează că nanoparticulele

sunt acoperite cu macromolecule de PAmHU ca urmare a interacțiunii icircntre

polimer și nanoparticule conform studiilor FTIR Sistemele coloidale prezintă un

nivel acceptabil de stabilitate conform valorilor medii ale potenţialului Zeta

Nanoparticulele de argint icircmpachetate icircn polimer par a avea o stabilitate

mai bună pentru dimensiuni mai mari (100nm) Nanoparticulele de aur prezintă o

anumită dinamică a dimensiunilor de la cacircțiva zeci de nm pacircnă la cicircteva sute de

nm ca urmare a procesului de maturare Oswald și o multitudine de forme puse icircn

evitență atacirct prin DF cacirct și prin TEM Prin AFM s-a observat că nanoparticulele

sunt acoperite cu chitosan și prin analiză FTIR s-au identificat grupările

funcționale care permit interacțiunea cu polimerul

Fig 69 Spectrele UV-Vis-NIR ale

chitosanului PG pentru toate

concentrațiile de precursor HAuCl4

Fig 70 Micrografia obținută prin

microscopie optică DF evidențiază faptul că

nanoparticulele de Au au geometrii diferite

deoarece plasmonii acestora sunt colorați

diferit

Soluțiile proaspăt sintetizate se află pe pragul de dispersie urmacircnd ca prin

icircmbătrănire icircn timp să li se icircmbunătățească nivelul de stabilitate

530

535

540

545

550

555

2

4

6

8

005

010

015

020

PG

MMW

LMW

OSL

Abso

rban

ta (

ua

)

Lungim

ea d

e undatilde

(nm

)

Cantitatea de aur (mL)

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

11

IV3 Analiza comportamentului sistemelor de nanoparticule de Au icircn chitosan

icircn raport cu diferiți factorii externi

Supuse proceselor de icircmbătracircnire icircn timp soluțiile de nanopatricule de Au

acoperite cu chitosan (menținute la 23ordmC) au fost analizate spectral UV-Vis-NIR la

intervale de 2 3 4 7 8 și respectiv 11 luni și determinate distribuțiile de

dimensiuni și de potențial Zeta la 2 3 7 și 11 luni după sinteză

Fig 78 Spectrul UV-Vis pentru toate soluțiile de chitosan cu concentrații mici de aur

Soluțiile cu cea mai icircndelungată stabilitate de 11 luni s-au dovedit a fi

cele care conțin concentrații mici de precursor de aur indiferent de masa

moleculară a chitosanului Soluțiile cu concentrații medii de precursor de aur au

avantajul că-și pot păstra forma și dimensiunea medie a nanoparticulelor icircn

polimerul cu masă mică și mare moleculară Stabilitatea acestor soluții scade odată

cu creșterea concentrației de precursor de aur

Soluțiile coloidale menținute la temperatura de 500C icircntr-o etuvă

termostatată au fost analizate spectral și li s-au determinat distribuțiile de

dimensiune și potențial Zeta fiind apoi analizate prin TEM și spectroscopie

Raman[10]

Fig 89 Spectre Raman pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la concentrații mari de aur

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2PG

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

532

532

535

530

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6LMW m

6LMW inc

29185

15718

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare raman (cm-1)

6MMW m

6MMW inc

15718

15997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

6PG m

6PG inc

6595

6036

1570

151521325

2118 2945

29176

400 600 800

00

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2MMW

1luna

2luni

3luni

4luni

7luni

8luni

11luni

537

520

526

524531 629

530 638

638

400 600 80000

Ab

sorb

anta

(u

a)

Lungimea de unda (nm)

2LMW

1luna

2 luni

3 luni

4luni

7luni

8luni

11luni

530

521

5245

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

12

S-a observat că cu cacirct masa moleculară a chitosanului este mai mare (PG)

cu atacirct soluțiile prezintă o mai bună stabilitate odată cu creșterea timpului de

icircncălzire Supuse procesului de icircncălzire sistemele coloidale tind icircn primele ore

să-și crească progresiv intensitatea modului transversal la 530 nm fapt ce indică o

icircmbunătățire a mediului dielectric icircn imediata vecinătate a nanoparticulelor [12]

Acest lucru duce la și atomii din metalul nanoparticulelor fenomen pus icircn

evidență și de intensificarea semnalului Raman [13] mai ales la soluțiile cu cea

mai mare concentrație de precursor de aur

Soluțiile coloidale supuse la o temperatură constantă de -20 0C icircn cicluri

de cacircte 20 min icircn care au atins starea solidă prin icircnghețare și apoi au fost readuse icircn

stare lichidă prin dezghețare la temperatura camerei tot icircn 20 min au fost analizate

spectral li s-au efectuat măsurători de potențial Zeta distribuții de dimensiune și

micrografii TEM [10] S-a observat că cu excepția probelor ce conțin chitosan PG

toate celelalte au suferit procese de destabilizare mai rapidă Pierderea stabilității a

fost motivată icircn toate cazurile de creșterea bruscă a dimensiunilor clusterilor de

nanoparticule lucru dovedit și de pierderea culorii soluțiilor și existența

precipitatului depus pe fundul flaconului Cu cacirct masa chitosanului scade cu atacirct

maximul de absorbție scade mai repede ceea ce dovedește că succesiunea unui

număr de congelări și decongelări conduce la degradarea stabilității soluțiilor care

au suferit o creștere a vacircscozității și determină precipitarea nanoparticulelor

aglomerate [15]

Fig 99 Spectrul de absorbție pentru soluțiile 6PG 6MMW și 6LMW la icircnghețare

O proprietate care se manifestă de altfel și la icircncălzirea soluțiilor

coloidale este stabilitatea mai mare a chitosanului mare molecular Aceasta pare să

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

13

fie motivată de faptul că după legarea nanoparticulelor de aur se micșorează

intensitatea vibraței legăturii N-H făcacircndu-o mai flexibilă [16]

Soluțiile coloidale amestecate cu activatori (acid Formic și bufer Tris)

supuse unui proces de oxidare electrochimică icircn regim galvanostatic la un curent

de 025 mA timp de 10 min au fost analizate spectral icircn UV-Vis-NIR după 30

minute și icircn final prin DF și RAMA

(a) (b)

Fig 102 Modificarea absorbanței (a) și semnalului Raman (b) a sol 2LMW icircn ac formic

Procedura de oxidare electrochimică a probelor s-a repetat de icircncă 4 ori

la intervale de 24 de ore S-a observat o scădere a absorbanței icircnsoțită și de o

deplasare spre lungimi de undă mai mari Soluțiile proaspăt preparate nu au

prezentat creșteri ale absorbanței ci mai curacircnd mici scăderi icircnsoțite de deplasări

spre lungimi de undă mai mari

Icircn final dispariția semnalului Raman pune icircn evidență tocmai scăderea

activității optice a soluțiilor cu nanoparticule supuse proceselor oxidative

Fenomenul poate fi datorat adsorbțieiabsorbției de hidrogen la nivelul

nanoparticulelor de aur [18 - 20] icircn urma oxidării electrochimice Se induc astfel

schimbări structurale icircn masa de substață şi rezultă o activitate metastabilă ce se

menține și după eliminarea hidrogenului [21 - 22] Odată cu icircmbătracircnirea acestor

soluții are loc o reorganizare structurală lentă care conduce la stări mai puţin

active

Au fost supuse iradierii icircn spectrul vizibil probe de nanoparticule de aur

epuizate prin icircmbătracircnire icircn timp icircn scopul reactivării efectelor de Plasmon

