Home >Documents >Reg 152_09 Furaje

Reg 152_09 Furaje

Date post:17-Jul-2015
Category:
View:72 times
Download:0 times
Share this document with a friend
Transcript:

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/1

I(Acte adoptate n temeiul Tratatelor CE/Euratom a cror publicare este obligatorie)

REGULAMENTE

REGULAMENTUL (CE) NR. 152/2009 AL COMISIEI din 27 ianuarie 2009 de stabilire a metodelor de eantionare i analiz pentru controlul oficial al furajelor(Text cu relevan pentru SEE)

COMISIA COMUNITILOR EUROPENE,

A patra Directiv 73/46/CEE a Comisiei din 5 decembrie 1972 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (5);

avnd n vedere Tratatul de instituire a Comunitii Europene, Prima Directiv 76/371/CEE a Comisiei din 1 martie 1976 de stabilire a modalitilor comunitare de prelevare de probe pentru controlul oficial al furajelor (6);

avnd n vedere Regulamentul (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European i al Consiliului din 29 aprilie 2004 privind controalele oficiale efectuate pentru a asigura verificarea conformitii cu legislaia privind hrana pentru animale i produsele alimentare i cu normele de sntate animal i de bunstare a animalelor (1), n special articolul 11 alineatul (4) literele (a), (b) i (c),

A aptea Directiv 76/372/CEE a Comisiei din 1 martie 1976 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (7);

ntruct: (1)

Urmtoarele acte au fost adoptate n vederea punerii n aplicare a Directivei 70/373/CEE i rmn n vigoare n conformitate cu articolul 61 alineatul (2) din Regulamentul (CE) nr. 882/2004:

A opta Directiv 78/633/CEE a Comisiei din 15 iunie 1978 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (8);

Prima Directiv 71/250/CEE a Comisiei din 15 iunie 1971 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (2);

A noua Directiv 81/715/CEE a Comisiei din 31 iulie 1981 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (9);

A doua Directiv 71/393/CEE a Comisiei din 18 noiembrie 1971 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (3);

A zecea Directiv 84/425/CEE a Comisiei din 25 iulie 1984 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (10);

Directiva 86/174/CEE a Comisiei din 9 aprilie 1986 de stabilire a metodei de calculare a valorii energetice a furajelor combinate pentru psrile de curte (11);83, 30.3.1973, p. 21. 102, 15.4.1976, p. 1. 102, 15.4.1976, p. 8. 206, 29.7.1978, p. 43. 257, 10.9.1981, p. 38. 238, 6.9.1984, p. 34. 130, 16.5.1986, p. 53.

A treia Directiv 72/199/CEE a Comisiei din 27 aprilie 1972 de stabilire a unor metode comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (4);165, 155, 279, 123, 30.4.2004, p. 1. 12.7.1971, p. 13. 20.12.1971, p. 7. 29.5.1972, p. 6.

(1) (2) (3) (4)

JO JO JO JO

L L L L

(5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)

JO JO JO JO JO JO JO

L L L L L L L

L 54/2

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

A unsprezecea Directiv 93/70/CEE a Comisiei din 28 iulie 1993 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (1); A dousprezecea Directiv 93/117/CE a Comisiei din 17 decembrie 1993 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru controlul oficial al furajelor (2); Directiva 98/64/CE a Comisiei din 3 septembrie 1998 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru determinarea aminoacizilor, uleiurilor i grsimilor brute i a olaquindoxului din furaje i de modificare a Directivei 71/393/CEE (3); Directiva 1999/27/CE a Comisiei din 20 aprilie 1999 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru dozarea de amproliu, diclazuril i carbadox n furaje, de modificare a Directivelor 71/250/CEE, 73/46/CEE i de abrogare a Directivei 74/203/CEE (4); Directiva 1999/76/CE a Comisiei din 23 iulie 1999 de stabilire a unei metode comunitare pentru dozarea de lasalocid sodiu n furaje (5); Directiva 2000/45/CE a Comisiei din 6 iulie 2000 de stabilire a metodelor comunitare de analiz pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E i a triptofanului din furaje (6); Directiva 2002/70/CE a Comisiei din 26 iulie 2002 de stabilire a cerinelor pentru determinarea nivelurilor de dioxine i de PCB de tipul dioxinelor din furaje (7); Directiva 2003/126/CE a Comisiei din 23 decembrie 2003 privind metoda analitic de determinare a componentelor de origine animal pentru controlul oficial al furajelor (8).

81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/ 117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/ CE, 2002/70/CE i 2003/126/CE ar trebui abrogate. Msurile prevzute n prezentul regulament sunt conforme cu avizul Comitetului permanent pentru lanul alimentar i sntatea animal,

(4)

ADOPT PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1 Eantionarea pentru controlul oficial al furajelor, n vederea determinrii constituenilor, aditivilor i a substanelor nedorite, cu excepia reziduurilor de pesticide i a microorganismelor, se efectueaz n conformitate cu metodele descrise n anexa I. Articolul 2

Prepararea eantioanelor pentru analiz i exprimarea rezultatelor se efectueaz n conformitate cu metodele descrise n anexa II. Articolul 3 Analizele pentru controlul oficial al furajelor se efectueaz utiliznd metodele descrise n anexa III (Metode de analiz pentru controlul compoziiei materiilor prime furajere i a furajelor combinate), anexa IV (Metode de analiz pentru controlul nivelului de aditivi autorizai n furaje), anexa V (Metode de analiz pentru controlul substanelor nedorite n furaje) i anexa VI (Metode de analiz pentru determinarea constituenilor de origine animal pentru controlul oficial al furajelor). Articolul 4

(2)

Din moment ce Directiva 70/373/CEE a fost nlocuit de Regulamentul (CE) nr. 882/2004, este necesar nlocuirea actelor de punere n aplicare a directivei respective cu un singur regulament. n acelai timp, metodele ar trebui adaptate innd cont de progresele tiinifice i tehnologice n domeniu. Metodele care nu mai sunt valabile pentru scopul lor propus ar trebui eliminate. Cu toate c, pentru a se lua n considerare progresele recente n modul n care furajele sunt produse, pstrate, transportate i comercializate, se anticipeaz actualizarea ntr-un termen adecvat a dispoziiilor privind eantionarea, n prezent este necesar meninerea dispoziiilor actuale privind eantionarea. Prin urmare, directivele 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/ CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE,JO JO JO JO JO JO JO JO L L L L L L L L 234, 329, 257, 118, 207, 174, 209, 339, 17.9.1993, p. 17. 30.12.1993, p. 54. 19.9.1998, p. 14. 6.5.1999, p. 36. 6.8.1999, p. 13. 13.7.2000, p. 32. 6.8.2002, p. 15. 24.12.2003, p. 78.

Valoarea energetic a furajelor combinate pentru psri de cresctorie se calculeaz n conformitate cu anexa VII. Articolul 5 Metodele de analiz pentru controlul prezenei ilegale a aditivilor care nu mai sunt autorizai pentru furaje, descrise n anexa VIII, se utilizeaz n scop de confirmare. Articolul 6

(3)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)

Directivele 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/ CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/ CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE i 2003/126/CE se abrog. Trimiterile la directivele abrogate se interpreteaz ca trimiteri la prezentul regulament i se citesc n conformitate cu tabelul de coresponden din anexa IX.

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene Articolul 7

L 54/3

Prezentul regulament intr n vigoare n a douzecea zi de la data publicrii n Jurnalul Oficial al Uniunii Europene. Se aplic de la 26 august 2009. Prezentul regulament este obligatoriu n toate elementele sale i se aplic direct n toate statele membre. Adoptat la Bruxelles, 27 ianuarie 2009. Pentru ComisieAndroulla VASSILIOU

Membru al Comisiei

L 54/4

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii EuropeneANEXA I METODE DE EANTIONARE

26.2.2009

1.

OBIECTIV I DOMENIU DE APLICARE Eantioanele destinate controlului oficial al furajelor se preleveaz n conformitate cu metodele descrise n continuare. Eantioanele astfel prelevate se consider reprezentative pentru loturile eantionate.

2.

PERSONALUL CARE EFECTUEAZ EANTIONAREA Eantioanele se preleveaz de ctre personal autorizat n acest sens de statele membre.

3.

DEFINIII Lot eantionat: o cantitate de produs care constituie o unitate i care are caracteristici presupuse a fi uniforme. Eantion elementar: o cantitate prelevat dintr-un punct al lotului eantionat. Eantion colectiv: o colecie de eantioane elementare prelevate din acelai lot eantionat. Eantion redus: o parte reprezentativ a eantionului colectiv, obinut din acesta printr-un proces de reducere. Eantion final: o parte din eantionul redus sau din eantionul colectiv omogenizat.

4. 4.1.

APARATUR Aparatura de prelevare de eantioane trebuie s fie realizat din materiale care nu contamineaz produsele de eantionat. Aceast aparatur poate fi omologat de ctre statele membre.

4.2. 4.2.1. 4.2.1.1. 4.2.1.2.

Aparatura recomandat pentru prelevarea eantioanelor din furaje solide Prelevarea manual Lopat plat cu margini verticale. Sond de eantionare cu o fant lung sau compartimentat. Dimensiunile sondei de eantionare trebuie s fie adecvate caracteristicilor lotului eantionat (adncimea recipientului, dimensiunile sacului etc.) i dimensiunilor particulelor furajului.

4.2.2.

Prelevarea mecanic Pentru prelevarea de eantioane din furajele n micare poate fi utilizat aparatur mecanic omologat.

4.2.3.

Separatorul Aparatura destinat divizrii eantionului n pri aproximativ egale poate fi folosit pentru prelevri de eantioane elementare i pentru prepararea eantioanelor reduse i finale.

5.

CERINE CANTITATIVE 5.A. 5.A.1. n relaie cu controlul substanelor sau produselor uniform distribuite n furaje Lotul eantionat Mrimea lotului eantionat trebuie s permit eantionarea fiecrei pri constituente.

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/5

5.A.2. 5.A.2.1. 5.A.2.1.1. 5.A.2.1.2.

Eantioane elementare Furaje vrac: loturile eantionate nu depesc 2,5 tone metrice loturile eantionate depesc 2,5 tone metrice Furaje ambalate: Ambalaje care depesc 1 kg: loturi eantionate reprezentnd unul pn la patru ambalaje loturi eantionate reprezentnd cinci pn la 16 ambalaje loturi eantionate reprezentnd mai mult de 16 ambalaje Ambalaje care nu depesc 1 kg Furaje lichide sau semilichide: Recipiente care depesc un litru: loturi eantionate de unul pn la patru recipiente loturi eantionate de cinci pn la 16 recipiente loturi eantionate reprezentnd mai mult de 16 recipiente Recipiente care nu depesc un litru Blocuri de furaje i brichete minerale toate recipientele patru numrul de recipiente care compune lotul eantionat (*), pn la un maximum de 20 de recipiente patru Numrul minim de blocuri sau brichete de eantionat (**): un bloc sau o brichet per lot eantionat de 25 de uniti, pn la un maximum de patru blocuri sau brichete toate ambalajele patru numrul de ambalaje care compun lotul eantionat (*), pn la un maximum de 20 de ambalaje patru Numrul minim de recipiente de eantionat (**): Numr minim de eantioane elementare: apte 20 nmulit cu numrul de tone metrice care compune lotul eantionat (*), pn la un maximum de 40 de eantioane elementare Numrul minim de ambalaje de eantionat (**):

5.A.2.2. 5.A.2.2.1. 5.A.2.2.1.1. 5.A.2.2.1.2. 5.A.2.2.1.3.

