RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC

Denumirea proiectului: NANOSTRUCTURI BIOACTIVE PENTRU STRATEGII TERAPEUTICE INOVATOARE (NANO-LIFE) Cod proiect : PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0749 Perioada de raportare: 16.04.2018-31.12.2018 Denumirea etapei 1: Standardizarea tehnologiilor de obținere și caracterizare a celulelor care vor fi utilizate in proiect: keratinocite, fibroblasti, celule stromale mezenchimale (MSC), a exosomilor precum si a nanoparticulelor cu proprietăți antibacteriene Rezumat In aceasta etapa s-a realizat izolarea principalelor tipuri celulare de la nivelul tegumentului uman (keratinocite, fibroblaste) precum si a celulelor stromale mezenchimale (MSC) din cicatrici cheloide tegumentaresi din țesutul adipos (ADSC)precum și caracterizarea biologică a acestora în culturi de celule. De asemenea, s-a urmărit obținerea si caracterizarea comparativa a exosomilor izolați din celulele stromale mezenchimale umane provenite din cele 2 surse, precum si testarea citotoxicității nanoparticulelor pe celulele izolate de la nivelul tegumentului. Am efectuat testarea nanoparticulelor in medii de cultura microbiene si la animale de laborator. Rezultatele proiectului au fost diseminate prin publicarea a 3 articole in reviste indexate ISI Web of Science, patru lucrari prezentate la congrese nationale si internationale si prin site-ul proiectului http://www.umfcv.ro/45pccdi A1.1 Recoltarea de fragmente de piele si țesut celular subcutanat uman pentru extragerea de MSC, fibroblaste și keratinocite Indicatori de realizare: Documentaţie recoltare fragmente – grad de realizare 100% Participanți:UMFCD

S-a elaborat consimțământul informat al pacientului în care s-a obținut acordul pentru a participa în cadrul proiectului de cercetare. S-a elaborat documentația necesară pentru obținerea avizului de etică al U.M.F.„Carol Davila” București.

În urma obținerii consimţământului pacientului, s-au recoltat minim două probe de țesut cutanat (maxim 12 cm2 /probă) și/sau două probe de lipoaspirat (maxim 50 de ml/probă). Acestea au fost recoltate în recipiente sterile furnizate de Institutul de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu”. Tuburile sterile cu ser fiziologic sunt păstrate la 4°C, cele cu antibiotic la -20°C. Probele se recoltează în tuburile cu ser fiziologic peste care se adaugă conținutul tuburilor cu antibiotic. Acestea sunt păstrate la 4°C câteva ore până când sunt preluate și transportate de un angajat al Institutului de Biologie și Patologie Celulară. În studiu au fost incluși 9 pacienți, de la care au fost prelevate probe de tegument normal (tegument falanga mijlocie deget expandată prin efectul de compresie al unei tumori benigne de părți moi, tegument preauricular de la nivelul feței, tegument pleoapă superioră, tegument abdomen și țesut adipos recoltate cu bisturiul clasic și electric, piele liberă despicată recoltată cu dermatomul electric de la nivelul coapsei) și tegument cicatriceal (cicatrice postcombustională de la nivelul brațului și peretelui toracic lateral drept vechi de 12 ani, cicatrice postcezariană veche de 3 ani, cicatrice brat drept veche de 9 ani, cicatrice postcombustională față dorsală genunchi drept veche de 25 de ani, recoltate cu bisturiul clasic). Nu au fost prelevate probe de lipoaspirat.

Probele au fost conservate conform indicațiilor și transportate în maxim 4 ore de la recoltare pentru a fi prelucrate în cadrul Institutului de Biologie și Patologie Celulară. Probele recoltate nu au depășit 12 cm2 / probă, fiind recoltate minim două probe de la fiecare pacient.

1

A1.2 Standardizarea protocolului de recoltare si izolare a celulelor epiteliale si a fibroblastelor umane Indicatori de realizare: Protocoale experimentale (documentație) – grad de realizare 100% Participanți: INBPNS

Pentru a izola keratinocitele, respectiv fibroblastele din piele, a fost necesarăfragmentarea probei (a fragmentelpr de tegument uman) si separarea celor 2 componente ale acesteia: epiderma si dermul. Acest lucru s-a realizat prin tratamentul cu dispaza (2h/37°C), enzima care acționează la nivelul membranei bazale, clivând moleculele de fibronectina si colagen de tip IV. In urma acestui tratament, cele 2 componente ale pielii au fost prelucrate diferit, după cum se poate observa in Figura 2.1.

Figura 2.1 Reprezentarea schematica a protocolului de obținere de celule din pielea umana

Astfel, dupăseparare, epiderma a fost mărunțită si supusa unui proces de digestie enzimatica utilizând tripsina, timp de 15 min /37°C. Ulterior, enzima a fost inhibata cu mediu complet conținând ser fetal bovin, iar materialul rezultat a fost trecut prin filtru de nylon cu pori de 100 µm pentru a îndepărta fragmentele ramase nedigerate. Celulele astfel obținute au fost însămânțate pe placi de cultura in mediu special, conținând factori de creștere (EpiLife). Mediul a fost schimbat după 2-3 zile de la însămânțare.

Celulele epiteliale obținute (keratinocite) au fost caracterizate prin imunocitochimie (Figura 2.2). In urma colorării cu anticorpi specifici pentru citokeratinele 5 si 8, precum si pentru ocludina se observa prezenta acestor 2 proteine la nivelul culturii de keratinocite. Se poate remarca astfel prezenta celulelor cu potențial proliferativ (celule bazale) pozitive pentru citokeratina 5 si 8 precum si a ocludinei, care insa nu este inca organizata la nivelul jonctiunilor (Figura 2.2).

Figura 2.2. Cultura primara de keratinocite umane – aspect microscopic : a) contrast de

faza, b) citokeratina 5 si 8, c) ocludina

Dermul a fost de asemenea mărunțit în bucăți de circa 1 mm2, acestea fiind aplicate cu pensa pe plăci de cultura și incubate în DMEM suplimentat cu 15% SFB si 1% penicilina, streptomicina si amfotericina la 37°C pentru 2-3 săptămani, când s-a observat migrarea fibroblastilor din țesut pe suprafața vaselor de cultura. Ulterior, celulele au fost tripsinizate și reînsămânțate pentru a fi caracterizate prin imunocitochimie.

In urma coloratiei pentru evidentierea citoscheletului de actina se poate observa morfologia tipica celulelor mezenchimale precum si prezenta vimentinei (rosu) caracteristica acestor celule. De asemenea a fost identificat si colagenul de tip I (verde), proteina sintetizata de fibroblasti (Figura 2.3).

2

Figura 2.3. Imagine microscopică de cultura de fibroblasti umani: a) filamente de actina, b) vimentina, c) colagen de tip I, nucleii – albastru

A1.3 Caracterizarea comparativa a MSC umane izolate din surse diferite (cicatrici cheloide, versus tesut adipos subcutanat - Ad-MSC) din punct de vedere al potentialului de diferentiere Indicatori de realizare: Documentație și studii de carcaterizare MSC umane Participanți: INBPNS – grad de realizare 100%

Pentru realizarea studiilor de diferentiere au fost utilizate celule stromale mezenchimale MSC si AD-MSC prelevate de la subiecti diferiti (cate 2 subiecti pentru fiecare tip celular). In vederea inducerii diferențierii MSC in cele 3 tipuri celulare mezenchimale (osteoblaste, condrocite, adipocite) au fost utilizate medii de cultura speciale.. Astfel, diferentierea osteogenica s-a realizat prin incubarea unui monostrat confluent in mediu DMEM 1 ‰ glucoza suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 0.3 mM acid ascorbic, 10-7 dexametazona si 10 mM β-glicerofosfat, timp de 3 saptamani. Capacitatea de diferentiere osteogena a celulelor a fost pusa in evidenta prin colorarea nodulilor de calciu din matricea extracelulara prin tehnica von Kossa (cu nitrat de Ag). Astfel, acestia vor fi colorati in negru, iar nucleul celulelor va fi marcati cu roz folosind colorantul Nuclear Fast Red (Figurile 5 si 6 panelul din stanga). Diferentierea adipogenica a fost indusa prin incubarea pentru 3 saptamani a unui monostrat pre-confluent in DMEM 1 ‰ glucoza suplimentat cu 10% ser fetal bovin si un cocktail hormonal continand 10-6 M dexametazona, 100 mM indometacin, 1 µM roziglitazona si 1% supliment ITS (insulina, selenit, transferina). La finalul acestei perioade, celulele au fost fixate cu PFA 4% si acumularea lipidelor neutre in citoplasma celulelor a fost pusa in evidenta prin coloratie cu Oil Red O 0.3%, in urma careia depozitele de lipide apar colorate in rosu (Figurile 5 si 6 panelul din mijloc).

Diferentierea condrogenica a MSC s-a realizat in culturi in sediment, in prezenta de TGF-β3 (Figura 3.1). Aproximativ 250.000 de MSC au fost centrifugate in tub Falcon de 15 ml, iar sedimentul a fost cultivat in 500 µl mediu condrogenic (DMEM 4.5 ‰ glucoza, 10 ng/ml TGF-β3, 10-7 M dexametazona, 50 µg/ml ascorbat –2P, 40 µg/ml prolina, 100 µg/ml piruvat, 1% ITS) la 37 oC timp de 21 de zile. La sfarsit, sedimentul a fost inclus in parafina, taiat in sectiuni de 5µm si colorat cu Alcian Blue. Astfel, matricea extracelulara bogata in gligozaminoglicani va aparea colorata in albastru (Figurile 3.2 si 3.3 panelul din dreapta).

Dupa cum se observa in Figurile 3.2 si 3.3, rezultatele au aratat ca atat BM-MSC, cat si AD-MSC au prezentat capacitate de diferentiere catre cele 3 tipuri celulare (adipocite, osteoblaste, condrocite), indeplinind criteriul indicat de Societatea Internationala de Terapie Celulara pentru a fi considerate celule stem.

