1 LUCRARE DE SINTEZĂ Etapa II / 2008 Director de proiect: Drd. Dan Ionuţ GHEONEA Instituţia: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova Titlul proiectului: Markeri prognostici pentru evaluarea supravietuirii pacientilor cu cancer de pancreas Cod CNCSIS: 10 Nr proiect: 195/2007 Introducere Cancerul pancreatic reprezintă o cauză importantă de morbiditate şi mortalitate, reprezentând a patra cauză principală de decese prin cancer. De altfel, incidenţa este in creştere şi prognosticul este sever. Date statistice recente susţin ipoteza care arată o supravieţuire generală (la 5 ani) de aproximativ 0,2%. Intervenţia chirurgicală reprezintă singurul tratament eficient, totuşi doar 10-20% din pacienţi au un diagnostic precoce şi şansa unei rezecţii potenţial curative. Rata de supravieţuire la cinci ani la acest grup de pacienţi este de numai 25%. Pornind de la aceste aspecte importante, există un interes deosebit pentru dezvoltarea unor tehnici noi pentru diagnosticul precoce ca şi pentru o înţelegere mai bună a factorilor predictivi de pronostic în cancerul pancreatic. Un articol recent publicat de Asociaţia Americană de Gastroenterologie (AGA), a analizat în amănunt acurateţea comparativă a diferitelor metode imagistice folosite pentru diagnosticul şi stadializarea adenocarcinomului pancreatic ductal. Acest studiu nu recomandă ecografia transabdominală (larg folosită în România), datorită acurateţei sale scăzute. În ciuda progreselor tehnice evidente din ultimii ani încorporate în sistemele ultrasonografice (power Doppler, armonici tisulare, inversie de puls, etc.), există puţini entuziaşti ai folosirii ecografiei transabdominale pentru diagnosticul şi stadializarea cancerului de pancreas. Tomografia computerizată (TC) spirală a fost considerată în mod curent procedura iniţială folosită pentru diagnosticul şi stadializarea cancerului pancreatic. Aşadar sensibilitatea TC spirale este de aproximativ 85-95% comparativ cu ecoendoscopia (EUS). Sensibilitatea EUS în diagnosticul cancerului pancreatic este mai mare de 95%, incluzând tumorile mai mici de 2 cm (cancer pancreatic precoce). TC spirală oferă valori similare cu EUS în ceea ce priveşte rezecabilitatea cu o acurateţe de aproximativ 95%. În ceea ce priveşte extensia locoregională, EUS are o acurateţe de 85% pentru stadializarea tumorală, 70% pentru cea ganglionară, fiind superioară altor tehnici imagistice
Transcript
1
LLUUCCRRAARREE DDEE SSIINNTTEEZZĂĂ
EEttaappaa IIII // 22000088
Director de proiect: Drd. Dan Ionuţ GHEONEA Instituţia: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova Titlul proiectului: Markeri prognostici pentru evaluarea supravietuirii
pacientilor cu cancer de pancreas Cod CNCSIS: 10 Nr proiect: 195/2007
IInnttrroodduucceerree Cancerul pancreatic reprezintă o cauză importantă de morbiditate şi mortalitate, reprezentând a patra cauză principală de decese prin cancer. De altfel, incidenţa este in creştere şi prognosticul este sever. Date statistice recente susţin ipoteza care arată o supravieţuire generală (la 5 ani) de aproximativ 0,2%. Intervenţia chirurgicală reprezintă singurul tratament eficient, totuşi doar 10-20% din pacienţi au un diagnostic precoce şi şansa unei rezecţii potenţial curative. Rata de supravieţuire la cinci ani la acest grup de pacienţi este de numai 25%. Pornind de la aceste aspecte importante, există un interes deosebit pentru dezvoltarea unor tehnici noi pentru diagnosticul precoce ca şi pentru o înţelegere mai bună a factorilor predictivi de pronostic în cancerul pancreatic. Un articol recent publicat de Asociaţia Americană de Gastroenterologie (AGA), a analizat în amănunt acurateţea comparativă a diferitelor metode imagistice folosite pentru diagnosticul şi stadializarea adenocarcinomului pancreatic ductal. Acest studiu nu recomandă ecografia transabdominală (larg folosită în România), datorită acurateţei sale scăzute. În ciuda progreselor tehnice evidente din ultimii ani încorporate în sistemele ultrasonografice (power Doppler, armonici tisulare, inversie de puls, etc.), există puţini entuziaşti ai folosirii ecografiei transabdominale pentru diagnosticul şi stadializarea cancerului de pancreas. Tomografia computerizată (TC) spirală a fost considerată în mod curent procedura iniţială folosită pentru diagnosticul şi stadializarea cancerului pancreatic. Aşadar sensibilitatea TC spirale este de aproximativ 85-95% comparativ cu ecoendoscopia (EUS). Sensibilitatea EUS în diagnosticul cancerului pancreatic este mai mare de 95%, incluzând tumorile mai mici de 2 cm (cancer pancreatic precoce). TC spirală oferă valori similare cu EUS în ceea ce priveşte rezecabilitatea cu o acurateţe de aproximativ 95%. În ceea ce priveşte extensia locoregională, EUS are o acurateţe de 85% pentru stadializarea tumorală, 70% pentru cea ganglionară, fiind superioară altor tehnici imagistice
2
standard. Prin urmare, puncţia fină aspirativă ghidată ecoendoscopic (PFA-EUS) este considerată actual procedura de elecţie pentru diagnostic (incluzând confirmarea tisulară prin aspiraţie fină pe ac), ca şi pentru stadializarea pacienţilor cu cancer pancreatic, fiind folosită în cele mai multe centre din străinătate. Câteva metode recente au îmbunătăţit semnificativ aplicarea EUS şi au deschis porţile pentru diagnosticul imagistic non-invaziv (elastografie şi reconstrucţie 3D), ca şi pentru analiza markerilor moleculari în specimenele tisulare obţinute prin PFA-EUS. EEvvaalluuaarreeaa iimmaaggiissttiiccaa ccoommpplleexxaa aa ppaacciieennttiilloorr Am inclus în studiu pacienţii cu cancer pancreatic din Clinica de Gastroenterologie, UMF Craiova, evaluaţi prin ecografie transabdominală, tomografie computerizată (CT), ecoendoscopie cu puncţie fină aspirativă ghidată ecoendoscopic. Toţi pacienţii incluşi în studiu au ridicat suspiciunea de cancer pancreatic prin cel puţin una din următoarele: evidenţierea clinică a colestazei cu semne de impregnare neoplazică (scădere în greutate, astenie fizică), rezultate anormale ale testelor biologice (bilirubină, fosfatază alcalină, gamma glutamil transpeptidază, amilaze serice şi urinare) sau valori crescute ale markerilor tumorali pancreatici (CEA, CA 19.9). La toţi pacienţii a fost efectuată ecografie trans-abdominală, CT, ecoendoscopie şi puncţie fină aspirativă într-un interval de maximum 7 zile. Ecografia transabdominală a fost efectuată a jéun, folosind un sistem de ecografie Aloka SSD 5000, cu transductor convex cu frecvenţă de 5 MHz. Ecoendoscopia a fost efectuată a jéun, folosind un sistem de ecoendoscopie liniară cu sondă ecoendoscopică cu frecvenţă variabilă (5-10 MHz) Olimpus UCT, cuplat la acelaşi ecograf Aloka SSD 5000. Examinările au fost efectuate de examinatori care nu cunoşteau rezultatele examinărilor ecografice transabdominale. La toţi pacienţii s-a folosit în timpul examinării ecoendoscopice sedare conştientă cu midazolam (Dormicum) intravenos, iar la un procent mic cu propofol intravenos.
3
Pentru limitarea motilităţii duodenale au fost folosite antispastice de tipul butilscopolaminei (Buscopan). Un plan de scanare al tumorii pancreatice ideal a fost ales şi au fost făcute eforturi pentru vizualizarea întregii arii în vederea identificării sau absenţei semnalelor vasculare.
