Reactii antigen-anticorp

Dr. Cristiana Cerasella Dragomirescu

Reactiile antigen anticorp “in vitro”

• I.Seroidentificare: Detectarea şi dozarea Ag (element necunoscut-tulpini microbiene izolate din diferite prelevate)cu ajutorul Ac specifici cunoscuţi.

• II.Serodiagnostic: Detectarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific cunoscut .

REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢIILE SEROLOGICE)

• Reacţia Ag-Ac este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii Antigenului şi paratopii Anticorpilor.

• În acest proces intervin patru tipuri de legături:

- legături de hidrogen,

- legături electrostatice,

- forţele Van der Waals şi

- legături hidrofobe.• Legătura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermică, specifică

şi reversibilă.

• Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizează intensitatea forţelor de legătură a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea sterică dintre paratop şi epitop.

• Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezintă rapiditatea apariţiei manifestării reacţiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenţa Ac, de numărul de epitopi, de temperatură, de pH, de forţa ionică a mediului.

INTERACŢIUNEA ANTIGEN-ANTICORP

I. Faza specifică: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific corespunzător. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reacţiile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică).II. Faza nespecifică, vizibilă a uniunii Ag-Ac, se manifestă prin precipitare, aglutinare, liză, etc - fenomene determinate de anumite condiţii (valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc).

Teoria lui Marrack

Tipuri de reactii Ag- Ac

1. Reactii de precipitare2. Reactii de aglutinare3. Reactii de seroneutralizare 4. Reactia de fixare a complementului5. Reactii in care componentele sunt marcate

- izotopic-RIA- enzimatic- ELISA- fluorescent- FIA- chemiluminiscent- CLA

REACTIILE DE PRECIPITARE• Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este

amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa.

• Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi.

• Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac. Condiţiile de formare a reţelei de precipitare:- Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)- Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate)

• Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraţie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator.În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează.

PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID

Reactia de precipitare inelara• Utilizarea practica: identificarea petelor de

sange, depistarea falsificarilor

produselor alimentare, depistarea

antigenului polizaharidic al agentului

antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli).

Reactia de precipitare in inel

Titrarea toxinei difterice- reactia Ramon:

• Se pun in contact, in amestec, in tuburi cantitati egale din componenta care trebuie titrata (Ag- toxina difterica) cu cantitati variabile de Ac la care titrul este cunoscut

• Cantitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul unde exista raportul de echivalenta. Cunoscand titrul anticorpilor se poate afla titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans= cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina = 1 UA= 1 unitate antitoxica )

• Ex : testul Kahn pentru sifilis, metoda Dean, Web

PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)

• În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor doi reactivi se produce precipitarea sub formă de linii alb-cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie.

• Imunodifuzia simplă radială

(tehnica Mancini)

• Imunodifuzie dublă

(tehnica Ouchterlony)

PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)

PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL)

• Imunodifuzie dublă

(tehnica ELEK)

Reactii de precipitare in mediu solid (gel)

• Contraimunoelectroforeza (CIEF)- Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice

complexe. Lectura este posibila peste 90 minute.

- Electroforeza proteica in gel- Imunelectroforeza = imunodifuzie dubla in camp

electric - Electroimunodifuzia = difuzie simpla mediata de

camp electric

Reactii de aglutinare

• In reactia de aglutinare atg sunt de natura corpusculara

• Reactia de aglutinare consta in reactia atc cu atg de pe suprafata unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol)

• Reactia este mai sensibila decat cea de precipitare

• Atc de tip IgM sunt mai aglutinanti decat cei de tip IgG.

Reactii de aglutinare • Aglutinare “activă” sau “directă”, în care particula

figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii)-se utilizeaza in diagnosticul bacteriologic pt identificarea enterobacteriilor (E. coli, Salmonella si Shigella)

• Aglutinare “pasivă” sau “indirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.- se utilizeaza in determinarea factorului reumatoid, CRP, grupului streptococic

• Reactiile de aglutinare se pot efectua :- pe lama- in tuburi

Reactii de aglutinare

Aglutinarea directa pe lama

Reactia de aglutinare pe lama

• Utilizata in diagnosticul tulpinilor de E. coli, Salmonella, Shigella, Haemophylus influenzae, Vibrio cholerae

• Se utilizeaza seruri polivalente si apoi monovalente ce permit identificarea pana la nivel de specie.