3

Figura 3.1. Reprezentarea schematica a protocolului de diferentiere condrogenica a MSC

Figura 3.2. Diferentierea trilineara a MSC (celule izolate de la 2 pacienti): stanga – diferentiere osteogena (coloratie von Kossa), mijoc – diferentiere adipogena (coloratie Oil Red O), dreapta - diferentiere condrogena (coloratie Alcian Blue).

Figura 3.3. Diferentierea trilineara a ADSC (celule izolate de la 2 pacienti): stanga – diferentiere osteogena (coloratie von Kossa), mijoc – diferentiere adipogena (coloratie Oil Red O), dreapta - diferentiere condrogena (coloratie Alcian Blue).

4

A1.4 Sinteza si caracterizarea din punct de vedere fizico-chimic si biologic a nanoparticulelor de chitosan si variatii ale acestora cu un continut redus de argint Indicatori de realizare: Modele experimentale de sinteză și documentația aferentă Participanți: UMPB, INBPNS – grad de realizare 100%

Obtinerea nanoparticulelor de chitosan Obținerea experimentală a nanoparticulelor de chitosan a fost posibilă prin prepararea unei

soluții 0.1% chitosan prin dizolvarea unui gram de chitosan (low molecular weight) în 40 mL acid acetic 1M și 960 mL apă distilată sub agitare continuă până la solubilizarea completă a chiosanului. Ulterior, au fost adăugați 50 mL cloroform peste soluția de chitosan și omogenizat timp de 5 minute. Soluția astfel obținută a fost supusă procesului de sonicare cu o sondă de ultrasunete timp de 3 minute (3 secunde on – 3 secunde off). După procesul de sonicare, se adaugă în picătură, sub agitare magnetică continuă 150 mL soluție tripolifosfat (TPP) de concentrație 1%. Soluția finală a fost lăsată la maturat peste noapte, fără agitare. Ulterior, nanoparticulele obținute au fost separate și spălate prin centrifugare. O parte din precipitatul obținut a fost uscat în etuvă la 40ºC, iar restul a fost resuspendat în apă distilată în vederea investigării fizico – chimice și biologice.

Obtinerea nanoparticulelor de chitosan cu continut redus de argint. Procedeul de sinteza este similar celui de obtinere a nanoparticulelor de chitosan, cu mici

ajustari. 10 mg nanoparticule de argint de tipul Ag/(P)EG/(PVP) au fost dispersate in 200 mL apa ultrapura, si sonicate timp de 30 de minute. Ulterior, aceasta cantitate de dispersie a fost adaugata peste 800 mL solutie de chitosan 0.1%, iar procedura s-a reluat conform experimentului descris in cadrul obtinerii de nanoparticule de chitosan. Metode de caracterizare

SEM Analiza SEM s-a realizat cu ajutorul unui microscop electronic de baleiaj achiziționat de la

compania FEI (Oregon, Statele Unite ale Americii, imaginile obținute fiind realizate prin înregistrarea fasciculului de electroni secundari rezultat, cu energie de 30 keV.

TEM, SAED În scopul obținerii imaginilor TEM, s-a folosit un microscop electronic de transmisie de înaltă

rezoluție de tip TecnaiTM G2 F30 S-TWIN echipat cu modul SAED, achiziționat de la compania FEI (Oregon, SUA). Acest microscop funcționează în modul de transmisie la o tensiune de 300 kV, rezoluția punctuală și de linie garantate având valorile de 2Å, respectiv 1Å.

FT-IR Pentru investigarea integrității grupelor funcționale caracteristice nanoparticulelor obtinute, o

cantitate redusă de nanoparticule a fost analizată prin intermediul unui cristal de ZnSe al spectrometrului de tip FT-IR Nicolet 6700, achiziționat de la compania Thermo Nicolet (Wisconsin, Statele Unite ale Americii). Măsurătorile au fost efectuate la temperatura camerei, fiind efectuate 32 de scanări ale probei între 4000 și 500 cm-1, la o rezoluție de 4 cm-1. Înregistrarea informațiilor astfel achiziționate a fost posibilă prin conectarea spectrometrului la o unitate de preluare și prelucrare a datelor, prin intermediul programului de lucru Omnic (versiunea 8.2 Thermo Nicolet).

DTA-TG Analiza termica s-a realizat cu ajutorul unui aparat STA TG/DSC Netzsch Jupiter 449C, in

intervalul de temperatura 25-900C, in atmosfera dinamica de 50 mL/min aer, cu o viteza de incalzire de 10K/min in creuzet din alumina (Al2O3).

5

Caracterizarea nanoparticulelor de chitosan (CS) TEM Nanoparticulele de chitosan, obtinute prin ultrasonare, au fost caracterizate prin Microscopie

Electronica prin Transmisie, principalele imagini inregistrate fiind prezentate in figura 4.1. Analizand imaginile prezentate in figura 5, se observa structure de morfologie aproape sferica, cu un grad scazut de cristalinitate si ale caror dimensiuni variaza intre 20 si 40 nm.

Figura 4.1.Imagini TEM inregistrate pentru nanoparticulele de chitosan (npCS)

FT-IR Ulterior, npCS au fost caracterizate din punct de vedere al integritatii grupelor functionale,

post ultrasonare. Spectrul FT-IR obtinut este prezentat in figura 4.2. Analizand figura 6, se observa benzi de absorbtie caracteristice chitosanului. Astfel, banda

de absorbtie de la 886 cm-1 poate fi atribuita gruparii C-O-C, banda de absorbtie de la 1017 si 1059 poate fi atribuita gruparii –C-O, banda de absorbtie de la 1153 cm-1 poate fi atribuita gruparii C-O-C, banda de absorbtie de la 1377 cm-1 si 1319 cm-1 poate fi atribuita gruparii C-N, banda de absorbtie de la 1528 cm-1 poate fi atribuita gruparii -NH, iar banda de absorbtie de la 1627 cm-1 corespunde gruparii C=O caracteristica gruparii acetil, prezente in proba in proportie de 15%. Gradul de dezacetilare al chitosanului utilizat fiin de 85%. De asemenea, pot fi identificate si benzi de absorbtie caracteristice legaturilor C-H la 2934 si 2877 cm-1.

6

Figura 4.2.Spectrul FT-IR inregistrat pentru npCS obtinute prin ultrasonare

Caracterizarea nanoparticulelor de chitosan cu continut redus de argint - Ag/(P)EG/

(PVP)@npCS SEM Analiza SEM in backscattering a permis caracterizarea materialelor obtinute de tipul

Ag/(P)EG/ (PVP)@npCS. In figura 4.3 sunt prezentate imaginile B-SEM pentru Ag/PEG@npCS. Analizand imaginile se observa o distribuite omogena a nanoparticulelor de argint in proba (punctele albe luminoase), cu tendinte de aglomerare. De asemenea se pot identifica si sfere, cu continut de nanoparticule de argint, cu dimensiuni de 1-2 µm, si sfere care nu contin argint. Se mai observa ca pe langa morfologia sferica a particulelor Ag/PEG@npCS mai exista si o retea polimerica distribuita neuniform si lipsita de morfologie. De aici se poate concluziona ca ruta de sinteza propusa este fezabila, cu mentiunea ca optimizari de proces sunt necesare, pentru a diminua cantitatea de chitosan nereactionat, si pentru a reduce dimensiunea sferelor polimerice cu continut de nanoparticule de argint.

Figura 4.3.Imagini B-SEM pentru Ag/PEG@npCS

Evaluarea biocompatibiliatii nanoparticulelor testate In vederea evaluarii biocompatibiliatii nanoparticulelor testate, s-au utilizat urmatoarele tipuri

celulare umane: keratinocite – linia HaCaT, fibroblasti izolati din derm si celule endoteliale-linia EA.hy926, considerate relevante pentru aplicatia nanoparticulelor in tratamentul ranilor cutanate. De asemenea, s-au testat si solutiile de polimeri in concentratiile corespondente dilutiilor suspensiilor de nanoparticule de argint.

Morfologia celulelor expuse la diverse concentratii de nanoparticule s-a evaluat cu ajutorul microscopiei in constrast de faza, iar viabilitatea celulelor cultivate in prezenta nanoparticulelor a

7

fost evaluata prin intermediul testului XTT care indica intensitatea activitatii metabolice ca o masura a viabilitatii celulare. Solutia de XTT este usor galbena, iar atunci cand are loc reducerea XTT la formazan, solutia devine portocalie. Modificarea culorii si deci reducerea XTT necesita un reactiv de activare-PMS (N-metil dibenzopirazina metil sulfat) care mediaza aceasta reactie. Celulele au fost insamantate cu o densitate de 10 000 celule/cm2, si dupa 24 de ore, mediul a fost schimbat adaugandu-se suspensiile de nanoparticule diluate in mediul de cultura aferent fiecarui tip celular. In final, dupa 6 zile/3 zile (pentru celulele endoteliale) de cultivare in prezenta probelor, s-a efectuat testul XTT.

In cazul keratinocitelor, NP Ag EG si NP EG PVP devin citotoxice începând cu o concentrație mai mare de 40 µg/ml (Figura 4.1), NP Ag PEG si NP Ag PEG PVP- începând cu 20 µg/ml, si respectiv 25 µg/ml (Figura 4.4). Efectul citotoxic observat nu poate fi atribuit prezentei polimerilor din suspensiile de nanoparticule de argint, doar in cazul EG si EG/PVP observandu-se o scădere a viabilității keratinocitelor la concentratii mai mari de 10 µg/ml, respectiv 50 µg/ml (Figura 4.5). Nanoparticulele de chitosan au determinat o scadere a viabilitatii keratinocitelor sub 80% la concentratii mai mari de 500 µg/ml (Figura 4.6). Aceste rezultate au fost confirmate si de imaginile de microscopie in contrast de faza (Figura 4.7).

