Raport stiintific privind implementarea proiectului PCCE ”Deteriorarea cailor de semnalizare in sistemul nervos central imbatranit. Implicatii pentru recuperarea tisulara si functionala dupa stroke.” nr. 314/2011 in perioada ianuarie – decembrie 2014 Accidentele vasculare cerebrale ischemice ocupa locul al doilea in ceea ce priveste morbiditatea si primul loc in randul afectiunilor ce sunt urmate de dizabilitate pe termen lung cu costuri ridicate pentru familie si societate, in tarile dezvoltate. Pentru terapia accidentelor vasculare cerebrale ischemice nu exista astazi un tratament eficient care sa vizeze perioada de recuperare, cu exceptia terapiei de repermeabilizare ce poate fi aplicata in primele 36 ore dupa instalarea ischemiei. Studiile asupra ischemiei cerebrale pe animale experimentale au demonstrat eficacitatea neuroprotectoare a unei varietăţi de intervenţii, dar majoritatea strategiilor care au fost testate nu au arătat niciun beneficiu pentru indivizi. O posibilă explicaţie pentru această discrepanţă dintre studiile experimentale şi clinice ar putea fi rolul pe care îl joacă vârsta în recuperarea creierului. Întradevăr creşterea în funcţie de vârstă a conversiei ţesutului ischemic către infarct sugerează că vârsta este un evidenţiator biologic pentru variabilitatea în debitul ţesutului la accidentul vascular cerebral la oameni. Scopul major al acestui proiect este acela de a stimula potentialul endogen al creierului în ceea ce priveste capacitatea de regenerare, pentru a imbunatati recuperarea tisulara si functionala dupa accidentul vascular ischemic, folosind un model animal de ischemie cerebrala pe soareci. Cuprins: Pentru etapa 2014 a proiectului nostru am avut propuse următoarele obiective: 1) Dezvoltarea de noi strategii de refacere tisulara si functionala a creierului imbatranit dupa AVC in model animal; (ii) identificarea la nivel de transcriptom, de cai de semnalizare implicate in imbatranirea sanatoasa si recuperare dupa AVC in model animal
Transcript
Raport stiintific
privind implementarea proiectului PCCE ”Deteriorarea cailor de
semnalizare in sistemul nervos central imbatranit. Implicatii pentru
recuperarea tisulara si functionala dupa stroke.” nr. 314/2011 in perioada
ianuarie – decembrie 2014
Accidentele vasculare cerebrale ischemice ocupa locul al doilea in ceea ce
priveste morbiditatea si primul loc in randul afectiunilor ce sunt urmate de dizabilitate
pe termen lung cu costuri ridicate pentru familie si societate, in tarile dezvoltate.
Pentru terapia accidentelor vasculare cerebrale ischemice nu exista astazi un
tratament eficient care sa vizeze perioada de recuperare, cu exceptia terapiei de
repermeabilizare ce poate fi aplicata in primele 3-‐6 ore dupa instalarea ischemiei.
Studiile asupra ischemiei cerebrale pe animale experimentale au demonstrat eficacitatea
neuroprotectoare a unei varietăţi de intervenţii, dar majoritatea strategiilor care au fost
testate nu au arătat niciun beneficiu pentru indivizi. O posibilă explicaţie pentru această
discrepanţă dintre studiile experimentale şi clinice ar putea fi rolul pe care îl joacă vârsta în
recuperarea creierului. Într-‐adevăr creşterea în funcţie de vârstă a conversiei ţesutului
ischemic către infarct sugerează că vârsta este un evidenţiator biologic pentru variabilitatea
în debitul ţesutului la accidentul vascular cerebral la oameni.
Scopul major al acestui proiect este acela de a stimula potentialul endogen al
creierului în ceea ce priveste capacitatea de regenerare, pentru a imbunatati
recuperarea tisulara si functionala dupa accidentul vascular ischemic, folosind un
model animal de ischemie cerebrala pe soareci.
