1 | 20

Proiecte colaborative de cercetare aplicativa – PCCA 2013

Program: PARTENERIATE ÎN DOMENII PRIORITARE

Cod PN-II-PT-PCCA-2013-4-2154

Contract nr. 207/2014

Titlu proiect:“Dezvoltarea unui protocol de selecţie pentru chirurgia metabolică în

urma evaluarii impactului acesteia asupra remisiei diabetului zaharat de tip 2 la

pacienţii cu obezitate” (CREDOR - Collaborative Romanian Efforts for Diabetes and

Obesity Retrench)

Contractor: DELTA HEALTH CARE S.R.L.

Coordonator proiect: Dr. Catalin Copaescu

ETAPA DE RAPORTARE: Etapa I aferenta perioadei 01.07.2014 – 31.12.2014

Denumirea etapei I: „Elaborarea studiului randomizat pentru evaluarea eficacitatii

chirurgiei metabolice („laparoscopic sleeve gastrectomy”-LSG) in remisia

diabetului la pacienti cu obezitate si diabet zaharat tip 2 si a metodologiei de

lucru pentru studiile in vitro”

REZUMATUL ETAPEI

In etapa I a fost constituit lotul de pacienti cu obezitate si diabet de tip 2 (DZ2) din

studiul clinic si de cercetare CREDOR. Selectia a fost realizată pe baza criteriilor de

includere si excludere stabilite in cursul intalnirilor la care au luat parte membrii

echipelor celor 4 institutii partenere in proiect. Din numarul initial de 144 de persoane

inscrise in studiu, au fost selectati 50 de pacienti care urmeaza sa fie repartizati

computerizat in cele doua grupe ale studiului CREDOR: cu tratament de chirurgie

metabolica si tratament conventional al DZ2. Pacienţii candidati pentru participarea în

studiul CREDOR au primit informaţii cu privire la scopul şi utilitatea studiului, în ce mod

vor fi implicati în studiu, beneficiile si riscurile potenţiale ale intervenţiei de chirurgie

2 | 20

metabolica, sau ale tratamentului conventional. Sunt considerati ca participanti la studiu

si participa la etapa de randomizare numai pacientii care revin la echipa medicală a

proiectului cu consimtamantul informat semnat. Modalitatea de randomizare a

pacientilor inclusi in studiu are la baza un pseudo-generator creat pe

platforma Microsoft Visual Studio (2013). Procedurile de lucru cu subiectii umani sau cu

probe biologice provenite de la acestia au primit avizul favorabil al Comisiilor de etica

ale fiecarei institutii partenere. Date despre studiul CREDOR pot fi accesate pe site-ul

proiectului (www.credor.ro).

Pentru realizarea obiectivului de cercetare al proiectului CREDOR au fost

intocmite si optimizate protocoalele de lucru pentru experimentele pe culturi primare de

celule izolate din tesut adipos de la pacienti obezi cu DZ2 si pe celule β-pancreatice din

liniile PANC1 (1.1B4) si INS1-E.

Obiectivele studiului CREDOR (clinic si de cercetare) au fost diseminate in

cadrul Simpozionului de Chirurgie Bariatrica si Metabolica cu tema "Progres

Continuu in Chirurgia Metabolica" (Bucuresti, 6 decembrie 2014).

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC IN EXTENSO

ETAPA DE RAPORTARE: Etapa I aferenta perioadei 01.07.2014 – 31.12.2014

Denumirea etapei I: „Elaborarea studiului randomizat pentru evaluarea eficacitatii

chirurgiei metabolice („laparoscopic sleeve gastrectomy”-LSG) in remisia

diabetului la pacienti cu obezitate si diabet zaharat tip 2 si a metodologiei de

lucru pentru studiile in vitro”

Premiza: Tratamentul obezitătii prin chirurgie metabolică la persoanele cu obezitate si

diabet zaharat de tip 2 (DZ2) este urmat, in multe cazuri, de ameliorarea sau

remisiaDZ2, respectiv după intervenția de chirurgie bariatrică/metabolică un procent

important de pacienți cu obezitate și DZ2 prezintă, chiar înainte ca acestia să scadă în

greutate substanțial şi permanent, îmbunătăţirea semnificativă a glicemiei, scăderea

necesarului de medicamente şi ameliorarea factorilor de risc cardio-metabolic. Pe de

altă parte, tratamentul medicamentos pentru DZ2 reuşeşte să compenseze doar

temporar evoluţia acestei boli către complicaţii cardiovasculare. Astfel chirurgia

metabolica devine o alternativa eficienta de terapie a DZ2.

3 | 20

Scopul proiectului CREDOR îl reprezintă elaborarea unui protocol de selecție a

pacienților cu obezitate și DZ2, care au șanse de remisie a diabetului în urma efectuării

chirurgiei metabolice.

În vederea realizării scopului proiectului au fost incluși în studiu 53 de bărbaţi cu

obezitate și diabet de tip 2, pe baza unor criterii stabilite astfel încât rezultatele studiului

să fie semnificative. Selecţia a fost realizată de două echipe de medici de la Institutul

Național de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice „Prof. Dr. N.C. Paulescu” și de la Centrul

de Excelență în Chirurgia Bariatrică și Metabolică PONDERAS. Persoanele înrolate în

studiul clinic sunt supuse, pe parcursul studiului, unor analize complexe care să reflecte

statusul lor metabolic real. Acesti subiecti vor fi repartizati in mod aleator în doua

grupuri: pacienti care urmeaza sa fie tratati prin chirurgie metabolica si pacienti care vor

primi tratament conventional pentru DZ2 (etapa II). Pacientii din cele doua grupe vor fi

urmariti din punct de vedere medical pe parcursul unui an pentru a observa efectul celor

doua tipuri de abordari medicale asupra scaderii masei de tesut adipos si a modificarii

principalilor parametri ai metabolismului glucidic, lipidic si proteic. Cercetarea

mecanismelor celulare si moleculare posibil implicate in remisia DZ2 dupa interventia

de chirurgie metabolică va contribui la identificarea unor biomarkeri pe baza cărora se

va intocmi un protocol de selectie a pacientilor cu DZ2 si obezitate care au sanse reale

de remisie a diabetului după corectarea obezitatii prin chirurgie metabolică.

