1  

 

Raport  ştiinţific    

privind  implementarea  proiectului  in  perioada  octombrie  2011    –  decembrie  2013  

 

Titlu  proiect:  Explorarea  minim  invazivă  a  angiogenezei  în  canerul  de  pancreas  prin  metode  imagistice  şi  

moleculare  (Angio-­‐PAC)  

Director:  Prof.  Univ.  Dr.  Adrian  Săftoiu  

 

Etapa  1:    

• Crearea  bazei  de  date  şi  a  protocolului  de  lucru  

Etapa  2:    

• Crearea  bazei  de  date  şi  a  protocolului  de  lucru  

• Includerea  pacienţilor  cu  cancer  pancreatic  (CE-­‐EUS,  3D-­‐EUS,  EUS-­‐FNA,  EUS-­‐TCB)    

• Includerea  pacienţilor  cu  cancer  pancreatic  (colectarea  de  ţesut  pancreatic  post  rezecţie  

chirurgicală)  

Etapa  3:    

• Studiul  in  timp  real  al  micromediului  tumoral  

• Studiul  angiogenezei  si  al  celulelor  stem  in  cancerul  pancreatic  prin  imunohistochimie  si  

microdisectie  laser  

 

 

• Crearea  bazei  de  date  şi  a  protocolului  de  lucru  

Pe   parcursul   acestei   etape   a   fost   completată   baza   de   date   în   format   electronic   şi   protocolul   de  

lucru,  necesar  pentru  evaluarea  minim  invazivă  a  pacienţilor  cu  cancer  de  pancreas.  Au  fost  de  asemenea  

definitivate  criteriile  de  includere  şi  excludere.    

Baza   de   date   a   fost   completată   pentru   toţii   pacienţii   incluşi   în   studiu   şi   conţine   toate   rezultatele  

explorărilor   efectuate.   Înregistrările   explorărilor   imagistice   sunt   stocate   în   format   digital   pentru   analiza  

computerizată  ulterioară.    

  2  

 

 

 

• Includerea  pacienţilor  cu  cancer  pancreatic  (CE-­‐EUS,  3D-­‐EUS,  EUS-­‐FNA,  EUS-­‐TCB)    

Toţi   pacienţii   şi-­‐au   dat   consimţământul   scris   pentru   examinarea   ecoendoscopică,   efectuarea  

anesteziei,  colectarea  de  probe  biologice  şi  folosirea  datelor  rezultate  din  investigaţii  în  scopuri  ştiinţifice.  

Endoscopia   Ultrasonografică   (EUS)   s-­‐a   efectuat   iniţial   în   mod   convenţional   în   scală   gri,   prin  

examinarea  cu  atenţie  din  duoden  şi  stomac  a  capului,  corpului  şi  cozii  de  pancreas  (Figura  1a).  

S-­‐a  efectuat,  de  asemenea,  examinarea   în  mod  Doppler  color  şi  Power  Doppler  pentru  a  vizualiza  

vasele  tumorale  şi  cele  din  vecinătate,  pentru  a  stadializa  boala  şi  a  aprecia  rezecabilitatea.  S-­‐a  menţinut  o  

imagine  stabilă  centrată  pe  aria  de   interes,   în  general  cu   tumora   în  centrul   imaginii   şi  unul  dintre  vasele  

mari  (Figura  1b).  

 

 

Figura  1  –  Adenocarcinom  de  cap  de  pancreas  

(1a  –  imagine  EUS  în  scală  gri;  1b  –mod  Doppler  evidenţiind  contactul  formaţiunii  cu  vena  splenică)  

 

  3  

Figura  2a  –  Adenocarcinom  de  cap  de  pancreas,  imaginea  standard  în  modul  de  examinare  cu  

contrast  şi  index  mecanic  scăzut      

Figura  2b  –  Adenocarcinom  de  cap  de  pancreas  –  formaţiune  hipocaptantă  după  injectarea  substanţei  

de  contrast  (faza  arterială,  10  secunde)      

Pentru   examinarea   cu   substanţă   de   contrast   (CE-­‐EUS)   şi   index   mecanic   scăzut,   ecograful   a   fost  

comutat  în  modul  de  examinare  dedicat,  afişând  astfel  imaginea  cu  contrast  în  partea  stână  a  ecranului  şi  

imaginea  în  scală  gri  în  partea  din  dreapta  (Figura  2a).  Selectarea  indexului  mecanic  (MI  -­‐  0,2)  şi  a  gain-­‐ului  

a   fost   urmată   de   injectarea   în   bolus   a   substanţei   de   contrast   de   generaţia   a   2-­‐a   (Sonovue   2,4   ml)   şi  

înregistrarea  în  format  digital  a  examinării  (Figura  2b).    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

După   înregistrarea   fazei  arteriale   şi  a   celei  venoase   (aprox.  120  secunde),   sistemul  a   fost  din  nou  

setat  pe  mod  EUS  standard  şi  s-­‐au  efectuat  examinări  în  moduri  Doppler  Color  şi  Power  Dopple,  dar  după  

administrarea  substanţei  de  contrast  (cu  index  mecanic  crescut).  