Figura 4.4. Viabilitate keratinocite umane (HaCaT) expuse la diferite concentratii de nanoparticule de argint pentru o perioada de 6 zile

Figura 4.5. Viabilitate keratinocite umane (HaCaT) expuse la concentratii de polimeri corespondente celor din dilutiile de nanoparticule de argint, pentru o perioada de 6 zile

8

Figura 4.6. Viabilitate keratinocite umane (HaCaT) expuse la diferite concentratii de nanoparticule de chitosan pentru o perioada de 6 zile

Figura 4.7. Imagini de microscopie in contrast de faza pentru keratinocite umane (HaCaT) cultivate in prezenta variantelor de nanoparticule de argint la diferite concentratii

In cazul fibroblastelor, NP Ag EG si NP EG PVP devin citotoxice incepand cu o

concentratie mai mare de 50 µg/ml (Figura 4.5), NP Ag PEG si NP Ag PEG PVP- incepand cu 20 µg/ml, si respectiv 40 µg/ml (Figura 4.8). Ca si in cazul, keratinocitelor, prezenta polimerilor in concentratiile corespondente suspensiile de nanoparticule de argint testate, au determinat un efect citotoxic doar in cazul EG si a EG/PVP- începând cu 20 µg/ml (Figura 4.9). De asemenea, concentratia maxima de nanoparticulele de chitosan la care nu s-a observat un efect citotoxic a fost 500 µg/ml (Figura 4.10). Imaginile de microscopia in contrast de faza pentru culturile de fibroblaste cultivate in prezenta nanoparticulelor de argint a sustinut rezultatele de viabilitate (Figura 4.11).

Figura 4.8. Viabilitate fibroblaste umane expuse la diferite concentratii de nanoparticule de argint pentru o perioada de 6 zile

9

Figura 4.9. Viabilitate fibroblaste umane expuse la concentratii de polimeri corespondente celor din dilutiile de nanoparticule de argint, pentru o perioada de 6 zile

Figura 4.10. Viabilitate fibroblaste umane expuse la diferite concentratii de nanoparticule de chitosan pentru o perioada de 6 zile

Figura 4.11. Imagini de microscopie in contrast de faza pentru fibroblaste umane (cultura primara) cultivate in prezenta variantelor de nanoparticule de argint la diferite concentratii

Ținând cont de intervalele de concentratii stabilite pentru keratinocite si fibroblaste, in continuare, celulele endoteliale au fost expuse la o concentratie maxima de 33,3 µg/ml pentru fiecare varianta de nanoparticule de argint. Astfel s-a observat ca NP Ag EG si EG PVP sunt biocompatibile pe intervalul 10 - 33 µg/ml (Figura 4.12 si Figura 4.13), iar NP Ag PEG si PEG PVP pe intervalul 10-20 µg/ml, respectiv 10-25 µg/ml (Figura 4.12 si Figura 4.13). In ceea ce priveste nanopaticulele de chitosan, ca si in cazul celorlalte tipuri celulare testate, linia EA.hy926 prezinta o

10

viabilitate mai mare de 80% pentru intervalul 100-500 µg/ml (Figura 4.14). Rezultatele de viabilitate pentru celulele endoteliale incubate cu nanoparticulele de argint sunt sprijinite de imaginile de microscopie in contrast de faza (Figura 4.12).

Figura 4.12. Imagini de microscopie in contrast de faza pentru celule endoteliale (linia EA.hy926) cultivate in prezenta variantelor de nanoparticule de argint la diferite concentratii

Figura 4.13. Viabilitate celule endotelialte umane (EA.hy926) expuse la diferite concentratii de nanoparticule de argint pentru o perioada de 3 zile

Figura 4.14. Viabilitate celule endotelialte umane (EA.hy926) expuse la diferite concentratii de nanoparticule de chitosan pentru o perioada de 3 zile

11

A1.5 Elaborarea protocolului pentru testarea pe culturi microbiene a proprietatilor nanoparticulelor de chitosan Indicatori de realizare: Studiu de testare – grad de realizare 100% Participanți: UMPB, UMFCV

Protocolul de lucru a fost elaborat pornindu-se de la unele tehnici actuale de microbiologie utilizate la nivel național și internațional. Au fost testate următoarele tipuri de nanoparticule puse la dispoziție de partenerul 3 (UMPB):

- nanopaticule de chitosan suspendate în apă fiziologic sterilă, concentrație 10mg/ml; - nanopaticule de chitosan asociate cu nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol

(Ag/EG), concentrație 1mg/ml, - nanoparticule de argint functionalizate cu polietilenglicol (Ag/PEG), concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu polietilenglicol si polivinilpirolidona

(Ag/PEG/PVP), concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol Ag/EG, concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol si polivinilpirolidona (Ag/EG/PVP),

concentrație 1mg/ml; Nanoparticulele au fost testate pe tulpinile microbiene de referințăîn conformitate cu

standardul CLSI/EUCAST, a căror activitate antibacteriana este cunoscuta. Aceste tulpini au fost:

-pentru STAFILOCOCCUS AUREUS:ATCC25923 betalactamaze negativ -pentru ESCHERICHIA COLI :ATCC25922 betalactamaze negativ -pentru PSEUDOMONAS AERUGINOSA :ATCC27853 ESBL negativ. -pentru CANDIDA ALBICANS.....cod: ATCC10231

Tulpinile de testat, rezistente la antibiotice au fost reprezentate de: -STAPHYLOCOCCUS AUREUS – MRSA -PSEUDOMONAS AERUGINOSA -CANDIDA ALBICANS -E. COLI Materiale utilizate:

- Hota cu flux laminar vertical clasa II, - Termostate pentru incubarea plăcilor cu medii de cultura pentru toate genurile bacteriene; - Cititor plăci (Spectofotometru - Clariostar® BMG Labtech); - Vortex/agitator turbionar; - Plăci cu medii de cultură: geloză sânge, Mueller-Hinton, Sabouraud, Drigalski - Plăci cu 96 de godeuri, - Micropipete; - Pipete Pasteur; - Anse bacteriologice de unică folosință

Protocol de lucru 1: Pentru nanoparticulele în ser fiziologic s-a folosit metoda microdiluțiilorbinare în bulion

(în mediul lichid). S-au folostplăci sterile cu microgodeuri (96), în care s-au adaugat aceeași concentrație de bacterie în bulion Mueller-Hinton, din care am realizat 12 diluții din nanoparticulele în ser fiziologic (în concentrații descrescânde), în fiecare godeu, o diluție cunoscută, în prezența a doi martori, unul negativ, în care nu am avut bacterii, și unul pozitiv cu o bacteria cunoscută, fără substanță antibacteriană.

Tulpina de testat a fost însămânțată standard pe un mediu nutritiv solid (geloză-sânge), se incubată la 37 grade Celsius 18-24 ore, pentru a obține colonii izolate. Apoi s-a resuspendat 4-5 colonii într-un mediu lichid (bulion), care a reprezentat inoculul de lucru. S-a așteaptat, la temperatura camerei, până ce densitatea a ajunns la 108 UFC/ml,conform cu standardul

12

turbidimetric 0,5 McFarland. Apoi s-a agitat și s-a incubat la 35-37 0C timp de 18-24ore. Apoi s-a citit concentrația la care substanța antibacteriană, a produs inhibiția culturii bacteriene,prin citirea spectrofotometrica a turbiditatii din microgodeu, în comparație cu martorii negativ și pozitiv.

Curba standard de creștere a absorbanței (abs) vs. densitatea celulară în plăcile YPD s-a realizat la o λ=520 nm (400nm, 450nm, 500nm, 550nm, 600nm, 650nm) la spectrofotometru.

Protocol de lucru 2 Pentru evaluarea efectelor bactericide/bacteriostatice ale nanoparticulele de chitosanam

utilizat si a doua metodă de lucru,metoda difuzimetrică,utilizându-se microdiscuri sterile cu diametrul de 0,5 cm (similare cu cele utilizate la antibiograme) impregnate cu nanoparticule la diverse diluții.

Tulpinile de testat au fost însămânțate standard pe un mediu nutritiv solid (geloză-sange), șiincubeate la 37 grade Celsius timp de 18-24 ore, pentru a obține colonii izolate. Apoi s-au resuspendat 4-5 colonii într-un mediu lichid (bulion), care a reprezinatinoculul de lucru. S-a așteaptat, la temperatura camerei, până ce densitatea bacteriilor a ajuns la 108 UFC/ml,conform cu standardul turbidimetric 0,5 McFarland. La metoda diluțiilor binare trebuie asigurat un inocul de 104 UFC/ML.

Apoi, culturile bacteriene au fost însămânțate pe un mediu solid–agar MUELLER-HINTON, turnat în plăci Petri. Însămânțarea s-a efectuat prin inundarea plăcii,aseptic.După 20 de minute, s-au aplicat pe suprafața plăciiPetru microcomprimatele sterile îmbibate cu nanoparticulele de testat, în dicerse diluții pentru evaluarea efect antibacterian,cu ajutorul unei pense, în condiții aseptice, lăsând o distanță de 30mm între ele și15mm de marginea plăcii. Controlul mediilor și al substanțelor antibacteriene s-a făcut cu un microcomprimat steril neimpregnat sau impregnat cu ser fiziplogic(control negativ), și cu un microcomprimatsteril impregnat cu un chimioterapic cu concentrație cunoscută dinstandardul CLSI/EUCAST( control pozitiv).

După 15-20 minute plăcile au fost incubatela 37°Celsius (sau alte temperaturi în funcție de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului). Substanța antibacteriană din microcomprimat difuzează în mediu, realizând o zonă de inhibiție a culturii bacteriene, în jurul microdiscului, zonă în care coloniile nu se dezvolta. Cu cât zona de inhibiție este mai largă,cu atât germenul este considerat mai sensibil.

Pentru fiecare tulpină s-au impregnat microcomprimatele sterile cu diferite volume (10μl, 25μl, 35μl, 50μl) și diferite diluții (1/1, ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32) ale nanoparticulelor de argint+chitosan, pentru a urmări acțiunea acestora în raport cu germenul din mediul de cultură.

Evaluarea efectului nanoparticulelor s-a realizat prin măsurarea diametrului și grosimii haloului creeat în jurul microcomprimatelor, folosind un software special de analiză a imaginii.