Cuprins:
Pentru etapa 2014 a proiectului nostru am avut propuse următoarele obiective:
1) Dezvoltarea de noi strategii de refacere tisulara si functionala a creierului imbatranit
dupa AVC in model animal; (ii) identificarea la nivel de transcriptom, de cai de semnalizare
implicate in imbatranirea sanatoasa si recuperare dupa AVC in model animal
Justificare: Este cunoscut ca mediul cortical din creierul batran este nefavorabil
refacerea tisulare dupa AVC. Cauza principala este formarea unei cicatrice care in
tesuturile periferice este benefica pentru organism dar in creier blocheaza cesterea
axonala si migrarea celelor fie injectate fie endogene. Ne-‐am propus sa detectam
capacitatea reziduala a mediului micromediului cortical din creier batran prin metode
indirecte bazate pe fenotipizarea celulelor nou generate ca urmare a leziunii corticale.
Activitati
1.1. Behavioral testing of post-‐stroke young and aged animals
1.1.1. Ocluzia ireversibilă a arterei cerebrale medii
Infarctul cerebral a fost indus prin cauterizarea arterei cerebrale medii. Optsprezece ore
înainte de intervenția chirurgicală, șobolanii au fost privați de hrană. Apa a rămas disponibilă
în orice moment. Artera cerebrală medie dreptă a fost ridicată cu un cârlig de tungsten
atașat la un micromanipulator (Maerzhaeuser Precision Micro-‐manipulator Systems, Fine
Science Tools) si cauterizata. Ambele artere carotide comune au fost apoi ocluzionate timp
de 90 de minute prin strângerea unei bucle pre-‐poziționate folosind un stereomicroscop 5x
şi având la dispoziţie instrumente chirurgicale specifice. De-‐a lungul operației, anestezia a
fost menținută prin inhalare spontană de halotan 1-‐1,5% într-‐un amestec de 75% protoxid
de azot și 25% oxigen. Amestecul a fost administrat cu ajutorul unei cuşti etanşe, din
plexiglas. Cuşca a fost folosită pentru inducerea anesteziei, iar pentru menţinerea anesteziei
pe tot parcursul intervenţiei chirugicale s-‐a folosit o mască special concepută pentru acest
scop. Temperatura corpului a fost permanent monitorizaţă cu ajutorul unei sonde
intrarectale şi menținută la aproximativ 37°C cu ajutorul unei pături homeotermice
1.1.2 Stimularea neurogenezei endogene la soareci sa realizat prin stimulare la nivelul
urechii, unilateral cu curenti mici (ECS) 12–50 mA, 60 pulsuri/sec, T = 0.5-‐msec, t=1-‐sec
utilizand un aparat comercial. Acesti parametri au fost optimizati in experimente preliminare
unde neurogeneza endogena a fost cuantificata prin injectare de BrdU (50 mg/kg corp),
sectionarea creierelor si numarara de celule proliferative in zona subventriculara. Critic la
acest mod de A doua metoda de stimulare a neurogenezei endogene este chimica, folosind
un medicament din clasa SSRI, fluoxetina, acre este cunoscuta pt activitate de stimulare a
neurgenezei endogene desi la un nivel mai scazut fata de metoda ECS si care se manifetsa
foarte lent, efectul fiin masurabil dupa citca 4 saptamani. In mod smilar cu prima metoda,
doza optima de stimulare a fost optimizata in experimente preliminare unde neurogeneza
endogena a fost cuantificata prin injectare de BrdU (50 mg/kg corp), sectionarea creierelor si
numarara de celule proliferative in zona subventriculara.
Rezultate
1.1.3. Evaluarea efectului neurogenic prin testari functionale si de comportament
2.1. Analiza transcriptoma dupa stroke
Justificare: Schimbarile de expresie genica in imbatranire se fac clasic prin analiza de tip
Northern Blot. Aceasta metoda are 2 neajunsuri majore: (i) permite analiza a uni mic de gene
(1-‐5); (ii) eroarea de determinare este relativ mare astfel incat schimbari de expresie genica
mici dar importante pt refacerea tisulara, nu sunt detectabile. Ipoteza noastra de lucru a fost
amplificarea semnalului expresiei genice prin leziune si monitorizarea procesului de
recuperare tisulara si functionala prin tehnologia Affymetrix.