Rezultate asteptate:

1. Designul studiului clinic randomizat

2. Metodologiile de lucru pentru studiile in vitro pe tipuri de culturi de celule

relevante pentru studiu

3. Avizul comisiilor de etica ale partenerilor din proiectul CREDOR

4. Pagina web a proiectului CREDOR

Obiectivele si activitatile etapei I au fost îndeplinite în totalitate fără abateri de la

activitatile prevazute in planul de realizare.

In etapa I a fost constituit grupul de persoane cu obezitate si diabet de tip 2 care

participă in studiul clinic. Selectia a fost realizată pe baza criteriilor de includere si

excludere stabilite in cursul intalnirilor lunare la care au luat parte membrii echipelor

celor 4 institutii partenere in proiect.

4 | 20

Pacienţii participanţi în studiul CREDOR au primit informaţii cu privire la scopul şi

utilitatea studiului, în ce mod vor fi implicate în studiu, beneficiile si riscurile potenţiale

ale intervenţiei de chirurgie metabolica, sau ale tratamentului conventional. În cursul

lunii decembrie toti pacienţii care au decis sa participe în studiu vor semna formularul

de consimtamant informat.

Coordonatorul si institutiile partenere în proiect au obtinut avizele favorabile ale

Comisiilor de etica locale pentru procedurile de lucru cu subiectii umani, sau cu

materialul biologic uman (in studiile de cercetare pe culturi celulare) pe care urmeaza sa

le realizeze.

A fost creat site-ul proiectului CREDOR (www.credor.ro) unde pot fi accesate

informatii despre acest studiu. Pe pagina de internet vor fi prezentate informatii

actualizate despre rezultatele obtinute in proiect, parametrii clinici si biochimici masurati,

fara insa a furniza informații prin care pacientii ar putea fi identificati, în mod direct sau

indirect. Astfel toate datele personale vor avea caracter strict confidenţial pe tot

parcursul studiului şi după încheierea acestuia, în conformitate cu legile şi

reglementările in vigoare privind protecţia datelor personale. În cazul în care va fi

solicitat un control privind calitatea sau corectitudinea efectuării studiului CREDOR,

reprezentanţii Comisiilor de Etică ale instituţiilor partenere, sau a autorităţii care

finanțează studiul vor putea consulta informaţiile medicale rezultate din participarea

pacienţilor la studiu, fără a le extrage din fişele lor medicale, sau fără a le copia.

Activitatea 1.1: Stabilirea criteriilor de includere a pacientilor in studiu

Au fost organizate intalniri lunare la sediul CO, cu reprezentanti ai tuturor partenerilor

P1, P2, P3. In cursul acestor intilniri au fost discutate si stabilite activitatile si sarcinile

corespunzatoare perioadei urmatoare, cu termene limita pentru indeplinirea acestora.

CO si P1: Pentru indeplinirea activitatii 1.1 prevazuta in planul de realizare al

proiectului, coordonatorul impreuna cu partenerul P1 si in acord cu P2 si P3 au stabilit

urmatoarele criterii de includere/excludere a pacientilor in studiu:

Criterii de includere:

1. Sex: masculin

2. Vârsta: 30-65 ani

3. Tip Diabet: 2

4. IMC: 30-50kg/m2

5. Durata diabet zaharat: 1 -15 ani

6. Asigurare medicală CNAS sau OPSNAJ

7. Posibilitatea acoperirii costurilor medicaţiei post-operatorii

5 | 20

Criterii de excludere:

1. Diabet tip 1

2. Peptid C < 0.81 ng/ml (VN = 0.81-3.85 ng/ml)

3. HbA1c < 6.5%

4. Creatinina serica >1.2mg/dL sau GFR < 60 ml/min/1/73 m2

5. Anemie cu Hb < 10 g/dl

6. Teste pozitive pentru hepatita B, C, HIV

7. Insuficienţă cardiacă clasa NYHA III-IV, sau insuficiență respiratorie

8. IMA sau AVC in antecedentele recente (ultimele 12 luni)

9. Revascularizare coronariană/carotidiană/mb inf în ultimele 6-12 luni

10. Ciroză hepatică, Insuficiență hepatica

11. Patologie cronică a tubului digestiv sau a glandelor anexe

12. Intervenţii chirurgicale majore în sfera digestivă (rezecţii gastrice / intestinale /

pancreatită acuta)

13. Patologie tiroidiană decompensată

14. Patologie oncologică – exceptând epitelioame bazocelulare tratate

15. Patologie psihiatrică

16. Tratament cu imunosupresoare, corticosteroizi, anticoagulant

Proiectul a fost mediatizat prin organizarea de catre CO a unei conferinţe de presa, in

data de 25 septembrie, cu participarea mass-mediei si a reprezentantilor P1, P2, P3. Ca

urmare, persoanele interesate sa se inroleze intr-un astfel de studiu clinic si care

corespundeau criteriilor de includere / excludere mentionate au reusit sa se inscrie ca

participanti in proiect.

De asemenea, proiectul si obiectivele acestuia au fost diseminate in cadrul unui

Simpozion de Chirurgie Bariatrica si Metabolica cu tema "Progres Continuu in

Chirurgia Metabolica" organizat in data de 6 decembrie de catre ARCE (Asociatia

Romana de Chirurgie Endoscopica), Asociatia de Chirurgie Bariatrica si pentru

Tratamentul Complex al Obezitatii, Spitalul Ponderas si Fundatia de Chirurgie

Laparoscopica si Toracoscopica, evenimentul fiind aprobat de IFSO (International

Federation for the Surgery of Obesity). Prezentarea proiectului, sustinuta de dr. Bogdan

Smeu, poarta titlul: “CREDOR” - A RTC for the Efficiency of Metabolic Surgery versus

Conservative Treatment in Patients with Poor Control of T2DM”, autori Bogdan Smeu,

6 | 20

Constantin Ionescu Tîrgoviște, Cristian Gruja, Daniela Lixandru, Gabriela Tanko,

Cătălin Copăescu.

