1

REZUMAT al tezei de doctorat cu titlul :

EFECTELE UNOR PRINCIPII FITOTERAPEUTICE ASUPRA RADICALILOR LIBERI RESPONSABILI DE INSTALAREA STRESULUI

OXIDATIV

Termenul de stress oxidativ a fost definit pentru prima dată în 1985 ca o alterare a balanţei

dintre pro-oxidanţi versus antioxidanţi, în favoarea primei forme [Sies, 1985]. Odată cu desluşirea

în amănunt a mecanismelor moleculare care conduc la instalarea stresului oxidativ, definiţia

stressului oxidativ a fost reformulată, astfel Dean Jones propune redefinirea acestui termen ca “o

întrerupere a controlului semnalizării redox” [Jones 2006]. O abordare comună pentru evaluarea

stresului oxidativ în sistemele biologice implică dozarea moleculelor redox sensibile, creşterea sau

scăderea acestora ca răspuns la fenomenul de stres oxidativ.

În sistemele biologice stresul oxidativ este caracterizat de următorii parametri: creşterea şi

formarea de specii chimice cu caracter oxidant, scăderea antioxidanţilor cu greutate moleculară

mică şi a celor lipo-solubili, tulburări ale balanţei redox celulare, alterarea oxidativă a

componentelor celulare (biomembrane, proteine, ADN, ARN, etc).

Radicalii liberi sunt compuşi reactivi, produşi în mod natural în corpul uman. Ei pot

exercita efecte pozitive (asupra sistemului imunitar) sau negative (oxidarea lipidelor, proteinelor

sau ADN-ului). Pentru a limita aceste efecte dăunătoare, un organism necesită o protecţie

complexă reprezentată de sistemul antioxidant. Acest sistem este constituit din antioxidanţi

enzimatici (catalaza, glutation peroxidaza, superoxid dismutaza etc.) şi antioxidanţi neenzimatici

(vitamina E-tocoferol, vitamina A-retinol, vitamina C-acidul ascorbic, glutationul şi acidul uric).

Defensiva endogenă antioxidantă proprie organismului, enzimatică sau non-enzimatică,

poate fi suplimentată, prin hrană, deci exogen, cu substanțe cu proprietăți asemănătoare celor

enumerate mai sus [Hayes et al. 1999; Masella et al., 2005]. Dintre aceste substanțe, polifenolii din

plante au fost intens studiați pentru proprietățile lor antioxidante precum și proprietăți de reglare

celulară [Hartman et al. 2006]. Polifenolii reprezintă un grup de metaboliți secundari ai plantelor,

care sunt frecvent întălniți în fructe, legume, plante medicinale, etc.

*

* * *

2

Teza redactată cuprinde un număr de 358 pagini, în care sunt incluse 54 tabele, 297 figuri

şi/sau grafice şi 291 surse bibliografice. Teza este structurată în două părţi, respectiv studiul

bibliografic şi cercetările proprii.

Partea I, dedicată studiului bibliografic al cunoştinţelor în domeniu reprezintă 29,20 % din

lucrare, cuprinde un număr de 101 pagini în care sunt incluse 18 tabele şi 39 figuri şi a fost

elaborată pe baza consultării a 178 de titluri bibliografice, din care 75 % apărute după anul 2000.

Partea a II-a, rezervată cercetărilor proprii cuprinde un număr de 253 pagini care reprezintă

70,80 % din conţinutul tezei şi include 36 tabele şi 252 figuri şi/sau grafice.

Partea I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

Partea I, reprezentată de Studiul bibliographic, este structurată în 2 capitole, respectiv:

stresul oxidativ şi compuşi polifenolici.

În capitolul I – Stresul oxidativ – sunt prezentate consideraţii generale ale stresului oxidativ,

modalităţile de formare intracelulară a speciilor reactive de oxigen, modalităţile de formare

extracelulară a speciilor reactive de oxigen, clasificarea speciilor reactive de oxigen, oxidarea

biomoleculelor celulare (proteine, lipide, ADN), mecanismele de protecţie ale organismului contra

stresului oxidativ – antioxidanţi enzimatici (superoxid dismutazele, catalazele, glucozo–6–fosfat

dehidrogenaza, glutation peroxidaza) şi antioxidanţi nonenzimatici (vitamina E, ubichinonele,

carotinele, metalotioneine, glutationul, tioredoxinele, vitamina C).

