1 Prefaţă În plan ştiinţific, progresele din ultimele decenii în descoperirea şi utilizarea unor metode moderne de investigare în domeniul biologiei (microscopia electronică, utilizarea anticorpilor monoclonali, difracţia cu raze X, tehnici de secvenţiere şi amplificare a ADN, utilizarea culturilor de celule, imunoelectroforeze, etc.) a determinat diversificarea cunoştinţelor de biologie moleculară şi apariţia unor noi ramuri noi: genomica, proteomica, transcriptomica, bioinformatica. Astfel, biologia din ştiinţă fundamentală se divide, dobândind noi discipline. Scopul prezentei lucrări intitulată „Biologie celulară şi moleculară” este acela ca bazându-se pe aspectele fundamentale ale biologiei să integreze, armonios, noile descoperiri ştiinţifice din diversele domenii, astfel încât înţelegerea diverselor procese biologice care se desfăşoară în structurile celulare şi subcelulare să fie pe de o parte facilă, iar pe de alta să permită corelarea interrelaţiilor: structură celular-subcelulară, funcţie, interacţiune cu mediul. Lucrarea prezentă se plasează la graniţa manual universitar-tratat deoarece se adresează atât studenţilor cât şi medicilor, biologilor şi chimiştilor preocupaţi de cunoaşterea şi înţelegerea unor aspecte moderne precum: structura moleculară şi funcţiile componentelor celulare, aspectele semnalizării şi diferenţierii celulare, ciclul celular, senescenţa şi apoptoza celulară, sau proliferarea tumorală. Editarea unei astfel de cărţi care prezintă noţiuni de fiziologie, dar şi de patologie celulară, poate fi dublu justificată: vine în sprijinul ideii că viitorul va aparţine unui nou concept-medicina moleculară, iar prin conţinutul său este furnizor de reale competenţe, deoarece prezintă unele date recente referitoare la importanţa diagnosticului molecular şi implicarea biologiei moleculare în etio-patogenia şi terapia unor afecţiuni. Manualul-tratat, deşi cu caracterul cercetărilor fundamentale, dobândeşte şi un specific de multidisciplinaritate şi intersectorialitate, secant altor discipline. Această ultimă particularitate este susţinută inclusiv de materialul ilustrativ inclus, bogat reprezentat, deşi poate prea dens, dar de real folos în realizarea obiectivului propus: înţelegerea biologiei celulare şi moleculare ca ştiinţă fundamentală, în continuă dinamică, cu profunde şi multiple implicaţii în domeniul altor discipline medicale precum genetica, fiziologia, fiziopatologia, farmacologia, medicina internă etc., de la care utilizează achiziţii ştiinţifice, dar pe care le „ajută”. Sursele bibliografice utilizate sunt atent selecţionate, incluzând atât date ştiinţifice considerate deja clasice, cât şi achiziţiile de dată recentă, ceea ce situează acest curs în zona de noutate în domeniu. Importanţa editorială a unei astfel de apariţii este pe deplin atinsă, întrucât ca manual universitar, prin parcurgerea acestor pagini, deschide pentru studenţi porţile unui univers pasionant, denumit ,,celulă”, încă plin de necunoscute ce se aşteaptă descoperite şi înţelese. Pentru practicieni, tratatul reaminteşte datele fundamentale de biologie celulară şi permite fundamentarea ştiinţifică a unora dintre activităţiile medicale, fără a omite „necunoscutele” de moment din domeniu. Prof.dr. Elena Lucia Moldoveanu
Transcript
1
Prefaţă
În plan ştiinţific, progresele din ultimele decenii în descoperirea şi utilizarea unor metode moderne de investigare în domeniul biologiei (microscopia electronică, utilizarea anticorpilor monoclonali, difracţia cu raze X, tehnici de secvenţiere şi amplificare a ADN, utilizarea culturilor de celule, imunoelectroforeze, etc.) a determinat diversificarea cunoştinţelor de biologie moleculară şi apariţia unor noi ramuri noi: genomica, proteomica, transcriptomica, bioinformatica. Astfel, biologia din ştiinţă fundamentală se divide, dobândind noi discipline. Scopul prezentei lucrări intitulată „Biologie celulară şi moleculară” este acela ca bazându-se pe aspectele fundamentale ale biologiei să integreze, armonios, noile descoperiri ştiinţifice din diversele domenii, astfel încât înţelegerea diverselor procese biologice care se desfăşoară în structurile celulare şi subcelulare să fie pe de o parte facilă, iar pe de alta să permită corelarea interrelaţiilor: structură celular-subcelulară, funcţie, interacţiune cu mediul. Lucrarea prezentă se plasează la graniţa manual universitar-tratat deoarece se adresează atât studenţilor cât şi medicilor, biologilor şi chimiştilor preocupaţi de cunoaşterea şi înţelegerea unor aspecte moderne precum: structura moleculară şi funcţiile componentelor celulare, aspectele semnalizării şi diferenţierii celulare, ciclul celular, senescenţa şi apoptoza celulară, sau proliferarea tumorală. Editarea unei astfel de cărţi care prezintă noţiuni de fiziologie, dar şi de patologie celulară, poate fi dublu justificată: vine în sprijinul ideii că viitorul va aparţine unui nou concept-medicina moleculară, iar prin conţinutul său este furnizor de reale competenţe, deoarece prezintă unele date recente referitoare la importanţa diagnosticului molecular şi implicarea biologiei moleculare în etio-patogenia şi terapia unor afecţiuni. Manualul-tratat, deşi cu caracterul cercetărilor fundamentale, dobândeşte şi un specific de multidisciplinaritate şi intersectorialitate, secant altor discipline. Această ultimă particularitate este susţinută inclusiv de materialul ilustrativ inclus, bogat reprezentat, deşi poate prea dens, dar de real folos în realizarea obiectivului propus: înţelegerea biologiei celulare şi moleculare ca ştiinţă fundamentală, în continuă dinamică, cu profunde şi multiple implicaţii în domeniul altor discipline medicale precum genetica, fiziologia, fiziopatologia, farmacologia, medicina internă etc., de la care utilizează achiziţii ştiinţifice, dar pe care le „ajută”. Sursele bibliografice utilizate sunt atent selecţionate, incluzând atât date ştiinţifice considerate deja clasice, cât şi achiziţiile de dată recentă, ceea ce situează acest curs în zona de noutate în domeniu. Importanţa editorială a unei astfel de apariţii este pe deplin atinsă, întrucât ca manual universitar, prin parcurgerea acestor pagini, deschide pentru studenţi porţile unui univers pasionant, denumit ,,celulă”, încă plin de necunoscute ce se aşteaptă descoperite şi înţelese. Pentru practicieni, tratatul reaminteşte datele fundamentale de biologie celulară şi permite fundamentarea ştiinţifică a unora dintre activităţiile medicale, fără a omite „necunoscutele” de moment din domeniu.
Prof.dr. Elena Lucia Moldoveanu
2
Cuprins
Capitolul1. Noţiuni introductive………………………………………………………….8 Capitolul 2. Constituienţii chimici ai celulei……………………………………………..11
Capitolul 3. Membrana celulară. Structura moleculară şi funcţiile membranelor celulare…………………….15
3.1.Structura moleculară a memmbranelor biologice……………………......... 15
3.1.1. Dublul strat lipidic al membranelor biologice……………………... 15
3.1.2. Lipidele majore ale membranelor celulare…………………………. 16
8.2.1. Rolul aparatului Golgi în transportul vesicular al proteinelor…...106
8.2.2. Modificările macromoleculelor la nivelul aparatului Golgi….......108 8.2.2.1. Glicozilarea la azot a proteinelor…………………………108 8.2.2.2. Glicozilarea la oxigen şi asamblarea proteoglicanilor…. ..109
Listă de abrevieri………………………………………………………………………….. 163
Bibliografie…………………………………………………………………………………165
8
1. Introducere
Biologia celulară şi moleculară este disciplina care studiază structurile celulare şi proprietăţile fiziologice ale celulelor, interacţiunea cu mediul, ciclul celular, diviziunea şi moartea celulară, la nivel microscopic şi molecular. Celula este cea mai mică unitate structurală şi funcţională a organismelor vii. Unele organisme sunt unicelulare, altele sunt multicelulare cum este organismul uman care cuprinde 100 trilioane sau 1014 celule. Teoria celulară elaborată în 1839 de Matthias Jakob Schleiden şi Theodor Schwann se bazează pe conceptul că toate organismele sunt formate din una sau mai multe celule vii; în 1855, Rudolf Virchow completează teoria celulară cu conceptul conform căruia toate celulele organismelor vii provin din celule preexistente: "Omnis cellula e celula". Deci, nu există creaţie spontană a celulelor din materie nevie. Această idee a fost demonstrată experimental de Louis Pasteur în 1862. Teoria celulară postulează că funcţiile vitale ale unui organism au sediul în interiorul celulelor şi că toate celulele conţin informaţia ereditară necesară pentru a controla funcţiile celulare şi pentru transmiterea acestor funcţii în următoarea generaţie de celule. În 1880 August Weissman impune ideea că toate celulele vii existente provin dintr-o celulă ancestrală, un strămoş comun. Cuvântul ,,celulă" provine din latinescul ,,cellulae", care este diminutivul cuvântului ,,cella", care semnifică ,,cămăruţă". Termenul descriptiv al celei mai mici structuri biologice viabile a fost atribuit de medicul englez Robert Hooke în cartea sa ,,Micrographia" publicată în 1665, însă în mod eronat, el a considerat celule cămăruţele delimitate de pereţii celulozici observaţi la microscop într-o secţiune fină prin ţesut vegetal. "These pores or cells, were not very deep, but consisted of a great many little boxes, separated out of one continued long pore, by certain diaphragms." Biologia celulară şi moleculară este ştiinţa care s-a desprins din citologia clasică, atunci când instrumentele şi tehnicile achiziţionate au permis acumularea de date experimentale privind arhitectura moleculară şi fiziologia celulei. Aceste acumulări de date noi continuă intens, fiind susţinute de metode de cercetare bazate pe o tehnologie a cărei dezvoltare este uimitoare. Ca ştiinţă, biologia celulară şi moleculară porneşte de la ideea că nu poţi înţelege întregul înainte de a-i descifra părţile, de la ideea că minunile şi misterul vieţii conduc la curiozitatea dar până la urmă şi la necesitatea de a descifra mecanismele de funcţionare ale viului. Ce este viaţa? Progresele actuale din biologia moleculară ne dau speranţă că ne vom apropia de unele răspunsuri şi ne vor oferi soluţii măcar pentru îmbunătăţirea vieţii. Diagnosticul molecular este deja de actualitate, mecanismele moleculare ale multor maladii sunt descifrate, genomica şi proteomica sunt domenii în plină expansiune. Deşi universul nostru pare a fi format pe principiul ,,lumi în interiorul altor lumi”, spiritul uman are calităţi care ne dau speranţa că le vom cunoaşte şi înţelege. Prin parcurgerea celor scrise în paginile de mai jos, sper ca studenţii şi nu numai ei să găsească informaţii care să îi ajute să treacă de prima poartă a cunoaşterii în domeniul biologiei celulei şi moleculare şi să dorească să deschidă următoarele porţi. Există două clase fundamentale de celule: celulele procariote şi celulele eucariote.
9
Caracteristicile celulelor sunt prezentate în tabelul de mai jos:
Tipul de nucleu Regiunea nucleoidului; fără nucleu tipic
Nucleu tipic cu dublă membrană
DNA Mai ales circular Molecule liniare (cromozomi) cu proteine histonice
Sinteza ARN/Proteinelor
Cuplate în citoplasmă Sinteza ARN în nucleu, sinteza proteinelor în citoplasmă
Ribosomii 50S+30S 60S+40S
Structura citoplasmei
Structurată, cu citoschelet, dar mai puţin complex
Înalt structurată prin endomembrane şi citoschelet mai complex
Mişcarea celulară flageli formaţi din flagelină
Flageli şi cili care conţin microtubuli; lamelipodii şi filopodii care conţin actină
Mitocondrii fără Una până la mai multe mii
Cloroplaste fără În alge şi plante
Organizarea Unicelulare O singură celulă, colonii, organisme multicelulare evoluate cu celule specializate
Diviziunea celulară Fisiune binară Mitoză; Meioză
Tabelul 1. Caracteristicile celulelor procariote şi eucariote Celulele eucariote au evoluat dintr-o comunitate simbiotică de celule procariote. Este aproape sigur că organite purtătoare de ADN propriu cum este mitocondria sau cloroplastul sunt ceea ce a mai rămas dintr-o proteobacterie sau cianobacterie străveche simbiontă capabilă de respiraţie aerobă, în timp ce restul componentelor celulelor eucariote actuale par să derive dintr-o celulă procariotă ancestrală de tip archaea, conform teoriei endosimbiozei. Cartea este structurată în capitole care prezintă caracteristicile celulelor eucariote, cu referire predominant la celula umană. Aceste celule în interfază prezintă nucleu cu nucleoli, citoplasmă alcătuită din ecto- şi endoplasmă, plasmalema sau membrana celulară. Apariţia microscopiei electronice a permis studierea plasmalemei, joncţiunilor intercelulare, a prelungirilor: microvili, cili, flageli, caracterizarea membranei duble a nucleului, cu pori şi foiţa externă care se continuă cu membrana RER, unde are loc biosinteza, modificarea, împachetarea şi exportul unor proteine de secreţie sau membranare, caracterizarea nucleolilor
10
în care are loc biogeneza ribozomilor. Au fost studiate organitele celulare: lizosomii se desprind din aparatul Golgi şi conţin hidrolaze cu rol în digestia celulară, peroxisomii în detoxifierea celulară, aparatul Golgi în procesarea lipidelor şi proteinelor sintetizate de celulă, mitocondriile generează energia necesară celulei, capabile de autoreplicare, centrozomul cu doi centrioli, este centrul de organizare microtubulară, vacuolele care sunt organite de depozitare. Cartea parcurge în mod foarte selectiv toate aceste aspecte, inevitabil pentru un domeniu atât de vast şi în continuă expansiune cum este biologia celulară şi moleculară.
11
2. Constituienţii chimici ai celulei
Celula este compusă dintr-un set restrâns de elemente chimice, dintre care patru: C, N, O, H alcătuiesc structuri care reprezintă aproximativ 99% din greutatea unei celule vii. Cea mai abundentă substanţă chimică din celulele vii este apa, care reprezintă 70% din greutatea acestora şi este mediul în care se desfăşoară majoritatea reacţiilor intracelulare, în dependenţă de proprietăţile speciale ale moleculelor de apă: caracterul polar, capacitatea de a forma legături de hidrogen şi tensiunea superficială mare. În celule predomină elementele chimice uşoare, solubile în apă. Atomul de carbon predomină în structura chimică a celulelor, are o masă atomică mică (12), dar formează patru legături covalente puternice cu alţi atomi, generând un număr infinit de mare de molecule simple până la extrem de complexe (pot conţine până la 30 de atomi de C) . N, O, H au de asemenea masă atomică mică (14, 16, 1) şi sunt capabili de a forma legături covalente puternice. Viaţa este posibilă datorită combinaţiei dintre stabilitatea legăturilor covalente în condiţiile fiziologice şi capacitatea catalizatorilor biologici (denumiţi enzime) de a rupe şi reface aceste legături covalente în mod controlat, specific în anumite molecule. Setul de molecule cu funcţia biologică specifică fiecăreia dintre ele, odată stabilit în celula ancestrală, s-a conservat, cu variaţii, de-a lungul bilioanelor de ani de evoluţie celulară. Câteva combinaţii simple de atomi cum este gruparea metil, hidroxil, carboxil şi amino sunt larg răspândite în moleculele biologice. Aceste grupări au proprietăţi fizice şi chimice care determină caracteristicile moleculelor din care fac parte, determinante pentru funcţiile moleculare din celulă. Unele dintre aceste molecule sunt molecule mici, libere în soluţie, în mediul intracelular, unde o parte din ele formează o categorie de intermediari din care are loc sinteza macromoleculelor, altele sunt intermediari esenţiali în căile metabolice sau compuşi de înmagazinare a energiei. Aceste molecule organice mici reprezintă o zecime din totalul moleculelor organice din celulă, dar sunt foarte multe, de ordinul a o mie de tipuri diferite, însă fiind sintetizate din şi degradate în compuşi comuni, având caracteristici chimice comune, pot fi clasificate în patru clase de molecule organice mici: monozaharide, acizi graşi, aminoacizi şi nucleotide. Cele mai simple glucide, monozaharidele, sunt compuşi cu formula (CH2O)n, unde n=3-7. Glucoza, de exemplu are formula C6H12O6. Monozaharidele există sub formă liniară, dar în soluţii monozaharidele cu 5 sau 6 atomi de carbon pot forma un inel heterociclic tip furan-pentaciclu sau piran-hexaciclu. În forma liniară, poate apărea interacţiunea grupării aldehidice sau cetonice cu o grupare hidroxil a aceleiaşi molecule, pentru a forma heterociclul. Carbonul grupării aldehidice sau cetonice poate lega un carbon ce poartă o grupare hidroxil a altui monozaharid, formând un dizaharid. Adiţia mai multor monozaharide în acelaşi mod conduce la formarea macromoleculelor polizaharidice. Pentozele, monozaharide cu 5 atomi de C cuprind ribozele, componentele ribonucleotidelor şi acizilor ribonucleici şi dezoxiribozele, componente ale dezoxiribonucleotidelor şi acidului dezoxiribonucleic. Hexozele sunt monozaharide cu 6 atomi de carbon şi ar fi de menţionat glucoza, care în formă liberă este o sursă vitală de energie, energia şi caracterul reducător sunt înmagazinate apoi sub formă de compuşi intermediari (ATP şi respectiv, NADH).
12
Glicoliza este o cale amfibolică, având semnificaţie funcţională energetică preponderentă în ţesutul muscular în contracţie, ţesutul nervos şi eritrocite şi o semnificaţie biosintetică prin compuşii intermediari pe care îi generează. Manoza, o altă hexoză, intră în constituţia glicoproteinelor sanguine umane. Poliglucidele pot fi omogene, constituite dintr-un singur tip de oze, cum este glicogenul, format numai din resturi de glucoză, unica formă de depozitare a glucidelor în lumea animală în hepatocite, celulele musculare şi în cantitate mai mică şi în alte celule. Heteropoliglucidele dau prin hidroliză amestecuri de monozaharide şi/sau derivaţi ai lor, la care se pot adăuga proteine sau lipide. Cuprind glicozaminoglicanii, numiţi şi mucopolizaharide întâlniţi în special în structura ţesutului conjunctiv (acidul hialuronic-substanţa fundamentală a ţesutului conjunctiv şi cartilaginos, în corpul vitros şi în lichidul sinovial, acizii condroitinsulfurici, keratansulfatul, heparina), iar glicozaminoglicanii legaţi covalent de proteine formează proteoglicanii numiţi şi mucoproteine din substanţa fundamentală a ţesutului conjunctiv sau din mucoase şi lipopolizaharidele de pe suprafaţa externă a peretelui celular al bacteriilor Gram-negative (endotoxine). Lanţuri mai scurte, dar complexe constituite din unităţi monozaharidice sunt aşadar legate de proteine formând glicoproteine sau de lipide, formând glicolipide. Lipidele au trei componente: lipidele simple- acizii graşi, lipidele complexe- fosfolipide şi glicolipide şi lipidele de rezervă- trigliceridele. Acizii graşi au roluri fundamentale în celule: energetic, biosintetic, structural. Acizii graşi sunt catabolizaţi în celule prin β-oxidarea mitocondrială, proces cu rol predominant energetic, cu randament dublu faţă de al glicolizei. Acizii graşi sunt eliberaţi prin degradarea trigliceridelor, proces intensificat de factori hormonali, inaniţie, frig sau compuşi toxici. Prin generarea de acetil-CoA, intermediar în procese biosintetice, rolul lor devine dublu, dar cel mai important rol este cel structural, prin sinteza pornind de la acizi graşi a fosfolipidelor membranare. Fosfogliceridele sunt formate din glicerol esterificat cu 2 molecule de AG, şi o moleculă de acid fosforic. În consecinţă, fiecare moleculă de fosfolipid are o coadă hidrofobă constituită din lanţurile de AG şi un cap hidrofil polar, format din restul de acid fosforic, structură care stă la baza arhitecturii de bistrat lipidic al membranelor biologice. Prostaglandinele, modulatori ai acţiunilor hormonale, ai transmisiei nervoase şi ai schimburilor ionice celulare se formează din acizi graşi nesaturaţi. Sterolii au ca reprezentant principal colesterolul, component structural fundamental al celulelor animale, în special la nivelul membranelor. Hormonii steroidici (sexuali, corticosteroizi) au precursor comun colesterolul. Vitaminele D sunt compuşi de origine steroidă. Există 20 de aminoacizi universal răspândiţi, care intră curent în structura proteinelor. Există AA care nu intră în structura proteinelor, au rol metabolic sau structural important, de exemplu acidul γ-aminobutiric (GABA) este mediator la nivelul SNC, 5-hidroxitriptofanul este precursor al serotoninei, ornitina şi citrulina sunt intermediari în sinteza ureei, etc. Caracteristica comună a acestei clase de constituienţi chimici ai celulei este prezenţa unui grup carboxil şi a unui grup amino, ambele grupări fiind legate de acelaşi atom de carbon denumit α. Sunt subunităţi ale moleculelor proteice care sunt polimeri lungi, liniari, constitutiţi din aminoacizi legaţi prin legături peptidice între gruparea carboxil a unui AA şi gruparea amino a AA următor. Aminoacizii pe care organismul uman nu îi poate sinteza din lipsa unor echipamente enzimatice corespunzătoare sau a lipsei unor precursori disponibili, poartă denumirea de AA esenţiali.