Activitatea 1.2: Stabilirea indicatorilor (clinici,biochimici si hormonali) relevanti

pentru urmarirea periodica(„follow-up”) a pacientilor cu tratament conventional

P1: În cadrul activitatii 1.2 partenerul P1 a chemat pacienții eligibili pentru o vizita

preliminară de evaluare clinica. Initial au fost inclusi un numar de 144 pacienti. Dintre

acestia, 60 pacienți care au intrunit cele mai multe dintre criteriile de includere si nu

aveau criterii de excludere (cu exceptia probelor de laborator ce urmau a fi evaluate) au

fost chemati la vizita preliminară de screening pentru evaluarea clinica si recoltarea

unor probe biologice in cazul celor care nu aveau efectuate analizele obligatorii de

screening la medicul de familie. Pentru fiecare pacient echipa medicala a P1:

1) a realizat fisa medicală in care au fost inregistrate: data naşterii, vechimea diabetului

zaharat şi a obezităţii, deprinderile alimentare, antecedentele medicale, medicaţia

primită uzual, reacţiile alergice, istoricul familial, fumatul, activitatea fizică zilnică;

2) a determinat: înălţimea, greutatea, frecvenţa cardiacă şi tensiunea arteriala;

3) a adresat o scrisoare de recomandare medicului de familie/curant, prin care acesta a

fost rugat să completeze istoricul medical relevant pentru studiu;

4) a recoltat probe de sânge pentru determinarea urmatorilor parametrii: glicemie,

hemoglobină glicozilata, HLG, profilul lipidic (colesterol, trigliceride, HDL-colesterol),

peptid C, creatinina, uree, acid uric, TGO si TGP, markeri virali ai hepatitei B, C si HIV.

Un numar de 50 de pacienti au ramas pentru etapa de randomizare.

De asemenea echipa P1 a stabilit urmatorii parametri ce vor fi urmariti pe parcursul unui

an de la inceperea studiului:

rata metabolica bazala, prin calorimetrie indirecta,

glicemia si hemoglobina glicozilata,

profilul lipidic,

insulinemia, pro-insulinemia si peptidul C ,

nivelele circulante ale adipocitokinelor (leptina, adiponectina)

nivelele circulante de grelina si GLP-1

markerii pro-inflamatori (CRP, Homocisteina, IL-6, TNF-alpha)

7 | 20

statusul antioxidant (activitatea enzimelor antioxidante GPx, SOD, CAT; raportul

GSH/GSSG in eritrocite)

nivelul de 8-OH-deoxi-guanozina ca marker al modificarii oxidative a ADN-ului,

determinarea „respiratory burst” in celulele mononucleare din sangele periferic.

Activitatea 1.3: Stabilirea profilului de investigatie prospectiva, multiparametrica a

pacientilor selectati pentru chirurgia metabolica

CO: Pentru realizarea activitatii 1.3 prevazuta in planul de realizare al proiectului,

institutia coordonatoare a tinut cont de faptul ca interventia chirurgicala metabolica,

gastrectomia longitudinala laparoscopica, este o interventie complet standardizata, ce

va fi efectuata de o singura echipa chirurgicala (prof. dr. C. Copaescu si dr. B. Smeu) cu

experienta in aceasta patologie. Pacientii vor fi internati in ziua interventiei chirurgicale,

aceasta urmand sa se desfasoare sub anestezie generala cu intubatie oro-traheala

(AGIOT). Interventia presupune mai multe porti de acces (4-7 incizii minime)

laparoscopic, ce se stabilesc de catre echipa chirurgicala in functie de IMC al

pacientului, de conformatia acestuia si de conditiile intraoperatorii (gradul de adipozitate

viscerala). Se devascularizeaza marea curbura gastrica cu ajutorul echipamentelor de

electrochirurgie, se va identifica prezenta unei eventuale hernii hiatale in timpul disectiei

polului superior gastric, existenta acesteia impunand cura acesteia prin calibrarea

hiatusului esofagian (calibrare sub bujie de 35fr). Gastrectomia longitudinala se face

incepand de la 1-2 cm de pilor, folosind dispozitive de sutura mecanica (staplere),

progresand cranial pana la nivelul unghiului His. Calibrarea stomacului se va face cu o

bujie de 35fr. In functie de necesitate, hemostaza pe transa de sectiune gastrica se va

face cu clipuri sau prin sutura secundara, decizie ce va fi luata de echipa chirurgicala pe

baza datelor intraoperatorii. Extragerea stomacului rezecat se va face printr-una din

plagile din flancuri, cu sutura secundara de apropiere a acesteia cu fir resorbabil.

Interventia presupune montarea unui tub gastric de garda pentru 24 de ore postoperator

si a unei sonde naso-gastrice care va fi mentinuta pentru 24-48 de ore postoperator,

interval care depinde de posibilitatea pacientului de a se hidrata pe cale orala.In primele

24 de ore postoperator, bolnavii vor fi monitorizati in sectia de terapie intensiva.

Incepand cu 24 de ore postoperator, pacientilor li se va permite hidratarea pe cale

orala. La 48 de ore postoperator se va face un control radiologic al stomacului operat,

folosind gastrografin ca substanta de contrast, externarea producandu-se la 48-72 de

ore postoperator in functie de evolutia clinica a fiecarui pacient. Bolnavii se vor prezenta

la 10 zile postoperator pentru extragerea agrafelor tegumentare, in policlinica Ponderas.

