Rezumat teza limba romana_Iancu_Cristina_Elena

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Contribuții la evaluarea farmacognostică și biologică a

unor specii din familia Geraniaceae

Conducător doctorat,

Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu

Doctorand,

Drd. Cristina Elena Iancu

2016

Contribuții la evaluarea farmacognostică și biologică a

unor specii din familia Geraniaceae

~Rezumatul tezei~

Conducător doctorat,

Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu

Doctorand,

Drd. Cristina Elena Iancu

2016

Teza de doctorat „Contribuții la evaluarea farmacognostică

și biologică a unor specii din familia Geraniaceae” conține 165 de

pagini, 28 tabele şi 106 figuri și 235 titluri bibliografice.

Numerotarea figurilor, tabelelor și cuprinsul din cadrul

rezumatului păstrează aceeași formă ca și în teza de doctorat.

Cuvinte cheie: Pelargonium, extracte vegetale, UHPLC, GC-MS,

efecte antioxidante, C2C12, A375, MDA-MB-231, HaCaT, test

scratch, MTT, activitate biologică in vitro/ in vivo.

Comisia de referenți a acestei teze este formată din:

Președinte Prof. Univ. Dr. Lenuța Profire

Prof. Univ. Dr. Cristina Dehelean - Universitatea de

Medicină şi Farmacie „Victor Babeș” Timișoara

Prof. Univ. Dr. Cătălin Tănase – Universitatea „Alexandru

Ioan Cuza” Iași

Conf.Univ. Dr. Cornelia Mircea – Universitatea de Medicină

și Farmacie „Grigore T. Popa” Iași

Conducător științific Prof. Univ. Dr. Monica Hăncianu

CUPRINS

MULȚUMIRI .......................................................................................... iii

ABREVIERI............................................................................................. iv

PARTEA GENERALĂ .............................................................................1

CAPITOLUL I. Stadiul actual al cunoașterii cu privire la familia

GERANIACEAE ..................................................................................... 1 I.1. Încadrarea sistematică a geraniaceelor............................................................1

I.2. Genul Geranium…......................................................................................... 3

I.3. Genul Pelargonium....................................................................................... 12

I.4. Profilul chimic al unor specii din familia Geraniaceae ............................... 27

I.5. Geraniaceele de la etnomedicină la fitopreparatele moderne....................... 41

PARTEA PERSONALĂ ........................................................................ 47

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ȘI

OBIECTIVELE URMĂRITE................................................................. 47

CAPITOLUL II. Evaluarea caracterelor macroscopice și histo-anatomice

ale frunzelor speciilor Pelargonium peltatum, pelargonium zonale,

Pelargonium radens, Pelargonium hispidum,Pelargonium grandiflorum,

prin analiză microscopică ....................................................................... 49 II.1. Analiza macroscopică a frunzelor provenite de la cinci specii de

Pelargonium investigate....................................................................................... 49

II.2. Analiza histo-anatomică a speciilor investigate.......................................... 51 CAPITOLUL III. Obținerea și caracterizarea fitochimică a extractelor

etanolice și metanolice din frunzele speciilor de Pelargonium hispidum,

Pelargonium grandiflorum, Pelargonium radens, Pelargonium peltatum,

Pelargonium zonale..................................................................................60 III.1. Obținerea extractelor etanolice 50C/ metanolice ......................................61

III.2. Obţinerea fracţiunilor volatile ...................................................................62

III.3. Analiza fitochimică a extractelor obținute din frunzele de P. hispidum,

P.grandiflorum, P. radens, P. peltatum, P. zonale ............................................64

CAPITOLUL IV. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte

vegetale obținute din specii de Pelargonium............................................89 IV.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi (radical

DPPH)..................................................................................................................91

IV.2. Determinarea capacităţii de scavenger a cationului radical ABTS

............................................................................................................................96

IV.3. Determinarea capacității reducătoare .......................................................101

IV.4. Capacitatea de chelatare a ionul feros ......................................................105

IV.5. Capacitatea de scavanger a radicalului anion superoxid ..........................110

CAPITOLUL V. Acțiunea antibacteriană și antimicotică ....................117

CAPITOLUL VI. Evaluarea acțiunii antiinflamatoare a Pelargonium

hispidum, pelargonium grandiflorum, Pelargonium radens, Pelargonium

peltatum, pelargonium zonale prin teste in vitro și in vivo

...............................................................................................................123 VI.1. Testul de stabilitate a membranei eritrocitare .......................................124

VI.2. Evaluarea in vivo a activității extractelor metanolice în testul edemului

indus chimic (TPA-indus) .......................................................................129

CAPITOLUL VII. Investigarea efectelor biologice dezvoltate de

extractele metanolice ale speciilor de Pelargonium pe linii celulare

...............................................................................................................133 VII.1. Evaluarea viabilității celulelor prin testul MTT ..................................135

VII.2. Evaluarea capacității de diviziune celulară prin tehnica scratch .........141

CAPITOLUL VIII. Concluzii generale. Elemente de originalitate.

Perspective de viitor…………………………………………..........…147

CONCLUZII GENERALE ...................................................................147

ELEMENTE DE ORIGINALITATE ...................................................151

PERSPECTIVE DE CERCETARE ......................................................151

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE ..........................................................152

LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN TEMATICA TEZEI DE

DOCTORAT………………………………………………………….166

Mulțumiri Finalizarea tezei de doctorat reprezintă momentul în care se încheie o

etapă importantă din pregătirea mea profesională. Acesta este rezultatul

efortului meu susţinut pe parcursul celor patru ani de studii şi cercetări. Ea se

datorează totodată şi celor care m-au ajutat, mi-au fost alături şi împreună am

format o echipă pe plan profesional şi nu numai.

Deosebită recunoştinţă datorez doamnei Prof. Univ. dr. Monica

Hăncianu, în calitate de coordonator ştiinţific, pentru efortul depus şi pentru

răbdarea de care a dat dovadă în îndrumarea competentă şi permanentă pe

parcursul elaborării şi realizării acestei teze de doctorat.

Sincere mulţumiri doamnei Conf. Dr. Cornelia Mircea – coordonator

didactic al Disciplinei de Biochimie Farmaceutică și Laborator Clinic, pentru

sprijinul științific și moral de care am beneficiat continuu și necondiționat.

Mulţumesc distinselor cadre didactice referenţi oficiali: doamna Prof.

Univ. Dr. Cristina Dehelean – Universitatea de Medicină şi Farmacie „Victor

Babeș” Timișoara, domnului Prof. Uni. Dr. Cătălin Tănase – Universitatea

„Alexandru Ioan Cuza” Iași, doamnei Conf. Dr. Cornelia Mircea –

Universitatea de Medicină și Farmacie „Grigore T. Popa” Iași.

Doresc să aduc mulţumiri deosebite doamnei Conf. Dr. Ana Clara

Aprotosoaie și doamnei Șef lucrări Dr. Oana Cioancă, de la disciplina de

Farmacognozie, de asemeneai domnului Conf. dr. Mihai Apostu, de la disciplina

de Chimie Analitică, ca membri în comisia de îndrumare, pentru sugestiile şi

suportul moral oferit, care au contribuit la finalizarea acestui demers ştiinţific.

Mulțumesc cu multă recunoștință doamnei Șef lucrări Dr. Oana Cioancă

pentru răbdare și susținere necontenită, împreună cu suportul științific care au

contribuit la finalizarea acestei teze de doctorat.

Mulțumiri respectuase domnului Academician Prof. Univ. Dr. Constantin

Toma pentru amabilitatea și expertiza oferită în domeniul histoanatomiei

vegetale.

Sincere mulţumiri Prof. Dr. Habil. Lucian Hrițcu, Laboratorul de

Fiziologie animală, Facultatea de Biologie, Universitatea „Alexandru Ioan

Cuza” Iași, pentru ideile inovative care au susținut această cercetare.

Mulţumesc, în mod special, echipei de management a proiectului

„Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice din

universitățile medicale prin acordarea de burse doctorale și postdoctorale –

DocMed.Net_2.0” POSDRU/159/1.5/S/136893, pentru suportul ştiinţific şi

material acordat.

Cele mai calde mulţumiri se îndreaptă către colectivele: disciplinei de

Farmacognozie, Microbiologie și Industria Medicamentului pentru ajutorul şi

înţelegerea de care au dat dovadă pe parcursul acestor patru ani. Disciplinei de

Biochimie Farmaceutică și Laborator Clinic pentru ajutorul necondiționat şi

sfaturile oferite pe parcursul cercetărilor din cadrul tezei de doctorat.

Îmi manifest cu drag recunoştinţa faţă de familia mea pentru

înţelegerea şi suportul moral acordat în toţi aceşti ani, când am fost nevoită să

acord exclusivitate muncii mele profesionale.