13
Proteinele sunt compuşi macromoleculari, formaţi din mai multe lanţuri polipeptidice, fiecare lanţ polipeptidic fiind alcătuit din câteva zeci până la câteva sute de AA. Proteinele reprezintă 55-85% din greutatea uscată a celulei, pot fi clasificate după structura chimică, funcţia biologică, solubilitate, forma şi împachetarea moleculară, numărul catenelor polipeptidice. După structura chimică, sunt proteine simple (holoproteine), care cuprind scleroproteinele- colageni, elastine, keratine, sferoproteine- albumine, globuline, protamine, histone, gliadine, gluteline şi heteroproteine sau proteine conjugate- metaloproteine (conţin fier, cupru, zinc, mangan, cobalt, molibden, magneziu, cu rol de depozitare sau de transport al acestor metale sau enzime), fosfoproteine, lipoproteine cu grupare prostetică AG, gliceride, fosfolipide, colesterol, nucleoproteinele, cromoproteinele porfirinice (hemoglobina, citocromii, citocromoxidaza, catalaza, peroxidaza), neporfirinice (rodopsina, flavoproteinele) şi glicoproteinele care au ca grupare prostetică glucide (monozaharide, acidul glucuronic, aminoglucide- glucozamina, galactozamina, derivaţi ai monozaharidelor- acidul neuraminic, sialic). Glicoproteinele acide, cu vâscozitate mare, sunt componente esenţiale ale ţesutului conjunctiv: mucoproteinele cu acid mucoitinsulfuric, condroproteinele cu acid condroitinsulfuric, hialoproteinele cu acid hialuronic, sialoproteinele cu acid sialic. Glicoproteinele neutre se găsesc în plasma sanguină (haptoglobina, factorii grupelor sanguine, orosomucoidul), în tractul intestinal - factorul intrinsec cu rol în absorbţia vitaminei B12, în constituţia unor enzime (transferaze), în constituţia unor hormoni (LH, FSH, TSH). Proteinele îndeplinesc următoarele funcţii biologice: formează structuri de rezistenţă-colagen, keratina, sunt proteine contractile- actina, miozina cu rol în contracţia musculară, catalizează reacţii biochimice- enzimele, transportă oxigenul- pigmenţii respiratori (hemoglobina, mioglobina), transportă informaţie- hormonii proteici, recepţionează informaţie- receptorii membranari, intervin în mecanismul imun- imunoglobulinele, sistemul complement, reglează expresia genică- represorii, activatorii, factorii de reglare, histone, pot fi substanţe toxice- toxinele bacteriene. Nucleotidele sunt unităţile structurale fundamentale ale acizilor nucleici, fiind alcătuite dintr-o bază azotată purinică sau pirimidinică, o pentoză (riboza- constituent al ARN şi dezoxiriboza- constituient al ADN) şi acid fosforic. Nucleotidele îndeplinesc următoarele funcţii biologice: rol în metabolismul energetic, ATP fiind cea mai importantă formă de înmagazinare a energiei, accesibilă direct celulei. Alţi compuşi macroergici sunt: GTP, CTP, UTP, etc.; sunt mediatori fiziologici, AMP ciclic este ,,al doilea mesager" în mecanismul de acţiune al hormonilor nesteroizi, rol de ,,al doilea mesager" are şi GMP ciclic, ADP este mediator în agregarea plachetelor sanguine, adenozina produce dilatarea vaselor coronariene, reglând circulaţia sanguină cardiacă; prin policondensarea nucleotidelor se formează acizii nucleici; intră în structura unor coenzime: NAD(P), FAD, CoA, etc.; intră în alcătuirea unor intermediari activaţi în metabolismul celular: UDP-glucoza (biosinteza glicogenului), UDP-galactoza (biosinteza glicoproteinelor), CDP-colina şi CDP-colamina (biosinteza lipidelor); sunt efectori alosterici, reglează activitatea unor enzime. Acizii nucleici sunt macromolecule cu structură liniară (polinucleotide), formate prin policondensarea mononucleotidelor, legătura dintre nucleotide fiind formată prin esterificarea grupării hidroxi din poziţia 3´ a pentozei cu restul fosforic din poziţia 5´ a nucleotidului următor. În funcţie de natura pentozei, acizii nucleici se clasifică în acid ribonucleici care
14
conţin riboză şi acid dezoxiribonucleici, care conţin dezoxiriboză. Bazele azotate ale ADN sunt: adenina, citozina, guanina şi timina, iar ARN conţine: adenina, citozina, guanina şi uracilul. ADN este purtătorul informaţiei ereditare, alcătuieşte genomul tuturor organismelor procariote şi eucariote, precum şi al dezoxivirusurilor. Cantitatea de ADN din celulele unei specii este constantă. La procariote, ADN este localizat în cromozomul bacterian dar şi extracromozomal, în episomi şi plasmide. La eucariote, ADN se gaseşte preponderent în nucleu, este ADN cromozomial şi în cantităţi mici în mitocondrii. Cu cât organismele sunt mai evoluate, cantitatea de ADN este mai mare: la dezoxiribovirusuri 5x10-6 pg/ celulă, la mamifere 6pg/ celulă. Lungimea extinsă a moleculei de ADN la virusurile tumorigene este de 1,5 µm, iar la mamifere lungimea este de 2m. Cele 6 miliarde de nucleotide din celula mamiferelor corespund la peste 1 milion de gene, din care doar 10% codifică proteine şi doar câteva mii sunt transcrise. Structura unui cromozom conţine o moleculă de ADN dublu helix, ADN monocatenar fiind prezent în structura unor dezoxiribovirusuri. ARN sunt clasificaţi în trei tipuri majore: ARN mesager (2-4% din totalul de ARN celular), ARN de transfer (16-18%), ARN ribozomal (80%), la care se adaugă ARN nuclear heterogen, ARN viral şi ARN viroidal. ARNm reprezintă o copie a catenei codogene a ADN, ARNt este localizat cu precădere în citosol şi are rolul de a transporta aminoacizii din citosol la ribozom în cursul biosintezei proteinelor. Există peste 60 de specii moleculare de ARNt , fiecărui AA din cei 20 corespunzându-i cel puţin unul sau mai multe tipuri de ARNt. ARN ribozomal este reprezentat la eucariote de ARNr 5S, ARNr 5,8S, ARNr 28S în subunitatea ribozomală mare şi de ARNr de 18S în subunitatea ribozomală mică. ARN nuclear heterogen este reprezentat de un ansamblu format din ARN premesageri, ARN ribozomali imaturi, alte specii de ARN. Moleculele mici de ARN nuclear şi nucleolar formate din 100-180 nucleotide, participă la reglarea fenomenului de transcripţie. ARN viral este o moleculă monocatenară liniară sau circulară sau dublu catenară liniară. În celule se găsesc şi alte elemente chimice puţin abundente (0,02-0,1%): P, S, Cl, Na, K, Ca, Mg şi oligoelemente (<0,02%): Fe, Cu, Zn, Se, însă lipsa acestor elemente este puternic resimţită de organism, determinând afecţiuni severe. Substanţele minerale se găsesc în organism sub formă disociată (cationii de exemplu Na+, K+, Mg2+, Ca2+ şi anionii cum sunt Cl-, HCO3
-, NO32-, SO4
2-, PO43- de care depinde presiunea osmotică, echilibrul acido-bazic şi
interacţiunea enzimatică) sau în combinaţii cu proteine.
15
3.Membrana celulară. Structura moleculară şi funcţiile membranelor celulare.
Membrana celulară delimitează conţinutul celular, conferă individualitate celulei şi menţine diferenţele esenţiale între citosol şi mediul extracelular. Realizează transportul molecular şi ionic, conexiunile intercelulare şi ancorarea celulelor în matricea extracelulară, este sediul reacţiilor enzimatice asociate structurilor membranare, are rol în semnalizarea celulară, recunoaşterea, legarea şi transmiterea moleculelor semnal care înmagazinează informaţie, precum şi în imunitate.
3.1. Structura moleculară a membranelor biologice
Membranele biologice au o structură general identică, de ,,mozaic fluid" lipido-proteic, cu o grosime de 6-10 nm grosime. Este un fluid structural alcătuit din bistrat lipidic penetrat total sau parţial de molecule proteice; între lipidele şi proteinele membranare există mai ales legături necovalente.
3.1.1.Dublul strat lipidic ( bistratul lipidic) al membranelor biologice
Este o componentă fundamentală de 5nm grosime, observabilă în microscopie electronică. Are structură fluidă, conferă membranelor proprietatea de membrană impermeabilă pentru moleculele hidrosolubile. Structura de bistrat este atribuită proprietăţilor speciale ale lipidelor membranare, care se asociază spontan sub formă de bistrat şi în condiţii artificiale.
Figura1. Structura membranei celulare (imagine preluată din cellbiology.med.unsw.edu.au)
16
3.1.2.Lipidele majore ale membranelor celulare
Lipidele majore ale membranelor celulare reprezintă 50% din greutatea acestora şi sunt reprezentate de trei clase majore: fosfolipidele, colesterolul, glicolipidele. Există 500-1000 de tipuri diferite de lipide în funcţie grupările din capul polar, lungimea şi gradul de desaturare al acizilor graşi componenţi, în care sunt incluse şi lipidele minore, de exemplu fosfatidilinozitolul. Bistratul lipidic conţine 5x106 molecule lipidice/ µm2.
3.1.2.1.Fosfolipidele membranare Clasa fosfolipidelor cuprinde fosfogliceridele şi sfingolipidele şi reprezintă peste 50% din fosfolipidele membranare. Fosfolipidele au caracter amfipatic deoarece sunt formate dintr-o regiune hidrofilă polară sau cap polar şi o regiune hidrofobă nepolară sau cozi hidrofobe. Regiunea hidrofobă este formată din două cozi hidrofobe alcătuite fiecare din câte un acid gras cu 14-24 atomi de carbon, unul fiind acid gras saturat, iar celălalt nesaturat, cu una sau mai multe legături duble de tip ,,cis". Diferenţele în lungimea lanţului de atomi de carbon ai acizilor graşi şi în gradul lor de nesaturare influenţează împachetarea moleculelor lipidice şi fluiditatea bistratului. Prezenţa dublelor legături de tip ,,cis" introduce un punct de inflexiune în catene acidului gras nesaturat.
Figura 2. Bistrat fosfolipidic în care atomii unei molecule fosfolipidice sunt reprezentate ca
sfere (imagine prelucrată din http://courses.washington.edu/conj/membrane/bilayer.htm)
Cele mai numeroase fosfolipide membranare sunt fosfogliceridele. Ele sunt formate dintr-un schelet de glicerină, prin esterificarea a două grupări hidroxil din structura glicerinei cu doi acizi graşi şi a celei de-a treia cu acid fosforic. Gruparea fosfat la rândul ei, leagă diferite tipuri de molecule, formându-se regiunea cap hidrofilă a diferitelor tipuri de fosfogliceride: fosfatidiletanolamine, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilgicerol,
17
difosfatidilglicerol (cardiolipina), fosfatidilinozitol. În acidul fosfatidic gruparea fosfat nu este legată la o altă moleculă polară.
Figura 3. Fosfogliceride membranare ( imagine prelucrată după John M. Owens, Ph.D
http://www.agen.ufl.edu)
Sfingolipidele conţin sfingozină (un aminoalcool) în loc de glicerol. Sfingozina este formată dintr-un lanţ lung nesaturat, cu o grupare amino care leagă un acid gras prin legătură amidică, rezultând structura ceramidică şi două grupări hidroxil, dintre care gruparea hidroxil terminală a sfingozinei leagă prin legătură fosfodiesterică gruparea polară. Sfingolipidul major este sfingomielina.
Figura 4. Structura generală a unui sfingolipid. Structura specifică a unei molecule depinde
de tipul grupării R2 şi de lungimea lanţului hidrofob al acidului gras R1. (imagine prelucrată din
http://www.britannica.com)
18
3.1.2.2.Colesterolul Raportul molecular colesterol:fosfolipide în membranele celulare este de 1:1. Molecula de colesterol se inserează între fosfolipidele membranare, orientându-se cu gruparea hidroxil în vecinătatea capului polar al fosfolipidelor. Inelul steroidic este o structură rigidă, plană, care interacţionează cu lanţul hidrocarbonat adiacent capului polar, lăsând restul cozilor hidrofobe ale acizilor graşi libere, flexibile. Colesterolul modulează proprietăţile bistratului lipidic, intensificând proprietatea de barieră impermeabilă faţă de moleculele mici solubile în apă, influenţează fluiditatea membranei, previne interacţiunea lanţurilor hidrocarbonate ale acizilor graşi din structura lipidelor membranare.
Figura 5. Interacţiunea colesterolului cu fosfolipidele în bistratul lipidic (imagine prelucrată
din http://www.yellowtang.org/chemistry.php)
3.1.2.3.Glicolipidele membranare Glicolipidele membranelor celulare sunt specifice pentru specie, sunt de asemenea tisular-specifice şi reprezintă 5% din moleculele lipidice ale monostratului extern. Conţin un cap polar format din unul sau mai multe resturi glucidice, ataşate la o structură ceramidică. De exemplu, în structura galactocerebrozidelor, sfingozina împreună cu acizii graşi formează o structură ceramidică de care sunt ataşate resturi de galactoză, iar gangliozidele conţin unul sau mai multe resturi de acid sialic (acid N-acetilneuraminic) care imprimă acestor molecule încărcătură negativă. În consecinţă, gangliozidele participă la construcţia moleculară a canalelor ionofore şi la mecanismul de transmitere a informaţiei de la suprafaţa celulei (semnalizarea celulară). Clasele de lipide membranare, datorită structurii şi proprietăţilor lor imprimă membranelor anumite caracteristici:
19
1. Fosfolipidele formează spontan bistratul, deoarece au o regiune hidrofilă sau polară care este capabilă de interacţiuni electrostatice sau prin legături de hidrogen cu moleculele de apă. Regiunile hidrofobe sunt insolubile în apă deoarece nu pot forma interacţiuni energetic favorabile cu moleculele de apă. Ca urmare, moleculele de apă înconjoară moleculele hidrofobe formând structuri asemănătoare unor ,,cuşti", în care moleculele de apă se prezintă într-un aranjament mult mai ordonat decât în apa care constituie mediul înconjurător. Costul energetic este minimalizat dacă moleculele hidrofobe se acumulează cât mai strâns, astfel încât un număr cât mai mic de molecule de apă să fie implicate în înconjurarea lor. Introduse în mediu apos, moleculele cu caracter amfipatic ale lipidelor membranare agregă spontan în aşa mod încât adăpostesc regiunile (cozile) hidrofobe în interiorul structurilor sferice denumite micelii sau plane denumite bistrat lipidic, fiind expuse apei regiunile cap hidrofile. 2. Fosfolipidele se rearanjează spontan, refac bistratul atunci când apar breşe în acesta. 3. Un alt caracter este fluiditatea care stă la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. La o anumită valoare de temperatură denumită temperatură critică, are loc tranziţia de fază, adică trecerea bistratului din stare fluidă în stare de gel, datorită scăderii mobilităţii legăturilor C-C din lanţuri hidrocarbonat ale acizilor graşi din structura fosfolipidelor. Are loc trecerea de la o conformaţie randomică la o conformaţie cu grad superior de ordonare. Valoarea de temperatură la care are loc tranziţia de fază depinde de lungimea şi caracterul nesaturat al lanţurilor hidrocarbonate ale fosfolipidelor. Lanţurile hidrocarbonate mai scurte şi prezenţa legăturilor duble favorizează organizarea randomică datorită scăderii numărului de legături van der Waals dintre regiunile hidrofobe. Fluiditatea depinde şi de conţinutul de colesterol al membranelor, concentraţiile mari de colesterol scad fluiditatea bistratului. Această scădere a fluidităţii are efecte aupra funcţiilor membranei celuare, prin scăderea permeabilităţii pentru apă şi molecule hidrofile şi creşterea rezistenţei mecanice a acestora. Prezenţa glicolipidelor influenţează fluiditatea: gangliozidele se caracterizează prin capacitatea de a participa la formarea legăturilor de hidrogen care determină creşterea gradului de ordonare moleculară şi scăderea fluidităţii. 4. Bistratul lipidic este format din domenii cu compoziţie diferită: forţele van der Waals (forţe de atracţie între lanţurile hidrocarbonate ale lipidelor membranare adiacente) nu sunt suficient de selective pentru a ţine împreună grupurile de molecule fosfolipidice, în consecinţă apar domenii specializate denumite ,,bacuri de lipide". Un exemplu de astfel de domenii sunt caveolele implicate în endocitoză, bogate în colesterol şi sfingolipide, împreună cu proteine specifice cu rol stabilizator al acestor domenii. Un alt exemplu este cel al unor domenii care conţin o proporţie ridicată de sfingolipide care, având lanţuri hidrocarbonate mai lungi, determină la acest nivel o grosime crescută a bistratului, intervenind în organizarea moleculelor proteice pentru a-şi îndeplini funcţiile: de transport, de semnalizare celulară. 5. Organizarea sub formă de monostrat a lipidelor (în loc de bistrat) este caracteristică picăturilor lipidice cu rol în depozitarea trigliceridelor şi colesterolului esterificat, fiind sursă de precursori lipidici pentru sinteza membranelor sau sursă de substrate pentru metabolismul energetic. Monostratul lipidic conţine mari cantităţi de proteine, unele cu funcţie în metabolismul lipidelor, altele cu funcţie necunoscută. Lipidele neutre din aceste picături lipidice sunt molecule hidrofobe care în mediul apos intracelular agregă în picături tridimensionale înconjurate de monostratul lipidic, cu cozile hidrofobe orientate spre
20
conţinutul în lipide neutre, iar cu capetele hidrofile spre mediul apos intracelular. Această organizare este întâlnită în special în adipocite.
3.1.3. Proteinele membranelor celulare
Proteinele membranare sunt moleculele implicate în funcţiile majore ale membranelor celulare. Reprezintă 50% din greutatea membranelor celulare şi 75% din greutatea membranelor mitocondriale, cu o intensă activitate metabolică. Clasificarea acestor proteine s-a făcut după criteriul topografic, dar şi după aspectul interacţiunilor cu moleculele lipidice ale bistratului în două clase: proteine integrale ale membranelor şi proteine periferice (de suprafaţă).
Figura 6. Tipuri de proteine ale membranei celulare (imagine prelucrată din ,,The Cell”,
Geoffrey M. Cooper)
3.1.3.1. Proteinele integrale
Pot penetra membrana în întregime datorită caracterului lor amfipatic: regiunea centrală localizată în interiorul membranei are caracter hidrofob şi interacţionează cu lanţurile hidrocarbonate ale fosfolipidelor, fiind alcătuită din aminoacizi cu caracter nepolar. Legăturile dintre aminoacizi sunt legături peptidice care sunt legături polare şi pentru că apa este absentă în compartimentul hidrofob al membranelor, aceste legături peptidice vor forma punţi de hidrogen între ele. Domeniile hidrofile ale moleculelor proteice vor fi expuse pe faţa extracelulară şi citosolică a membranelor, în contact cu grupările polare ale moleculelor lipidice. Lanţurile polipeptidice ale acestor proteine transmembranare pot realiza unul sau mai multe pasaje prin bistratul lipidic, prezentând conformaţie de α-helix: un pasaj prin bistrat- un α-helix ( ,,singlepass"), mai multe pasaje prin bistrat- mai multe α-helixuri (,,multipass"). Conformaţia de α-helix nu este unica conformaţie a proteinelor transmembranare. Aceste proteine pot prezenta conformaţie a lanţului polipeptidic de β-foaie pliată, care poate fi împachetată sau rulată în continuare în conformaţie de ,,β-barrel", multiplele segmente transmembranare putând satisface în acest caz necesitatea de legături de
21
hidrogen. α-helixurile proteinelor transmembranare au funcţie de ancorare în bistratul lipidic prin compoziţia în aminoacizi hidrofobi. Multe proteine transmembranare care realizează un singur pasaj prin bistrat formează homodimeri datorită interacţiunilor dintre domeniile α-helix adiacente, cruciale pentru structura şi funcţia proteinelor-canal şi proteinelor transportor. Proteinele transmembranare care realizează mai multe pasaje sunt formate din mai multe α-helixuri, toate constituite din aminoacizi hidrofobi, deoarece după sinteza lor în citosol, acestea sunt iniţial integrate în bistratul lipidic de o proteină-translocază, fiind înconjurate de molecule lipidice. Împachetarea moleculei proteice apare ulterior şi apără o parte din α-helixuri de contactul cu lipidele membranare, unele interacţiuni proteine-lipide fiind înlocuite cu interacţiuni proteine-proteine şi α-helix-α-helix, facilitând astfel apariţia unor structuri canal pentru transportul moleculelor hidrofile mici prin membrana hidrofobă . Unele proteine integrale străbat parţial membrana şi sunt integrate în bistrat în moduri diferite: 1. Proteinele prezente pe faţa citoplasmatică, cum este familia de proteine Src kinaze care convertesc semnale extracelulare în semnale intracelulare, conţin acid miristic adăugat la gruparea aminoterminală a proteinei în timpul sintezei în ribozomi- se stabileşte o legătură amidică. Acidul miristic reprezintă o primă ancoră, care se inseră în monostratul citoplasmic al bistratului, însă este o ancoră slabă. Apariţia unei molecule-semnal din mediul extracelular determină adăugarea acidului palmitic la un rest de cisteină al lanţului polipeptidic pentru a ancora mai ferm proteinele Src. Oprirea semnalelor extracelulare conduce la desprinderea acidului palmitic şi desprinderea kinazelor din membrana celulară, urmată de eliberarea lor în citosol şi, fireşte, de inactivarea căii de semnalizare celulară. Inserarea unor proteine cum sunt proteinele p21ras se poate realiza prin legarea unui rest farnezil la un rest de cisteină prin legătură tioesterică, la capătul C-terminal al proteinei. 2. Proteinele situate pe faţa exoplasmică a membranelor celulare se ancorează de monostratul lipidic prin intermediul unui fosfolipid glicozilat care conţine resturi glucidice inozitol şi N-acetilglucozamina.
Figura 7. Proteinele integrale de pe faţa citoplasmică şi exoplasmică a membranei celulare
(imagine prelucrată din ,,The Cell”, Geoffrey M. Cooper)
22
3.1.4. Carbohidraţii membranelor celulare
Reprezintă 2-10% din greutatea componentelor membranare. Oligo- şi polizaharidele se leagă covalent de proteinele sau lipidele membranare formând glicoproteine şi respectiv, glicolipide: majoritatea proteinelor de suprafaţă ale membranelor sunt glicoproteine şi una din zece molecule lipidice membranare sunt glicozilate. Proteoglicanii sunt constituiţi dintr-o componentă proteică în bistratul lipidic şi o componentă polizaharidică. Lanţul polizaharidic rămâne în exteriorul celulei, fiind o componentă a matricei extracelulare.
3.1.5. Mobilitatea proteinelor şi lipidelor în membrana celulară
Mobilitatea proteinelor şi lipidelor în monostratul lipidic se realizează prin difuzie laterală. Un alt mecanism este difuzia rotaţională, care semnifică mişcarea de rotaţie a unei biomolecule în jurul unei axe perpendiculare pe planul membranei. Atât difuzia laterală cât şi cea rotaţională sunt favorizate energetic, deoarece regiunile nepolare ale moleculelor proteice şi lipidice nu părăsesc interiorul hidrofob. Difuzia transversală denumită şi inversiune sau ,,flip-flop" se realizează prin deplasarea moleculelor între cele două monostraturi ale bistratului lipidic. Mobilitatea lipidelor şi proteinelor membranare împreună cu fluiditatea bistratului determină caracterul dinamic al membranelor celulare.