8 | 20

Pentru a evita eventualele complicatii post-operatorii, suplimentar fata de lotul cu

tratament conservator, pacientii repartizati in urma randomizarii in lotul cu tratament

chirurgical vor fi evaluati conform standardelor de investigare preoperatorii:

o Tranzit baritat

o Endoscopie digestiva superioara sub anestezie intravenoasa

o Consult cardiologic

o Spirometrie

o Ecografie abdominala

o Radiografie toraco-pulmonara

Pacientilor supusi tratamentului chirurgical li se vor recolta probe de țesut adipos

(visceral – marele epiploon)(maxim 10 grame) care vor fi utilizate pentru izolarea de

celule ADSC care vor fi obtinute la IBPC „Nicolae Simionescu” . Aceste celule primare

vor constitui materialul biologic care va fi folosit in experimentele ulterioare prevazute in

planul de realizare al proiectului, atat al P2 cat si al P3.

Activitatea 1.4: Elaborarea protocoalelor de lucru pentru studiile in vitro pe culturi

celulare

P2: Pentru realizarea activitatii 1.4, echipa P2 a intocmit si optimizat protocoalele de

lucru pentru: 1) culturi primare de celule izolate din fragmentele de tesut adipos prelevat

de la pacienti obezi si2) linia de celule β-pancreatice PANC1 (1.1B4), in vederea

utilizarii acestor doua tipuri celulare in studiile de stres metabolic indus de serul

recoltate de la pacientii obezi cu DZ2in diferite momente ale studiului (0, 6 si 12 luni).

Culturile primare de celule stromale izolate din tesut adipos („adipose derived stromal

cells”, ADSC) de la pacienti obezi sunt un model experimental potrivit pentru studiile de

stres metabolic datorita dependentei acestor celule de glucoza si lipide, cu stimularea

hiperplaziei si hipertrofiei tesutului adipos. Pe de alta parte, disfunctii survenite in

metabolismul acestor celule contribuie la cresterea nivelelor circulante de glucoza si

lipide. PANC1 este o linie stabilizata de celule β-pancreatice obtinuta recent prin

electro-fuzionarea unei culturi primare de celule β-pancreatice umane secretoare de

insulina cu o linie de carcinom pancreatic ductal. Se stie ca celulele PANC1 raspund la

lipotoxicitate similar cu insulele beta pancreatice umane.

9 | 20

Au fost optimizate urmatoarele protocoale de lucru:

Determinarea viabilitatii si proliferarii celulare

Determinarea viabilitatii si proliferarii celulare a ADSC si PANC 1se realizeaza printr-o

metoda colorimetrica, folosind compusul MTT.

Principiul metodei:compusul galben MTT (bromura de 3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-

difeniltetrazoliu) este redus prin clivarea inelului tetrazolic de catre dehidrogenazele

mitocondriale active, astfel incat rata de conversie este direct corelata cu numarul

celulelor vii. Compusul rezultat –formazanul, observat in celule sub forma de cristale de

culoare violet, este dizolvat in izopropanol acidifiat. Absorbanta masurata

spectrofotometric, ca diferenta intre cea masurata la =570 nm si lungimea de unda de

referinta la =590 nm, reprezinta o masura indirecta a activitatii metabolice a celulelor.

Metodologia experimentala: Celulele se insamanteaza la o densitate de 10 x 103 cel/ml

(vADSC) si 103 PANC in placi de 96 godeuri transparente, in mediu DMEM F12 cu 10%

FBS (ADSC) si RPMI cu 10 % FBS (PANC 1). Dupa aderare, celulele sunt mentinute 24

de ore in conditii de deprivare de ser, urmand apoi o perioada de 24, 48, sau 72 de ore

in care celulele sunt incubate cu substantele de interes.La finalul acestei perioade, dupa

indepartarea mediului, celulele sunt incubate timp de pentru 4 h intr-un mediu fara fenol

red care contine 10% din solutia stoc de 5mg/ml MTT. Dupa indepartarea mediului cu

MTT, peste celulele aderate in care se observa prezenta cristalelor de formazan de

culoare violet, se adaug 0,1 N HCl in izopropanol. Absorbanta masurata

spectrofotometric reprezinta o masura a activitatii metabolice a celulelor, rezultatele

fiind prezentate ca raport intre o situatie analizate si conditia control.

Determinarea speciilor reactive de oxigen

Nivelele intracelulare de specii reactive de oxigen se determina prin metoda cu

2’,7’diclorofluoresceina-diacetat (DCF-H).

Principiul metodei: Compusul nepolar H2DCF-DA difuzeaza rapid in celula unde este

hidrolizat si se formeaza derivatul polar, nefluorescent, H2DCF. In prezenta speciilor

oxidante intracelulare existente, H2DCF este oxidat generand DCF fluorescent.

Evaluarea cantitatii de ROS generat intracelular se prin masurarea spectrofotometrica a

fluorescentei emise la excitatie480nm/emisie530nm. Pentru normalizarea rezultatelor, se

realizeaza determinarea fluorescentei emise de colorantul nuclear Hoechst:

excitatie355nm/emisie485nm, cunoscut fiind faptul ca el se intercaleaza in ADN oferind o

10 | 20

informatie legata de numarul de celule din placa. Rezultatele sunt exprimate ca raport

intre fluorescenta masurata pentru compusul DCF si cea masurata pentru Hoechst.

Metodologia experimentala :Celulele se insamanteaza la o densitate de 5 x 104cel/ml

(ADSC) si 8x103 cel/200μl (PANC1) in placi negre de 96 godeuri, in mediu DMEM F12

cu 10% FBS si RPMI cu 10 % FBS.Ajunse la preconfluenta, celulele se depriveaza de

ser (FBS) timp de 24 h, pentru sincronizarea ciclului lor celular, dupa care mediul este

indeparat, iar celulele aderate se spala cu tampon izoton (HBSS). Celulele se

incubeaza cu DCFH (10 μM) 1 h la 37C,la intuneric. In ultimele 10 minute de incubare

se adauga Hoechst (0,2 μg/ml). Se cuantifica fluorescenta la spectrofotometrul Infinite

M200 Pro –Tecan.