A1.6 Caracterizarea exosomilor prin Microscopie Electronica Criogenica Indicatori de realizare: Raport caracterizare – grad de realizare 100% Participanți: UMPB

Obtinerea nanoparticulelor de argint de tipul Ag/(P)EG/(PVP) Obținerea experimentală a nanoparticulelor de argint în prezența unor monomeri/polimeri, și

anume: etilenglicol - EG, polietilenglicol - PEG, etilenglicol/polivinilpirolidonă - EG/PVP respectiv polietilenglicol/polivinilpirolidonă - PEG/PVP (notate în continuare Ag@EG, Ag@PEG, Ag@EG_PVP, Ag@PEG_PVP) a fost posibilă prin utilizarea unei metode chimice de reduce a precursorului metalic, ceea ce a implicat obținerea a a câte două soluții necesare procesului de sinteză pentru fiecare sinteză în parte.

Soluțiile de azotat de argint au fost obținute prin dizolvarea în câte 300 mL apă ultrapură a unei cantități de 1 g AgNO3. Cea de-a doua soluție necesară experimentului a fost obținută prin dizolvarea în câte 400 mL apă ultrapură a 20 g NaOH și x g de polimer (x = 3 g EG, x = 3 g PEG, x= 1,5 g EG + 1,5 g PVP, x = 1,5g PEG + 1,5 g PVP), procesul desfășurându-se sub agitare la 80ºC.

13

Ulterior, soluțiile de azotat de argint au fost adăugate în soluțiile de polimer/monomer, prin picurare și sub agitare continuă. Pe parcursul procesului a putut fi observată modificarea culorii dispersiilor obținute, aspect corelat cu formarea particulelor de argint. Prin filtrarea la vid a dispersiilor obținute a fost posibilă colectarea nanoparticulelor astfel sintetizate. Particulele de argint au fost supuse unui triplu tratament de spălare cu apă distilată și uscate la temperatura camerei. O parte din pulberea astfel obținută a fost ulterior supusă unor metode de investigare a caracteristicilor fizico-chimice și biologice.

Caracterizarea nanoparticulelor de argint de tipul Ag/(P)EG/(PVP)

Figura 6.1.Imagini SEM inregistrate pentru nanoparticulele Ag/(P)EG/(PVP)

SEM Pulberile obtinute de tipul Ag/(P)EG/(PVP) au fost caracterizate prin Microscopie

Electronica de Baleiaj. Rezultatele obtinute sunt prezentate in figura 6.1. Analizand imaginile SEM prezentate in Figura 6.1, se observa ca nu exista diferente semnificative intre variantele experimentale. Astfel, dimensiunea particulelor este de ordin nanometric si variaza intre 10 si 30 nm. Pot fi identificate nanoparticule cu morfologie aproape sferica ce prezinta o tendinta ridicata de aglomerare.

TEM Nanoparticulele de argint de tipul Ag/(P)EG/(PVP) au fost caracterizate si prin Microscopie

Electronica prin Transmisie, imaginile obtinute fiind prezentate in Figura 6.2. Analizand imaginile TEM prezentate pentru cele 4 variante experimentale, se observa

particule de dimensiuni nanometrice, cristaline, aceoperite de o faza ce are cristalinitare redusa si corespunde componentelor organice utilizate in procedeul de obtinere, EG, PEG si PVP. Particulele au dimensiuni de 20-30 nm, iar acoperirea cu cristalinitare redusa de natura organica are grosimi de 1-3 nm.

Pattern-ul SAED ofera informatii despre cristalinitatea probelor caracterizate. In cazul celor 4 variante experimentale se observa, din analiza inelelor de difractie identificate si masurate, ca singura faza cristalina prezenta este argintul hexagonal. Acesta a fost identificat si corespunde fisei ICDD [PDF card no. 01-071-5025] (Tabelul 6.1).

14

Tabelul 6.1.Distanta planara si indicia hkl aferenti fisei 01-071-5025

Figura 6.2.Imagini TEM inregistrate pentru nanoparticulele Ag/(P)EG/(PVP)

DTG-TA Analiza termica a permis estimarea cantitatitatii de monomer/polimer ce interactioneaza cu

nanoparticulele. In cazul probei Ag@EG, pierderea de masa pana la 215oC este de 1.33%. Procesul este

insotit de un efect endoterm la 194.9oC cauzat de evaporarea EG din straturile exterioare, care nu este atasat de suprafata nanoparticulelor (EG are p.f. 197.3oC).

Ag@PEG

Ag@EG_PVP Ag@PEG_PVP

Ag@EG

15

Pierderea de masa continua lent pana la 340oC (-1.25%) cu molecule de EG legate mai puternic. Urmeaza etapa principala de descompunere a probei, intre 340-420oC, cand are loc o pierdere de masa de 12.95%, procesul fiind insotit de un efect endoterm ascutit cu minimul la 385.2oC. Fie este o descompunere a EG legat de nanoparticule, fie acolo se rup legaturile EG-Ag si se volatilizeaza tot EG. Masa reziduala este 84.28%.

Figura 6.3.Derivatograme inregistrate pentru nanoparticulele Ag/(P)EG/(PVP), unde: (a)

Ag@EG; (b) Ag@EG_PVP; (c) Ag@PEG; (d) Ag@PEG_PVP In cazul probei Ag@EG_PVP analiza termica in prima faza este asemanatoare. Pierderea de

masa pana la 210oC este de 2.49%, cu un efect endoterm la 193.5oC, probabil datorat evaporarii

(a)

(d)

(c)

(b)

16

unei parti din EG. Urmeaza apoi o pierdere de masa de 6.59% pana la 290oC, insotita de un efect endoterm cu minimul la 256.1oC. Cele doua procese sunt suprapuse si desi le vedem separate pe DSC, pe curba TG formeaza o singura etapa de pierdere de masa. Intre 290-420oC proba mai pierde 6.14% procesul fiind de asemenea unul endoterm, efectul avand un minim la 393.8oC. Masa reziduala are 84.57% .

Rationamentul este similar si pentru probele Ag@PEG si Ag@PEG_PVP, acestea comportanduse relativ identic. Rezultatele sunt prezentate in tabelul 6.2 si figura 6.3.

Proba Pierdere de

masa % EG %PEG % PVP

Ag@EG 15.43 15.43 - - Ag@PEG 15.83 - 15.83 - Ag@EG_PVP 15.72 15.43 - 0.29 Ag@PEG_PVP 16.19 - 15.83 0.36

Tabelul 6.2.Pierderile de masa inregistrate pentru probele de tipul Ag/(P)EG/(PVP)

FT-IR Nanopulberile obtinute au fost caracterizate prin spectroscopie de infrarosu cu transformata

fourier. Rezultatele obtinute sunt prezentate in figurile6.4a si 6.4b. Se observa benzi de absorbtie caracteristice EG si PEG. PVP nu a putut fi identificat in spectrele FT-IR inregistrate pentru ca, cantitatea de PVP ce a interactionat cu nanoparticulele de argint este sub 3%, aspect ce reiese din analiza termogravimetrica, cantitatea de PVP fiind sub limita de detectie a echipamentului utilizat.

Figura 6.4a.Spectre FT-IR inregistrate pentru nanoparticulele Ag/(P)EG/(PVP) In aceste conditii, benzile de absorbtie identificate sunt: banda de absorbtie de la 1058 cm-1

este caracteristica gruparii C-O-H, banda de absorbtie de la 1322 si 1400 sunt caracteristice gruparii C-H de deformare. De asemenea, benzi de absorbtie caracteristice legaturii C-H au fost identificate la 2853 si 2922 cm-1, si sunt prezentate in figura 6.4b (ce repzinta un detaliu al figurii 6.4a).

Figura 6.4b.Detaliu din spectrele FT-IR inregistrate pentru nanoparticulele Ag/(P)EG/(PVP)

17

In scopul obtinerii imaginilor TEM, s-a folosit un microscop electronic prin transmisie, biologic, de inalta rezolutie de tip Titan Themis 200, achizitionat de la compania FEI (Oregon, SUA). In figura 1 sunt prezentate imaginile TEM inregistrate pentru exozomi izolati. Analizand imaginile prezentate se observa o dimensiune relative omogeana a exozomilor cuprinsa intre 80 si 100 nm. Morfologia este sferica cu usoare tendinte de alungire.

Figura 1. Imagini TEM inregistrate pentru exozomi A1.7 Studiul comparativ al capacității MSC si Ad-MSC de a produce și elibera exosomi (cantitate, compoziție) Indicatori de realizare: Documentație și raport caracterizare – grad de realizare 100% Participanți: INBPNS

Exosomii sunt nanovezicule de 30-150 nm, eliberate in mediul extracelular, responsabile de comunicarea inter-celulara. S-a demonstrat ca exosomii derivati din MSC sunt responsabili, in mare parte, de efectul regenerativ paracrin al acestora. In acest context, pe plan mondial, a luat nastere o directie a Medicinii Regenerative bazandu-se pe utilizarea proprietatilor regenerative ale MSC, eliminand componenta celulara (asa numita „cell-free regenerative therapy”).

Pentru izolarea exosomilor, ADSC si BM-MSC au fost cultivate pe 4-5 flascuri de 75 cm2 sau placi de 60 cm2, pentru a obtine o cantitate suficienta de exosomi care sa poata fi analizat in continuare. Pe scurt, la 4 zile de la insamantare, placile au fost spalate cu PBS pentru a indeparta urmele de ser si incubate timp de 48 de ore in mediu fara ser. La finalul perioadei, mediul a fost recoltat si supus la 2 centrifugari succesive, de 350g/10 min si 2000g/25 min pentru a indeparta eventualele celule moarte si resturi celulare. In continuare, mediul a fost trecut prin filtre cu pori de 0.22 µm pentru a retine veziculele cu dimensiuni mai mari de 200 nm,exosimii regasindu-se sub aceasta dimensiune. Acestia au fost in continuare izolati din mediul filtrat prin ultracentrifugare la 100.000g/90 min/4°C. Dupa prima ultracentrifugare, supernatantul a fost inlaturat, iar peletul a fost resuspendat in PBS si supus unei noi centrifugari de 100.000g/90 min/4°C. Sedimentul a fost ulterior resuspendat in 50-100 µl PBS si analizat la Nanosizer pentru a stabili dimensiunea veziculelor extracelulare izolate si prin citometrie de flux pentru a le caracteriza din punct de vedere al markerilor proteici. De asemenea, pentru a evalua concentratia proteica, sedimentul a fost solubilizat cu tampon Laemmli. Totodata, in momentul recoltarii mediului, celulele au fost tripsinizate si numarate pentru a stabili capacitatea fiecarui tip celular de a elibera exosomi.