Pentru  o  examinare  mai  fidelă  a  formaţiunii  tumorale  şi  a  relaţiilor  spaţiale  cu  vasele  înconjurătoare  

au   fost   realizate   în   continuare   înregistrări   în   mod   3D   (3D-­‐EUS),   atât   cu   index   mecanic   crescut   prin  

examinare  în  mod  Doppler  (Figura  3a)  cât  şi  scăzut  (Figura  3b)  .  

 

  4  

   

Figura  3  –  Adenocarcinom  de  cap  de  pancreas,  examinare  tri-­‐dimensională  pentru  o  mai  bună  apreciere  a  

relaţiei  cu  vasele  trunchiului  celiac    

(3a  –  reconstrucţie  3D  în  mod  Doppler  ;  3b  –  reconstrucţie  3D  în  mod  cu  index  mecanic  scăzut)  

 

 

În  continuare,  pentru  un  diagnostic  de  certitudine  s-­‐a  efectuat  colectarea  de  material  biologic  din  

formaţiunea   tumorală   examinată.   Această   tehnică   s-­‐a   realizat   fie   prin   puncţie   fină   aspirativă   ghidată  

ecoendoscopic   (PFA-­‐EUS)   fie   prin   puncţie   cu  

ac   histologic   (Figura   4).     Puncţia   aspirativă  

este   ghidată   prin   examinare   cu  

ecoendoscopul   cu   vedere   longitudinală,  

inclusiv  în  mod  power  Doppler  (pentru  a  evita  

puncţionarea   vaselor   şi   hemoragie  

consecutivă).  După  ce  s-­‐a  fixat  leziunea  (dacă  

este  posibil  prin  angulare   în  UP)   s-­‐a   introdus  

acul   pe   porţiunea   proximală   a   canalului   de  

biopsie   şi   s-­‐a   montat   prin   înfiletarea  

mânerului  acului  la  nivelul  capătului  proximal  

al   canalului   de   biopsie.   S-­‐a   avansat   capătul  

acului   până   ce   acesta   apare   în   câmpul  

ecoendoscopic,   moment   în   care   se   fixează  

poziţia  cu  ajutorul  şurubului  de  pe  mâner.  Ulterior  s-­‐a  avansat  vârful  acului  în  interiorul  leziunii,  s-­‐a  extras  

stiletul  şi  s-­‐a  fixat  seringa  în  care  s-­‐a  creat  vid  (facilitându-­‐se  astfel  sucţiunea  permanentă).  S-­‐au  executat  

un  număr  de  3  până  la  6  pasaje  prin  mişcări  de  avansare  şi  retragere  după  care  s-­‐a  extras  acul  de  puncţie.  

Conţinutul  acului  a  fost  descărcat  pe  mai  multe  lame  de  sticlă  pe  care  s-­‐au  realizat  frotiuri  colorate,  o  parte  

Figura  4  –  Adenocarcinom  de  cap  de  pancreas  -­‐  puncţie  aspirativă  cu  ac  histologic  (procore)  de  19  G  

 

  5  

din  conţinutul  puncţionat  a  fost  colectat  pentru  obţinerea  de  blocuri  celulare  şi  o  altă  parte  a  fost  imersată  

în   stabilizator   ARN   şi   congelată   la   -­‐80⁰   C.   Tehnica   de   recoltare   cu   ac   histologic   (Figura   4b)   a   fost  

asemănătoare.  Din  produsul  obţinut,  o  parte  a  fost  imersat  în  formol  pentru  analiză  anatomopatologică  şi  

o  altă  parte,  de  asemenea  în  stabilizator  ARN  pentru  analizele  genetice  din  etapele  viitoare.    

Diagnosticul  final  de  cancer  pancreatic  s-­‐a  bazat  bazat  pe  o  combinaţie  de  informaţii  obţinute  prin  

testele  imagistice  (inclusiv  PFA  şi  confirmare  citologică  a  malignităţii),  urmărire  timp  de  cel  puţin  6  luni  prin  

examinări   repetate   clinice,   ecografice   sau   computer   tomografice,   respectiv   laparotomie   cu   examen  

histopatologic.  Pacienţii  diagnosticaţi  cu  pancreatită  cronică  pseudotumorală  au  fost  urmăriţi  minim  6  luni  

prin   ecografie   transabdominală,   CT   şi/sau   ecoendoscopie   cu   PFA,   pentru   excluderea   diagnosticului   de  

malignitate.  