Western-blotting

Principiul metodei: Celulele aderate (ADSC sau PANC1), deprivate de ser timp de 24

de ore, sunt apoi incubate in conditiile specifice fiecarui tip de experiment. Ulterior

acestei incubari, celulele mentinute pe gheata, sunt spalate cu tampon fosfat salin

(PBS) pH 7,4, dupa care se adauga 200-400l/placa de cultura tampon RIPPA (formula

modificata dupa cum urmeaza: Tris HCl 50mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 1%,

deoxicolat de sodiu 1%, SDS 0,1%, EDTA 1mM, PMSF 1mM, 1:100 dintr-un coktail de

inhibitori de proteaze, Na3VO4 1mM, NaF 1mM). Celulele resuspendate in tamponul de

liza sunt centrifugate la 13.000 x g, 10 minute la 4ºC. Supernatantul (lizatul celular total)

este folosit pentru determinarea concentratiei proteice prin metoda Amido Black

(Scheffield si colab., 1987). Proteinele din lizatele celulare (30-50 μg proteina din

fiecare) se separa in gel denaturant de poliacrilamida (SDS-PAGE) si se transfera pe

membrana de nitroceluloza sub actiunea curentului electric. Pentru a bloca legarea

nespecfica a anticorpilor, membranele de nitroceluloza sunt incubate cu o solutie de 5%

lapte degresat in tampon tris salin timp de o ora la temperatua camerei. Identificarea

proteinei de interes se realizeaza prin incubarea membranelor, peste noapte, la 4ºC, cu

anticorpi specifici proteinelor de interes. Vizualizarea interactiei imune a anticorpului

primar cu proteina specifica, se realizeaza prin incubarea membranelor cu anticorpi

secundari cuplati cu peroxidaza din hrean (HRP). Reactia peroxidazei cu substratul

chemiluminescent pe baza de luminol (Pierce) poate fi observata cu ajutorul analizorului

de imagine LAS 4000 (Fujifilm). Cuantificarea benzilor obtinute in urma reactiei

chemiluminescente se realizeaza cu programul TotalLab, rezultatele fiind exprimate ca

unitati arbitrare.

11 | 20

Imunofluorescenta

Celulele vADSC sau PANC1 se spala cu tampon fosfat salin (PBS) pH 7,4, se fixeaza

cu paraformaldehida 4% pentru 10 minute la temperatura camerei, dupa care se

permeabilizeaza cu o solutie de 0,1% Triton X100 in PBS, pentru 20 minute la

temperatura camerei. Pentru blocarea legarii nespecifice a anticorpului secundar,

celulele se incubeaza pentru o ora cu o solutie de blocare de albumina serica bovina

1% in PBS, urmata de incubarea peste noapte la 4C cu anticorpul primar cu

specificitate de legare pentru proteina de interes. Evidentierea proteinei de interes se

realizeaza dupa incubarea celulelor cu anticorpul secundar cuplat cu un fluorocrom

(Alexa488). Nucleii celulelor poti fi vizualizati dupa incubarea celulelor cu 4', 6-

diamidino-2-phenylindole (DAPI).

Microscopie electronica

Celulele vADSC sau PANC1 ajunse in stare preconfluenta se spala cu PBS pH 7,4 si se

fixeaza cu o solutie de glutaraldehida 2,5% in solutie tampon cacodilat 0,1M (pH 7,4).

Postfixarea celulelor se realizeaza cu o solutie de tetraoxid de osmiu OsO4 2%, urmata

de incubarea cu acid tanic 1% in cacodilat de sodiu 10 minute si de spalare cu sulfat de

sodiu 1% in cacodilat de sodiu 0,1M. Deshidratarea probelor se realizeaza cu

concentratii crescatoare de etanol si apoi incluse in Epon 812. Dupa polimerizarea

rasinei au fost taiate sectiuni fine (60 – 90 μm) care au fost contrastate cu 7,6% uranil

acetat (dizolvat in apa distilata) si citrat de plumb 0,4% (in NaOH 0,1N). Vizualizarea

probelor se realizeaza cu ajutorul microscopului Tecnai G2 Spirit Biotwin (FEI

Company) echipat cu camera digitala Eagle (2kx2k).

Zimografie

Se colecteaza mediile conditionate de la celulele care, in prealabil, au fost deprivate de

FBS pentru 24 de ore si incubate cu substantele de interes. Se centrifugheaza la 2000

rpm pentru indepartarea debriurilor celulare. Celulele vADSC sau PANC1 ramase

aderate se spala cu tampon fosfat salin (PBS) pH 7.4, dupa care se adauga 400l

tampon (PBS, 0.1% Triton X 100, 0.1 mM PMSF), se centrifugheaza la 16 000 x g, 10

minute la 4ºC. Supernatantele (lizatele celulare totale) si mediile conditionate sunt

folosite pentru determinarea concentratiei proteice prin metoda Amido Black . Proteinele

din lizatele celulare sau din mediile conditionate ( 25-40 μg proteina din fiecare) se

separa in gel nedenaturant de 10% poliacrilamida care contine 1 mg/ml gelatina, sub

actiunea unui camp electric (la voltaj constant). Dupa migrare se indeparteaza SDS-ul

12 | 20

cu 2.5 % Triton X 100 ( 2x 30’). Activitatea gelatinolitica este evidentiata in urma

incubarii timp de 17 ore, la 37C, cu tampon de developare (50 mM Tris-HCl, 150 mM

NaCl, 5mM CaCl2, 0.02% Brij, pH 7.6). A doua zi se observa aparitia benzilor

transparente, a caror densitometrare se realizeaza cu programul software TotalLab.

P3: Validarea materialelor şi optimizarea metodelor pentru studiului in vitro s-a realizat

utilizând liniile celulare standardizate PANC-1 (origine umană) şi INS-1E (şobolan).