Astfel, s-a observat ca din 1x106 ADSC au rezultat o cantitate de exosomi de aproximativ 2,14 µg proteina, in timp ce pentru BM-MSC valoarea a fost mult mai mica, de aproximativ 0,5 µg la 1x106 celule.

Dimensiunea veziculelor a fost determinata prin citire la Nanisizer (Malvern). Se observa in Figura 7.1 ca atat veziculele derivate din ADSC, cat si cele derivate din BM-MSC au o dimensiune medie de aproximativ 180 nm, ceea ce confirma prezenta exosomilor, care au in general un diametru sub 200 nm.

In continuare, exosomii izolati din cele doua tipuri de celule stem mezenchimale au fost caracterizati prin citometrie de flux, pentru a pune in evidenta pe sprafata acestora principalele

18

tetraspaninecaracteristice exosomilor, CD63 si CD9. Deoarece dimensiunea mica a exosomilor nu permite vizualizarea lor in mod curent printr-o metoda uzuala de citometrie de flux, aceasta gasindu-se in afara capacitatii de detectie a aparatelor, a fost utilizat un kit pe baza de bile magnetice (Dynabeads, Invitrogen, Life Technologies), cuplate cu un anticorp anti CD63.Astfel, dupa ultracentrifugare, sedimentul continand exosomii a fost resuspendati in PBS (suplimetat cu 0.1% albumina serica bovina si fitrat prin filtru de 0,22 µm) si incubati pentru ~20 de ore, sub agitare continua (650 rpm) in prezenta bilelor magnetice. Ulterior, bilele magnetice cuplate cu exosomii pe baza interactiei CD63-anticorp anti CD63 au fost incubate cu anticorpi anti-CD63 si anti-CD9 cuplati cu ficoeritrina (PE), timp de o ora, sub agitare (1000 rpm), la temperatura camerei. Analiza s-a realizat pe un citometru CytoFLEX (Beckman Coulter). Se observa in Figura 7.2 ca atat veziculele derivate din ADSC, cat si din BM-MSC sunt, in mod similar, pozitive pentru markerii CD63 si CD9, ceea ce confirma prezenta exosomilor.

Figura 7.1. Determinarea dimensiunii exososmilor derivati din ADSC si BM-MSC prin citire la Nanosizer (Malvern)

Figura 7.2. Histograme de citometrie de flux aratand prezenta markerilor specifici exosomilor pe suprafata veziculelor izolate din ADSC (stanga) si BM-MSC (dreapta). A1.8 Obtinerea unei surse perpetue de exosomi terapeutici prin imortalizarea MSC (supraexprimarea telomerazei) Indicatori de realizare:Raport caracterizare – grad de realizare 100%

Participanți: INBPNS O problema a celulelor primare menținute in cultura o constituie senescenta celulara, care

duce la imposibilitatea utilizarii acestora pe termen lung, de-a lungul mai multor pasaje. Din acest motiv, este necesara obtinerea continua a celulelor izolate de la pacienti, ceea ce duce la o variabilitate crescuta a rezultatelor obtinute. O modalitate de a depasi acest lucru este imortalizarea

19

celulelor primare, in scopul de a obtine o sursa de celule utilizabile pe o perioDA de timp nedefinita, care sa-si pastreze proprietatile si sa genereze rezultate concordante in urma experimentelor.

Pentru imortalizarea celulelor stem mezenchimale in vederea productiei de exosomi, s-a ales inducerea expresiei genei hTERT (telomeraza), deoarece aceasta are rolul de a mentine dimensiunile capetelor telomerice ale cromozomilor, reprimand senescenta replicativa. De asemenea, se cunoaste faptul ca celulele imortalizate cu hTERT au un cariotip normal, mentinand in acelasi timp caracteristicile fenotipice ale celulelor primare, mentin controlul ciclului celular, au raspuns normal la ser si mitogeni, nu sunt maligne, prezinta inhibitie de contact si depind de ancorarea la substrat.

Pentru a realiza aceasta activitate, s-a ales utilizarea transfectiei lentivirale. Pentru a creste siguranta utilizarii acestei metode, a fost folosit sistemul de generatia a III-a, care contine 4 plasmide codificatoare pentru producerea virusului: 3 plasmide de impachetare si de codificare a anvelopei (pMD2.G, pMDLg_pRRE, pRSV-Rev) si o plasmida care contine gena hTERT (pLV-hTERT-IRES-hygro), care contine si gena de rezistenta la higromicina, in vederea selectiei ulterioare a celulelor transfectate pentru a obtine o linie stabila (Figura 8.1).

Figura 8.1. Harta plasmidelor utilizate pentru imortalizarea MSC prin transfectie lentivirala

In prealabil, pentru verificarea sensibilitatii MSC la higromicina, s-a realizat o titrare a concetratiei de antibiotic. Astfel, celulele insamantate cu 24 de ore inainte, la o densitate de ~60 %, au fost tratate cu doze crescatoare de antibiotic: 50µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml si 300 µg/ml. Dupa o saptamana a fost verificata viabilitatea prin tehnica XTT. Se observa in Figura 8.2 ca MSC testate au prezentat o sensibilitate crescuta la higromicina. Pentru mai multa siguranta, s-a ales doza initiala de 200 µg/ml, iar doza de continuare a selectiei de 100 µg/ml.

Figura 8.2. Curba de testare a sensibilitatii celulelor la higromicina in vederea selectiei clonelor transfectate cu gena de interes

Impachetarea lentivirusului s-a realizat cu ajutorul celulelor AD293 (celule dembrionare umane de rinichi). Pe scurt, utilizand kitul de transfectie Lipofectamine 2000, cele 4 plasmide au fost introduse concomitent in celulele AD293, in raport pRSV-Rev: pMDLg_pRRE: pMD2.G: pLV-hTERT-IRES-hygro de 1:2:1:4. Dupa 3 zile, mediul continand pariculele lentivirale a fost

20

recoltat, filtrat prin filtre cu pori de 0,45 µm si adaugat peste MSC insamantate in prealabil cu 24 de ore inainte pe placi de 12 godeuri. Particulele lentivirale au fost adaugate in urmatoarele dilutii: 1/1, 1/2, 1/4, 1/6 si 1/10, iar un godeu a fost pastrat drept control pentru a verifica eficienta selectiei cu antibiotic. Dupa 24 de ore, mediul a fost indepartat, adaugandu-se mediu proaspat (DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin), la care s-a adaugat 200 µg/ml higromicina. Dupa 3 zile, la schimabrea de mediu s-a utilizat o concentratie mai mica de higromicina, 100µg/ml, care s-a pastrat in continuare pentru selectia celulelor transfectate stabil. Dupa 1 saptamana de selectie, s-a putut observa moartea celulelor din godeul control in prezenta antibioticului, in timp ce in godeurile corespunzatoare dilutiilor 1/1 si 1/2 s-au gasit celule rezistente (Figura 8.3).

Figura 8.3. Aspectul culturii de MSC transfectate la o saptamana de la inceperea selectiei cu antibiotic

Dupa trei saptamani, celulele transfectate au proliferat si au ajuns la confluenta (Figura 8.4). Se observa ca dupa transfectie si-au pastrat fenotipul fibroblast-like. In continuare, aceste celule imortalizate urmeaza a fi caracterizate.

Figura 8.4. Aspectul celulelor imortalizate după trei saptamani de selectie cu higromicina. Se observa in panelul din dreapta aspectul fibroblast-like al celulelor selectate. A1.9 Evaluarea comparativă a efectelor antibacteriene a nanoparticulelor de chitosan și variații ale acestora cu un conținut redus de argint pe culturi microbiene standardizate și pe culturi microbiene rezistente la antibiotice Indicatori de realizare:Dezvoltare model experimental – grad de realizare 100% Participanți: UMFCV, UPB

În cadrul acestei activități au fost utilizate două metode de lucru pentru evaluarea efectelor antibacteriene ale nanoparticulelor:

− metoda microdilutiilor binare in bulion − metoda difuzimetrică, utilizându-se microdiscuri impregnate cu nanoparticule

Rezultatele obținute Prin metoda diluțiilorpentru fiecare tip de nanoparticule asupra

germenilor sensibili și rezistenți. I. Pentru nanoparticulele Ag EG:

21

a. CMI asupra tulpinii de Staphilococcus aureus ATCC25923 a fost de 0,00781 mg/ml (Tabel 1), cu mult mai scăzută față de cea utilizată pentru tulpina rezistentă de Staphilococcus aureus, adică 0,0625 mg/ml (Tabel 1)

b. CMI în cazul tulpinii de E. coli ATCC25922 a fost de 0,0039 mg/ml (Tabel 1), de aproape zece ori mai scăzută față de tulpina omoloagă rezistentă, pentru aceasta obținându-se un CMI=0,03125 mg/ml (Tabel 1).

c. În cazul Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, valoarea CMI obținută a fost de 0,00195 mg/ml (Tabel 1). Se remarcă și în acest caz o diferență de cel puțin zece ori mai mare la tulpina Pseudomonas aeruginosa rezistentă și anume 0,0156 mg/ml (Tabel 1).

d. În final, pentru tulpina Candida albicans ATCC10231, CMI a fost de 0,0156 mg/ml, respectiv 15,63 μg/ml, cea rezistentă având o valoare semnificativ crecută față de aceasta și anume de 0,25 mg/ml sau 250 μg/ml (Tabel 1)

În cazul tuturor tulpinilor se poate distinge un efect bacteriostatic mult mai bun al Ag EG asupra tulpinilor sensibile față de cele rezistente, eficiența maximală fiind în cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa.

II. Pentru nanoparticulele Ag PEG: a. CMI asupra tulpinii de Staphilococcus aureus ATCC25923 a fost de 0,03125 mg/ml

(Tabel 1), valoarile obținute pentru tulpina omoloagă rezistentă Staphilococcus aureus MRSA fiind asemănătoare.

b. CMI în cazul tulpinii de E. coli ATCC25922 a fost de 0,0625 mg/ml (Tabel 1), din nou constatându-se aceleași valori și în cazul tulpinii rezistente

c. În cazul Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, valoarea CMI obținută a fost de 0,00195 mg/ml (Tabel 1), din nou remarcându-se aceleași valori și pentru tulpinile rezistente.

d. În final, pentru tulpina Candida albicans ATCC10231, CMI a fost de 0,0156 mg/ml, respectiv 15,63 μg/ml, cea rezistentă prezentând de această dată o valoare semnificativ mai crecută și anume de 0,25 mg/ml sau 250 μg/ml.