Activitati
2.1 Crearea unei baze de date de tip transcriptome pentru creierul sanatos si lezionat prin
AVC la animale tinere si animale batrane. Tehnica include: (i) izolare de RNA total prin
metoda TRIZOL; (ii) verificarea calitatii si cantitatii de RNA prin electroforeza; (iii) hibridizare
utilizand chip-‐uri specifice de la firma Affymetrix; (iv) analiza trascriptomica comparativa cu
urmatorii factori de variabilitate: varsta; leziune: timp post-‐stroke. A rezultat o baza de date
pe baza careia au fost generate noi tinte terapeutice.
Extracția ARN-‐ului și controlul calității ARN-‐ului
După ce țesutul a fost omogenizat, ARN total a fost extras din țesutul microdisecat
utilizând reactivul TRIzol (Invitrogen life technologies, Karlsruhe, Germania). ADN-‐ul genomic
a fost eliminat cu ajutorul Rneasy Plus Kit (Qiagen). ARN-‐ul purificat l-‐am folosit în etapele de
cDNA arrays şi RT-‐PCR.
Numele corect al metodei este extracția Guanidinium tiocianat-‐fenol-‐cloroform.
Randamentul extracţiei ADN-‐ului și ARN-‐ului prin utilizarea kit-‐ului TRIzol este comparabil cu
alte metode de extractie. O metodă alternativă pentru extracția ARN-‐ul este reprezentată de
extracția cu fenol și precipitatrea cu TCA/acetonă. Cloroformul poate fi înlocuit cu 1-‐bromo-‐
3-‐cloropropan atunci când se utilizează noua generație TRI-‐reactivi.
TRIzol este sensibil la lumină și atunci când este utilizat, se aseamănă cu un sirop de
tuse, de culoare roz luminos. Mirosul de fenol este extrem de puternic. TRIzol funcționează
prin menținerea integrității ARN-‐ului în timpul omogenizării tisulare, dar în același timp
reactivul distruge celulele și componentele celulare. Produce şi o inhibare imediată și extrem
de eficientă a activității RN-‐aselor în timpul lizei sau omogenizării probei.
Kit-‐ul TRIzol de purificare a ARN-‐ului oferă o metodă simplă, fiabilă și rapidă pentru
izolarea ARN-‐ului total dintr-‐o mare varietate de probe, inclusiv probe animale cât și probe
vegetale. Kit-‐ul utilizează capacitatea de liză puternică a reactivului TRIzol urmat de un
protocol convenabil ca timp şi spaţiu. Se economiseşte în principal foarte mult timp,
purificarea fragmentelor totale de ARN ultrapure producându-‐se într-‐o oră, chiar și pentru
probe dificile, cum ar fi țesutul fibros.
Reactivul TRIzol este o soluție de izotiocianat de fenol monofazic, guanidină, precum
și alte componente a căror principală proprietate este aceea de a facilita izolarea unei mari
varietăţi de specii de ARN de mari sau mici dimensiuni moleculare. ADN-‐ul şi proteinele vor fi
astfel izolate prin succesiunea de precipitări din timpul fazei fenolice.
Am folosit acest scurt protocolul de izolare a ARN-‐ului :
• Timpul 1-‐omogenizarea tisulară:
Ø am folosit un omogenizator de ţesut (Tekmar's Tissumizer) la o viteză de 8000 rpm.Ţesutul a
fost depozitat în tuburi sterile de 5 ml. La fiecare 100mg de ţesut am folosit 1ml reactiv
TRIzol.
• Timpul 2-‐ etapa de extracţie
Ø după omogenizarea probei de ţesut am adăugat 0,2 ml cloroform pentru fiecare 1 ml de
reactiv TRIzol, iar apoi timp de 10 min şi la 4°C am centrifugat proba la viteza de 12500 rpm.
ARN-‐ul total astfel obţinut a fost apoi purificat cu ajutorul kit-‐ului RneasyMini (Qiagen,
Hilden, Germany). Kituri-‐urile RNeasy Mini sunt special concepute pentru a izola ARN total
din mici cantități de probă. Acestea oferă o metodă rapidă și simplă pentru detectarea de
până la 100 micrograme de ARN din celulele animale, din țesuturi, bacterii şi drojdie.