5.A.2.2.2. 5.A.2.3. 5.A.2.3.1. 5.A.2.3.1.1. 5.A.2.3.1.2. 5.A.2.3.1.3.

5.A.2.3.2. 5.A.2.4.

5.A.3.

Eantion colectiv Se cere un singur eantion colectiv per lot eantionat. Cantitatea total de eantioane elementare care constituie eantionul colectiv nu poate fi mai mic dect cantitile de mai jos: Furaje vrac Furaje ambalate ambalaje care depesc 1 kg ambalaje care nu depesc 1 kg Furaje lichide sau semilichide: recipiente care depesc un litru: recipiente care nu depesc un litru Blocuri de furaje sau brichete minerale: cntrind mai mult de 1 kg fiecare cntrind cel mult 1 kg fiecare 4 kg greutatea a patru blocuri sau brichete originale patru litri volumul coninutului a patru recipiente originale 4 kg greutatea coninutului a patru ambalaje originale 4 kg

5.A.3.1. 5.A.3.2. 5.A.3.2.1. 5.A.3.2.2. 5.A.3.3. 5.A.3.3.1. 5.A.3.3.2. 5.A.3.4. 5.A.3.4.1. 5.A.3.4.2.

L 54/6

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

5.A.4.

Eantioane finale Dac este cazul, eantionul final provine din eantionul colectiv, prin reducere. Se cere analiza a cel puin un eantion final. Cantitatea din eantionul final de analizat nu poate fi mai mic dect cantitile de mai jos: Furaje solide Furaje lichide sau semilichide 500 g 500 ml

5.B.

n funcie de controlul substanelor sau produselor nedorite care pot fi distribuite neuniform n masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul i crotalaria din materiile prime furajere (***) Lot eantionat: a se vedea 5.A.1. Eantioane elementare Furaje vrac: a se vedea 5.A.2.1. Furaje ambalate: loturi eantionate numrnd unul pn la patru ambalaje loturi eantionate de cinci pn la 16 ambalaje loturi eantionate numrnd mai mult de 16 ambalaje Numrul minim de ambalaje de eantionat: toate ambalajele patru numrul de ambalaje care compun lotul eantionat (*), pn la un maximum de 40 de ambalaje

5.B.1. 5.B.2. 5.B.2.1. 5.B.2.2. 5.B.2.2.1. 5.B.2.2.2. 5.B.2.2.3.

5.B.3.

Eantioane colective Numrul de eantioane colective va varia n funcie de mrimea lotului eantionat. Numrul minim de eantioane colective per lot eantionat este redat mai jos. Greutatea total a eantioanelor elementare care constituie eantionul colectiv nu poate fi mai mic de 4 kg Furaje vrac Greutatea lotului eantionat n tone metrice: pn la 1 mai mult de 1 i pn la 10 mai mult de 10 i pn la 40 mai mult de 40 Numrul minim de eantioane colective per lot eantionat: 1 2 3 4

5.B.3.1.

5.B.3.2.

Furaje ambalate Mrimea loturilor eantionate pentru furajele ambalate, n numr de ambalaje: 1 pn la 16 17 pn la 200 201 pn la 800 mai mult de 800 Numrul minim de eantioane colective per lot eantionat: 1 2 3 4

5.B.4.

Eantioane finale Eantionul final provine din fiecare eantion colectiv, prin reducere. Se cere analiza a cel puin un eantion final per eantion colectiv. Greutatea eantionului final de analizat nu poate fi mai mic de 500 g.

(*) n cazul n care numrul obinut este o fracie, aceasta se rotunjete la numrul ntreg imediat superior. (**) n cazul ambalajelor sau recipientelor care nu depesc 1 kg sau un litru i n cazul blocurilor sau brichetelor de sare care nu cntresc mai mult de 1 kg fiecare, un eantion elementar este reprezentat de coninutul unui ambalaj sau recipient original, un bloc sau o brichet de sare. (***) Metodele menionate n 5.A sunt destinate a fi utilizate n controlul aflatoxinelor, cornului-secarei, ricinului i crotalariei din furajele complete i complementare.

26.2.20096. 6.1.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/7

INSTRUCIUNI PENTRU PRELEVAREA, PREPARAREA I AMBALAREA EANTIOANELOR Aspecte generale Eantioanele se preleveaz i se prepar ct mai rapid posibil, lund n considerare precauiile necesare pentru a asigura c produsul nu este nici modificat, nici contaminat. Instrumentele, suprafeele de lucru i recipientele destinate eantionrii trebuie s fie curate i uscate.

6.2. 6.2.A.

Eantioane elementare n relaie cu controlul substanelor sau produselor uniform distribuite n furaje Eantioanele elementare trebuie prelevate n mod aleatoriu din ntregul lot eantionat, iar dimensiunile lor trebuie s fie aproximativ egale.

6.2.A.1. F u r a j e v r a c Lotul eantionat se mparte n mod imaginar n mai multe pri aproximativ egale. n mod aleator, se selecteaz un numr de pri corespunztor numrului de eantioane elementare necesare, n conformitate cu punctul 5.A.2, i se preleveaz cel puin un eantion din fiecare din aceste pri. Dac este cazul, eantionarea poate fi efectuat atunci cnd lotul este n micare (ncrcare sau descrcare). 6.2.A.2. F u r a j e a m b a l a t e Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de ambalaje, conform indicaiilor de la punctul 5.A.2, o parte a coninutului fiecrui ambalaj se scoate folosind o sond sau o lopat. Dac este cazul, eantioanele se preleveaz dup ce ambalajele au fost golite separat. Orice aglomerri se destram, dac este cazul prin separarea lor de eantion, urmat de rencorporare n eantion, pentru fiecare eantion colectiv n parte. 6.2.A.3. F u r a j e l i c h i d e s a u s e m i l i c h i d e , o m o g e n e s a u o m o g e n i z a b i l e Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de recipiente, n conformitate cu indicaiile de la punctul 5.A.2, coninutul lor se omogenizeaz, dac este necesar, i se preleveaz o cantitate din fiecare recipient. Eantioanele elementare pot fi prelevate la descrcarea coninutului. 6.2.A.4. F u r a j e l i c h i d e s a u s e m i l i c h i d e , n e o m o g e n i z a b i l e Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de containere, n conformitate cu indicaiile de la punctul 5.A.2, eantioanele se preleveaz de la diferite niveluri. Eantioanele se pot preleva i n timpul descrcrii coninutului, dar primele fraciuni se ndeprteaz. n oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie s fie mai mic de 10 litri. 6.2.A.5. B l o c u r i d e f u r a j e i b r i c h e t e m i n e r a l e Dup selectarea pentru eantionare a numrului necesar de blocuri sau brichete, conform indicaiilor de la punctul 5.A.2, se preleveaz o parte din fiecare bloc sau brichet.

6.2.B.

n relaie cu controlul substanelor sau al produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform n masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul i crotalaria din materiile prime furajere Lotul eantionat se mparte n mod imaginar n mai multe pri aproximativ egale, corespunztoare numrului de eantioane colective prevzute la punctul 5.B.3. Dac acest numr este mai mare dect 1, numrul total de eantioane elementare prevzute la punctul 5.B.2 se distribuie aproximativ egal ntre diferitele pri. n continuare se preleveaz eantioane cu mrimi aproximativ egale (1), astfel nct cantitatea total a eantioanelor provenite din fiecare parte s nu fie mai mic dect cantitatea minim de 4 kg necesar pentru fiecare eantion colectiv. Eantioanele elementare prelevate din diferite pri nu se consider colective.

(1)

Pentru furajele ambalate, o parte a coninutului ambalajelor de eantionat se preleveaz prin utilizarea unei sonde sau a unei lopei, dup golirea separat a ambalajelor, dac este cazul.

L 54/86.3. 6.3.A.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Prepararea eantioanelor colective n relaie cu controlul substanelor produselor cu distribuie uniform n masa de furaje Eantioanele elementare se amestec pentru a forma un singur eantion colectiv.

6.3.B.

n relaie cu controlul substanelor sau produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform n masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul i crotalaria din materii prime furajere Eantioanele elementare prelevate din fiecare parte a lotului eantionat se amestec i se constituie numrul de eantioane colective prevzute la punctul 5.B.3, avndu-se grij s se noteze proveniena fiecrui eantion colectiv.

6.4.

Prepararea eantioanelor finale Materialul din fiecare eantion colectiv se amestec cu grij pentru a se obine un eantion omogenizat (1). Dac este necesar, eantionul colectiv se reduce mai nti la cel puin 2 kg sau doi litri (eantion redus), fie prin utilizarea unui separator mecanic sau automat, fie prin metoda sferturilor. Se prepar apoi cel puin trei eantioane finale avnd aproximativ aceeai cantitate, n conformitate cu cerinele cantitative prevzute la punctul 5.A.4 sau 5.B.4. Fiecare eantion se pune ntr-un recipient corespunztor. Se iau toate precauiile necesare pentru evitarea oricrei modificri de compoziie a eantionului, a contaminrii sau a falsificrii, care ar putea avea loc n timpul transportrii sau depozitrii.

6.5.

Ambalarea eantioanelor finale Recipientele sau ambalajele se sigileaz i se eticheteaz (eticheta complet se ncorporeaz n sigiliu) astfel nct ele s nu poat fi deschise fr a deteriora sigiliul.

7.

PROCESUL-VERBAL DE EANTIONARE Pentru fiecare eantionare se ntocmete un proces-verbal, care permite identificarea fr ambiguiti a lotului eantionat.

8.

DESTINAIA EANTIOANELOR Pentru fiecare eantion colectiv se trimite, ct mai repede posibil, ctre laboratorul de analize autorizat, cel puin un eantion final, mpreun cu informaiile necesare specialistului.

(1)

Orice aglomerri se destram (dac este cazul prin separarea lor de eantion urmat de rencorporarea lor n eantion), pentru fiecare eantion colectiv n parte.

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii EuropeneANEXA II DISPOZIII GENERALE PRIVIND METODELE DE ANALIZ A FURAJELOR

L 54/9

A. 1.

PREPARAREA EANTIOANELOR N VEDEREA ANALIZRII

Obiectiv Procedurile descrise mai jos privesc prepararea pentru analizarea eantioanelor finale, trimise laboratoarelor de control dup eantionare conform dispoziiilor menionate n anexa I. Prepararea acestor eantioane trebuie astfel efectuat nct cantitile prelevate, n conformitate cu dispoziiile din metoda de analiz, s fie omogene i reprezentative pentru eantioanele finale.

2.

Precauiile ce trebuie luate Procedura de preparare a eantioanelor care trebuie urmat este dependent de metodele de analiz utilizate. De aceea, este de importan major a se asigura ca procedura de preparare a eantioanelor urmat s fie adecvat metodei de analiz utilizate. Toate operaiunile necesare se efectueaz astfel nct s se evite, pe ct posibil, contaminarea eantionului i modificarea compoziiei acestuia. Mcinarea, amestecarea i cernerea se efectueaz ct mai repede posibil n condiiile unei expuneri minime a eantionului la aer i la lumin. Nu se utilizeaz rnie sau aparate de mcinat care ar putea cauza nclzirea semnificativ a eantionului. Se recomand ca furajele foarte sensibile la cldur s fie mcinate manual. De asemenea, aparatura folosit nu trebuie s constituie o surs de contaminare cu oligoelemente. Dac prepararea nu poate fi efectuat fr modificri semnificative ale coninutului umed al eantionului, se determin coninutul umed nainte i dup pregtire, n conformitate cu metoda menionat n partea A din anexa III.