Per total, acțiunea nanoparticulelor de tip Ag PEG a fost asemănătoare atât la tulpinile sensibile cât și la cele rezistente, cu excepția celei de Candida albicans, acolo unde valoarea CMI a fost mult mai scăzută pentru tulpina sensibiliă. Valoarea minimă a CMI a fost și de această dată obținută pe tulpina de Pseudomonas aeruginosa ATCC27853.

III. Pentru nanoparticulele Ag EG PVP: a. CMI a tulpinii de Staphilococcus aureus ATCC25923 a fost de 0,0039 mg/ml (Tabel 1),

mai scăzută față de cea utilizată pentru tulpina rezistentă de Staphilococcus aureus MRSA, adică 0,0156 mg/ml.

b. CMI în cazul tulpinii de E. coli ATCC25922 a fost de 0,00195 mg/ml (Tabel 1), mai scăzută față de tulpina E. coli rezistentă, pentru aceasta obținându-se un CMI=0,00781 mg/ml.

c. În cazul Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, valoarea CMI obținută a fost de 0,0625 mg/ml (Tabel 1). Se remarcă în acest caz o diferență de cel puțin zece ori mai mică la tulpina Pseudomonas aeruginosa rezistentă și anume 0,00195 mg/ml.

d. Pentru tulpina Candida albicans ATCC10231, CMI a fost de 0,0625 mg/ml, respectiv 62,5 μg/ml, cea rezistentă având o valoare semnificativ crecută față de aceasta și anume de 0,25 mg/ml (Tabel 1)

Astfel, valoarea minimă a CMI pentru acest tip de nanoparticule a fost obținută pentru tulpina E. coli ATCC25922, însă ceea ce este remarcabil este faptul că nanoparticulele Ag EG PVP au avut un efect bacteriostatic mai bun asupra unei tulpini rezistente de Pseudomonas aeruginosa (CMI-ul fiind minim) față de tulpina sensibilă.

IV. Pentru nanoparticulele Ag PEG PVP:

22

a. CMI a tulpinii de Staphilococcus aureus ATCC25923 a fost de 0,00195 mg/ml (Tabel 1), cu mult mai scăzută față de cea utilizată pentru tulpina rezistentă de Staphilococcus aureus, adică 0,0156 mg/ml (Tabel 1),

b. CMI în cazul tulpinii de E. coli ATCC25922 a avut o valoare tot de 0,00195 mg/ml (Tabel 1), de două ori mai mică față de tulpina E. coli rezistentă, pentru aceasta CMI fiind de 0,0039 mg/ml (Tabel 1), respectiv 3,91 μg/ml (Tabel 2).

c. Valoarea CMI în cazul Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, a fost din nou de 0,00195 mg/ml (Tabel 1), aceleași valori fiind obținute și pentru tulpina omoloagă rezistentă.

d. În final, pentru tulpina Candida albicans ATCC10231, CMI a fost de 0,0156 mg/ml, respectiv 15,63 μg/ml, cea rezistentă având o valoare de două ori mai mare față de aceasta și anume de 0,03125 mg/ml, (Tabel 9.1)

Pentru acest tip de nanoparticule s-au obținut cele mai scăzute valori ale CMI, valoarea minimă de 0,00195 mg/ml fiind obținută pentru 4 din cele 8 tulpini testate, eficiența maximă fiind împotriva tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa.

NOTA: pentru nanopaticule de chitosan suspendate în apă fiziologic sterilă, concentrație 10 mg/ml și nanopaticule de chitosan asociate cu nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol (Ag/EG), concentrație 1mg/ml, NU S-AU IDENTIFICAT ACTIVITĂȚI BACTERICIDE/BACTERIOSTATICE

Tulpina bacteriană

Nanoparticule

Ag PEG Ag EG PVP Ag PEG

PVP Ag EG

Staphilococcus Aureus ATCC25923

0,03125 mg/ml

0,0039 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,00781 mg/ml

E. colic ATCC25922

0,0625 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,0039 mg/ml

Pseudomonas aeruginosa ATCC27853

0,00195 mg/ml

0,0625 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,00195 mg/ml

Candida albicans ATCC10231

0,0156 Mg/ml

0,0625 mg/ml

0,0156 mg/ml

0,0156 mg/ml

Staphilococcus aureus MRSA (rezistent)

0,03125 mg/ml

0,0156 mg/ml

0,0156 mg/ml

0,0625 mg/ml

E. coli (rezistent)

0,0625 mg/ml

0,00781 mg/ml

0,0039 mg/ml

0,03125 mg/ml

Pseudomonas aeruginosa (rezistent)

0,00195 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,00195 mg/ml

0,0156 mg/ml

Candida (rezistent) 0,25 mg/ml

0,25 mg/ml

0,03125 mg/ml

0,25 mg/ml

Tabelul 9.1 - reprezentând concentrațiile minime inhibitorii de nanoparticule pentru fiecare tip de nanoparticule și culturile bacteriene investigate

B. Rezultatele obtinute prin metoda difuzimetrică au fost similare cu cele obtinute

microdilutiilor binare în bulion. Așa cum se poate observa in figurile 9.1 – 9.5 nanoparticulele de argint funcționalizate cu etilenglicol, polietilenglicol, polietilenglicol si polivinilpirolidona au avut acțiune bactericida/bacteriostatică variabilă în funcție de diluția de nanoparticule utilizate, atât pe bacteriile standard cât și pe cele rezistente la antibiotice.

23

Pentru nanopaticule de chitosan suspendate în apă fiziologic sterilă, concentrație 10 mg/ml și nanopaticule de chitosan asociate cu nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol (Ag/EG), concentrație 1mg/ml, nu s-au identificat activități bactericide / bacteriostatice, nici în aceasta metodă de testare.

Figura 9.1 - Nanoparticule Ag PEG PVP impregnate pe microcomprimate sterile cu diluțiile 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; Germenul de pe mediul de cultură este Staphilococcus Aureus ATCC25923

Figura 9.2 - Nanoparticule Ag PEG impregnate pe microcomprimate sterile cu diluțiile 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; Germenul de pe mediul de cultură este Staphilococcus Aureus ATCC25923

Figura 9. 3 - Nanoparticule Ag EG PVP impregnate pe microcomprimate sterile cu diluțiile 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; Germenul de pe mediul de cultură este Staphilococcus Aureus ATCC25923

Figura 9.4 - Nanoparticule Ag EG impregnate pe microcomprimate sterile cu diluțiile 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; Germenul de pe mediul de cultură este Staphilococcus Aureus ATCC25923

Figura 9.5 - Microcomprimate sterile impregnatecu 10μl de chitosan; germenul de pe mediul de cultură este Pseudomonas Aeruginosa ATCC27853

24

A1.10 Evaluarea efectelor chitosanului și variații ale acestora cu un conținut redus de argint asupra metabolismelor, prin injecții intraperitoneale la animalul de experiență Indicatori de realizare:Dezvoltare model experimental și a documentației aferente Participanți: UMFCV, UMFCD, INBPNS – grad de realizare 100%

Scopul studiului a fost acela de a evalua efectele toxice ale nanoparticulelor de chitosan, ale variațiilor acestora funcționalizate cu nanoparticule de argint și a unor tipuri de nanoparticule de argint funcționalizate cu alți compusi, asupra metabolismelor, utilizând un model experimental, pe animalul de laborator. Studiul s-a efectuat la UMF. Craiova după obținerea Avizului Comisiei de Etică al UME Craiova, nr. 89 / 13.09.2018

În esență, studiul nostru a urmărit efectele metabolice și histopatologice ale următoarelor tipuri de naoparticule:

- nanopaticule de chitosan suspendate în apă fiziologic sterilă, concentrație 10mg/ml; - nanopaticule de chitosan asociate cu nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol

(Ag/EG), concentrație 1mg/ml, - nanoparticule de argint functionalizate cu polietilenglicol (Ag/PEG), concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu polietilenglicol si polivinilpirolidona

(Ag/PEG/PVP), concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol Ag/EG, concentrație 1mg/ml; - nanoparticule de argint functionalizate cu etilenglicol si polivinilpirolidona (Ag/EG/PVP),

concentrație 1mg/ml; Nanoparticulele au fost oferite de partenerul 3 – Universitatea Politehnică București În Biobaza UMF. Craiova au fost alcătuite 6 loturi a câte 5 sobolani adulți din rasa Wistar

comun (câte un lot pentru fiecare tip de nanoparticule investigate), cu greutatea de între 350 și 375grame. Animalele au fost ținute înainte și în timpulexperimentul în condiții standard de lumină, temperatură și umiditate, având acces permanent la hranăși apă (ad libitum). S-au luat toate masurile pentru respectare întocmai a condițiilor cerute de Comisia de etică a UMF Craiova și Ordonanța Guvernului nr. 37/2.02.2002, a cerințelor Directivei Consiliului European din11.24.1986 (86/609 / CEE), și Convenției Europeane privindProtecția animalelor vertebrate (2005).

În cadrul acestei activități s-au efectuat două studii pentru evaluarea eventualelor efecte toxice ale nanoparticulelor:

- evaluarea modificărilor biochimice ale unor produși de metabolism (glucidic, protidic și lipidic) în urma injectării intraperitoneale de nanoparticule;

- evaluarea efectelor citotoxice ”in vivo” ale nanoparticulelor asupra ficatului, rinichilor, splinei, plamânilor, cordului și encefalului prin studii de microscopie optică pe colorații clasice.