Hibridizare microarray
Înainte de preprocesarea probei, integritatea ARN-‐ului a fost evaluată cu nanokitul ARN
6000 folosind instrumentul Bioanalyzer 2100 (Agilent, Böblingen, Germania). Valorile de
integritate ARN au variat între 6,5 și 8,2. 200ng din fiecare probă au fost prelucrate cu kit de
expresie a transcriptului complet (whole transcript -‐ WT) (Ambion, Darmstadt, Germania),
adică a fost amplificat ARN-‐ul prin revers-‐transcripție la ADNc dublu catenar și ulterior
transcripție in vitro, urmată de o nouă rundă de revers-‐transcripție rezultând ADN
monocatenar sens. Amestecurile de hibridizare au fost realizate după fragmentarea și
etichetarea cu biotina a ADN-‐ului țintă conform protocolului GeneChip WT, kit de etichetare
terminală (Affymetrix, Santa Clara, CA). Sistemul GeneChip WT reprezintă unul dintre cele
mai bune sisteme, raportat la eficienţă şi costuri, pentru determinarea expresiei genice a
întregului trasncriptom. Sondele sunt distribuite pe întreaga lungime a genei, oferind o
imagine mai completă și precisă raportată la expresia de ansamblu a genelor. Transcripţia
genică îndeplineşte importante roluri biologice şi poate fi acum detectată cu ajutorul
platformei mai sus amintite. Sistemul prezintă numeroase avantaje, printre care amintim
costurile scăzute pentru acoperirea întregului transcriptom, analiza concomitentă a mai
multor probe de pe diferiti exoni, comprimate într-‐o singură expresie genică ce înglobează
toate transcripţiile unei singure gene, existenţa unei baze de date a celor mai cunoscute
gene precum şi un protocol simplificat de lucru.
Hibridizarea microarray pentru GeneChip Rat Gene 1.0 ST arrays (Affymetrix) a fost
efectuată în conformitate cu protocolul producătorului folosind Fluidics Station 450 cu
programul FS450_0007. Fișierele CEL scanate din microarrays au fost generate cu consola de
expresie (Affymetrix).
Evaluarea Microarray-‐urilor
Înalta și constanta calitate a datelor obținute din microarray a fost asigurată prin inspecția
vizuală a imaginilor scanate pentru descoperirea de artefacte de hibridizare și analiza
corespondenței dintre datele microarray brute și cele normalizate. Normalizarea a fost
efectuată prin metoda cuantilelor [Bolstad, 2003], iar corecția de fond și sumarul setului de
valori au fost realizate cu Robust Microarray Average (RMA) [Irizarry, 2003]. Rata
rezultatelor false (RIF) a genelor exprimate diferit în comparații perechi a fost estimat printr-‐
o metodologie empirică Bayes care implică o distribuție logaritm normală [Kendziorski,
2003]. Toate analizele au fost efectuate în R versiunea 2.14.0 (www.r-‐project.org), împreună
cu pachetele Bioconductor (www.bioconductor.org): affy, EBarrays și made4.
PCR cantitativ în timp real
Pentru PCR cantitativ în timp real (qPCR), am sintetizat ADNc din fonduri mari (n = 19-‐24) de
ARN total utilizând kitul de revers transcripție High-‐Capacity cDNA (Applied Biosystems,
USA). qPCR a fost efectuat pe o placă cu pereți subțiri cu 96 de godeuri de 0.1 ml (Applied
Biosystems), folosind sistemul One Step Plus (Applied Biosystems).
Fiecare tub de 20µl a conținut 10µl iQ SYBR Green Master Mix (BioRad Laboratories,
Hercules, CA), 2µl primer sens și anti-‐sens specific genei (Qiagen, Alameda, CA) și 8 µl de
ADNc pre-‐diluat Controalele „NO” au conținut apă fără nucleaze. Condițiile fiecărui ciclu de
amplificare au fost: 3 min 95°C pentru a activa iTaq ADN-‐polimeraza, urmată de 45 de cicluri
de denaturare de 30s la 95°C, atașarea primerilor 30s la 58 ° C și extensia de 30 s la 72°C. La
sfârșitul ciclurilor de amplificare, curbe de topire au fost folosite pentru a valida
specificitatea rezultatului PCR. Toate probele au fost amplificate în triplicat. Datele au fost
analizate folosind metoda ΔΔCt (Livak și Schmittgen 2001).