Este o caracteristică cu rol esenţial în realizarea funcţiilor celulare. Distribuţia asimetrică a moleculelor lipidice pe cele două feţe ale bistratului poate fi exemplificată prin structura membranei hematiilor care conţine în monostratul lipidic extern predominant fosfatidilcolină şi sfingomielină, iar în monostratul intern fosfatidiletanolamină şi fosfatidilserină. Consecinţele sunt multiple: diferenţele gradului de nesaturare ale lanţurilor hidrocarbonate ale lipidelor şi natura diferită a grupărilor polare determină diferenţe în fluiditatea celor două monostraturi, apare de asemenea şi o distribuţie diferită a sarcinilor electrice, fosfatidilserina fiind singurul fosfolipid cu sarcină negativă. Importanţa funcţională a asimetriei de distribuţie a componentelor membranare poate fi exemplificată astfel:
a. Activitatea enzimatică a proteinelor asociate membranei este dependentă de sarcina electrică a fosfolipidelor, proteinkinazele necesitând prezenţa fosfatidilserinei cu sarcină electrică negativă.
b. În timpul apoptozei, fosfatidilserina este translocată în monostratul exoplasmic al bistratului lipidic şi expusă astfel pe suprafaţa celulară, semnalizează macrofagelor prezenţa unei celule moarte, acesta fiind semnalul pentru fagocitare. Translocarea fosfatidilserinei în monostratul extern se produce prin inactivarea translocazei care realizează translocări din monostratul extern în cel intern şi activarea scramblazei care transferă fosfolipide nespecific între monostraturile lipidice.
Localizarea glicolipidelor în monostratul extern este implicată funcţional în mecanisme de semnalizare celulară, ele funcţionând ca receptori. De exemplu, toxina holerică
23
se leagă doar de celule care prezintă gangliozide GM1 pe suprafaţa celulară (celulele epiteliului intestinal). Se remarcă localizarea proteinelor membranare, mai precis orientarea strictă, specifică pe faţa exoplasmică sau citosolică a unor domenii ale moleculelor proteice. De exemplu, glicoproteinele au lanţurile oligozaharidice orientate pe faţa externă a membranelor celulare şi pe faţa citosolică a membranelor reticului endoplasmic şi aparatului Golgi. Localizarea asimetrică a lipidelor şi proteinelor determină delimitarea specifică a unor domenii structural-funcţionale ale membranelor celulare: un exemplu ilustrativ este domeniul apical, respectiv laterobazal al membranei celulelor epiteliului intestinal.
3.2. Funcţia de transport a membranelor celulare
Existenţa celulelor depinde de o permanentă comunicare cu mediul înconjurător, iar un rol fundamental în această comunicare o are proprietatea de permeabilitate selectivă a membranelor celulare. Consecinţa este menţinerea homeostaziei celulare, adică asigurarea concentraţiilor intracelulare relativ constante ale substanţelor organice, ionilor, metaboliţilor, menţinerea unei activităţi metabolice stabile şi reglarea volumului celular. Permeabilitatea selectivă este influenţată de metabolismul celular, condiţiile din mediul extracelular şi tipul de ţesut. Transportul diferitelor substanţe prin membrană depinde de caracteristicile substanţei transportate (greutatea moleculară, forma, dimensiunile, gradul de ionizare, gradul de hidratare) şi de compoziţia chimică a membranelor, clasificându-se în: ◘Transport de ioni şi molecule mici prin mecanisme de difuzie sau mecanisme în care sunt implicate proteine membranare. ◘Transport de macromolecule şi particule prin vezicule delimitate de membrane. După consumul de energie metabolică înmagazinată în ATP, transportul prin membranele celulare se clasifică în ◘ transport pasiv şi ◘ transport activ.
3.2.1. Transportul pasiv
Transportul moleculelor şi ionilor prin membrana celulară în sensul gradientului de concentraţie sau electrochimic se numeşte transport pasiv. Decurge fără consum de energie inmagazinată în ATP, câteodată chiar cu pierdere de energie liberă.
3.2.1.1. Difuzia simplă
Caracterizează moleculele mici cu caracter hidrofob şi gazele: CO2, O2. Este cel mai simplu tip de transport pasiv, difuzia simplă fiind determinată de gradientul de concentraţie şi/sau electric al particulelor transportate, de o parte şi de alta a membranei. Moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor molecule în cursul trecerii prin membrană. Difuzia simplă se desfăşoară în următoarele etape:
24
1. Trecerea moleculelor din mediul extracelular sau intracelular apos în interiorul hidrofob al membranei
2. Traversarea bistratului lipidic 3. Deplasarea moleculelor din membrană în mediul apos intracelular sau
extracelular
Viteza cu care se desfăşoară etapa 1 depinde de coeficientul de partiţie (K) al moleculei, care măsoară afinitatea relativă a moleculei pentru mediul lipidic în raport cu apa, altfel spus, ilustrează gradul de hidrofobicitate al moleculei. Cu cât valoarea acestui coeficient este mai mare, molecula este mai hidrofobă (liposolubilă) şi pătrunde mai repede în celulă. Coeficientul de partiţie este direct proporţional cu constanta de permeabilitate a membranelor celulare (P). Viteza de difuzie a moleculelor prin membrană este mult mai mică în mediu apos, deci etapa 2 limitează viteza transportului. Difuzia simplă se desfăşoară conform legii lui Fick dacă avem gradient de concentraţie pe cele două feţe ale membranei:
(dn/dt) = P x S (C1aq – C2
aq)
adică, viteza de difuzie este direct proporţională cu diferenţa de concentraţie, suprafaţa şi coeficientul de permeabilitate al membranelor.
3.2.1.2. Difuzia facilitată a moleculelor şi ionilor
Figura 8. Transportul pasiv prin difuzie facilitată de proteinele canal sau de permeaze
(imagine prelucrată din http://www.brooklyn.cuny.edu)
A. În difuzia facilitată transportul pasiv este mediat de proteine membranare denumite permeaze care au specificitate faţă de molecula transportată, proces cu cinetică de tip enzimatic. Permeaza leagă reversibil la un situs activ pe o faţă a membranei o singură specie moleculară sau molecule ce aparţin unei singure familii: se formează complexul permează-moleculă care traversează bistratul, disociindu-se pe cealaltă faţă a membranei, cu eliberarea moleculei transportate. Viteza cu care are loc difuzia facilitată în funcţie de concentraţia moleculei transportate a evidenţiat existenţa unei relaţii de tip Michaelis-Menten pentru reacţii enzimatice cu un singur substrat. Viteza atinge o valoare maximă atunci când devine independentă de concentraţia substratului: la viteză maximă apare fenomenul de
25
saturare, toate permeazele fiind ,,ocupate", implicate în complexe de tip permează-moleculă de transportat. O altă caracteristică comună între difuzia facilitată şi reacţiile enzimatice este inhibiţia specifică competitivă prin molecule similare sau necompetitivă, de exemplu prin ioni ai metalelor grele sau 2,4 dinitrofluorobenzen. Modelul propus: modelul transportorilor cărăuşi care execută o mişcare de rotaţie în bistratul lipidic care are drept rezultat trecerea moleculelor de pe o faţă pe alta a membranelor celulare. Un exemplu este transportul unor ioni de polipeptide antibiotic (valinomicina transportă în acest mod ionul de potasiu). Un alt model este cel în care permeaza suferă o modificare conformaţională în urma legării moleculei de transportat, consecinţa fiind o modificare conformaţională, formarea unui ,,canal" prin care moleculele pot traversa membrana. Modificarea conformaţională ar determina de fapt orientarea aminoacizilor hidrofili ai permeazei spre interiorul moleculei, care ar delimita ,,canalul" prin care pot trece moleculele hidrofile. B.Difuzia mediată de proteinele canal, proteine transmembranare străbătute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili care formează pori membranari: 1. proteinele canal ionice prin care ionii difuzează cu diferite viteze în sensul gradientului de concentraţie. Sunt de mai multe tipuri în funcţie de modul cum are loc deschiderea lor care este un răspuns celular la stimuli mecanici, sau pot fi canale dependente de voltaj ( potenţialul de membrană) sau de liganzi. Ligandul poate fi un mediator extracelular (neurotransmiţător) sau intracelular (ion, nucleotid, proteină de legare a GTP).
Figura 9. Proteinele canal ionice cu poartă (imagine prelucrată din ,,Molecular Biology of the
Cell”, Bruce Alberts et al.)
Canalele cu poartă comandată de voltaj Celulele excitabile (neuronul şi celulele musculare) suferă modificări controlate ale valorilor potenţialului de membrană, asigurându-se conducerea impulsului electric de-a lungul membranei plasmatice. Celulele aflate în stare de repaus se caracterizează prin potenţial de membrană denumit potenţial de repaus. În prezenţa unui stimul, se produce o excitaţie electrică rapidă, autopropagabilă, cu caracter tranzitoriu denumită potenţial de acţiune care
26
generează un ciclu de depolarizare a membranei, hiperpolarizare, revenire la starea de repaus, asociate creşterii tranzitorii a permeabilităţii membranei celulare pentru ionii de Na şi K, datorită conformaţiilor moleculare alternative ale proteinelor canal în funcţie de diferenţa de potenţial. Depolarizarea este determinată de creşterea permeabilităţii pentru Na+, în consecinţă ionii de Na pătrund în celule datorită gradientului de concentraţie ionică şi potenţialului de repaus. Se deschid şi proteinele canal pentru K+, se produce efluxul ionilor de potasiu. Există două opţiuni în acest moment: anularea generării potenţialului de acţiune sau dezvoltarea potenţialului de acţiune, în funcţie de permeabilitatea pentru Na/K. Dacă permeabilitatea pentru ionii de sodiu este mai mare decât permeabilitatea pentru ionii de potasiu, influxul de Na este mai mare decât efluxul de K: se produce accentuarea depolarizării locale a membranei şi apare potenţialul de acţiune. La un prag de +35 mV canalele de Na+ sunt închise-inactive şi membrana fiind refractară la noi stimuli, este posibilă restabilirea potenţialului de repaus. Proteinele canal pentru Na+ sunt formate din patru domenii transmembranare, fiecare alcătuit din câte şase α-helixuri. Al 4-lea α-helix din fiecare domeniu este alcătuit din aminoacizi încărcaţi pozitiv ( arginină, lizină), cu rol de senzor voltaic. Canalele cu poartă comandată de liganzi. Structurile joncţionale specializate în transmiterea semnalelor de la neuroni la celule-ţintă: neuroni sau celule musculare, poartă denumirea de sinapse, care pot fi electrice sau chimice. Sinapsele chimice implică eliberarea de către neuroni a neurotransmiţătorilor care acţionează asupra celulelor-ţintă, împachetaţi sub formă de vezicule sinaptice în terminaţia axonală a neuronului presinaptic. Eliberarea neurotransmiţătorului în placa sinaptică determină creşterea concentraţiei de Ca++ în celula presinaptică, ca urmare a deschiderii canalelor pentru Ca++ cu poartă comandată de voltaj, în momentul apariţiei potenţialului de acţiune. Legarea neurotransmiţătorilor de receptorii membranari ai celulei postsinaptice determină modificarea conformaţiei acelui receptor, deschiderea canalului ionic, adică modificarea permeabilităţii locale a membranelor urmată de depolarizare şi propagarea potenţialului de acţiune. De exemplu, legarea acetilcolinei la receptorul nicotinic creşte local permeabilitatea membranei postsinaptice pentru Na+ şi K+ , apare depolarizarea membranei şi este generat potenţialul de acţiune. La rândul său, propagarea potenţialului de acţiune determină deschiderea proteinelor canal pentru Na+ (comandate de voltaj) din sarcolemă, depolarizarea membranei reticulului sarcoplasmic şi eliberarea Ca++ în citosol. Creşterea concentraţiei intracelulare a calciului determină contracţia musculară.
2. proteinele canal ionice de repaus, dintre care cel mai reprezentativ este canalul de K+ a cărui existenţă explică permeabilitatea mare a membranelor celulare pentru ionii de potasiu şi rolul major al K+ în menţinerea potenţialului de membrană. Există peste 100 de tipuri de canale pentru ioni. Canalul de K+ este dotat cu aminoacizi încărcaţi electronegativ care atrag cationii şi cu un filtru ion-selectiv alcătuit de atomii de oxigen ai grupărilor carbonil.
27
Figura 10. Modul de acţiune al filtrului ion-selectiv care permite trecerea selectivă a ionilor în
funcţie de dimensiunea lor: distanţa dintre ionul de potasiu şi oxigenii carbonil ai filtrului este
aceeaşi cu distanţa dintre ionul de potasiu şi atomii de oxigen ai apei care înconjură ionii când
aceştia sunt în mediul apos (înainte de intrarea în filtru).Ionii de sodiu sunt de dimensiuni mai mici,
distanţa dintre aceşti ioni şi oxigenul carbonil al filtrului este mai mare decât distanţa dintre ionii de
sodiu şi atomii de oxigen ai apei, deci ei nu pot interacţiona cu oxigenii carbonil ai filtrului, rămân în
soluţie apoasă nefiind preluaţi de proteina canal cu filtru selectiv pentru potasiu.(imagine prelucrată
din http://www.aquaporins.org/aquaporins/ion.htm)
Datorită transportului selectiv al ionilor prin membrana plasmatică şi a diferenţelor de compoziţie ionică dintre citosol şi mediul extracelular, cele două feţe ale membranei sunt diferite din punctul de vedere al încărcăturii electrice: faţa citoplasmică este încărcată negativ în raport cu faţa exoplasmică, deci există o diferenţă de potenţial electric denumită potenţial de membrană. Transportul unei specii ionice prin aceste proteine canal depinde de gradientul de concentraţie ionică şi valoarea potenţialului de membrană, care împreună formează gradientul electrochimic. Menţinerea stabilităţii potenţialului de membrană se realizează prin mecanisme în care proteinele canal pentru K+ au un rol central. Pomparea ionilor de Na în spaţiul extracelular prin activitatea Na+/K+ ATPazei conduce la creşterea numărului sarcinilor electrice pozitive pe faţa exoplasmică a membranelor şi la apariţia unui exces de sarcini electrice negative pe faţa citoplasmatică datorită anionilor organici intracelulari. Restabilirea echilibrului se produce datorită influxului de K+ prin funcţionarea Na+/K+ ATPazei, dar şi prin difuzia lor liberă prin canalele de K+. Influxul de potasiu are loc împotriva gradientului de concentraţie, sub acţiunea forţelor de atracţie electrostatică determinate de sarcinile electrice negative din celulă.
3. canalele de transport pentru apă (aquaporinele) Sunt impermeabile pentru ioni: Na+, K+, Ca++, Cl¯ , H+, deoarece sunt prevăzute cu canale înguste care permit moleculelor de apă să treacă urmând calea oxigenului carbonil şi aminoacizilor hidrofobi care flanchează constricţiile aquaporinelor. Porul este prea îngust pentru a permite ionilor hidrataţi să traverseze, iar dehidratarea ionilor implică consum energetic foarte ridicat care nu poate fi compensat deoarece peretele de aminoacizi hidrofobi nu poate interacţiona cu ionul dehidratat pentru a compensa pierderea apei. Aquaporinele
28
sunt impermeabile pentru ionii de hidrogen. Cei mai mulţi H+ sunt prezenţi în celulă sub formă de H3O
+, ruperea şi desfacerea legăturilor de H dintre moleculele de apă decurgând extrem de rapid. Aquaporinele au resturi de asparagină plasate strategic, care se leagă de atomul de oxigen al moleculei de apă. Doarece ambele valenţe ale atomului de oxigen sunt ocupate, ele nu mai sunt disponibile pentru a lega protoni. Au fost identificate 13 tipuri de aquaporine în membranele celulelor umane, membri ai unei familii de proteine majore intrinseci de membrană, care transportă apa în şi din celulă, prevenind trecerea ionilor şi altor substanţe. Prima aquaporină descoperită a fost AQP1 din membrana eritrocitului, a cărei existenţă a fost raportată de profesor dr. Gheorghe Benga de la Universitatea de Medicină şi Farmacie ,,Iuliu Haţieganu” din Cluj-Napoca, în 1986. Încercările de izolare ale antigenului Rh, evidenţiau constant o proteină asociată de 28 kDa, necunoscută, cu funcţie nedeterminată, dar cu prezenţă constantă în membrana hematiilor şi în membranele celulelor tubilor renali. Peter Agre este cel care izolează şi caracterizează această proteină cu funcţie de transport al apei, după ce mult timp a fost suspectat un mecanism adiţional de transport al apei care ar explica permeabilitatea mare pentru apă a membranelor unor tipuri de celule, permeabilitate care nu poate fi explicată prin simpla osmoză. Pentru activitatea sa de caracterizare şi demonstarare a existenţei aquaporinelor, Peter Agre primeşte premiul Nobel în 2003. Aquaporinele sunt formate din 6 domenii α-helix transmembranare care determină 5 bucle interhelicale (A-E) care formează domeniile extracelulare şi citosolice ale proteinei. Buclele B şi E sunt buclele hidrofobe care conţin un motiv înalt conservat Asn-Pro-Ala (NPA) care prin suprapunere în porţiunea centrală hidrofobă a bistratului lipidic, formează una din cele două constricţii ale aquaporinei în formă de clepsidră. Cealaltă constricţie, mai îngustă, este filtrul selectiv ar/R (aromatic/Arg), care slăbeşte legăturile de H dintre moleculele de apă, permiţând acestora să traverseze porul îngust al aquaporinelor şi să interacţioneze cu resturile de arginină încărcate pozitiv datorită valenţei negative a oxigenului. În acelaşi timp este oprită trecerea protonilor prin această proteină-canal ( ionii hidroniu H3O
+ sunt încărcaţi pozitiv). AQP1 se găseşte în membrana bazolaterală şi apicală a celulelor epiteliale din tubii contorţi proximali, ansa lui Henle şi vasa recta, în membranele hematiilor, endoteliilor vasculare şi tractului gastrointestinal. AQP2 se găseşte în ductul colector principal al rinichilor şi este controlată de vasopresină, mutaţii în gena AQP2 determină diabetul insipid. AQP2 apare în membrane intracelulare. Tipurile 3 şi 4 sunt răspunzătoare de reabsorbţia apei la nivelul ductelor colectoare medulare din rinichi. Tipurile 3, 7, 9 şi 10 sunt aquagliceroporine, canale care transportă glicerol şi apă. Dacă aquaporinele au un rol crucial în menţinerea homeostaziei apei, rolul lor fiziologic şi patologic ca transportori ai glicerolului nu este elucidat deplin. Adipocitele sunt sursa majoră de glicerol, substrat pentru gluconeogeneza hepatică. Aquaporinele 7 şi 9 (AQP7, AQP9) sunt canale pentru glicerol în adipocite şi hepatocite, care menţin balanţa optimă între eliberarea glicerolului din adipocite şi preluarea acestuia în hepatocite.
29
Figura 11. Structura aquaporinelor, constricţia cu resturi NPA şi interacţiunea moleculelor de
apă cu resturile de asparagină (imagine prelucrată din
Pentru a menţine constantă concentraţia ionică a mediului intracelular, celula şi-a creat mecanisme de transport activ, capabile să deplaseze moleculele şi ionii în sens invers gradientelor de concentraţie şi electrochimice, datorită consumului de energie metabolică.
3.2.2.1. Transportul activ propriu-zis
În acest tip de transport, proteina-transportor are şi funcţie ATPazică şi utilizează energia eliberată prin hidroliza ATP în procesul de transport. Aceste proteine transportoare sunt clasificate în: Clasa ATPazelor de tip P care au ca reprezentant major Na+-K+ ATPaza răspunzătoare de eliminarea activă din celulă a ionilor de sodiu concomitent cu acumularea intracelulară a ionilor de potasiu. Menţinerea constantă a concentraţiei intracelulare de K+ prin funcţia acestei pompe asigură condiţii pentru desfăşurarea biosintezei proteinelor, activităţii unor enzime şi menţinerii potenţialului de membrană.
30
Figura 12. Na+-K+ ATPaza (imagine prelucrată din http://www.bio.miami.edu)
Un alt reprezentant este Ca2+ATPaza care este situată la nivelul membranei celulare şi are rolul de a scoate ionii de calciu din celule, pentru menţinerea unei concentraţii intracelulare potrivite desfăşurării proceselor de semnalizare celulară. Pe de altă parte, Ca2+ ATPaza localizată în membrana reticulului sarcoplasmic din celulele musculare, scade concentraţia intracelulară de Ca2+ prin transportul activ al acestor ioni în lumenul reticulului în timpul relaxării musculare.
Figura 13. Reglarea concentraţiei intracelulare de Ca++ prin activitatea Ca++ ATPazelor din membrana
celulară şi sarcolemă (imagine prelucrată din http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem)
Clasa ATPazelor de tip V cuprind pompele de protoni (H+ATPazele) care au funcţia de a pompa protoni prin membrana celulară a unor tipuri de celule (renale, osteoclaste, macrofage, neutrofile, spermatozoizi, celule tumorale, fiind implicate în procese ca homeostazia, resorbţia osoasă, transportul cuplat prin membrană, fecundarea ovulului de spermatozoid, metastazarea tumorală. H+ATPazele localizate la nivelul membranelor
31
endosomale şi lizosomale determină scăderea pH-ului din interiorul acestor organite.
Clasa ATPazelor de tip F din membrana mitocondriilor utilizează gradientul protonic pentru a sintetiza ATP (cuplează sinteza ATP cu transportul H+ de la concentraţii ridicate la concentraţii scăzute).
Figura 14. Comparaţie structurală a ATPazelor de tip V şi F. V-ATPazele hidrolizează ATP prin
domeniul periferic V1 şi realizează transportul de protoni prin domeniul transmembranar
integral V0. F-ATPazele (sau ATP sintetazele) funcţionează în sensul sintezei de ATP, prin cuplarea
mişcării protonilor în direcţie opusă prin F0 cu sinteza ATP in F1. Ambele enzime operează prin
mecanism rotaţional.