Abrevieri A375 Celule ale melanomului uman

AAPH Dihidrocloridul de potasiu

ABTS Acidul 2,2´-azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic)

ADN Acidul dezoxiribonucleic

ALT Alanin aminotransferaza ANOVA Analiza statistică a variantelor

AST Aspartat aminotransferaza

ATP Acidul adenozin trifosforic BAX Proteină membră a familiei Bcl-2

BHT Hidroxi toluen butilat

C2C12 Mioblaste CE50 Concentrația eficace 50

DAD Detector cu diodă

DER Raport drog extract DMEM Mediul de cultură Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimetil sulfoxid

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil et. al. și alții

FCS Ser fetal bovin

FID Detector cu ionizare în flacără G(+) Bacterii gram pozitive

G(-) Bacterii gram negative

GC Gaz-cromatografie GSH Glutation

H2O2 Peroxid de hidrogen HaCaT Keratinocite

HIV Human Immunodeficiency Virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography HRBC Human red blood cell

ICRS Infecțiile căilor respiratorii superioare

LLC-PK1 Celule epiteliale renale MDA-MB-231 Celule ale cancerului de sân

MS Spectrometrie de masă

MTT Bromura de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazol NADH Nicotinamid adenin dinucleoid

NADHNa2 Nicotinamid dinucleotid disodic

NO Monoxid de azot ORL Otorinolaringologia

p21 Proteină

PGG Pentagaloil glucopiranoza PMS Fenazinmetosulfat

SKH-1 Șoareci fără păr

SOD Superoxid dismutaza SRO Speciilor reactive de oxigen

TBC Tuberculoza

TNFα Factorul de necroză tumorală alfa TPA 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetat

TRIS 2-amino-2-hidroximetil-propan-1,3-diol

UHPLC Ultra high performance liquid chromatography UV Ultraviolet

VEGF Factorului de creștere a edoteliului vascular

VIS Vizibil

1

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ȘI

OBIECTIVELE URMĂRITE

De-a lungul timpului, oamenii au recurs la resursele naturale, atât

ca sursă de hrană, dar în egală măsură pentru a se trata și a se proteja.

Istoria ne arată că plantele medicinale sunt preferate ca remedii

indiferent de nivelul de dezvoltare socială și industrială. Este bine

cunoscută rezistența bacteriană la diferite clase de chimioterapice ceea ce

pune problema imposibilității unor rezultate favorabile ale tratamentelor

abordate în cadrul bolilor infecțioase (1). Deși au existat perioade în care

diferite medicamente de sinteză au fost considerate de neînlocuit, sursele

vegetale intrând într-o zonă de umbră, odată cu supradezvoltarea și

apariția a numeroase boli așa numite „ale civilizației moderne”, lumea

științifică și-a îndreptat atenția din nou spre acestea, în speranța găsirii

unor soluții valoroase pentru terapia modernă (2). Sunt vizate patologii

numeroase cu componentă inflamatorie precum reumatismul, artrita

reumatoidă, dar și multe altele pentru care soluția alopată propune clase

de antiinflamatoare steroidine și/ sau nesteroidiene, neselective și/ sau

selective, dar care sunt grevate de numeroase efecte adverse care duc la

abandonul schemei de tratament. Există, deci, o serie de premise care

impun cercetări în sensul valorificării resurselor naturale cu potențial

teraputic clar. De aceea atenția noastră s-a îndreptat către specii ușor

accesibile dar puțin studiate din punct de vedere chimic și biologic,

pornind de la datele în medicina tradițională.

Speciile de Pelargonium se regăsesc în istoria medicinei

moderne de pe vremea Maiorului britanic Stevens care a lansat în 1897

un medicament Steves` Consumption Cure pentru tratamentul

tuberculozei (3). Experiența sa dobândită în Africa de Sud a reprezentat

baza introducerii unor preparate din umckaloabo (decoct de rădăcini de

Pelargonium sidoides ) deși primul studiu clinic a fost realizat abia în

1920 pe 800 de pacienți. Rezultatele promițătoare obținute de către

medicul Adrien Sechehaye au fost publicate în 1930, stabilind astfel un

prim tratament antituberculostatic până la apariția citostaticelor de

sinteză. Astăzi sub forma preparatului modern Kaloba® se

comercializează un extract fluid din rădăcini pe P. sidoides ce are ca

domeniu de indicație infecții acute și cronice din sfera ORL și căilor

respiratorii superioare și inferioare (4).

În acest sens, scopul lucrării de față este acela de a evidenția noi

surse înrudite cu această specie de Pelargonium, puțin accesibilă în

zonele noastre care să constituie resurse importante cu valoare

terapeutică. Conform cu datele cuprinse în capitolele anterioare din

2

partea generală a acestei teze, reprezentanții genului Geranium au fost

frecvent confundați cu cei ai genului Pelargonium, ambele categorii

aparținân aceleiași mari familii Geraniaceae. Pornind de la aceste

aspecte, cercetările din această lucrare s-au axat predominant pe mușcate

acoperite cu peri glandulari, inițial încadrate în genul Geranium, dar care

conform cu datele recente din literatura de specialitate sunt denumite

Pelargonium. Astfel, cercetările de față încearcă să evidențieze o serie de

date biologice și chimice cu privire la speciile aclimatizate în România,

din perspectiva corelațiilor cu datele din literatura de specialitate.

Obiectivele concrete ale prezentei teze de doctorat, cuprind

realizarea unor tipuri de extracte de origine vegetală cu potențial

farmacoterapeutic, pe care le vom analiza din punct de vedere al

randamentului de obținere, compoziției chimice și activității lor

biologice. În acest scop, în cercetarea noastră ne-am orientat către o

specie indigenă (Pelargonium zonale) şi patru specii aclimatizate la noi

(Pelargonium hispidum, Pelargonium grandiflorum, Pelargonium

peltatum şi Pelargonium radens) din genul Pelargonium, familia

Geraniaceae, produse vegetale bogate în principii active. Trebuie

menționat, de la bun început, că cercetările propuse au loc în premieră,

speciile selecționate nefiind studiate anterior din punct de vedere al

posibilelor utilizări terapeutice. În plus, testele care vizează evidențierea

potențialului biologic sunt teste standard care pot susține rezultatele

obținute pentru extracte standardizate care să poată fi incluse în forme

farmaceutice de uz terapeutic. Totodată, datele științifice în domeniu la

nivel internațional numără puține publicații și acestea pe alte specii

înrudite. Deci, avem avantajul unui domeniu puțin studiat și publicabil.

Obiectivele specifice au constat în:

Identificarea unor elemente mofologice și histo-anatomic specifice

fiecărei specii incluse în studiu, care să poată permite diferențierea

acestora;

Caracterizarea fitochimică a claselor de principii bioactive prin metode

de analiză moderne urmărind prezența unor compuși importanți, din

punct de vedere calitativ și cantitativ;

Obținerea unor extracte selective în funcție de clasele predominante de

compuși care ar putea induce efecte biologice specifice;

Evaluarea potențialului biologic in vitro și in vivo al extractelor din

punct de vedere al activității antioxidante, antimicrobiene,

antiinflamatoare și citoprotectoare.

3

Capitolul II. Evaluarea caracterelor macroscopice și histo-

anatomice ale frunzelor speciilor Pelargonium peltatum,

Pelargonium zonale, Pelargonium radens, Pelargonium

hispidum, Pelargonium grandiflorum, prin analiză

microscopică

Speciile incluse în studiu sunt Pelargonium peltatum (L.)

L'Heretier, Pelargonium radens H.E. Moore, Pelargonium grandiflorum

(Andrz.) Willd., Pelargonium hispidum (L.) Wild. și Pelargonium zonale

(L.) L'Heretier cultivate în serele Grădinii Botanice din Iaşi „Anastasie

Fătu”.

Fiecare specimen a fost menținut în condițiile de creștere similare

și propice acestor plante. Materialul vegetal a fost prelevat înainte de

analiza propriu-zisă și prelucrat corespunzător, contraprobele fiind

depuse în colecția Laboratorului de Farmacognozie UMF „Grigore T.

Popa”, Iași. Evaluarea detaliilor structurale macro- și microscopice ale

peţiolului şi limbului foliar de la cele 5 specii de Pelargonium a subliniat

îndeosebi caracterele histo-anatomice cu valoare taxonomică.

II.1. Analiza macroscopică a frunzelor provenite de la cinci specii de

Pelargonium investigate

Materialul vegetal a fost reprezentat de frunzele mature prelevate

de la P. hispidum, P. grandiflorum, P. radens, P. peltatum, P. zonale.

După detașarea de pe tulpină probele au fost evaluate cu lupa și cu ochiul

liber la lumina zilei pe un un fond de culoare deschisă. Aspectele fiecărei

frunze au fost observate atât pe suprafața superioară, pe cea inferioară,

cât și la nivelul pețiolului.

Rezultate și discuții

Caracteristicele macroscopice ale probelor investigate în prezenta

teza de doctorat sunt surprinse în fotografiile cuprinse în figura II.1.

Astfel, se poate observa că P. hispidum prezintă frunze simple,

mari cu aspect palmat-lobate, cu lobi ascuțiți, margine dințată, ambele

suprafețe acoperite de peri (vizibili și cu ochiul liber) și un pețiol foarte

lung, umflat la bază, lățimea frunzei fiind de 4-6 cm. Culoarea este

verde-deschis.

P. grandiflorum este o plantă cu frunze mici, diametrul lor fiind de

3-4 cm, simple, palmat-lobate, cu margini arcuite, ușor crenate. Prezintă

peri pe ambele suprafețe ce îi conferă un aspect catifelat, dar totodată

ușor aspru. Pețiolul este scurt (aproape de dimensiunea limbului foliar) și

4

îngust la bază. Frunza este de culoare verde-crud și prezintă miros plăcut

asemănător cu cel de trandafir.

P. radens reprezintă o altă specie caracterizată în cadrul acestui

studiu ce prezintă frunze cu o lungime a limbului foliar de 5-7 cm,

palmat-sectate. Marginile frunzelor sunt răsfrânte spre suprafața

inferioară, conferind acestora aspect arcuit și foarte segmentat. Pețiolul

depășește lungimea limbului foliar și prezintă tija rotunjită. În comparație

cu celelalte specii, perii sunt mai denși pe partea inferioară, greu vizibili

cu ochiul liber, dar la atingere conferă frunzelor o oarecare asprime.