3.

Procedura Se divide eantionul n subeantioane adecvate, n vederea analizrii i trimiterii, prin utilizarea unor tehnici adecvate de separare, cum ar fi eantionarea alternativ cu ajutorul lopeii sau eantionarea n condiii staionare sau rotative. Formarea unui con i selectarea de sferturi nu este recomandat deoarece ar putea s se formeze subeantioane care s dea natere la erori de separare mari. Eantionul de trimis se pstreaz ntr-un recipient adecvat, curat i uscat, prevzut cu un capac ermetic, iar subeantioanele de analizat, cu greutate de cel puin 100 g, se prepar n modul indicat mai jos.

3.1. Furaje care pot fi mcinate ca atare Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, se cerne ntregul eantion printr-o sit cu orificii ptrate cu latura de 1 mm (n conformitate cu recomandarea ISO R565), dup mcinare, dac este cazul. Se evit mcinarea exagerat. Se amestec eantionul trecut prin sit i se pune ntr-un recipient adecvat, curat i uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestec din nou, imediat nainte de a preleva eantionul pentru analiz. 3.2. Furaje care pot fi mcinate dup uscare Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, eantionul se deshidrateaz astfel nct umiditatea sa s se reduc la 8-12 %, n conformitate cu procedura de preuscare, descris la punctul 4.3, din metoda de determinare a umiditii, menionat n partea A din anexa III. n continuare, se procedeaz astfel cum se indic n seciunea 3.1. 3.3. Furaje lichide sau semilichide Eantioanele se recolteaz ntr-un recipient adecvat, curat i uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestec minuios, imediat nainte de prelevarea eantionului de analizat. 3.4. Alte furaje Eantioanele care nu pot fi preparate conform unei proceduri indicate anterior se trateaz prin orice alt procedur prin care se asigur c eantioanele prelevate n vederea analizrii sunt omogene i reprezentative pentru eantioanele finale.

L 54/104.

RODepozitarea eantioanelor

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Eantioanele trebuie pstrate la o temperatur care s nu le altereze compoziia. Eantioanele destinate analizrii prezenei vitaminelor sau substanelor foarte sensibile la lumin se pstreaz n recipiente de sticl brun.

B. 1.

DISPOZIII PRIVIND REACTIVII I APARATURA UTILIZATE N METODELE DE ANALIZ

Dac nu se specific altfel n metodele de analiz, toi reactivii destinai analizelor trebuie s fie puri din punct de vedere analitic (p.a.). Pentru analiza prezenei oligoelementelor, puritatea reactivilor se controleaz printr-un test martor. n funcie de rezultatele obinute, poate fi necesar o purificare suplimentar a reactivilor. Pentru orice operaie care implic prepararea soluiilor, diluia, cltirea sau splarea, menionate n metodele de analiz i pentru care nu exist indicaii referitoare la natura solventului sau diluantului, se utilizeaz apa. Ca regul general, se utilizeaz ap demineralizat sau distilat. n cazuri speciale, care sunt indicate n metodele de analiz, apa trebuie supus unor proceduri de purificare speciale. Avnd n vedere dotarea uzual a laboratoarelor de control, n metodele de analiz se menioneaz doar instrumentele i aparatura speciale sau care au utilizri specifice. Ele trebuie s fie curate, n special n cazul determinrii unor cantiti foarte mici de substane.

2.

3.

C. 1.

APLICAREA METODELOR DE ANALIZ I EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procedura de extracie O serie de metode determin o procedur de extracie specific. Ca regul general, se pot aplica alte proceduri de extracie dect cea la care se face referire n metod dac s-a dovedit c procedura de extracie utilizat are, pentru matricea analizat, o eficien de extracie echivalent cu procedura menionat n metod.

2.

Procedura de purificare O serie de metode determin o procedur de purificare specific. Ca regul general, se pot aplica alte proceduri de purificare dect cea la care se face referire n metod dac s-a dovedit c procedura de purificare utilizat determin, pentru matricea analizat, rezultate analitice echivalente cu procedura menionat n metod.

3.

Raportarea metodei de analiz utilizate n general, pentru determinarea fiecrei substane n furaje se stabilete o singur metod de analiz. n cazul n care sunt indicate mai multe metode, n buletinul de analiz se specific metoda aplicat de laboratorul de control.

4.

Numrul determinrilor Rezultatul menionat n buletinul de analiz reprezint valoarea medie obinut n urma a cel puin dou determinri, efectuate pe poriuni distincte ale eantionului, cu repetabilitate satisfctoare. Totui, n cazul analizelor de detectare a substanelor indezirabile, dac rezultatul primei determinri este semnificativ (> 50 %) mai mic dect specificaia de control, nu sunt necesare alte determinri, cu condiia s fie aplicate procedurile calitative adecvate. n cazul controlului privind coninutul declarat pentru o anumit substan sau un anumit ingredient, dac rezultatul primei determinri confirm coninutul declarat, adic rezultatul analizei se situeaz n interiorul intervalului de variaie acceptat, nu sunt necesare alte determinri, cu condiia s fie aplicate procedurile calitative adecvate. n unele cazuri, intervalul de variaie acceptabil respectiv este definit n legislaie, de exemplu n Directiva 79/373/CEE a Consiliului (1).

5.

Raportarea rezultatului analitic Rezultatul analitic se exprim n maniera indicat n metoda de analiz, printr-un numr adecvat de cifre semnificative i se ajusteaz, dac este cazul, la coninutul de umiditate al eantionului final nainte de preparare.

(1)

JO L 86, 6.4.1979, p. 30.

26.2.20096.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/11

Incertitudinea de msurare i rata de recuperare n cazul analizelor de detectare a substanelor indezirabile n ce privete substanele indezirabile, n sensul Directivei 2002/32/CE, inclusiv dioxina i PCB asemntori dioxinei, un produs destinat utilizrii n furaje se consider neconform n ce privete coninutul maxim acceptat dac rezultatul analitic este considerat c depete coninutul maxim, innd cont de incertitudinea de msurare extins i ajustarea pentru recuperare. Pentru a evalua conformitatea, concentraia analizat se utilizeaz dup ce a fost corectat pentru recuperare i dup deducerea incertitudinii de msurare extinse. Aceast procedur este aplicabil doar n cazurile n care metoda de analiz permite estimarea incertitudinii de msurare i ajustarea pentru recuperare (de exemplu, imposibil n cazul analizelor la microscop). Rezultatul analitic se raporteaz n modul urmtor (n msura n care metoda de analiz utilizat permite estimarea incertitudinii de msurare i a ratei de recuperare): (a) ajustat pentru recuperare, nivelul de recuperare fiind indicat. Ajustarea pentru recuperare nu este necesar n cazul n care rata de recuperare este ntre 90 i 110 %. ca x +/ U, unde x este rezultatul analitic i U este incertitudinea de msurare extins, folosind un factor de acoperire 2, care d un nivel de ncredere de aproximativ 95 %.

(b)

Totui, dac rezultatul analizei este semnificativ (> 50 %) mai mic dect specificaia de control i cu condiia ca procedurile calitative corespunztoare s fie aplicate i ca analiza s serveasc doar verificrii conformitii cu prevederile legale, rezultatul analitic ar putea fi raportat fr ajustare pentru recuperare, iar raportarea ratei de recuperare i a incertitudinii de msurare ar putea fi omis n aceste cazuri.

L 54/12

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii EuropeneANEXA III

26.2.2009

METODE DE ANALIZ DE CONTROL AL COMPOZIIEI MATERIILOR PRIME FURAJERE I AL FURAJELOR COMBINATE

A. 1.

DETERMINAREA UMIDITII

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinarea coninutului de umiditate al furajelor. n cazul furajelor care conin substane volatile, cum sunt acizii organici, este de notat c o dat cu determinarea coninutului de umiditate se determin i cantiti semnificative de substane volatile. Metoda nu se aplic n cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime furajere, analizei substanelor minerale i a mixturilor compuse n principal din substane minerale, analizei grsimilor i uleiurilor de origine animal i vegetal sau analizei seminelor i a fructelor oleaginoase.

2.

Principiu Eantionul se deshidrateaz n condiii specificate, care variaz n funcie de natura furajelor. Scderea greutii se determin prin cntrire. Este necesar s se efectueze o uscare prealabil atunci cnd se analizeaz furaje solide cu coninut ridicat de umiditate.

3. 3.1.

Aparatur Moar construit dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, uor de curat, care permite o zdrobire rapid i uniform, fr a provoca nclzire semnificativ, care evit pe ct posibil contactul cu aerul exterior i care corespunde cerinelor menionate la punctele 4.1.1 i 4.1.2 (de exemplu, micro-mori cu ciocane sau rcite cu ap, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dinate). Balan analitic, cu toleran de 1 mg. Recipiente uscate din metal care nu se corodeaz sau din sticl cu capace ermetice; suprafaa de lucru permite mprtierea eantionului pn la aproximativ 0,3 g/cm2. Cuptor izoterm cu nclzire electric ( 2 oC), ventilat corespunztor i care asigur o reglare rapid a temperaturii (1). Cuptor vidat cu nclzire electric, reglabil, dotat cu o pomp de ulei i cu: fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat, fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu). Desicator cu o plac din metal sau porelan, groas, perforat, coninnd un agent de desicare eficient.

3.2. 3.3.

3.4.

3.5.

3.6.

4.

Procedura N.B. Operaiile descrise n aceast seciune se efectueaz imediat dup deschiderea ambalajelor care conin eantioanele. Analizele trebuie s fie efectuate cel puin n duplicat.

4.1. 4.1.1.

Preparare Furaje care nu sunt menionate la punctele 4.1.2 i 4.1.3 Se preleveaz cel puin 50 g de eantion. Dac este necesar, se zdrobete sau se divizeaz astfel nct s se evite orice variaie a coninutului de umiditate (a se vedea punctul 6).

4.1.2.

Cereale i tre Se preleveaz cel puin 50 g de eantion. Se macin n particule din care cel puin 50 % trec printr-o sit cu orificii de 0,5 mm i care nu determin un reziduu mai mare de 10 % n cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.

(1)

Pentru uscarea cerealelor, a finii fine, a trelor i a finii grunjoase, cuptorul trebuie s aib o capacitate termic astfel nct, atunci cnd este prestabilit la 131 oC, va reveni la temperatura respectiv n mai puin de 45 de minute dup ce n interior a fost plasat un numr maxim de eantioane de testat, n vederea uscrii simultane. Ventilaia trebuie s fie astfel nct, atunci cnd un numr ct mai mare de eantioane de gru comun pe care le poate conine sunt supuse uscrii timp de dou ore, rezultatele difer de cele obinute dup patru ore de uscare cu mai puin de 0,15 %.

26.2.20094.1.3.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/13

Furaje lichide sau pstoase, furaje constituite n mod predominant din uleiuri i grsimi Se preleveaz aproximativ 25 g din eantion, se cntrete cu o abatere de 10 mg, se adaug o cantitate adecvat de nisip anhidru cntrit cu o abatere de 10 mg i se amestec pn la obinerea unui produs omogen.

4.2. 4.2.1.