 

 

• Includerea  pacienţilor   cu   cancer   pancreatic   (colectarea  de   ţesut   pancreatic   post   rezecţie  

chirurgicală)  

 

Pacienţii   la   care   diagnosticul   s-­‐a   realizat   într-­‐un   stadiu   rezecabil   (<20%)   au   fost   propuşi   pentru  

intervenţie   chirurgicală   (duodenopancreatectomie).   Echipa  de   chirurgi   a   fost   înştiinţată  despre   studiul   la  

care   participă   pacientul   şi   şi-­‐au   dat   acordul   pentru   recoltarea   de   ţesut   pancreatic   tumoral.   Produsul  

biologic  a  fost  recoltat  în  recipiente  cu  formol  şi  în  recipiente  conţinând  soluţie  de  stabilizare  ARN,  acestea  

fiind  ulterior  congelate  la  -­‐80⁰  C.  

 

 

• Studiul  in  timp  real  al  micromediului  tumoral  

Endomicroscopia   confocală   laser   (CLE)   a   fost   propusă   ca   o   nouă   metodă   de   examinare   care  

permite   studiul  microscopic   in   vivo   al  mucoasei   gastrointestinale   în   timpul   endoscopiei.  Avantajul  major  

constă  în  obţinerea  unor  imagini  histologice  in  vivo,  cu  detalii  asupra  structurilor  celulare  și  vasculare,  care  

fac  posibil  diagnosticul  imediat  pentru  diferite  leziuni  şi  tipuri  de  țesuturi.  Din  punct  de  vedere  tehnic  există  

un  sistem  dedicat  de  endomicroscopie  (eCLE,  Pentax;  Tokio,  Japonia)  și  un  sistem  de  miniprobe  flexibile  ce  

pot  fi  trecute  prin  canalul  de  lucru  al  unui  endoscop  obișnuit  (pCLE,  Cellvizio,  Mauna  Kea  Technology,  Paris,  

Franța),  principiul  examinării   fiind  similar:  generarea  unei  raze   laser  cu   lungime  de  unde  de  488  nm  care  

este   direcționată   către   țesutul   țintă,   iar   semnalul   recapturat   este   reprezentat   sub   forma   unor   secţiuni  

optice  tisulare.    

  6  

Potențialul   CLE   a   fost   explorat   în   patologii   diverse   ale   tractului   gastrointestinal,   demonstrând  

acuratețe  înaltă  în  diagnosticul  leziunilor  premaligne  şi  maligne  pe  baza  evaluării  în  timp  real  a  aspectelor  

vasculare  și  tisulare.  

Sistemul  cu  miniprobe  (pCLE)  este  alcătuit  dintr-­‐o  probă-­‐cateter  compusă  dintr-­‐un  fascicol  de  fibre  

optice  conectate   la  un  micro-­‐obiectiv,  o  unitate  de  scanare   laser  și  un  software  de  control  şi  achiziţie.  O  

gamă   largă   de   miniprobe   a   fost   proiectată   pentru   diferite   proceduri   endoscopice   și   aplicații   la   nivelul  

tractului  gastrointestinal  superior  și   inferior  cu  diferite  dimensiuni  și  parametri  optici.  Endomicroscopia  a  

depășit  recent  indicațiile  luminale  prin  dezvoltarea  unei  noi  miniprobe  de  dimensiuni  submilimetrice  care  

poate  fi  avansată  sub  ghidaj  ecoendoscopic  printr-­‐un  ac  de  puncție  fina  aspirativă  de  19G.  Această  tehnică  

de  endomicroscopie  ghidată  EUS  (nCLE)  oferă  posibilitatea  obținerii  detaliilor  microscopice  pentru  leziunile  

identificate   la   nivelul   organelor   solide   adiacente   tractului   gastrointestinal,   altfel   greu   accesibile   pentru  

prelevarea   de   biopsii.   Fezabilitatea   tehnicii   a   fost   demonstrată   în   studii   clinice   care   au   vizat   în   principal  

leziunile   chistice   pancreatice   și   care   au   condus   la   obținerea   unor   criterii   descriptive   pentru   diagnosticul  

acestora.  A  fost  raportat  însă  doar  un  număr  limitat  de  cazuri  de  tumori  solide  pancreatice  examinate  prin  

nCLE.  

Prin   urmare,   în   această   etapă   a   proiectului   am   urmărit   evaluarea   în   timp   real   a   micromediului  

tumoral  în  leziunile  solide  pancreatice  și  a  ganglionilor  limfatici  utilizând  examinarea  endomicroscopiei  pe  

ac  sub  ghidaj  ecoendoscopic  (EUS-­‐nCLE).  În  același  timp  am  urmărit  demonstrarea  fezabilității  și  evaluarea  

siguranței  acestei  noi  tehnici  de  examinare.    