Rezonant și SERS S-a ales timpul optim de iradiere a probelor de 20 min distanța

optimă de 15 cm de lampa cu halogen și au fost termostatate la temperatura de

25 0C S-a observat intensificarea efectului LPR (Local Plasmon resonance) și

SERS

400 600 800 1000

00

02

04

Ab

sorb

ance

(a

u)

Wavelength (nm)

2LMW MaetorB

10mL 2LMW+1mL Ac Formic

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (2)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (3)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (4)

10mL 2LMW+1mL Ac Formic (5)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

20000

40000

60000

80000

Inte

nsi

tate

(u

a)

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW +Ac Formic

2134

2142

2907

2924

1584

1524

2355

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

14

Creștea semnalului Raman sugerează o icircnbunătățire a relației (interacției

intime) mediu-polimer și nanoparticule Soluțiile care conțin chitosani cu mase

mici și medii moleculare prezintă cel mai puternic semnal Raman La toate

soluțiile cu chitosan cu masă mare moleculară acest fenomen este mai slab

(a) (b)

Fig 110 Spectrul de absorbție (a) și spectrul Raman (b) pentru soluția 2LMW aflată

sub acțiunea luminii

IV 4 Evaluarea in vivo a proprietăţilor sistemelor de nanoparticule metale

nobile

Pentru icircnceput au fost evaluate proprietațile nanoparticulelor de argint

introduse icircn medii de cultură bacteriană S-a urmărit modul icircn care efectul

antibacterian este influențat de dimensiunea acestora (29 nm la Ag I şi 23 nm la Ag

II) de concentrația (10 30 60 μgml icircn mediu) și modul icircn care prezența

polimerului modifică acțiunea nanoparticulelor icircn mediile biologice [25]

Fig 129 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu E coli pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

Fig 130 Dinamica de creştere a curbei

bacteriene icircn mediu LB cu S aureus pentru

diferite mărimi şi concentraţii ale

nanoparticulelor de argint

400 600 80000

01

02

03

04

05

06

07

Inte

nsi

tate

(u

a)

Lungime de unda (nm)

2LMW

1exp

2exp

3exp

5exp

6exp

7exp

8exp

9exp

10exp

11exp

12exp

13exp

14exp

16exp

test 2

17exp

18exp

19exp

20exp

21exp

22exp

523

525

525

614

614

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

50000

100000

150000

200000

250000

Inte

nsi

tate

ua

Deplasare Raman (cm-1)

2LMW m

2LMW Viz

1578

15465

2134

21234

2921

2910

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

00

05

10

15

20

25

30

Control

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (5gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (5gml)

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

0 10 20 30 40 50

00

05

10

15

20

25

30

35

40

Den

sita

te o

pti

ca

Timp (ore)

Contro

AgI (1gml)

AgI (5gml)

AgI (50gml)

AgII (1gml)

AgII (5gml)

AgII (50gml)

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

15

Prin microscopie DF și SEM s-au pus icircn evidență prezența

nanoparticulelor de argint icircn mediul de cultură și inducerea unor modificări icircn

morfologia celulei Acest studiu a arătat că nanoparticulele de Ag au efect

antibacterian chiar și la concentrații mai mici decacirct cele din literatură Polimerul de

acoperire PAmHU a permis o creștere cu 10 ore a ratei de inhibiție a mediului

bacterian datorită asigurării unei mai bune dispersii a nanoparticulelor Eficiența

bactericidă a soluțiilor coloidale crește cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor

aderența la suprafața bacteriei fiind datorată proprietăţilor de suprafaţă

Control Ag I 10 μgmL Ag II 10 μgmL

a b c

d e f

Fig 131 Micrografiile SEM prezintă efectele nanoparticulelor Ag I ndash 29 nm şi Ag II ndash 23

nm asupra morfologiei celulelor de E coli (a b c) şi S aureus (d e f)

Totuși mecanismul major prin care nanoparticulele de argint au manifestat

proprietăţi antibacteriene eficiente pare a fi datorat formării de aglomerări şi

ancorării la suprafaţa celulei bacteriene ceea ce ne determină să credem că

dispersia nanoparticulelor icircn polimer se menține chiar și icircn formele aglomerate

Studiul icircși propune de asemenea să evalueze biocompatibilitatea

nanoparticulelor de Ag administrate intraperitoneal la șoareci și a efectele produse

de nanoparticulele de Au (AuNP) la imunizarea șobolanilor tratați cu tulpini

bacteriene test ca și asupra reactivității imune a șobolanilor icircn condiții de stres S-a

folosită o tulpină test (LPS 250 micrograme) de endotoxină lipopolizaharidă

bacteriană comună produsă de bacteriile Gram negative

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

16

După administrarea nanoparticulelor de AgI la concentraţii de 5 μgml 10

μgml şi polimer (grupului de control) icircn analizele de laborator s-a observant ca nu

au aparut diferenţe semnificative a formulei elementelor leucocitare GOT GPT şi

a nivelurilor de LDH nici a parametrilor imunitari (OC PC BC )

Nanoparticulele de Au cu dimensiuni mai mici AuNP1 au contracarat efectul

toxic indus de LPS (figura 135) prin creșterea nivelului anticorpilor

Fig 135 Nivelul anticorpilor icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2

Fig 137 Indicele de fagocitare in vitro al

neutrofilelor circulante icircn a 9-a zi

postimunizate cu (LPS) la administrarea

AuNP1 și AuNP2

Amble dimensiuni de nanoparticule au produs diminuarea indicelui de

fagocitare in vitro a neutrofilelor circulante la loturile imunizate cu LPS (figura

137)

Icircn urma inducerii stresului electric s-a constat o diminuare a titrului anticorpilor la

animalele imunizate cu LPS și tratate cu AuNP1 și AuNP2 sugeracircndu-se că nanoparticulele

de aur nu pot contracara efectele factorului de stres și a LPS (figura 138) Rezultate

experimentale similare au fost observate și icircn cazul aplicării ședințelor de stres prin izolare

individuală icircn tub (figura 139) icircnsă efectele sunt mai pronunțate

Fig 138 Nivelul anticorpilor evaluat icircn a

4-a zi postimunizate cu (LPS 250 μgkg)

la administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse stimuluilui electric

Fig139 Nivelul anticorpilor icircn a 4-a zi

postimunizate cu (LPS 250 μgkg) la

administrarea AuNP1 și AuNP2 pentru

animalele supuse izolării

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

17

Studii de comportament și modificări neurocomportamentale la șoareci au

sugerat producerea unor efecte neurotoxice sub acțiunea nanoparticulelor de argint

Acest lucru a putut fi evaluat prin investigarea histopatologică a creierului

de șobolan supus tratamentelor cu nanoparticule de Ag De asemenea rezultatele de

limitare a toxicității induse de LPS de către nanoparticulele de Au icircmpachetate icircn

chitosan la şobolanii de laborator au sugerat investigarea efectului acestora asupra

creierului și a ficatului

S-a constatat la șoarecii tratați cu nanoparticule de Ag cum coeficienţii

creierelor au scăzut semnificativ faţă de lotul de control [28] Putem spune că

nanoparticulele de Ag induc degradări ale structurilor nervoase implicate icircn

procesele memoriei icircn loturile tratate cu nanoparticule de Ag indiferent de

dimensiunea acestora

Fig 144 Imagini de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule de Ag icircn creierul de șobolan (a) comparativ cu controlul (b)

Fig 145 Histopatologia creierelor Control (A) Ag I ndash 5 microgml (B) Ag I ndash 10 microgml (C) Ag