Uscare Furaje care nu sunt menionate la punctele 4.1.2 i 4.1.3 Se cntrete un recipient (3.3) mpreun cu capacul su, cu o abatere de 1 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de 5 g de eantion i se mprtie uniform. Recipientul se introduce, fr capac, n cuptorul nclzit n prealabil la 103 oC. Pentru a mpiedica scderea inadecvat a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid posibil. Se las la uscat timp de patru ore, calculate din momentul n care temperatura din cuptor revine la 103 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urm se scoate din cuptor, se las s se rceasc timp de 30-45 de minute n desicator (3.6) i se cntrete cu o abatere de 1 mg. n cazul furajelor constituite n mod predominant din uleiuri i grsimi, uscarea n cuptor se prelungete cu 30 de minute, la 103 oC. Diferena ntre cele dou cntriri nu trebuie s depeasc 0,1 % n umiditate.

4.2.2.

Cereale, fin fin, tre i fin grunjoas Se cntrete un recipient (3.3) mpreun cu capacul su, cu o abatere de 0,5 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eantion mcinat i se mprtie uniform. Recipientul se introduce, fr capac, n cuptorul nclzit n prealabil la 130 oC. Pentru a mpiedica scderea inadecvat a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid posibil. Se las la uscat timp de dou ore, considerate din momentul n care temperatura din cuptor revine la 130 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urm se scoate din cuptor, se las s se rceasc timp de 30-45 de minute n desicator (3.6) i se cntrete cu o abatere de 1 mg.

4.2.3.

Furaje combinate coninnd peste 4 % zaharoz sau lactoz: materii prime furajere precum seminele de rocove, produsele cerealiere hidrolizate, seminele de mal, buci de sfecl uscat, solubilizate de pete i zaharuri; furaje combinate coninnd peste 25 % sruri minerale care nglobeaz ap de cristalizare. Se cntrete un recipient (3.3) mpreun cu capacul su, cu o abatere de 0,5 mg. n recipientul respectiv se cntrete, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eantion i se mprtie uniform. Recipientul se introduce, fr capac, n cuptorul vidat (3.5) nclzit n prealabil la o temperatur cuprins ntre 80 i 85 oC. Pentru a mpiedica scderea inadecvat a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce ct mai rapid posibil. Se aduce presiunea la 100 Torr i se las la uscat, la aceast presiune, timp de patru ore, fie ntr-un curent de aer uscat i cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ 300 g pentru 20 de eantioane). n al doilea caz, pompa de vid se deconecteaz dup ce se obine presiunea recomandat. Durata de uscare se calculeaz din momentul n care temperatura n cuptor revine la o valoare cuprins ntre 80 i 85 oC. Presiunea cuptorului se readuce cu grij pn la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se aeaz imediat capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se las s se rceasc timp de 30-45 de minute n desicator (3.6) i se cntrete cu o abatere de 1 mg. Uscarea n cuptorul vidat se prelungete cu nc 30 de minute la o temperatur cuprins ntre 80 i 85 oC i se recntrete. Diferena ntre cele dou cntriri nu trebuie s depeasc 0,1 % n umiditate.

4.3. 4.3.1.

Uscarea prealabil Furaje care nu sunt menionate la punctul 4.3.2 Furajele solide al cror coninut de umiditate este ridicat, fcnd dificil zdrobirea, trebuie s fie supuse uscrii prealabile, dup cum urmeaz: Se cntresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de eantion nemcinat (dac este cazul, furajele comprimate sau aglomerate pot fi divizate cu aproximaie) ntr-un recipient corespunztor (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 12 cm cu bordur de 0,5 cm). Se las la uscat ntr-un cuptor la o temperatur cuprins ntre 60 i 70 oC, pn ce coninutul de umiditate s-a redus la o valoare cuprins ntre 8 i 12 %. Se scoate din cuptor, se las s se rceasc, neacoperit, n laborator, timp de o or i se cntrete cu o abatere de 10 mg. Se zdrobete imediat conform indicaiilor de la punctul 4.1.1 i se usuc conform indicaiilor de la punctul 4.2.1 sau 4.2.3, n funcie de natura furajului.

4.3.2.

Cereale Grunele cu un coninut de umiditate mai mare de 17 % trebuie s fie supuse uscrii prealabile, dup cum urmeaz:

L 54/14

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Se cntresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de grune nemcinate ntr-un recipient corespunztor (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 12 cm cu bordur de 0,5 cm). Se las la uscat ntr-un cuptor, timp de 5-7 minute, la temperatura de 130 oC. Se scot din cuptor, se las s se rceasc, neacoperit, n laborator, timp de dou ore i se cntresc cu o abatere de 10 mg. Se macin imediat conform indicaiilor de la punctul 4.1.2 i se usuc conform indicaiilor de la punctul 4.2.2.

5.

Calculul rezultatelor Coninutul de umiditate (X) al eantionului, n procente, se calculeaz prin utilizarea formulelor urmtoare:

5.1.

Uscare fr uscare prealabil X= unde: m = greutatea iniial, n grame, a eantionului de testat; m0 = greutatea, n grame, a eantionului de testat uscat. m m0 100 m

5.2.

Uscare cu uscare prealabil Xp = unde: m m1 m2 m0 = = = = greutatea iniial, n greutatea, n grame, greutatea, n grame, greutatea, n grame, grame, a eantionului de testat; a eantionului de testat dup uscare prealabil; a eantionului de testat dup zdrobire sau mcinare; a eantionului de testat uscat. m2 m0 m1 100 m1 m0 m m1 = 100 1 m m2 m m2

5.3.

Repetabilitate Diferena dintre rezultatele obinute n dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu depete 0,2 % din valoarea absolut pentru umiditate.

6.

Observaie Dac zdrobirea se dovedete a fi necesar i dac aceast aciune poate modifica coninutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele furajelor trebuie ajustate n funcie de coninutul de umiditate al eantionului n starea lui iniial.

B. 1.

DETERMINAREA UMIDITII DIN GRSIMILE I ULEIURILE ANIMALE I VEGETALE

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinarea coninutului n ap i substane volatile din grsimile i uleiurile animale i vegetale.

2.

Principiu Eantionul se usuc pn la atingerea greutii constante (pierderea de greutate ntre dou cntriri succesive este mai mic sau egal cu 1 mg) la 103 oC. Pierderea de greutate se determin prin cntrire.

3. 3.1. 3.2.

Aparatur Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm i adncime de aproximativ 3 cm. Termometru cu bulb ntrit i cu tub de expansiune la captul superior, gradat de la aproximativ 80 oC pn la cel puin 110 oC i lung de aproximativ 10 cm. Cuv cu nisip sau plit.

3.3.

26.2.20093.4. 3.5.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/15

Desicator, coninnd un agent de uscare eficient. Balan analitic.

4.

Procedura Se cntresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eantionul omogenizat, n recipientul uscat i cntrit (3.1), coninnd termometrul (3.2). Se nclzete pe cuva cu nisip sau pe plit (3.3), amestecnd continuu cu termometrul, astfel nct temperatura s ajung la 90 oC n aproximativ 7 minute. Se reduce intensitatea cldurii, urmrind frecvena cu care bulele se ridic de pe fundul vasului. Temperatura nu trebuie s depeasc 105 oC. Se continu amestecarea, rzuind fundul vasului, pn cnd bulele nceteaz s se mai formeze. Pentru a asigura eliminarea complet a umiditii, se renclzete de cteva ori la 103 2 oC, rcind la 93 oC ntre nclziri succesive. n continuare se las s se rceasc la temperatura camerei n desicator (3.4) i se cntrete. Se repet aceast operaie pn cnd pierderea de greutate dintre dou nclziri succesive nu depete 2 mg. N.B. O cretere a greutii eantionului dup nclzire repetat indic oxidarea grsimilor, caz n care rezultatul se calculeaz prin cntrirea imediat nainte ca greutatea s nceap s creasc.

5.

Calculul rezultatelor Coninutul de umiditate (X), ca procentaj din eantion, este dat de urmtoarea formul: X = m1 m2 unde: m = greutatea, n grame, a eantionului de testat; m1 = greutatea, n grame, a vasului mpreun cu coninutul su nainte de nclzire; m2 = greutatea, n grame, a vasului mpreun cu coninutul su dup nclzire. Rezultatele mai mici de 0,05 % se nregistreaz ca fiind sub 0,05 %. 100 m

Repetabilitate Diferena de umiditate dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu trebuie s depeasc 0,05 %, n valoare absolut.

C. 1.

DETERMINAREA CONINUTULUI DE PROTEINE BRUTE

Obiectiv i domeniu de aplicare Prezenta metod permite determinarea coninutului de proteine brute din furaje pe baza coninutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl.

2.

Principiu Eantionul se dizolv cu acid sulfuric n prezena unui catalizator. Soluia acid se alcalinizeaz cu soluie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distileaz i se colecteaz ntr-o cantitate msurat de acid sulfuric, al crei exces se titreaz cu o soluie etalon de hidroxid de sodiu. Ca alternativ, amoniacul eliberat se distileaz ntr-o soluie de acid boric n exces, urmat de titrare cu o soluie de acid clorhidric sau acid sulfuric.

3. 3.1.

Reactivi Sulfat de potasiu.

L 54/163.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. 3.12. 3.13. 3.14. 3.15. 3.16. 3.17. 3.18.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO 4 5H2O. Zinc granulat. Acid sulfuric, 20 = 1,84 g/ml. Acid sulfuric, soluie volumetric standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. Acid sulfuric, soluie volumetric standard, c(H2SO4) = 0,1 mol/l. Acid sulfuric, soluie volumetric standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. Indicator rou de metil; se dizolv 300 mg de rou de metil n 100 ml de etanol, = 95-96 % (v/v). Soluie de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluie de calitate tehnic) = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). Hidroxid de sodiu, soluie volumetric standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l. Hidroxid de sodiu, soluie volumetric standard, c(NaOH) = 0,1 mol/l. Piatr ponce granulat, splat n acid clorhidric i calcinat. Acetanilid (m.p. = 114 oC, coninutul n N = 10,36 %). Zaharoz (fr azot). Acid boric (H3BO3). Soluie indicator de rou de metil: se dizolv 100 mg de rou de metil n 100 ml de etanol sau metanol. Soluie de verde de bromocrezol: se dizolv 100 mg de verde de bromocrezol n 100 ml de etanol sau metanol. Soluie de acid boric (10-40 g/l, n funcie de aparatura utilizat). Cnd se aplic detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii rou de metil i bromocrezol trebuie adugai la soluiile de acid boric. Dac se prepar 1 litru de soluie de acid boric, nainte de ajustarea de volum, se adaug 7 ml de soluie de indicator rou de metil (3.16) i 10 ml de soluie verde de bromocrezol (3.17). n funcie de apa utilizat, pH-ul soluiei de acid boric poate diferi de la lot la lot. Adesea este necesar o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substan alcalin pentru a obine un martor pozitiv. Not: Adugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH (3.11) n 1 litru de acid boric 10 g/l boric ofer, de obicei, ajustri bune. Soluia se pstreaz la temperatura camerei i, pe durata pstrrii, se protejeaz de lumin i de surse de vapori de amoniac.

3.19.

Acid clorhidric, soluie volumetric standard, c(HCl) = 0,1 mol/l. Not: Dac n calcule se fac ajustrile necesare, se pot folosi alte concentraii de soluii volumetrice (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19). Concentraiile se exprim ntotdeauna cu patru zecimale.

4.

Aparatur Aparatur adecvat pentru efectuarea dizolvrii, distilrii i titrrii conform procedurii Kjeldahl.