În capitolul II sunt prezentate datele generale despre polifenolii din plante, clasificarea

acestora, oxidarea polifenolilor în reacţiile antioxidante la care participă, reacţiile polifenolilor cu

proteinele. În acest capitol sunt descrise bioacţiunile polifenolilor: acţiunea împotriva

aterosclerozei şi efectul cardioprotector, efectele neuroprotectoare şi efectele împotriva

îmbătrânirii, proprietăţile antiinflamatorii, proprietăţile anticarcinogene şi antimutagene, efectele

asupra aparatului digestiv, inclusiv asupra enzimelor digestive, modularea căilor de semnalizare ale

transducţiei indusă de polifenoli, efectele protectoare asupra celulelor imunităţii, stimularea

activităţii antialergice, efectele antidiabetice, reglarea ciclului celular, activitatea antimicrobiană

prezentată de unii polifenoli, efectele biochimice ale flavonoidelor (asupra hormonilor, asupra

enzimelor). Ultima parte a capitolului II prezintă activitatea prooxidantă şi efectele celulare ale

radicalilor fenoxil şi biodisponibilitatea polifenolilor (absorbţia intestinală, mecanismele de conjugare şi

transportul în plasmă, concentraţiile plasmatice, modalităţi de excreţie şi captarea polifenolilor de ţesuturi).

3

Partea II – CERCETĂRI PROPRII Partea a II-a, rezervată Cercetărilor personale este structurată în 3 capitole, respectiv:

materiale şi metodele utilizate, rezultate şi discuţii şi concluziile generale.

În prima parte a capitolului 3 au fost prezentate scopul şi obiectivele cercetărilor în care

sunt prezentate scopul şi obiectivele urmărite, respectiv:

scopul tezei de doctorat a fost 1) îmbogăţirea cunoştinţelor ştiinţifice referitoare la

sursele şi nivelurile de polifenoli din unsprezece plante medicinale din flora autohtonă

şi 2) determinarea capacitaţii polifenolilor de a anihila radicalilor liberi: in vitro – pe

modelul emulsiei de acid linoleic şi pe modele experimentale care decurg cu generare

de radicali liberi şi in vivo – la animalele de laborator supuse unui stres oxidativ.

Obiectivele tezei de doctorat au fost reprezentate de:

extracţia şi izolarea polifenolilor din plante medicinale;;

analiza calitativă a polifenolilor din extractele alcoolice obţinute din plante

medicinale prin spectroscopie UV-VIS;

analiza cantitativă a polifenolilor din extractele alcoolice obţinute din plante

medicinale (dozarea polifenolilor totali şi a flavonoidelor);

testarea capacităţilor de anihilare a radicalilor liberi, de reducere şi chelatare a

ionilor metalelor tranziţionale de către extractele alcoolice obţinute din plantele

medicinale. În scopul atingerii acestui obiectiv au fost detrminate: 1) capacitatea de

anihilare a radicalilor liberi: 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), anionul superoxid

(O2•−), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil (HO•), a radicalul oxid

nitric (NO•);; şi 2)capacitatea de reducere a ionului Fe3+, abilitatea extractelor de a

chelata ionul Fe2+.

determinarea activităţii antioxidante a polifenolilor pe modelul emulsiei de acid

linoleic: determinarea valorii de peroxid (PV), dienelor conjugate (CD) şi

substanţelor care reacţionează cu acidul tiobarbituric (TBARS);;

evaluarea procesului de peroxidare lipidică indus de stresul oxidativ la animalele de

laborator: determinarea peroxizilor lipidici, determinarea substanţelor care

reacţionează cu acidul tiobarbituric (TBARS), determinarea activităţii unor enzime

antioxidante şi a glutationului redus.

În acest capitol s-a efectuat o prezentare generală a plantelor medicinale din care s-au

obţinut extracte polifenolice: sunătoarea (Hypericum perforatum), păducelul (Crataegus

4

oxyacantha), trei frați pătați (Violae tricoloris), urzica (Urtica dioica), fasolea (Phaseolus

Vulgaris), afinul (Vaccinium myrtillus), vâscul (Viscum album), mărul lupului (Aristolochia

clematitis), rostopasca (Chelidonium majus), pedicuța (Lycopodium clavatum), schinelul (Cnicus

benedictus), precum şi modalitatea de obţinere a extractelor alcoolice care au fost utilizate pentru

cercetările ulterioare.