II ndash 5 microgml (D) Ag II ndash 10 microgml (E) Săgeţile indică clivajul neuronal indus de tratamentul

cu nanoparticule de argint

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

18

Icircn cazul șoarecilor tratați cu nanoparticule de Au de dimensiuni mai mari

AuNP2 și LPS ficatul a crescut semnificativ raportat la greutatea corporală

comparativ cu controlul S-a constatat de asemenea o scădere semnificativă a

greutății creierului icircn raport cu greutatea corporală numai icircn cazul LPS + AuNP2

comparativ cu controlul Cu toate acestea icircn grupurile tratate cu LPS şi cu ambele

tipuri de AuNP nu au fost observate modificări patologice semnificative icircn creier

AuNP1(icircn insert Controlul) (a) AuNP (b)

Fig 146 Imaginile de microscopie optică icircn DF indică formarea de aglomerări de

nanoparticule AuNP2 icircn creierul de șobolan (b) comparativ cu AuNP1 unde se observă foarte

puțini plasmoni (a) și comparativ cu controlul (icircn insert)

Fig 147 Histopatologia ţesuturilor cerebrale la şobolanii masculi Wistar trataţi cu LPS după

expunerea la AuNP1 şi AuNP2 A control B LPS C LPS + AuNP1 D LPS + AuNP2

A

B

C

D

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

19

Concluzii generale

Icircn această lucrare mi-am propus să obțin icircn condiții blacircnde vezicule de

dimensiuni nanometrice și nanoparticule platforme icircn biomedicină

Pentru a icircmpiedica procesul de absorbţie a proteinelor opsonice pe

suprafața acestor transportatori a fost necesară stabilizarea lor prin polimerizarea

unor monomeri biocompatibili

Am ales un polimer sintetic PAmHU cu proprietăți biodegradabile și

chitosanul un biopolimer cationic care poate interacţiona atacirct cu bistratul lipidic al

veziculelor cacirct și cu membranele anionice ale celulelor Pentru ajustarea pH-ului

la nivel fiziologic toate sistemele coloidale au fost dializate stabilitatea acestora

fiind medie ndash acceptabilă pentru aplicațiile propuse

Caracterizarea formulărilor obținute a arătat că veziculele sunt stabile

datorită polimerului de acoperire carea a rigidizat structurile veziculelor și a creeat

o icircncărcare cu sarcină pozitivă a acestora

Studiul efectelor in vivo a veziculelor cu medicament a pus icircn evidență

următoarele

procesul de eliberare se prelungește icircn timp față de substanța

neicircncorporată

momentul eliberării medicamentului este controlat de comportamentul

chitosanului la diferitele pH-uri ale mediilor biologice (efectul la nivel

gastric s-a obținut cu icircntacircrziere față de obținerea maximului de

concentrație din sacircnge de asemenea efectul sedativ obținut la nivelul

sistemului nervos după administrarea de magneziu icircncorporat icircn vezicule

a suferit intacircrzieri și mai mari)

Caracterizarea nanoparticulelor a arătat că acestea sunt acoperite cu

polimer și prezintă o bună stabilitate

Studiul comportamentului soluțiilor coloidale de aur supuse unor factori

fizici externi (icircncălzire răcire) a arătat că soluțiile suferă icircn timp un proces de

oxidare care se manifestă mai rapid la icircnghețare și care icircn final poate fi considerat

un proces de icircmbătracircnire mai lentă

Sub acțiunea unor formulări chimice nanoparticulele suferă un proces de

oxidare care destabilizează foarte rapid structura sistemului coloidal Prin iradiere

icircn vizibil am reușit să icircntacircrziem procesul de oxidare icircn soluțiile coloidale

provocacircnd intensificarea efectului LPR

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

20

Evaluarea in vivo a efectelor nanoparticulelor de Ag și Au a arătat că

- atacirct nanoparticulele de argint cacirct și cele de aur icircn cei doi polimeri prezintă o bună

biocompatibilitate cu organismul

- creșterea activității antibacteriene datorită prezenței polimerului de asociere icircn

soluțiile cu nanoparticule de argint a permis obținerea unor rezultate superioare

pentru soluții de nanoparticule cu dimensiuni și concentrații mai mici decăt cele

studiate icircn literatură Mai mult decacirct atacirct s-a observat că argintul cu dimensiunea

medie de 23 nm este mult mai activ decacirct argintul de 29 nm

- soluțiile cu nanoparticule de aur icircn chitosan acționează icircmpotriva toxicității

induse de (un factor nociv) LPS fapt demonstrat prin analiza detaliată a

parametrilor hematologici şi a unor metaboliţi icircn serul animalelor experimentale

Sub acțiunea celor două forme de stres nanoparticulele de aur nu au

putut contracara efectele supresive și ale activării sistemului simpatic prin

administrarea LPS

- soluțiile cu nanoparticule de argint (23 nm și 29 nm) icircn PAmHU au prezentat

efecte neurotoxice asupra creierului de șobolan Ambele soluțiil de aur icircn chitosan

nu au produs efecte neurotoxice chiar dacă la aurul de 2222 nm s-au manifestat

ușoare modificări la nivelul indicelui ficatului și al creierului

Evaluarea histopatologică a creierelor icircn vederea determinării

neurotoxicităţii induse de nanoparticule a arătat modificări sub formă de clivaj

local al neuronilor icircn cazul nanoparticulelor de Ag icircn PAmHU și lipsa totală a

modificărilor patologice icircn cazul nanoparticulelor de Au icircn chitosan

Comparacircnd comportamentul nanoparticulelor de metale nobile icircn cei doi

polimeri se poate spune că

Nanoparticulele stabilizate icircn chitosan prezintă modificări de

comportament la interacțiunea cu mediul icircn care ajung datorită

comportamentului diferit al chitosanului icircn funcție de pH

Nanoparticulele de metale nobile stabilizate icircn PAmHU sau icircn chitosan au

produs efecte semnificativ diferite pentru dimensiuni aproape

comparabile atacirct icircn mediile de cultură cacirct și icircn testele pe șobolani

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

21

Lucrări științifice

Lucrări publicate ISI

1 M Stefan L Hritcu M Mihasan Daniela Pricop Irina Gostin R-I Olariu

Simona Dunca VMelnig Enhanced antibacterial effect of silver

nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-

hydroxyurethane) media Journal of Materials Science Materials in Medicine

Volume 22 Issue 4 (2011) Pages 789-796 DOI 101007s10856-011-4281-z

ISSN0957-4530 (print version) ISSN 1573-4838 (electronic version)

ArticleISI Factor 2325 (2010) Influence Score 0597

2 Laura Obreja Dana Pricop N Foca V Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47(1) 2010 p

42 - 47 ISSN 00255289

3 L Hritcu M Stefan Daniela Pricop Anca Neagu M Mihasan Liliana

Tartau V Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate

LPS - induced toxicity after repeated administration in laboratory rats

Materials Science and Engineering C 2011 (Impact factor 2407) Influence

Score 061 (trimisa spre publicare )

4 D Bicircndar C Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J

Colloid Interf Sci (trimisă spre publicare)

Abstracte publicate icircn reviste ISI

5 L Tartau D Bindar D Ciubotariu V Melnig Evaluation of

poly(amidehydroxyurethane) coated silver nanoparticles influence on

morphine-induced place preference in rats Conference24th Congress

Meeting of European-College-of-Neuropsychopharmacology Location Paris

FRANCE Date SEP 03-07 2011 Sponsor(s) European Coll

NeuropsychopharmacolSourceEuropean Neuropsychopharmacology

Volume 21 Supplement 3 Pages S267-S267 Published SEP 2011 Impact

Factor 4201 AIS 1208 (2010) httpdxdoiorg101016S0924-

977X(11)70416-3(Influence Score 15779)