5. 5.1.

Procedur Dizolvarea Se cntrete 1 g de eantion cu o abatere de 0,001 g i se transfer eantionul n vasul aparatului de dizolvare. Se adaug 15 g de sulfat de potasiu (3.1), o cantitate adecvat de catalizator (3.2) [0,3-0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9-1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid sulfuric (3.4) i, dac este necesar, cteva granule de piatr ponce (3.12), apoi se amestec.

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/17

Se nclzete vasul, la nceput moderat, agitnd circular din cnd, dac este cazul, pn cnd materia s-a carbonizat i spuma a disprut; apoi se nclzete mai intens, pn cnd lichidul fierbe constant. nclzirea este adecvat dac acidul aflat n fierbere se condenseaz pe peretele vasului. Se previne supranclzirea marginilor i lipirea particulelor organice de acestea. Cnd soluia devine limpede i de culoare verde deschis, se continu fierberea timp de nc dou ore, apoi se las s se rceasc.

5.2.

Distilarea Se adaug cu atenie ap suficient pentru a asigura dizolvarea complet a sulfailor. Se las la rcit i apoi se adaug, dac este cazul, cteva granule de zinc (3.3). Se procedeaz ca la punctul 5.2.1 sau 5.2.2.

5.2.1.

Distilarea n acid sulfuric n vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid sulfuric (3.5) sau (3.7), msurat cu exactitate, n funcie de coninutul estimat de azot. Se adug cteva picturi de indicator rou de metil (3.8). Se conecteaz vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare i se scufund captul condensatorului n lichidul din vasul de colectare pn la o adncime de cel puin 1 cm (a se vedea observaia 8.3). Se toarn ncet 100 ml de soluie de hidroxid de sodiu (3.9) n vasul de dizolvare, fr pierderi de amoniac (a se vedea observaia 8.1). Se nclzete vasul pn la distilarea complet a amoniacului.

5.2.2.

Distilarea n acid boric n cazul n care titrarea amoniacului coninut n distilat se face manual, se aplic procedura de mai jos. n cazul n care unitatea de distilare este complet automatizat, inclusiv titrarea amoniacului coninut n distilat, se urmeaz instruciunile de operare a unitii de distilare puse la dispoziie de fabricant. Sub orificiul de evacuare al condensatorului se aeaz un vas de colectare coninnd 25-30 ml de soluie de acid boric (3.18), astfel nct tubul de evacuare se afl sub nivelul suprafeei soluiei de acid boric n exces. Se regleaz unitatea de distilare astfel nct s elibereze 50 ml de soluie de hidroxid de sodiu (3.9). Unitatea de distilare se opereaz n conformitate cu instruciunile fabricantului, distilndu-se complet amoniacul eliberat prin adugarea de soluie de hidroxid de sodiu. Distilatul se colecteaz n soluia de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat (timpul de distilare n vapori) depinde de cantitatea de azot din eantion. Se urmeaz instruciunile fabricantului. Not: n cazul unei uniti de distilare semiautomate, adugarea hidroxidului de sodiu n exces i distilarea n vapori se efectueaz automat.

5.3.

Titrarea Se procedeaz ca la punctul 5.3.1 sau 5.3.2.

5.3.1.

Acid sulfur ic Se titreaz excesul de acid sulfuric n vasul de colectare cu soluie de hidroxid de sodiu (3.10 sau 3.11), n funcie de concentraia acidului sulfuric utilizat, pn se atinge punctul final.

5.3.2.

Acid bor ic Cu ajutorul unei biurete se titreaz coninutul vasului de colectare cu soluie volumetric standard de acid clorhidric (3.19) sau cu soluie volumetric standard de acid sulfuric (3.6) i se citete cantitatea de soluie de titrare utilizat. Cnd se aplic detectarea colorimetric a punctului final, acesta este atins la prima apariie n coninut a culorii roz. Citirea biuretei se estimeaz cu o abatere de 0,05 ml. Vizualizarea punctului final poate fi facilitat de o plac de agitator magnetic iluminat sau de un detector fotometric. Aceasta poate fi efectuat automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu titrare automat. Operarea specific a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face conform instruciunilor fabricantului.

L 54/18

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Not: n cazul n care se utilizeaz un sistem automat de titrare, aceasta ncepe imediat dup nceperea distilrii i se utilizeaz soluia de acid boric 1 % (3.18). n cazul care se utilizeaz o unitate de distilare complet automat, titrarea automat a amoniacului poate fi efectuat, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui sistem pH poteniometric. n acest caz, se utilizeaz un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se calibreaz corespunztor n intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale de calibrare a pH-ului. Punctul final al titrrii exprimat n pH este atins la valoarea de 4,6, reprezentnd punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune). 5.4. Testul martor Pentru a confirma faptul c reactivii nu conin azot, se efectueaz un test martor (dizolvare, distilare i titrare), folosind 1 g de zaharoz (3.14) n locul eantionului.

6.

Calculul rezultatelor Calcularea se efectueaz n conformitate cu punctul 6.1 sau 6.2.

6.1.

Calcularea titrrii n conformitate cu punctul 5.3.1 Coninutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculeaz conform urmtoarei formule: V0 V1 c 0,014 100 6,25 m unde: V0 V1 c m = = = = volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit n testul martor; volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit n titrarea eantionului; concentraia (mol/l) a hidroxidului de sodiu (3.10 sau 3.11); greutatea (g) a eantionului.

6.2. 6.2.1.

Calcularea titrrii n conformitate cu punctul 5.3.2 Titrare cu acid clorhidric Coninutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculeaz conform urmtoarei formule: V1 V0 c 1,4 6,25 m unde: m c V0 V1 = = = = greutatea (g) a prii de testat; concentraia (mol/l) a soluiei volumetrice standard de acid clorhidric (3.19); volumul (n ml) de acid clorhidric utilizat n testul martor; volumul (n ml) de acid clorhidric utilizat n partea de testat.

6.2.2.

Titrare cu acid sulfuric Coninutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculeaz conform urmtoarei formule: V1 V0 c 2,8 6,25 m unde: m c V0 V1 = = = = greutatea (g) a prii de testat; concentraia (mol/l) a soluiei volumetrice standard de acid sulfuric (3.6); volumul (n ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat n testul martor; volumul (n ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat n testul martor.

26.2.20097. 7.1.

ROVerificarea metodei Repetabilitate

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/19

Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu trebuie s depeasc: 0,2 % n valoare absolut, pentru un coninut de proteine brute mai mic de 20 %; 1 % relativ la valoarea mai mare, pentru un coninut de proteine brute cuprins ntre 20 i 40 %; 0,4 % n valoare absolut, pentru un coninut de proteine brute mai mare de 40 %.

7.2.

Acurateea Analiza (dizolvare, distilare i titrare) se efectueaz pe 1,5-2 g acetanilid (3.13), n prezena a 1 g zaharoz (3.14); 1 g de acetanilid consum 14,8 ml de acid sulfuric (3.5). Recuperarea trebuie s fie de cel puin 99 %.

8. 8.1.

Observaii Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dac aparatura necesit un transfer ntre etapele de dizolvare i distilare, acest transfer trebuie realizat fr pierderi. Dac vasul aparatului de distilare nu este prevzut cu o plnie de picurare, se adaug hidroxidul de sodiu imediat nainte de conectarea vasului la condensator, turnnd ncet lichidul pe marginea vasului. Dac produsul de dizolvare se solidific, se rencepe determinarea folosind o cantitate mai mare de acid sulfuric (3.4) dect cea menionat anterior. Pentru produsele cu coninut sczut de azot, volumul de acidul sulfuric (3.7) care trebuie introdus n vasul de colectare poate fi redus, dac este cazul, la 10 sau 15 ml i completat pn la 25 ml cu ap. Pentru analizele curente, n vederea determinrii coninutului de proteine brute se pot aplica metode alternative de analiz, dar metoda Kjeldahl descris n prezenta parte C este metoda de referin. Echivalena dintre rezultatele obinute cu metoda alternativ (de exemplu DUMAS) i cele obinute prin metoda de referin trebuie demonstrat pentru fiecare matrice n mod individual. ntruct rezultatele obinute cu o metod alternativ, chiar i dup verificarea echivalenei, pot devia uor fa de rezultatele obinute cu metoda de referin, este necesar a meniona n raportul analitic metoda de analiz utilizat pentru determinarea coninutului de proteine brute.

8.2.

8.3.

8.4.

D. 1.

DETERMINAREA UREEI

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinarea coninutului de uree din furaje.

2.

Principiu Eantionul este pus n suspensie n ap, n care s-a adugat un produs de limpezire. Suspensia se filtreaz. Coninutul n uree al filtratului este determinat dup adugarea de 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB), prin msurarea densitii optice la o lungime de und de 420 nm.

3. 3.1.

Reactivi Soluie de 4-dimetilaminobenzaldehid: se dizolv 1,6 g de 4-DMAB n 100 ml de etanol 96 % i se adaug 10 ml de acid clorhidric (20 1,19 g/ml). Acest reactiv se conserv timp de maximum dou sptmni. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)22H2O i 3 g de acid acetic glacial n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu, K4Fe(CN)63H2O n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. Crbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).

3.2.

3.3.

3.4.

L 54/203.5.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Uree, soluie 0,1 % (greutate/volum).

4. 4.1. 4.2. 4.3.

Aparatur Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm. Eprubete: 160 16 mm cu dopuri de sticl lefuit. Spectrofotometru.

5. 5.1.

Procedur Analiza eantionului Se cntresc 2 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 1 g de crbune activ (3.4) ntr-un balon gradat de 500 ml. Se adaug 400 ml de ap i 5 ml de soluie Carrez I (3.2), se amestec timp de aproximativ 30 secunde i se adaug 5 ml de soluie Carrez II (3.3). Se amestec timp de treizeci de minute n agitator. Se completeaz volumul cu ap, se agit i se filtreaz. Se ndeprteaz 5 ml de filtrat transparent i incolor, se introduc n eprubete cu dop de sticl lefuit, se adaug 5 ml de soluie de 4-DMAB (3.1) i se amestec. Se introduc eprubetele ntr-o baie de ap la 20 oC ( 4 oC). Dup cincisprezece minute se msoar densitatea optic a soluiei de eantion cu spectrofotometrul la 420 nm. Se compar cu soluia de reactivi pentru testul martor.

5.2.

Curba de calibrare Se ndeprteaz volume de 1, 2, 4, 5 i 10 ml din soluia de uree (3.5), se introduc n baloanele gradate de 100 ml i se completeaz volumul cu ap. Se ndeprteaz 5 ml din fiecare soluie, se adaug n fiecare 5 ml de soluie 4-DMAB (3.1), se omogenizeaz i se msoar densitatea optic conform indicaiilor de mai sus cu o soluie martor care conine 5 ml de 4-DMAB i 5 ml de ap n care nu exist uree. Se traseaz curba de calibrare.

6.

Calculul rezultatelor Se determin cantitatea de uree din eantion cu ajutorul curbei de calibrare. Se exprim rezultatul ca procent din eantion.

7. 7.1.

Observaii n cazul unui coninut de uree care depete 3 %, se reduce greutatea eantionului la 1 g sau se dilueaz soluia iniial astfel nct s nu fie mai mult de 50 mg de uree n 500 ml. n cazul unui coninut mic n uree, se crete greutatea eantionului atta timp ct filtratul rmne transparent i incolor. Dac eantionul conine compui de azot simpli cum ar fi aminoacizii, densitatea optic se msoar la 435 nm.

