TRANSFERUL DE TRANSFERUL DE EMBRIONIEMBRIONI

Transferul embrionarTransferul embrionar reprezintă o metodă de intensivizare a reprezintă o metodă de intensivizare a reproducţiei constând în prelevarea unuia sau mai multor reproducţiei constând în prelevarea unuia sau mai multor embrioni din uterul femelelor donatoare, supuse în prealabil embrioni din uterul femelelor donatoare, supuse în prealabil superovulaţiei şi fecundaţiei, pentru a-i transplanta în uterul superovulaţiei şi fecundaţiei, pentru a-i transplanta în uterul femelelor receptoare a căror cicluri sexuale sunt sincronizate femelelor receptoare a căror cicluri sexuale sunt sincronizate cu ale donatoarelor.cu ale donatoarelor.

Transferul de embrioni Transferul de embrioni la animalele de fermă, parte la animalele de fermă, parte integrantă a marii familii a biotehnologiilor moderne la integrantă a marii familii a biotehnologiilor moderne la animale a cunoscut în ultimul deceniu o dezvoltare animale a cunoscut în ultimul deceniu o dezvoltare deosebită. Biotehnologiile aplicate pe embrionii de vacă s-au deosebită. Biotehnologiile aplicate pe embrionii de vacă s-au impus ca fiind o combinaţie a reproducţiei asistate la animale impus ca fiind o combinaţie a reproducţiei asistate la animale cu biotehnologiile celulare, moleculare şi genomice.cu biotehnologiile celulare, moleculare şi genomice.

Avantajele transferului de embrioniAvantajele transferului de embrioni

Asigurarea progresului genetic al raselor prin Asigurarea progresului genetic al raselor prin creşterea numărului genotipurilor valoroase.creşterea numărului genotipurilor valoroase.

Posibilitatea creării unor bănci de embrioni care să Posibilitatea creării unor bănci de embrioni care să asigure conservarea genofondului.asigure conservarea genofondului.

Oferă posibilitatea descifrării mecanismelor ce Oferă posibilitatea descifrării mecanismelor ce guvernează procesele biologice de bază.guvernează procesele biologice de bază.

Tehnicile embrio-transferului sunt implicate în Tehnicile embrio-transferului sunt implicate în biotehnologiile avangardiste, reprezentate de biotehnologiile avangardiste, reprezentate de clonare, obţinerea de animale transgenice, sexarea clonare, obţinerea de animale transgenice, sexarea embrionilor.embrionilor.

Selecţia donatoarelor de embrioniSelecţia donatoarelor de embrioni

Pentru a intra în programul de recoltare a embrionilor, Pentru a intra în programul de recoltare a embrionilor, selecţia donatoarelor selecţia donatoarelor se realizează pe baza anchetei se realizează pe baza anchetei ginecologice globale, a examenului clinic şi a examenului ginecologice globale, a examenului clinic şi a examenului transrectal individual. transrectal individual.

Rezultatele trebuie menţionate în Fişa de Observaţie Rezultatele trebuie menţionate în Fişa de Observaţie GinecologicăGinecologică

Fişa ginecologicăFişa ginecologică se întocmeşte individual şi stă la se întocmeşte individual şi stă la baza selecţiei donatoarelorbaza selecţiei donatoarelor

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară ANEXA 1

Facultatea de Medicină Veterinară

Clinica de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară Nume examinator

…….………………………

FIŞĂ GINECOLOGICĂ DE SELECŢIE A DONATOARELOR

Numele vacii……………………………nr. matricol……………….rasa…………………...

vârsta………………………proprietatea…………………….producţia…………………….

starea de întreţinere…………………………………………………………………………...

DATE ANAMNETICE ASUPRA PRODUCŢIEI

Nr.fătări anterioare………………………………..când a avut loc ultima fătare sau

avortul………………………………………………………………..cum a decurs (eutocic,

distocic, complicaţii)…………………………………………………………………………...

…………………………………………………………………………………………………..

eliminarea placentei…………………………………comportarea în puerperium………...

…………………………………………………………………………………………………..

De ce boli a suferit animalul………………………………………………………………….

Apariţia primului ciclu de călduri……………………………………………………………..

dacă se repetă…………..caracteristicile căldurilor (neregulate, liniştite, inaparente,

intense)…………………………………………………………………………………………

La al câtelea ciclu de călduri a fost poliovulată……………………..……………………..

Ce tratament de poliovulaţie s-a aplicat…………………………………………………….

EXAMENUL CLINIC EXTERN

Temperamentul……………………temperatura…………………pulsul şi caracterele

lui…………………respiraţia…………………..poziţia femelei……………………………..

Bazinul (dezvoltare şi conformaţie)………………………………………………………….

Organul genital extern (vulva) poziţia………………………pigmentaţia………………….

culoarea……………….infiltraţie……………………leziuni şi cicatrici…………………….

Dacă se observă scurgeri vaginale: cantitatea…………………….caracterul lor……….

pH-ul lor………………..examenul bacteriologic……………………………………………

Antibiograma…………………………………………………………………………………...

Leucograma……………………………………………………………………………………

INDUCEREA ŞI SINCRONIZAREA INDUCEREA ŞI SINCRONIZAREA ESTRUSULUI LAESTRUSULUI LA

1. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU GESTAGENI1. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU GESTAGENI

Această tehnică constă în Această tehnică constă în administrarea de steroizi cu administrarea de steroizi cu efect gestagenefect gestagen care inhibă estrul şi ovulaţia, realizând o care inhibă estrul şi ovulaţia, realizând o blocadă a secreţiei de hormoni hipofizari (feed-back blocadă a secreţiei de hormoni hipofizari (feed-back negativ – efect Rebound). negativ – efect Rebound).

Tratamentul Tratamentul are o durată de 11-13 zile, iar rezultatele are o durată de 11-13 zile, iar rezultatele cele mai bune se obţin atunci când se administrează un cele mai bune se obţin atunci când se administrează un estrogen la începutul tratamentului, având ca rezultat estrogen la începutul tratamentului, având ca rezultat regresia timpurie a corpului galben.regresia timpurie a corpului galben.

Durata tratamentului poate fi scurtată (7-9 zile) prin Durata tratamentului poate fi scurtată (7-9 zile) prin administrarea unei doze de prostaglandină la sfârşitul administrarea unei doze de prostaglandină la sfârşitul acestuia. acestuia.

Preparate utilizatePreparate utilizate::

Progesteron;Progesteron;

Gestageni sintetici:Gestageni sintetici:

CAP – chlormadinonacetat;CAP – chlormadinonacetat;

MAP – Medroxiprogesteronacetat;MAP – Medroxiprogesteronacetat;

Melengestrolacetat;Melengestrolacetat;

Norgestomet.Norgestomet.

Căi de administrareCăi de administrare::

Parenteral sub formă injectabilă;Parenteral sub formă injectabilă;

Intravaginal – spirale, bureţi, etc.;Intravaginal – spirale, bureţi, etc.;

Subcutanat – implante.Subcutanat – implante.

Tratamentul cu produse injectabileTratamentul cu produse injectabile poate fi poate fi eficient, însă este destul de incomod de realizat, eficient, însă este destul de incomod de realizat, datorită faptului că necesită deplasarea zilnică a datorită faptului că necesită deplasarea zilnică a medicului veterinar, pe toată durata tratamentului, medicului veterinar, pe toată durata tratamentului, în vederea administrării dozei necesare de hormon în vederea administrării dozei necesare de hormon gestagen. gestagen. Tratamentul intravaginal, cu ajutorul spiralelorTratamentul intravaginal, cu ajutorul spiralelor este deosebit de răspândit, fiind cunoscut pe plan este deosebit de răspândit, fiind cunoscut pe plan mondial sub forma metodei PRID (progesteron mondial sub forma metodei PRID (progesteron releasing intravaginal device);releasing intravaginal device);SpiralaSpirala este din cauciuc siliconat şi conţine 1,5 g este din cauciuc siliconat şi conţine 1,5 g progesteron (se eliberează aprox. 60 mg/zi), iar la progesteron (se eliberează aprox. 60 mg/zi), iar la capătul cranial prezintă o capsulă ce conţine 10 capătul cranial prezintă o capsulă ce conţine 10 mg benzoat de estradiol.mg benzoat de estradiol.Introducerea spiralei Introducerea spiralei se face cu ajutorul unui se face cu ajutorul unui speculum tubular, iar căldurile apar la 30-40 de ore speculum tubular, iar căldurile apar la 30-40 de ore de la suprimarea tratamentului. Însămânţarea de la suprimarea tratamentului. Însămânţarea artificială se efectuează la 56 h de la scoaterea artificială se efectuează la 56 h de la scoaterea spiralei.spiralei.În urma menţinerii intravaginale timp de mai multe În urma menţinerii intravaginale timp de mai multe zile a spiralei, poate apare o uşoară leucoree zile a spiralei, poate apare o uşoară leucoree locală care însă nu influenţează fertilitatea. locală care însă nu influenţează fertilitatea.