Puncţia fină aspirativă ghidată ecoendoscopic s-a practicat în conformitate cu un protocol comun care a inclus minimum 3 pasaje cu cel puţin 10 mişcări de “du-te-vino” pe fiecare pasaj cu aspiraţie simultană. Acul (Olympus NA-10J-1) a fost direct vizualizat în timp real în timpul procedurii pentru certitudinea plasării corecte în
interiorul masei tumorale pancreatice sugestive. Puncţia fină aspirativă ghidată ecoendoscopic s-a practicat în diferite puncte ale leziunii, în centru şi la periferie, prin ajustări subtile ale acului şi endoscopului pentru a mări probabilitatea obţinerii de material diagnostic. Dacă au fost vizualizate mai multe leziuni la acelaşi pacient, puncţia s-a practicat succesiv
(metastazele la distanţă, ascită, ganglionii limfatici locali şi, la final tumora primară) pentru a preveni suprastadializarea bolii. Un citolog a fost în permanenţă prezent pe durata procedurii pregătind lamele, verificând calitatea materialului biologic extras şi, totodată, avertizând asupra necesităţii pasajelor suplimentare. Materialul aspirat obţinut prin puncţie fină aspirativă a fost dispersat pe lame de sticlă, iar frotiul într-un singur strat obţinut a fost colorat atât Giemsa cât şi Papanicolau. Coloraţia Papanicolau s-a făcut după fixare umedă în etanol pentru cel puţin 5 minute în timp ce coloraţia Giemsa s-a practicat după fixare umedă şi postfixare cu metanol. Frotiurile au fost fiecare caracterizate din punct de vedere al celularităţii, nucleilor, nucleolilor şi cromatinei şi au fost interpretate ca benign, atipic - probabil benign, atipic - probabil malign, sugestiv pentru malignitate şi malign. Tomografia computerizată s-a efectuat în cadrul Departamentului de Imagistică medicală din cadrul Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova folodindu-se substanţe de contrast adecvate petru vizualizarea tumorilor pancreatice.
4
EEvvaalluuaarreeaa iimmuunnoocciittoocchhiimmiiccăă Urmatorii parametrii citopatologici au fost identificati pentru fiecare pacient: celularitatea frotiurilor, prezenta, dispozitia, forma si numarul celulelor maligne, prezenta altor cellule benigne (celule inflamatorii pancreatice, alte celule inflamatorii, hematii). In plus, au fost cuantificate urmatoarele modificari sugestive pentru malignitate: atipii maligne (absente 0, rare 1, moderate 2, frecvente 3), hipertrofie nucleara (absenta 0, 2-3x 1, 3-5x 2, >5x 2), pleiomorfism nuclear (absent 0, usor 1, moderat 2, sever 3), raport N/C (normal 0, crescut 1), condensare cromatiniana (absent 0, mica 1, moderat 2, grunji 3). In cazurile cu frotiuri suspecte de malignitate sau cert maligne, au fost obtinute blocuri celulare (prin centrifugare dubla in etanol 100%, urmata de fixare in formol si procesare prin metoda clasica de inglobare in parafina), fiind apoi efectuate coloratii imunohistochimice pentru identificarea fenotipului epitelial al celuleor maligne prin efectuarea urmatorilor anticorpi: citokeratine anti-AE1/AE3, anti-CA19-9, citokeratine anti-CK 20, respectiv pentru markerii de proliferare (Ki67 si PCNA), sau pentru identificarea unei metastaze pancreatice de melanom ocular (HMB-45 si S100). Rezultatele acestui studiu preliminar au confirmat diagnosticul de benignitate la 13 pacienti, la 9 fiind prezent un infiltrat inflamator ca argument suplimentar al diagnosticului de pancreatita cronica pseudotumorale sugerat de examinarea ecoendoscopica. AL alte 4 cazuri au fost prezente celule spumoase si focare de celule canaliculare benigne, astfel incit diagnosticul final a fost tot de pancreatita cronica. La 5 pacienti aspectul citologic a sugerat suspiciunea de malignitate, fiind efectuate coloratii suplimentare pentru Ki67. Astfel indicele de legare al Ki67 a fost sub 5% in 3 cazuri, aceste cazuri fiind considerate benigne, cu moficari celulare reactive. La ceilalţi 2 pacienţi, indexul de legare al Ki67 avea valori foarte crescute, permiţând stabilirea diagnosticului de malignitate.
Fig. 1 EUS-FNA – bloc celular: imunomarcaj citoplasmatic pozitiv pentru HMB45 în frecvente celule tumorale, tehnica LSAB, 400x.
Fig. 2 EUS-FNA – bloc celular: frecvente celule atipice cu imunomarcaj citoplasmatic şi pe alocuri nuclear intens pozitiv pentru S100, tehnica LSAB, 400x.
