Real-time PCR si alte tehnici noi de PCR

Referat de Chirila Corina

Real-time PCR vs. PCR traditional

Spre deosebire de PCRul clasic real-time PCR permite detectarea rapida a ampliconilor inca din timpul reactiei. Masurarea cineticii reactiei inca din fazele incipiente ale acesteia reprezinta unul dintre avantajele real-time PCR. PCRul traditional permite detectarea si analizarea ampliconilor abia la sfarsitul reactiei.

Avantajele real-time PCR

se economiseste timp deoarece detectia se realizeaza in faza de crestere exponential a reactiei, nu in faza de platou dupa ce reactia a fost stopataacuratete mai mare a rezultatelor obtinutedomeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor)limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta)

Fazele rectiei PCR

Faza exponentiala Faza liniara Faza de platou

Tipuri de real-time PCR

Real-tme PCR relativ Real-time PCR competitiv Real-time PCR comparativ

Reactivi folositi in Real-time PCR

TaqMan Scorpions SYBR

In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora (“reporter dye” R) si la celalat capat cu o molecula blocanta (“quencher dye” Q). Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.

Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare, fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv

Aparatura necesara

Cuantificarea rezultatelor

Metoda curbelor standard

Metoda comparatica Ct

Bibliografie

www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf

http://www.rt-pcr.com/