Procedeul de lucru Înainte de a se injecta intraperitoneal cate 1 ml de nanoparticule (2,5 mg/kg.corp) fiecare animal a anesteziat prin injectare intramusculară de Ketamină clorhidrat (Ketalar®, Parke-Davis),85 mg / kg și clorhidrat de xilazină (Rompun®,Bayer) 6 mg / kg corp (figura 10.1). Apoi s-a extras de la fiecare animal câte 1 ml de sânge din vena dorsală a cozii (figura 10.2) care s-a trimis la laborator, unde au fost determinate principalele constante biochimice, utilizându-se analizorul de biochimie uscată SPOTCHEM EZ sp-4430. După aceasta s-a injectat fiecărui animal câte 1 ml de nanoparticule (figura 10,3). Animalele au fost urmărite în continuare timp de 7 zile, fiind ținute în condiții standard de lumina, umiditate și temperatură și având acces liber la apă și hrană. Nu s-au înregistrat decese în rândul animalelor de experiență, iar starea fizică și comportamentul animalelor a fost normal. După 7 zile de la începerea experimentului, sub anestezie generală, s-a recoltat sânge din vena dorsală a cozii pentru studiul biochimic, după care animalele au fost sacrificate și recoltate organele interne pentru studii de histopatologie. Constantele biochimice ale fiecărui animal au fost comparate cu cele de la începutul experimentului.

25

Pentru studiul histopatologic, organele interne ale fiecărui animal au fost puse în soluție fixatoare de formalină neutră 10% timp de 72 de ore. Apoi au fost prelevate fragmente de organe de circa 1mm grosime care au fost incluse în parafină histologică utilizându-se protocolul clasic.

Rezultatele studiului biochimic Analizele biochimice respectiv glicemie, proteine totale, albumine, transaminaze (GOT,

GPT), acid uric, colesterol, trigiceride nu au avut modificari semnificative inainte si dupa injectarea nanoparticulelor. De aceea s-a propus reluarea experimentului cu concentrații mai mari de nanoparticule penttru a stabili doza minima letala (DZ50%) si apoi de a evidențuia modificarile metabolice si histopatologice la doze sub doza minima letală.

Figura 10.1. Anestezice (xilazina +

ketamina) Figura 10.2.Recoltare probe de sânge din

vena dorsala a cozii

Figura 10.3 – Injectarea intraperitoneala a nanoparticulelor la animalul de experiență

Figura 10.4.Determinarea parametrilor biochimici cu aparatul de biochimie uscata SPOTCHEM EZ sp-4430

A1.11 Diseminarea rezultatelor de cercetare obtinute in cadrul proiectului si lansarea paginii web a proiectului Indicatori de realizare:Publicarea a cel puțin 2 lucrări științifice în reviste cotate ISI, cu factor de impact; Site-ul web al proiectului – grad de realizare peste 100% (indicator depasit) Participanți: UMFCV, UPB, UMFCD, INBPNS

Articole publicate 1.Negut, I.; Grumezescu, V.; Grumezescu, A.M.* Treatment Strategies for Infected

Wounds. Molecules 2018, 23, 2392. Factor de impact - 3.098 (Q2) 2. Burdușel, A.-C.; Gherasim, O.; Grumezescu, A.M.; Mogoantă, L.; Ficai, A.;

Andronescu, E. Biomedical Applications of Silver Nanoparticles: An Up-to-Date Overview. Nanomaterials 2018, 8, 681. Factor de impact - 3.504 (Q1)

26

3.Ana-Maria Rosca, Raluca Tutuianu, Irina Domnica Titorencu. Mesenchymal stromal cells derived exosomes as tools for chronic wound healing therapy. Articol acceptat spre publicare la revista Romanian Journal of Morphology and Embryology, Factor de impact - 0.912.

Participari la conferinte internationale 1. Grumezescu Alexandru M, Holban Alina M, Grumezescu Valentina, Mogoanta Laurentiu,

Andronescu Ecaterina.Functionalized silver nanoparticles modified surfaces differently modulate attachment and biofilms in opportunistic and microbiota microorganisms, 6th World Congress on Targeting Microbiota October 28-30, 2018 - Hotel Crowne Plaza, Porto, Portugal. Prezentari la conferințe naționale

1. Ana-Maria Rosca, Raluca Tutuianu, Vasile Pruna, Irina Titorencu. Mesenchymal stromal cells derived exosomes as tools for chronic wound healing therapy. Prezentare orala la manifestatia stiintifica “The 16th National Symposium of Microscopic Morphology with International Attendance” organizata la Craiova, in perioada 22-25 mai 2018. Abstract publicat in Volum de Rezumate, pag. 69.

2. Raluca Tutuianu, Ana-Maria Rosca, Madalina Albu-Kaya, Vasile Pruna, Maya Simionescu, Irina Titorencu. The secretome of mesenchymal stromal cells sustains the colonization of skin cells on collagen scaffolds. Prezentare orala la manifestatia stiintifica “Al 10-lea Congres National cu Participare Internationala si a 36-a Sesiune Stiintifica a Societatii Nationale de Biologie Celulara” organizata la Craiova, in perioada 6-9 iunie 2018. Abstract publicat in Bulletin of Romania Society for Cell Biology no. 46, Pag. 93.

3. Ana-Maria Rosca, Vasile Pruna, Raluca Tutuianu, T.Paul Neagu, Ioan Lascar, Maya Simionescu, Irina Titorencu. Dermal fibroblasts as new players in regenerative therapy. Poster prezentat la la manifestatia stiintifica “The 12th Central and Eastern European Proteomic Conference" 24-26 octombrie 2018, Bucuresti. Abstract publicat in Book of Abstracts pag. 108.

Prezentarea structurii ofertei de servicii de cercetare si tehnologice

1) Universitatea de Medicină și Farmacie din Craiova Centrul pentru Studii de Morfologie Microscopica si Imunologie

https://erris.gov.ro/Research-Center-for-Microsco Infiintat in anul 1998, Centrul de Cercetare pentru Studii de Morfologie si Imunologie

Microscopica din cadrul Departamentului de Histologie al Universitatii de Medicina si Farmacie din Craiova isi propune sa sprijine cercetarea medicala preclinica si clinica, sa integreze diferite proiecte de cercetare cu diagnostic, să contribuie cu cercetători bine pregătiți și să susțină dezvoltarea continuă a personalului didactic și a studenților.

În prezent, acesta este un centru de diagnostic acreditat pentru leziuni neoplazice și neoplazice, în special pentru sistemul mamar, respirator și digestiv.

Desi centrul este implicat in numeroase proiecte de cercetare, una dintre principalele domenii de interes si expertiza este neuropatologia si neurobiologia atacului ischemic, atat la pacientii umani, cat si la modelele animale, conducand la publicatii in reviste precum Patologie Brain, Neurologie, Neuropatologie, Journal din histochimie și citochimie și PLoS One.

Pe ambele direcții de diagnosticare și de cercetare, capacitățile noastre se bazează pe imunohistochimia semi-cantitativă și cantitativă (ultima bazată pe o configurație multispectrală unică, Nuance FX, Perkin Elmer) și o stație de analiză a imaginii personalizate, capabilă să efectueze orice bi-dimensional și arhitecturi morfologice și de măsurare dimensionale (bazate pe pachetul de procesare a imaginii complete Image ProPlus AMS 7, Media Cybernetics, SUA).

27

În cele din urmă, suntem printre primele grupuri care folosesc un scanner macroscopic tridimensional în evaluarea volumetrică a organelor, cum ar fi evaluarea edemului cerebral la modelele animale de accident vascular cerebral. Achiziții relevante efectuate în cadrul etapei

• Analizor de biochimie uscata SPOTCHEM EZ SP-4439 • Camera HDMI, sensor Sony, 6 Mpxl pentru microscopul Nikon Eclipse 200 • Calculator Lenovo pentru microscopul de cercetare Nikon 55i

Resursa umana implicata Prof. univ. dr. Mogoanta Laurențiu: 2 brevete; 95 articole ISI, 654 de citări, Hirsch 13; 5 capitole intenaționale; 11 cărți nationale. 28 de proiecte naționale, 1 internațional, 8 director/responsabil. Președinte Soc Româna de Morfologie, Expert ARACIS, Redactor Șef Rom J Morphol Embryol (ISI Thomson). Premiu Asociația Medicale Române (2017). Prof. univ. dr. Pirici Daniel-Nicolae: 10 proiecte nationale (2 director). 1 brevet, 1 in evaluare. 78 articole ISI, Hirsch 15, 1596 citari. 4 carti internationale, 10 nationale. Managing editor Currenth Health Sciences. Reviewer pt Brain, Diagnostic Pathology, Pattern Recognition, RJME. Conf. Univ. Dr. Mogosanu George-Dan: Farmacist primar. 61 articole ISI, 410 citari, Indice Hirsch 11. Sase proiecte de cercetare (1 director). Conf. Dr. Streba Costin Teodor: 51 articole ISI Hirsch 12, 480 citari. Editor tratat international (2018). Autor principal doua monografii internationale, una nationala, 9 capitole carti internationale (6 autor principal); co-autor 4 volume nationale. Membru 8 proiecte (2 internationale, doua in stransa legatura cu tema – nanoparticule activate magnetic pentru ablatia tumorilor hepatice; studiu microscopie confocala laser).