5
La 20 de pacienţi erau prezente criterii de malignitate evidente (frotiuri pozitive). La aceşti pacienţi au fost efectuate blocuri celulare, fiind observate coloraţii positive pentru citokinele AE1-AE3, respectiv Ca19-9, confirmând diagnosticul de adenocarcinom pancreatic, în timp ce 1 pacient avea coloraţii negative pentru aceşti markeri, dar imunomarcaj pozitiv pentru HMB45 (Fig. 1) şi S100 (Fig. 2), permiţând stabilirea unui diagnostic pozitiv de metastază pancreatică de la un melanom malign ocular. Aceste date preliminare au sugerat că diagnosticul citopatologic (pe frotiuri şi blocuri celulare) efectuat pe baza materialului obţinut prin puncţie fină aspirativă ghidată ecoendoscopic permite stabilirea diagnosticului de malignitate în cazul tumorilor pancreatice. Pentru aprecierea supravieţuirii pacienţilor cu cancer de pancreas a fost iniţiat un studiu care a luat în consideraţie atât caracterele apreciate prin EUS cât şi cele citologice. Astfel, rotiurile obţinute au fost fiecare caracterizate din punct de vedere al celularităţii, nucleilor, nucleolilor, cromatinei şi au fost interpretate ca benign sau malign (Tabel 1). Tabel 1
Semne de pancreatită cronică Condensarea cromatinei
Toate caracteristicile tumorale apreciate prin EUS cât şi cele identificate pe frotiu au fost codificate astfel încât să poată fi prelucrate statistic prin analiza multivariată utilizând modelul Cox. Timpul de supravieţuire a fost definit ca fiind perioada de timp scursă între momentul diagnosticului şi momentul înregistrării decesului. Timpul mediu de supravieţuire a fost de 281 de zile cu valorile extreme de 21 şi 945 de zile. Modelul Cox (metoda Backward Stepwise - Conditional LR) a identificat 3 variabile corelate negativ cu supravieţuirea: stadiul N (p=0,029), prezenţa pleiomorfismului nuclear (p=0,037) şi hipertrofia nucleară (p=0,019). Modelul Cox creat a prezentat semnificaţie statistică (p=0,032).
6
EEvvaalluuaarreeaa ggeenniiccăă Protooncogenele celulare, genele supresoare de tumori (antioncogene), precum si genele implicate în repararea erorilor de replicare reprezintă, în general, biomarkeri genetici cheie ce suferă alterări în carcinogeneză. Activarea oncogenelor, inactivarea antioncogene si perturbarea genelor implicate în corectarea erorilor apărute în secventa ADN sunt evenimentele genetice esentiale în aparitia cancerului. În cancerul pancreatic incidenta crescută a mutatiilor punctiforme în gena K-Ras la nivelul codonului 12 este asociată cu transformările premaligne si maligne. De asemenea, în adenocarcinomul pancreatic sunt detectate mutatii si în gena supresoare de tumori p53. Pierderea simultană a functiilor celor 2 gene poate contribui la evolutia dramatică a acestui tip de cancer. Instabilitatea microsatelitilor precum si alterarea mecanismelor de reparare a erorilor ADN pot reprezenta un nou fenotip care să crească rata mutatiilor spontane în timpul carcinogenezei pancreatice. Mutatiile apărute la nivelul genelor implicate în reglarea ciclului celular, un exemplu fiind inhibitorul CDK4 (cell division protein kinase) sau p16 (CDKN2A), se constituie într-un nou eveniment în carcinogeneza pancreatică. O altă modificare moleculară implicată în această patologie este consecinta mutatiilor apărute în genele kinazelor dependente de ciclină. Marea majoritate a acestor biomarkeri din sfera geneticii moleculare asociati atât reglării ciclului celular si recunoasterii cât si activării genice oferă noi perspective asupra precursorilor celulari si geneticii cancerului pancreatic. Dintre posibilitătile de abordare genetică a patologiei pancreatice în acest stadiu al proiectului am optat atât pentru detectarea mutatiilor apărute la nivelul genelor p53 si K-Ras cât si pentru evaluarea gradului de activare a genelor implicate în repararea erorilor de replicare. Pentru că aceste optiuni au se constituie atât într-o evaluare calitativă (de secventă ADN) cât si cantitativă (ARNm) au fost recoltate prin puncţie fină-aspirativă sub control eco-endoscopic câte 2 probe pentru fiecare subiect inclus în studiu. Specimenele recoltate au fost transferate în tuburi de microcentrifugă de 1,5ml pre-umplute cu solutie de stabilizare a ARN-ului (RNA later - Ambion). Ca o măsură suplimentară de sigurantă tuburile au fost ţinute în gheaţă pentru a reduce gradul de deteriorare a specimenului. Conservarea probelor s-a realizat prin ultracongelare la -80°C. Pentru extractia si purificarea ADN-ARN am folosit kit-urile: ADN: Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), ARN: ArrayGrade Total RNA isolation kit (Superarray). Kit-ul ArrayGrade Total RNA isolation este optimizat pentru evaluarea expresiei genice fiind destinat extractiei ARN-ului total din cantităti mici de probă biologică. Solutia de liză ce contine agenti chaotropici stabilizează si previn degradarea ARN-ului favorizând atasarea optimă la membrana silica-gel. Solutia de spălare înlătură sărurile, metabolitii si componentele macromoleculare celulare. Eluatorul, în conditii de tarie ionică scăzută, desprinde ARN-ul purificat de pe coloanele cu membrane silica-gel. Evaluarea concentratiei si puritătii acizilor nucleici s-a efectuat folosind spectrofotometrul Eppendorf Biophotometer cuplat cu unitatea
7
optică Hellma TrayCell fiind astfel posibilă măsurarea în volume de 0,7 până la 5 µl. Toate probele folosite în etapele ulterioare au avut raportul absorbantelor 260/280 si 260/230 peste 1,7. Cunoscută fiind importanta prevenirii degradării ARN-ului mesager în cazul evaluării expresiei genice, ARN-ul total a fost supus electroforezei în gel denaturant de agaroză 2% ce contine etidium bromid (0.5 µg/ml). ARN-ul total asupra căruia au fost continuate investigatiile a fost nefragmentat (benzile ARNr 28S şi 18S bine definite şi cu raportul intensităţilor de aproximativ 2:1). Evaluarea mutatiilor la nivelul oncogenelor K-Ras si P53 a implicat amplificarea locilor de interes prin reacţii de polimerizare în lanţ folosind primeri specifici cu secvente poli-GC aditionale urmate de migrarea produsilor de amplificare într-un gel cu gradient denaturant. Electroforeza în Gradient de Gel Denaturant (DGGE) este o metodă de screening utilizată pentru detecţia mutaţiilor punctiforme. Tehnica se bazează pe diferenţele de mobilitate electroforetică între secvenţele de acizi nucleici normale şi mutante. ADN-ul dublu-catenar este supus unei electroforeze într-un gel cu un gradient în creştere de agent denaturant (uree şi/sau formamidă). Pe măsura creşterii concentraţiei se produce o disociere a domeniilor ADN în funcţie de Temperatura de Topire Tm (Melting Temperature). Disocierea determină diminuarea mobilităţii, evidenţiindu-se diferenţe în vitezele de migrare dintre două heteroduplexuri ce diferă printr-o singură bp. Împerecherile greşite de baze conduc la destabilizarea domeniilor prin modificările dramatice ale Tm între tipurile normale şi cele mutante. Pentru a creşte numărul domeniilor ce urmează a fi analizate se adaugă, în timpul PCR, secvenţe bogate în GC (GC clamp). Detectarea fragmentelor electroforetice se face în UV folosind etidium bromid. Nivelul de activitate al genelor implicate în corectarea erorilor de replicare este evaluat folosind tehnologia qRT-Real Time PCR (Quantitative real-time RT-PCR) o metoda de ultimă generatie în domeniul cercetării biomedicale. Avantajele acestei tehnici sunt numeroase, incluzând abilitatea de a cuantifica cu o înaltă acuratete ARNm specific în pofida volumelor mici ale probelor biologice sau numărului mic de molecule/probă. Genele tintă sunt analizate rapid si precis prin corelarea cu un paramentru independent stabil, neinfluentat de factori precum hormoni, statusul ciclului celular, etc. Această tehnică poartă numele de normalizare, în cadrul protocolului nostru gena aleasă fiind GAPDH. Laboratorul nostru dispune de o platformă RotorGene 6200 (Corbett) cu două canale de detectie. Pentru detectarea expresiei genice este folosit kit-ul The TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Rezultatele obţinute până în acest moment au permis selectarea lucrării intitulată Expression profile of genes coding for DNA repair in human pancreatic cancer pentru a fi prezentată la Digestive Disease Week, May 2008, San Diego Studiul s-a realizat pe 26 de probe de punctie fina aspirativa ecoghidata pancreatica. Genele analizate au fost: ABL1, ANKRD17, EXO1, MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH4, MSH5, MSH6:
8
9
Diseminarea rezultatelor obţinute prin finanţarea acestui proiect de cercetare
împreună cu alte proiecte la care directorul de proiect este participant (CEEX 2006, PNCD II) a permis diseminarea rezultatelor în anul 2008 astfel:
• Lucrari in extenso in reviste indexate ISI: 1
• Saftoiu A, Vilmann P, Gorunescu F, Gheonea DI, Gorunescu M, Ciurea T, Popescu GL,
Iordache A, Hassan H, Iordache S Neural network analysis of dynamic sequences of
EUS elastography used for the differential diagnosis of chronic pancreatitis and