Culoarea este verde-intens, iar mirosul ușor citrat este profund și

pregnant.

P. peltatum prezintă frunze palmat-lobate, cu marginile crenate, de

dimensiuni între 3-5 cm. Pe suprafața frunzelor perii sunt rari, partea

superioară fiind aproape glabră și coriace. Pețiolul este foarte lung și

rotunjit. Aspectul general al frunzei este lucios, iar culoarea este verde

intens către centrul limbului foliar, marginile fiind deschise la culoare.

Mirosul este neplăcut, intens și ușor citrat.

P. zonale este o specie de mușcată aromată, cu frunze cărnoase,

palmat-lobate, cu marginile crenate, cu diametrul de 4-6 cm. Prezintă

până la 7 lobi, acoperiți de peri scurți, foarte fini, pe ambele suprafețe.

Un element distinctiv este prezența unei zone întunecate în nuanțe

maronii sub forma unui inel la mijlocul limbului foliar. Această zonă

concentrează compuși din clasa taninurilor și antocianilor având rol

atractant. Pețiolul este cărnos și relativ scurt. Mirosul este caracteristic,

ușor neplăcut, repelent.

Fig. II.1: Aspectul macroscopic diferențiat al frunzei speciilor de Pelargonium

investigate: a). P. zonale, b). P. hispidum, c). P. radens, d). P. grandiflorum, e).

P. peltatum

a b c

d e

5

II.2. Analiza histo-anatomică a speciilor investigate

Materialul de studiu a fost reprezintat de frunzele aflate în stare de

anteză, ale celor 5 specii de Pelargonium incluse în studiu. Pentru fiecare

dintre probe au fost efectuate secţiuni superficiale și transversale prin

limbul foliar şi peţiol. Fiecare secțiune a fost colorată cu verde iod şi roşu

rutheniu și apoi analizate la microscopul fotonic NOVEX (Holland).

Fotografiile au fost realizate cu microscopul cu cameră foto Olympus

încorporată (5).

Rezultate și discuţii

Cercetarea de față prezintă o importanță taxonomică deosebită ce

vine în completarea datelor din literatură referitor la analiza histo-

anatomică a frunzei speciilor de Pelargonium.

P. peltatum: peri tectori relativ frecvenţi, uni- sau bicelulari, lungi;

peri secretori rari şi scurţi, având o celulă bazală (inserată între celulele

epidermice), un pedicel (2-3 celule scurte, suprapuse) şi o glandă

unicelulară. (Figura II.2)

Fig. II.2: Secțiune transversală prin pețiolul frunzei de P. peltatum

P. zonale: peri tectori rari, lungi, subţiri şi groşi, pluricelulari (3-

4 celule), cu vârful obtuz; peri secretori frecvenţi, scurţi (pedicel cu 2-4

celule) şi foarte lungi (pedicel cu 3-4 celule, din ce în ce mai lungi spre

vârf), cu glanda piriformă ori sferică, mai rar lung-triunghiulară, cu

unghiurile rotunjite. (Figura II.3)

Fig. II.3: Secțiune transversală prin pețiolul frunzei de P. zonale

6

P. radens: peri tectori foarte mulţi (unii mai scurţi, unicelulari,

alţii foarte lungi, bicelulari, de grosime diferită); peri secretori mulţi, doar

scurţ) şi cu glanda sferică. (Figura II.4)

Fig. II.4 Secțiune transversală prin pețiolul frunzei de P. radens

a. Aspect general; b. Detaliu peri tectori; c. Detaliu peri glandulari

P. hispidum: peri tectori extrem de mulţi, peri secretori scurţi şi

de lungime mijlocie, cu glanda foarte mare, sferică. (Figura II.5)

Fig. II.5: Secțiune transversală prin pețiolul frunzei de P. hispidum

a. Aspect general; b. Detaliu peri tectori; c. Detaliu peri glandulari

P. grandiflorum: peri tectori foarte mulţi (cei mai mulţi

unicelulari, ceilalţi cu 2-3 celule, de lungime şi grosime diferită şi cu

vârful ascuţit); peri secretori foarte mulţi, relativ scurţi (pedicel cu 3-4

celule), cu glandă piriformă. (Figura II.6)

c

7

Fig. II.6: Secțiune transversală prin pețiolul frunzei de P. hispidum a.Aspect

general; b. Detaliu peri glandulari cu glandă piriformă

Sistematizat, observațiile microscopice cu privire la pețiol și la

țesuturile conducătoare corespunzătoare sunt cuprinse în tabelul II.1.

Tabel II.1: Structura diferenţiată a ţesuturilor conducătoare pentru cele 5 specii

incluse în studiu

CARACTERISTICI

SPECIA

P.

peltatum

P.

zonale

P.

radens

P.

hispidum

P.

grandiflorum

Număr fascicule -10 fascicule -11

fascicule

-10

fascicule -8 fascicule -19-21 fascicule

Tip fascicule

-4 groase

-6 subţiri

-1-2 vase de

lemn

-5 mari

-6 mici

-14 la baza

peţiolului

-4 groase

-6 subţiri

-4 mari

(numeroase

vase

lemnoase)

-4 mici

-4 mai

-4 mici

-11-13 foarte

mici (doar

elemente

liberiene)

Fascicul central foarte

mare/gros

-1 mare

-1 mic -1 mare -1 mare

-1mare marginit

de 2-3mici

Elemente

sclerenchimatice absente absente absente

prezente şi la

periferia

liberului

prezente la faţa

externă a

liberului

Perii secretori variază foarte mult ca lungime şi număr pe

unitatea de suprafaţă, având o celulă bazală (între celulelele epidermice),

un pedicel pluricelular şi o glandă unicelulară (sferică sau circulară).

Diferențele și asemănările dintre specii pot fi sistematizate succint după

cum se poate observa în tabelul II.2 și figurile de la II.7 la II.11

prezentate în cadrul tezei de doctorat.

Mezofilul este diferenţiat în cele două ţesuturi asimilatoare:

palisadic (totdeauna unistratificat) la faţa superioară a limbului şi lacunos

(pluristratificat) la cea inferioară, deci limbul are o structură bifacială

heterofacială (dorsiventrală).

8

Capitolul III. Obținerea și caracterizarea fitochimică a extractelor

etanolice și metanolice din frunzele speciilor de Pelargonium

hispidum, Pelargonium grandiflorum, Pelargonium radens,

Pelargonium peltatum, Pelargonium zonale

Pentru a evalua proprietățile benefice ale celor mai importante

grupe de compuși prezenți în frunze, s-a urmărit obținerea unor extracte

care să asigure izolarea atât a compușilor hidrofili cât și a celor lipofili. În

acest sens s-au obținut două tipuri de extracte cu solvenți diferiți (etanol

50c și metanol absolut) care au fost analizate concomitent cu ajutorul

metodelor și tehnicilor de analiză (6).

III.1. Obținerea extractelor etanolice 50c/ metanolice

Toate probele au fost prelucrate urmărind același procedeu de

lucru: 2 g produs vegetal au fost extrase cu 2 x 40 mL etanol 50°respectiv

metanol absolut într-un balon cu șlif de 100 mL, pe baia de apă, la reflux,

timp de 45 minute. Extractele reunite au fost filtrate printr-un filtru de

vată și filtrul a fost spălat pentru completarea volumului obținut la 100

mL utilizând același solvent, într-un balon cotat. După răcire, extractele

au fost aduse în capsule de dimensiuni corespunzătoare pentru

concentrare în etuva termostatată de 40C obținându-se extractele uscate

corespunzătoare (98). Probele au fost codificate astfel: P1 (P. hispidum),

P2 (P. grandiflorum), P3 (P. radens), P4 (P. peltatum) și P5 (P. zonale).

În funcție de tipul de extract la numele de cod s-a adăugat indicele

corespunzător E (hidroalcoolic) sau M (metanolic) conform cu solventul

de extracție folosit.

Rezultate și discuții Extractibilitate

Valorile DER înregistrate pentru extractele hidro-alcoolice și

pentru extractele metanolice sunt prezentate în tabelul III.1.

Tabelul III.1: Cantitatea de extract obținută din probele de Pelargonium

Codificare Sursa Extractibil DER* m/m

E** M*** E** M***

P1 P. hispidum 0,58837g 0,3155 g 3,3992 6,3391

P2 P. grandiflorum 0,59366g 0,2745 g 3,3689 7,2859

P3 P. radens 0,48753g 0,2546 g 4,1023 7,8554

P4 P. peltatum 0,58920g 0,3042 g 3,4362 6,5746

P5 P.zonale 0,69577g 0,4149 g 2,8745 4,8204

*DER= masă produs vegetal: masă extract obținut;

**E-extract hidro-acoolic, ***M-extract metanolic

9

Rezultatele obținute prin calcularea DER au indicat că cel mai bun

solvent de extracție a fost etanolul 50c. Din punct de vedere al

extractibilității, cu ambele tipuri de solvenți, cel mai avantajos produs

vegetal s-a dovedit cel furnizat de specia Pelargonium zonale obținându-

se cantitățile cele mai mari de extracte.

La polul opus s-a situat produsul vegetal (frunzele) de la

Pelargonium radens care la extracție a generat cele mai mici cantități de

extracte.

III.2. Obţinerea fracţiunilor volatile

Fracţiunile volatile din probele de Pelargonium supuse analizei au

fost separate folosind metoda de separare prin distilare cu vapori de apă.