Spirală intravaginalăSpirală intravaginală

Metoda cu Norgestomet implantMetoda cu Norgestomet implant

Această metodă presupune efectuarea unui Această metodă presupune efectuarea unui implant subcutanat, la implant subcutanat, la baza urechii, cu un gestagen sintetic – norgestometbaza urechii, cu un gestagen sintetic – norgestomet . În urma . În urma implantului are loc eliberarea zilnică a dozei necesare menţinerii implantului are loc eliberarea zilnică a dozei necesare menţinerii progesteronemiei la un nivel adecvat obţinerii efectului Rebound. progesteronemiei la un nivel adecvat obţinerii efectului Rebound. Protocolul administrăriiProtocolul administrării presupune următoarele etape:presupune următoarele etape:Se injectează 5 mg valerianat de estradiol şi 3 mg Norgestomet i.m. Se injectează 5 mg valerianat de estradiol şi 3 mg Norgestomet i.m. (efect luteolitic);(efect luteolitic);Se face implantul de Norgestomet s.c., la baza urechii;Se face implantul de Norgestomet s.c., la baza urechii;Implantul se menţine timp de 9 zile după care se extrage;Implantul se menţine timp de 9 zile după care se extrage;Se efectuează IA la 56 şi 72 ore;Se efectuează IA la 56 şi 72 ore;Se poate administra PMSG 400-700 UI.Se poate administra PMSG 400-700 UI.

SINCRONIZAREA CĂLDURILOR CU SINCRONIZAREA CĂLDURILOR CU PROSTAGLANDINEPROSTAGLANDINE

ProstaglandineleProstaglandinele reprezintă o grupă de substanţe cu reprezintă o grupă de substanţe cu efect luteolitic apariţia căldurilor realizându-se la un efect luteolitic apariţia căldurilor realizându-se la un interval de 48-72 ore de la administrare. Cel mai interval de 48-72 ore de la administrare. Cel mai adesea, în urma administrării prostaglandinelor adesea, în urma administrării prostaglandinelor căldurile se manifestă cu intensitate destul de scăzută căldurile se manifestă cu intensitate destul de scăzută (călduri silenţioase), ceea ce necesită o supraveghere (călduri silenţioase), ceea ce necesită o supraveghere atentă a femelelor pentru determinarea momentului atentă a femelelor pentru determinarea momentului optim pentru efectuarea însămânţării artificiale. De optim pentru efectuarea însămânţării artificiale. De obicei se aplică două administrări la interval de 11-12 obicei se aplică două administrări la interval de 11-12 zile.zile.

Produse utilizateProduse utilizate: : PGF2alfa naturală – Dinoprost, Lutalyse.PGF2alfa naturală – Dinoprost, Lutalyse.Analogi sintetici: Cloprostenol (Estrumate);Luprostiol Analogi sintetici: Cloprostenol (Estrumate);Luprostiol (Prosolvin); Fluprostenol (Equimate); Prostianol.(Prosolvin); Fluprostenol (Equimate); Prostianol.

Însămânţarea artificialăÎnsămânţarea artificială se efectuează la 72 şi 96 de se efectuează la 72 şi 96 de ore de la ultima administrare. La 48 de ore de la a ore de la ultima administrare. La 48 de ore de la a doua doză de PG se poate administra GnRH sau doua doză de PG se poate administra GnRH sau estradiol.estradiol.

Prosolvin

2. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU AJUTORUL 2. SINCRONIZAREA ESTRULUI CU AJUTORUL UNEI ASOCIERI DE GESTAGENI ŞI UNEI ASOCIERI DE GESTAGENI ŞI

PROSTAGLANDINEPROSTAGLANDINE

Această metodă permite reducerea administrării sau Această metodă permite reducerea administrării sau menţinerii sursei de gestageni până la 7 zile. menţinerii sursei de gestageni până la 7 zile. Administrarea gestagenilor are ca scop:Administrarea gestagenilor are ca scop:Inhibiţia apariţiei estrului şi ovulaţiei la vacile aflate în Inhibiţia apariţiei estrului şi ovulaţiei la vacile aflate în faza foliculară a ciclului;faza foliculară a ciclului;Dezvoltarea CL mai recenţi de 5 zile până la stadiul în Dezvoltarea CL mai recenţi de 5 zile până la stadiul în care reacţionează la PG;care reacţionează la PG;Administrarea PG va provoca luteoliza la vacile cu CL Administrarea PG va provoca luteoliza la vacile cu CL funcţional. La 2-4 zile după terminarea tratamentului, funcţional. La 2-4 zile după terminarea tratamentului, vacile vor intra în călduri. vacile vor intra în călduri.

Inducerea poliovulaţiei la vacile Inducerea poliovulaţiei la vacile donatoaredonatoare

PoliovulaţiaPoliovulaţia este procesul prin care se stimulează este procesul prin care se stimulează eliberarea în cadrul aceluiaşi ciclu a unui număr mai eliberarea în cadrul aceluiaşi ciclu a unui număr mai mare de ovule comparativ cu numărul caracteristic mare de ovule comparativ cu numărul caracteristic speciei.speciei.

PrincipiulPrincipiul: : Tratamentele de inducere a poliovulaţiei constau în Tratamentele de inducere a poliovulaţiei constau în administrarea uneia sau mai multor doze de hormoni administrarea uneia sau mai multor doze de hormoni foliculo-stimulatori (foliculo-stimulatori (FSH sau PMSG)FSH sau PMSG) pe fondul unui corp pe fondul unui corp galben pe ovar (producător de progesteron), care este galben pe ovar (producător de progesteron), care este luteolizat de o luteolizat de o PGF2alfaPGF2alfa şi suplimentarea hormonului de şi suplimentarea hormonului de luteinizare (luteinizare (LH sau HCGLH sau HCG) pentru a stimula fenomenul ) pentru a stimula fenomenul ovulator natural.ovulator natural.

Pentru inducerea poliovulaţiei la vacile donatoare selecţionate conform Pentru inducerea poliovulaţiei la vacile donatoare selecţionate conform fişei ginecologice prezentate, se utilizează fişei ginecologice prezentate, se utilizează gonadotropina serică gonadotropina serică (PMSG) Folligon(PMSG) Folligon în doză unică de 2500 UI, administrată în ziua 9 – 10 în doză unică de 2500 UI, administrată în ziua 9 – 10 a ciclului estral pe cale intramusculară. La 48 de ore de la administrarea a ciclului estral pe cale intramusculară. La 48 de ore de la administrarea gonadotropinei serice, vacilor donatoare li se administrează o doză de gonadotropinei serice, vacilor donatoare li se administrează o doză de prostaglandină F2prostaglandină F2 - 15 mg ( - 15 mg (ProsolvinProsolvin). Atât Folligonul cât şi ). Atât Folligonul cât şi Prosolvinul sunt produse ale firmei Intervet – Olanda. Prosolvinul sunt produse ale firmei Intervet – Olanda. La două – trei zile de la administrarea prostaglandinei, donatoarele care La două – trei zile de la administrarea prostaglandinei, donatoarele care manifestă călduri, sunt inseminate artificial de două ori la interval de 12 manifestă călduri, sunt inseminate artificial de două ori la interval de 12 ore. ore. Înainte cu două ore de prima inseminare, donatoarelor li se administrată Înainte cu două ore de prima inseminare, donatoarelor li se administrată o doză de o doză de Neutra-PMSGNeutra-PMSG pe cale intravenoasă, urmată de o doză (1500 pe cale intravenoasă, urmată de o doză (1500 UI) de UI) de gonadotropină corionică (Chorulon)gonadotropină corionică (Chorulon) – ambele fiind produse ale – ambele fiind produse ale firmei Intervet – Olanda. firmei Intervet – Olanda.