6 L Tartau D Bindar V Melnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in mice European

Neuropsychopharmacology Vol 20 Supplement 3 2010 p S276 - Papers of

the 23rd Congress Meeting of European-College-of-

Neuropsychopharmacology AUG 28-SEP 01 2010 Amsterdam Netherlands

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

22

ISSN 0924-977X (Abstract) Impact Factor 4201 AIS 1208 (2010)

httpdxdoiorg101016S0924-977X(10)70359-X (Influence Score 15779)

7 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of

magnesium chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p

185S ISSN 0953-1424 (Abstract) (Impact Factor 1246 (2009))( Influence

Score 0267)

8 Liliana Tarţău Daniela Bicircndar Raoul Vasile Lupuşoru Viorel Melnig The

effects of magnesium soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in

mice Magnesium Research 22(3) 2009 p 212S ISSN 0953-1424 (Abstract)

(Impact Factor 1246 (2009)) (Influence Score 0267)

Publicații non-ISI publicate

1 Liliana Tartau Daniela Bindar V Melnig Morphologic analysis and in vivo

subacute toxicity evaluation of nanovesicles encapsulating the K-opioid

agonist U50488 Acta Chemica Iasi Vol 18(2)

2 A Cazacu D Bicircndar L Tarțău L Hrițcu M Ștefan L Niță C Ionescu V

Nica GRusu M Dobromir V Melnig (2011) Effect on nerve structures of

functionalized gold-chitosan nanoparticles obtained by one pot synthesis

Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan Cuza Secțiunea Genetică

și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

3 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău V Melnig Acetaminophen entrapped in soft

matter vesicles design based on nociceptive model in mice Academic Journal

of Manufacturing Engineering vol8 Issue 1 2010 pp 12-17 ISSN 1583-

7904B+

4 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania Conference

Proceedings Book Series Knowledge Based Organization International

Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters Conference

Proceedings Citation IndexB+

5 D Bicircndar L Tarţău A Gacircrlea L Niţă V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice Romanian

Journal of Biophysics vol 20 nr 1 p 23ndash35 2010B+

6 LTarţău RV Lupuşoru DBicircndar VMelnig Experimental researches on

the effects of nano-vesicles encapsulating ketoprofen in a visceral pain model

in mice Therapeutics Pharmacology and Clinical Toxicology Volume XIV

Number 2 June 2010 pp 113-117B+

23

7 LTarţău CE Lupuşoru DBicircndar VMelnig Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles Annals of the

Romanian Society for Cell Biology Volume XVIII Issue 2 December

2010B+

8 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău A Chiriac L Niţă V Melnig Effect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice

Annals of the Romanian Society for Cell Biology Vol XIV Issue 2 p 256-

260 2009 B+

Participări la conferințecongrese internaționale și naționale

9 D Pricop M Ștefan M Mihașan L Hriţcu R Olariu V Melnig

Antibacterial activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical

synthesis The 16th International Conference the Knowledge-Based

Organization Applied Technical Sciences and Advanced Military

Technologies November 25-27 2010 Sibiu Romania (prezentare orală)

10 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău A Chiriac V Melnig Acetaminophen

entrapped in soft matter vesicles design based on nociceptive model in mice

effects correlation The 2nd

International Conference on Polymers Processing

in Engineering Galați 22 ndash 23 octombrie 2009 (prezentare orală)

11 L Tartau D Bicircndar R V Lupusoru V Melnig The effects of magnesium

soft matter vesicles carrier in a nociceptive model in mice International

magnesium symposium Romania The XII ndash th International Magnesium

Symposium 22-25 Septembrie 2009 Iasi (prezentare orală)

12 LTarțău LV Lupușoru DBicircndar V Melnig Experimental Reseaches on

the effects of tramadol soft matter vesicles in a somatic pain model in mice

PostSatelite to the 46-th EUROTOX Meeting Inovation Trough

Nanotechnology and Nanomaterials- Current Aspect of Safety Assesment and

Regulation 22-24 april 2010 Dresden Germany (prezentare orala)

13 LTarțău DBicircndar VMelnig Experimental researches on the effects of

original tramadol loaded nanoparticulate formulations in visceral nociception

Joint meeting of 2-nd Hungarian Symposium on Neurostimulation

Hungarian Pain Society and Teaching course on Neuromodulation for Central

and Eastern Europe Greece and Israel 30sept -2oct 2010 Pecs

Hungary(prezentare orala)

14 L Tarţău C E Lupuşoru D Bicircndar V Melnig Biocompatibility

investigation and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles

Al XXVIII Simpozion Stiintific SRBC 9-12 Iunie 2010 Constanţa

(prezentare orală)

24

15 L Tarţău CE Lupuşoru DBicircndar VMelnig Designul evaluarea toxicităţii

acute şi studierea eliberării in vivo a ketoprofenului trapat icircn nano-vezicule

lipidice A XXVIII-a Sesiune Anuala a SRBC 9-12 iunie 2010 Constanţa

(prezentare orală)

16 L Tarţău RV Lupuşoru D Bicircndar V Melnig In vivo release and visceral

antinociceptive effect evaluation of ketoprofen loaded vesicles in mice 11-th

International Congres of Clinical Pharmacology Therapeutics and Toxicology

8-11 June Oradea 2010 (prezentare orală)

17 V Melnig L Obreja A Garlea D Bicircndar Quantum nanoparticles effects

used for biological application The X-th National Coference of Biophysics

ldquoCNB 2009 bdquo1-3 october 2009 Cluj (prezentare orala)

18 VMelnig NFoca LObreja D Pricop Size-controled synthesis of

monodisperse platinum nanoparticle by sonoelectrochemical methods 3-rd

International Confertence bdquo Biomaterials amp Medical Devicesrdquo BioMed 2008

13-16 november 2008 Bucuresti

Participări cu poster

1 L Tarțău D Bicircndar V Melnig The effect of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in miceThe 23rd

ECNPCongres Amsterdam The Netherlands 28 august-1 september 2010

(poster)

2 L Tarțău RV Lupusoru D Bicircndar C Lupusoru V Melnig Experimental

researches on the effects of tramadol soft vesicles in a somatic pain model in

mice bdquoInovation through nanotechnhology and nanomaterialsrdquoDresden 22-24

April 2010 (poster)

3 D Bicircndar A Garlea L Tartau V Melnig Design of magnesium chloride

soft vehicle carrier 12th International Magnesium Symposium Iasi 22-25

septembrie 2009 (poster)

4 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău AChiriac L Nită V Melnig Eeffect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice

The 15 th International Scientific Conference Land Force Academy 26-28

November 2009 Sibiu (poster)

5 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău A Chiriac L Niță V Melnig Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-assemble characterization

NanoRomania International Workshop Iasi 2-5 iunie 2009 (poster)

6 A Gacircrlea D Pricop V Melnig M I Popa Paracetamol Nanocontainers

Obtained in Cationic Polymer-Surfactant Self-Assembling Matrices 8th

International Conference on Physics of Advanced Materials Iasi 4-7 iunie

2008 (poster)

25

7 LTarțău DBicircndar VMelnig Mophologic analysis and in vivo subacute

toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488

1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale Iasi 07-08 oct 2010

(poster)

8 M Viorel Ș Marius H Lucian M Mihășan C Irina DPricop Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in

Poly(amide-hydroxyurethane) media Al III-lea Congres Internaţional şi a

XXIX-a sesiune anuală a SRBC 8-12 iunie 2011 Arad

9 D Bicircndar L Tarțău A Gacircrlea L Niță V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice National

Conference on Biophysics Cluj-Napoca 1-3 octombrie 2009 (poster)