Metoda comparativă ΔΔCt este asemănătoare cu metoda curbei standard, doar că
această metodă utilizează formule matematice în scopul obţinerii aceluiaşi rezultat pentru
cuantificarea relativă. Descriem în continuare formulele aritmetice folosite la interpretarea
metodei.
Valorea tintă este determinată cu ajutorul formulei ΔΔCt, normalizarea fiind iniţiată
atît în raport cu un primer endogen cât şi cu un calibrator. Nivelurile de expresie a genelor
de interes au fost normalizate la nivelul mediu de expresie a două gene „housekeeping”
(gene implicate în meținerea funcțiilor celulare de bază) (hipoxantin guanin fosforibozil
transferaza 1, HPRT1 și proteina ribozomală 19, RPL 19) din aceeași probă. Deci, expresia
relativă pentru o gena de interes a fost definită ca raportul dintre expresia genei respective
și o genă „housekeeping”. Coeficientul de multiplicare a expresiei genei de interes a fost
definit ca raportul dintre expresia relativă a acesteia în emisfera ipsilaterală (afectată de
AVC, peri-‐infarctizată), și cea a animalelor neoperate. Toți primerii au fost furnizați de
Eurofinn, Germania.
Rezultate
2.2. Cuantificarea proteinelor identificate prin metode genomice. In acest scop am
dezvoltat a noua tehnica de analiza, Dot Blot-‐ELISA. Sumar, aceasta tehnica se realizeaza
astfel. CD31 a fost identificat prin metode transcriptomica si cuantificat utilizand metoda Dot
Blot-‐ELISA. Pe scurt, tesutul din zona lezionata a fost omogenizat in TRIzol si dupa izolare
RNA precipitatul proteic a fost dizolvat in 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % CHAPS, 65 mM DTT si
40 mM Tris. Apoi 2 µg proteine au fost aplicate pe o membrnaa de tip PVDF utilizand un
aparat specific de la Hoeffer Scientific. De la acest pas, procedeul devine de tip ELISA fara
insa a dezmembra aparatul de Dot Blot. Detectia s-‐a facut prin chemiluminiscenta si
cuantificarea s-‐a realizat cu Image J.
2.3. Analiza imunhistochimica a unor protein identificate prin analiza genomica.
Material: Sectiuni de criostat dupa AVC, grosime 25 µm-‐thick. Ziua 1: Aplicare primul
anticorp primar (CD31, Mouse); Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween
Fixare cu PFA 4% , 10 min; Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween.
Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton, 1% , restul 1xPBS /0.2%
Tween. Inlocuire blocking cu anticorp primar: Rabbit anti Prolyl hydroxilaza 1/1000 in 3%
GS, restul 1x PBS /0.2% Tween. Pastrare la 4 gr C peste noapte.
Ziua 2: Spalare de 3x3 min cu 1xPBS/0.2% Tween; Anticorp secundar : Goat anti Rb CFL 555
dilutie 1/1000 in 1% GS , restul 1xPBS; Mentinere pe sectiuni cca 5 ore la RT , sub agitare.
Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween. Fixare cu PFA 4%, 10 min. Spalare 3x3 min cu
1XPBS/0.2% Tween. Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton,
1% , restul 1xPBS /0.2% Tween. Inlocuire blocking cu al doilea anticorp primar: Ms anti
serotonin receptor , dilutie 1/4000, peste noapte la 4 gr C in 3% GS, restul 1x PBS /0.2%
Tween.
Anticorp secundar: Goat anti Ms POD polimer dilutie 1/10 in 1% GS, restul 1xPBS. Pastrare
sub agitare timp de 5 ore la temp. camerei.