Produsele utilizate pentru inducerea poliovulaţiei sunt prezentate în imaginile de mai jos:

RECOLTAREA EMBRIONILORRECOLTAREA EMBRIONILORTipuri de catetere şi mediul utilizat pentru Tipuri de catetere şi mediul utilizat pentru

recoltarea nechirurgicală a embrionilorrecoltarea nechirurgicală a embrionilor

Recoltarea embrionilorRecoltarea embrionilor se efectuează la 6,5 zile după se efectuează la 6,5 zile după inseminarea artificială pe cale nechirurgicală, prin utilizarea a inseminarea artificială pe cale nechirurgicală, prin utilizarea a trei tipuri de catetere. trei tipuri de catetere.

Cele trei tipuri de catetere fac parte din grupul sondelor cu Cele trei tipuri de catetere fac parte din grupul sondelor cu

două căi de acces, având următoarele particularităţi :două căi de acces, având următoarele particularităţi : Cateterul RuschCateterul Rusch Cateterul MT tip CH 18Cateterul MT tip CH 18 Cateterul LampeterCateterul Lampeter

Cateterul Rusch Cateterul Rusch cu două căi, confecţionat din cauciuc cu două căi, confecţionat din cauciuc flexibil având 70 cm lungime şi 7 mm diametru. Este prevăzut flexibil având 70 cm lungime şi 7 mm diametru. Este prevăzut cu două căi de acces: cu două căi de acces: o cale care permite atât introducerea cât şi recuperarea prin o cale care permite atât introducerea cât şi recuperarea prin

alternanţă a mediul de recoltare;alternanţă a mediul de recoltare; o cale care asigură gonflarea balonaşului obturator.o cale care asigură gonflarea balonaşului obturator.

Rigidizarea acestui tip de cateter în vederea tunelizării Rigidizarea acestui tip de cateter în vederea tunelizării cervixului donatoarei în momentul recoltării, se realizează cu cervixului donatoarei în momentul recoltării, se realizează cu ajutorul unui mandren confecţionat din oţel inoxidabil.ajutorul unui mandren confecţionat din oţel inoxidabil.Cateterul prezintă patru orificii de evacuare în zona apicală, Cateterul prezintă patru orificii de evacuare în zona apicală, prin intermediul cărora se introduce şi se recoltează mediul de prin intermediul cărora se introduce şi se recoltează mediul de spălare din uter.spălare din uter.

Cateterul MT tip CH 18 Cateterul MT tip CH 18 cu două căi, produs de firma Minitub. cu două căi, produs de firma Minitub. Sonda este confecţionată din cauciuc fin şi flexibil, având 70 cm Sonda este confecţionată din cauciuc fin şi flexibil, având 70 cm lungime şi 7 mm diametru.lungime şi 7 mm diametru.Cateterul dispune de două căi :Cateterul dispune de două căi :

o cale pentru introducerea şi recuperarea în alternanţă a mediului o cale pentru introducerea şi recuperarea în alternanţă a mediului de recoltare ;de recoltare ;

a doua cale asigură gonflarea balonaşului fiind prevăzută cu valvă a doua cale asigură gonflarea balonaşului fiind prevăzută cu valvă şi cu supapă.şi cu supapă.

Capătul sondei dispune imediat după balonaş de două deschideri, care Capătul sondei dispune imediat după balonaş de două deschideri, care permit introducerea şi recoltarea mediul de spălare. Rigidizarea acestui permit introducerea şi recoltarea mediul de spălare. Rigidizarea acestui tip de sondă, în vederea tunelizării cervixului se realizează cu ajutorul tip de sondă, în vederea tunelizării cervixului se realizează cu ajutorul unui mandren confecţionat din oţel inoxidabil.unui mandren confecţionat din oţel inoxidabil.

Cateterul Lampeter Cateterul Lampeter cu două căi, este confecţionat cu două căi, este confecţionat dintr-un amestec de materiale plastice ce-i oferă dintr-un amestec de materiale plastice ce-i oferă elasticitate şi flexibilitate, fiind prevăzut cu elasticitate şi flexibilitate, fiind prevăzut cu două căidouă căi de de acces, care permit introducerea, recuperarea alternantă a acces, care permit introducerea, recuperarea alternantă a mediului şi fixarea la nivelul uterului donatoarei. mediului şi fixarea la nivelul uterului donatoarei.

Comparativ cu celelalte două sonde, acest tip de Comparativ cu celelalte două sonde, acest tip de cateter prezintă imediat după balonaş un vârf metalic, cateter prezintă imediat după balonaş un vârf metalic, prevăzut cu 8 deschideri.prevăzut cu 8 deschideri.

Pasajul cervixului donatoarei în momentul recoltării Pasajul cervixului donatoarei în momentul recoltării nechirurgicale a embrionilor se realizează prin rigidizarea nechirurgicale a embrionilor se realizează prin rigidizarea sondei cu ajutorul mandrenului confecţionat din oţel sondei cu ajutorul mandrenului confecţionat din oţel inoxidabil.inoxidabil.

Cateterul Lampeter

Pentru Pentru recoltarea nechirurgicală recoltarea nechirurgicală a embrionilor se utilizează a embrionilor se utilizează mediul PBS (Phosphate Buffered Salin) produs al firmei Minitub mediul PBS (Phosphate Buffered Salin) produs al firmei Minitub (Vigro Complete Flush).(Vigro Complete Flush).Pungile cu mediu se păstrează la temperatura laboratorului, iar Pungile cu mediu se păstrează la temperatura laboratorului, iar în momentul recoltării se încălzesc într-o baie marină, în momentul recoltării se încălzesc într-o baie marină, asigurându-se 30asigurându-se 30ooC vara şi 35C vara şi 35ooC iarna. Recuperarea mediului de C iarna. Recuperarea mediului de spălare s-a realizat în flacoane sterile transparente cu pereţi spălare s-a realizat în flacoane sterile transparente cu pereţi dubli gradaţi, ceea ce permite controlul aspectului şi cantităţii dubli gradaţi, ceea ce permite controlul aspectului şi cantităţii mediului introdus şi recuperat.mediului introdus şi recuperat.

Protocolul de recoltareProtocolul de recoltare

Înainte de a fi utilizate, cateterele de recoltare sunt spălate Înainte de a fi utilizate, cateterele de recoltare sunt spălate în interior şi la exterior cu ser fiziologic steril pentru a în interior şi la exterior cu ser fiziologic steril pentru a îndepărta eventualele urme de dezinfectanţi ce pot avea îndepărta eventualele urme de dezinfectanţi ce pot avea efect toxic asupra embrionilor. efect toxic asupra embrionilor. De asemenea, cateterele se siliconează cu silicon spray De asemenea, cateterele se siliconează cu silicon spray pentru a evita aderarea embrionilor în timpul recoltării.pentru a evita aderarea embrionilor în timpul recoltării.Donatoarele se contenţionează, anesteziei epidurale cu 4 Donatoarele se contenţionează, anesteziei epidurale cu 4 ml Lidocaină 2% şi administrarea i.m. a 10 ml utero-relaxant ml Lidocaină 2% şi administrarea i.m. a 10 ml utero-relaxant ((DegraspaminDegraspamin – produs de firma Graner-Elveţia), se leagă – produs de firma Graner-Elveţia), se leagă coada animalului, se face toaleta şi dezinfecţia regiunii coada animalului, se face toaleta şi dezinfecţia regiunii perivulvare.perivulvare.