10 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău A Chiriac L Niţă V Melnig Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization

Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB) Xth edition

Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster)

11 A Cazacu L Ursu D Pricop L Hrițcu S Marius V Melnig Silver

nanoparticles plasmon ndash resonant applications in biological microscopy

Conferinţa Naţională de Fizică CNF 2010 - Iaşi 23-25 septembrie 2010

Rezumatele Lucrarilor p174 (poster)

12 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău A Chiriac V Melnig Efectele

acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la

soareci 21-22 octombrie 2009 Bucuresti (prezentare poster)

Contract de cercetare

PN II Idei cod 1996 nr 5092008 Sinteza in conditii blande prin

nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici

de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie

26

Bibliografie selectivă

1 DD Lasic Elsevier New York 1998

2 El-Sayed I H Huang X EL-Sayed M A Nano letters 5 821 2005

3 Mie G (1908) Ann Phys 25377

4 El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34257

5 Kreibig U Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters Vol 25 Springer

Berlin

6 P Buseck J M Cowley L Eyring eds High resolution transmission electron

microscopy and associated techniques New York London Amsterdam Oxford

University Press 1988)

7 Douglas B Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging a

John Wiley amp Sons Inc Publication

8 D Cullity Elemnts of X-Ray Diffraction Reading Addison-Wesley Publishing Co

Inc 1978

9 J P Glusker M Lewis M Rossi Crystal Structure Analysis for Chemists and

Biologists VCH Publishers New York 1994

10 R Griffiths J A De Haseth Fourier Transform Infrared Spectrometr Wiley N York

1986

11 J R Ferraro K K Krishnan Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Industrial and Laboratory Chemical Analysis Academic Press San Diego 1990

12 R K Poole Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption visible and

ultraviolet spectra icircn Michael G Gore (ed) Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13 Gacircrlea A MI Popa V Pohoaţă V Melnig Ibuprofenketoprofen entrapment in

chitosan based vesicle carrier Rom J Biophys 2007 17 157-168

14 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of magnesium

chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p 185S ISSN 0953-

15 Tarţău L Lupuşoru CE Bicircndar Daniela Melnig V Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles Annals of the

Romanian Society for Cell Biology Volume XVIII Issue 2 December 2010

16 Saacutenchez-Carpena J Domiacutenguez-Hervella F Garciacutea I Gene E Bugariacuten R

Martiacuten A Tomaacutes-Vecina S Garciacutea D Serrano JA Roman A Marineacute M

Mosteiro ML Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic Eur J Clin Pharmacol 63 (8)751-60 2007

17 Zippel H Wagenitz A A multicentre randomised double-blind study comparing the

efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain Clin Drug Investig 27 (8)533-43

2007

18 Jimeacutenez-Martiacutenez E Gasco-Garciacutea C Arrieta-Blanco JJ Gomez del Torno J

Bartolome Villar B Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg vs Ibuprofen 600mg after their administration in patients subjected to oral

surgery Med Oral 9 (2)143-8 138-43 2004

19 LTartau D BindarVMelnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter

vesicles in an experimental pain model in mice European Neuropsychopharmacology

Vol 20 S3- Papers of the 23rd ECNP Congressp S276 ISSN 0924-977X

20 Obreja l Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 31

21 Cismaru l Hamaide T Popa M Materiale Plastice 44(3) 2007 p 243

27

22 Laura Obreja Daniela Pricop Neculai Foca Viorel Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47 (1) pg42-47 2010

23 Obreja L Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 3

Obreja L Dorohoi DH Melnig V Foca N Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis Mater Plast 3 261-2641

24 Melnig V Ciobanu C J Optoelectron Adv Mater 7(6) 2005 p 2809

25 Ana Cazacu Daniela Bicircndar Liliana Tarțău Lucian Hrițcu Marius Ștefan Loredana

Niță Cezar Ionescu Valentin Nica George Rusu Marius Dobromir Viorel Melnig

(2011) Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

26 Bicircndar Daniela Cezar Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J Colloid

Interf Sci (trimisă spre publicare)

27 M Baia F Toderas L Baia J Popp S Astilean Chem Phys Letters 422 127 2006

28 Panacek A Kevitek I Prucek R Kolar M VecerovaR Pizorova M Sharma VK

Nevena T Zeboril R Silver colloid nanoparticles synthesischaracterization and their

antibacterial activity

29 Ming-Hua Hoa Pei-Yun Kuoa Hsyue-Jen Hsieha Tzu-Yang Hsienb Lein-Tuan

HoucJuin-Yih Laid Da-Ming Wanga Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129ndash138)

30 LD Burke AM OConnell AP OMullane J Appl Electrochem 33 (2003) 1125

31 B Bozzini G Giovannelli S Natali Scr Mater 43 (2000) 877

32 OM Bockris Z Minevski Int J Hydrogen Energy 25 (2000) 747

33 J Das S Patra H Yang Chem Commun (2008) 4451

34 Hyun Ju Kang Srikanta Patra Jagotamoy Das Abdul Aziz Jinkyung Jo Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles HJ Kang et al

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245ndash1248

35 Lucian Hritcu Marius Stefan Daniela Pricop Anca Neagu Marius Mihasan Liliana

Tartau Viorel Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C

36 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies November 25-27 2010 Sibiu

Romania Conference Proceedings Book Series Knowledge Based Organization

International Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37 Garner JP Mason GJ Behav Brain Res 2002 136(1)83ndash92

38 L Hritcu A Ciobica L Gorgan 2009 Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress Cent Eur J Biol 4(3) 335ndash342

24

15 L Tarţău CE Lupuşoru DBicircndar VMelnig Designul evaluarea toxicităţii

acute şi studierea eliberării in vivo a ketoprofenului trapat icircn nano-vezicule

lipidice A XXVIII-a Sesiune Anuala a SRBC 9-12 iunie 2010 Constanţa

(prezentare orală)

16 L Tarţău RV Lupuşoru D Bicircndar V Melnig In vivo release and visceral

antinociceptive effect evaluation of ketoprofen loaded vesicles in mice 11-th

International Congres of Clinical Pharmacology Therapeutics and Toxicology

8-11 June Oradea 2010 (prezentare orală)

17 V Melnig L Obreja A Garlea D Bicircndar Quantum nanoparticles effects

used for biological application The X-th National Coference of Biophysics

ldquoCNB 2009 bdquo1-3 october 2009 Cluj (prezentare orala)

18 VMelnig NFoca LObreja D Pricop Size-controled synthesis of

monodisperse platinum nanoparticle by sonoelectrochemical methods 3-rd

International Confertence bdquo Biomaterials amp Medical Devicesrdquo BioMed 2008

13-16 november 2008 Bucuresti

Participări cu poster

1 L Tarțău D Bicircndar V Melnig The effect of ketoprofen and dexketoprofen

soft matter vesicles in an experimental pain model in miceThe 23rd

ECNPCongres Amsterdam The Netherlands 28 august-1 september 2010

(poster)

2 L Tarțău RV Lupusoru D Bicircndar C Lupusoru V Melnig Experimental

researches on the effects of tramadol soft vesicles in a somatic pain model in

mice bdquoInovation through nanotechnhology and nanomaterialsrdquoDresden 22-24

April 2010 (poster)

3 D Bicircndar A Garlea L Tartau V Melnig Design of magnesium chloride

soft vehicle carrier 12th International Magnesium Symposium Iasi 22-25

septembrie 2009 (poster)