Clasa ATPazelor de tip ABC se remarcă printr-un număr mare de molecule ce aparţin acestei clase, implicate în mecanisme cu semnificaţie în domeniul clinic. Dacă ABC ATPazele bacteriene realizează importul de ioni, aminoacizi, peptide, proteine, mono- şi polizaharide necesare acestor celule, ATPazele ABC ale eucariotelor sunt specializate pentru export. O astfel de ATPază este proteina de multirezistenţă la medicamente (,,multidrug resistance protein" MDR ) care este supraexprimată în celulele tumorale umane, determinând rezistenţă simultană la o varietate de medicamente citotoxice larg utilizate în chemoterapie, 40% din cancerele umane având rezistenţă multimedicamentoasă. ABCATPazele din membrana reticulului endoplasmic transportă în lumen peptide provenite din degradarea citosolică a proteinelor virale sau microbiene. Aceste peptide ajung din lumenul RE pe suprafaţa celulară fiind recunoscute de limfocitele T citotoxice, care în acest mod suprimă celulele infectate.Un alt reprezentant al acestei clase este proteina CTFR (,,cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"), care este un transportor al ionilor de clor prin
32
membranele celulelor producătoare de mucus, salivă, transpiraţie, lacrimi sau enzime digestive. Transportul clorului prin membranele celulare are rol în reglarea transportului de apă pentru menţinerea fluidităţii secreţiilor şi mucusului, dar şi în reglarea transportului membranar de sodiu. Deleţia unui aminoacid din poziţia 508 a proteinei CTFR determină un blocaj al transportului de apă şi sare (NaCl) prin membrane, cu producerea de către celulele care căptuşesc căile respiratorii sau canalele secretorii ale pancreasului a unui mucus vâscos ce obstruează aceste căi. Mucusul cu aceste caracteristici defavorizează funcţia ciliară şi favorizează infecţii bacteriene cronice.
3.2.2.2. Sistemele de cotransport
Proteinele transportor de tip ATPazic nu sunt singurele răspunzătoare de transportul activ prin membranele celulare. Celulele au o clasă secundară de proteine care importă sau exportă ioni şi molecule mici cum sunt glucoza sau aminoacizii împotriva gradientului lor de concentraţie, fără consum de energie provenită din hidroliză de ATP. Proteinele care realizează cotransport utilizează energia gradientului electrochimic al Na+ sau H+ pentru a transporta simultan o altă substanţă, proces denumit cotransport. Când molecula/ionul transportat şi ionul cotransportat trec prin membrană în aceeaşi direcţie, procesul se numeşte simport, iar când trec în direcţii opuse, procesul este antiport. Un exemplu de cotransport este importul glucozei sau aminoacizilor în celulele epiteliului intestinal sau al tubilor renali împotriva gradientului lor de concentraţie prin cuplarea cu transportul în celulă al ionilor de Na.
Figura 15. Simportul Na+-glucoză/aminoacizi (imagine prelucrată din http://www.biochem.arizona.edu)
Mişcarea Na+ din mediul extracelular în celule este determinată de două forţe: gradientul de concentraţie (concentraţia Na+ este scăzută în mediul intracelular faţă de cel extracelular) şi de potenţialul de membrană (faţa citoplasmică a membranelor celulare fiind încărcată negativ în raport cu faţa exoplasmică). Pentru fiecare doi ioni de sodiu transportaţi
33
în celulă se produce cotransportul unei molecule de glucoză. În aceelaşi timp, activitatea Na+-K+ATPazei asigură menţinerea gradientului de concentraţie al Na+
şi simportul continuu al Na+-glucozei/AA în celulele epiteliale. Transportul transcelular al glucozei şi aminoacizilor din lumenul intestinal sau tubii renali în sânge este condiţionat de polaritatea celulelor epiteliale: membrana apicală conţine proteina simport Na+- glucoză/aminoacizi, iar membrana latero-bazală deţine pompe de tip Na+-K+ATPază şi proteine (permeaze) care mediază difuzia facilitată a glucozei şi aminoacizilor în circulaţie. Celulele miocardice au o proteină membranară denumită sistem antiport Na+-Ca2+ care are un rol mai important în menţinerea unei concentraţii intracelulare scăzute de Ca2+ în aceste celule, importul a trei ioni de sodiu fiind însoţit de exportul unui ion de calciu împotriva gradientului său de concentraţie (concentraţia extracelulară de Ca2+ este de 10000 de ori mai mare decât cea intracelulară). Creşterea concentraţiei intracelulare de calciu determină contracţia, iar activitatea antiportului Na+-Ca++ care scade concentraţia intracelulară de calciu reduce forţa contracţiilor inimii. Gradientul de Na+ necesar funcţionării acestui antiport este furnizat prin activitatea Na+-K+ATPazei. Ouabaina şi digoxina cresc contracţiile musculaturii cardiace în insuficienţă cardiacă congestivă, prin inhibarea Na+-K+ATPazei, ceea ce determină creşterea concentraţiei intracelulare de Na+ şi reducerea activităţii sistemului antiport Na+-Ca2+, cu creşterea concentraţiei intracelulare de ioni de calciu, consecinţa fiind creşterea forţei de contracţie a miocardului.
Figura 16. Ca++ este transportat în celulă prin canalele pentru Ca++ (1) sau prin antiportul Na+-Ca++(2), iar scăderea concentraţiei intracelulare a calciului se realizează prin Ca++ATPaza din membrana plasmatică (3) şi antiport Na+-Ca++ (2), dar şi prin sechestrarea Ca++ în reticulul sarcoplasmic, nucleu şi mitocondrie sau de către proteine din citosol-calmodulina, calsequestrina. Reticulul sarcolasmic, ca şi învelişul nuclear posedă Ca++ATPază, iar transportul Ca++ în mitocondrie are loc prin transportor de tip uniport (imagine prelucrată din http://ehp.niehs.nih.gov)
Proteina antiport Cl¯ /HCO3¯ denumită proteina AE1 este proteina integrală de
membrană predominantă în eritrocitele mamiferelor. Schimbul unui anion de clor contra unui anion bicarbonat nu implică modificări ale încărcăturii electrice a membranei, antiportul fiind
34
dependent doar de gradienţii de concentraţie ai celor doi anioni pe cele două feţe ale membranei. CO2 eliberat din celule ajunge în sângele capilar, difuzează prin membrana eritrocitului şi este transformat în bicarbonat solubil în apă (anionul HCO3
-), reacţie catalizată de anhidraza carbonică:
Eliberarea O2 din oxihemoglobină induce o schimbare conformaţională în polipeptidul globină, care permite unei histidine să lege protonul produs în reacţia catalizată de anhidraza carbonică cu formare de hemoglobinat acid. HCO3
¯ format este transportat din eritrocit prin acivitatea antiportului Cl¯ /HCO3
¯ , la schimb cu Cl¯ , care pătrunde în eritrocit.
Figura 17. Transportul CO2 de la ţesuturi la plămâni mediat de antiportul Cl¯/HCO3¯ (imagine
prelucrată din ,,Mollecular Cell Biology", H.Lodish et al.)
La nivelul capilarelor pulmonare, procesul este invers. CO2 difuzează din eritrocite, scăderea concentraţiei citosolice a CO2 determină activarea anhidrazei carbonice care
35
catalizează reacţia de la dreapta la stânga, în sensul formării CO2 şi OH¯ . Prin legarea oxigenului la hemoglobină, este eliberat protonul, care formează cu OH¯ molecula de apă. Scăderea concentraţiei intracelulare a HCO3
¯ datorită activităţii anhidrazei carbonice determină pătrunderea HCO3
¯ în celulă, la schimb cu Cl¯ . Dacă schimbul anionic prin proteina AE1 nu ar avea loc, HCO3
¯ s-ar acumula în eritrocite şi ar genera mult CO2, modificând pH-ul citosolic eritrocitar, care devine alcalin. Aproximativ 80% din CO2 din sânge este transportat prin mecanismul de generare al bicarbonatului în eritrocite. Sistemul antiport Cl¯ /HCO3
¯ permite transportul unor mari volume de CO2 de la ţesuturi spre plămâni, schimbul HCO3
¯ cu Cl¯ menţine pH-ul citosolic neutru.
În reglarea pH-ului celular, un rol esenţial au proteinele cotransportor Na+HCO3−/Cl−
şi antiportul Na+/H+. Metabolismul anaerob al glucozei produce acid lactic, iar metabolismul aerob produce mari cantităţi de CO2, care este hidratat de anhidraza carbonică la acid carbonic. Acest acid slab disociază, crescând concentraţia intracelulară de protoni, pH-ul celular devine acid, afectând metabolismul celulelor. Proteina antiport Na+HCO3
−/Cl− importă un ion de sodiu în sensul gradientului său de concentraţie, împreună cu ionul bicarbonat şi exportă la schimb un ion de clor împotriva gradientului de concentraţie. HCO3
− importat se combină cu protonii, generând CO2, care difuzează din celule. Antiportul Na+/H+ importă un ion de sodiu în sensul gradientului de concentraţie şi exportă la schimb un proton. Aceste sisteme de export de protoni sunt activate de scăderea pH-ului intracelular, care stimulează antiportul Cl−/HCO3
−, determină intensificarea importului de HCO3− şi
normalizarea pH-ului citosolic la valori de 7,4. Menţinerea pH-ului fiziologic creează condiţiile desfăşurării normale a proceselor de sinteză de ADN, ARN, de biosinteză a proteinelor (creşterea şi diviziunea celulară) şi activitatea enzimelor implicate în desfăşurarea altor căi metabolice celulare.
3.2.3. Transportul macromoleculelor şi particulelor prin membrana celulară
Transportul proteinelor, polinucleotidelor, polizaharidelor şi particulelor prin membrana celulară se desfăşoară prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Transportul mediat de vezicule cuprinde: 1.Exocitoza prin care molecule sintetizate în celulă sunt secretate în spaţiul extracelular 2.Endocitoza prin care are loc transportul în celulă al unor molecule sau particule din fluidul interstiţial 3.Fagocitoza care reprezintă ingerarea de către celule specializate a unor particule de ordinul micrometrilor: bacterii, debriuri celulare 4.Transcitoza este procesul prin care moleculele sau particulele pătrunse în celulă prin endocitoză străbat spaţiul celular fiind exportate din nou printr-o altă regiune membranară decât cea prin care au pătruns. Caracterele comune ale acestor tipuri de transport mediat de vezicule sunt: sechestrarea moleculelor sau particulelor în vezicule, transportul strict direcţionat, procesele de fuziune ale veziculelor cu membrane.
36
1.Exocitoza este procesul pe care se bazează secreţia celulară a componenţilor structurali membranari şi extracelulari şi a unor proteine solubile cum sunt moleculele-semnal (hormonii, neurotransmiţătorii), enzimele. Proteinele de export sunt sintetizate în ribozomii ataşaţi reticulului enpoplasmic rugos, sunt procesate şi sortate în aparatul Golgi, de unde se desprind veziculele care conţin proteinele de secreţie, vezicule care traversează spaţiul celular, fuzionează cu membrana celulară şi deversează conţinutul în spaţiul extracelular. Componentele lipidice şi proteice ale membranelor veziculelor sunt încorporate în membrana celulară şi apoi recuperate prin endocitoză şi reutilizate la nivelul aparatului Golgi, de unde se desprind noi vezicule. Exocitoza este de două tipuri: Ca2+ dependentă non-constitutivă şi Ca2+ independentă constitutivă. Exocitoza la nivelul sinapselor chimice neuronale este un exemplu de exocitoză Ca2+ dependentă şi are ca finalitate semnalizarea interneuronală. Exocitoza constitutivă este caracteristică tuturor celulelor şi are ca finalitate eliberarea componenţilor matricii extracelulare şi a proteinelor structurale de membrană care vor fi încorporate în membrana plasmatică după fuziunea veziculelor cu aceasta. Transportul intracelular al veziculelor de exocitoză implică activitatea proteinelor-motor asociate citoscheletului actinic şi tubulinic. Urmează captarea veziculelor de către membrana-ţintă cu care va avea loc fuziunea. Captarea implică legături care limitează mobilitatea veziculelor, dar nu sunt foarte rigide şi au o lungime >25 nm. Ancorarea veziculelor la membrana plasmatică se realizează prin interacţiunea stabilă a celor două membrane, la distanţa de 5-10nm, care implică rearanjări moleculare şi apariţia unor structuri încolăcite extinse. O altă etapă este condiţionarea care însă este caracteristică doar exocitozelor Ca2+ dependente neconstitutive, este etapa care include modificările moleculare ale proteinelor ATP-dependente şi ale lipidelor, astfel încât infuzia de ioni de calciu să declanşeze secreţia, de exemplu a neurotransmiţătorilor. Fuziunea membranei plasmatice cu membrana veziculelor este mediată de proteinele SNARE, fiind finalizată fie prin eliberarea conţinutului veziculei (enzime, hormoni, neurotransmiţători, toxine) în spaţiul extracelular, fie de încorporarea unor componente ale membranei veziculare (proteine, lipide) în membrana ţintă (de exemplu membrana celulară). Ultimul proces e important pentru menţinerea compoziţiei/dimensiunilor membranei celulare, sau dimpotrivă, pentru schimbarea rapidă a acestora ca răspuns la semnale exterioare. Mai mult, în acest fel se asigură modificarea suprafeţei membranei în timpul creşterii celulei. Proteinele SNARE (,,Soluble NSF Attachment Protein Receptors") mediază fuziunea veziculelor cu membrana plasmatică sau cu membranele lizosomale. Proteinele v-SNARE sunt localizate în membranele veziculelor, iar t-SNARE sunt localizate în membranele-ţintă. Cele mai bine studiate sunt cele implicate în fuziunea veziculelor sinaptice cu membrana presinaptică, fiind ţinta neurotoxinelor bacteriene care produc tetanosul şi botulismul. Domeniul citoplasmic al acestor proteine, motivul SNARE alcătuit din 60-70 de aminoacizi este capabil de asamblare reversibilă în complexe strânse alcătuite din teancuri de câte 4 α-helixuri, denumite complexe trans- SNARE. Moleculele proteice implicate în formarea complexelor de fuziune sunt: sintaxina1 (1 α-helix) şi SNAP-25 (2 α-helixuri) din membrana celulară şi sinaptobrevina (1 α-helix) din membrana veziculară. Complexul trans-SNARE este format din proteine SNARE ancorate în membrane ,,trans" aflate în opoziţie înainte de fuziune. După unirea membranelor, proteinele SNARE formează un complex ,,cis" fiind localizate în membrana unică, rezultată în urma fuziunii. Influxul de calciu completează
37
fuziunea, prin interacţiunea senzorului pentru calciu denumit sinaptotagmin cu lipidele membranare şi complexul trans-SNARE. Energia eliberată în cursul asamblării complexului SNARE este utilizată pentru a contracara forţele de respingere dintre membrane.
Figura 18. Complex de fuziune între membrana veziculei de exocitoză şi membrana-ţintă (imagine prelucrată după autorul Danko Dimchev Georgiev, M.D.)
2.Endocitoza este un proces de importanţă vitală pentru celule, intervenind în preluarea nutrienţilor din mediul extracelular, în adeziunea şi migrarea celulară, semnalizarea celulară prin receptori, neurotransmisia, prezentarea antigenelor, polaritatea celulară, diviziunea, creşterea şi diferenţierea celulară şi importul unor medicamente în celule. În funcţie de mecanism, se cunosc mai multe tipuri de endocitoză: a.endocitoză mediată de receptor, un mecanism de transport specific, deoarece receptorul membranar recunoaşte şi leagă macromolecule care intră în celulă sub formă de complex receptor-ligand. Implică existenţa unor regiuni specializate ale membranei celulare, care au aspectul unor depresiuni şi pe a căror faţă citoplasmică se află o reţea proteică. Componentul major al acestei reţele proteice este clatrina, alcătuită din şase lanţuri polipeptidice care formează o structură caracteristică de stea cu 3 braţe (,,triskelion"). Prin asamblarea moleculelor de clatrină se formează o reţea polihedrală care dă veziculelor de endocitoză aspectul de vezicule ,,îmbrăcate". După formarea veziculelor, reţeaua polihedrală se destramă, clatrina şi celelalte proteine ale reţelei sunt reciclate, ajungând din nou în membrană formând noi regiuni specializate pentru endocitoză. Depresiunile membranare ,,îmbrăcate" pot concentra şi internaliza numeroase tipuri de molecule deoarece conţin receptori responsabili pentru endocitoza mediată a acestor liganzi, cum sunt: LDLcolesterolul, transferina, factori de creştere, anticorpi, etc. Endocitoza mediată de receptor are loc şi prin vezicule de endocitoză fără înveliş de clatrină. Regiunile specializate ale membranei fără clatrină deţin o proteină denumită caveolină care leagă colesterolul şi au un bistrat lipidic bogat în colesterol şi glicolipide. Sunt abundente în celulele musculaturii netede, pneumocite, fibroblaste, adipocite şi celule endoteliale, au formă tipică de grotă, de unde şi denumirea lor.
38
Figura 19. Mecanismul endocitozei mediate de receptor prin vezicule ,,îmbrăcate” de clatrină. Proteinele adaptor AP leagă membrana plasmatică prin situsuri fosfatidilinozitol (4,5)bifosfat, recunosc şi leagă o secvenţă de aminoacizi hidrofobi din molecula receptorilor. Clatrina stabilizează interacţiunea AP cu membrana plasmatică şi activează prin fosforilare o subunitate a AP, ceea ce permite recunoaşterea şi legarea receptorilor. (imagine preluată din: http://www.abcam.com)
b. Pinocitoza sau endocitoza de fază fluidă este un proces constitutiv, comun tuturor celulelor, prin care pătrund în celule molecule în soluţie, procesul fiind direct proporţional cu concentraţia moleculelor în fluidul extracelular. Veziculele de pinocitoză fuzionează cu alte vezicule: endosomi şi lizosomi. Calea endocitozei constă din compartimente distincte care internalizează molecule şi le reciclează spre membrana plasmatică (endosomii timpurii şi endosomii de reciclare) sau le sortează spre a fi degradate (endosomii târzii şi lizozomii). Endosomii timpurii sunt localizaţi la periferia celulei şi recepţionează veziculele internalizate din membrana celulară. Au structură tubulo-veziculară şi pH acid, datorită pompelor de H+ din structura membranelor lor. Sunt organite de sortare în care receptorii disociază de liganzi în mediu acid, receptorii fiind reciclaţi în membrana celulară via tubulii endosomali, sau de sortare spre calea transcitozei şi spre endosomii târzii. Endosomii târzii preiau particule sau molecule de la endosomii timpurii ai căii endocitozei, de la reţeaua trans-Golgi în calea biosintetică sau de la fagosomi în calea fagocitozei, reprezentând ultima etapă în procesul de sortare înainte de a ceda conţinutul lizosomilor. Lizosomii sunt ultimul compartiment al căii de endocitoză, fiind principalul compartiment hidrolitic al celulei cu un pH acid (4,8) şi conţinut ridicat de enzime hidrolitice.
39
Figura 20. Calea endocitozei: EV- veziculă de endocitoză, EE- endosom timpuriu, de sortare
(,,early endosome”), LE- endosom târziu (,,late endosome”), PA- preautofagosom, EA-autofagosom
timpuriu, autofagosom târziu, LY-lizosom, G-reţeaua transGolgi. (imagine prelucrată din
http://www.cell-research.com)
3. Fagocitoza este un proces de apărare faţă de substanţe străine, microorganisme, celule îmbătrînite sau tumorale, resturi celulare, etc. caracteristic unor celule specializate: monocitele care se diferenţiază în ţesuturi în macrofage şi neutrofilele. Procesul de fagocitoză este influenţat de compoziţia chimică şi proprietăţile suprafeţei particulei ingerate şi se desfăşoară în următoarele etape: a. legarea particulei de fagocit prin receptorii membranari ai fagocitului care recunosc şi leagă specific liganzii de pe suprafaţa particulei-ţintă. De exemplu, fagocitarea bacteriilor este precedată de opsonizarea lor (acoperirea cu anticorpi şi/sau componente ale complementului). Regiunea FC a anticorpului este expusă spre exterior fiind recunoscută şi legată de receptorii FC din membrana fagocitului. Formarea complexului receptor- ligand FC declanşează semnalul intracelular pentru internalizarea bacteriei. b. internalizarea bacteriei prin emiterea pseudopodelor care închid particula într-o veziculă care se numeşte fagosom. Acesta fuzionează cu vezicule din compartimentul lizosomal formând fagolizosomul unde se desfăşoară acţiunea enzimelor hidrolitice şi a enzimelor care catalizează reacţii din care rezultă substanţe toxice: peroxid de hidrogen, anion superoxid, care suprimă bacteriile.
40
Figura 21. Fagocitoza mediată de receptori şi prezentarea antigenelor pe suprafaţa celulei
fagocitare.
41
Figura 22. Căile de semnalizare activate consecutiv fagocitozei şi răspunsul celular
4. Transcitoza se caracterizează prin internalizarea veziculelor de endocitoză, după care urmează sortarea la nivel endozomal, care presupune existenţa unei secvenţe-semnal de recunoaştere, complexul receptor-ligand fiind sustras acţiunii enzimelor lizosomale şi transportat prin vezicule spre membrana celulară, unde are loc externalizarea moleculei în spaţiul extracelular.
42
3.3. Funcţia de adeziune celulară
Adeziunea celulară creează căi de comunicare, permite celulelor să schimbe semnale prin care este coordonat comportamentul lor şi este reglată expresia genică. Adeziunea celulă- celulă sau adeziunea la matricea extracelulară controlează structura internă a fiecărei celule deoarece desfacerea şi refacerea adeziunii şi modelarea matricii guvernează modul în care celulele sunt orientate în timpul creşterii, dezvoltării şi proceselor reparatorii. Joncţiunile celulare, mecanismul adeziunii celulare şi matricea extracelulară sunt esenţiale pentru organizarea, dinamica şi funcţia structurilor multicelulare. Semnalele sunt transmise în structurile multicelulare prin 2 strategii: ◘ prin matricea extracelulară ◘ prin citoscheletul celular şi adeziunea celulă-celulă care leagă citoscheletul celulelor adiacente. În ţesuturi contactul dintre celule se realizează prin structuri specializate care poartă denumirea de joncţiuni intercelulare. Un rol important îl are matricea extracelulară, ancorarea celulelor în matrice are loc prin joncţiuni celulă-matrice care sunt regiuni specializate ale membranei celulare. În ţesutul epitelial matricea este subţire, alcătuieşte lamina sau membrana bazală, rezistenţa ţesutului epitelial fiind conferită de elementele citoscheletului care interacţionează cu membrana plasmatică la nivelul joncţiunilor specializate, cu suprafaţa altor celule sau cu matricea extracelulară. În ţesutul conjunctiv celulele sunt dispersate în matricea extracelulară, elementele matricei asigurând în acest caz stabilitatea ţesutului. Aparatul de joncţiune este alcătuit din următoarele tipuri : 1. Joncţiunile de ancorare, realizează adeziunea celulă-celulă şi celule-matrice extracelulară; 2. Joncţiunile de ocluzie, sudează membranele plasmatice ale celulelor epiteliale conferindu-le proprietăţi de barieră impermeabilă sau selectiv permeabilă; 3.Joncţiunile de comunicare formează canale, creează pasaje care unesc citoplasma celulelor adiacente, realizând cuplarea metabolică a celulelor care îndeplinesc aceeaşi funcţie; 4.Joncţiuni de retransmitere a semnalelor de la celulă la celulă prin membranele plasmatice, la situsurile de contact celulă-celulă (sinapsele interneuronale sau sinapsele imunologice în care limfocitele T interacţionează cu celulele prezentatoare de antigen şi alte exemple ilustrează faptul că membranele celulare trebuie să fie în contact pentru a avea loc interacţiunea ligandului cu receptorul)
3.3.1. Joncţiunile de ancorare realizează adeziunea celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulară. Sunt alcătuite din proteine de ataşare intracelulară care leagă elemente ale citoscheletului de structurile joncţionale şi din glicoproteine transmembranare de legare care interacţionează prin domeniul lor citoplasmic cu proteinele de ataşare şi prin domeniul extracelular cu glicoproteinele transmembranare ale celulelor adiacente. Joncţiunile de ancorare se clasifică în joncţiuni de adeziune şi structuri dezmosomale.