Caracterizarea primară a extractelor alcoolice a presupus:

Analiza calitativă a extractelor alcoolice care s-a realizat prin determinarea spectrelor

de absorbţie UV-VIS;

Analiza cantitativă a polifenolilor care a presupus determinarea polifenolilor totali şi

a flavonoidelor prezente în extractele alcoolice;

Determinarea puterii reducătoare a extractelor polifenolice: determinarea puterii de

reducerea a ionului Fe III la Fe II şi a ionului Mo VI la Mo V;;

Determinarea capacităţii de chelatare a ionului Fe II de către principiile

fitoterapeutice prezente în extractele alcoolice;

Evaluarea capacităţii de anihilare a radicalilor liberi: radicalului sintetic 1,1-

difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•), anionul superoxid (O2•−), peroxidul de hidrogen

(H2O2), radicalul hidroxil (HO•) şi radicalul oxid nitric (NO•);;

Determinarea activităţii antioxidante a polifenolilor din extractele alcoolice obţinute

din plantele medicinale menţionate, pe modelul emulsiei de acid linoleic: a fost

evaluată inhibarea formării produşilor primari (peroxizii lipidici şi dienele conjugate)

şi a produşilor secundari ai peroxidării lipidice (substanţele care reacţionează cu

acidul tiobarbituric (TBARS)).

Evaluarea procesului de peroxidare lipidică indus de stresul oxidativ la animalele de

laborator, s-a realizat prin:

determinarea peroxizilor lipidici, şi a substanţelor care reacţionează cu acidul

tiobarbituric (TBARS) din omogenatele de ficat de şoarece;

determinarea activităţii unor enzime antioxidante: superoxid dismutaza (SOD),

catalaza (CAT), glutation peroxidaza (GPX), glutation S transferazelor hepatice,

glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH) din omogenatele de ficat de şoarece;;

determinarea glutationului redus din omogenatele de ficat de şoarece;;

determinarea proteinelor totale din omogenatele de ficat de şoarece.

În capitolul 4, dedicat rezultatelor şi discuţiilor, sunt prezentate rezultatele obţinute la

evaluarea parametrilor enumeraţi anterior.

5

În subcapitolul 4.2 au fost prezentate rezultatele analizei spectrelor UV-VIS ale extractelor

alcoolice obţinute din plante medicinale. Rezultatele obţinute pentru extractele alcoolice din cele

unsprezece plante investigate au fost comparate cu rezultatele obţinute pentru diferite standarde ca:

acid galic, acid cafeic, acid tanic, acid eleagic, acid clorogenic, quercitină, catehină, guaiacol.

În subcapitolul 4.3 au fost redate rezultatele analizei cantitative a polifenolilor. Cea mai

mare concentraţie în polifenoli a prezentat-o extractul de sunătoare (Hypericum perforatum) 40.43

± 3.09 mg echivalent acid cafeic /g substanţă uscată iar cea mai redusă concentraţie a prezentat-o

extractul de fasole (Phaseolus Vulgaris) 7,46 ± 1,29 mg echivalent acid cafeic /g substanţă uscată.

De asemenea, Toate extractele alcoolice obținute din plantele medicinale aflate în studiu, au

prezentat concentrații semnificative în compuși flavonoidici. Cea mai mare concentrație a

prezentat-o extractul alcoolic de afin (Vaccinium mirtillus) 2145,0 ± 45,5 µg equivalent

quercitină/g substanţă uscată, iar cea mai mică extractul alcoolic de pedicuță (Lycopodium

clavatum) 334,0 ± 24,8 µg equivalent quercitină/g substanţă uscată.

În subcapitolul 4.4 au fost analizate rezultatele obţinute la evaluarea puterii reducătoare şi a

capacităţii de chelatare a ionilor metalelor tranziţionale de către extractele alcoolice obţinute din

plantele medicinale investigate. Cea mai mare puterea reducătoare, adică 3,81 ± 0,23 mM

echivalent FeSO4/g substanţă uscată, au prezentat-o extractele alcoolice de păducel (Crataegus

oxyacantha) şi afin (Vaccinium myrtillus). Cele mai mici capacităţi de reducere ale ionilor de Fe3+

la Fe2+ le-au prezentat extractele alcoolice de pedicuţă (Lycopodium clavatum) 0,42 ± 0,07 mM

echivalenţi de FeSO4/g substanţă uscată şi cel de fasole (Phaseolus Vulgaris) 0,59 ± 0,04 mM

echivalenţi de FeSO4/g substanţă uscată. Cele mai semnificative valori, în ceea ce priveşte

capacitatea de chelatare, au fost înregistrate pentru extractele etanolice de trei frați pătați (Viola

tricoloris) 63,35 ± 15,09 %, urzică (Urtica dioica) 61,55 ± 14,39 %, fasole (Phaseolus vulgaris)

61,01 ± 15,21 % şi rostopască (Chelidonium majus) 67,61 ± 15,62 % respectiv. Extractul alcoolic

de pedicuță (Lycopodium clavatum) a prezentat cea mai redusă capacitate de chelatare a ionilor de

Fe (II), şi anume 14,55 ± 4,55 %.