Menţinerea celulelor INS-1E şi PANC-1 în cultură se realizeaza prin pasarea lor de

două ori pe săptămănă. Mediul celulelor ajunse la confluenţă e îndepărtat, iar

monostratul de celule se clatestex1 cu tampon fosfat salin(PBS) steril, dupa care

celulele se desprind prin incubare cu tripsină-EDTA 0.05%,3-5 min. la 37ºC. Inactivarea

tripsinei se realizeaza folosind un raport de tripsină: mediu de cultură complet de 1:2.

Celulele sunt recoltate, centrifugate la 1500rpm, 5min, la 4 ºC şi resuspendate într-un 1

ml de mediu pentru a fi numărate apoi diluate la 10mL de mediu de cultură complet.

Numărarea celulelor şi respectiv determinarea viabilităţii celulare se face prin colorarea

lor cu Trypan Blue, urmata denumararea lor sub microscop folosind o cameră Burker-

Turk (hemocitometrul). Viabilitatea celulelor trebuie sa fie ≥ 95%.

Mediile de cultură folosite:

1. RPMI-1640 cu 11.1 mmoli/L D-glucoza, 10% FBS, 10mmoli/L Hepes, 2mmoli/L

L-glutamină, 1mmol/L piruvat de sodiu, 50μmoli/L β-mercaptoetanol, 100U/mL

penicilina şi 100μg/mL streptomicină pentru linia celulară INS-1E

2. RPMI-1640 cu 11.1 mmoli/L D-glucoza, 10% FBS, 4mmoli/L L-glutamină,

100U/mL penicilina şi 100μg/mL streptomicină pentru linia celulară PANC1.

În vederea optimizării protocolului de stimulare cu glucoză cu/făra acid oleic sau

palmitic am realizat incubarea celulelor β-pancreatice cu o serie de concentraţii de

glucoză (0; 2.8; 5.5; 11.1; 28 şi 100mM), în prezenţa sau absenţa de acid oleic 50µM (2

experimente), acid palmitic 1mM (1 experiment), sau în combinaţia acid oleic:acid

palmitic în raport 2:1 (1 experiment). Celulele au fost menţinute în cultură 2h sau 24h.

Cuantificarea secreţiei de insulină la stimularea de glucoză am realizat-o prin

determinarea concentraţia de insulină in mediu şi în lizatul celular prin tehnica ELISA.

Cu o zi înainte de experiment celulele au fost desprinse, numărate şi insamantate2x104

celule/mL în plăci de 6 godeuri. După intervalele de timp stabilite pentru fiecare tip de

13 | 20

experiment, mediul de cultură a fost îndepărtat, celulele au fost spălate cu PBS,

desprinse cu tripsină-EDTA 0.05% şi sedimentate prin centrifugare la 2000rpm, 5min. la

4ºC. O alicota de mediu de cultură a fost păstrata (-70ºC ) pentru determinarea

concentraţiei de insulină din mediu.

Liza celulelor s-a realizat folosind 2 tampoane de liza: (1) HEPES-CHAPS (Hepes

50mM, Chaps 2%, NaCl 200mM, pH = 7.5) şi (2) 0.1 % Triton X100. Celulele au fost

menţinute pe gheata 30 min., cu vortexare la 15min. După centrifugarea la 10.000g

(4ºC, 20 min.) din supernatantul obţinut a fost determinata concentraţia proteica folosind

un kit disponibil comercial cu acid bicinconinic (BCA) (Pierce BCA kit nr. 23225). Lizatul

celular /mediul recoltat au fost utilizate pentru cuantificarea insulineiprin metoda ELISA

(kit EIA 2935) conform instrucţiunilor producătorului.

Experimentele preliminare realizate cu liniile celulare β-pancreatice, ca model

experimental pentru studiul DZ2, au arătat că acumularea intracelulară de insulină a

fost mai scazuta la concentrații mai mari de glucoza, iar acest lucru a fost asociat cu

modificarea secreției de insulină. Efectul a fost amplificat prin adăugarea de acid oleic

în combinaţie cu concentraţia mare de glucoză. Rezultatele trebuie validate prin

repetarea experimentului de minim 3 ori în aceleaşi condiţii.

Activitatea 1.5: Studii preliminare de investigare a viabilitatii celulare in prezenta

de ser de la pacientii luati in studiu (partea I - activitate transferata)

P2: Pentru realizarea activitatii 1.5 au fost utilizate: celule β-pancreatice din linia

PANC1 si preadipocite izolate din tesut adipos visceral de la pacienti cu obezitate si

DZ2. Tesutul adipos si serurile folosite in experimentele preliminare au fost obtinute de

la alti pacienti decat cei inclusi in studiul CREDOR care si-au dat consimtamantul pentru

utilizarea probelor biologice in scop de cercetare. Celulele aflate la confluenta au fost

aduse in starea metabolica de repaus (toate celulele sunt in faza G0 a ciclului celular),

prin deprivare de nutrienti timp de 24 de ore, in mediu DMEM cu 5 mM glucoza si 0.2%

FBS. Pentru evaluarea efectelor asupra viabilitatii si proliferarii celulare, preadipocitele

si celulele β-pancreatice au fost incubate inca 24 de ore in mediu DMEM cu 5 mM

glucoza in prezenta de ser provenit de la pacienti cu obezitate si DZ2, in concentratie

finala de 10% .