43
3.3.1.1. Joncţiunile de adeziune intercelulară sunt structuri la nivelul cărora sunt ancorate filamente de actină dispuse în mănunchiuri. O joncţiune de aderenţă este definită ca o joncţiune celulară a cărei faţă citoplasmică este ataşată citoscheletului de actină. Aceste joncţiuni formează o bandă de adeziune continuă (,,zonulae adherens"), caracteristice celulelor epiteliale. Astfel de structuri joncţionale se găsesc şi în celule non-epiteliale, dar ele nu formează benzi de adeziune continuă, de exemplu în cardiomiocite. Filamentele de actină interacţionează cu structurile joncţionale prin intermediul unor proteine de ataşare: vinculina şi α-actinina. Regiunea ,,cap" a vinculinei se leagă de E-caderină prin intermediul α-, β - şi γ-cateninelor. Regiunea ,,coadă" a vinculinei leagă lipidele membranare şi filamentele de actină. Domeniul extracelular al caderinelor interacţionează cu domeniile extracelulare ale glicoproteinelor omoloage din membranele celulelor învecinate. Joncţiunile de aderenţă sunt compuse din următoarele proteine: Caderinele, proteine transmembranare care formează homodimeri în manieră Ca-dependentă cu moleculele de caderină ale celulelor adiacente. Proteinele p120 denumite delta-catenine leagă regiunea juxtamembranară a caderinei. β-catenina sau γ-catenina (plakoglobina) leagă caderina la nivelul regiunii ce conţine situsul specific de legare al cateninei. α- catenina leagă caderina indirect, prin β-catenină sau plakoglobină.
Figura 23. Principalele interacţiuni între proteinele structurale ale joncţiunilor de aderenţă.
Filamentele de actină sunt ataşate prin α-actinine şi la membranele celulare prin vinculină.
Domeniile ,,cap” ale vinculinei sunt asociate cu E-caderinele prin α, β, γ-catenine. Domeniul ,,coadă”
al vinculinei se leagă la lipidele membranare şi la filamentele de actină. (imagine prelucrată din
http://herkules.oulu.fi)
E-caderina (epitelială) cea mai bine studiată, este alcătuită din 5 domenii repetitive (EC1 ~ EC5) în domeniul extracelular, un domeniu transmembranar şi domeniul intracelular care leagă p120 catenina şi beta-catenina. Domeniul intracelular conţine o regiune înalt fosforilată care leagă beta-catenina, care la rândul său leagă alfa-catenina, cu rol în reglarea citoscheletului de actină. E-caderina este exprimată şi fosforilată în celule în cursul
44
diferenţierii. În ţesuturile adulte, E-caderina este exprimată în ţesuturile epiteliale, cu un timp de înjumătăţire de 5ore. Pierderea funcţiei E-caderinei sau lipsa exprimării acestei glicoproteine membranare este implicată în dezvoltarea tumorii canceroase şi în metastazare, deoarece în asemenea condiţii descreşte rigiditatea şi stabilitatea tisulară şi creşte motilitatea celulelor, ceea ce permite celulelor tumorale să penetreze membrana bazală şi să invadeze ţesuturile din jur. Joncţiunile intercelulare prin legarea homofilică a caderinelor au un rol esenţial în segregarea tisulară. Apariţia şi dispariţia caderinelor specifice este corelată cu etapele dezvoltării embrionare când celulele se grupează şi îşi modifică contactele pentru a forma noi structuri tisulare. În timpul formării tubului neural din ectoderm, celulele pierd E-caderina şi sintetizează N-caderină, în timp ce celelalte celule din ectoderm continuă să sintetizeze E-caderina. Când celulele crestei neurale migrează din tubul neural, caderinele menţionate sunt greu detectabile, în schimb sunt exprimate în aceste celule caderine-7 care menţin sub formă de grupări celulele migrate prin adeziune intercelulară. În final, când aceste celule agregă pentru a forma un ganglion nervos, ele exprimă N-caderinele. Dacă într-o cultură de celule există celule care exprimă diferite tipuri moleculare de caderine, ele vor fi sortate şi vor agrega separat în funcţie de tipul de caderină exprimată, caderinele legându-se preferenţial de propriul lor tip molecular. Asamblarea celulelor în epitelii poate fi reversibilă. Exprimarea E-caderinelor determină adeziunea celulelor neataşate, dispersate denumite celule mezenchimale, care pot astfel forma un epiteliu. Invers, celulele epiteliale se pot detaşa, se dispersează şi îşi pot schimba caracterele migrând din epiteliul parental. Această tranziţie epiteliu-mezenchim are un rol important în dezvoltarea embrionară normală, dar are un rol important în procese patologice la adult, în cancer, multe tipuri de tumori maligne având originea în epitelii. 3.3.1.2. Joncţiunile de adeziune celulă-matrice extracelulară conectează filamentele de actină cu elementele componente ale matricei extracelulare. Adeziunea celulă-matrice se realizează prin regiuni specializate ale membranei plasmatice, prin structuri joncţionale denumite contacte focale sau plăci de adeziune.
Figura 24. Structura plăcilor de adeziune (imagine prelucrată din herkules.oulu.fi)
45
La nivelul acestor structuri se stabilesc interacţiuni între mănunchiurile de filamente de actină şi elemente ale matricei, prin intermediul unei glicoproteine membranare ce aparţine familiei integrinelor. Interacţiunea filamentelor de actină cu integrina este mediată de 4 proteine diferite: o proteină de legare a capului filamentelor de actină, vinculina, α-actinina, talina.
3.3.1.3. Dezmosomii sunt structuri de adeziune celulară la nivelul cărora se realizează contactul între filamentele intermediare ale celulelor adiacente. În celulele epiteliale structurilor dezmosomale le sunt asociate filamente de cheratină, în miocite filamente de desmină care sunt o cale de transmitere a forţei de contracţie, în celulele mezenchimale filamente de vimentină. Electronomicroscopic, dezmosomii apar formaţi din două discuri dense de 15-20 nm grosime situate pe faţa citoplasmică a membranelor a două celule adiacente, alcătuite din molecule proteice denumite desmoplachine care interacţionează cu filamentele intermediare, dar şi cu glicoproteine transmembranare denumit desmogleina şi desmocolina. Domeniile extracelulare ale desmogleinelor şi desmocolinelor interacţionează homofilic printr-un mecanism Ca-dependent, conectând desmosomii celulelor adiacente. Desmogleina şi desmocolina sunt membre ale familiei de molecule de adeziune celulară denumită caderine.
Figura 25. Domeniul extracelular a desmosomului se numeşte Domeniu central extracelular (ECD)
sau Desmoglea în care desmogleina(Dsg) interacţionează cu desmocolina(Dsc). Pe faţa citoplasmică
se află Placa densă externă (ODP) şi Placa densă internă (IDP), străbătute de moleculele de
desmoplachină. La nivelul ODP, domeniul citoplasmic al celor 2 caderine desmosomale
interacţionează cu desmoplachina (Dp) prin intermediul plakoglobinei (Pg) şi plakofilinei (Pkp). La
nivelul IDP, desmoplachina interacţionează cu filamentele intermediare ale celulei.(imagine
prelucrată din http://www.uchsc.edu)
3.3.1.4. Hemidesmozomii sunt structuri de ancorare a filamentelor de cheratină din celulele epiteliale de membrana plasmatică şi de lamina bazală a epiteliului prin intermediul unor glicoproteine transmembranare. HD conţin 2 plăci asemănătoare unor nituri (placa internă şi
46
placa externă), împreună cu fibrile de ancorare şi filamente de ancorare care alcătuiesc împreună complexul HD de adeziune stabilă sau complexul filamentos HD de ancorare.
Figura 26. Structura unui complex HD de ancorare: filamentele de keratină sunt strâns asociate plăcii
interne a hemidesmosomului care este paralelă cu placa externă de pe membrana celulară. Sub
placa externă, filamente de ancorare traversează lamina lucida spre lamina densa.(imagine
prelucrată din www.nature.com)
Acest complex formează o structură continuă de legătură între filamentele intermediare de keratină şi membrana bazală împreună cu componente ale dermei şi este alcătuit din peste 10 molecule componente. Hemidesmosomul este alcătuit din keratina citosolică legată noncovalent de o placă citosolică de plectină care interacţionează cu molecule de adeziune transmembranare: integrinele α6β4. Integrinele interacţionează apoi cu una dintre numeroasele proteine multiadezive cum este laminina din matricea extracelulară, în acest fel formându-se una dintre multele adeziuni dintre celule şi matrice.
Figura 27.Complexul multiproteic al hemidesmosomului. (imagine prelucrată din: www.oulu.fi)
47
3.3.2. Joncţiunile de ocluzie sau ,,zonulae occludens" , mai sunt denumite joncţiuni strânse sau impermeabile (,,tight junctions") sunt prezente la nivelul polului apical al celulelor epiteliale ce delimitează lumenul unor cavităţi. Sunt evidenţiate în M.E. ca puncte de contact sau de sudură ale membranelor celulelor adiacente. Sunt formate dintr-o reţea ramificată de catene strânse, fiecare catenă fiind independentă. Eficienţa acestor joncţiuni în a preveni difuzia ionilor creşte exponenţial cu numărul de catene componente. Fiecare catenă este formată dintr-un şir de proteine transmembranare, care interacţionează direct la nivelul domeniilor extracelulare. Speciile proteice majore sunt claudina şi ocludina, asociate cu proteine membranare periferice localizate pe faţa citoplasmică a membaranei plasmatice, care ancorează aceste catene proteice de citoscheletul de actină, unind în acest fel citoscheletul de actină al celulelor adiacente.
Figura 28. Structura joncţiunilor de ocluzie. (imagine preluată din:
cellbiology.med.unsw.edu.au)
Funcţiile joncţiunilor de ocluzie descoperite de M.G. Farquhar şi G.E. Palade în 1963
sunt: menţinerea adeziunii intercelulare, menţinerea polarităţii celulelor prin prevenirea difuziei laterale a proteinelor integrale de membrană între zona apicală şi cea bazală sau zonele laterale, permiţând menţinerea funcţiilor specifice ale fiecărei suprafeţe celulare: de
48
exemplu endocitoza mediată de receptor pe suprafaţa apicală şi exocitoza pe suprafaţa bazolaterală (transportul transcelular) sau antiportul Na/ glucoză la nivelul celulelor epiteliului intestinal. O altă funcţie este de prevenire a trecerii moleculelor sau ionilor prin spaţiile intercelulare. Ionii sau moleculele trebuie să pătrundă doar în celule prin difuzie sau transport activ. Această funcţie exercită control asupra transportului selectiv al particulelor, fiind nepermisiv pentru unele, ca în cazul barierei hemato-encefalice, însă mecanismul de control nu este cunoscut, poate să se datoreze unor breşe apărute prin mici discontinuităţi structurale sau prin pori multipli. În funcţie de permisivitatea faţă de moleculele de apă şi soluţii, epiteliile care conţin astfel de joncţiuni se clasifică în epitelii impermeabile sau permeabile. 3.3.3. Joncţiunile de comunicare se mai numesc şi joncţiuni permeabile (,,gap jonctions"). Conectează direct citoplasma a două celule şi permit trecerea ionilor şi moleculelor între celule. O astfel de joncţiune este formată din 2 conexoni sau hemicanale care străbat spaţiul intercelular. Conexonii sunt formaţi din homo sau heterodimeri de conexină- proteina constitutivă. La nivelul joncţiunilor de comunicare, spaţiul intercelular este de 4 nm şi unităţile conexonilor aparţinând celor 2 celule adiacente sunt aliniate.
Figura 29. Structura joncţiunilor permeabile. (imagine preluată din: https://wiki.brown.edu)
Joncţiunile formate din două hemicanale identice sunt denumite homotipice, iar cele formate din hemicanale diferite sunt heterotipice. Hemicanalele formate din conexine identice sunt homodimerice, cele formate din conexine diferite sunt heterodimerice. Compoziţia chimică influenţează funcţiile acestor canale, care sunt: ▫ de comunicare electrică între celule, diferitele subunităţi de conexină pot împărtăşi diferite conductanţe electrice ▫ de comunicare chimică între celule, prin transportul moleculelor mici, cum sunt mesagerii secundari (IP3, Ca2+), diferitele subunităţi de conexină pot prezenta selectivitate diferită pentru anumite molecule mici. Deşi diferitele conexine determină dimensiuni diferite
49
ale porilor, cu selectivitate electrică diferită, toate aceste canale permit în general trecerea moleculelor mai mici sau egale cu 1000 Da. Nu este permisă trecerea macromoleculelor: proteine, acizi nucleici. ▫ asigură controlul transportului moleculelor prin spaţiul intercelular, conferă caracter ordonat, înlătură posibilitatea ,,scurgerii" de molecule în acest apaţiu. Funcţiile menţionate asigură cuplarea electrică şi metabolică a celulelor prin schimburi electrice şi chimice prin hemicanale şi are implicaţii în homeostazie. Potenţialul de acţiune este răspândit în miocard de la celulă la celulă determinând contracţia ritmică a cordului. La nivelul anumitor sinapse din creier, joncţiunile de comunicare permit transmiterea potenţialului de acţiune, într-un interval mai scurt de timp decât cel necesar neurotransmiţătorilor. Defecte ale conexinelor ce compun joncţiunile la nivelul ţesutului nervos duc la degenerări ale substanţei albe în manieră caracteristică unor afecţiuni cum este boala Pelizaeus-Merzbacher şi scleroza multiplă. Neuronii din retină sunt cuplaţi prin joncţiuni permeabile care apar între aceleaşi tipuri de celule dar şi între celule diferite. În timpul travaliului, joncţiunile permeabile dintre celulele musculaturii netede a uterului permit contracţii coordonate, puternice necesare expulziei fetale. Funcţia de transport este dublată de o funcţie de adeziune a celulelor adiacente în timpul dezvoltării embrionare, cu implicaţii în diferenţiere, ex.: migrarea neuronală în neocortex. Defectele genetice ale proteinelor structurale ale joncţiunilor permeabile sunt implicate în boli ale pielii, deoarece acest tip de joncţiuni sunt puternic implicate în procesele de diferenţiere şi proliferare ale acestor ţesuturi. ▫ sunt supresori ai oncogenelor, s-a constatat exprimarea scăzută sau lipsa totală a acestor proteine în celule tumorale cu pierderea controlului proliferării. Defecte ale conexinelor sunt implicate în cancerul mamar, renal, esofagian, etc. Conexinele sunt exprimate în toate tipurile tisulare cu excepţia unor celule mobile cum sunt hematiile şi spermatozoizii 3.3.4. O altă categorie este adeziunea mediată de selectine ,,selected lectins", proteine de adeziune celulară care leagă carbohidraţi. În timpul răspunsului inflamator, stimuli ca histamina şi trombina determină mobilizarea P-selectinelor din interiorul celulelor, pe suprafaţa lor. În plus, citokinele ca TNF-alpha stimulează exprimarea E-selectinelor şi P-selectinelor adiţionale, câteva ore mai târziu. Domeniul distal ,,lectin-like" al selectinelor leagă grupuri carbohidrat prezente în molecula glicoproteinelor cum este glicoproteina PSGL-1 din membrana leucocitelor, care favorizează pătrunderea acestor celule la situsul infecţiei. Neutrofilele şi eozinofilele se leagă de E-selectine.
50
Tabelul 2. Molecule de adeziune Ca++ independente:
N-CAM ,,Neural Cell Adhesion Molecule" sau proteina zero a mielinei · ICAM1,5 ,,Intercellular adhesion molecules" · VCAM-1 ,,Vascular cell adhesion molecules" · PE-CAM molecule de adeziune plachetare/ endoteliale· L1-CAM molecule de adeziune din neuroni, intervin în diferenţierea şi dezv. SN CD2 de pe suprafaţa LT sau NK intervin în interacţiunea cu alte molecule de adeziune (LFA3/CD58) de pe suprafaţa Mf SIGLEC ,,sialic acid binding Ig-like lectins" de pe suprafaţa Mf., LB
Familia CTX ex.: JAM ,,junctional adhesion molecule B" în joncţiunile impermeabile ale cel. endoteliale ESAM ,,endothelial cell selective adhesion molecules"
2. Integrinele sunt receptori care mediază adeziunea dintre o celulă şi alte celule sau matricea extracelulară aparţinând ţesuturilor din jurul ei. Au rol important în semnalizarea celulară şi definesc forma celulelor, mobilitatea, reglează ciclul celular -Ca2+independente
Integrina β-2( CD18) este subunitatea β a 3 structuri: 1.LFA-1 ,,Lymphocyte function-associated antigen"-molecule de adeziune ale LT , LB , Mf, neutrofilelor la cel. prezentatoare de Ag, are loc recrutarea lor la situsul infecţiei. 2.Integrina alphaXbeta2- receptor de complement. 3.Antigenul 1 al macrofagelor- receptor de pe suprafaţa Mf care recunosc componenta C3b a complementului legată de suprafaţa cel. străine, declanşează fagocitarea acestor cel. VLA1-6 molecule de adeziune celulă-celulă şi de integrare a EMC cu citoscheletul Glicoproteina IIb/IIIa sunt receptori pentru fibrinogen ai plachetelor, intervin în activarea plachetară
51
Tabelul 3. Molecule de adeziune dependente de Ca++ :
1. Caderinele sunt o clasă majoră de proteine de membrană cu rol proeminent în adeziunea celulară,reglarea organizării tisulare şi morfogeneză. Mediază adeziunea monotipică celulă-celulă dar şi adeziunea heterotipică între diferite tipuri de caderine este posibilă. Acţionează atât ca receptor cât şi ca ligand. Sunt responsabile pentru adeziunea selectivă celulă-celulă care este necesară pentru a repartiza diferitele tipuri celulare în poziţia corectă în timpul dezvoltării. Caderinele tind să se concentreze pe suprafaţa celulară la nivelul joncţiunilor celulă-celulă, fiind structural asociate filamentelor de actină. Domeniul citoplasmic este asociat cu proteine citoplasmice denumite catenine. Deleţia domeniului citoplasmic distruge aceste interacţiuni şi funcţia caderinelor. Funcţia caderinelor ca receptori membranari este de a recepţiona semnale externe şi de a le traduce în semnale interne prin activarea GTPazelor şi căii beta-catenin/Wnt rezultând o reorganizare dinamică a citoscheletului şi schimbări fenotipice.
Desmogleina (DSG1, DSG2, DSG3, DSG4) au rol în formarea desmosomilor Desmocolina (DSC1, DSC2, DSC3) · T-caderina · Protocaderina · CDH1 E-caderina (epitelială) CDH2 N-caderina (neurală) CDH3 P-caderina (din placentă) CDH4 R-caderina (din retină) CDH5 VE-caderina (vasculară endotelială) CDH6 K-caderina (renală) CDH8 CDH9(T1) CDH10(T2) CDH11 OB-Caderina (osteoblastică) CDH12 CDH13 T-caderin - H-caderinA (inima) CDH15 - M-caderina (miotubuli) CDH16 - KSP-caderina CDH17 - LI caderina (ficat-intestin) CDH18 - caderina 18, tip 2 CDH19 - caderina 19, tip 2 CDH20 - caderina 20, tip 2 CDH23 - caderina 23 (epitelii neurosenzoriale)
2. Selectinele sunt o familie de molecule de adeziune heterofile care leagă carbohidraţi fucozilaţi, de exemplu mucine. Cel mai bine reprezentat ligand pentru cele trei selectine este P-selectin glicoprotein ligand-1(PSGL-1), care este o glicoproteină tip mucină exprimată în toate celulele albe ale sângelui.
Matricea extracelulară este produsă de celule şi secretată în mediul interstiţial din jurul celulelor. Este un amestec complex de carbohidraţi şi proteine, dar şi minerale în ţesutul osos. Arhitectura, elementele structurale şi rolul ECM diferă în funcţie de tipul tisular. Complexitatea structurală a ECM este dată nu numai de componentele sale ci şi de organizarea diferită în ţesuturile organismului, spre exemplu, la interfaţa dintre ţesutul epitelial sau endotelial şi ţesutul conjunctiv subadiacent, se află o structură specializată a matricei extranucleare denumită lamina bazală, care la rândul ei poate avea un aspect diferit în funcţie de ţesut: poate înconjura celule individuale sau se poate afla între straturi unicelulare (în alveolele pulmonare şi glomerulii renali). În ţesutul conjunctiv, matricea este bine reprezentată, având rolul de a conferi rezistenţă mecanică, dar şi elasticitate acestor ţesuturi. ECM este o structură dinamică cu funcţie complexă în susţinerea şi ancorarea celulelor, reglează comunicarea celulelor cu mediul şi cu alte celule, fiind un filtru structural implicat în dezvoltarea, migrarea, proliferarea, forma şi metabolismul celular. Este depozitul unor factori de creştere celulară, eliberaţi în momentul acţiunii proteazelor asupra ECM, ceea ce determină activarea rapidă a funcţiilor celulare mediate de aceşti factori de creştere. Invazia tumorală, metastazarea implică distrugerea ECM de către proteaze sintetizate de celulele tumorale.