Acest   studiu   a   inclus   prospectiv   pacienți   cu   mase   tumorale   pancreatice   în   cele   două   centre  

implicate:   Centrul   de   Cercetare   în   Gastroenterologie   și   Hepatologie,   UMF   din   Craiova,   România   și  

Departamentul   de   Endoscopie,   Unitatea   de   Gastroenterologie,   Spitalul   Universitar   Herlev,   Copenhaga,  

Danemarca.   Criteriile   de   includere   a   pacienților   au   fost:   vârsta   peste   18   ani,   prezența   unei   tumori  

pancreatice   cu   indicație   pentru   efectuarea   puncției   fine   aspirative   (PFA)   ghidate   EUS,   acordarea  

consimțământului   informat  pentru  efectuarea  procedurii,   fiind  excluși  pacienții   cu  contraindicație  pentru  

PFA-­‐EUS,  cu  alergie  la  substanța  de  contrast  utilizată  sau  cei  la  care  nu  a  putut  fi  obținut  consimțământul.  

Pentru  aceste  proceduri  a  fost  utilizată  o  miniprobă  proiectată  pentru  a  fi  introdusă  printr-­‐un  ac  de  

PFA  de  19G  în  leziunile  de  interes  (AQ-­‐Flex  19™,  Cellvizio;  Mauna  Kea  Technology,  Paris,  France),  având  un  

diametru  de  0,85  mm,  o  rezoluție   laterală  de  3,5  µm  și  câmpul  optic  de  325  µm  (Figura  5A).  Examinarea  

EUS   a   fost   efectuată   cu   ajutorul   ecoenedoscoapelor   liniare   (Pentax   EG  3870  UTK,  Hamburg,   Europe   sau  

Olympus   GF-­‐UCT180,   Tokyo,   Japan)   cuplate   la   sistemele   de   ultrasonografie   compatibile,   urmărind  

examinarea   completă   a   pancreasului   cu   descrierea   caracteristicilor   tumorale   (ecostructură,   dimensiuni,  

prezența   invaziei   vasculare).  A   fost  notată  de  asemenea  prezența  ganglionilor   regionali   și   a  eventualelor  

metastaze  hepatice.    

  7  

 

Figura  5  -­‐  Miniproba  pentru  endomicroscopie  (AQ-­‐Flex  19™,  Cellvizio).  B.  Miniproba  AQ-­‐Flex  19™  vizualizată  în  

imaginea  ecoendoscopică  la  nivelul  unei  tumori  pancreatice  

 

Miniproba   de   endomicroscopie   a   fost   preîncărcată   într-­‐un   ac   de   puncţie   fină   aspirativă   de   19G,  

după   îndepărtarea   stiletului,   fixată   în   poziția   adecvată   la   vârful   acului   şi   avansată   în   interiorul   tumorilor  

după  identificarea  acestora  prin  ecoendoscopie  (Figura  5B).  Examinarea  endomicrosopică  a   început  după  

administrarea  substanţei  de  contrast   (fluoresceină  10%,  2,5   -­‐  5  ml,   i.v.),   salvând  secvenţele  video  pentru  

analiză  ulterioară.   Pentru   confirmarea  diagnosticului,   după  achiziționarea   secvențelor  nCLE,   s-­‐a  practicat  

PFA-­‐EUS  cu  examen  citologic  și  microhistologie  pe  blocuri  celulare.  

Diagnosticul   final   s-­‐a   bazat   bazat   pe   PFA   şi   confirmarea   citologică   a   malignităţii,   coroborat   cu  

informaţiile   obţinute  prin   testele   imagistice   și   urmărire   timp  de   cel   puţin   6   luni   prin   examinări   repetate  

clinice,  ecografice  sau  computer  tomografice.  

În  perioada  noiembrie  2012  -­‐  iulie  2013  au  fost  incluși  20  pacienți  cu  vârsta  medie  de  66  ani  (41-­‐85  

ani),  fiind  examinate  19  tumori  pancreatice  și  3  ganglioni  limfatici.  Examinarea  EUS-­‐nCLE  a  fost  posibilă  în  

toate   cazurile,   reuşind   avansarea  miniprobei   la   nivelul   tumorilor   şi   achiziția   de   secvenţe   reprezentative,  

fără  a  se  înregistra  reacții  adverse  în  timpul  examinării  sau  la  urmărirea  pacienților  timp  de  30  zile.    

Diagnosticul   final   al   leziunilor   examinate   a   fost   malign   în   13   cazuri   (o   tumoră   neuroendocrină  

pancreatică  malignă  și  12  adenocarcinoame  pancreatice)  și  benign  în  7  cazuri,  reprezentate  de  pancreatite  

cronice  pseudotumorale.  

Elementele   întâlnite   frecvent   la   EUS-­‐nCLE   au   fost   reprezentate   de   agregate   celulare   întunecate  

(n=12),   identificate  cel  mai  frecvent   în  cazul   leziunilor  maligne.  Benzile  gri,  subțiri  au  fost  descrise  atât   în  

cazurile  benigne   cât   și   in   cele  maligne,   reprezentând   cel  mai  probabil   benzi   de   fibroză.  Figurile   6,   7   și   8  

ilustrează  aspecte  nCLE  reprezentative  suprinse  la  nivelul  leziunilor  pancreatice  benigne  și  maligne,  dar  și  în  

cazul  ganglionilor  examinați.  