Protocolul de recoltareProtocolul de recoltare

Protocolul de recoltareProtocolul de recoltare

Sonda se introduce în vagin acoperită cu o cămaşă de Sonda se introduce în vagin acoperită cu o cămaşă de protecţie plasticată de unică folosinţă. protecţie plasticată de unică folosinţă.

Când sonda ajunge la nivelul intrării vaginale a cervixului, Când sonda ajunge la nivelul intrării vaginale a cervixului, sonda străpunge protecţia şi este orientată transrectal în sonda străpunge protecţia şi este orientată transrectal în vederea trecerii barierelor inelare cervicale.vederea trecerii barierelor inelare cervicale.

Înaintarea se realizează sub control transrectal, Înaintarea se realizează sub control transrectal, centimetru cu centimetru, plasarea sondei făcându-se centimetru cu centimetru, plasarea sondei făcându-se în treimea mijlocie a coarnelor uterine, la 4 – 5 cm de în treimea mijlocie a coarnelor uterine, la 4 – 5 cm de bifurcaţia coarnelor uterine, având astfel posibilitatea bifurcaţia coarnelor uterine, având astfel posibilitatea recoltării embrionilor aflaţi în treimea anterioară a recoltării embrionilor aflaţi în treimea anterioară a acestuia.acestuia.După poziţionarea sondei în lumenul cornului uterin, se După poziţionarea sondei în lumenul cornului uterin, se umple balonul acesteia cu 8 – 10 – 12 cmumple balonul acesteia cu 8 – 10 – 12 cm33 de aer, în de aer, în funcţie de diametrul cornului. funcţie de diametrul cornului. Introducerea mediului de spălare se realizează cu Introducerea mediului de spălare se realizează cu ajutorul unor seringi cu o capacitate de 60 ml, iar ajutorul unor seringi cu o capacitate de 60 ml, iar recoltarea intrauterină a acestuia se realizează în vase recoltarea intrauterină a acestuia se realizează în vase de recoltare gradate, cu pereţi dublide recoltare gradate, cu pereţi dubli

Mediul recoltat separat din cele două Mediul recoltat separat din cele două coarne uterine se menţine 30 minute la coarne uterine se menţine 30 minute la 3030ooC pentru decantarea embrionilor, C pentru decantarea embrionilor, după care se îndepărtează prin sifonare după care se îndepărtează prin sifonare supernatantul.supernatantul.Ultimii 50 – 100 ml din mediul recoltat Ultimii 50 – 100 ml din mediul recoltat se reţin pentru examinarea la se reţin pentru examinarea la stereomicroscop în vederea identificării stereomicroscop în vederea identificării şi izolării embrionilor şi izolării embrionilor Imediat după recoltare, pentru Imediat după recoltare, pentru prevenirea inflamaţiilor, au fost prevenirea inflamaţiilor, au fost introduse intrauterin suspensii introduse intrauterin suspensii constituite din 1 milion UI penicilină şi constituite din 1 milion UI penicilină şi 1gr streptomicină. Luteoliza corpilor 1gr streptomicină. Luteoliza corpilor galbeni de la nivelul ovarelor galbeni de la nivelul ovarelor donatoarelor se realizează cu ajutorul donatoarelor se realizează cu ajutorul PGF2PGF2 (Prosolvin) injectată (Prosolvin) injectată intramuscular imediat după recoltare, în intramuscular imediat după recoltare, în doză de 15 mg per animal.doză de 15 mg per animal.

EVALUAREA EVALUAREA EMBRIONILOR EMBRIONILOR

DE VACĂDE VACĂ

După recoltare şi până când este transferat, După recoltare şi până când este transferat, embrionul face obiectul unui examen morfologic embrionul face obiectul unui examen morfologic minuţios destinat aprecierii calităţii sale în minuţios destinat aprecierii calităţii sale în momentul recoltării şi stabilirii şanselor de momentul recoltării şi stabilirii şanselor de dezvoltare.dezvoltare.

Această apreciere necesită cunoaşterea în prealabil Această apreciere necesită cunoaşterea în prealabil a stadiilor de dezvoltare a embrionilor, evoluţia lor şi a stadiilor de dezvoltare a embrionilor, evoluţia lor şi implicaţiile manipulărilor excesive asupra implicaţiile manipulărilor excesive asupra morfologiei acestora.morfologiei acestora.

Identificarea embrionilorIdentificarea embrionilor

Identificarea embrionilor din lichidul de spălare utilizat Identificarea embrionilor din lichidul de spălare utilizat după recoltarea intrauterină se bazează pe observarea după recoltarea intrauterină se bazează pe observarea trăsăturilor morfologice ale acestora. trăsăturilor morfologice ale acestora. EmbrionulEmbrionul este o structură sferică, compusă din celule este o structură sferică, compusă din celule (blastomere) înconjurate de o membrană cu aspect (blastomere) înconjurate de o membrană cu aspect gelatinos constituind matricea acelulară şi reprezentând gelatinos constituind matricea acelulară şi reprezentând zona pelucidăzona pelucidă.. Zona pelucida Zona pelucida prezintă o varietate de funcţii atât timp cât prezintă o varietate de funcţii atât timp cât embrionul se află în stadiile de dezvoltare intrapelucide, embrionul se află în stadiile de dezvoltare intrapelucide, fiind totodată un reper pentru identificarea embrionilor fiind totodată un reper pentru identificarea embrionilor datorită sfericităţii şi aspectului translucid uşor de distins datorită sfericităţii şi aspectului translucid uşor de distins printre detritusurile celulare.printre detritusurile celulare.

Diametrul embrionuluiDiametrul embrionului bovin se estimează a fi de bovin se estimează a fi de 150-180 μ150-180 μ, , incluzând grosimea membranei pelucida de 12-15μ acesta incluzând grosimea membranei pelucida de 12-15μ acesta rămânând constant până în momentul începerii expansiunii rămânând constant până în momentul începerii expansiunii blastocelice.blastocelice.

În timpul dezvoltării embrionare, numărul de blastomere În timpul dezvoltării embrionare, numărul de blastomere creşte în progresie geometrică (1-2-4-8-16, etc.), aceste creşte în progresie geometrică (1-2-4-8-16, etc.), aceste diviziuni celulare fiind sincrone şi în general menţinute până diviziuni celulare fiind sincrone şi în general menţinute până în stadiul de 16 celule. în stadiul de 16 celule.

După acest stadiu, diviziunile devin asincrone, astfel încât După acest stadiu, diviziunile devin asincrone, astfel încât după stadiul de 32 celule (morulă) embrionul suferă după stadiul de 32 celule (morulă) embrionul suferă compactarea, fenomen ce îngreunează observarea şi compactarea, fenomen ce îngreunează observarea şi identificarea individuală a blastomerelor.identificarea individuală a blastomerelor.

Cele mai importante criterii pentru identificarea Cele mai importante criterii pentru identificarea embrionilor sunt: embrionilor sunt:

forma embrionilor ;forma embrionilor ;prezenţa zonei pelucide ;prezenţa zonei pelucide ;mărimea ;mărimea ;culoarea ;culoarea ;cunoaşterea vârstei embrionuluicunoaşterea vârstei embrionului..

Embrionul normalEmbrionul normal este considerat a fi cel care este considerat a fi cel care prezintă în structură blastomere integre, compacte cu o prezintă în structură blastomere integre, compacte cu o coloraţie, formă şi dimensiuni conforme stadiului de coloraţie, formă şi dimensiuni conforme stadiului de dezvoltare.dezvoltare.

Astfel un embrion este socotit Astfel un embrion este socotit normalnormal dacă la dacă la recoltare în zilele:recoltare în zilele:2-3 posedă 4 blastomere ;2-3 posedă 4 blastomere ;3-4 posedă 8 blastomere ;3-4 posedă 8 blastomere ;4-5 posedă 16 blastomere ;4-5 posedă 16 blastomere ;5-6 posedă morulă timpurie ;5-6 posedă morulă timpurie ;6-7 posedă morulă compactă ;6-7 posedă morulă compactă ;7-8 posedă blastocist tânăr ;7-8 posedă blastocist tânăr ;8-10 posedă blastocist expandat ;8-10 posedă blastocist expandat ;9-11 blastocist eclozionat.9-11 blastocist eclozionat.