4 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău AChiriac L Nită V Melnig Eeffect of

acetaminophen soft matter vesicles carrier in a somatic pain model in mice

The 15 th International Scientific Conference Land Force Academy 26-28

November 2009 Sibiu (poster)

5 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău A Chiriac L Niță V Melnig Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-assemble characterization

NanoRomania International Workshop Iasi 2-5 iunie 2009 (poster)

6 A Gacircrlea D Pricop V Melnig M I Popa Paracetamol Nanocontainers

Obtained in Cationic Polymer-Surfactant Self-Assembling Matrices 8th

International Conference on Physics of Advanced Materials Iasi 4-7 iunie

2008 (poster)

25

7 LTarțău DBicircndar VMelnig Mophologic analysis and in vivo subacute

toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488

1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale Iasi 07-08 oct 2010

(poster)

8 M Viorel Ș Marius H Lucian M Mihășan C Irina DPricop Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in

Poly(amide-hydroxyurethane) media Al III-lea Congres Internaţional şi a

XXIX-a sesiune anuală a SRBC 8-12 iunie 2011 Arad

9 D Bicircndar L Tarțău A Gacircrlea L Niță V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice National

Conference on Biophysics Cluj-Napoca 1-3 octombrie 2009 (poster)

10 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău A Chiriac L Niţă V Melnig Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization

Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB) Xth edition

Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster)

11 A Cazacu L Ursu D Pricop L Hrițcu S Marius V Melnig Silver

nanoparticles plasmon ndash resonant applications in biological microscopy

Conferinţa Naţională de Fizică CNF 2010 - Iaşi 23-25 septembrie 2010

Rezumatele Lucrarilor p174 (poster)

12 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău A Chiriac V Melnig Efectele

acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la

soareci 21-22 octombrie 2009 Bucuresti (prezentare poster)

Contract de cercetare

PN II Idei cod 1996 nr 5092008 Sinteza in conditii blande prin

nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici

de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie

26

Bibliografie selectivă

1 DD Lasic Elsevier New York 1998

2 El-Sayed I H Huang X EL-Sayed M A Nano letters 5 821 2005

3 Mie G (1908) Ann Phys 25377

4 El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34257

5 Kreibig U Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters Vol 25 Springer

Berlin

6 P Buseck J M Cowley L Eyring eds High resolution transmission electron

microscopy and associated techniques New York London Amsterdam Oxford

University Press 1988)

7 Douglas B Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging a

John Wiley amp Sons Inc Publication

8 D Cullity Elemnts of X-Ray Diffraction Reading Addison-Wesley Publishing Co

Inc 1978

9 J P Glusker M Lewis M Rossi Crystal Structure Analysis for Chemists and

Biologists VCH Publishers New York 1994

10 R Griffiths J A De Haseth Fourier Transform Infrared Spectrometr Wiley N York

1986

11 J R Ferraro K K Krishnan Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Industrial and Laboratory Chemical Analysis Academic Press San Diego 1990

12 R K Poole Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption visible and

ultraviolet spectra icircn Michael G Gore (ed) Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13 Gacircrlea A MI Popa V Pohoaţă V Melnig Ibuprofenketoprofen entrapment in

chitosan based vesicle carrier Rom J Biophys 2007 17 157-168

14 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of magnesium

chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p 185S ISSN 0953-

15 Tarţău L Lupuşoru CE Bicircndar Daniela Melnig V Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles Annals of the

Romanian Society for Cell Biology Volume XVIII Issue 2 December 2010

16 Saacutenchez-Carpena J Domiacutenguez-Hervella F Garciacutea I Gene E Bugariacuten R

Martiacuten A Tomaacutes-Vecina S Garciacutea D Serrano JA Roman A Marineacute M

Mosteiro ML Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic Eur J Clin Pharmacol 63 (8)751-60 2007

17 Zippel H Wagenitz A A multicentre randomised double-blind study comparing the

efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain Clin Drug Investig 27 (8)533-43

2007

18 Jimeacutenez-Martiacutenez E Gasco-Garciacutea C Arrieta-Blanco JJ Gomez del Torno J

Bartolome Villar B Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg vs Ibuprofen 600mg after their administration in patients subjected to oral

surgery Med Oral 9 (2)143-8 138-43 2004

19 LTartau D BindarVMelnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter

vesicles in an experimental pain model in mice European Neuropsychopharmacology

Vol 20 S3- Papers of the 23rd ECNP Congressp S276 ISSN 0924-977X

20 Obreja l Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 31

21 Cismaru l Hamaide T Popa M Materiale Plastice 44(3) 2007 p 243

27

22 Laura Obreja Daniela Pricop Neculai Foca Viorel Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47 (1) pg42-47 2010

23 Obreja L Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 3

Obreja L Dorohoi DH Melnig V Foca N Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis Mater Plast 3 261-2641

24 Melnig V Ciobanu C J Optoelectron Adv Mater 7(6) 2005 p 2809

25 Ana Cazacu Daniela Bicircndar Liliana Tarțău Lucian Hrițcu Marius Ștefan Loredana

Niță Cezar Ionescu Valentin Nica George Rusu Marius Dobromir Viorel Melnig

(2011) Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

26 Bicircndar Daniela Cezar Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J Colloid

Interf Sci (trimisă spre publicare)

27 M Baia F Toderas L Baia J Popp S Astilean Chem Phys Letters 422 127 2006

28 Panacek A Kevitek I Prucek R Kolar M VecerovaR Pizorova M Sharma VK

Nevena T Zeboril R Silver colloid nanoparticles synthesischaracterization and their

antibacterial activity

29 Ming-Hua Hoa Pei-Yun Kuoa Hsyue-Jen Hsieha Tzu-Yang Hsienb Lein-Tuan

HoucJuin-Yih Laid Da-Ming Wanga Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129ndash138)

30 LD Burke AM OConnell AP OMullane J Appl Electrochem 33 (2003) 1125

31 B Bozzini G Giovannelli S Natali Scr Mater 43 (2000) 877

32 OM Bockris Z Minevski Int J Hydrogen Energy 25 (2000) 747

33 J Das S Patra H Yang Chem Commun (2008) 4451

34 Hyun Ju Kang Srikanta Patra Jagotamoy Das Abdul Aziz Jinkyung Jo Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles HJ Kang et al

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245ndash1248

35 Lucian Hritcu Marius Stefan Daniela Pricop Anca Neagu Marius Mihasan Liliana

Tartau Viorel Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C

36 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies November 25-27 2010 Sibiu

Romania Conference Proceedings Book Series Knowledge Based Organization

International Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37 Garner JP Mason GJ Behav Brain Res 2002 136(1)83ndash92

38 L Hritcu A Ciobica L Gorgan 2009 Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress Cent Eur J Biol 4(3) 335ndash342

25

7 LTarțău DBicircndar VMelnig Mophologic analysis and in vivo subacute

toxicity evolation of nano-vesicles encapsulating the k-opioid agonist U50488

1-er Colloque Franco-Romain de Chimie Medicinale Iasi 07-08 oct 2010

(poster)

8 M Viorel Ș Marius H Lucian M Mihășan C Irina DPricop Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in

Poly(amide-hydroxyurethane) media Al III-lea Congres Internaţional şi a

XXIX-a sesiune anuală a SRBC 8-12 iunie 2011 Arad

9 D Bicircndar L Tarțău A Gacircrlea L Niță V Melnig Effects of magnesium soft

matter vesicles carrier on the behavioral manifestations in mice National

Conference on Biophysics Cluj-Napoca 1-3 octombrie 2009 (poster)