 

 

  8  

 

 

 Figura  6  -­‐  Secvențe  nCLE  înregistrate  la  nivelul  leziunilor  benigne  în  care  pot  fi  observate  structuri  

întunecate  lobulare,  dispuse  regulat,  reprezentând  acinii  pancreatici  (A,  B),  uneori  distanțate  prin  prezența  

țesutului  conjunctiv  abundent  (B),  dar  și  benzi  negre,  subțiri,  probabil    benzi  de  fibroză  în  pancreatita  

cronică  (C)  

 

 

 

Figura  7  -­‐  Imagini  nCLE  surprinse  într-­‐un  caz  de  adenocarcinom  pancreatic  în  care  se  observă  vase  

mari,  dilatate  (A),  cu  fluoresceină  în  cantități  crescute  şi  prezenţa  unor  agregate  întunecate  reprezentând  

grupuri  de  celule  maligne  (B,  C).  

  9  

 

Figura   8   -­‐   Imagini   nCLE   înregistrate   la  

nivelul   ganglionilor   limfatici.   A   -­‐   ganglion  

benign   cu   celule   mici,   inflamatorii.   B   -­‐  

agregate   întuncate   de   celule   maligne  

observate   într-­‐un   caz   de   metastază  

ganglionară   cu   leziune   primitivă  

reprezentată  de  un  adenocarcinom  colonic    

 

 

Ținând   cont   de   numărul   mic   de   pacienți   examinați   și   de   indisponibilitatea   secțiunilor  

histopatologice,   în   cele   mai   multe   cazuri   având   la   dispoziție   doar   aspecte   de   citopatologie,   a   fost   însă  

dificilă   stabilirea   unor   corelații   ferme   între   structurile   observate   la   examinarea   nCLE   și   cele   de  

histopatologie.  

Ca  urmare  a  acestui  studiu  putem  afirma  că  examinarea  tumorilor  pancreatice  prin  EUS-­‐nCLE  este  

fezabilă   din   punct   de   vedere   tehnic,   fără   a   fi   grevată   de   complicații.   Această   nouă   metodă   imagistică  

permite   evaluarea   în   timp   real   a  micromediului   tumoral,   cu  obținerea  unor  detalii   de  ordin  microscopic  

care  ar  putea  permite  pe  viitor  obținerea  unui  diagnostic  histopatologic   în   timp   real   și   inițierea   rapidă  a  

terapiei   adecvate   fiecărui   pacient.   Sunt   necesare   însă   studii   suplimentare   pentru   validarea   criteriilor  

diagnostice  şi  stabilirea  rolului  real  al  metodei  în  examinarea  pacienţilor  cu  cancer  pancreatic.  

 

 

• Studiul  angiogenezei  si  al  celulelor  stem  in  cancerul  pancreatic  prin  imunohistochimie  si  

microdisectie  laser  

Pe  parcursul  acestei  etape  s-­‐a  desfășurat   studiul   imunohistochimic   în   scopul   caracterizării   relației  

dintre   procesul   de   angiogeneză   și   nișa   de   celule   stem   tumorale   (CSC),   pe   contingentul   de   material  

anatomopatologic   colectat   până   în   prezent   (adenocarcinoame   pancreatice   cu   diferite   grade   de  

diferentiere).  

Datele   din   literatură   arată   că   citoarhitectonica   adenocarcinomului   pancreatic   este   organizată   și  

susținută   pe   baza   existenței   celulelor   stem   pancreatice   tumorale,   eliminarea   acestei   populații   de   celule  

fiind  o  țintă  atractivă  în  scopuri  terapeutice  (Wei  et  al.,  2011).  

La  ora  actuala  nu  există  un  consens   în   ceea  ce  privește   strategiile  de   identificare   și   izolare  a  CSC  

datorită  complexității  lor  fenotipice  și  dificultăților  tehnice  întâlnite  (Lee  et  al.,  2008;  Matsuda  et  al.,  2012).  

  10  

Mai  multe  molecule,  in  general  glicoproteine  membranare,  au  fost  propuse  ca  biomarkeri  ai  celulelor  stem:  

CD44,  CD24,  EpCAM  (Epithelial  Cellular  Adhesion  Molecule),  ALDH1A1  (Aldehyde  Dehydrogenase  1-­‐A1),  or  

CXCR4  (Wei  et  al.,  2011;  Lee  et  al.,  2008;  Matsuda  et  al.,  2012).  Datorita   însă  specificității  relativ  scazute  

pentru  populația  de  celule  stem  chiar  si  globală  (normală  și  tumorală),  a  devenit  evident  ca  acest  deziderat  

nu  se  poate  atinge  decat  prin  procedee  de  imunofenotipare  multiplă  simultană  (Matsuda  et  al.,  2012).  