14 | 20

Fig.1. Evaluarea viabilitatii celulare in conditiile incubarii ADSC si PANC1

cu ser de la pacienti obezi cu diabet de tip 2

Rezultatele obtinute au evidentiat comportamentul diferit al celulelor in prezenta de ser

provenit de la pacientii cu obezitate si DZ2. In cazul preadipocitelor s-a observat o

crestere cu ~ 47% a viabilitatii si proliferarii celulare, in timp ce in cazul PANC1a fost

obtinut un efect opus, respectiv de scadere cu ~ 50% a activitatii metabolice a celulelor

pancreatice in prezenta serului de la pacienti cu obezitate si DZ2. Rezultatele

preliminare obtinute in aceste experimente au aratat faptul ca la pacientii obezi cu DZ 2

expansiunea masei de tesut adipos poate fi atribuita hiperplaziei preadipocitelor

rezidente in tesutul adipos, capabile sa se diferentieze in adipocite gratie unor

mecanisme initiate de factori circulanti. Scaderea numarului de celule β pancreatice

poate sa reprezinte o consecinta a sensibilitatii, in sensul scaderii viabilitatii, a acestor

celule in conditii de hiperglicemie si/sau hiperlipidemie.

Activitatea 1.6: Evaluarea exprimarii proteinelor implicate in stresul

reticululuiendoplasmatic (SRE) (partea I - activitate transferata)

P2: Experimentele preliminarii efectuate pentru realizarea activitatii 1.6. au constat in

incubarea celulelor vADSC si PANC1 cu doi metaboliti cunoscuti ca inductori de SRE:

glucoza in concentratii crescute (25mM) si acizii grasi saturati cu lant lung (ex. acidul

palmitic, 250μM). Glucoza si lipidele în exces concura la inducerea stresului oxidativ si

a stresului reticulului endoplasmatic (SRE), afectand sever functia celulara si ducand în

ADSC PANC1

15 | 20

cele din urma la la moartea acesteia. Ineficienta mecanismelor de control al calitatii la

nivelul RE determina acumularea de proteine modificate în lumenul RE, care activeaza

o serie de cai de semnalizare (PERK, IRE1α, ATF6) cu scopul cresterii supravietuirii

celulei. Rezultatele preliminarii au aratat ca glucoza in concentratie de 25 mM

determina cresterea expresiei proteice a PERK si IRE1α, iar in combinatie, glucoza si

acidul palmitic au efect sinergic asupra cresterii exprimarii proteinelor implicate in

declansarea raspunsului celular la SRE in vADSC. In experimentele in care a fost testat

efectul tunicamicinei (controlul pozitiv al declansarii SRE) rezultatele preliminarii au

aratat cresterea exprimarii IRE1α dupa 1 ora de incubare cu 5μg/ml tunicamicina.

Incubarea celulelor PANC1 cu glucoza 5mM nu a determinat o cresterea a expresiei

IRE1α in timp (la 10 minute, 1, 6 si 24 ore), in timp ce incubarea acestor celule in

glucoza 25mM si acid palmitic 250μM a dus la cresterea expresiei proteice a IRE1α.

Activitatea 1.7: Evaluarea statusului oxidativ incelulele β-pancreatice si

adipociteincubate cu ser de la pacientii luati in studiu (partea I - activitate

transferata)

P2: Experimentele aferente activitatii 1.7 au avut ca scop studiul efectului stresului

reticulului endoplasmic asupra activitatii metaloproteinazelor matriceale MMP2 si

MMP9. In experimente preliminarii, preadipocitele izolate din tesut adipos visceral si

celulele din linia PANC1 au fost incubate timp de 24 de ore in mediu DMEM cu 5mM

glucoza (conditie de normo-glicemie), in DMEM cu 25 mM glucoza (conditie care

mimeaza starea de hiperglicemie), si in prezenta de ser provenit de la pacienti cu

obezitate si DZ2. Evaluarea nivelelor de specii reactive generate intracelular dupa

incubarea celulelor in conditii cu glucoza crescuta, sau in prezenta de ser, s-a realizat

prin metoda spectrofluorimetrica folosind 2`,7`dicloro-dihidro-fluorescein diacetatul

(DCF) care detecteaza specific peroxidul de hidrogen intracelular. Rezultatele obtinute

au fost exprimate ca raport intre fluorescenta datorata DCF si cea data de Hoechst

33342.

16 | 20

Fig. 2. Efectul glucozei, a acidului palmitic si a serului provenit de la pacienti cu obezitate si

DZ2 asupra productiei de ROS in ADSC, evaluat prin masurarea fluorescentei DCF.

Celule PANC1 si ADSC incubate in conditii de glucoza crescuta prezinta nivele ridicate

de ROS, fenomen observat si in cazul incubarii acestor celule in prezenta de ser

provenit de la pacienti cu obezitate si DZ2.

Stresul oxidativ crescut se coreleaza, in obezitate si diabet, cu activitate si

exprimari crescute ale metaloproteinazelor matriceale MMP2 si MMP9. MMP9 este una

dintre metaloproteinazele matriceale (MMP) cheie implicate în adipogeneza, a carei

exprimare este crescuta în obezitate, probabil datorita rezistentei la insulina. In acest

context, in experimentele realizate am urmarit determinarea activitatii gelatinolitice a

MMP2 si MMP9, in mediile conditionate si in lizate celulare totale obtinute dupa

incubarea timp de 24h a PANC1 si ADSC in conditii de glucoza crescuta, acid palmitic

250 µM si ser provenit de la pacienti.

17 | 20

Activitatea enzimatica in mediile de cultura si in lizatele celulare a fost evaluata prin

cuantificarea benzilor translucide ce apar in gelurile de poliacrilamida ce contin gelatina,

substrat al acestor enzime matriceale, dupa colorararea cu Comassie brilliant blue.

Rezultatele obtinute in urma evaluariii activitatii zimogene a MMP2 in mediile

conditionate au aratat cresterea activitatii gelatinolitice in conditiile incubarii celulelor in

prezenta de glucoza crescuta si ser de la pacienti cu obezitate si diabet de tip 2, in timp

ce activitatea MMP9 nu pare a fi semnificativ afectata de conditiile ce induc un stres

metabolic in ADSC cat si PANC1.

Activitatea 1.8: Identificarea mecanismelor intracelulare modulate de

grelina/deacilgrelina in conditii destres metabolic in adipocite si celule

β-pancreatice (partea I – activitate transferata).