Tabelul III.2: Randamentul de extracție a uleiurilor volatile din frunzele speciilor

de Pelargonium

Specie mL ulei volatil/100 g produs

vegetal (%, v/m)

Pelargonium hispidum 1,167%

Pelargonium grandiflorum 0,667%

Pelargonium radens 0,834%

Condițiile de cultură biologică, temperatura, umiditatea cât și

lumina naturală, influențează producția plantei în ce privește

componentele volatile. În cazul probelor investigate, ce s-au dezvoltat în

aceleași condiții, specia cea mai bogată în ulei volatil a fost P. hispidum.

III.3. Analiza fitochimică a extractelor obținute din frunzele de P.

hispidum, P. grandiflorum, P. radens, P. peltatum,

P. zonale

Evaluarea conținutului de acizi polifenolcarboxilici, flavonoide,

antociani și taninuri în extractele vegetale, s-a realizat conform

umătorului plan:

Identificarea și analiza semicantitativă a unor compuși

polifenolici: acizi polifenolcarboxilici, flavonoide,

antociani/taninuri, prin metodă UHPLC.

Determinarea cantitativă a flavonoidelor prin spectrofotometrie

UV-VIS.

Determinarea cantitativă a conținutului în polifenoli totali din

probele analizate prin spetrofotometrie UV-VIS

10

III.3.1. Identificarea și analiza semicantitativă a unor compuși

polifenolici: acizi polifenolcarboxilici, flavonoide, antociani/taninuri,

prin metodă UHPLC

Metoda utilizată în acestă teză de doctorat a fost adaptată

cromatografiei de lichide ultra rapide ceea ce înseamnă creșterea

eficienței odată cu scăderea consumului de reactivi și solvenți.

Cromatogramele înregistrate pentru fiecare probă în parte au fost

efectuate într-un timp relativ redus, de maxim 25 minute, folosind soluții

diluate de probe, metoda fiind totodată caracterizată prin linearitate,

sensibilitate și selectivitate ridicată (7-9).

În scopul verificării și validării metodei folosite, dar și pentru

calculul concentrațiilor compușilor ce au putut fi identificați, s-au realizat

o serie de scări etalon pentru fiecare standard utilizat. Acestea au fost

alcătuite pe baza datelor obținute după cinci injectări pentru fiecare

concentrație utilizată (0,17-20µg/mL).


Pentru fiecare probă este prezentată cromatograma UHPLC

obținută în condițiile de lucru descrise mai sus. Identificarea celor mai

importante componente a fost realizată prin compararea spectrelor UV și

a timpilor de retenție cu etaloanele utilizate.

Fig. III.4. Cromatograma HPLC pentru extractul etanolic din Pelargonium

hispidum (P1E) Catehină (1); Rutozidă.(2); Acid cafeic(3); Cvercetol-3-

arabinozidă(4); Epicatehină(5); Luteolină(6); Cvercetol(7);Kaempferol(8).

catehină cvercetol-3-

arabinozidă

luteolină

cvercetol

epicatehină

11


grandiflorum (P2E) Catehină (1); Derivați de acid cinamic.(2); Rutozidă(3);

Epicatehină(4); Derivați de acid galic(5); Luteolină(6); Apigenol(7).


radens (P3E), Catehină (1); Rutozidă (2); Cvercetol-3-arabinozidă(4);

Epicatehină(5); Kaempferol (6).

epicatehină catehină

luteolină

apigenol

derivat de

acid galic

epicatehină

kaempferol

rutozidă catehină cvercetol-3-arabinozidă

12


peltatum (P4E) Catehină (1); Cianidol-3-O-glucozidă (3); Epicatehină (5);

Derivați ai acidului galic (5a); Cvercetol (8); Apigenol (9).


zonale (P5E), Catehină (1); Cianidol-3-O-glucozidă (3); Delfinidol-3-O-

rutinozida (4); Epicatehină(5); Apigenol (7).

catehină epicatehină cianidol-3-O-glucozidă derivați ai acidului

galic

cvercetol

apigenol

catehină cianidol-3-O-glucozidă cianidol-3-O-rutinozil

epicatehină

apigenol

13

Fig. III.9. Cromatograma HPLC pentru extractul metanolic din Pelargonium

hispidum (P1M) Catehină (1); Derivați de acid cinamic.(2); Epicatehină(5);

Luteolină(6); Cvercetol(7);Kaempferol(8).


grandiflorum (P2M), Catehină (1); Rutozidă(2); Epicatehină (4); Luteolină(6);

Apigenol (7); Kaempferol(8).

cvercetol

kaempferol

catehină epicatehină luteolină derivat cinamic

kaempferol

catehin

ă

rutozidă epicatehină luteolină

apigenol

14


radens (P3M), Catehină (1); Rutozidă (2); cvercetol-3-arabinozidă(4); Derivați

ai acidului galic (5);Apigenol (6); Kaempferol (7).


zonale (P5M), Catehină (1); Cianidol-3-O-glucozidă (4); Epicatehină(5);

Cvercetol(7); Derivați acid galic (8; )Kaempferol(9).

Privind în ansamblu spectrul componentelor identificate în cele

două tipuri de extracte se poate concluziona că numărul compușilor

chimici prezenți este mai mare în extractele etanolice. Analizând

comparativ cele cinci extracte hidroetanolice se remarcă probele

catehină rutozidă cvercetol-3-

arabinozidă derivați ai acidului galic

kaempferol

apigenol

catehină cianidol-3-O-glucozidă epicatehină

kaempferol

cvercetol

derivați ai

acidului galic

15

corespunzătoare obținute din frunzele de P. zonale (P5E) și P. peltatum

(P4E) care, pe baza etaloanelor utilizate, s-au dovedit a avea compoziția

cea mai complexă, cu cel mai mare număr de componente identificate. În

proba P4E se remarcă de asemenea, prezența derivaților de cianidol și

delfinidol, în cantități importante, derivați care nu au fost regăsiți în

celelalte extracte analizate.

În ce privește prezența rutozidei, proba P2E este de departe cea

mai bogată probă cu 31,198 µg/ mg extract uscat. Între extractele

metanolice tot proba de P. grandiflorum se remarcă pentru prezența

rutozidei în cantitate ridicată.

Catehina se găsește în cantități mai mari în extractele hidro-

alcoolice, cea mai bogată probă fiind P2E (13,898 µg/ mg extract uscat)

urmată de P4E (10,910 µg/ mg extract uscat).

În probele metanolice aceeași substanță, catehina, se găsește în

cantități mari în P5M (10,930 µg/ mg extract uscat) urmată de P1M

(8,717 µg/ mg extract uscat).

III.3.2. Determinarea cantitativă a flavonoidelor prin

spectrofotometrie UV-VIS

Studiul chimic cantitativ a urmărit cuatificarea complecșilor de

culoare roz formați în urma reacției dintre flavonoide și clorura de

aluminiu în prezența nitritului de sodiu, cu absorbanță λ=510 nm (10,11).

III.3.3. Determinarea cantitativă a polifenolilor totali

Conținutul fenolic total al probelor de analizat a fost cuatificat cu

reactiv Folin-Ciocâlteu utilizând acidul galic ca și standard. Polifenolii în

prezența reactivului formează complecși de culoare albastră

colorimetrabili la λ=765 nm (12-14).


Particular, pentru extractele noastre s-a dovedit că solvenții polari

au favorizat o extractibilitate mai bună; de aceea în practica farmaceutică

trebuie ținut cont de solubilitatea compușilor care se regăsesc în materialul

vegetal.

Comparând cu extractele metanolice, se observă că Pelargonium

grandiflorum (P2M) prezintă concentrația cea mai mică, însă și în cazul

acestui tip de extract, Pelargonium zonale (P5M) rămâne specia cu

conținutul cel mai ridicat în polifenoli totali.

16

Fig. III.15. Analiza comparativă a conținutului în polifenoli totali și flavonoide

în extractele etanolice și metanolice studiate

Determinarea cantitativă a flavonoidelor în cazul extractelor

etanolice așează crescător speciile, astfel: P4˂ P5˂ P3˂ P1˂ P2,

comparativ cu extractele metanolice a căror evoluție cantitativă este: P2˂

P5˂ P3˂ P1.

III.3.4. Analiza profilului chimic al fracțiunilor volatile de

Pelargonium hispidum, Pelargonium grandiflorum, Pelargonium

radens prin metoda GC-MS-FID

Uleiurile volatile pentru speciile investigate Pelargonium:

hispidum, grandiflorum, radens au fost separate conform metodei

indicate în FRX capitolul IX.


Analiza prin metoda graz-cromatografică a uleiurilor volatile ale

Pelargonium: hispidum, grandiflorum și radens au revelat diferența

importante între numărul și tipul componentelor volatile.

Totodată era de așteptat să existe aceste variații dat fiind caracterele

macro- și microscopice diferite, însă randamentul de extracție mic nu a

permis studiul biologic amănunțit al acestor compuși volatili.

Profilul GC-MS al cromatogramelor înregistrate pentru uleiurile

volatile este prezentat în figura III.16, iar imaginea gromatogamelor GC-

FID în figura III.17.