În  studiul  de  față  am  urmărit  caracterizarea  populației  de  celule  CD44+/CD24+,  precum  și  raportul  

acestora  cu  rețeaua  vasculară  de  neoformație.  

CD44  este  o  glicoproteină  membranară  implicată  în  proliferarea,  diferențierea,  și  migrarea  celulară,  

în  procesele  de  semnalizare   intercelulară  si  de  angiogeneză  (Lesley  and  Hyman,  1998).  Experimentele  pe  

animale  au  arătat   că  blocarea  CD44  prin  anticorpi   specifici,  oligonucleotide  antisens,   și  proteine   solubile  

reduc  semnificativ  activitatea  malignă  a  diferitelor  linii  celulare  neoplazice,  subliniind  potențialul  terapeutic  

al  agenților  anti-­‐CD44.  Este  dovedit  că  CD44  promovează  metastazarea,  rezistența   le  terapie  și   împiedică  

apoptoza  în  celulele  tumorale  (Naor  et  al.,  1997).  

CD24   este   o   sialoproteină   membranară   puternic   glicozilată   cu   masa   moleculară   de   35-­‐60   kDa  

exprimată  în  limfocitele  B,  T,  keratinocite,  fiind  supraexprimată  în  multe  tipuri  de  cancer  (Kristiansen  et  al.,  

2003;   Zheng  et   al.,   2011).  Datorită   glicozilării   sale   accentuate,   se  pare   ca   funcția   sa  principală  este  de  a  

media   interacțiunile   dintre   celule   si   respectiv   celule-­‐matrice   extracelulară,   fiind   implicată   în   proceul   de  

metastazare  (Lee  et  al.,  2010;  Kristiansen  et  al.,  2003).  A  fost   identificată  și  ca  ligand  alternativ  pentru  P-­‐

selectine,  o  clasă  de  receptori  de  adeziune  situați  pe  plachetele  sanguine  si  pe  celulele  endoteliale,  această  

interacțiune  facilitând  trecerea  celulelor  tumorale   în   fluxul  sanguin   în  procesul  de  metastazare  (Zheng  et  

al.,  2011;  Myung  et  al.,  2011).  

CD105  (Endoglina)  este  o  proteină  transmembranară  cu  masa  moleculară  de  95  kDa,  exprimată  în  

celulele   vasculare   endoteliale   umane.   Expresia   sa   crește   în   celulele   endoteliale   în   angiogeneză,   si  

numeroase  studii  au  indicat  o  asociere  semnificativă  a  creșterii  densității  vaselor  CD105+  cu  un  prognostic  

rezervat  în  diferite  neoplasme  (Brewer  et  al.,  2000;  Li  et  al.,  2003).    

După  stabilirea  grading-­‐ului  și  stadiului  tumoral  prin  integrarea  datelor  clinice  si  histopatologice,  s-­‐a  

trecut   la  carcacterizarea   individulală  a  markerilor  propuși,  precum  și   studiul   lor  simultan  prin   technici  de  

imunohistochimie  simplă  și  dublă  cu  detecție  enzimatică.  Pe  surt,  anticorpii  primari  direcționați  împortiva  

CD44,   CD24   si   CD105   au   fost   detectați   individual   cu   ajutorul   unui   sistem   de   detecție   polimeric   specific  

speciei   anticorpului   primar,   polimeri   conjugati   cu   peroxidază   (HRP),   detecția   propriu-­‐zisă   fiind   efectuată  

apoi  cu  DAB.  Evaluarea  simultană  a  fost  necesară  pentru  caracterizarea  populației  de  celule  CD44+/CD24+,  

si  s-­‐a  facut  prin  detecție  secvențială  cu  polimeri  direcționați  către  specia  fiecărui  anticorp  primar,  polimerii  

fiind  conjugați  fie  cu  HRP  fie  cu  fosfatază  alcalină  (AP).  Detecția  s-­‐a  efectuat  cu  DAB  pentru  HRP  si  cu  Fast  

Red  pentru  AP,  cele  două  semnale  distincte  permițînd  analiza  separată  dar  corelată  a  expresiei  celor  doi  

  11  

markeri,  aceasta  fiind  singura  combinație  larg  utilizată  și  în  scopul  identificării  semnalelor  de  colocalizare.  

În   plus,   acelasi   algoritm   de   dublă   marcare   s-­‐a   utilizat   și   pentru   CD24   si   CD105,   dat   fiind   rolul   CD24   în  

facilitarea  transcitozei  trans-­‐endoteliale  a  celulelor  tumorale.  

În   țesutul  pancreatic  normal,   CD44  are  o  expresie  predominat  membranară   în  multe  din   celulele  

epiteliale  acinare,  si  mult  mai  puțin  intensă  la  nivel  citoplasmatic.  În  marea  majoritate  a  cazurilor,  insulele  

Langerhans  sunt  negative,  insă  mici  variații  pot  apărea.  Celulele  ductale  nu  exprimă  acest  marker  (Takada  

et  al.,  1994a;  Takada  et  al.,  1994b).  