Criteriile morfologice de apreciere Criteriile morfologice de apreciere a viabilităţii embrionarea viabilităţii embrionare

Stadiul embrionar

Timp scurs de

la IVF

Morfologia stadiului

embrionar

Ovocit fecundat

Ziua fertilizării

Stadiul de 2–celule

Ziua a 2a

Stadiul de 4–celule

36-48h

Stadiul de 8–celule

Ziua a 4a

Morulă Ziua a 5a – a 6a

Stadiul embrionar

Timp scurs de

la IVF

Morfologia stadiului

embrionar

Blastocist tânăr

Ziua a 7a

Blastocist Ziua a 7a – a 8a

Blastocist expandat

Ziua a 8a – a 9a

Blastocist în ecloziune

Ziua a 9a

Identificarea embrionilor pe baza aspectelor morfologice (după Groza I. şi col., 2005; Ciupe Simona, 2004)

Clasificarea embrionilorClasificarea embrionilorembrioni excelenţi (nota 5)embrioni excelenţi (nota 5);; perfect sferici, simetrici;perfect sferici, simetrici; cu blastomere poligonale uniforme;cu blastomere poligonale uniforme; vezicule citoplasmatice uniforme;vezicule citoplasmatice uniforme; citoplasma agranulară;citoplasma agranulară; spaţiul perivitelin liber, cu diametru regulat.spaţiul perivitelin liber, cu diametru regulat.

embrioni buni (nota 4)embrioni buni (nota 4);; sunt asemănători cu cei din clasa 5, dar sunt asimetrici, cu sunt asemănători cu cei din clasa 5, dar sunt asimetrici, cu

unele celule separate de masa compactă.unele celule separate de masa compactă.embrioni mijlocii (mediu) (nota 3)embrioni mijlocii (mediu) (nota 3);; cuprinde embrioni retardaţi cu o zi, cu blastomere sferice, de cuprinde embrioni retardaţi cu o zi, cu blastomere sferice, de

mărime variabilă, uneori putându-se evidenţia vezicule mărime variabilă, uneori putându-se evidenţia vezicule intracelulare în număr redus.intracelulare în număr redus.

embrioni slabi (nota 2)embrioni slabi (nota 2);; cuprinde clasa embrionilor cu dezvoltare retardată cu 2 zile, cu cuprinde clasa embrionilor cu dezvoltare retardată cu 2 zile, cu

limitele celulare nedistincte.limitele celulare nedistincte.embrioni necorespunzători (nota 1)embrioni necorespunzători (nota 1);; embrioni degeneraţi, cu vacuole intercelulare, zona pelucidă embrioni degeneraţi, cu vacuole intercelulare, zona pelucidă

ruptă, uşor deformată.ruptă, uşor deformată.

Pe parcursul segmentării sunt deosebite următoarele Pe parcursul segmentării sunt deosebite următoarele stadii embrionarestadii embrionare::Stadiul timpuriu al clivajului embrionarStadiul timpuriu al clivajului embrionar care cuprinde care cuprinde procesele de segmentare de la procesele de segmentare de la 0 la 16 blastomere0 la 16 blastomere, examenul , examenul microscopic putând să precizeze: numărul de celule prezente, microscopic putând să precizeze: numărul de celule prezente, forma, simetria, mărimea acestora.forma, simetria, mărimea acestora.

Stadiul deStadiul de morulă tânărămorulă tânără: încadrarea se face pe baza aspectului : încadrarea se face pe baza aspectului blastomerelor şi a numărului lor. În acest stadiu de dezvoltare, blastomerelor şi a numărului lor. În acest stadiu de dezvoltare, blastomerele se prezintă sub forma unor aglomeraţii sferice ce blastomerele se prezintă sub forma unor aglomeraţii sferice ce păstrează conturul individual al fiecărei celule, spaţiul perivitelin fiind păstrează conturul individual al fiecărei celule, spaţiul perivitelin fiind bine evidenţiat bine evidenţiat

Stadiul deStadiul de morulă compactămorulă compactă: încadrarea se face pe baza : încadrarea se face pe baza aspectului compact al blastomerelor, fapt ce determină aspectului compact al blastomerelor, fapt ce determină imposibilitatea delimitării celulelor unele de celelalte. În imposibilitatea delimitării celulelor unele de celelalte. În acest stadiu, embrionul ocupă 60 – 70% din spaţiul acest stadiu, embrionul ocupă 60 – 70% din spaţiul delimitat de membrana pelucida. delimitat de membrana pelucida.

Stadiul deStadiul de blastocistul tânăr (timpuriu)blastocistul tânăr (timpuriu) se bazează pe se bazează pe evidenţierea apariţiei cavităţii lecitocelice care ocupă 50 – evidenţierea apariţiei cavităţii lecitocelice care ocupă 50 – 60% din spaţiul intern al zonei pelucida. Se poate observa o 60% din spaţiul intern al zonei pelucida. Se poate observa o uşoară diferenţiere între trofoblast şi masa de celule uşoară diferenţiere între trofoblast şi masa de celule embrionare care apar mai compacte.embrionare care apar mai compacte.

Stadiul de blastocist maturStadiul de blastocist matur: se face pe baza observării : se face pe baza observării trofoblastului care devine mult mai vizibil. În interior, masa trofoblastului care devine mult mai vizibil. În interior, masa de celule embrionare devine mai compactă, de culoare de celule embrionare devine mai compactă, de culoare închisă, masată uniform în interiorul zonei pelucida.închisă, masată uniform în interiorul zonei pelucida.

Stadiul de blastocist expandatStadiul de blastocist expandat: se stabileşte pe seama : se stabileşte pe seama observării extensiei blastocistului, cu modificarea diametrului observării extensiei blastocistului, cu modificarea diametrului de la 150 – 190 microni la 1,2 mm. Zona pelucida se de la 150 – 190 microni la 1,2 mm. Zona pelucida se subţiază foarte mult ajungând la o treime din grosimea subţiază foarte mult ajungând la o treime din grosimea anterioară de 1 – 15 microni, fapt datorat sporirii numărului anterioară de 1 – 15 microni, fapt datorat sporirii numărului de celule (de la 70 la 180).de celule (de la 70 la 180).

Embrionilor degeneraţiEmbrionilor degeneraţi: în care sunt încadraţi embrionii cu : în care sunt încadraţi embrionii cu modificări morfologice clare, reprezentate de apariţia în modificări morfologice clare, reprezentate de apariţia în număr mare a blastomerelor izolate cât şi a vacuolizărilor număr mare a blastomerelor izolate cât şi a vacuolizărilor citoplasmatice însoţite uneori de apariţia unor procese de citoplasmatice însoţite uneori de apariţia unor procese de degenerescenţă celulară şi modificări la nivelul membranei degenerescenţă celulară şi modificări la nivelul membranei pelucida (fisuri, fragmentări, deformaţii). În plus embrionii pelucida (fisuri, fragmentări, deformaţii). În plus embrionii prezintă retard de peste o zi în dezvoltare vizavi de ziua prezintă retard de peste o zi în dezvoltare vizavi de ziua recoltării.recoltării.

CRIOCONSERVAREA CRIOCONSERVAREA EMBRIONILOREMBRIONILOR

CURS 2CURS 2

Crioconservarea embrionilorCrioconservarea embrionilor

Tehnicile de congelare/decongelare au evoluat în Tehnicile de congelare/decongelare au evoluat în direcţia simplificării etapelor de lucru, reuşindu-se să se direcţia simplificării etapelor de lucru, reuşindu-se să se dezvolte metode rapide, uşor utilizabile în producţie.dezvolte metode rapide, uşor utilizabile în producţie.