3.3.5.1.Componentele matricii extracelulare sunt sintetizate de celulele aflate în ECM care aparţin clasei fibroblastelor şi sunt exportate prin exocitoză. Matricea extracelulară este formată din proteine fibrilare dispuse într-o reţea, care conferă rezistenţă mecanică matricei, imersată în gelul polizaharidic al glicozaminoglicanilor (GAG), a doua componentă structurală a matricei, care permite difuzia moleculelor şi ionilor. GAG sunt lanţuri poliglucidice liniare formate prin polimerizarea unor unităţi diglucidice alcătuite de obicei dintr-un aminoglucid (N-acetilglucozamina) şi acid uronic. Datorită grupărilor sulfat şi grupării carboxil a acidului uronic, GAG sunt molecule încărcate electronegativ, care leagă cationi osmotic activi, ceea ce are ca efect atragerea apei în ECM, menţinând matricea şi celulele rezidente în stare hidratată, cu efect de rezistenţă faţă de forţele de compresie ce se exercită asupra matricii. Glicozaminoglicanii sunt ataşaţi de proteine ale ECM cu formare de proteoglicani, cu excepţia acidului hialuronic.
3.3.5.1.1. Glicozaminoglicanii În funcţie de tipul de resturile monoglucidice ce alcătuiesc unităţile dizaharidice ale GAG şi în funcţie de compoziţia în grupări sulfat, se disting următoarele clase de glicozaminoglicani: Heparan sulfatul este caracteristic tuturor tipurilor de ţesuturi, formează proteoglicani în care două sau trei lanţuri poliglucidice de heparansulfat se leagă de proteine de suprafaţă celulară sau din matricea extracelulară, în special din membrana bazală (perlecanul, agrina, colagenul XVIII sunt proteoglicani care conţin heparansulfat). Intervin în reglarea unor procese de creştere celulară, în angiogeneză, coagulare, şi metastazare tumorală. Condroitin sulfatul intervine în rezistenţa la tensiunile aplicate asupra cartilajelor, tendoanelor, ligamentelor şi pereţilor aortici şi în neuroplasticitate (capacitatea de formare, de desfacere şi refacere a conexiunilor interneuronale în cursul dezvoltării şi în cursul proceselor de învăţare şi de adiţie a noi celule neuronale, proces care include şi înaintarea conului de creştere al neuroblastelor). Este larg utilizat ca supliment alimentar, în tratamentul
53
osteoartritei. Cheratan sulfatul nu conţine acid uronic, se găseşte în cornee, cartilaje, ţesut osos şi în SNC unde are rol atât în dezvoltare, cât şi în procesul de cicatrizare a ţesutului nervos. Principala componentă care intervine în cicatrizare este astrocitul reactiv. Astrocitele se ataşează de membrana bazală şi împreună cu moleculele componente ale membranei bazale, din care fac parte şi moleculele de perlecan ce conţin cheratan sulfat, formează un înveliş în jurul ţesutului nervos afectat şi în jurul vaselor de sânge din zonă, în acest fel debutând procesul de vindecare. Acidul hialuronic este un polizaharid anionic nonproteoglicanic (nu formează proteoglicani) lung, alcătuit din mii de resturi de acid D-glucuronic şi N-acetilglucozamină, lipsite de grupări sulfat. Se găseşte în ţesuturi epiteliale, conjunctive şi în ţesutul nervos. Component major al ECM al acestor ţesuturi, intervine în procesele de proliferare şi migrare, în cursul dezvoltării embrionare, dar şi în proliferarea celulelor tumorale fiind mediator al tranziţiei epiteliu-mezenchim al acestor celule, deoarece participă la interacţiunea cu numeroşi receptori de suprafaţă celulară de pe suprafaţa celulelor care migrează (CD44, RHAMM şi ICAM-1) împiedicând procesele de adeziune intercelulară şi intervenind în activitatea kinazelor implicate în motilitatea celulară, favorizând deplasarea liberă a celulelor. Intervine în procesele de vindecare, în etapele de inflamaţie, în formarea ţesuturilor de granulaţie, reepitelizare şi remodelare, evenimente în care participă celulele şi matricea extracelulară. Intervine în mecanismul inflamaţiei, prin legarea de receptorul său specific CD44, determină activarea limfocitelor, iar produşii de degradare ai acidului hialuronic sunt molecule care prin receptori specifici de tip ,,toll-like receptors" activează macrofagele şi celulele dendritice. Fibroblastele, în prezenţa unei concentraţii crescute de HA, cresc sinteza de citokine proinflamatorii TNFα şi Il8 prin mecanism mediat de HA-CD44. În ţesuturile de granulaţie, facilitează migrarea celulară şi organizarea matricii acestor ţesuturi. Este component al lichidului sinovial, având rol în lubrifierea articulaţiilor, şi al ţesutului cartilaginos, unde formează un înveliş în jurul condrocitelor (agregate moleculare cu agrecanul), cu rol de hidratare a structurii cartilajului, care imprimă rezistenţă la compresie.
3.3.5.1.2.Proteinele fibrilare
Colagenul este cea mai abundentă componentă a ECM, este şi cea mai abundentă componentă proteică a corpului uman. Conferă suport structural celulelor rezidente. Colagenul este exportat prin exocitoză în ECM sub forma unui precursor procolagen care nu se poate asambla în fibre în interiorul celulei. Procolagenul este clivat în matrice de o protează, formându-se moleculele de tropocolagen care se asamblează în fibrile de colagen. Tropocolagenul, unitatea structurală a colagenului este o moleculă proteică cu o lungime de 300nm şi un diametru de 1,5nm, alcătuită din trei lanţuri polipeptidice de tip helix α, cu orientare spre stânga, înfăşurate unul în jurul celuilalt, formând o structură triplu helix cu orientare spre dreapta. Fiecare rotaţie completă a triplului-helix conţine trei aminoacizi, fiecare al treilea aminoacid, orientat spre interiorul helixului, este glicina. Molecula de colagen este bogată în prolină şi lizină, în general sub formă hidroxilată, gruparea hidroxil a prolinei participând la formarea legăturilor de hidrogen care stabilizează acest triplu-helix, iar gruparea hidroxil a lizinei conferă moleculei capacitatea de autoasamblare în matricea extracelulară. Tropocolagenul de tip I,II,III se autoasamblează spontan, fiecare triplu-helix participă la formarea unei structuri suprarăsucite care poartă denumirea de microfibrile de
54
colagen, cu un diametru de 50nm instabile ca structuri individuale, dar stabilizate în fibrele de colagen. Moleculele de tropocolagen sunt dispuse în şiruri longitudinale, între moleculele din acelaşi şir există o distanţă de 35nm, iar moleculele de tropocolagen din şiruri adiacente sunt deplasate una faţă de alta cu 67nm, fiecare moleculă de tropocolagen fiind în avans faţă de cea adiacentă cu 67nm, până la şirul al cincilea. Următoarea moleculă este aliniată din nou cu cea din primul şir. Se creează astfel zone de suprapunere (,,overlap") alcătuite din cinci molecule de tropocolagen aparţinând la cinci şiruri adiacente, defazate cu câte 67 nm una faţă de alta şi zone ,,gap" alcătuite din câte patru molecule adiacente. Această structură conferă maximum de elasticitate. Regiunile amino- şi carboxiterminale ale colagenului nu au conformaţie de triplu-helix, resturile de lizină şi hidroxilizină din capetele moleculei participă la legături covalente între gruparea carboxil a unei molecule şi grupări amino a moleculei din şirul adiacent, cu stabilizarea structurii fibrilelor de colagen.
Figura 30. Structura fibrei de colagen: (a), (b), (c)- triplul helix de tropocolagen cu resturile de
glicină orientate spre interior; (d), (e)- zonele de ,,overlap” şi ,,gap”; (f)- fibre de colagen în ME
Fibrilele sunt agregate semicristaline de colagen, dispuse diferit în diverse ţesuturi, mănunchiurile de fibrile formând fibrele de colagen. În funcţie de structura pe care o formează, colagenul poate fi împărţit în următoarele familii: fibrilar (tipurile I,II,III,V,XI), facit (tipurile IX,XII,XIV), lanţuri scurte (tipurile VIII,X), din membrana bazală (tip IV), altele (tipurile VI,VII, XIII). Peste 90% din colagenul organismului este reprezentat de tipurile I,II,III şi IV. Fibrele de colagen se găsesc în următoarele ţesuturi:
55
Colagen I: piele, tendoane, pereţi vasculari, ligamente, oase Colagen II: cartilaj Colagen III: asociat cu tipul 1, în ţesutul reticulat Colagen IV: în membrana bazală Colagen V: suprafeţe celulare, păr şi placentă
Elastina spre deosebire de colagen, dă elasticitate ţesuturilor, se găseşte în vasele sangvine, plămâni, piele. Elastinele sunt sintetizate de fibroblaste şi celulele musculaturii netede ale pereţilor arteriali. Sunt molecule insolubile, secretate în interiorul unei chaperone, care eliberează precursorul în contact cu o fibră de elastină, după care urmează o deaminare pentru ca tropoelastina să fie încorporată în fibra de elastină. Fibrele de elastină sunt formate din microfibrile, alcătuite la rândul lor din molecule de elastină, elaunină, oxitalan dar şi din proteine asociate microfibrilelor: glicoproteine ca fibrilina esenţială pentru formarea fibrelor de elastină în ţesuturile conjunctive, fibulina care se leagă în matricea extracelulară nu numai de tropoelastină, dar şi de fibronectină, proteoglicani, laminine şi receptorul pentru elastină. Scheletul de microfibrile organizează dispunerea elastinei amorfe formată din tropoelastină solubilă care devine insolubilă şi legată în reţea prin activitatea liziloxidazei, care produce deaminarea oxidativă a resturilor de lizină cu formare de aldehide şi alizină. Aceste aldehide şi alizine reacţionează cu resturi de lizină şi alizină, cu formare de desmozine şi izodesmozine, prin legături covalente încrucişate, care formează reţele ce înconjoară moleculele de elastină, intervenind în formarea reţelei de fibre de elastină. Fibronectinele sunt proteine care conectează fibrele de colagen cu integrinele din membranele celulare, determinând o reorganizare a citoscheletului celular şi mişcarea celulelor. Fibronectinele au rol important în menţinerea formei celulelor, iar pe parcursul embriogenezei, în migrarea şi diferenţierea celulară. Sunt întâlnite în sânge şi alte fluide sub formă de dimeri solubili care favorizează fagocitoza, migrarea celulelor imune, aderarea plachetară la endotelii lezate, sub formă de oligomeri de fibronectină ataşate de receptorul lor din clasa integrinelor sau sub formă de fibre insolubile în ECM. Molecula de fibronectină conţine o secvenţă specifică ( Arg-Gly-Asp-Ser) RGDS comună mai multor proteine de adeziune celulară, care permite recunoaşterea şi legarea lor de către integrine, care mediază interacţiunea fibronectinelor cu citoscheletul celular actinic. Lamininele sunt proteine situate în lamina bazală (pe faţa dinspre membrana bazală a laminei densa) care delimitează suprafaţa bazală a celulelor epiteliale şi endoteliale, pe care le separă de ţesutul conjunctiv adiacent. Lamininele formează reţele independente şi sunt asociate cu colagenul de tip IV prin entactine şi cu perlecanii. Se leagă de membranele celulare prin receptori din clasa integrinelor şi de alte proteine ale membranei celulare (de exemplu de distroglican, care în miocite conectează lamininele cu distrofina din citoschelet, care este în contact cu filamentele de actină) . Prin aceste interacţiuni, intervine în adeziunea celulară, mediază legarea laminei bazale de suprafaţa celulară, intervine în diferenţierea celulară, menţinerea formei celulelor, mişcarea celulelor, menţinerea fenotipului ţesuturilor.
56
4. Organizarea structurală a citoplasmei. Hialoplasma şi citoscheletul
4.1. Hialoplasma, matricea citoplasmatică, substanţa fundamentală a citoplasmei sau citosolul sunt denumiri sinonime care exprimă aceeaşi realitate biologică, definesc o componentă structural-funcţională prezentă în toate celulele eucariote, localizată în spaţiul celular, în afara compartimentelor delimitate de membranele intracelulare. Studiile clasice de microscopie optică au prezentat hialoplasma ca o masă omogenă optic, mai refringentă decât apa, dar nestructurată, lipsită de structură specifică, ceea ce explică şi denumirea dată. Progresele microscopiei electronice au dus la evidenţierea în citoplasmă a mai multor diferenţieri structurale: poliribosomi, microtuburi, granule de glicogen, picături lipidice, etc. S-a constatat că microtubulii, microfilamentele şi filamentele intermediare constituie o structură denumită citoschelet care este o reţea tridimensională ce străbate întreaga hialoplasmă , cu implicaţii funcţionale complexe în viaţa celulei: transportul intracelular de particule, vezicule de transport, organite celulare; translocarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare; desfăşurarea citokinezei; motilitatea celulară prin cili şi flageli; locomoţia de tip ameboidal; contracţia musculară; rol structural în menţinerea formei celulei, stabilităţii ţesuturilor şi poziţiei organitelor în celule.
Figura 31. Reţeaua tridimensională a citoscheletului (electronomicrografie preluată din Svitkina et al,
1995).
Citoscheletul este constituit din 3 elemente structurale:
microtubulii, microfilamentele şi filamentele intermediare.
57
Figura 32. Componentele citoscheletului (imagine preluată din David E. Metzler
,,Biochemistry”Harcourt/Academic Press, 2001)
4.2. Microtubulii se găsesc în citoplasma tuturor celulelor eucariote cu excepţii rare cum este cazul hematiilor mamiferelor. Formează structuri diverse, în funcţie de tipul de ţesut, şi s-au acumulat dovezi care susţin că diferitele tipuri de celule conţin tipuri diferite de tubuline alfa şi beta (izotipuri codificate de gene diferite ), cum este β-tubulina din banda marginală a eritrocitelor şi plachetelor sangvine mamaliene, dar este frapantă uniformitatea lor constitutivă la eucariote. Microtubulii au un diametru de 24nm, în timp ce lungimea variază de la fracţiuni de micrometru până la zeci de micrometri. Peretele microtubulilor este constituit din proteine globulare, monomeri de α şi β-tubulină, de 4-5µm în diametru, cu aceeaşi greutate moleculară (50 000) şi care sunt aranjate în 13 şiruri longitudinale, numite protofilamente, paralele cu axa microtubulului şi care delimitează lumenul microtubular.
58
Figura 33. Protofilamentele sunt constituite din subunităţi dimerice de α-β tubulină, dispuse
după un model helical şi care polimerizează ordonat definind în felul aceste polaritatea
microtubulilor (capetele microtubulilor nu sunt echivalente). Imagine preluată din vbaulin.front.ru.
Microtubulii depolimerizează în subunităţi α-β stabile. Polimerizarea este favorizată de prezenţa în mediu a unor fragmente microtubulare cu rol de amorse, iar adăugarea dimerilor la amorsă apare ca un proces preferenţial datorită polarităţii intrinseci a microtubulilor, cele două capete nefiind funcţional echivalente, unul din capete, denumit capăt plus se alungeşte de 2-3 ori mai rapid decât capătul minus. Dezasamblarea are loc de asemenea mai rapid la capătul plus. În cili, flageli şi în axoni capetele cele mai îndepărtate de centrul celular sunt întotdeauna capetele plus. Asamblarea tubulinei în microtubuli este însoţită de o hidroliză întârziată a unei molecule de GTP ataşată tubulinei. Energia furnizată de această hidroliză nu este necesară polimerizării, hidroliza GTP are loc după ce subunitatea a fost ataşată microtubulului. Moleculele de tubulină ataşate GTP polimerizează cu o afinitate mult mai mare, iar viteza polimerizării este mai mare decât viteza cu care are loc hidroliza: se formează la capătul plus un cap de tubulină-GTP care favorizează polimerizarea. Un microtubul care şi-a pierdut capul GTP ca urmare a unei rate prea mici de polimerizare, va începe să piardă unităţi, să depolimerizeze. Subunităţile tubulină-GDP au afinitate mai mică şi vor depolimeriza mai uşor. Toate aceste caracteristici sunt cunoscute sub denumirea de labilitate sau instabilitate dinamică a microtubulilor. Capetele minus sunt legate de centri de organizare microtubulară care controlează polimerizarea-depolimerizarea la acest nivel. Capetele plus libere pot trece rapid de la o polimerizare lentă la polimerizare rapidă sau la depolimerizare rapidă. În anumite condiţii de concentraţie ionică există o anumită concentraţie de tubulină liberă, denumită concentraţie critică, care determină apariţia stării staţionare, adăugarea de dimeri la anumiţi microtubuli este însoţită de pierderea unei cantităţi echivalente de la nivelul altor microtubuli. Peste această concentraţie microtubulii tind să crească, sub ea, să descrească. Din cauza instabilităţii dinamice, un microtubul nou format va persista numai dacă ambele capete sunt protejate faţă de depolimerizare. Capetele minus sunt protejate de centrii de organizare microtubulară, iar capetele plus sunt capturate
59
prin intermediul unor proteine ce alcătuiesc structuri de acoperire sintetizate în cursul unor evenimente celulare distincte, care controlează în acest fel stabilitatea şi localizarea microtubulilor în celulă. Atât polaritatea celulară cât şi planul diviziunii celulare sunt stabilite în acest fel. Un rol important îl au proteinele asociate microtubulilor MAP cu rolul de protejare al microtubulilor faţă de dezasamblare şi de a media interacţiunea lor cu alte componente celulare. Au fost izolate două MAP în ţesutul nervos: Tipul I (proteinele HMW ,,high molecular proteins”) cum sunt MAP1A şi MAP1B care interconectează microtubulii adiacenţi ai axonilor, leagă microtubulii de filamentele intermediare sau de membrana celulară, controlând aranjarea lor spaţială. Tipul II (MAP 2, 4 sau proteinele tau) care conectează microtubulii cu filamentele intermediare, cu membrana plasmatică sau cu alţi microtubuli. Au rol în stabilizarea microtubulilor în timpul întregului ciclu celular. Proteinele tau organizează microtubulii în mănunchiuri, iar MAP 4 sunt importante în timpul diviziunii celulare.
4.2.1.Funcţiile microtubulilor sunt:
4.2.1.1. Mişcarea organitelor şi transportul axonal. Prin microscopie optică de contrast de fază s-a demonstrat că citoplasma celulelor vii este în mişcare continuă, în timp de câteva minute organitele îşi schimbă poziţia în citosol, executând mişcări direcţionate ce nu pot fi confundate cu mişcarea browniană. Microscopul electronic a demonstrat că membranele organitelor sunt conectate la microtubuli şi că microtubulii au, alături de microfilamentele de actină un rol important în mişcările pe care le efectuează organitele celulare. Un exemplu de mişcări rapide de-a lungul microtubulilor este transportul granulelor de pigment în celulele melanofore. Transportul axonal are loc de la corpul celular spre sinapsele axonice denumit anterograd (transport de proteine şi alte molecule sintetizate la nivelul corpului celular) şi în direcţie opusă, retrograd (veziculele conţin membrane îmbătrânite şi proteine destinate degradării în lizosomii corpului celular). Mecanismul transportului axonal este explicat prin existenţa unei proteine cu activitate ATP-azică, denumită kinesina, care are în structură 2 lanţuri grele- situsuri de legare pentru ATP şi pentru microtubuli şi 2 lanţuri uşoare– situsuri pentru structurile delimitate de membrane(vezicule). În prezenţa ATP, kinesina se mişcă de-a lungul microtubulului de la capătul minus spre capătul plus, realizând transportul anterograd. Explicaţia constă în modificările conformaţionale, alosterice ale acestor proteine –motor, cauzate de cicluri succesive de fosforilare – defosforilare: legarea ATP de proteină, însoţită de trecerea de la o conformaţie (1) la alta (2) a proteinei, hidroliza ATP-ului legat cu eliberare de ADP şi Pi , iar eliberarea ADP şi Pi determină reîntoarcerea proteinei la conformaţia sa iniţială(1), procesul fiind ireversibil, ceea ce duce la transport unidirecţional. O altă proteină asociată microtubulilor, denumită MAP1C sau dineina citoplasmică (cu structură şi funcţie asemănătoare dineinei flagelare) este responsabilă de transportul in direcţia capetelor minus, deci retrograd.
60
Figura 34. Dineina şi kinesina citoplasmică. (Imagine preluată din http://www.cytochemistry.net/cell-
biology/microtubule_intro.htm)
4.2.1.2. Mişcarea flagelară(ciliară). Cilii şi flagelii celulelor eucariote au o remarcabilă uniformitate structural-funcţională; se deosebesc prin lungime şi prin tipul bătăii: cilii execută mişcare de îndoire urmată de mişcare de revenire, iar mişcarea flagelară constă în unde de diferite amplitudini, care sunt generate fie de la bază spre partea terminală, fie invers, spre punctul de inserţie, direcţia de propagare a undelor determinând mişcarea celulei în sens invers direcţiei de propagare. Flagelul este alcătuit din corpul bazal şi axonemă. În axonemă există 2 microtubuli centrali, individuali, C1 şi C2, conectaţi printr-o punte şi înconjuraţi de o teacă fiboasă care pare să regleze forma bătăii flagelare sau ciliare şi 9 perechi de microtubuli, denumite dublete. Fiecare dublet este alcătuit din subfibrele A (microtubul complet format din 13 protofilamente) şi B (10-11 protofilamente). Ataşarea subfibrelor A şi B este realizată de filamente proteice longitudinale de tectină. Fiecare subfibră A este conectată la cei doi microtubuli centrali prin spiţe radiale, terminate prin capul spiţei, cu o periodicitate de 32 nm (la fiecare al patrulea dimer de alfa-beta tubulină) de-a lungul protofilamentului. Mobilitatea cililor şi flagelilor este generată de braţele externe şi interne de dineină, care sunt ataşate de subfibrele A la intervale regulate şi sunt orientate în aceeaşi direcţie, în sensul de rotaţie al acelor ceasornicului. Axonema este consolidată printr-un set de leagături de nexină între dubletele adiacente, foarte elastice .