17

Fig.III.16. Profilul GC-MS al uleiurilor extrase din speciile inestigate P.

hispidum, P. grandiflorum, P. radens

18

Fig.III.17. Cromatograme GC-FID ale uleiurilor extrase din specii de

Pelargonium: P. hispidum, P. grandiflorum, P. radens

19

Capitolul IV. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte

vegetale obținute din specii de Pelargonium

Întrucât speciile studiate de noi prezintă un conținut ridicat în

polifenoli, ne-am propus ca evaluarea in vitro a potențialului antioxidant

al acestor extracte să se realizeze prin următoarele teste:

determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul

difenilpicrilhidrazil (DPPH),

investigarea capacităţii de chelatare a ionului feros,

determinarea capacității de chelatare a radicalului 2,2′-

azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic acid) ABTS•+,

determinarea capacității reducătoare,

investigarea capacității de scavanger a anionului radical

superoxid.

IV.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi

(radical DPPH)

Radicalul 2,2-difenil-1-picrilhidrazil prezintă o pereche de

electroni neparticipanți ai celor doi atomi de azot, soluția sa prezentând

culoare violet închis. La tratarea soluției cu un scavenger de radicali

liberi rezultă difenilpicrilhidrazina (DPPH-H) cu viraj de la violet la

galben pal, cu scăderea absorbanței maxime la 517 nm.


Radicalul DPPH este un compus sintetic ce nu se regăsește la acest

nivel, însă este frecvent folosit pentru screening-ul potențialului

antioxidant datorită reactivității crescute față de compușii naturali (15).

Încercând să poziționăm pe o axă descrescătoare a potențialelor

antioxidante cele nouă extracte investigate, vom obține următoarea scară:

P5M ˃P4E ˃P5E ˃P1M ˃P2E ˃P3M ˃P1E ˃P2M ˃P3E.

Fig. IV.3. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (μg/mL) obţinute la evaluarea

extractelor etanolice prin testul DPPH

20

Fig. IV.4. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (μg/mL) obţinute la evaluarea

extractelor metanolice prin testul DPPH

IV.2. Determinarea capacităţii de scavenger a cationului radical

ABTS

Metoda se bazează pe generarea radicalui cationic ABTS prin

oxidarea acidului 2,2´-azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) în prezența

persulfatului de potasiu și reducerea acestuia de către antioxidantul

generator de atomi de hidrogen cu măsurarea spectrofotometrică a

absorbanţei la 734 nm.


Radicalul ABTS este frecvent utilizat pentru evaluarea in vitro a

capacității de scavenger de radicali.

Fig. IV.7. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (µg/mL) obţinute la evaluarea

extractelor etanolice prin testul ABTS

0 20 40 60

P1

P2

P3

P5

Acid galic

21

Fig. IV.8. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (µg/mL) obţinute la evaluarea

extractelor metanolice prin testul ABTS

Luând în calcul valorile CE50 pentru testul ABTS in vitro,

ordinea descrecătoare de aranjare a probelor este: P4E ˃ P5E ˃ P5M ˃

P2E ˃ P1M ˃ P1E ˃ P3E ˃ P2M ˃ P3M.

IV.3. Determinarea capacității reducătoare

Metoda se bazează pe capacitatea substanţelor reducătoare de a

reduce fericianura de potasiu la ferocianură de potasiu care reacţionează

cu ionul feric şi formează un complex de culoare albastră cu absorbanţă

maximă la 700 nm.


Rezultatele obținute confirmă datele din literatură în sensul unei

linearități între concentrația compușilor antioxidanți prezenți în mediul de

reacție și activitatea imprimată (16).

Fig. IV.11. Reprezentarea grafică a valorii CE50 (µg/mL) a extractelor etanolice

în cadrul testului de determinare a capacității reducătoare

22

Fig IV.12. Reprezentarea grafică a valorii CE50 (µg/mL) a extractelor

metanolice în cadrul testului de determinare a capacității reducătoare

Corelând rezultatele determinărilor cantitative ale claselor de

compuși prezenți în extractele hidro-alcoolice și metanolice ale speciilor

de Pelargonium cercetate, cu datele obţinute în urma efectuării acestui

test, în funcție de tipul de extract și capacitatea reducătoare a acestora,

cele nouă extracte investigate pot fi ierarhizate descrescător, astfel: P5M

˃ P5E ˃ P4E ˃ P2E ˃ P3M ˃ P1E ˃ P1M ˃ P3E ˃ P2M.

IV.4. Capacitatea de chelatare a ionul feros

Fe2+ în prezența ferozinei formează un complex de culoare roz cu

absorbanță la 562 nm. Prezența în mediul de reacție a unui agent de

chelatare determină reducerea absorbanței complexului format.


Chelatarea ionului feros conferă protecție față de stresul oxidativ

prin diminuarea concentrației acestuia în mediul de reacție ceea ce duce

la scăderea radicalilor hidroxil generați în mod normal în urma reacțiilor

tip Fenton.

Fig IV.15. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (µg/mL) în cadrul testului de

chelatare a fierului pentru extractele etanolice

23

Fig IV.16. Reprezentarea grafică a valorilor CE50 (µg/mL) în cadrul testului de

chelatare a fierului pentru extractele metanolice

Ierarhizarea probelor în ceea ce privește capacitatea de chelatare a

ionului feros poate fi următoarea: P4E ˃ P5E ˃ P3E ˃ P2E ˃ P3M ˃ P1E

˃ P1M ˃ P2M ˃ P5M.

IV.5. Capacitatea de scavanger a radicalului anion superoxid

Radicalul anion superoxid, generat de sistemul nicotinamid –

adenindinucleotid redus – ferozinmetosulfat, reduce nitratul de tetrazol

(NBT) la un formazan de culoare albastră cu absorbanță la 560 nm.


Este unanim acceptat faptul că stresul oxidativ induce distrugeri la

nivel celular, prin accelerarea mecanismelor de îmbătrânire celulară

extrapolate la nivelul întregului organism. De aceea, principiile active

care prezintă efecte antioxidante au atras atenția cercetătorilor tot mai

mult în ultimii ani (17).

Fig. IV.19. Reprezentarea grafică a CE50 (µg/mL) a extractelor etanolice din

cadrul testului de scavanger de anion superoxid

24

Fig. IV.20. Reprezentarea grafică a CE50 (µg/mL) a extractelor etanolice din

cadrul testului de scavanger de anion superoxid

Conform valorilor înregistrate pentru concentrația eficientă 50

ordinea descrescătoare a potențialului de scavanger de anion radical

superoxid a fost următoarea: P5M ˃ P5E ˃ P4E ˃ P2M ˃ P1M ˃ P2E ˃

P3M ˃ P1E ˃ P3E.

Compușii responsabili de activitatea antioxidantă a extractelor

vegetale, în general, sunt reprezentați de polifenolii totali.

Capitolul V. Acțiunea antibacteriană și antimicotică

Activitatea antimicrobiană a extractelor din frunzele de

Pelargonium a fost măsurată prin metoda disc-difuzimetrică în agar

Mueller-Hinton, conform standardelor internaționale, când s-a măsurat

diametrul zonei de inhibiție a probelor comparativ cu cele ale

standardelor.


Chiar de la început se impune precizarea că nici una dintre probe,

indiferent de tipul de extract, nu a fost activă față de tulpina de E.coli

ATCC 25922, ceea ce limitează utilizarea extractelor de Pelargonium în

infecțiile microbiene induse de aceasta. Activitatea antibacteriană și

antimicotică a fitocomplexelor izolate din cele cinci probe de

Pelargonium investigate poate fi sistematizată în funcție de tipul de

extract și tulpina bacteriană testată în modul următor:

După tipul de extract:

extractele metanolice au avut o activitate mai intensă decât acel

al extractelor etanolice față de germenii G(-).

extractele etanolice mai active decât cele metanolice pe tulpinile

G(+).

25

După tipul de tulpină bacteriană/ fungică ordinea descrescătoare a

intensității de acțiune în funcție de diametrul zonei de inhibiție măsurat,

este:

S. aureus: P3M ˃ P5E ≥ P1E ˃ P5M ˃ P2E ˃ P2M ˃ P3E ˃ P4E.

S. lutea: P5E ˃ P4E ˃ P2E ≥ P1E ˃ P3E, valorile obținute au fost

comparabile cu cele ale ampicilinei.

Pseudomonas aeruginosa: P5E ˃ P5M ≥ P3M ˃P4E ˃ P2M

≥P1M; P1E, P2E, P3E au fost inactive.

C. albicans: P5M ˃ P3M ≥ P1M ˃ P2M, diferențele de valoare

obținute se încadrează în limita a ± 0,5 (diferențe nesemnificativ

statistic) (extractele etanolice au fost inactive).

C. glabrata: P5M ˃ P1M ˃ P2M ˃ P3M. (extractele etanolice au

fost inactive).

C. parapsilopsis: P5M ˃ P3M ˃ P1M ˃ P2M. (extractele

etanolice au fost inactive).

Ca aspect general se poate corela concentrația în polifenoli totali a

probelor cu activitatea antimicrobiană și antimicotică, în sensul că

probele mai bogate în compuși fenolici sunt mai active (P4, P5). De

asemenea prezența fenolilor liberi în extractul metanolic influențează

direct proporțional proprietățile antimicotice ale probelor. Nu s-a putut

evidenția o corelație de acest gen și în cazul flavonoidelor, concentrația

acestora în probe nu a avut o relevanță semnificativă.

Capitolul VI. Evaluarea acțiunii antiinflamatoare a Pelargonium

hispidum, Pelargonium grandiflorum, Pelargonium radens,

Pelargonium peltatum, Pelargonium zonale prin teste in vitro și in vivo

Inflamaţia este un proces patologic a cărui dezvoltare implică

participarea de enzime, mediatori chimici proinflamatori, extravazarea de

fluide, migrare celulară, lezare tisulară, dar şi procese de refacere tisulară

(18).