În  adenocarcinoamele  pancreatice,  expresia  CD44  crește  ca  intensitate  și  arie  de  imunomarcare  în  

masa  tumorală,  un  număr  mult  mai  mare  de  celule  fiind  marcate,  comparativ  cu  acinii  normali  (Takada  et  

al.,  1994a;  Takada  et  al.,  1994b).  

CD24  are  o  expresie  membranară   redusă   în  celulele  acinare  pancreatice  normale,  epiteliul  ductal  

fiind  constant  negativ  pentru  acest  marker,  numărul  de  celule  pozitive  fiind  în  general  sub  5%  (Zhu  et  al.,  

2012).  

În  adenocarcinomul  pancreatic,  în  schimb,  expresia  CD24  a  fost  observată  în  peste  70%  din  celulele  

tumorale,  cu  pattern  atât  membranar  cât  și  citoplasmtic.  Expresia  a  fost  crescută  în  special  în  tumorile  cu  

grading  crescut  și  stadiu  avansat,  confirmând  potențialul  agresiv  al  celulelor  CD24+  (Zhu  et  al.,  2012).  

Endoglina   a   fost   exprimată   la   nivelul   celulelor   endoteliale   ale   vaselor  mici   de   tipul   capilarelor   în  

țesuturile   tumorale   colectate   de   la   toți   pacienții,   precum   și   la   nivelul   endoteliului   vaselor   limfatice.   În  

țesutul   pancreatic   normal,   CD105   nu   a   fost   prezent   la   nivelul   endoteliilor   vaselor   de   sânge   și   limfatice.  

Pacienții  cu  stadii  avansate  ale  bolii  au  avut  o  densitate  a  vaselor  CD105+  crescută  (Yoshitomi  et  al.,  2008).  

Suntem  în  curs  de  evaluare  morfometrică  a  gradului  de  proximitate  al  celulelor  CD24+  fata  de  endoteliile  

CD105+.    

Technica  de  microdisecție  laser  

Microdisecția   laser   reprezintă   standardul   de   aur   în   prelevarea   țintită   de   țesut,   făcând   posibilă  

selectarea   câtorva   celule   de   interes   sau   chiar   a   unei   singure   celule   dintr-­‐un   compartiment   tisular  

heterogen,  cu  o  precizie  de  3-­‐5  µm  (Emmert-­‐Buck  et  al.,  1996;  Kihara  et  al.,  2005).    

Metodologia   de   lucru   a   utilizat   sistemul   achiziționat   recent   în   Centrul   de   Cercetare   din   Craiova:  

SISTEM   MICRODISECTIE   OLYMPUS   -­‐   mmi   SmartCut   Plus   montat   pe   un   microscop   inversat   Olympus  

CKX41/CKX31,  și  echipat  cu  softul  aferent  de  control  al  platanului  motorizat,  al  laserului  UV  si  al  sistemului  

de  colectare  in  tuburi  speciale  cu  adeziv.  

In  acest  sens,  secțiunile  destinate  microdisecției  laser  au  fost  colectate,  după  taierea  din  blocul  de  

parafină,   pe   lame   speciale  mmi   cu  membrane   de   plastic  montate   pe   o   rama  metalica.   Imunocolorarea  

dublă  CD44/CD24  a  decurs  la  fel  ca  și  pentru  technica  clasica  secvențială  în  lumină  transmisă,  cu  finalizarea  

marcajelor  cu  3,3-­‐diamino-­‐benzidină  (DAB)  si  Fast  Red.  Lamele  au  fost  acoperite  temporar  pentru  evaluare  

  12  

și  arhivare  cu  un  mediu  pe  bază  de  glicerol.  Imediat  inaintea  disecției  propriu-­‐zise,  lamelele  au  fost  date  jos  

de  pe  lame,  iar  sectiunile  uscate  în  aer.  La  un  obiectiv  de  20×,  cu  ajutorul   instrumentelor  de  marcare  din  

softul  mmi  SmartCut,  am  selectat  ariile  de  imunomarcaj  dublu,    alegând  în  total  40  de  astfel  de  câmpuri  de  

maximă  colocalizare  pentru  fiecare  lamă  în  parte.  Laserul  UV  a  secționat  apoi  automat  ariile  desemnate,  iar  

intreg  tesutul  selectat  a  fost  preluat  in  flacoane  speciale  de  1,5  ml  cu  pelicula  adezivă,  care  ulterior  au  fost  

înaintate  spre  arhivare  si  prelucrare  departamentului  de  Genetica  Medicală.  Materialul  astfel  obținut  va  fi  

procesat  pentru  analiză  genomică  prin  qRT-­‐PCR.  