61
Figura 35. Secţiune transversală prin axonema flagelară. (Imagine preluată din www.uic.edu)
În axonemele izolate, adăugarea de ATP face ca fiecare dublet să alunece faţă de unul adiacent, în acord cu modelul de „păşire’’ al dineinei, braţele de dineină de pe subfibra A a unui dublet determină înaintarea subfibrei B de pe dubletul adiacent spre vârful axonemei. Forţa de producere a alunecării dubletelor adiacente este determinată de formarea şi ruperea succesivă a punţilor între braţele de dineină ale unui dublet şi subfibra B a dubletului adiacent, cele două dublete mişcându-se unul faţă de altul. Formarea unor astfel de punţi este ATP-dependentă. Structura şi mişcarea dineinei flagelare de-a lungul microtubulului adiacent B sunt similare cu cele ale dineinei citoplasmice implicate în translocarea organitelor: ambele păşesc spre capătul minus al microtubulului adiacent. Într-un flagel sau cil , toate dubletele externe sunt constrânse prin legăturile de nexină sau prin spiţele radiale, de aceea, forţa de alunecare a dubletelor externe este convertită într-o bătaie a axonemei. Bătaia sub formă de unde a flagelului, are loc într-un anumit plan, o explicaţie posibilă este aceea că două dublete adiacente, notate convenţional cu numerele 5 şi 6 au legături permanente rigide între ele. Deoarece aceste dublete nu pot aluneca unul faţă de celălalt, orice bătaie a flagelului are loc în acest plan.
4.2.1.3. Fusul mitotic din diviziunea celulară. Aparatul mitotic al oricărei celule este constituit din microtubuli, cinetocori şi polii fusului. În celulele animale, în centrul fiecărui pol mitotic se găsesc centrioli, care au funcţia de centru de organizare microtubulară. S-ar părea că în structura centriolilor se găseşte o variantă moleculară de tubulină denumită gamma-tubulină, capabilă să iniţieze asamblarea microtubulară. Microtubulii fusului mitotic sunt de trei tipuri, grupaţi în fascicule denumite fibre: microtubulii astrali radiază din polii mitotici în citoplasma periferică. Microtubulii polari sau interzonali se extind din poli spre ecuatorul fusului, unde are loc interdigitarea microtubulilor proveniţi de la un pol cu cei proveniţi de la celălalt pol. Microtubulii cinetocorici sunt ataşaţi la nivelul cinetocorilor din zona centromerică a cromozomilor.Fusul
62
mitotic poate fi considerat ca fiind format din două jumătăţi numite semifusuri în care microtubulii au o polariate bine definită: capetele minus sunt orientate spre poli, iar capetele plus sunt orientate spre cromozomi.Microtubulii cinetocorici sunt mai stabili decât cei astrali deoarece capetele lor plus sunt capturate şi stabilizate la nivelul cinetocorilor, iar microtubulii polari sunt şi ei stabili datorită interacţiunilor dintre capetele lor plus la nivelul interdigitaţiilor ecuatoriale. Numărul microtubulilor ataşaţi de cinetocor este varibil, la om cinetocorii au ataşaţi 20-40 de microtubuli, în timp ce la microorganisme există câte unul., care este suficient pentru a realiza mişcarea cromozomului.
Figura 36. Fusul mitotic alcătuit din micotubuli astrali, cinetocorici şi polari.
În timpul prometafazei, cromozomii sunt dispuşi întâmplător între cei doi poli, aşa cum au rezultat în urma condensării cromatinei şi ruperii învelişului nuclear. Capetele plus ale microtubulilor sunt captate treptat, întâmplător şi din direcţii diferite, astfel încât cromozomii execută mişcări de rotaţie şi de oscilaţie între cei doi poli. Asocierea dintre microtubuli şi cinetocori este întâmplătoare şi stă la baza segregării întâmplătoare a cromatidelor în celulele-fiice. Deplasarea cromozomilor spre planul ecuatorial al celulei este determinată de polimerizarea fibrelor cinetocorice. Aceste fibre au capătul minus inserat în centrozom şi capătul plus legat de cinetocor şi stabilizat prin proteine asociate. Experienţele au evidenţiat faptul că cinetocorii pot transloca rapid microtubuli în direcţia capetelor minus şi mai încet spre capetele plus. Procesele de translocare sunt dependente de starea de fosforilare a structurilor cinetocorilor, pentru că sunt dependente de prezenţa proteinelor-motor, capabile de activitate ATP-azică. Cea mai cunoscută dintre aceste proteine-motor este cea responsabilă de mişcarea cinetocorului spre capătul minus, identificată ca o moleculă de dineină, localizată atât la nivelul cinetocorilor, cât şi a coroanei fibroase a cinetocorului. Însă mişcarea direcţionată spre capătul plus care s-a încercat să se pună pe seama kinezinei, nu a putut fi demonstrată experimental, rezultatele fiind contradictorii . În anafaza A , îndepărtarea cromatidelor–surori devenite libere spre polii fusului de
63
diviziune, implică scurtarea microtubulilor cinetocorici, prin depolimerizare la nivelul cinetocorului şi nu la nivelul polului, pe măsură ce cromozomii unicromatidici se mişcă spre poli. Simultan, are loc anafaza B, care constă în separarea celor doi poli ai fusului, prin elongarea microtubulilor polari şi îndepărtarea polilor. Pentru mişcarea cromozomilor nu este necesară nici o sursă de energie cum este ATP. În schimb, pentru elongarea microtubulilor polari este nevoie de ATP, datorită interacţiunii microtubulilor din zona de suprapunere, care scade în lungime pe măsură ce fusul se alungeşte, deci are loc polimerizare la capătul plus, dar şi alunecarea microtubulilor unul faţă de altul.
4.3.Microfilamentele sunt alcătuite dintr-o singură proteină globulară majoră denumită actina, care este proteina citosolică cea mai abundentă în unele celule, responsabilă pentru menţinerea şi modificarea formei celulelor şi pentru generarea forţei de mişcare celulară. Microfilamentele de actină se asociază în îndeplinirea funcţiilor celulare cu numeroase alte proteine, formând structuri specifice, cu funcţii particulare. Cea mai cunoscută este miozina, ea însăşi structurată sub formă de filamente. Microfilamentele de actină cunoscute sub denumirea de actină F sunt polimeri ai unor subunităţi proteice globulare, actina G. Atât în celulele musculare, cât şi în cele nemusculare, microfilamentele de actină constau într-un şirag de monomeri identici, în formă de halteră, cu axa aproape perpendiculară pe axa microfilamentului, ceea ce determină forma de helix a microfilamentului. Polimerizarea are loc după modelul cap-coadă, prin adăugarea de subunităţi globulare legate de ATP, care este complexat cu Mg++, sau de ADP, rezultând o macromoleculă helicală, polară. Monomerii de actină legaţi de ATP polimerizează mult mai rapid decât cei legaţi de ADP. Viteza de elongare este mult mai mare la capetele notate plus faţă de cele minus. Capătul notat (-) este capătul filamentului de actină care prezintă actină G cu situsul de legare al ATP expus mediului apos intracelular, iar capătul opus al microfilamentului este capătul (+).
Figura 37. Structura tridimensională a actinei F şi actinei G; în monomerul de actină G este
marcată cu roşu molecula de ATP fixată pe situs. (imagine preluată din www.spring8.or.jp)
64
Actinele celulelor musculare şi nemusculare sunt exprimate de gene diferite (la om sunt 6 gene care codifică izoforme ale actinei), au mici diferenţe structurale care sunt însă responsabile de diferenţele funcţionale semnificative. Viteza de disociere a microfilamentelor este mult mai redusă decât a microtubulilor, sunt structuri mult mai stabile intrinsec, stabilitatea datorându-se şi proteinelor asociate care organizează filamentele de actină sub formă de reţele şi teancuri. Proteinele asociate filementelor de actină aparţin superfamiliei de proteine cu domeniu omolog calponinei, mai precis deţin două situsuri de legare a actinei a căror secvenţă este omoloagă unei secvenţe din calponină. Organizarea situsurilor de legare a actininei în molecula acestor proteine este determinantă pentru organizarea filamentelor de actină în mănunchiuri sau reţele: fimbrina şi α-actinina determină împachetare strânsă şi aliniere sub forma de teancuri în formaţiuni de adeziune celulară şi expansiuni celulare, iar filamina formează reţele de actină în celule sau expansiuni celulare.
Figura 38. Organizarea filamentelor de actină conectate prin fimbrină (marcată cu roşu ) sub formă
de teancuri- imaginea din stânga (după autor: D.Hanein) şi sub formă de reţea, în care proteina
asociată este filamina, o proteină lungă, cu situsuri de legare ale actinei situate la distanţă în lanţul
polipeptidic, ceea ce determină flexibilitatea ancorării şi formarea reţelei-imaginea din dreapta
(după autor: J.Hartwig). Imagini preluate din Lodish et al. ,,Molecular Cell Biology” fifth ed.)
Anumite proteine asociate favorizează polimerizarea filamentelor de actină cum este profilina, care leagă monomerii de actină în raport 1:1 şi intervine şi în interacţiuni ale actinelor cu membrana celulară (rol în semnalizarea intercelulară). Proteinele Asp2/3 leagă filamente de actină şi determină adiţia de noi monomeri actină: profilină într-o manieră care determină apariţia unei ramificaţii, a unui nou filament de actină, Asp2/3 fiind localizată la punctele de ramificaţie ale unei reţele de actină. Alte proteine asociate ,,acoperă” capătul (+) -proteina cap Z sau capătul (-) -tropomodulina, împiedicând adiţia sau îndepărtarea subunităţilor de actină G, cu stabilizarea filamentelor de actină. Depolimerizarea actinei F este intensificată de cofilină care determină disocierea la capetele (-), gelsolina şi severina rup filamente de actină şi rămân legate la capătul (+) al fragmentelor rezultate, împiedicând adiţia de monomeri, furnizând în schimb numeroase capete (-) ale fragmentelor, care accelerează dezintegrarea citoscheletului actinic. Activitatea proteinelor asociate este reglată prin
65
modificarea concentraţiei unor molecule semnal (PIP2) sau a ionilor de calciu în cursul activării unor căi de semnalizare celulară. Migrarea celulară prin modificarea citoscheletului actinic este rezultatul unor semnale extracelulare. Miozina din celulele musculare este miozina II alcătuită dintr-o regiune globulară prin care se asociază cu actina şi un segment fibros. O astfel de moleculă este constituită din 2 lanţuri polipeptidice grele, identice, şi două perechi de lanţuri uşoare. Fiecare lanţ greu constă dintr-un cap N-terminal globular şi o coadă α-helix sub forma unei baghete, aceasta conţinând şi capătul C-terminal. Cozile α-helix se răsucesc una în jurul celeilalte formând o coadă rigidă, cu două articulaţii, una între cap şi coadă şi una la nivelul cozii. În celulele musculare, 300-400 de dimeri miozinici se asociază pentru a forma un agregat bipolar denumit filament gros de miozină. Miozina are activitate ATP-azică, care este de 200 de ori mai mare în prezenţa microfilamentelor de actină.
Figura 39. Structura miozinei şi interacţiunea filamentelor de miozină cu actina.
În muşchiul striat, miofibrilele sunt organizate în benzi întunecate, benzi A (anizotrope) şi benzi luminoase sau benzi I (izotrope), perpendiculare pe axa lungă a celulei. O miofibrilă este constituită din unităţi repetate denumite sarcomere. Un sarcomer este format dint-o bandă întunecată şi două jumătăţi de benzi luminoase. O bandă luminoasă întreagă este divizată în două jumătăţi de linia sau stria Z, iar banda întunecată este traversată de o zonă mai luminoasă denumită banda H. Un sarcomer este deci delimitat de două linii Z. Microscopia electronică arată că în alcătuirea unui sarcomer intră două tipuri de filamente: groase şi subţiri. Filamentele groase sunt alcătuite din miozină, iar filamentele subţiri sunt alcătuite majoritar din actină. Capetele plus ale filamentelor sunt ancorate de discul rigid Z, iar capetele minus sunt orientate spre centrul sarcomerului. Benzile H sunt regiuni unde, când muşchiul este relaxat, filamentele fine de actină nu se întrepătrund cu filamentele de miozină.
66
În zona de suprapunere, fiecare filament gros de miozină este înconjurat de 6 filamente subţiri de actină.
Figura 40. Structura unui sarcomer. Interacţiunea filamentelor groase de miozină cu filamentele
subţiri de actină în banda A. Imagine preluată din http://respiratory-research.com.
Filamentele de actină sunt ancorate prin capetele (+) la discurile Z, interacţiunea fiind stabilizată prin proteine asociate. Astfel, α-actinina este concentrată în regiunea discurilor Z şi interconectează filamentele de actină. Filamentele de miozină sunt menţinute într-un aranjament hexagonal regulat prin proteine asociate. Există în miocite proteine cu molecule extrem de mari, titina şi nebulina, care formează o reţea de fibre proteice asociate filamentelor de actină şi miozină. Moleculele titinei se extind de la discurile Z la filamentele groase de miozină, stabilizând poziţia centrală a miozinelor, fiecare filament de miozină fiind înconjurat de filamentele de actină în zona de suprapunere. Moleculele de nebulină sunt asociate filamentelor de actină şi se extind de la un capăt al filamentelor de actină la celălalt capăt. Miofibrilele sunt interconectate prin reţea de filamente intermediare denumite desmină şi ancorate la membrana celulară prin proteine flexibile, cum este proteina care leagă actina, denumită distrofină.
4.3.1. Mecanismul molecular al contracţiei musculare. Contracţia musculară presupune scurtarea muşchiului şi a elementelor contractile prin alunecarea filamentelor de actină peste filamentele de miozină. Lăţimea benzii A rămâne constantă în timp ce discurile Z se apropie când muşchiul se contractă. Deci, banda I devine mai îngustă. Contracţia musculară este rezultatul interacţiunii dintre capetele de miozină şi
67
filamentele adiacente de actină: într-o primă etapă (A) miozina leagă ATP, în prezenţa ionilor de calciu, cu slăbirea legăturii dintre miozină şi actină şi punerea în libertate a capului miozinei. În etapa a doua (B), are loc hidroliza ATP la ADP şi Pi, care rămân legaţi de miozină, ceea ce determină o modificare mică a energiei libere, în schimb este generată o stare „energizată” a miozinei, al cărui cap se roteşte prin regiunea de articulaţie, devenind perpendicular pe filamentul de actină. În etapa a treia (C), capul miozinei, în prezenţa ionilor de calciu, eliberează Pi şi se leagă de filamentul adiacent de actină. În etapa a patra (D), capul miozinei pivotează la nivelul articulaţiei, mişcând filamentul de actină faţă de miozină, ceea ce are ca efect contracţia. În timpul acestei etape, unghiul de ataşare al capului miozinei se schimbă de la 90˚ la 45˚ , iar ADP este eliberat. Eliberările de ADP şi Pi sunt etape puternic exergonice care potenţează pivotarea capului miozinic. Cu fiecare ciclu care decurge cu hidroliza unei molecule ce ATP per cap de miozină, filamentul de actină este mişcat pe o distanţă de aproximativ 7 nm, are loc o „păşire” a capetelor de miozină în aceeaşi direcţie, spre capătul plus al filamentelor de actină.
Figura 41. Ciclul de interacţiune miozină-actină. Imagine preluată din http://www.bms.ed.ac.uk.
Fiecare filament gros are aproximativ 500 capete de miozină, iar ciclul descris mai sus se repetă de 5 ori /sec. în contracţia rapidă pentru fiecare cap, rezultând o viteză de alunecare de 15 µm/sec. a filamentelor de actină pe filamentul gros de miozină. Legarea de actină a complexului miozină – ATP este declanşată de creşterea concentraţiei citosolice a Ca++ de la 10-7 la 10-6 moli, prin activarea canalelor pentru calciu din membrana cisternelor reticulului sarcoplasmic ce înconjoară benzile A, sub efectul depolarizării membranelor tubulilor transversali T, invaginări delicate ale membranei plasmatice. Medierea efectelor Ca++ asupra filamentelor de actină este realizată de tropomiozină, care polimerizează tot după modelul cap-coadă şi are situsuri de legare de actină, astfel încât formează filamente ce se dispun în şanţurile helixului actinei. Tropomiozina are şi situsuri specifice de legare a troponinei T, care la rândul ei leagă troponinele I (inhibitorie) şi C (leagă Ca2+) la tropomiozină. Troponina I legată la tropomiozină determină o modificare conformaţională a actinei, care se poate lega de capetele de miozină, dar nu le poate activa regiunea ATP-azică. Troponina C, are structură
68
şi funcţie asemănătoare calmodulinei, cu situsuri de legare a calciului ionic. Legarea calciului are ca efect îndepărtarea TnI şi TnC de tropomiozină. Tropomiozina eliberată îşi modifică poziţia pe filamentul de actină, expunând monomerii de actină interacţiunii cu capetele de miozină, într-o manieră în care funcţia ATP-azică este activată.
4.3.2. Particularităţi de reglare a contracţiei în celulele musculare netede. Filamentele contractile ale muşchiului neted nu au o organizare sarcomerică, nu au sistem dezvoltat al RS, nici sistem de tubuli ai sarcolemei. Ca urmare, schimbarea concentraţiei Ca++ în citosol este lentă, răspunsul este lent şi tensiunea contractilă este staţionară. Celula musculară netedă este lipsită de troponine. În consecinţă, reglarea prin calciu a contracţiei musculare este diferită, prin calmodulină. În celula musculară netedă, miozina LC inhibă activitatea ATP-azică a miozinei. Prin fosforilarea miozinei LC, sub acţiunea miozin LC- kinazei, enzimă calmodulină-Ca++ dependentă şi cAMP, DAG- dependentă, miozina LC devine inactivă şi contracţia poate avea loc. Fosforilarea acestor lanţuri uşoare de miozină (miozina LC) permite şi polimerizarea miozinei în filamente groase. O proteină denumită caldesmon, este legată în prezenţa ionilor de calciu de tropomiozină de-a lungul filamentelor de actină şi împiedică interacţiunea actinei cu miozina. Creşterea nivelului calciului citosolic şi formarea complexului Ca++-calmodulina are ca efect legarea de acest complex a calmodulinei, desprinderea ei de pe tropomiozină şi astfel are loc interacţiunea miozinei cu actina.
4.3.3.Actina şi miozina în celulele nemusculare. Filamentele de actină din celulele nemusculare au un pronunţat caracter tranzitoriu, formarea reţelei de microfilamente este reglată de factori proteici şi de concentraţia ionilor de calciu prin două proteine identice ca structură şi funcţie : vilina şi gelsolina. La o concentraţie mare a ionilor de calciu, proteinele rup filamentele de actină şi rămân ataşate capetelor plus, împiedicând reasamblarea filamentelor. La concentraţii mici ale ionilor de calciu, vilina accelerează procesul de polimerizare al actinei. Profilina se leagă de monomerii de actină formând un complex profilin-actină, care favorizează alungirea filamentului de actină la capătul plus. În aceste celule, actina interacţionează cu capetele de miozină la fel ca în celulele musculare, deşi miozina este prezentă în cantităţi mici. Capetele plus ale microfilamentelor de actină sunt ancorate de membrana plasmatică, deci există posibilitatea ca în urma ataşării miozinei să se genereze tensiuni contractile. Activarea funcţiei ATP-azice a miozinei, se realizează prin complexul Ca++- calmodulină, ceea ce explică lipsa troponinelor din aceste celule, deşi s-a pus în evidenţă prezenţa tropomiozinei. Exemple: a. Microvilii sunt expansiuni ale celulelor epiteliale ce delimitează lumenul intestinului subţire şi al tubului contort proximal în rinichi. Sunt formaţiuni necontractile, alcătuite din regiunea centrală şi reţeaua terminală. Regiunea centrală este reprezentată de un mănunchi de filamente de actină dispuse paralel, cu capetele plus îndreptate spre vârful microvilului, cu rol structural, de menţinere a formei microvilului. Din regiunea centrală lipsesc miozina, tropomiozina şi alfa-actinina. Au fost izolate fimbrina şi vilina care stabilizează filamentele în mănunchiuri şi proteina 110, similară miozinei I, care are activitate ATP-azică. Se apreciază că tensiunea generată de proteina110 menţine mănunchiul de actină
69
în poziţie centrală. La polul bazal, reţeaua terminală alcătuită din filamente scurte de actină şi proteine asociate cum este fodrina, interconectează filamentele de actină în mănunchi şi interconectează mănunchiurile între ele.
Figura 42. Structura microvililor. Imagine preluată din: Ross ,,Histology: A Text and Atlas”, 4th ed.
b. Mişcarea amiboidală este un tip particular de locomoţie întâlnit şi la celule din corpul uman: macrofage, fibroblaste, limfocite şi constă din emiterea şi retracţia continuă a unor prelungiri celulare. Procesul are la bază tranziţia reversibilă a hialoplasmei din stare de gel, în stare fluidă, de sol. Regiunea centrală a celulei, denumită endoplasmă conţine particule şi organite celulare aflate în permanentă mişcare. În această regiune, hialoplasma se află în stare de sol. În regiunea distală, aflată sub membrana plasmatică, este localizată ectoplasma, lipsită de organite, dar cu o reţea de filamente de actină, interconectate prin filamină. În reţeaua de microfilamente se mai găsesc şi alte proteine asociate, alfa-actinina şi gelsolina. Filamina şi alfa-actinina, proteine implicate în formarea şi stabilizarea reţelei filamentelor de actinină asigură tranziţia în starea de gel, în timp ce gelsolina, în condiţiile creşterii concentraţiei ionilor de calciu, scindează filamentele de actină.
c. Actina şi miozina în citokineza celulelor animale. Citokineza are loc prin intermediul unui inel contractil, format în cea mai mare parte din microfilamente de actină, situat sub plasmalemă, la nivelul şanţului de clivaj. Citokineza se produce prin dezasamblarea treptată a filamentelor de actină. Procesul de clivare progresează datorită unor interacţiuni de tip actină- miozină, filamentele de actină şi cele de miozină formând minisarcomere, fără discuri Z.
d. Conul de creştere al neuroblastelor. Neuroblastele sunt precursorii neuronilor, celule în curs de diferenţiere, fără proiecţii axonale sau dendritice. Conul de creştere
70
explorează suprafeţele şi direcţionează creşterea axonului spre o ţintă celulară, astfel încât viitorul neuron să-şi poată îndeplini funcţia de interconectare specifică, prin intermediul lamelipodiilor şi filopodiilor. Lamelipodiile sunt emisii citoplasmatice la nivelul cărora citoplasma se „dispersează” deasupra substratului. Filopodiile, denumite şi microspiţe, sunt prelungiri alungite şi subţiri care conţin filamente de actină, pot fi extinse şi retrase, orientând creşterea spre o anumită direcţie. Aceste mişcări sunt determinate de minimiozine. Creşterea axonală şi dendritică propriu-zisă se desfăşoară prin polimerizarea microtubulilor.
e. Activarea plăcuţelor sangvine. Plăcuţele sangvine provin din megacariocitele din măduva osoasă, nu sunt nucleate, dar au mici vezicule interne. Plăcuţele se ataşează la nivelul leziunii endoteliului, formând un dop, apoi se activează, îşi schimbă forma producând filopodii lungi. Procesul este declanşat de fuzionarea membranelor veziculelor interne cu membrana plasmatică. Apar astfel pe suprafaţa plachetelor molecule proteice de suprafaţă noi, care măresc capacitatea de aderare. În plăcuţele activate, monomerii de actină – profilină polimerizează în microfilamente de actină, care determină schimbarea formei plăcuţelor.