Avantajele crioconservării embrionilor sunt considerabile Avantajele crioconservării embrionilor sunt considerabile şi vor asigura desigur un impact asupra creşterii şi vor asigura desigur un impact asupra creşterii animalelor, similar celui obţinut cu crioconservarea animalelor, similar celui obţinut cu crioconservarea spermei.spermei.

Conservarea prin congelare Conservarea prin congelare presupune un complex de presupune un complex de procese fizico-chimice de transport al apei şi temperaturii procese fizico-chimice de transport al apei şi temperaturii între embrion şi mediul de conservare, supravieţuirea fiind între embrion şi mediul de conservare, supravieţuirea fiind condiţionată de prezenţa substanţelor crioprotectoare, în condiţionată de prezenţa substanţelor crioprotectoare, în concentraţii de 1-2 M, adăugate în mediul de conservare.concentraţii de 1-2 M, adăugate în mediul de conservare.Viteza de conservare Viteza de conservare trebuie să fie foarte rapidă pentru a trebuie să fie foarte rapidă pentru a se putea evita formarea de noi cristale (recristalizarea), se putea evita formarea de noi cristale (recristalizarea), care prin acţiunea mecanică produc şi întreţin leziuni care prin acţiunea mecanică produc şi întreţin leziuni ireversibile pentru celulă. ireversibile pentru celulă. Supravieţuirea celulară depinde în esenţă de condiţiile în Supravieţuirea celulară depinde în esenţă de condiţiile în care se produc modificările apei celulare, agentul care se produc modificările apei celulare, agentul crioprotector, concentraţiile acestuia în mediu, viteza de crioprotector, concentraţiile acestuia în mediu, viteza de răcire, viteza de decongelare şi modul de eliminare a răcire, viteza de decongelare şi modul de eliminare a crioprotectorului crioprotectorului

Agenţii crioprotectoriAgenţii crioprotectori

IntracelulariIntracelulari – reprezentaţi de substanţe cu greutate – reprezentaţi de substanţe cu greutate moleculară mică (alcooli), care asociate cu moleculele de moleculară mică (alcooli), care asociate cu moleculele de apă pătrund în interiorul celulei: apă pătrund în interiorul celulei: dimetilsulfoxidul (DMSO), dimetilsulfoxidul (DMSO), glicerolul, metanolul şi etilenglicolulglicerolul, metanolul şi etilenglicolul. Prin dislocarea unei . Prin dislocarea unei cantităţi determinate de apă şi asocierea cu aceasta, cantităţi determinate de apă şi asocierea cu aceasta, crioprotectorul scade punctul de cristalizare, diminuă crioprotectorul scade punctul de cristalizare, diminuă cantitatea şi natura cristalelor de gheaţă formate în timpul cantitatea şi natura cristalelor de gheaţă formate în timpul congelării /decongelării şi previne creşterea excesivă a congelării /decongelării şi previne creşterea excesivă a concentraţiei sărurilor în celule;concentraţiei sărurilor în celule;ExtracelulariExtracelulari – reprezentaţi de substanţe cu greutate – reprezentaţi de substanţe cu greutate moleculară mică sau mare care nu pătrund în celulă şi care moleculară mică sau mare care nu pătrund în celulă şi care îşi exercită efectul crioprotector prin: deschiderea celulei – îşi exercită efectul crioprotector prin: deschiderea celulei – reprezentantul de bază fiind reprezentantul de bază fiind sucrozasucroza, colmatarea zonelor , colmatarea zonelor penetrabile ale membranei în timpul congelării, asigurând penetrabile ale membranei în timpul congelării, asigurând revenirea funcţiei membranei după decongelare prin lipidele revenirea funcţiei membranei după decongelare prin lipidele pe care le conţin. pe care le conţin.

Temperatura de stocareTemperatura de stocare La majoritatea speciilor domestice, La majoritatea speciilor domestice, după temperatura de - 33după temperatura de - 3300C, - 35C, - 3500C, C, deshidratarea celulelor este optimă, deshidratarea celulelor este optimă, embrionii putând fi plonjaţi direct în embrionii putând fi plonjaţi direct în azot lichid la –196azot lichid la –19600C, stocarea C, stocarea realizându-se în containere cu azot realizându-se în containere cu azot lichid, prevăzute cu suporturi pentru lichid, prevăzute cu suporturi pentru stocare (canistre) .stocare (canistre) .

Personalizarea paietelor şi containerelor de Personalizarea paietelor şi containerelor de stocare a embrionilorstocare a embrionilor

Etichetarea containerelor şi paietelor utilizate în scopul Etichetarea containerelor şi paietelor utilizate în scopul conservării pe timp îndelungat a embrionilor se realizează conservării pe timp îndelungat a embrionilor se realizează după sistemul IETS (International Embryo Transfer Society), după sistemul IETS (International Embryo Transfer Society), astfel încât oricine să poate identifica embrionii din fiecare astfel încât oricine să poate identifica embrionii din fiecare recipient de stocaj.recipient de stocaj.

Identificarea paietelor se realizează prin inscripţionarea Identificarea paietelor se realizează prin inscripţionarea directă cu ajutorul markerelor permanente a următoarelor directă cu ajutorul markerelor permanente a următoarelor date:date:codul companiei care a congelat embrionul;codul companiei care a congelat embrionul;rasa şi numărul de înregistrare a donatoarei notat sub forma rasa şi numărul de înregistrare a donatoarei notat sub forma unor abrevieri bine stabilite de IETS şi cunoscute de toată unor abrevieri bine stabilite de IETS şi cunoscute de toată lumea;lumea;rasa şi numărul de înregistrare al taurului notat în pedigri;rasa şi numărul de înregistrare al taurului notat în pedigri;numărul paietei;numărul paietei;ziua recoltării notată începând cu anul, luna şi ziua;ziua recoltării notată începând cu anul, luna şi ziua;numărul embrionilor din paietă.numărul embrionilor din paietă.

Tehnica de congelare a embrionilorTehnica de congelare a embrionilor Aparatul de congelareAparatul de congelare care care se pretează cel mai bine se pretează cel mai bine condiţiilor existente la nivel de condiţiilor existente la nivel de fermă este produs în S.U.A. fermă este produs în S.U.A. de către firma Cryogenetic şi de către firma Cryogenetic şi are ca principiu de funcţionare are ca principiu de funcţionare plasarea gradată a paietelor plasarea gradată a paietelor care conţin embrioni şi mediul care conţin embrioni şi mediul crioprotector în vapori de azot crioprotector în vapori de azot lichid, efectuarea seedingului lichid, efectuarea seedingului la –6la –6ooC, apoi răcirea treptată C, apoi răcirea treptată până la atingerea temperaturii până la atingerea temperaturii ce permite plonjarea în azot ce permite plonjarea în azot lichid lichid

Aparatul de măsurare a temperaturii

Pipeta de aspiraţie automată

Agenţii crioprotectori Agenţii crioprotectori recomandaţi a fi recomandaţi a fi utilizaţi sunt :utilizaţi sunt :

glicerolul în concentraţie de 0,47 M ; glicerolul în concentraţie de 0,47 M ; 0,94 M ; 1,4 M în PBS Vigro ;0,94 M ; 1,4 M în PBS Vigro ;

glicerol 1,5 M în PBS Vigro ;glicerol 1,5 M în PBS Vigro ;

etilen glicol 1,5 M şi sucroză 0,1 M etilen glicol 1,5 M şi sucroză 0,1 M (Mediul Vigro produs al firmei Minitub din (Mediul Vigro produs al firmei Minitub din Germania)Germania)

1. Congelarea în diluţii succesive de glicerol1. Congelarea în diluţii succesive de glicerol

2. Congelarea în glicerol într-un singur pas2. Congelarea în glicerol într-un singur pas

3. Metoda de congelare în etilen glicol 1,5 M 3. Metoda de congelare în etilen glicol 1,5 M şi sucroză 0,1 Mşi sucroză 0,1 M