Coloratie sistem Tiramida –FITC. Dilutia finala pe lama 1/500. Alti anticopri folositi pentru
fenotipizare si proliferare celulara: rabbit anti-‐lamini-‐5 (1:2000, Sigma); Rat anti-‐BrdU
(1:2000, Serotec). S-‐a constatat o decalare in timp a raspunsului genic la creierul batran care
s-‐a reflectat si intr-‐un raspuns celular intarziat cu consecinte nefavorabile pentru
recuperarea morfo-‐functionala (lucrari publicate sau aflate in curs de publicare).
Evaluarea recuperării memoriei spaţiale prin testul labirintului radial
Pentru această evaluare, animalele au fost testaţe într-‐un labirint radial. ce prezintă o
zonă centrală, de la care pleacă radiar 8 braţe simetrice, conturând o formă circular-‐
octogonală. Acest dispozitiv a fost ridicat la 60 cm înălţime, pentru a evita ieşirea Animlanilor
din labirint peste peretele braţelor.
Animalele au fost plasaţi la capătul unuia dintre cele 8 braţe, folosit totdeauna ca
start, iar celelalte trasee (braţe) fiind considerate ca destinaţii. Compartimentul de start şi
fiecare dintre cele 8 destinaţii au fost etichetate cu simboluri albe şi negre, de diferite forme
geometrice, pentru orientarea animalelor.
Animalele, privaţi de hrană din seara precedentă, au fost plasaţi în labirint în braţul
de start şi, la capătul unuia dintre celelalte braţe, a fost plasată hrană. Aceştia, după ce au
găsit hrana, au fost scoşi din labirint, urmând ca după un interval de 30 de minute să fie
plasaţi în acelaşi labirint, cu hrana în aceeaşi poziţie, fiind nevoiţi să „îşi reamintească” braţul
cu recompensa alimentară.
Notarea şi cuantificarea rezultatelor a fost efectuată astfel:
Ø 0 pentru un parcurs de succes, în care Animlanul a găsit recompensa alimentară,
reamintindu-‐şi poziţia acesteia;
Ø 1 pentru eşecul găsirii hranei într-‐un timp mai mic de 3 minute, considerându-‐se că acest
interval de timp este suficient pentru un găsirea recompensei.
4. RotaRod
Evaluarea funcţiei vestibulo-‐motorie prin testul rotarod (puntea rotitoare)
Acest test evaluează funcţiile vestibulară şi motorie fină, în cazul recuperării după
ischemia cerebrală, la model animal. Fiecare animal a fost testat în ceea ce priveşte
capacitatea de a se adapta la trecerea peste o punte rotitoare, a cărei viteză de rotaţie poate
fi modificată.
Dispozitivul constă într-‐un cilindru cu o lungime de 160 cm şi diametru de 12 cm,
acoperit cu o suprafaţă semidură, pentru a nu permite animalelor să alunece. Cilindrul se
poate roti, cu ajutorul unui potenţiometru, putând ajusta viteza de la 0 la 6 rotaţii pe minut.
Animalul a fost plasat pe cilindru, măsurându-‐se timpul necesar pentru a traversa
cilindrul şi de a ajunge la capătul distal, unde se găseşte un grup de animale, plasate într-‐o
cuşcă, pentru a favoriza deplasarea acestuia. Rezultatele au fost exprimate sub forma a
două entităţi: timpul necesar traversării şi scorul acordat de către examinator
comportamentului animalului de experienţă în timpul traversării, după următoarea schemă:
Ø 0 -‐ Animalul cade imediat după plasarea pe cilindru, fără a se putea deplasa;
Ø 1 -‐ Animalul rămâne pe rotor, dar nu avansează, menţinându-‐şi totuşi poziţia;
Ø 2 -‐ Animalul avansează, dar cade înainte să ajungă la capătul distal al cilindrului;
Ø 3 -‐ Animalul traversează, dar membrele sunt folosite asimetric, cu preponderenţă membrul
stâng se dovedeşte a fi deficitar;
Ø 4 -‐ Animalul traversează, dar membrul stâng este folosit mai puţin de 50% din timpul
necesar traversării;
Ø 5 -‐ Animalul traversează cu succes, dar având mici dificultăţi în a-‐şi menţine echilibrul;
Ø 6 -‐ Animalul traversează fără greşeală cilindrul, prezentând mişcări simetrice ale membrelor.