7.2.

7.3.

E.

DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE I. PRIN MICRODIFUZIE

1.

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinare coninutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, din furaje.

2.

Principiu Eantionul este supus extraciei cu ap, iar soluia este limpezit i filtrat. Bazele azotate volatile sunt dislocate prin microdifuzie cu ajutorul unei soluii de carbonat de potasiu, colectate ntr-o soluie de acid boric i titrate cu acid sulfuric.

26.2.20093. 3.1. 3.2.

ROReactivi

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/21

Acid tricloracetic, soluie 20 % (greutate/volum). Indicator: se dizolv 33 mg de verde de bromocrezol i 65 mg de rou de metil n 100 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v). Soluie de acid boric: ntr-un balon gradat de 1 l se dizolv 10 g de acid boric n 200 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v) i 700 ml de ap. Se adaug 10 ml de indicator (3.2). Se amestec i, dac este necesar, se ajusteaz coloraia soluiei la rou deschis prin adugarea unei soluii de hidroxid de sodiu. 1 ml din aceast soluie permite fixarea a maximum 300 g de NH3. Soluie saturat de carbonat de potasiu: se dizolv 100 g de carbonat de sodiu n 100 ml de ap la temperatura de fierbere. Se las s se rceasc i se filtreaz. Acid sulfuric 0,01 mol/litru.

3.3.

3.4.

3.5.

4. 4.1. 4.2. 4.3.

Aparatur Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm. Celule Conway (a se vedea diagrama) din sticl sau din material plastic. Microbiurete gradate la 1/100 ml.

5.

Procedur Se cntresc 10 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 100 ml de ap ntr-un balon gradat de 200 ml. Se amestec sau se agit n agitator timp de 30 de minute. Se adaug 50 ml de soluie de acid tricloracetic (3.1), se completeaz volumul cu ap, se agit cu putere i se filtreaz printr-un un filtru cutat. Cu ajutorul unei pipete se introduce 1 ml de soluie de acid boric (3.3) n partea central a celulei Conway i 1 ml de filtrat de eantion n coroana celulei. Se acoper parial cu ajutorul unui capac lubrifiat. Se picur cu rapiditate 1 ml de soluie saturat de carbonat de potasiu (3.4) n coroan i se nchide capacul astfel nct celula este ermetizat. Se ntoarce celula cu precauie, rotind-o n plan orizontal, astfel nct cei doi reactivi se amestec. Se las la incubat fie timp de cel puin patru ore la temperatura camerei, fie timp de o or la 40 oC. Cu ajutorul unei microbiurete (4.3), se titreaz bazele volatile din soluia de acid boric cu acid sulfuric (3.5). Se efectueaz un test martor aplicnd aceeai procedur, dar fr a analiza un eantion.

6.

Calculul rezultatelor 1 ml de H2SO4 0,01 mol/litru corespunde la 0,34 mg de amoniac. Se exprim rezultatul ca procent din eantion. Repetabilitate Diferena dintre rezultatele obinute n dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu depete: 10 %, n valoare relativ, pentru un coninut n amoniac mai mic de 1 %; 0,1 %, n valoare absolut, pentru un coninut n amoniac de 1 % sau mai mare.

7.

Observaie Dac coninutul n amoniac al eantionului depete 0,6 %, se dilueaz filtratul iniial.

L 54/22

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii EuropeneCELULA CONWAY Scara 1/1

26.2.2009

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii EuropeneII. PRIN DISTILARE

L 54/23

1.

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinarea coninutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, a finii din pete care practic nu conine deloc uree. Ea este aplicabil doar n cazul unui coninut n amoniac mai mic de 0,25 %.

2.

Principiu Eantionul este supus extraciei cu ap, iar soluia este limpezit i filtrat. Bazele azotate volatile sunt dislocate la punctul de fierbere prin adugare de oxid de magneziu i colectate ntr-o cantitate determinat de acid sulfuric, al crui exces este retitrat cu o soluie de hidroxid de sodiu.

3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 4. 4.1. 4.2. 5.

Reactivi Acid tricloracetic, soluie 20 % (greutate/volum). Oxid de magneziu. Emulsie antispumant (de exemplu, silicon). Acid sulfuric 0,05 mol/litru. Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru. Soluie de rou de metil 0,3 % n etanol 95-96 % (v/v). Aparatur Mixer (agitator): aproximativ 35-40 de rpm. Aparat de distilat de tip Kjeldahl. Procedur Se cntresc 10 g de eantion cu abatere de 1 mg i se introduc mpreun cu 100 ml de ap ntr-un balon gradat de 200 ml. Se amestec sau se agit n agitator timp de 30 de minute. Se adaug 50 ml de soluie de acid tricloracetic (3.1), se completeaz volumul cu ap, se agit cu putere i se filtreaz printr-un un filtru cutat. Se preleveaz o cantitate de filtrat limpede adecvat pentru coninutul n baze azotate volatile presupus (100 ml este de obicei suficient). Se dilueaz la 200 ml i se adaug 2 g de oxid de magneziu (3.2), precum i cteva picturi de emulsie antispumant (3.3). Soluia trebuie s fie alcalin la testul cu turnesol; dac nu este, se adaug oxid de magneziu (3.2). Se continu ca la punctul 5.2 i 5.3 al metodei de analiz pentru determinarea coninutului de proteine brute (partea C a prezentei anexe). Se efectueaz un test martor aplicnd aceeai procedur, dar fr a analiza un eantion.

6.

Calculul rezultatelor 1 ml de H2SO4 0,05 mol/litru corespunde la 1,7 mg de amoniac. Se exprim rezultatul ca procent din eantion. Repetabilitate Diferena dintre rezultatele obinute n dou determinri paralele efectuate pe acelai eantion nu depete, n valoare relativ, 10 % amoniac.

F. 1.

DETERMINAREA AMINOACIZILOR (CU EXCEPIA TRIPTOFANULUI)

Obiectiv i domeniu de aplicare Aceast metod permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici i naturali) i totali (legai n peptide i liberi) din furaje, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este aplicabil urmtorilor aminoacizi: cist(e)in, metionin,

L 54/24

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

lizin, treonin, alanin, arginin, acid aspartic, acid glutamic, glicin, histidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin i valin. Metoda nu deosebete srurile aminoacizilor i nu permite diferenierea ntre formele D i L ale aminoacizilor. Ea nu este valabil pentru determinarea triptofanului sau a analogilor hidroxilai ai aminoacizilor.

2. 2.1.

Principiu Aminoacizi liberi Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate coextrase se precipit cu acid sulfosalicilic i se ndeprteaz prin filtrare. Soluia filtrat se ajusteaz la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separ prin cromatografie cu schimb de ioni i se determin prin reacie cu ninhidrin cu detecie fotometric la 570 nm.

2.2.

Aminoacizi totali Procedura aleas depinde de aminoacizii care sunt analizai. Cist(e)ina i metionina trebuie oxidate la acid cisteic i, respectiv, metionin sulfon nainte de hidroliz. Tirozina trebuie determinat n hidrolizate de eantioane neoxidate. Toi ceilali aminoacizi enumerai la punctul 1 se pot determina fie n eantionul oxidat, fie n eantionul neoxidat. Oxidarea se realizeaz la 0 oC cu ajutorul unui amestec de acid performic i fenol. Reactivul de oxidare n exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eantionul oxidat sau neoxidat se hidrolizeaz cu acid clorhidric (3.20) timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajusteaz la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separ prin cromatografie cu schimb de ioni i se determin prin reacie cu ninhidrin folosind detecia fotometric la 570 nm (440 nm pentru prolin).

3.

Reactivi Trebuie utilizat ap dublu distilat sau ap de calitate echivalent (conductivitate < 10 S).

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. 3.12. 3.13. 3.14. 3.15.

Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30 %. Acid formic, g (g/g) = 98-100 %. Fenol. Disulfit de sodiu. Hidroxid de sodiu. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat. Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml. Citrat trisodic dihidrat. 2,2'-tiodietanol (tiodiglicol). Clorur de sodiu. Ninhidrin. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC. Norleucin sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern. Azot, gaz (< 10 ppm oxigen). 1-octanol.

26.2.20093.16. 3.16.1.

ROAminoacizi.

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/25

Substane standard enumerate la punctul 1. Compui puri care nu conin deloc ap de cristalizare. nainte de utilizare, se usuc n vid cu ajutorul P2O5 sau al H2SO4, timp de 1 sptmn. Acid cisteic. Metionin sulfon. Soluie de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l Se dizolv 300 g de NaOH (3.5) n ap i se completeaz pn la 1 litru.

3.16.2. 3.16.3. 3.17.

3.18.

Soluie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l Se dizolv 40 g de NaOH (3.5) n ap i se completeaz pn la 1 litru.

3.19.

Soluie de acid formic-fenol: Se amestec 889 g de acid formic (3.2) cu 111 g de ap i se adaug 4,73 g de fenol (3.3).

3.20.

Mixtur de hidroliz, c = 6 mol HCl/l coninnd 1 g de fenol/l: Se adaug 1 g de fenol (3.3) la 492 ml de HCl (3.7) i se completeaz cu ap pn la 1 litru.

3.21.

Mixtur de extracie, c = 0,1 mol HCl/l coninnd 2 % tiodiglicol: se iau 8,2 ml de HCl (3.7), se dilueaz cu aproximativ 900 ml de ap, se adaug 20 ml de tiodiglicol (3.9) i se completeaz cu ap pn la 1 litru (nu se amestec direct 3.7 i 3.9). Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, = 6 %: se dizolv 60 g de acid 5-sulfosalicilic (3.6) n ap i se completeaz cu ap pn la 1 litru.

3.22.

3.23.

Mixtur de oxidare (acid performic-fenol): Se amestec 0,5 ml de peroxid de hidrogen (3.1) cu 4,5 ml soluie de acid formic-fenol (3.19) ntr-un mic pahar de laborator. Se incubeaz la 20-30 oC timp de 1 or pentru a se forma acid performic, apoi se rcete n baie de ap cu ghea (15 minute) nainte de a se aduga la eantion. Atenie: a se evita contactul cu pielea i a se purta mbrcminte protectoare.

3.24.

Soluie tampon de citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,2: Se dizolv 19,61 g de citrat de sodiu (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) i 16,5 ml de HCl (3.7) n aproximativ 800 ml de ap. Se ajusteaz pH-ul la 2,2. Se completeaz cu ap pn la 1 litru.

3.25. 3.26. 3.27. 3.27.1.

Soluii tampon de eluie, preparate n conformitate cu condiiile pentru analizorul utilizat (4.9). Reactiv ninhidrin, preparat n conformitate cu condiiile pentru analizorul utilizat (4.9). Soluii etalon de aminoacizi. Aceste soluii se pstreaz la o temperatur sub 5 oC. Soluie etalon stoc de aminoacizi (3.16.1). c = 2,5 mol/ml pentru fiecare, n acid clorhidric. Se pot obine din surse comerciale.

3.27.2.

Soluie etalon stoc de acid cisteic i metionin sulfon, c = 1,25 mol/ml. Se dizolv 0,2115 g de acid cisteic (3.16.2) i 0,2265 g de metionin sulfon (3.16.3) n soluie tampon de citrat (3.24) ntr-un balon gradat de 1 litru i se completeaz pn la semn cu soluie tampon de citrat. Se pstreaz la o temperatur sub 5 oC, nu mai mult de 12 luni. Aceast soluie nu se utilizeaz dac soluia etalon stoc (3.27.1) conine acid cisteic i metionin sulfon.