2) Institutul National de Biologie Celulara „Nicolae Simionescu” http://erris.gov.ro/EXPERIMENTAL-MODELING-PLATFO

Centru de Excelenta al Comunitatii Europene, beneficiaza de o infrastructura moderna, dezvoltata prin fonduri europene (CARDIOPRO si SORTIS), care asigura echipamentul necesar pentru activitatile propuse in acest proiect. Astfel, experimentele care vizeaza izolarea si caracterizarea celulelor stem mezenchimale umane din cele 2 surse: tesut adipos si maduva osoasa hematogena precum si a fibroblastelor si keratinocitelor umane si testarea biocompatibilitatii naoparticulelor cu celulele tegumentare au fost implementate in principal in Laboratorul Central de Culturi Celulare, dotat cu camere curate avand standard ISO 6 - ISO 8, in care se afla 6 hote cu flux laminar de clasa II, 12 incubatoare, 3 centrifugi cu racire, 4 microscoape optice inversate, 2 microscoape de fluorescenta si un sistem xCELLigence. In acest an a fost demarata procedura de modernizare a acestui laborator prin achizitia unui termoblok, a unei bai de uscare digitale prevazuta cu 2 blocuri (pentru tuburi de 15 ml si 50 ml), a unei combine frigorifice de 505 L folosita pentru stocarea reactivilor precum si a unui sterilizator - STERI 350 intrebuintat la sterilizare instrumentelor utilizate in tehnicile de izolare a celulelor din tesuturi si a unui sistem de electroforeza utilizat in studiile de caracterizare comparativa a exozomilor. De asemenea, Statia de Spalare - Sterilizare care deserveste Laboratorul de Culturi Celulare a fost modernizata prin achizitionarea unui sistem de purificare si dedurizare a apei care a fost conectat la cele 2 autoclave precum si la masina de spalare a intregii sticlarii utilizate pentru lucrul in camerele curate. O alta achizitie efectuata in aceasta etapa a presupus cumpararea unei macara folosita in manevrarea rackurilor din vasele Dewar in care este depozitata intreaga colectie de celule a institutului. Pentru realizarea experimentelor de culturi celulare si biologie moleculara au fost achizitionate 2 pachete de pipete Eppendorf research plus. Institutul dispune de un Laborator central de Imagistica pentru procesarea histologica a probelor biologice, un Laborator de Citometrie de Flux echipat cu un citometru Gallios cu 3 lasere si un sorter MoFlo Astrios, microscop confocal Leica TCS SP5 II si microscop de fluorescenta Zeiss Observer D1, de aparate pentru RT-PCR si Real Time PCR, hote cu flux laminar si aparate de dozare spectrofotometrica Nanodrop, care sunt utilizate pentru analizele biochimice prevazute in acest proiect. Platforma moderna de Modelare Experimentala contine o biobaza fara patogeni (SPF - Specific Pathogen-Free), un iradiator gamma RS 2000 RadSource si un sistem de imagistica in vivo IVIS Spectrum CT

28

Servicii de cercetare - Initiere si caracterizare de linii celulare; - Obtinere de linii imortalizate; - Studii de biocompatibilitate pe variate tipuri celulare: celule stem mezenchimale umane

izolate din multiple surse, celule musculare netede umane, celule endoteliale umane, keratinocite si fibroblaste umane, celule osteoprogenitoare umane, macrofage, hepatocite, etc;

- Studii de chemotaxie pe camere duble si folosind sistemul xCELLigence; - Studii de histologie, inclusiv procesare histopatologica (criosectiuni si parafina)

imunohistochimie si imunocitochimie, izolarea de la nivelul sectiunilor prin microdisectie laser (Palm MicroBeam, Zeiss) in vederea caracterizarii genice si proteice a fragmentelor de interes;

- Tehnici de biologie moleculara si biochimie: izolare de acizi nucleici, PCR, qPCR, Western Blot, Elisa, transfectii, clonari, dozare spectrofotometrica si fluorimetrica, determinari de activitate enzimatica;

- Studii de citometrie in flux. Resursa umana

Echipa IBPC va fi compusa din 11 membri, cercetatori cu experienta in domeniul biologiei celulare si al biomaterialelor, tehnicieni si doi noi angajati, absolventi ai unei facultati de profil. Responsabilul de proiect, dr. Irina Titorencu (h=12, 42 articole si 381 citari, Scopus), biolog, are o experienta bogata in lucrul cu celule stem, in tehnici de imunocitochimie, histologie si tehnici de biocompatibilitate, ceea ce se reflecta in numarul de articole publicat, 4 proiecte castigate in calitate de director/responsabil si 2 brevete, din care unul a fost premiat international. Echipa, cu un grad inalt de complementaritate, va fi formata din: doi cercetatori cu vasta experienta in domeniul biologiei celulare, coordonatori a numeroase proiecte de cercetare nationale si internationale (Acad. Maya Simionescu, biolog, CS I, h=43, 201 articole si 6349 de citari, Scopus si Adriana Georgescu, fizician, CS I, h=12, 41 articole si 444 citari, Scopus), trei postdoctoranzi cu experienta in lucrul cu celule stem, tehnici de biocompatibilitate, de biochimie si biologie moleculara (dr. Ana-Maria Rosca - biochimist, dr. Vasile Pruna – matematician si biochimist si dr. Alina Constantin - fizician), un doctorand absolvent al Facultatii de Bioinginerie Medicala si Master de Substante, Materiale si Sisteme Biocompatibile (Raluca Tutuianu) si doi tehnicieni (Stan Constanta si Ana Magdalena Maiovschi). Mentionam ca majoritatea membrilor echipei IBPC sunt absolventi POSDRU: scoala doctorala (Vasile Pruna) si postdoctorala (Irina Titorencu, Adriana Georgescu, Ana-Maria Rosca si Alina Constantin). La acestia se vor adauga doi noi angajati, care vor fi recrutati in primele 6 luni dupa semnarea contractului, in functie de educatia si experienta profesionala, relevante pentru tema proiectului.

3) Universitatea Politehnica Bucuresti Departamentul de Stiinta si Ingineria Materialelor Oxidice si Nanomaterialelor

https://erris.gov.ro/UPB-CASM-SIMONa Creșterea calității vieții, îmbunătățirea stării de sănătate și siguranță a omenirii,

dezvoltarea industrială și a noilor produse și tehnologii, toate se bazează pe proiectarea de noi materiale, având noi funcții și proprietăți îmbunătățite. Acesta este scopul activităților de cercetare efectuate de echipele active în cadrul Centrului Național pentru Micro și Nanomateriale (laboratorul face parte din Departamentul de Știință și Inginerie al Materialelor Oxide și Nanomateriale de la Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor la Universitatea POLITEHNICA din București), programele de cercetare propuse care vizează dezvoltarea materialelor multifuncționale, nano și microstructurate, care combină materiale oxidice, organice, polimerice sau metalice și au proprietăți predeterminate. Activitatea de cercetare propusă este cuprinzătoare, în sensul că include sinteza, prelucrarea, caracterizarea, modelarea și validarea noilor materiale multifuncționale. Resursa umana

Prof.dr.ing. Ecaterina ANDRONESCU, Prof.dr.ing. Adrian VOLCEANOV, Prof.dr.ing. Adelina IANCULESCU, Prof.dr.ing. Alina Ioana BĂDĂNOIU, Prof.dr.ing. Cristina

29

GHIȚULICĂ, Prof.dr.ing. Ștefania STOLERIU, CS I.dr.ing Eugeniu VASILE, Conf.dr.ing. Ovidiu DUMITRESCU, Prof.dr.ing. Sorin JINGA, ș.a. Zeno GHIZDĂVEȚ, Conf.dr.ing. Alina MELINESCU, Conf.dr.ing. Anton FICAI, Prof.dr.ing. Georgeta VOICU, ș.a. Mihai Eftimie, CS.III.dr.ing. Bogdan VASILE, ș.a. Alexandru Mihai GRUMEZESCU, ș.a. Cristina BUSUIOC, As.drd.ing. Ionela-Andreea NEACSU, As.drd.ing. Vladimir Lucian ENE, As.drd.ing. Adrian NICOARA, As. cercet.drd.ing. Adrian SURDU, CS. Dr. Ing. Otilia VASILE, Drd.ing. Mihaela BIRSAN, Drd.ing. Andreia CUCURUZ. 4) Universitatea de Medicina si Farmacie din Craiova Centrul de Excelență în Microchirurgie Experimentală http://erris.gov.ro/Department-of-Regenerative-M-1 http://erris.gov.ro/EXPERIMENTAL-MODELING-PLATFO

Acreditat în anul 2015 sub tutela Academiei de Științe Medicale și a funcționat ca laborator de microchirurgie experimentală din anul 2000 când a fost înființat de către Prof. Dr. Ioan Lascar. Arie principală cu 5 mese de microchirurgie, aparat de anestezie pentru animale mici cu ventilator și vaporizator de inducție cu isoflurane, microscop chirurgical Carl Zeiss 4x, microscop experimental Carl Zeiss OPMI PICO. DVD Panasonic DMR-ES15. Trusă microchirurgie Aesculap, consumabile. Aria secundară: acomodare animale de laborator, salon postoperator, salon animale „bolnave” și salon principal de monitorizare postoperatorie. 30 cuști, adăpătoare și hrănitoare.

IBPC, Centru de Excelenta al Comunitatii Europene,beneficiaza de o infrastructura moderna, dezvoltata prin fonduri europene (CARDIOPRO si SORTIS), care asigura echipamentul necesar pentru activitatile propuse. Proiectul va fi implementat in principal in Departamentul de Medicina Regenerativa, care include Laboratorul Central de Culturi Celulare, cu camere curate avand standard ISO 6 -ISO 8 , dotate cu 6 hote cu flux laminar de clasa II, 12 incubatoare, 3 centrifugi cu racire, 4 microscoape optice inversate, 2 microscoape de fluorescenta si un sistemxCELLigence. Aceasta sectiune va fi dezvoltata pe parcusul proiectului prin modernizarea statiei de sterilizare, presupunand achizitia unei etuve de capacitatemare, a unui bidistilator si a unui aparat de dedurizare a apei, iar camerele curate vor fi dotate cu bai cu bile metalice si aparat de nebulizare pentru imbunatatirea sterilitatii si un frigider pentru stocarea reactivilor. Institutul are de asemenea un Laborator central de Imagistica pentru procesarea histologica a probelor biologice, un Laborator de Citometrie de Flux echipat cu un citometru Gallios cu 3 lasere si un sorter MoFlo Astrios, microscop confocal LeicaTCSSP5II si microscop de fluorescenta Zeiss Observer D1, care va fi imbunatatit prin achizitia de obiective cu putere de marire mare si performante pentru observarea preparatelor histologice, aparate pentru RT-PCR si Real Time PCR, hota cu flux laminar si aparat de dozare spectrofotometrica Nanodrop, care vor fi utilizate pentru analizele biochimice prevazute in acest proiect. Platforma moderna de Modelare Experimentala contine o biobaza fara patogeni (SPF -Specific Pathogen-Free), un iradiator gamma RS2000RadSource si un sistem de imagistica in vivo IVIS Spectrum CT. De asemenea, vor fi achizitionate o serie de aparate de mica valoare, necesare activitatii de cercetare.

Director Proiect Complex, Prof. Univ. Dr. Mogoanta Laurentiu

30