Decongelarea embrionilorDecongelarea embrionilor

Decongelarea unui embrion Decongelarea unui embrion comportă două fenomene:comportă două fenomene:reîncălzirea de la -196reîncălzirea de la -19600C, temperatura azotului lichid, la o C, temperatura azotului lichid, la o temperatură de 20temperatură de 2000C şi apoi 37C şi apoi 3700C. C. extragerea crioprotectorului prezent în celulele embrionilor.extragerea crioprotectorului prezent în celulele embrionilor.Reîncălzirea este instantanee şi în funcţie de starea de Reîncălzirea este instantanee şi în funcţie de starea de deshidratare a embrionului. Acestea avantajează tehnicile deshidratare a embrionului. Acestea avantajează tehnicile recente de congelare unde embrionul este plonjat în azot recente de congelare unde embrionul este plonjat în azot lichid. Embrionul nu este reîncălzit lent pentru a nu se lichid. Embrionul nu este reîncălzit lent pentru a nu se deshidrata. Reîncălzirea este obţinută simplu prin deshidrata. Reîncălzirea este obţinută simplu prin plonjarea paietei în apă caldă. plonjarea paietei în apă caldă. Procesul de extracţie a crioprotectorului poate influenţa Procesul de extracţie a crioprotectorului poate influenţa supravieţuirea celulelor datorită şocului osmotic. Fiind supravieţuirea celulelor datorită şocului osmotic. Fiind sensibile la mediile hipotonice, unele pot să sufere sensibile la mediile hipotonice, unele pot să sufere fenomenul de gonflare şi să se spargă. Apa traversează fenomenul de gonflare şi să se spargă. Apa traversează mai rapid membranele celulare faţă de etilenglicol.mai rapid membranele celulare faţă de etilenglicol.

Indiferent de metoda utilizată, trebuie corelate cele două Indiferent de metoda utilizată, trebuie corelate cele două viteze, de congelare şi decongelare. viteze, de congelare şi decongelare.

O congelare lentă O congelare lentă permite deshidratarea importantă a permite deshidratarea importantă a embrionilor, deci a celulei, impune o încălzire lentă embrionilor, deci a celulei, impune o încălzire lentă pentru evitarea diferenţei importante de presiune pentru evitarea diferenţei importante de presiune osmotică care ar putea sparge celula. osmotică care ar putea sparge celula.

O răcire rapidă O răcire rapidă antrenează formarea unor mici cristale antrenează formarea unor mici cristale intracelulare. O reîncălzire lentă permite o recristalizare intracelulare. O reîncălzire lentă permite o recristalizare în cristale mari ce pot sparge celula. în cristale mari ce pot sparge celula.

1. Decongelarea embrionilor de vacă în 1. Decongelarea embrionilor de vacă în soluţii succesive de glicerol soluţii succesive de glicerol 

2. Decongelarea embrionilor de vacă într-un 2. Decongelarea embrionilor de vacă într-un singur pas cu glicerol 1,5Msingur pas cu glicerol 1,5M

3. Decongelarea embrionilor de vacă în 3. Decongelarea embrionilor de vacă în etilen glicol 1,5M şi sucroză 0,1Metilen glicol 1,5M şi sucroză 0,1M

TRANSFERUL EMBRIONARTRANSFERUL EMBRIONAR

Cu toate rezultatele bune obţinute în urma transferului Cu toate rezultatele bune obţinute în urma transferului chirurgical al embrionilor, obligativitatea intervenţiei chirurgical al embrionilor, obligativitatea intervenţiei chirurgicale atât la femela donatoare cât şi la femela chirurgicale atât la femela donatoare cât şi la femela receptoare de embrioni, cu urmări negative asupra receptoare de embrioni, cu urmări negative asupra repetabilităţii operaţiunilor de embrio-transfer a constituit repetabilităţii operaţiunilor de embrio-transfer a constituit un obstacol important în extinderea pe scară largă a un obstacol important în extinderea pe scară largă a embrio-transferului. De aceea a fost necesară o metodă embrio-transferului. De aceea a fost necesară o metodă mai simplă şi mai expeditivă de transfer a embrionilor la mai simplă şi mai expeditivă de transfer a embrionilor la vacă.vacă.Reuşita transferului de embrioni este supusă influenţei Reuşita transferului de embrioni este supusă influenţei unui unui număr mare de factori printre care se mare de factori printre care se numără şi şi modalitatea de transfer al embrionilor (tipul de inovulare).modalitatea de transfer al embrionilor (tipul de inovulare).După recoltarea şi selectarea morfologică, embrionii sunt După recoltarea şi selectarea morfologică, embrionii sunt transferaţi în stare transferaţi în stare proaspătă sau după congelare, la sau după congelare, la femelele receptoare a femelele receptoare a căror ciclu estral a fost sincronizat ciclu estral a fost sincronizat cu a donatoarelor cu a donatoarelor

Este preferabil ca transferul embrionilor să fie realizat la Este preferabil ca transferul embrionilor să fie realizat la tineretul femel şi primipare tineretul femel şi primipare întrucât prezintă mai puţine întrucât prezintă mai puţine probleme privind infecţiile genitale, iar răspunsul la probleme privind infecţiile genitale, iar răspunsul la tratamentele de stimulare este mai bun.tratamentele de stimulare este mai bun.Transferul nechirurgical Transferul nechirurgical de embrioni la vacile receptoare de embrioni la vacile receptoare se poate face cu embrioni proaspăt recoltaţi, embrioni se poate face cu embrioni proaspăt recoltaţi, embrioni decongelaţi şi embrioni proveniţi din fecundarea in vitro. decongelaţi şi embrioni proveniţi din fecundarea in vitro. Efectuarea transferului nechirurgical constă în Efectuarea transferului nechirurgical constă în depunerea embrionului în corpul uterin ipsilateral depunerea embrionului în corpul uterin ipsilateral corpului galben corpului galben cu ajutorul unor instrumente introduse în cu ajutorul unor instrumente introduse în lumenul uterin prin traiectul cervical.lumenul uterin prin traiectul cervical.În vederea utilizării practice a transferului nechirurgical în În vederea utilizării practice a transferului nechirurgical în fermele de producţie, au fost construite până în prezent fermele de producţie, au fost construite până în prezent o serie de instrumente care permit depunerea o serie de instrumente care permit depunerea embrionilor la diferite nivele ale corpului uterin.embrionilor la diferite nivele ale corpului uterin.

Factorii care pot afecta transferul nechirurgical Factorii care pot afecta transferul nechirurgical al embrionilor pot fi reprezentaţi deal embrionilor pot fi reprezentaţi de ::

calitatea embrionului;calitatea embrionului;

mediul uterin al receptoarei;mediul uterin al receptoarei;

sincronizarea estrului dintre donatoare şi receptoare;sincronizarea estrului dintre donatoare şi receptoare;

prevenirea infecţiilor;prevenirea infecţiilor;

situsul de transfer;situsul de transfer;

tehnica de transfer şi priceperea operatorului;tehnica de transfer şi priceperea operatorului;

calitatea receptoarelor;calitatea receptoarelor;

statusul nutritiv al receptoarelor.statusul nutritiv al receptoarelor.

Alegerea femelelor receptoare de embrioniAlegerea femelelor receptoare de embrioni

Alegerea cu atenţie a femelelor receptoare de embrioni Alegerea cu atenţie a femelelor receptoare de embrioni este o condiţie esenţială a reuşitei embrio-transferului.este o condiţie esenţială a reuşitei embrio-transferului.Cele mai importante criterii Cele mai importante criterii care stau la baza alegerii care stau la baza alegerii femelelor receptoare de embrioni sunt: femelelor receptoare de embrioni sunt: starea generală de sănătate, starea generală de sănătate, integritatea funcţională a organelor genitale, integritatea funcţională a organelor genitale, activitatea ciclica a ovarelor şi a căilor genitale. activitatea ciclica a ovarelor şi a căilor genitale.