P2 Pentru realizarea experimentelor cuprinse in activitatea 1.8 celulele ADSC si

PANC1 au fost stimulate timp de 24 de ore cu grelina/desacil grelina in conditii care sa

mimeze situatia intalnita in vivo la pacientii cu obezitate si DZ2 si anume: (a) DMEM cu

25 mM glucoza (conditia „hiperglicemica”), (b) DMEM cu 5 mM glucoza la care se

adauga acid palmitic in concentratie de 250 µM, (c) DMEM cu 25mM glucoza si

250 µM acid palmitic. In plus, tunicamicina, inductor al stresului de reticul endoplasmic,

a fost utilizat ca un control pozitiv pentru stresul intracelular indus de factori metabolici.

Evaluarea ratei de supravietuire sau proliferare celulara a fost realizata cu metoda MTT.

Rezultatele obtinute au evidentiat faptul ca celule β-pancreatice sunt mult mai sensibile

la efectele induse de glucoza si acidul palmitic la concentratii crescute in sensul afectarii

viabilitatii acestor celule, efect comparabil cu cel indus de tunicamicina, cunoscut ca

inductor al stresului de reticul endoplasmatic. In plus, comparativ cu glucoza, acidul

palmitic determina o scadere a viabilitatii celulelor pancreatice cu ~ 50% (Fig. 4 a),

grelina compensand printr-un efect de crestere a metabolismului in celulele PANC1 cu

~ 10%.

18 | 20

a. PANC1

b. ADSC

Fig. 4. Evaluarea viabilitatii celulare in prezenta de grelina

Intelegerea mecanismelor prin care grelina, hormon secretat la nivelul stomacului,

contribuie la cresterea proliferarii si a metabolismului celulelor din pancreas si a

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

19 | 20

preadipoctelor rezidente in tesutul adipos in conditii de hiperglicemie si hiperlipidemie,

vor putea aduce informatii noi asupra proceselor implicate in regresia diabetului de tip 2

dupa operatia de gastrectomie longitudinala.

Activitatea 1.9: Obtinerea avizului Comisiilor de Etica

CO,P1,P2,P3 Pentru realizarea activitatii 1.9 prevazuta in planul de realizare,

coordonatorul si fiecare dintre parteneri a intocmit o cerere de avizare din partea

comisiei locale de etica in care a mentionat titlul proiectului, finantatorii, obiectivele, o

scurta descriere a proiectului si legislatia in vigoare care reglementeaza circuitul

probelor de provenienta umana de la prelevare si pana la starea de deseu. Comisia de

etica a fiecarei institutii din consortiu s-a intrunit pentru avizarea procedurilor si

experimentelor necesare derularii proiectului CREDOR. In urma acestor sedinte,

comisiile de etica au eliberat autorizari pentru desfasurarea activitatilor CREDOR (CO-

aut. Nr. 412/2.12.2014; P1 – aut. Nr. 4088/08.12.2014; P2 – aut. Nr. 691/28.11.2014;

P3 – 34424/14.11.2014).

Activitatea 1.10: Organizarea de mese rotunde informative intre parteneri

CO: pentru indeplinirea activitatii 1.10 prevazuta in etapa I a proiectului, institutia

coordonatoare a organizat, pe parcursul acestei etape, cinci intalniri cu partenerii

(24.09; 01.10; 10.10; 20.10; 24.11) in cadrul carora s-au discutat criteriile de

incudere/excludere a pacientilor in studiu, consimtamantul informat, designul studiului

clinic randomizat, modalitati de randomizare a pacientilor inclusi in studiu. La sfarsitul

fiecarei sedinte de lucru a fost intocmit un proces verbal.

Activitatea 1.11: Selectia si includerea pacientilor cu obezitate si DZ2 pe baza

consimtamantului informat

P1: echipa de medici a P1 a prezentat pacientilor care corespundeau criteriilor de

includere in studiul CREDOR riscurile, beneficiile, avantajele si dezavantajele

participarii in studiu si le-a inmanat formularul de consimtamant informat pentru a fi

semnat. Vor fi considerati ca participanti la studiu, si vor participa la etapa de

randomizare, numai acei pacienti care vor reveni la echipa medicală a proiectului cu

consimtamantul informat semnat.

20 | 20

Activitatea 1.12: Randomizarea pacientilor in doua grupe (grupul cu tratament

conservator si grupul cu tratament chirurgical metabolic)

CO si P1: pentru realizarea activitatii 1.12., CO si P1 au stabilit modalitatea de

randomizare a pacientilor inclusi in studiu astfel incat apartenenta unei persoane la un

tip sau altul de tratament sa fie complet aleatorie. Pentru randomizare se foloseste un

program de computer dedicat acestui scop, creat pe platforma Microsoft Visual Studio

2013 Community Edition (Microsoft Visual Studio Community 2013 Version

12.0.31101.0 REL (c) 2014 Microsoft Corporation Microsoft; .NET Framework Version

4.5.50938 (c) 2014 Microsoft Corporation. Generatorul de numere aleatoare

implementat in compilatorul din Visual Studio (este vorba de un “pseudo-generator”

care in practica se comporta ca un generator autentic) se bazeaza pe algoritimul

descris de Donald E. Knuth (pentru informatii suplimentare vezi D. E. Knuth. "The Art of

Computer Programming, volume 2: Seminumerical Algorithms". Addison-Wesley,

Reading, MA, second edition, 1981).

Activitatea 1.13: Informarea pacientilor asupra studiului

CO: va organiza in data de 13 decembrie 2014 un seminar in care persoanele incluse in

studiu vor fi informate despre procedura de gastrectomie longitudinala, managementul

alimentatiei in perioada post-operatorie, evitarea efectelor secundare ale interventiei

precum si beneficiile pe care aceasta procedura le are in ceea ce priveste tratamentul

obezitatii si posibilitatea de remisie a diabetului.