Rezultatele privind determinarea capacităţii de anihilare a radicalilor liberi de către

extractele alcoolice obţinute din plantele medicinale au fost prezentate în subcapitolul 4.5.. Toate

extractele alcoolice obţinute din cele 11 plante medicinale au prezentat importante capacităţi de

anihilare a radicalilor liberi (a radicalului 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•), a anionului

superoxid (O2•−), a peroxidului de hidrogen (H2O2), a radicalului hidroxil (HO•) şi a radicalului

oxid nitric (NO•)). Extractele alcoolice de sunătoare (Hypericum perforatum) şi de frați pătați

(Viola tricoloris) au prezentat cea mai importantă valoare în ceea ce priveşte capacitatea de

6

anihilare a oxidului nitric (59.31 %). Extractul alcoolic de păducel (Crataegus oxycantha) a

prezentat capacităţi de anihilare a DPPH• de 87,25 ± 9,89 % şi a peroxidului de hidrogen de 3.94 ±

0.12 % care de altfel au fost cele mai mari capacităţi de anihilare ale acestor radicali dintre toate

extractele alcoolice obţinute din plantele medicinale investigate. Extractul de afin (Vaccinium

myrtillus) a prezentat cea mai importantă activitate de anihilare a anionului superoxid (63.33 ±

12.09 %). Extractul alcoolic de Viscum album a prezentat cea mai importantă capacitate de

anihilare a radicalului hidroxil 34,44 ± 4,98 %.

S-au studiat activitățile antioxidante ale celor unsprezece extracte alcoolice obţinute din

plante medicinale pe modelul emulsiei de acid linoleic, utilizându-se pentru comparaţie un etalon

de butilhidroxianisol (BHA), iar rezultatele au fost prezentate în subcapitolul 4.6. În acest scop,

activitatea antioxidantă a acestor extracte din plante medicinale a fost testată pe emulsie de acid

linoleic, urmărindu-se valoarea de inhibiţie a dienelor conjugate, valoarea de inhibiţie a peroxizilor

și valoarea de inhibiţie a substanţelor ce reacţionează cu acidul tiobarbituric (TBARS) pe o

perioadă de 7 zile și la o temperatură de incubație de 37ºC. În general, asupra emulsiei de acid

linoleic, extractele alcoolice au manifestat efect de inhibiție a peroxidării lipidice.

În subcapitolul 4.7 s-au prezentat rezultatele obţinute pentru efectul in vivo a extractelor

obţinute din plantele medicinale asupra stresului oxidativ. În acest scop s-au utilizat 120 soareci

care au fost împărţiţi aleator în 24 de loturi. Primul lot (G1) a fost utilizat ca martor pozitiv,

şoarecii din acest lot au fost ţinuţi în condiţii adecvate, ei primind per os în fiecare zi apă distilată.

Loturile G2 – G12 cu şoareci nestresaţi, au primit extracte obţinute din plantele medicinale Lotul

13 (G13) a fost utilizat ca martor negativ, şoarecii din acest lot au fost stresaţi prin modificarea

orelor de lumină şi orelor de întuneric şi au primit per os numai apă distilată. Loturile G14 – G24

sunt loturi de şoareci care au fost supuşi stresului datorat modificării orelor de lumină şi orelor de

întuneric, însă au primit per os extracte de plante medicinale. În vederea determinării efectelor

celor unsprezece plante medicinale asupra stresului indus animalelor de laborator, la nivelul

ficatului s-au evaluat: peroxidarea lipidică – au fost dozaţi peroxizii lipidici şi substanţele care

reacţionează cu acidul tiobarbituric (TBARS);; marker-ii enzimatici ai stresului oxidativ: a fost

evaluată activitatea enzimelor superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT), glutation peroxidaza

(GPx), glutation S transferaza (GST), glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH); marker non-

enzimatic al stresului oxidative - glutationul redus; proteinele totale din ficat. Testele efectuate au

demonstrat că toate extractele polifenolice utilizate au prezentat capacitatea de a atenua, într-o

măsură mai mare sau mai mică, stresul oxidativ la şoarece determinat de modificarea orelor de

lumină şi orelor de întuneric.