10 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarţău A Chiriac L Niţă V Melnig Soft vesicle

carrier containing magnesium chloride self-ansamble characterization

Romanian Society of Pure and Applied Biophysics (RSPAB) Xth edition

Cluj Napoca 1-3 october 2009 (poster)

11 A Cazacu L Ursu D Pricop L Hrițcu S Marius V Melnig Silver

nanoparticles plasmon ndash resonant applications in biological microscopy

Conferinţa Naţională de Fizică CNF 2010 - Iaşi 23-25 septembrie 2010

Rezumatele Lucrarilor p174 (poster)

12 D Bicircndar A Gacircrlea L Tarțău A Chiriac V Melnig Efectele

acetaminofenului transportat in vezicule moi in modelul somatizari durerii la

soareci 21-22 octombrie 2009 Bucuresti (prezentare poster)

Contract de cercetare

PN II Idei cod 1996 nr 5092008 Sinteza in conditii blande prin

nanodimensionarea particulelor metalice in matrice de copolimeri bloc amfifilici

de nanoparticule active biologic - platforme in bioinginerie

26

Bibliografie selectivă

1 DD Lasic Elsevier New York 1998

2 El-Sayed I H Huang X EL-Sayed M A Nano letters 5 821 2005

3 Mie G (1908) Ann Phys 25377

4 El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34257

5 Kreibig U Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters Vol 25 Springer

Berlin

6 P Buseck J M Cowley L Eyring eds High resolution transmission electron

microscopy and associated techniques New York London Amsterdam Oxford

University Press 1988)

7 Douglas B Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging a

John Wiley amp Sons Inc Publication

8 D Cullity Elemnts of X-Ray Diffraction Reading Addison-Wesley Publishing Co

Inc 1978

9 J P Glusker M Lewis M Rossi Crystal Structure Analysis for Chemists and

Biologists VCH Publishers New York 1994

10 R Griffiths J A De Haseth Fourier Transform Infrared Spectrometr Wiley N York

1986

11 J R Ferraro K K Krishnan Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Industrial and Laboratory Chemical Analysis Academic Press San Diego 1990

12 R K Poole Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption visible and

ultraviolet spectra icircn Michael G Gore (ed) Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13 Gacircrlea A MI Popa V Pohoaţă V Melnig Ibuprofenketoprofen entrapment in

chitosan based vesicle carrier Rom J Biophys 2007 17 157-168

14 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of magnesium

chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p 185S ISSN 0953-

15 Tarţău L Lupuşoru CE Bicircndar Daniela Melnig V Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles Annals of the

Romanian Society for Cell Biology Volume XVIII Issue 2 December 2010

16 Saacutenchez-Carpena J Domiacutenguez-Hervella F Garciacutea I Gene E Bugariacuten R

Martiacuten A Tomaacutes-Vecina S Garciacutea D Serrano JA Roman A Marineacute M

Mosteiro ML Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic Eur J Clin Pharmacol 63 (8)751-60 2007

17 Zippel H Wagenitz A A multicentre randomised double-blind study comparing the

efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain Clin Drug Investig 27 (8)533-43

2007

18 Jimeacutenez-Martiacutenez E Gasco-Garciacutea C Arrieta-Blanco JJ Gomez del Torno J

Bartolome Villar B Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg vs Ibuprofen 600mg after their administration in patients subjected to oral

surgery Med Oral 9 (2)143-8 138-43 2004

19 LTartau D BindarVMelnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter

vesicles in an experimental pain model in mice European Neuropsychopharmacology

Vol 20 S3- Papers of the 23rd ECNP Congressp S276 ISSN 0924-977X

20 Obreja l Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 31

21 Cismaru l Hamaide T Popa M Materiale Plastice 44(3) 2007 p 243

27

22 Laura Obreja Daniela Pricop Neculai Foca Viorel Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47 (1) pg42-47 2010

23 Obreja L Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 3

Obreja L Dorohoi DH Melnig V Foca N Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis Mater Plast 3 261-2641

24 Melnig V Ciobanu C J Optoelectron Adv Mater 7(6) 2005 p 2809

25 Ana Cazacu Daniela Bicircndar Liliana Tarțău Lucian Hrițcu Marius Ștefan Loredana

Niță Cezar Ionescu Valentin Nica George Rusu Marius Dobromir Viorel Melnig

(2011) Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

26 Bicircndar Daniela Cezar Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J Colloid

Interf Sci (trimisă spre publicare)

27 M Baia F Toderas L Baia J Popp S Astilean Chem Phys Letters 422 127 2006

28 Panacek A Kevitek I Prucek R Kolar M VecerovaR Pizorova M Sharma VK

Nevena T Zeboril R Silver colloid nanoparticles synthesischaracterization and their

antibacterial activity

29 Ming-Hua Hoa Pei-Yun Kuoa Hsyue-Jen Hsieha Tzu-Yang Hsienb Lein-Tuan

HoucJuin-Yih Laid Da-Ming Wanga Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129ndash138)

30 LD Burke AM OConnell AP OMullane J Appl Electrochem 33 (2003) 1125

31 B Bozzini G Giovannelli S Natali Scr Mater 43 (2000) 877

32 OM Bockris Z Minevski Int J Hydrogen Energy 25 (2000) 747

33 J Das S Patra H Yang Chem Commun (2008) 4451

34 Hyun Ju Kang Srikanta Patra Jagotamoy Das Abdul Aziz Jinkyung Jo Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles HJ Kang et al

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245ndash1248

35 Lucian Hritcu Marius Stefan Daniela Pricop Anca Neagu Marius Mihasan Liliana

Tartau Viorel Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C

36 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies November 25-27 2010 Sibiu

Romania Conference Proceedings Book Series Knowledge Based Organization

International Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37 Garner JP Mason GJ Behav Brain Res 2002 136(1)83ndash92

38 L Hritcu A Ciobica L Gorgan 2009 Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress Cent Eur J Biol 4(3) 335ndash342

26

Bibliografie selectivă

1 DD Lasic Elsevier New York 1998

2 El-Sayed I H Huang X EL-Sayed M A Nano letters 5 821 2005

3 Mie G (1908) Ann Phys 25377

4 El-Sayed MA (2001) Acc Chem Res 34257

5 Kreibig U Vollmer M (1995) Optical properties of metal clusters Vol 25 Springer

Berlin

6 P Buseck J M Cowley L Eyring eds High resolution transmission electron

microscopy and associated techniques New York London Amsterdam Oxford

University Press 1988)

7 Douglas B Murphy Fundamentals Of Light Microscopy And Electronic Imaging a

John Wiley amp Sons Inc Publication

8 D Cullity Elemnts of X-Ray Diffraction Reading Addison-Wesley Publishing Co

Inc 1978

9 J P Glusker M Lewis M Rossi Crystal Structure Analysis for Chemists and

Biologists VCH Publishers New York 1994

10 R Griffiths J A De Haseth Fourier Transform Infrared Spectrometr Wiley N York

1986

11 J R Ferraro K K Krishnan Practical Fourier Transform Infrared Spectroscopy

Industrial and Laboratory Chemical Analysis Academic Press San Diego 1990

12 R K Poole Uldis Kalnenieks (2000) Introduction to light absorption visible and

ultraviolet spectra icircn Michael G Gore (ed) Spectrophotometry and

Spectrofluorimetry Oxford University Press

13 Gacircrlea A MI Popa V Pohoaţă V Melnig Ibuprofenketoprofen entrapment in

chitosan based vesicle carrier Rom J Biophys 2007 17 157-168

14 Daniela Bicircndar Ana Garlea Liliana Tartău Viorel Melnig Design of magnesium

chloride soft vehicle carrier Magnesium Research 22(3) 2009 p 185S ISSN 0953-

15 Tarţău L Lupuşoru CE Bicircndar Daniela Melnig V Biocompatibility investigation

and in vivo evaluation of ketoprofen entrapped in lipid vesicles Annals of the

Romanian Society for Cell Biology Volume XVIII Issue 2 December 2010

16 Saacutenchez-Carpena J Domiacutenguez-Hervella F Garciacutea I Gene E Bugariacuten R

Martiacuten A Tomaacutes-Vecina S Garciacutea D Serrano JA Roman A Marineacute M

Mosteiro ML Comparison of intravenous dexketoprofen and dipyrone in acute renal

colic Eur J Clin Pharmacol 63 (8)751-60 2007

17 Zippel H Wagenitz A A multicentre randomised double-blind study comparing the

efficacy and tolerability of intramuscular dexketoprofen versus diclofenac in the