VI.1. Testul de stabilitate a membranei eritrocitare

Metoda spectrofotometrică se bazează pe evaluarea in vitro, în

mediul hipoton, a stabilității membranei eritrocitelor în prezența

substanțelor cu efect protector. Agresiunea mediului hipoton induce liza

eritrocitelor cu eliberarea hemoglobinei care determină colorarea soluției

în roșu și creșterea absorbanței maxime a acesteia la 560 nm.

26


Rezultatele obținute la evaluarea capacității extractelor vegetale de

a crește stabilitatea membrane eritrocitare și în mod indirect de a

previziona efectul antiinflamator, sunt reprezentate grafic în figurile VI.1

și VI.2.

Analizând comparativ efectul protector indus de cele două tipuri de

extracte, se observă că în general extractele metanolice au efect protector

mai intens comparativ cu cele hidro-etanolice.

Fig. VI.1. Reprezentarea grafică a capacității de stabilizarea a membrane

eritrocitare a extractelor etanolice din Pelargonium sp.

Fig. VI.2. Reprezentarea grafică a capacității de stabilizarea a membrane

eritrocitare a extractelor etanolice din Pelargonium sp

Se observă însă că proba P5E prezintă efect mai intens pentru

extractul etanolic, deși extractul metanolic conţine cea mai mare cantitate

de polifenoli.

27

VI.2. Evaluarea in vivo a activității extractelor metanolice în testul

edemului indus chimic (TPA-indus)

Efectul antiedematos/ antiinflamator al probelor investigate s-a

evidențiat pe model animal TPA-indus, când în urma tratamentului se

observă o reducere a parametrilor inflamatori caracteristici (dimensiunea

bazei urechii, lungimea și masa acesteia).


În general, valorile obținute au reprezentat determinările după o

singură aplicație topică a TPA ceea ce concordă cu datele din literatura

de (19). Exprimarea maximă a edemelor s-a observat la 24h de la

administrarea TPA, cu diferențe importante în cazul loturilor tratate cu

extractele de Pelargonium investigate conform figurii VI.3.

Fig. VI.3. Efectul antiedematos al extractelor de Pelargonium în

edemul urechii de șoarece TPA-indus (24h)

La aceeași doză (5mg/ mL) aplicată topic efectul cel mai intens

de reducere al edemului se observă la lotul tratat cu extract metanolic de

P. zonale, la care inflamația față de martorul negativ scade cu

aproximativ 70%, iar față de martorul pozitiv (tratat cu Indometacin) cu

aproximativ 30%. Pentru celelalte loturi tratate cu extract de P. radens și

cu extract de P. grandiflorum se observă o ameliorare a procesului

edematos, cu aproximativ 50% față de martorul negativ. Extractul

metanolic de P. hispidum prezintă un efect antiedematos de 45% față de

martorul negativ. Diferențe semnificativ statistic au fost notate și pentru

celelalte loturi tratate cu extracte de Pelargonium, pentru care însă

potențialul înregistrat a reprezentat o reducere a edemului între 5 și 15%

față de martorul pozitiv.

28

Capitolul VII. Investigarea efectelor biologice dezvoltate de

extractele metanolice ale speciilor de Pelargonium pe linii celulare

În urma rezultatelor obținute anterior la testele in vitro și corelând

cu datele din literatură, am apelat la o serie de teste pe linii celulare

pentru a completa tabloul acțiunilor biologice. Totodată analizând cele

două tipuri de extracte, hidroalcoolice și metanolice, din punct de vedere

al acțiunii antioxidante, antiinflamatoare și antimicrobiene, am ales

extractele metanolice pentru testele pe liniile celulare. Acestea au fost

izolate de la nivelul musculaturii șoarecilor – C2C12, keratinocite de la

nivelul pielii umane – HaCaT, celule ale cancerului de sân – MDA-MB-

231 și celule ale melanomului uman – A375.

VII.1. Evaluarea viabilității celulelor prin testul MTT

Soluția galbenă de MTT (bromura de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-

difeniltetrazol) este redusă la formazan violet (Fig. VII.1), în prezența

celulelor vii. Absorbanţa soluţiei după solubilizarea în DMSO se

determină spectrofotometric la 550 nm.


Rezultatele obținute în urma testului MTT sunt prezentate în

figurile VII.2 – VII.5.

Fig. VII.2. Reprezentarea grafică a procentului de viabilitate celulară a C2C12 în

funcție de concentrația extractelor metanolice utilizate

29

Fig. VII.3. Reprezentarea grafică a viabilității celulelor HaCaT la tratarea cu

extractele metanolice a speciilor de Pelargonium în funcție de concentrație

Fig. VII.4. Reprezentarea grafică a viabilității celulelor MDA-MB-231 la

tratarea cu extractele metanolice a speciilor de Pelargonium în funcție de

concentrație

Efectul protector al extractelor cercetate în cadrul acestei teze de

doctorat este strâns legat de compoziția chimică. Compușii direct

responsabili de această activitate biologică sunt de tipul polifenolilor și în

general sunt cei care prezintă potențial antioxidant prin prisma

caracterului lor reducător.

30

Fig. VII.5. Reprezentarea grafică a viabilității celulelor A375 la tratarea cu

extractele metanolice a speciilor de Pelargonium în funcție de concentrație

VII.2. Evaluarea capacității de diviziune celulară prin tehnica

Scratch

Metoda se bazează pe evaluarea in vitro a capacităţii extractelor

vegetale de a stimula procesul de refacere a legăturilor intercelulare care

au fost distruse pe cale mecanică (20).


Luând în considerare rezultatele obținute în cadrul testelor

anterioare, atât teste antioxidante cât și testele de viabilitate celulară, am

realizat acest test pe extractele metanolice utilizând două concentrații

0,0195 mg/mL și 1,25 mg/mL și s-au fotografiat plăcile cu camera foto

integrată în microscop.

Efectul extractelor asupra viabilităţii celulare diferă de la un tip de

celulă la alta datorită metabolismului particular al acestora, dar şi datorită

compoziţiei calitative şi cantitative variabile de la un extract la altul.

Rezultatele obţinute în urma efectuării acestor teste au demonstrat

că gradul de citotoxicitate al extractelor este strâns legat de compoziția

chimică a acestora. De asemenea sunt importante şi liniile celulare pe

care s-au realizat testările, acestea fiind linii celulare sănătoase (HaCaT,

C2C12) asupra cărora efectul citotoxic al extractelor trebuie să fie minim,

dar și linii canceroase (A375, MDA-MB-231) pentru care procentul de

viabilitate ar trebui să fie cât mai scăzut, iar efectul antimigrator cât mai

pronunţat.

31

0h 3h 24h Soluţia

Control

DMSO

P1M

(0,0195 mg/mL)

P1M

(1,25 mg/mL)

P2M

(0,0195

mg/mL)

P2M

(1,25

mg/mL)

P3M

(0,0195

mg/mL)

P3M

(1,25

mg/mL)

P5M (0,0195

mg/mL)

P5M (1,25

mg/mL)

Fig.VII.6. Efectul antimigrator al extractelor metanolice asupra celulelor A375

32

0h 3h 24h Soluţia

Control

DMSO

P1M

(0,0195

mg/mL)

P1M

(1,25

mg/mL)

P2M

(0,0195

mg/mL)

P2M

(1,25

mg/mL)

P3M

(0,0195

mg/mL)

P3M

(1,25

mg/mL)

P5M

(0,0195

mg/mL)

P5M

(1,25

mg/mL)

Fig.VII.7. Efectul antimigrator al extractelor metanolice asupra celulelor MDA-

MB-231

33

0h 3h 24h Soluția

Control

DMSO

P1M

(0,0195 mg/mL)

P1M

(1,25 mg/mL)

P2M

(0,0195

mg/mL)

P2M

(1,25

mg/mL)

P3M

(0,0195

mg/mL)

P3M

(1,25

mg/mL)

P5M (0,0195

mg/mL)

P5M (1,25

mg/mL)

Fig.VII.8. Efectul antimigrator al extractelor metanolice asupra celulelor HaCaT

34

Capitolul VIII. Concluzii generale. Elemente de originalitate.

Perspective de viitor.

CONCLUZII GENERALE

Teza de doctorat Contribuții la evaluarea farmacognostică și

biologică a unor specii din familia Geraniaceae are ca obiectiv

principal evidențierea acțiunilor biologice ale unor extracte

(hidroalcoolice și metanolice) din specii de Pelargonium: P. hispidum, P.

grandiflorum, P. radens, P. peltatum și P. zonale. Aceste specii sunt

aclimatizate la noi, ele provenind din Africa de Sud, cu excepția P.

zonale care este indigenă.

Trebuie menționat că cercetarea propusă are loc în premieră,

speciile selecționate nefiind studiate anterior din punct de vedere al

posibilelor utilizări terapeutice.

Prin cele menționate, susținem faptul că datele care s-au obținut au

un impact major în domeniul cercetării plantelor medicinale și al obținerii

de extracte standardizate cu potențial terapeutic.

În plus, testele care vizează evidențierea potențialului biologic sunt

teste standard care pot confirma obținerea unor extracte standardizate

care să poată fi incluse în forme farmaceutice de uz terapeutic, fapt care a

permis evidențierea următoarelor concluzii:

Evidențierea caracterelor macroscopice și histo-anatomice ale

frunzelor de Pelargonium a permis, așa cum era de așteptat, diferențierea

speciilor.