Astfel, este preferabil ca transferul de embrioni să se Astfel, este preferabil ca transferul de embrioni să se facă la viţel şi vaci primipare, întrucât prezintă mai puţine facă la viţel şi vaci primipare, întrucât prezintă mai puţine probleme de reproducţie legate de infecţiile genitale, probleme de reproducţie legate de infecţiile genitale, traumatismele peri – parturiale, iar răspunsul la traumatismele peri – parturiale, iar răspunsul la tratamentul de sincronizare este mult mai bun. tratamentul de sincronizare este mult mai bun. Cu toate că receptoarele sunt aparent mai uşor de Cu toate că receptoarele sunt aparent mai uşor de selecţionat, devin o problemă complexă care preocupă selecţionat, devin o problemă complexă care preocupă cercetătorii din domeniul transferului de embrioni cercetătorii din domeniul transferului de embrioni

Înaintea efectuării transferului, precum şi după efectuarea Înaintea efectuării transferului, precum şi după efectuarea lui, lui, se evită factorii stresanţi case evită factorii stresanţi ca: :

schimbarea bruscă a regimului furajer, schimbarea bruscă a regimului furajer,

intervenţia personalului pentru separarea sau intervenţia personalului pentru separarea sau

mutarea animalelor alese, mutarea animalelor alese,

variaţiile climatice, variaţiile climatice,

acţiuni sanitar – veterinare etc. acţiuni sanitar – veterinare etc.

În acest context se are în vedere realizarea unui echilibru În acest context se are în vedere realizarea unui echilibru hormonal sincron, metabolic, de histocompatibilitate, hormonal sincron, metabolic, de histocompatibilitate, pentru a păstra calitatea mediului uterin care pentru a păstra calitatea mediului uterin care condiţionează implantarea, nidarea sau din contră condiţionează implantarea, nidarea sau din contră respingerea embrionului respingerea embrionului

1. Tehnica de inovulare cu ajutorul pistoletului Cassou1. Tehnica de inovulare cu ajutorul pistoletului Cassou

Pistoletul telescopic tip Cassou permite extensia în lumenul Pistoletul telescopic tip Cassou permite extensia în lumenul uterin a unei piese flexibile din plastic, denumită aspibrion, uterin a unei piese flexibile din plastic, denumită aspibrion, care conţine minipaieta cu embrionul aflat în mediul de care conţine minipaieta cu embrionul aflat în mediul de cultură. În acest fel, embrionul poate fi depus profund în cultură. În acest fel, embrionul poate fi depus profund în lumenul cornului uterin, aproape de vârf. lumenul cornului uterin, aproape de vârf.

Tehnica inovulării Tehnica inovulării

Menţionăm că această tehnică necesită pe lângă operatorul calificat, Menţionăm că această tehnică necesită pe lângă operatorul calificat, special pregătit pentru efectuarea acestei tehnici, şi prezenţa unui ajutor special pregătit pentru efectuarea acestei tehnici, şi prezenţa unui ajutor care să acţioneze tija pistoletului. care să acţioneze tija pistoletului.

2. Tehnica cu inovulatorul tip MT2. Tehnica cu inovulatorul tip MT Acest inovulator are o construcţie mult mai simplă, fiind Acest inovulator are o construcţie mult mai simplă, fiind foarte asemănător cu un pistolet de însămînţare artificială, foarte asemănător cu un pistolet de însămînţare artificială, alcătuit dintr-o tija, in interiorul căreia se găseşte un alcătuit dintr-o tija, in interiorul căreia se găseşte un mandren. Prezintă de asemenea un vârf demontabil şi mandren. Prezintă de asemenea un vârf demontabil şi prezintă un orificiu lateral pentru depunerea embrionului. prezintă un orificiu lateral pentru depunerea embrionului. Paieta se introduce fie prin demontarea vârfului, fie prin Paieta se introduce fie prin demontarea vârfului, fie prin adaptarea la tijă adaptarea la tijă

Protocolul inovulării Protocolul inovulării

Această tehnică este superioară celei cu Această tehnică este superioară celei cu inovulatorul tip Cassou, deoarece :inovulatorul tip Cassou, deoarece :

nu este nevoie de prezenţa ajutorului, şi chiar mai mult, nu este nevoie de prezenţa ajutorului, şi chiar mai mult, manopera poate fi executată cu uşurinţă de către manopera poate fi executată cu uşurinţă de către medicul veterinar cu minime cunoştinţe de însămânţare medicul veterinar cu minime cunoştinţe de însămânţare artificială;artificială; nu necesită fonduri suplimentare pentru achiziţionarea nu necesită fonduri suplimentare pentru achiziţionarea ghenelor;ghenelor;nu există riscul ca ghena să rămână în lumenul uterin;nu există riscul ca ghena să rămână în lumenul uterin;dispare riscul refulării materialului în interiorul ghenei.dispare riscul refulării materialului în interiorul ghenei.

METODE CLINICE DE DIAGNOSTIC AL METODE CLINICE DE DIAGNOSTIC AL GESTAŢIEI LA ANIMALE GESTAŢIEI LA ANIMALE

Diagnosticul de Diagnosticul de gestaţiegestaţie prin metode cliniceprin metode cliniceAnamnezaAnamneza

Examenul clinic externExamenul clinic externInspecţia: Inspecţia: Modificarea conturului Modificarea conturului

abdominal, Edemele declive, Dezvoltarea abdominal, Edemele declive, Dezvoltarea glandei mamare, Edemaţierea organelor glandei mamare, Edemaţierea organelor genitale externe, Relaxarea şi infiltraţia genitale externe, Relaxarea şi infiltraţia ligamentelor şi articulaţiilor bazinuluiligamentelor şi articulaţiilor bazinului

semne sigure: semne sigure: Mişcările fetuşilorMişcările fetuşilor

Palpaţia:Palpaţia:la vacă începând din luna a VI-a de la vacă începând din luna a VI-a de

gestaţie, gestaţie,

Ascultaţia:Ascultaţia:din lunile VII - VIII la vacădin lunile VII - VIII la vacă

Examenul clinic internExamenul clinic intern Examenul vaginal cu speculumExamenul vaginal cu speculum

culoarea mată a mucoasei vaginale în primele două treimi de culoarea mată a mucoasei vaginale în primele două treimi de gestaţie şi o congestie vaginală cu evidenţierea reţelei venoase în ultima gestaţie şi o congestie vaginală cu evidenţierea reţelei venoase în ultima treime şi mai ales în preajma fătării;treime şi mai ales în preajma fătării;

prezenţa unei glazuri de mucus vâscos, mat, aderent de mucoasa prezenţa unei glazuri de mucus vâscos, mat, aderent de mucoasa vaginală;vaginală;

perfecta închidere a cervixului şi prezenţa unui dop de mucus perfecta închidere a cervixului şi prezenţa unui dop de mucus cervical;cervical;

poziţia cervixului care variază în funcţie de cornul gestant şi de poziţia cervixului care variază în funcţie de cornul gestant şi de vârsta fetusului. vârsta fetusului.

Examenul vaginal manualExamenul vaginal manual se face pentru a constata gradul se face pentru a constata gradul de permeabilitate a cervixuluide permeabilitate a cervixului..

Examenul transrectalExamenul transrectal topografia cervixului topografia cervixului şşi starea lui de închidere;i starea lui de închidere; topografia uterului;topografia uterului; mmăărimea cornului gestant;rimea cornului gestant; perceperea fluctuaperceperea fluctuaţţiei;iei; palparea placentoamelor;palparea placentoamelor; palparea embrionului, iar apoi a ppalparea embrionului, iar apoi a păărrţţilor din filor din făăt;t; palparea arterei uterine medii palparea arterei uterine medii şşi posterioare;i posterioare; persistenpersistenţţa corpului galben de gestaa corpului galben de gestaţţie dacie dacăă ovarul poate fi ovarul poate fi

palpatpalpat..

Aplicarea radiografieiAplicarea radiografiei

ECOGRAFIAECOGRAFIA

Gestaţie de 17-19 zile Gestaţie 24 zile

Gestaţie 25 zile

Gestaţie 26 zile (gemeni)

Gestaţie 27 zile

Gestaţie 30 zile Gestaţie 35 zile

Gestaţie 42 zile Gestaţie 55 zile

Gestaţie 58 zile

Gestaţie 61 zile

Gestaţie 63 zile

Gestaţie 65 zile