symptomatic treatment of acute low back pain Clin Drug Investig 27 (8)533-43

2007

18 Jimeacutenez-Martiacutenez E Gasco-Garciacutea C Arrieta-Blanco JJ Gomez del Torno J

Bartolome Villar B Study of the analgesic efficacy of Dexketoprofen Trometamol

25mg vs Ibuprofen 600mg after their administration in patients subjected to oral

surgery Med Oral 9 (2)143-8 138-43 2004

19 LTartau D BindarVMelnig The effects of ketoprofen and dexketoprofen soft matter

vesicles in an experimental pain model in mice European Neuropsychopharmacology

Vol 20 S3- Papers of the 23rd ECNP Congressp S276 ISSN 0924-977X

20 Obreja l Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 31

21 Cismaru l Hamaide T Popa M Materiale Plastice 44(3) 2007 p 243

27

22 Laura Obreja Daniela Pricop Neculai Foca Viorel Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47 (1) pg42-47 2010

23 Obreja L Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 3

Obreja L Dorohoi DH Melnig V Foca N Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis Mater Plast 3 261-2641

24 Melnig V Ciobanu C J Optoelectron Adv Mater 7(6) 2005 p 2809

25 Ana Cazacu Daniela Bicircndar Liliana Tarțău Lucian Hrițcu Marius Ștefan Loredana

Niță Cezar Ionescu Valentin Nica George Rusu Marius Dobromir Viorel Melnig

(2011) Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

26 Bicircndar Daniela Cezar Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J Colloid

Interf Sci (trimisă spre publicare)

27 M Baia F Toderas L Baia J Popp S Astilean Chem Phys Letters 422 127 2006

28 Panacek A Kevitek I Prucek R Kolar M VecerovaR Pizorova M Sharma VK

Nevena T Zeboril R Silver colloid nanoparticles synthesischaracterization and their

antibacterial activity

29 Ming-Hua Hoa Pei-Yun Kuoa Hsyue-Jen Hsieha Tzu-Yang Hsienb Lein-Tuan

HoucJuin-Yih Laid Da-Ming Wanga Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129ndash138)

30 LD Burke AM OConnell AP OMullane J Appl Electrochem 33 (2003) 1125

31 B Bozzini G Giovannelli S Natali Scr Mater 43 (2000) 877

32 OM Bockris Z Minevski Int J Hydrogen Energy 25 (2000) 747

33 J Das S Patra H Yang Chem Commun (2008) 4451

34 Hyun Ju Kang Srikanta Patra Jagotamoy Das Abdul Aziz Jinkyung Jo Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles HJ Kang et al

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245ndash1248

35 Lucian Hritcu Marius Stefan Daniela Pricop Anca Neagu Marius Mihasan Liliana

Tartau Viorel Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C

36 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies November 25-27 2010 Sibiu

Romania Conference Proceedings Book Series Knowledge Based Organization

International Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37 Garner JP Mason GJ Behav Brain Res 2002 136(1)83ndash92

38 L Hritcu A Ciobica L Gorgan 2009 Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress Cent Eur J Biol 4(3) 335ndash342

27

22 Laura Obreja Daniela Pricop Neculai Foca Viorel Melnig Platinum nanoparticles

synthesis by sonoelectrochemical methods Materiale Plastice 47 (1) pg42-47 2010

23 Obreja L Foca N Popa M I Melnig V Analele Univ Al I Cuza 7 2008 p 3

Obreja L Dorohoi DH Melnig V Foca N Nastuta A (2008)

Poly(amidehydroxyurethane) templated Fe3O4 and Ag nanoparticles galvanostatic

assay synthesis Mater Plast 3 261-2641

24 Melnig V Ciobanu C J Optoelectron Adv Mater 7(6) 2005 p 2809

25 Ana Cazacu Daniela Bicircndar Liliana Tarțău Lucian Hrițcu Marius Ștefan Loredana

Niță Cezar Ionescu Valentin Nica George Rusu Marius Dobromir Viorel Melnig

(2011) Effect on nerve structures of functionalized gold-chitosan nanoparticles

obtained by one pot synthesis Analele Științifice ale Universității Alexandru Ioan

Cuza Secțiunea Genetică și Biologie Moleculară XII(1) pg45-51

26 Bicircndar Daniela Cezar Ionescu V Melnig Study of Aging and Thermal Stability of

Gold Nanoparticles functionalized with Chitosan in aqueous solutions J Colloid

Interf Sci (trimisă spre publicare)

27 M Baia F Toderas L Baia J Popp S Astilean Chem Phys Letters 422 127 2006

28 Panacek A Kevitek I Prucek R Kolar M VecerovaR Pizorova M Sharma VK

Nevena T Zeboril R Silver colloid nanoparticles synthesischaracterization and their

antibacterial activity

29 Ming-Hua Hoa Pei-Yun Kuoa Hsyue-Jen Hsieha Tzu-Yang Hsienb Lein-Tuan

HoucJuin-Yih Laid Da-Ming Wanga Preparation of porous scaffolds by using freeze-

extraction and freeze-gelation methods Biomaterials 25 (2004) 129ndash138)

30 LD Burke AM OConnell AP OMullane J Appl Electrochem 33 (2003) 1125

31 B Bozzini G Giovannelli S Natali Scr Mater 43 (2000) 877

32 OM Bockris Z Minevski Int J Hydrogen Energy 25 (2000) 747

33 J Das S Patra H Yang Chem Commun (2008) 4451

34 Hyun Ju Kang Srikanta Patra Jagotamoy Das Abdul Aziz Jinkyung Jo Haesik Yang

Effect of aging on the electrocatalytic activity of gold nanoparticles HJ Kang et al

Electrochemistry Communications 12 (2010) 1245ndash1248

35 Lucian Hritcu Marius Stefan Daniela Pricop Anca Neagu Marius Mihasan Liliana

Tartau Viorel Melnig Small size chitosan-capped gold nanoparticles attenuate LPS -

induced toxicity after repeated administration in laboratory rats - trimisa spre publicare

in Materials Science and Engineering C

36 D Pricop M Ștefan M Mihasan L Hriţcu R Olariu V Melnig Antibacterial

activity of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis The 16th

International Conference the Knowledge-Based Organization Applied Technical

Sciences and Advanced Military Technologies November 25-27 2010 Sibiu

Romania Conference Proceedings Book Series Knowledge Based Organization

International Conference Volume 7 ISSN 1843-6722 ISI Thomson Reuters

Conference Proceedings Citation Index

37 Garner JP Mason GJ Behav Brain Res 2002 136(1)83ndash92

38 L Hritcu A Ciobica L Gorgan 2009 Nicotine-induced memory impairment by

increasing brain oxidative stress Cent Eur J Biol 4(3) 335ndash342