Diferențele macroscopice majore au fost observate în ceea ce

privește morfologia și caracterele organoleptice ale frunzelor.

Cele mai multe diferenţe de structură la nivelul frunzei la cele 5

specii sunt de ordin cantitativ, cu valoare taxonomică, ce se referă la

pețiol, limb foliar și peri secretori/ tectori. Pețiolul și limbul foliar diferă

între specii din punct de vedere structural, al dimensiunilor, localizării

acestora, frecvența și densitatea lor, precum și prezența și frecvența

celulelor oxalifere.

Perii secretori sunt elemente de individualizare între specii,

importanţi pentru calitatea şi cantitatea uleiului volatil cu proprietăţi

biologice. Aceștia se află la nivelul pețiolului, mai puţini la P. peltatum,

iar cei mai numeroși, foarte lungi, se regăsesc la P. radens, P. hispidum,

P. grandiflorum. Pe de altă parte, perii situați pe limbul foliar sunt mai

35

numeroşi şi, adesea, lungi, la P. hispidum şi P. zonale, iar perii scurți și

numeroși sunt caracteristici celorlalte specii.

După obținerea extractelor etanolice și metanolie s-a calculat

raportul drog-extract (DER) care a indicat că cel mai bun solvent de

extracție a fost etanolul 50c. Din punct de vedere al extractibilității cel

mai avantajos produs vegetal s-a dovedit cel furnizat de specia

Pelargonium zonale pentru care s-au obținut cantitățile cele mai mari de

extracte, cu ambele tipuri de solvenți.

Analiza UHPLC a celor două tipuri de extracte ale speciilor de

Pelargonium studiate a pus în evidență prezența următorilor compuși:

catehină, epicatehină, cianidol și derivați ai cianidolului, rutozidă,

cinarozidă, cvercetol, luteolină, kaempferol, derivați de acid galic.

Dintre acizii polifenolici, în cantitatea cea mai mare, s-au regăsit

acidul rozmarinic (3,473 µg/mg extract uscat) în extractul etanolic de

Pelargonium grandiflorum, acidul clorogenic (4,862 µg/mg extract uscat)

și acidul cinamic (3,005 µg/mg extract uscat) în extractul etanolic de

Pelargonium zonale.

Acidul clorogenic se găsește în cantitate de 4,451 µg/mg în

extractul metanolic al Pelargonium radens. Din acest punct de vedere

extractul metanolic este superior extractului etanolic corespunzător

aceleiași specii.

În urma determinării cantitative a principiilor active s-a

constatat pentru extractele etanolice că cea mai mare cantitate de

polifenoli totali se regăsește în extractul de P. zonale, iar extractul de P.

grandiflorum este cel mai bogat în fracțiunea flavonoidică.

În cazul extractelor metanolice conținutul cel mai ridicat în

polifenoli se regăsește în extractul de P. zonale, iar extractul din P.

hispidum este cel mai bogat în flavone.

Randamentul de obținere al fracțiunilor volatile s-a plasat în

jurul valorii de 1%, cel mai ridicat randament fiind în cazul P. hispidum

(1,167%). În urma analizei organoleptice s-a observat că uleiurile volatile

au avut culori de la galben-verde (P. radens), verde deschis (P.

grandiflorum) la verde intens (P. hispidum). De asemenea, au prezentat

mirosuri relativ asemănătoare, de lămâie, mirosul cel mai pregnant

constatându-se la uleiul speciei Pelargonium hispidum.

Analiza prin metoda graz-cromatografică (GC-MS și GC-FID)

a uleiurilor volatile de Pelargonium hispidum, P. grandiflorum și P.

radens a revelat diferențe importante între numărul și tipul componentelor

volatile. În cazul uleiului de Pelargonium grandiflorum s-au detectat

compuși precum linalolul, derivați de geraniol, cis-rose-oxid, comparativ

cu P. hispidum pentru care majoritari au fost mentona (15,70%), timolul,

36

pinenul și eucaliptolul. Componenta volatilă majoră a frunzelor de P.

radens a fost izomentona (85%) însoțită de cantități foarte mici de pinen,

terpinen, limonen, mircen, cimen și piperitonă.

Evaluarea activității biologice a extractelor a debutat cu

evidențierea acținii antioxidante. Acest efect se bazează pe prezența în

extractele hidroalcoolice și metanolice a polifenolilor, care prezintă

capacitate antioxidantă în forma lor redusă, sau prooxidantă în forma lor

oxidată (sistemul redox fenol - semichinone – chinone).

Se poate concluziona că cea mai bună capacitate de scavenger de

radical DPPH o are extractul metanolic obținut din Pelargonium zonale.

Pe baza acestui test a fost evaluat potențialul antioxidant pentru cele nouă

extracte investigate, rezultatele conducând la următoarea ierarhizare:

P5M ˃P4E ˃P5E ˃P1M ˃P2E ˃P3M ˃P1E ˃P2M ˃P3E.

Rezultatele pentru testul ABTS, exprimate prin valorile CE50,

ierarhizează extractele astfel: P4E ˃ P5E ˃ P5M ˃ P2E ˃ P1M ˃ P1E ˃

P3E ˃ P2M ˃ P3M.

După investigarea capacitatății reducătoare a extractelor

speciilor de Pelargonium ordinea celor mai active este următoarea: P5M

˃ P5E ˃ P4E ˃ P2E ˃ P3M ˃ P1E ˃ P1M ˃ P3E ˃ P2M.

Evaluarea probelor în ceea ce privește capacitatea de chelatare a

ionului feros poate furniza următoarea succesiune: P4E ˃ P5E ˃ P3E ˃

P2E ˃ P3M ˃ P1E ˃ P1M ˃ P2M ˃ P5M.

Conform valorilor înregistrate pentru concentrația eficientă 50,

ordinea descrescătoare a potențialului de scavanger de anion radical

superoxid a fost următoarea: P5M ˃ P5E ˃ P4E ˃ P2M ˃ P1M ˃ P2E ˃

P3M ˃ P1E ˃ P3E.

Compușii responsabili de activitatea antioxidantă a extractelor

vegetale, în general, sunt reprezentați de polifenolii totali. Corelând

capacitatea antioxidantă exprimată de extractele hidroalcoolice dar și de

cele metanolice ale speciilor de Pelargonium (P. hispidum, P.

grandiflorum, P. radens, P. peltatum, P. zonale) cu concentrațiile în

polifenoli totali se poate afirma că rezultatele testelor (DPPH, ABTS,

determinarea capacității reducătoare și capacitatea de scavanger al

anionului superoxid) sunt direct proporționale cu prezența fracțiunii

polifenolice.

Rezultatele obținute sunt în strânsă legătură nu doar cu intensitatea

de acțiune, ci și cu tipul de compuși și extractele în care aceștia

predomină, precum și cu mecanismele prin care activitatea antioxidantă a

polifenolilor poate fi evidențiată.

37

Testele realizate au evidențiat corelații între sensibilitatea anumitor

clase de compuși și tehnicile și metodele utilizate pentru stabilirea

potențialului antioxidant în mod specific.

Activitatea antibacteriană și antimicotică a fitocomplexelor

izolate din cele cinci probe de Pelargonium investigate poate fi

sistematizată în funcție de tipul de extract și tulpina bacteriană testată în

modul următor:

În funcție de tipul de extract:

extractele metanolice au avut o activitate mai intensă decât acel

al extractelor etanolice față de germenii G(-).

extractele etanolice mai active decât cele metanolice pe tulpinile

G(+).

În funcție de tipul de tulpină bacteriană/ fungică ordinea

descrescătoare a intensității de acțiune în funcție de diametrul zonei de

inhibiție măsurat, este:

S. aureus: P3M ˃ P5E ≥ P1E ˃ P5M ˃ P2E ˃ P2M ˃ P3E ˃ P4E.

S. lutea: P5E ˃ P4E ˃ P2E ≥ P1E ˃ P3E, valorile obținute au fost

comparabile cu cele ale Ampicilinei.

Pseudomonas aeruginosa: P5E ˃ P5M ≥ P3M ˃P4E ˃ P2M

≥P1M; P1E, P2E, P3E au fost inactive.

C. albicans: P5M ˃ P3M ≥ P1M ˃ P2M, diferențele de valoare

obținute se încadrează în limita a ± 0,5 (diferențe nesemnificativ

statistic) (extractele etanolice au fost inactive).

C. glabrata: P5M ˃ P1M ˃ P2M ˃ P3M. (extractele etanolice au

fost inactive).

C. parapsilopsis: P5M ˃ P3M ˃ P1M ˃ P2M. (extractele

etanolice au fost inactive).

Evaluarea acțiunii antiinflamatoare pentru cele nouă extracte

diferite s-a realizat atât in vitro cât și in vivo.

Analiza rezultatelor corespunzătoare celor două categorii de

extracte indică o foarte bună capacitate de stabilizare a membranei

eritrocitare exprimată de extractele investigate, capacitate care este

apropiată de a diclofenacului sau chiar mai puternică.

Referitor la efectul protector asupra membranei eritrocitare, toate

probele analizate (cu excepţia P4E), la concentraţia de 5 mg/mL prezintă

un efect scăzut comparativ cu al diclofenacului. Această observaţie

sugerează faptul că la concentraţii mari extractele de Pelargonium pot

influența negativ permeabilitatea membranei eritrocitare prin

fitocomplexul pe care îl conţin.

38

În general, extractele metanolice au efect protector mai intens

comparativ cu cele hidro-etanolice.