Pentru acest test, Animlanii trebuie antrenaţi cel puţin 10 zile înainte de intervenţia
chirurgicală, iniţial fără rotire, dar apoi crescând uşor viteza de rotaţie a cilindrului, până se
ajunge la 6 rotaţii pe minut.
2.2. Prepare the data for national and international conferences and publications
Gaman AM, Buga AM, Gaman MA, Popa-‐Wagner A. The role of oxidative stress and the effects of antioxidants on the incidence of infectious complications of chronic lymphocytic leukemia. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:158135. doi: 10.1155/2014/158135. Epub 2014 Oct 14. (IF = 3,4) Scheller A, Vivien D, Kirchhoff F, Orset C, Sandu RE, Popa-‐Wagner A. (2014) Imaging neuroinflammation after brain injuries by ultrasensitive MRI and two-‐photon laser-‐scanning microscopy. Rom J Morphol Embryol. 55:735-‐43. (IF = 0,80) M F-‐Stanculete, AM Buga, A Popa-‐Wagner and D Dumitrascu (2014). The relationship between irritable bowel syndrome and psychiatric disorders: from molecular changes to clinical manifestations. J Mol Psychiatry 2014, 2:4 doi:10.1186/2049-‐9256-‐2-‐4 M Sanmarti, L Ibáñez, S Huertas, D Badenes, D Dalmau, M Slevin, J Krupinski, A Popa-‐Wagner and A Jaen (2014) HIV-‐associated neurocognitive disorders. J Mol Psychiatry 2014, 2:2 doi:10.1186/2049-‐9256-‐2-‐2 Popa-‐Wagner A, Buga A-‐M, Doeppner TR and Hermann DM (2014) Stem cell therapies in preclinical models of stroke associated with aging. Front. Cell. Neurosci. 8:347. doi: 10.3389/fncel.2014.00347 (IF = 4.2) Popa-‐Wagner A, Buga AM, Tica AA, Albu CV (2014) Perfusion deficits, inflammation and aging precipitate depressive behaviour. Biogerontology Jul 18. [Epub ahead of print] (IF = 3,4) Balseanu, A, A-‐Ma Buga, D-‐C Wagner, J Boltze, K Reymann, W Schaebitz and A Popa-‐Wagner (2014). Multimodal approaches for regenerative stroke therapies: Combination of G-‐CSF with BM MSC is not superior to G-‐CSF alone. Frontiers Aging Neurosci. Front Aging Neurosci. Jun 23;6:130. doi: 10.3389/fnagi.2014.00130. eCollection 2014 (IF = 5,4) Tatarishvili, Oki K, Buga AM, Popa-‐Wagner A, Brüstle O, Lindvall O, Kokaia Z. (2014) Human induced pluripotent stem cells improve recovery in stroke-‐injured aged rats. Restor Neurol Neurosci. 2014 Jun 10. [Epub ahead of print] (IF = 2,9) Muresanu DF, Popa-‐Wagner A, Stan A, Buga AM, Popescu BO (2014). The vascular component of Alzheimer's disease. Curr Neurovasc Res. 11:168-‐76. (IF = 2,9) Buga AM, Margaritescu C, Scholz CJ, Radu E, Zelenak C, Popa-‐Wagner A. (2014) Transcriptomics of post-‐stroke angiogenesis in the aged brain. Front Aging Neurosci. 18;6:44. doi:0.3389/fnagi.2014.00044. (IF = 5,4) Freret T, Gaudreau P, Schumann-‐Bard P, Billard JM, Popa-‐Wagner A. (2014) Mechanisms underlying the neuroprotective effect of brain reserve against late life depression. J Neural Transm. Jan 5. [Epub ahead of print] (IF = 3,0) Di Napoli M, Parry-‐Jones AR, Smith CJ, Hopkins SJ, Slevin M, Masotti L, Campi V, Singh P, Papa F, Popa-‐Wagner A, Tudorica V, Godoy DA. (2014) C-‐reactive protein predicts hematoma