L 54/263.27.3.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Soluie etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucin, c = 20 mol/ml. Se dizolv 0,656 g de norleucin (3.13) n soluie tampon de citrat (3.24) ntr-un balon gradat i se completeaz cu soluie tampon de citrat pn la 250 ml. Se pstreaz la o temperatur sub 5 oC, nu mai mult de 6 luni.

3.27.4.

Soluie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 l de acid cisteic i metionin sulfon i c = 10 nmol/50 l din ceilali aminoacizi. Se dizolv 2,2 g de clorur de sodiu (3.10) ntr-un pahar de laborator de 100 ml care conine 30 ml soluie tampon de citrat (3.24). Se adaug 4 ml de soluie etalon stoc de aminoacizi (3.27.1), 4 ml soluie etalon stoc de acid cisteic i metionin sulfon (3.27.2) i 0,5 ml soluie etalon stoc de etalon intern (3.27.3), dac este cazul. Se ajusteaz pH-ul la valoarea 2,2 cu hidroxid de sodiu (3.18). Se transfer cantitativ ntr-un balon gradat de 50 ml, se completeaz pn la semn cu soluie tampon de citrat (3.24) i se amestec. Se pstreaz la o temperatur sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni. A se vedea i observaia de la punctul 9.1.

3.27.5.

Soluie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate preparat n conformitate cu punctul 5.3.3.1 i pentru utilizare cu extracte (5.2). Soluia de calibrare se prepar n conformitate cu 3.27.4 dar omind clorura de sodiu. Se pstreaz la o temperatur sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni.

4. 4.1. 4.2.

Aparatur Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux. Sticl din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu cptueal de cauciuc/teflon (de exemplu, Duran, Schott) pentru utilizare n cuptor. Cuptor cu ventilaie forat i un regulator de temperatur cu precizie mai mare de 2 oC. pH-metru (cu trei zecimale). Filtru cu membran (0,22 m). Centrifug. Evaporator rotativ cu vid. Agitator mecanic sau magnetic. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloan schimbtoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrin, derivare post-coloan i detector fotometric. Coloana este umplut cu rini de polistiren sulfonat capabile s separe aminoacizii unul de altul, precum i de materiale care conin ninhidrin. Fluxul din liniile cu soluie tampon i ninhidrin este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de 0,5 % n perioada care include att funcionarea n vederea calibrrii standardului, ct i analiza eantionului. n cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare n care hidrolizatul are o concentraie de sodiu de c = 0,8 mol/l i conine ntreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare. Ali analizori nu ofer o separare satisfctoare a anumitor aminoacizi dac hidrolizatul conine exces de acid formic i/sau concentraii mari de ioni de sodiu. n acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml dup hidroliz i nainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatur maxim de 40 oC.

4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9.

5. 5.1.

Procedur Prepararea eantionului Se macin eantionul astfel nct poate trece printr-o sit cu ochiuri de 0,5 mm. Eantioanele cu un coninut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer, la o temperatur de maximum 50 oC, fie liofilizate nainte de mcinare. Eantioanele cu un coninut ridicat de substane grase se extrag cu eter de petrol (3.12) nainte de mcinare.

26.2.20095.2.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/27

Determinarea aminoacizilor liberi n furaje i n premixuri Se cntrete cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvat (1-5 g) din eantionul preparat (5.1), ntr-un flacon tip Erlenmeyer i se adaug 100 ml de extract de mixtur (3.21). Se agit mixtura timp de 60 minute cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.8). Se las s se decanteze sedimentul i se pipeteaz 10 ml din soluia supernatant ntr-un pahar de laborator de 100 ml. Se adaug 5 ml de soluie de acid sulfosalicilic (3.22) n cursul agitrii i se continu agitarea cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtreaz sau se centrifugheaz supernatantul pentru a se ndeprta orice precipitat. Se introduc 10 ml din soluia rezultat ntr-un pahar de laborator de 100 ml i se ajusteaz pH-ul la valoarea de 2,2 cu ajutorul soluiei de hidroxid de sodiu (3.18), se transfer ntr-un balon gradat de volum adecvat utilizndu-se soluie tampon de citrat (3.24) i se completeaz pn la semn cu soluia tampon (3.24). Dac se utilizeaz etalon intern, se adaug 1 ml de etalon intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml de soluie final i se completeaz pn la semn cu soluie tampon (3.24). Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4. Dac extractele nu se examineaz n aceeai zi, trebuie pstrate la o temperatur sub 5 oC.

5.3. 5.3.1.

Determinarea coninutului total n aminoacizi Oxidare Se cntresc cu o abatere de 0,2 mg ntre 0,1 i 1 g de eantion preparat (5.1) ntr-un (ntr-o): balon cu fund rotund de 100 ml (4.1) pentru hidroliz n mediu deschis (5.3.2.3); sau balon cu fund rotund de 250 ml (4.1) dac este necesar o concentraie mic de sodiu (5.3.3.1); sau sticl de 100 ml dotat cu un dop filetat (4.2) pentru hidroliz n mediu nchis (5.3.2.4).

Poria de eantion cntrit are un coninut de azot de aproximativ 10 mg i un coninut de umiditate de maximum 100 mg. Se introduce balonul/sticla ntr-o baie de ap cu ghea i se rcete la 0 oC, se adaug 5 ml de mixtur de oxidare (3.23) i se amestec cu ajutorul unei spatule de sticl cu vrf ncovoiat. Se etaneizeaz balonul/sticla coninnd spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce baia de ap cu ghea coninnd recipientul etaneizat ntr-un frigider la 0 oC i se las timp de 16 ore. Dup 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune prin adugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu (3.4). Se trece la 5.3.2.1. 5.3.2. 5.3.2.1. Hidroliza Hidroliza eantioanelor oxidate La eantioanele oxidate preparate n conformitate cu punctul 5.3.1 se adaug 25 ml de mixtur hidrolizat (3.20) avnd grij s se spele orice reziduu de eantion de pe pereii vasului i de pe spatul. n funcie de procedura de hidrolizare utilizat, se trece la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hidroliza eantioanelor neoxidate Se cntresc 0,1-1 g de eantion preparat (5.1), cu o abatere de 0,2 mg, fie ntr-un balon cu fund rotund de 100 ml sau 250 ml (4.1), fie ntr-o sticl de 100 ml dotat cu dop filetat (4.2). Poria de eantion cntrit trebuie s aib un coninut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaug cu grij 25 ml de mixtur hidrolizat (3.20) i se amestec cu eantionul. Se procedeaz ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4. 5.3.2.3. Hidroliza n mediu deschis Se adaug 3 mrgele de sticl n mixtura din balon (preparat conform meniunilor de la punctul 5.3.2.1 sau 5.3.2.2) i se fierbe n clocot continuu sub reflux timp de 23 de ore. La ncheierea hidrolizei, se spal condensatorul cu 5 ml de soluie tampon de citrat (3.24). Se deconecteaz balonul i se rcete ntr-o baie de ap cu ghea. Se procedeaz ca la punctul 5.3.3.

L 54/285.3.2.4.

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Hidroliza n mediu nchis Sticla coninnd mixtura preparat conform punctului 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 se introduce n cuptor (4.3) la 110 oC. n timpul primei ore, pentru a se preveni o cretere progresiv a presiunii (datorat expansiunii substanelor gazoase) i pentru a se evita o explozie, se plaseaz dopul filetat la nivelul extremitii superioare a vasului. A nu se nchide vasul cu dopul respectiv. Dup o or, se nchide vasul cu dopul respectiv i se las n cuptor (4.3) timp de 23 de ore. La ncheierea hidrolizei, se ndeprteaz sticla din cuptor, se scoate cu grij dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce ntr-o baie de ap cu ghea. Se las s se rceasc. n funcie de procedura de ajustare a pH-ului (5.3.3), se transfer cantitativ coninutul sticlei ntr-un pahar de laborator de 250 de ml sau ntr-un balon cu fund rotund, utiliznd soluie tampon de citrat (3.24). Se procedeaz ca la punctul 5.3.3.

5.3.3.

Ajustarea pH-ului n funcie de tolerana la sodiu a analizorului de aminoacizi (4.9), pentru ajustarea pH-ului se procedeaz ca la punctul 5.3.3.1 sau 5.3.3.2.

5.3.3.1.

Pentr u sistemele cromatog rafice (4.9) necesitnd o concentraie de sodiu mic Este recomandabil s se utilizeze o soluie etalon stoc intern (3.27.3) n cazul n care se folosesc analizori de aminoacizi necesitnd o concentraie mic de sodiu (n cazul n care volumul de acid trebuie redus). n acest caz, la hidrolizat se adaug 2 ml de soluie etalon stoc intern (3.27.3) nainte de evaporare. La hidrolizatul obinut conform punctului 5.3.2.3 sau 5.2.3.4 se adaug 2 picturi de 1-octanol (3.15). Utiliznd un evaporator rotativ (4.7) se reduce volumul la 5-10 ml n condiii de vid la 40 oC. Dac volumul este redus accidental la mai puin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar analiza trebuie repetat. Se ajusteaz pH-ul la 2,2 cu ajutorul soluiei de hidroxid de sodiu (3.18) i se procedeaz ca la punctul 5.3.4.

5.3.3.2.

Pentr u toi ceilali analizori de aminoacizi (4.9) Hidrolizatele obinute ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 se neutralizeaz parial prin adugarea cu grij, n condiii de agitare continu, a 17 ml de soluie de hidroxid de sodiu (3.17), asigurndu-se c temperatura este meninut sub 40 oC. Se ajusteaz pH-ul la valoarea de 2,2 la temperatura camerei prin utilizarea soluiei de hidroxid de sodiu (3.17) i n cele din urm a soluiei de hidroxid de sodiu (3.18) Se trece la punctul 5.3.4.

5.3.4.

Soluia de eantion pentru cromatografie Se transfer cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat (5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu soluie tampon de citrat (3.24) ntr-un balon gradat de 200 ml i se completeaz pn la semn cu soluie tampon (3.24). Dac nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaug 2 ml de etalon intern (3.27.3) i se completeaz pn la semn cu soluie tampon de citrat (3.24). Se amestec minuios. Se trece la etapa cromatografic (5.4). Dac soluiile de eantion nu se examineaz n aceeai zi, ele se pstreaz la o temperatur sub 5 oC.

5.4.

Cromatografia nainte de cromatografie se aduce extractul (5.2) sau hidrolizatul (5.3.4) la temperatura camerei. Se agit mixtura i se filtreaz o cantitate potrivit printr-un filtru cu membran cu orificii de 0,22 m (4.5). Soluia limpede rezultat se supune cromatografiei prin schimb ionic, utiliznd un analizor de aminoacizi (4.9). Injectarea poate fi efectuat manual sau automat. Este important ca aceeai cantitate de soluie 0,5 % s fie adugat n coloan pentru analizarea etaloanelor i a eantioanelor cu excepia situaiilor n care se utilizeaz un etalon intern i ca raporturile sodiu:aminoacizi n soluiile de etalon i n cele de eantion s fie ct mai similare posibil.