Evaluarea in vivo a activității extractelor metanolice în testul

edemului indus chimic (TPA-indus) a demonstrat că la aceeași doză

(5mg/ mL) aplicată topic, efectul cel mai intens de reducere al edemului

se observă la lotul tratat cu extract metanolic de P. zonale. În acest caz,

inflamația față de lotul control scade cu aproximativ 70%, iar față de

martorul pozitiv (tratat cu Indometacin) cu aproximativ 30%. Pentru

celelalte loturi, lotul tratat cu P. radens și lotul tratat cu P. grandiflorum

se poate observa o ameliorare a procesului edematos, astfel acesta se

reduce cu aproximativ 50% față de martorul negativ.

Extractul metanolic de P. hispidum prezintă un efect

antiedematos, comparativ cu celelalte extracte metanolice, de 45% față

de lotul control. Rezultate avantajoase au fost notate și pentru celelalte

extracte de Pelargonium, pentru care însă potențialul înregistrat a

reprezentat o reducere a edemului între 5 și 15% față de martorul pozitiv.

Investigarea pe linii celulare a efectelor biologice dezvoltate de

extractele metanolice ale speciilor de Pelargonium s-a realizat prin

efectuarea testelor de viabilitate celulară și testul scratch. Acestea au

demonstrat că gradul de citotoxicitate al extractelor este strâns legat de

compoziția chimică a probelor.

Testele realizate pe linii celulare sănătoase (HaCaT, C2C12) au

demonstrat că viabilitatea acestor celule este dependentă de concentrația

aplicată și de tipul de extract. Astfel se constată că fracțiunea extractivă

în care predomină flavonoidele dezvoltă un efect citoprotector mai

important.

Pe liniile canceroase (A375, MDA-MB-231) procentul de

viabilitate și efectul antimigrator este inhibat la creșterea concentrației de

extract aplicate. S-a constatat că extractele mai bogate în fracțiunea

polifenolică prezintă un efect citotoxic mai intens.

39

ELEMENTE DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de față constă în investigarea pentru prima

dată a frunzelor de Pelargonium hispidum, Pelargonium radens,

Pelargonium grandiflorum, Pelargonium peltatum și Pelargonium zonale

din punct de vedere farmacognostic și biochimic.

Astfel, am realizat caracterizarea histo-anatomică a frunzelor celor

cinci specii, precum și evaluarea profilului chimic din punct de vedere

calitativ și cantitativ a celor două tipuri de extracte (hidroalcoolic și

metanolic).

Pentru cele cinci extracte hidroalcoolice și pentru cele patru

extracte metanolice am analizat:

capacitatea antioxidantă in vitro a extractelor,

efectul antibacterian și antifungic,

efectul antiinflamator pe model indus chimic, precum și

capacitatea protectoare pe membrana eritrocitară,

potențialul citoprotector/ citotoxic pe linii celulare normale și

canceroase.

PERSPECTIVE DE CERCETARE

În urma corelării rezultatelor obținute în cadrul acestei teze de

doctorat se poate susține desfășurarea unor studii în următoarele direcții:

fracționarea extractelor în scopul identificării compușilor

responsabili pentru acțiunile biologice pe care aceștia le

prezintă,

caracterizarea efectelor biologice a fracțiunilor volatile,

extinderea studiilor asupra speciei Pelargonium peltatum, cu

precădere asupra extractelor metanolice,

stabilirea mecanismelor apoptotice/ necrotice care stau la

baza efectelor citoprotectoare/ citotoxice evidențiate pentru

extractele analizate,

realizarea unei culturi experimentale în câmp pentru speciile

Pelargonium zonale, Pelargonium peltatum și Pelargonium

grandiflorum care au furnizat extracte valoroase din punct

de vedere chimic și biologic.

40

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Kolodziej H, Kayser O. Pelargonium sidoides DC. – Neueste

Erkenntnisse zum Verständnis des Phytotherapeutikums Umckaloabo.

Z.Phytother1998; 19: 141–151.

2. Bladt S. Zur Chemie der Inhaltsstoffe der Pelargonium reniforme

CURT. – Wurzel (Umckaloabo). München: Dissertation, Ludwig-

Maximilians-Universität, 1974.

3. Helmstädter A. Umckaloabo – Late vindication of a secret remedy.

Pharm. Historian 1996; 26: 2–4.

4. Watt C, Breyer-Brandwyk MG. Medicinal and Poisonous Plants of

Southern and Eastern Africa. Edinburgh: Livingstone, 1962.

5. Gostin I, Toma C, Damian M. Histo-anatomical data regarding the

aerial vegetative organs in some species and varieties of Pelargonium

L. An.şt.Univ. „Al.I. Cuza” s. II a Biol veget 2000; 46: 23-32.

6. Trifan A. Contribuții la studiul farmacognostic și biologic al unor

specii de plante medicinale cultivate în zona subcarpatică a

Moldovei: stabilirea variabilității chimice. UMF „Gr.T.Popa” Iași,

2012.

7. Gacea O. Cercetări privind calitatea farmaceutică a produsului

Chamomillae flos. UMF „Gr.T.Popa” Iași, 2010.

8. *** Farmacopeea Română, ediţia a X-a. Bucureşti: Editura Medicală,

1993.

9. ***Farmacopeea Europeană, ediţia a 6-a, Strasbourg, EDQM, 2008.

10. Ismail M. Central properties and chemical composition of Ocimum

basilicum essential oil. Pharm Biol 2006; 44: 619-626.

11. Wangensteen H., Samuelsen A.B., Malterud KE. Antioxidant activity

in extracts from coriander. Food Chem 2004; 88: 293-297.

12. Malterud KE, Farbrot TL, Huse A., Sund RB. Antioxidant and

radical-scavenging effects of anthraquinones and anthrones.

Pharmacol 1993; 47: 77-85

13. Prior RL, Wu XL, Schaich K. Standardized methods for the

determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and

dietary supplements. J Agric Food Chem 2005; 53: 4290-4302.

41

14. Csepregi K, Kocsis M, Hideg É. On the spectrophotometric

determination of total phenolic and flavonoid contents. Acta Biol

Hung 2013; 64: 509–518.

15. Piao X, Piao X-L, Kim HY, Cho EJ. Antioxidative activity of

geranium (Pelargonium inquinans Ait) and its active component,

1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose. Phytotherapy Research 2008;

22(5): 534-538.

16. Lopez-Alarcon C, Denicola A. Evaluating the antioxidant capacity of

natural products: A review on chemical and cellular-based assays.

Analytica Chimica Acta 2013; 763: 1-10.

17. Harman D. origin and evaluation of the free radical theory of aging: a

brief personal history. Biogerontology 2009; 10: 773-781.

18. Vane JR, Bolting RM. New insights into the mode of action of anti-

inflammatory drugs. Inflammation Res 1995; 44:1-10.

19. Passos GF, Medeiros R, Marcon R, Nascimento AFZ, Calixto JB,

Pianowski LF. The role of PKC/ERK1/2 signaling in the anti-

inflammatory effect of tetracyclic triterpene euphol on TPA-induced

skin inflammation in mice. Euro J of Pharmacol 2013; 698: 413-420.

20. Dehelean CA, Șoica C, Ledeți I, Aluaș M, Zupko I, Gălușcan A,

Cinta-Pinzaru S, Munteanu M. Study of the betulin enriched birch

bark extracts effects on human carcinoma cells and ear inflammation.

Chem Central J 2012; 6: 137-145.

42

LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN TEMATICA

TEZEI DE DOCTORAT

Articole publicate în reviste ISI

Iancu C, Cioancă O, Mircea C, Mocanu M, Hăncianu M. Pelargonium

SP: characterization of the polyphenols and their biological potential.

Farmacia (FI=1,162), 2016; 64(3): 333-338.

Articole publicate în reviste BDI

Iancu C, Cioancă O, Mircea C, Hăncianu M. Contributions regarding the

leaf histo-anatomy of some Pelargonium species. Rev Med Chir Soc Med

Nat 2013; 117(3): 812-818.

Lucrări prezentate la conferințe de specialitate naționale și

internaționale

Iancu C, Mircea C, Cioancă O, Ifrim C, Cojocaru A, Hăncianu M.

Evaluarea interrelației compoziție chimică-acțiune antioxidantă la

Pelargonium sp. Congresul Național de Farmacie din România, Ediția a

XV-a, 24-27 septembrie 2014, Iași, Volum de rezumate, p. 132. ISBN

978-606-544-252-8.

Iancu C, Cioancă O, Mircea C, Hăncianu M. Polyphenols and the in

vitro activity of five pelargonium species. 9th CAMPSEC Conference on

Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries, 26-29

mai 2016, Plovdiv, Bulgaria, Poster.

Iancu C, Ciancă O, Tuchiluș C, Hăncianu M, Mircea C. Antimicrobial

and antioxidant properties of Pelargonium SP. Leaf extracts. 2nd

International Young Scientists Symposium, 15-17 septembrie 2016,

Wroclaw, Polonia. Volum de rezumate, p. 34.ISBN 978-83-7055-591-7.

Iancu C, Cioanca O, Mircea C, Spac A, Robu S, Hancianu M. Rose-

scented Geraniums cultivated in Romania – essential oil profile. The 12th

National Symposium with International Participation, 6-9 septembrie

2016, Piatra Neamț, Poster.

Date post:	02-Feb-2017
Category:	Documents
Upload:	vanquynh
View:	291 times
Download:	2 times

Rezumat teza limba romana_Iancu_Cristina_Elena

Documents