 

 

Diseminarea  rezultatelor  cercetării  

 

o Articole  publicate  în  reviste  cotate  ISI    

o Gheonea  DI,   Streba   CT,   Ciurea   T,   Săftoiu   A.  Quantitative   low  mechanical   index   contrast-­‐enhanced  

endoscopic   ultrasound   for   the   differential   diagnosis   of   chronic   pseudotumoral   pancreatitis   and  

pancreatic  cancer.  BMC  Gastroenterol.  2013  Jan  3;13:2  

 

o Articole  publicate  în  reviste  indexate  în  BDI    

o DI  Gheonea,  CT  Streba,  T  Cârţână,  A  Săftoiu.  Pancreatic  Cancer  –  Advanced  EUS  Imaging:  Real-­‐Time  

EUS  Elastography.  Video  Journal  and  Encyclopedia  of  GI  Endoscopy.  2013;1(2):573-­‐575  

o A   Săftoiu,   DI   Gheonea,   T   Cârţână,   C   Streba.   Advanced   Endoscopic   Ultrasound   Imaging:   Contrast-­‐

Enhanced  Endoscopic  Ultrasound  (Low  MI,  High  MI),  Including  3D  Techniques  in  Pancreatic  Imaging.  

Video  Journal  and  Encyclopedia  of  GI  Endoscopy.2013;1(2):534-­‐536  

o MI   Costache,   A   Săftoiu,   DI   Gheonea.   Detection   and   Characterization   of   Solid   Pancreatic   Lesions  

(Contrast-­‐Enhancement,   Elastography,   EUS-­‐Guided   Fine   Needle   Aspiration).   Video   Journal   and  

Encyclopedia  of  GI  Endoscopy.  2013;1(2):Pages  545-­‐547  

o Angelescu  R,  Burada  F,  Angelescu  C,  Gheonea  DI,  Iordache  S,  Mixich  F,  Ioana  M,  Săftoiu  A.  Expression  

of  Vascular  Endothelial  Growth  Factor  and  Epidermal  Growth  Factor  Receptor   in  Pancreatic  Ductal  

Adenocarcinomas,  Neuroendocrine  Tumours  and  Chronic  Pancreatitis.  Endoscopic  Ultrasound  2013;  

2(2):  86-­‐91  

o Sevastita   Iordache,  Radu  Angelescu,  Maria  Monalisa  Filip,  Madalin   Ionut  Costache,  Carmen  Florina  

Popescu,   Dan-­‐Ionut   Gheonea,   Adrian   Saftoiu.   Power   doppler   endoscopic   ultrasound   for   the  

assessment  of  pancreatic  neuroendocrine  tumors.  Endoscopic  Ultrasound  2013;  2(2):  150-­‐155  

 

  13  

 

o Lucrări  prezentate  la  congrese  internaţionale  (cu  rezumat  indexat  în  reviste  cotate  ISI)    

o Dan   Ionut   Gheonea,   Costin   T.   Streba,   Ana  Maria   Ioncica,   Tudorel   Ciurea,   Adrian   Saftoiu.  

Diagnosis   of   Focal   Pancreatic   Masses   by   Quantitative   Low   Mechanical   Index   Contrast-­‐

Enhanced   Endoscopic   Ultrasound   (EUS).  Digestive   Disease  Week,   San  Diego,   USA,  AB204  

GASTROINTESTINAL  ENDOSCOPY  Volume  75,  No.  4S  :  2012  

o Adrian   Saftoiu,   Romania;   Julio   Iglesias-­‐García;   Peter   Vilmann;   Cristoph   Dietrich;   Michael  

Hocke;   Costin   Teodor   Streba;   Dan-­‐Ionut   Gheonea;   Florin   Gorunescu;   Tudorel   Ciurea.  

Artificial  neural  networks  analysis  of  contrast  enhanced  harmonic  endoscopic  ultrasound  in  

differential   diagnosis   of   focal   pancreatic   masses.   preliminary   results   of   an   european  

multicenter   study.   19th   United   European   Gastroenterology   Week,   Amsterdam,   The  

Netherlands,  ENDOSCOPY,  Volume  44,  No  1  

o DI   Gheonea,   CT   Streba,   S   Iordache,   L.   Streba,   T   Ciurea,   A   Saftoiu.   Diagnostic   value   of  

combined  quantitative  contrast-­‐enhanced  harmonic  endoscopic  ultrasound  and  endoscopic  

ultrasound  elastography  in  pancreatic  focal  masses.  19th  United  European  Gastroenterology  

Week,  Amsterdam,  The  Netherlands,  ENDOSCOPY,  Volume  44,  No  1  

 

o Premii  

o National   Scholar  Award  2012,  19th  United   European  Gastroenterology  Week,  Amsterdam,  

The   Netherlands   pentru   lucrarea   Diagnostic   value   of   combined   quantitative   contrast-­‐

enhanced   harmonic   endoscopic   ultrasound   and   endoscopic   ultrasound   elastography   in  

pancreatic  focal  masses.  

 

 

 

Director  proiect,  

Prof.  Univ.  Dr.  Adrian  Săftoiu