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/29

n general, frecvena manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului ninhidrin i a sistemului analitic. Etalonul sau eantionul se dilueaz cu soluie tampon de citrat (3.24) pentru a genera o arie a vrfului pentru etalon de 30-200 % din aria vrfului pentru eantionul de aminoacid. Cromatografia aminoacizilor va varia uor n funcie de tipul analizorului i de rina utilizate. Sistemul ales trebuie s fie capabil s separe aminoacizii unul de altul, precum i de materiale care conin ninhidrin. n cursul operaiilor, sistemul cromatografic genereaz un rspuns linear la modificrile cantitilor de aminoacizi adugai la coloan. n cursul etapei cromatografice se aplic rapoartele nlimii corespunztoare punctului minim:vrfului menionate mai jos, n cazul n care se analizeaz o soluie echimolar (de aminoacizi analizai). Aceast soluie echimolar trebuie s conin cel puin 30 % din cantitatea maxim de aminoacizi care poate fi msurat cu precizie cu ajutorul sistemului analizor de aminoacizi (4.9). Pentru separarea treoninei-serinei, n cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul punct minim/vrf corespunztor aminoacidului situat mai jos pe cromatogram nu trebuie s depeasc 2:10. [dac se determin doar cist(e)ina, metionina, treonina i lizina, separarea insuficient a vrfurilor nvecinate va influena n mod negativ determinarea]. Pentru toi ceilali aminoacizi, separarea trebuie s fie mai bun de 1:10. Sistemul trebuie s asigure c lizina se separ de artefactele de lizin i de ornitin.

6.

Calculul rezultatelor Aria vrfului pentru eantion i etalon se msoar pentru fiecare aminoacid n parte, iar cantitatea (X) se msoar n g de aminoacid per kg de eantion. AcMV B m 1 000 D C

X=

Dac se utilizeaz un etalon intern se multiplic cu: A = aria vrfului, hidrolizat sau extract; B = aria vrfului, soluia etalon de calibrare;

C = aria vrfului, etalon intern n hidrolizat sau extract; D = aria vrfului, etalon intern, soluia etalon de calibrare; M = greutatea molar a aminoacidului determinat; c = concentraia de standard n mol/ml; m = greutatea eantionului (g) (corectat pentru a obine greutatea original dac produsul este uscat sau degresat); V = total hidrolizat n ml (5.3.4) sau volumul de diluie total calculat pentru extract, n ml (6.1). Cistina i cisteina se determin amndou ca acid cisteic n hidrolizate de eantion oxidat, dar se calculeaz ca cistin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol (= 0,5 240,30 g/mol). Metionina se determin ca metionin sulfon n hidrolizate de eantion oxidat, dar se calculeaz ca metionin folosind M pentru metionin: 149,21 g/mol. Metionina liber adugat se determin dup extracie ca metionin, pentru calculare folosindu-se aceeai M. 6.1. Volumul total de diluie al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor liberi (5.2) se calculeaz dup cum urmeaz: 100 ml 10 ml 5 ml V 10 ml 10

F=

V = volumul extractului final.

L 54/307.

ROEvaluarea metodei

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Metoda a fost testat prin comparaii la nivel internaional n 1990 utiliznd patru furaje diferite (furaj mixt pentru porc, mixtur pentru pui de carne, concentrat proteic, premixuri). Rezultatele, dup eliminarea valorilor extreme, exprimate ca medie i deviaie standard sunt prezentate n tabelele de la acest punct:

Medii n g/kgAminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Material de referin

Furaj mixt pentru porci Compoziie pentru pui de carne Concentrat proteic Premixurin = numr de laboratoare participante.

6,94 n = 15 9,31 n = 16 22,32 n = 16 58,42 n = 16

3,01 n = 17 3,92 n = 18 5,06 n = 17

3,27 n = 17 5,08 n = 18 12,01 n = 17 90,21 n = 16

9,55 n = 13 13,93 n = 16 47,74 n = 15 98,03 n = 16

7.1.

Repetabilitate

Repetabilitatea exprimat ca deviaie standard intra-laborator a comparaiei ntre laboratoare menionat mai sus este redat n tabelele de mai jos:

Deviaia standard intra-laborator (Sr) n g/kgAminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Material de referin

Furaj mixt pentru porci Compoziie pentru pui de carne Concentrat proteic Premixurin = numr de laboratoare participante.

0,13 n = 15 0,20 n = 16 0,48 n = 16 1,30 n = 16

0,10 n = 17 0,11 n = 18 0,13 n = 17

0,11 n = 17 0,16 n = 18 0,27 n = 17 2,19 n = 16

0,26 n = 13 0,28 n = 16 0,99 n = 15 2,06 n = 16

Coeficient de variaie (%) al deviaiei standard intra-laborator (Sr)Aminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Material de referin

Furaj mixt pentru porci Compoziie pentru pui de carne Concentrat proteic

1,9 n = 15 2,1 n = 16 2,7 n = 16

3,3 n = 17 2,8 n = 18 2,6 n = 17

3,4 n = 17 3,1 n = 18 2,2 n = 17

2,8 n = 13 2,1 n = 16 2,4 n = 15

26.2.2009

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/31

Material de referin

Aminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Premixuri

2,2 n = 16

2,4 n = 16

2,1 n = 16

n = numr de laboratoare participante.

7.2

Reproductibilitate Rezultatele pentru deviaia standard inter-laboratoare pentru comparaia ntre laboratoare menionat mai sus sunt prezentate n tabelul de mai jos:

Deviaia standard inter-laboratoare (SR) n g/kgAminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Material de referin

Furaj mixt pentru porci Compoziie pentru pui de carne Concentrat proteic Premixurin = numr de laboratoare participante.

0,28 n = 15 0,48 n = 16 0,85 n = 16 2,49 n = 16

0,30 n = 17 0,34 n = 18 0,62 n = 17

0,23 n = 17 0,55 n = 18 1,57 n = 17 6,20 n = 16

0,30 n = 13 0,75 n = 16 1,24 n = 15 6,62 n = 16

Coeficient de variaie (%) al deviaiei standard inter-laboratoare (SR)Aminoacid Treonin Cist(e)in Metionin Lizin

Material de referin

Furaj mixt pentru porc Compoziie pentru pui de carne Concentrat proteic Premixurin = numr de laboratoare participante.

4,1 n = 15 5,2 n = 16 3,8 n = 16 4,3 n = 16

9,9 n = 17 8,8 n = 18 12,3 n = 17

7,0 n = 17 10,9 n = 18 13,0 n = 17 6,9 n = 16

3,2 n = 13 5,4 n = 16 3,0 n = 15 6,7 n = 16

8.

Utilizarea materialelor de referin Aplicarea corect a metodei se verific prin repetarea msurtorilor pentru materialele de referin certificate, atunci cnd acestea sunt disponibile. Se recomand calibrarea cu soluie de calibrare pentru aminoacid certificat.

9. 9.1.

Observaii Din cauza diferenelor dintre analizorii de aminoacizi, concentraiile finale ale soluiilor de calibrare pentru aminoacizii standard (a se vedea 3.27.4 i 3.27.5) i pentru hidrolizat (vezi 5.3.4) se consider orientative.

L 54/32

RO

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

26.2.2009

Intervalul rspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toi aminoacizii. Soluia etalon se dilueaz cu soluie tampon de citrat pentru a genera arii de vrf situate la mijlocul intervalului. 9.2. n cazul n care pentru analizarea hidrolizatelor se folosete aparatur de cromatografie lichid de nalt performan, condiiile experimentale trebuie optimizate n conformitate cu recomandrile fabricantului. Prin aplicarea metodei la furajele care conin peste 1 % clorur (concentrat, furaje minerale, furaje suplimentare) poate aprea o subestimare a metioninei, ceea ce necesit un tratament special.

9.3.

G. 1.

DETERMINAREA TRIPTOFANULUI

Obiectiv i domeniu de aplicare Metoda permite determinarea n furaje a triptofanului total i liber. Ea nu face distincie ntre formele D i L.

2.

Principiu Pentru determinarea triptofanului total, eantionul se hidrolizeaz n mediu bazic cu o soluie de hidroxid de bariu saturat i se nclzete la 110 oC timp de 20 de ore. Dup hidroliz, se adaug etalon intern. Pentru determinarea triptofanului liber, eantionul se extrage n mediu uor acid n prezena etalonului intern. Triptofanul i etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determin prin HPLC prin detectarea fluorescenei.

3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

Reactivi Se utilizeaz ap dublu distilat sau ap de calitate echivalent (conductivitate < 10 S/cm). Substan etalon: triptofan (puritate/coninut 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic. Substan etalon intern: -metil-triptofan (puritate/coninut 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic. Hidroxid de bariu octahidratat (se evit expunerea excesiv la aer a Ba(OH)2 8 H2O pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba determinarea) (a se vedea observaia de la punctul 9.3). Hidroxid de sodiu. Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %. Acid clorhidric, 20 1,19 g/ml. Metanol, de calitate HPLC. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC. Soluie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l: Se dizolv 40 g de NaOH (3.5) n ap i se completeaz pn la 1 litru cu ap (3.1).

3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10.

3.11.

Acid clorhidric, c = 6 mol/l: Se iau 492 ml HCl (3.7) i se completeaz pn la 1 litru cu ap.

26.2.20093.12.

ROAcid clorhidric, c = 1 mol/l:

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

L 54/33

Se iau 82 ml HCl (3.7) i se completeaz pn la 1 litru cu ap. 3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l: Se iau 8,2 ml HCl (3.7) i se completeaz pn la 1 litru cu ap. 3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l: Se iau 34 ml de acid ortofosforic (3.6) i se completeaz pn la 1 litru cu ap (3.1). 3.15. Soluie concentrat de triptofan (3.2), c = 2,50 mol/ml: ntr-un balon gradat de 500 ml se dizolv 0,2553 g de triptofan (3.2) n acid clorhidric (3.13) i se completeaz pn la semn cu acid clorhidric (3.13). Se pstreaz la 18 oC timp de maximum 4 sptmni. 3.16. Soluie de etalon intern concentrat, c = 2,50 mol/ml: ntr-un balon gradat de 500 ml se dizolv 0,2728 g de -metil-triptofan (3.3) n acid clorhidric (3.13) i se completeaz pn la semn cu acid clorhidric (3.13). Se pstreaz la 18 oC timp de maximum 4 sptmni. 3.17. Soluie etalon de calibrare pentru triptofan i etalon intern: Se iau 2 ml din soluia concentrat de triptofan (3.15) i 2 ml din soluia concentrat de etalon intern (-metiltriptofan) (3.16). Se dilueaz cu ap (3.1) i metanol (3.8) pn se ajunge la un volum aproximativ egal i la aproximativ aceeai concentraie de metanol (10-30 %) ca i hidrolizatul final. Aceast soluie trebuie proaspt preparat nainte de fiecare utilizare. n timpul preparrii se protejeaz de lumina solar direct. 3.18. 3.19. 3.20. 3.21. 3.22. Acid acetic. 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol. Etanolamin g (g/g) > 98 %. 1 g de soluie de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (3.19) n 100 ml de metanol (3.8). Faz mobil pentru HPLC: 3 g de acid acetic (3.18) + 900 ml ap (3.1) + 50 ml soluie (3.21) de 1,1,1-triclor-2metil-2-propanol (3.19) n metanol (3.8) (1 g/100 ml). Se ajusteaz pH-ul la valoarea 5 cu ajutorul etanolaminei (3.20). Se completeaz pn la 1 000 ml cu ap (3.1).

4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8.

Aparatur Echipament de HPLC cu detector spectro

of 130

Embed Size (px)
Recommended