• Reactia de aglutinare indirecta se utilizeaza pt det grupului streptococic, serotiparea pneumococilor, serogruparea meningococilor, detectarea unor enterotoxine stafilococice, detectarea unor fungi, etc…

Reactia de aglutinare in tuburi• Se utilizeaza pt:

- confirmarea aglutinarii pe lama- determinarea atg de tip O la bacteriile care prezinta atg H sau K (care ar putea inhiba aglutinarea cu atg O), cultura se mentine 1-2 ore la 100 grade C- se efectueaza dilutii din serul standard care contine atc si se pun in contact cu cantitati egale din suspensia de atg. Reactia este pozitiva in cazul in care apar aglutinate (grunjoase in cazul atg O si floconoase in cazul atg H)

Reactia de aglutinare in serodiagnostic utilizand atg standard

• Pe lama: - reactia Huddleson in diagnosticul brucelozei si reactia Kudicks-Steuer in diagnosticul tifosului exantematic

• In tuburi: - reactia Wright utilizata in diagnosticul serologic al brucelozei si reactia Widal in diagnosticul febrei tifoide (utilizeaza seruri recoltate in dinamica) si se det atc anti O, anti H si anti Vi (prin hemaglutinare pasiva)

• Complementul = constituent important al apararii naturale cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice

• Se poate activa: - pe cale clasica declansata de complexele atc-atg, celule apoptotice, virusuri, CRP - cale lectinica activata de microorganisme - cale alterna activata de bacterii, virusuri, celule tumorale

Reactia de fixare a complementului

Reactia de fixare a complementului

Reactie al carei rezultat nu poate fi vizualizat fara un sistem indicator. Sistemul indicator este format din hematii de berbec si atc anti hematii de oaie.Se utilizeaza in diag sifilisului reactia Bordet Wasserman.

• R + = in tuburile cu serul de cercetat nu apare hemoliza (hematiile se depun in buton)

• R - = in serul de cercetat nu exista atc si in aceste tuburi apare hemoliza

Reactia de fixare a complementului

Reactia de seroneutralizare - In aceasta reactie atg are o anumita proprietate biologica (toxica sau enzimatica) care poate fi blocata prin cuplarea cu anticorpii specifici.● Diagnosticul microbiologic direct : identificarea Clostridium perfringens metoda placilor seroneutralizante; testarea toxinogenezei tulpinilor de C. diphtheriae toxinotipia in suspiciunea unei infectii cu Clostridium botulinum ● Diagnosticul serologic Testul ASLO determinarea atc anti streptolizina O ●Reacţia de imobilizareUnii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)

Reactia ASLO

Reactie pozitiva prezenta atc =

absenta hemolizei

Reactie negativa absenta atc =

prezenta hemolizei

-Se realizeaza in tuburi in care se dilueaza serul de testat.

-Titrul de anticorpi antistreptolizina O este dat de ultimul tub in care lipseste hemoliza

-Pt Romania se accepta ca titru normal 200-250 unitati ASLO

Reactia de seroneutralizare1. Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin

seroneutralizare ( ex. Vaccinul DTP)2. Evaluarea eficacitatii vaccinurilor

- IDR Dick testarea susceptibilitatii fata de scarlatina- IDR Schick testarea susceptibilitatii fata de difterie

- Atg se inoculeaza intradermic, in treimea medie a antebratului, iar daca in serul pacientului exista atc anti toxina acestia vor neutraliza atg inoculat si la locul injectarii nu va aparea reactie.

3. Terapia sau profilaxia specifica (imunoterapia pasiva) consta in administrarea de: - imunoglobuline specifice omologe obtinute de la persoane imunizate

- imunoglobuline specifice heterologe (ser de cal)

Reactii in care componentele sunt marcate Componentele reactiei pot fi marcate:-Fluorescent (FIA) -Enzimatic (ELISA) - Izotopic (RIA)-Chemiluminiscent (CLA)

Reactie pozitivaReactie negativa

Reactia de imunofluorescenta

Reacţia Imuno-Enzimatică (RIE, ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assays). - RIE directă (metoda sandwich). Utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de

polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzima, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag

polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incoloră, dar care se colorează sub

acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

ELISA

RIA Radio Immuno Assey- Este o reactie de competitie intre doua antigene: un

atg marcat cu un izotop radioactiv si unul nemarcat (atg de testat)

- R+ : atg din proba formeaza complexe imune cu atc din serul standard iar la adaugarea atg marcat acesta nu va fi folosit in reactie = nivel de radioactivitate scazuta

- R- : absenta atg din proba faciliteaza legarea atg marcat de atc din serul standard = nivel de radioactivitate ridicat