Figura 43. Activarea plăcuţelor sangvine. Imagine preluată din Alberts et al, ,,Molecular Biology of
the Cell”, fourth ed.
71
4.4. Filamentele intermediare au un diametru intermediar (8-12nm), sunt mai groase decât filamentele de actină şi mai subţiri decât microtubulii. Ca şi celelalte elemente constitutive ale citoscheletului, sunt rezultatul polimerizării subunităţilor proteice, dar aceste subunităţi proteice sunt specifice unui anumit tip celular.
Figura 44. Model de construcţie a filamentelor intermediare. Imagine preluată din Alberts et al.
,,Molecular Biology of the Cell”, fourth ed.
Cele 5 tipuri de proteine prezintă caracteristici structurale comune, fiind formate dintr-o regiune centrală α-helicoidală şi două domenii globulare de mărimi variabile, în regiunile carboxi- şi aminoterminale (A, în figura de mai sus). Subunităţile proteice formează dimeri prin înfăşurarea strânsă una în jurul celeilalte a regiunilor centrale, în timp ce capetele globulare rămân separate, subunităţile fiind orientate paralel (B). Aceleaşi regiuni centrale sunt responsabile de asocierea în tetrameri, dar antiparalel (C). Prin legarea cap la cap a tetramerilor se generează protofilamentul (D), iar 8 protofilamente generează filamentul intermediar (E). S-a constatat că aceste subunităţi pot genera homopolimeri, în celulele în
72
care genele coexprimă anumite proteine, acestea copolimerizează. Modul de ordonare al subunităţilor proteice în filamente imprimă acestora un caracter apolar. Deci, spre deosebire de microfilamentele de actină şi microtubuli, filamentele intermediare au capete echivalente funcţional; polimerizarea şi depolimerizarea se desfăşoară cu aceeaşi viteză la ambele extremităţi.
4.4.1. Tipuri de filamente intermediare şi semnificaţia lor funcţională
4.4.1.1. Filamentele de vimentină sunt prezente în celulele mezenchimale (celule endoteliale ale vaselor sangvine, fibroblaşti, adipocite) şi unele celule epiteliale. În celulele epiteliale filamentele de vimentină sunt ancorate în desmozomi, contribuind la creşterea rigidităţii ţesutului epitelial. În adipocite filamentele înconjoară picaturile lipidice, impiedicându-le să fuzioneze între ele sau cu membranele celulare. În toate tipurile celulare filamentele de vimentină sunt fizic legate de membrana nucleară, fiind probabil implicate în coordonarea spaţială a nucleului celular. Se constată existenţa unei strânse asocieri între filamentele de vimentină şi microtubuli. Studiile efectuate pe fibroblaşti cultivaţi in vitro au demonstrat că în celulele aflate în mitoză, filamentele intermediare înconjoară mănunchiurile de microtubuli ce formează fibrele fusului de diviziune. Cele 2 tipuri de filamente sunt interconectate prin proteine, încă neidentificate. Tratarea acestor celule cu colchicină a condus la dezasamblarea microtubulilor urmată de deplasarea filamentelor de vimentină ce se organizează în mănunchiuri în apropierea nucleului. Acest experiment sugerează rolul important pe care microtubulii îl au în organizarea filamentelor de vimentina. 4.4.1.2. Filamentele de desmină se întâlnesc în toate tipurile de celule musculare. Filamentele din celulele muşchilor striaţi formează o reţea ce străbate întreaga miofibră şi care leagă discurile Z între ele, de membrana plasmatică şi, posibil, de unele organite celulare (mitocondrii). Se apreciază că filamentele de desmină joacă, în principal, un rol structural, susţinând discurile Z şi miofibrilele. 4.4.1.3. Neurofilamentele (NF) sunt prezente exclusiv în axonii celulelor nervoase. În corpul celular cele trei polipeptide se asamblează în filamente şi se asociază cu microtubulii. Complexele neurofilamente-microtubuli se deplasează în axon, conferindu-i acestuia stabilitate. 4.4.1.4. Filamentele gliale sunt caracteristice celulei gliale. 4.4.1.5. Filamentele de cheratină (tonofilamentele) sunt întâlnite în celulele epiteliale. Ancorate în desmozomi, filamentele de cheratină formează în celula epitelială o reţea ce asigură rezistenţa epiteliilor la factori mecanici. Se apreciază că fiecare tip de celulă epitelială conţine un complement citocheratinic specific.
73
5.Nucleul celular
Este cel mai mare organit din celulă. Conţine genomul, baza de date a celulei, informaţia genetică codificată în molecula de ADN. Nucleul este delimitat de învelişul nuclear compus din două membrane separate prin spaţiul perinuclear. Nucleul conţine nucleolii, nucleoplasma şi cromatina.
Figura 45. Structura nucleului celular şi continuitatea membranei externe a învelişului nuclear cu
reticulul endoplasmic rugos. Imagine preluată din http://www.cytochemistry.net/cell-biology
5.1. Învelişul nuclear este format din două membrane care fuzionează la anumite intervale formând porii care delimitează cisternele perinucleare. Membrana externă are 6nm grosime, faţa citoplasmică prezintă continuitate structural-funcţională cu RER, posedă ribosomi care sintetizează proteinele al căror lanţ polipeptidic pe măsură ce este elongat, intră în cisternele perinucleare. Faţa citoplasmică a membranei externe a învelişului nuclear este în contatct cu o reţea de filamente intermediare de vimentină. Membrana internă are 6nm grosime şi este structura învelişului orientată spre materialul nuclear, dar separată de acesta prin lamina nucleară, o structură fibroasă, de 80-300nm grosime, formată din lamininele A,B,C, filamente intermediare care ajută la organizarea învelişului nuclear şi cromatinei perinucleare, având rol de susţinere. Lamininele au un rol important în diviziunea celulară, în asamblarea şi dezasamblarea învelişului nuclear: fosforilarea lamininelor determină dezasamblarea, iar defosforilarea determină reasamblarea învelişului nuclear.
74
Figura 46. Învelişul nuclear în microscopie electronică (sursa: Martin Goldberg, imagine preluată din
Cisternele perinucleare sunt situate între membrana externă şi cea internă, cu o grosime de 20-40nm, continuă cu cisternele RER, sunt perforate de porii nucleari. Porii nucleari au în medie diametrul de 80nm. Numărul lor este asociat cu intensitatea activităţii metabolice a celulei: poate ajunge la câteva mii. Complexul porului nuclear (NPC) este alcătuit din aproximativ 100 de proteine, este alcătuit dintr-un inel citoplasmic care prezintă fibre ce se extind şi în citoplasmă, un inel nucleoplasmic, cu un coş nuclear central, un inel central care conţine proteine-transportor răspunzătoare de transportul mediat de receptori al proteinelor, dinspre şi înspre nucleu.
A. B. C.
Figura 47. Complexul porului nuclear. A. Reconstituire a structurii porului nuclear (de sus în jos):
inelul citoplasmic, inelul central şi inelul nucleoplasmic cu coşul nuclear central; B.imagine în
microscopie electronică a inelului nucleoplasmic cu coşul nuclear central; C. imagine în microscopie
electronică a inelului citoplasmic. Imagini preluate din http://www.nature.com.
Funcţiile NPC: este implicat în transportul pasiv prin difuzie, având canale deschise cu diametrul de 9-11nm; este răspunzător de transportul activ al proteinelor prin mecanism mediat de receptori, proteinele transportate având o secvenţă de aminoacizi denumită secvenţă-semnal de localizare nucleară (NLS). Importul şi exportul macromoleculelor
75
necesită karioferine denumite importine şi exportine. Importinele recunosc şi leagă în molecula proteinelor secvenţa NLS. Proteinele, ARN de transfer şi particulele ribosomale sunt exportate din nucleu în asociere cu exportine. Transportul activ al macromoleculelor prin NPC este mediat de GTPaze denumite Ran. Ran-GTP leagă karioferinele. Importinele eliberează macromolecula transportată în momentul în care se leagă de Ran-GTP, în timp ce exportinele trebuie să se asocieze cu Ran-GTP pentru a forma un complex ternar cu particula de export. Statutul dominant al Ran depinde de localizare: Ran-GTP în nucleu şi Ran-GDP în citoplasmă.
Figura 48. Importul proteic nuclear. Imagine preluată din: http://kc.njnu.edu.cn
5.2. Nucleolul este o zonă densă din nucleu, nedelimitată de o membrană, prezentă în celule cu sinteză proteică activă. Pot exista unul sau mai mulţi nucleoli, detectabili când celula este în interfază. Nucleolii conţin ARNr şi proteine, puţin ADN. Se formează în jurul unor loci genetici specifici alcătuiţi din ADN repetitiv ,,în tandem" care conţin genele ARNr, denumiţi regiuni de organizare nucleolară (NOR): porţiuni ale cromozomilor umani 13,14,15,21,22, unde sunt localizate genele care sunt transcrise în ARNr. Aceste regiuni sunt implicate în reconstituirea nucleolului în faza G1 a ciclului celular. Nucleolul are 4 regiuni distincte: 1. Un centru fibrilar care conţine ADN inactiv (care nu este transcris) şi NOR; 2. Pars fibrosa, o regiune fibrilară densă alcătuită din fibrile de 5nm care înconjură centrul fibrilar şi conţine ADN activ şi preARNr. 3. Pars granulosa, o componentă granulară care conţine particule precursori ale ribosomilor cu dimensiuni de 15nm. 4. Matricea nucleolară
76
Figura 49. Electronomicrografii ale nucleului celular cu nucleolul (Nu), eucromatina (E) şi
heterocromatina (H), raportul cu reticulul endoplasmic rugos şi structura nucleolului: centri fibrilari
(fc), pars fibrosa (dfc), pars granulosa (gc). Imagine preluată din: http://www.bio.miami.edu
Funcţiile nucleolului:
1. sinteza ARNr şi asamblarea în precursori ai ribosomilor 2. conţine proteine nucleolare care funcţionează ca proteine semnal ale punctelor critice de control ale ciclului celular.
Iniţial, prin transcrierea ADN care codifică ARNr de către ARNpolimeraza I, se formează un preARNr de 45S care este procesat prin metilare şi activitatea endo şi exonucleazelor, cu formarea ARNr matur de 28S, 5,8S şi 18S gata de utilizat în biogeneza ribosomilor. Pentru biogeneză este necesar şi un ARNr de 5S care este transcris de pe o genă aflată în afara NOR, în nucleoplasmă. Proteinele ribosomale sunt transcrise în citoplasmă. ARNm este exportat din nucleu, are loc sinteza de proteine în ribosomii RER, apoi proteinele sunt importate în nucleu, ajung la nucleol unde are loc biogeneza ribosomilor.
5.3. Nucleoplasma este formată din: matricea nucleară şi diferite tipuri de particule. Matricea nucleară are funcţia de suport pentru organizarea nucleoplasmei şi conţine: - componenţi structurali: elemente fibrilare, pori nucleari, complexe nucleare laminare, nucleoli reziduali, o reţea reziduală de riboproteine - componenţi funcţionali pentru transcripţia şi procesarea ARNm şi ARNr, situsuri de legare ale receptorilor steroidici, situsuri de legare ale carcinogenilor, proteine de şoc termic, dezoxoribovirusuri, proteine virale. Particulele nucleare sunt: - granule de heterocromatină, grupări de particule dispuse dezordonat, cu diametru de 20-25nm, alcătuite din ribonucleoproteine şi enzime. - granule de pericromatină, granule izolate, dense, cu diametrul de 30-50nm, înconjurate de un halou dens, localizate la periferia heterocromatinei, cu o substructură alcătuită din fibrile
77
compacte de 3nm. Sunt alcătuite din ARN 4,7S şi două peptide similare celor aflate în hnRNP (ribonucleoproteine nucleare heterogene). Pot fi hnRNP alcătuite din preARNm şi proteine implicate în procesarea ARNm. Cresc ca număr în celulele hepatice expuse la carcinogeni sau la temperaturi mai mari de 37˚C.
5.4.Cromatina nucleară este formată din ADN dublu-catenar complexat cu histone şi proteine acide. Cromatina este constituită din heterocromatină, cromatină condensată inactivă, localizată la periferia nucleului şi în jurul nucleolilor sau împrăştiată prin nucleoplasmă şi eucromatină activă transcripţional, cu rol în sinteza ARN şi diviziunea celulară. (vezi figura 49.) 5.4.1.Structura cromatinei. Cromatina este un complex alcătuit din ADN dublu-helical şi un tip special de proteine denumite histone, octamere formate din 4 tipuri de histone: H2A, H2B, H3, H4, în jurul cărora ADN se înfăşoară strâns, formând o structură compactă. Elementul structural repetitiv de bază al cromatinei este nucleosomul. Nucleosomii sunt interconectaţi prin ADN linker (de legătură). În adiţie faţă de histonele din miezul octameric al nucleosomului, există o altă histonă H1, de legătură, care se află în contact cu ADN care iese şi intră în nucleosom. Nucleosomul împreună cu histona H1 formează cromatosomul.
Figura 50. Nucleosomul (octamerul histonic şi ADN) care împreună cu H1 formează cromatosomul.
78
Cromatosomii, conectaţi prin ADN linker de 20-60pb, formează structura ,,şirag de mărgele" de 11nm grosime. Fibra de 11nm se răsuceşte într-o structură helicală cu diametrul de 30nm, denumită structură solenoid cu 6 nucleosomi/tură. Acest nivel de organizare a structurii cromatinei (fibra de nucleosomi) corespunde eucromatinei, care conţine gene active transcripţional. ME a demonstrat că structura de solenoid este foarte dinamică, ea se depliază în fibra de 11nm când este parcursă de ARN polimeraza angajată în transcripţie.
Figura 51. Structura solenoid a cromatinei şi imaginile în microscopie electronică ale fibrei de 11nm
şi structurii solenoid de 30nm. Imagine preluată din http://kc.njnu.edu.cn.
Structura de solenoid se spiralează, se înfăşoară pentru următorul nivel de împachetare al ADN, caracteristic cromatinei în metafază. Structura dezoxiribonucleoproteică a cromatinei este stabilizată prin interacţiunea cu o reţea proteică nonhistonică denumită matrice nucleară, al cărui component major este topoizomeraza II. Prin interacţiunea fibrei de 30nm cu proteinele matricii nucleare, aceasta formează bucle, fiecare conţinând 75kb ADN: fibra de cromatină şi proteinele nonhistonice asociate formează o structură helicală care poate fi observată ca un cromozom.
Figura 52. Interacţiunea fibrei de cromatină cu proteinele
matricii nucleare. ( http://kc.njnu.edu.cn)
79
53.A. 53.B.
Figura 53. Condensarea cromatinei sub formă de cromozom în metafază
Imaginea 53 A este preluată din http://kc.njnu.edu.cn; Imaginea 53 B este preluată din
http://www.cytochemistry.net/cell-biology
5.4.2. Replicarea ADN intervine în cursul procesului de diviziune celulară, materialul genetic al celulelor fiice trebuie să fie identic cu cel al celulei mamă, de aceea replicarea ADN este un proces cu înalt grad de fidelitate. Este un proces complex, care implică multiple activităţi enzimatice. Există 5 tipuri distincte de ADN polimeraze identificate ca: α, β, γ, δ, ε. Polimeraza α este echivalentul ADN polimerazei III de la procariote, ADN polimeraza β este echivalentul ADN polimerazei I de la procariote, deci are rol de a cataliza mecanismele de reparare ale ADN lezat sau greşit împerecheat , în timp ce polimeraza γ intervine în replicarea ADN mitocondrial. Capacitatea ADN polimerazei de a replica ADN necesită o serie de proteine adiţionale: primaza, proteine accesorii de procesare, proteine de legare de monocatena de ADN, helicaza, ADN ligaza, topoizomeraze şi uracil-ADNglicozilază. Procesul de sinteză al ADN începe în situsuri specifice denumite origini ale replicării, necesită o amorsă cu capăt 3΄OH, se desfăşoară în direcţia 5΄→3΄ de-a lungul ambelor catene, are ca rezultat copierea ambelor catene în manieră semiconservativă, ceea ce înseamnă că noua catenă (fiică) sintetizată rămâne asociată cu catena matriţă (mamă). Dimensiunea mare a cromozomilor eucarioţi şi limitele de încorporare ale nucleotidelor în cursul sintezei ADN, determină necesitatea existenţei mai multor origini de replicare, pentru ca replicarea să se desfăşoare într-o perioadă de timp rezonabilă. Este clar că la nivelul originilor de replicare, catenele dublului helix de ADN trebuie să se desfacă prin ruperea legăturilor existente între perechile de nucleotide complementare, necesită şi o dezrăsucire, ceea ce determină accesibilitatea catenelor pentru ADN polimeraza. Despiralizarea dublului helix este realizată de helicază. Regiunile monocatenare rezultate, sunt stabilizate prin proteinele de stabilizare a ADN monocatenar, acesta fiind accesibil ADN polimerazei. Situsul catenelor despiralizate la
80
nivelul căruia se desfăşoară replicarea ADN se numeşte furculiţă de replicare. ADN polimeraza începe sinteza ADN prin ataşarea grupării 5’-fosfat a unui nucleotid la o grupare 3’-OH liberă a unei amorse. Amorsa cu gruparea 3’-OH liberă este furnizată prin activitatea primazei, care utilizează catena de ADN ca matriţă pentru sinteza unui segment scurt de ARN, denumit primer sau amorsă. Sinteza continuă prin esterificarea grupării 3’-OH a nucleotidului ataşat anterior cu gruparea 5’-fosfat a nucleotidului următor, cu eliberare de pirofosfat, în direcţie 5’→3’, ADN polimerazele parcurgând catenele matriţă în direcţie 3’→5’. Iniţierea replicării decurge concomitent pe ambele catene de ADN parentale, dar continuă bidirecţional, cu o catenă parentală copiată continuu (catena în avans sau ,,leading strand") şi cealaltă copiată discontinuu (catena întârziată sau ,,lagging strand"). Termenul de catenă copiată ,,continuu” este relativ, deoarece ADN polimerazele nu rămîn asociate catenelor matriţă indefinit, capacitatea unei ADN polimeraze de a rămâne ataşată ADN monocatenar se numeşte procesivitate. Cu cât ADN polimeraza rămâne ataşată mai mult timp de catena matriţă, cu atât procesivitatea ei este mai mare, fiind intensificată prin activitatea proteinelor adiţionale care alcătuiesc replisomul. Catena în întârziere este formată din fragmente scurte de ARN primer şi ADN nou sintetizat (100-200 nucleotide) denumite fragmente Okazaki. Un model care explică copierea simultană în aceeaşi direcţie 5΄→3΄ a ambelor catene de ADN parental de către ADN polimerază propune că ADN polimeraza ar exista ca dimeri asociaţi cu alte proteine necesare replicării, identificaţi ca replisomi la nivelul furculiţei de replicare. Catena în întârziere este temporar înfăsurată în jurul replisomului, astfel încât ADN polimeraza se mişcă de-a lungul ambelor catene parentale în direcţia 3΄→5΄simultan pentru distanţe scurte care corespund unui fragment Okazaki. Pe măsură ce furculiţa de replicare înaintează de-a lungul catenelor parentale, catena nou-sintetizată şi catena parentală formează dublu-helix, ceea ce înseamnă că există doar mici porţiuni de ADN monocatenar la fiecare moment dat al replicării. Progresia furculiţei de replicare necesită o continuă despiralizare a dublului-helix de ADN, iar ADN eucariotic fiind ataşat reţelei proteice a matricii nucleare, deplasarea progresivă a furculiţei de replicare introduce un sever stress de torsiune în duplexul aflat în avans de furculiţa de replicare. Aceste constrângeri topologice sunt rezolvate prin activitatea ADN topoizomerazelor, care realizează breşe prin ruperea ambelor catene de ADN ( topoizomeraza II) sau a uneia (topoizomeraza I). Breşele sunt reunite tot prin activitatea topoizomerazelor. Primerii ARN ai catenei în avans şi ai fragmentelor Okazaki ale catenei în întârziere sunt înlăturaţi prin activitatea polimerazelor care realizează mecanismele reparatorii ale ADN, simultan fiind încorporate dezoxiribonucleotide. Spaţiile dintre capătul 3΄OH al unei catene în avans şi grupul 5΄fosfat al alteia sunt reunite de ADN ligaza, ca şi fragmentele Okazaki ale catenelor în întârziere, astfel procesul de replicare fiind complet.
81
Figura 54. Modelul recent al replicării ADN. RPA sunt proteine de stabilizare a monocatenei de ADN
rezultată în urma despiralizării sub acţiunea helicazei; ADN polimeraza α sintetizează primerul ARN;
RFC dislocă polimeraza α şi leagă PCNA pe ADN. ADN polimeraza δ se asociază pe PCNA
(,,Proliferating Cell Nuclear Antigen”) pentru a forma holoenzima ADN polimeraza δ activă,
procesivă, care extinde catena de ADN prin adăugarea de noi nucleotide. În catena ,,în avans”
sinteza ADN este continuă, în timp ce în catena ,,în întârziere” sinteza ADN continuă numai până
activitatea a două enzime: înlăturarea primerului ARN prin activitatea exonucleazică a RNazei H, iar
ultimul ribonucleotid şi parte din ADN-ul adiacent sunt înlăturate prin activitatea exonucleazei
Fen-1. O a treia enzimă, ADN ligaza, repară breşele şi realizează continuitatea catenelor nou-
sitetizate (http://herkules.oulu.fi)
82
5.4.3. Genele. Unitatea structural-funcţională a eredităţii este o copie unică a unei gene funcţionale. Genele eucariote, alcătuite din ADN, conţin instrucţiunile pentru sinteza moleculelor proteice şi a unor molecule mici de ARN (genele polimerazei II), pentru sinteza ARN ribozomal (genele polimerazei I) şi pentru sinteza ARN de transfer şi a altor ARN de dimensiuni mici (genele polimerazei III). Genele umane sunt variabile ca dimensiuni, de la câteva sute de baze, până la mai mult de 2 milioane de baze (gena distrofinei responsabilă pentru distrofia musculară Duchenne are 2,5 Mb). Genomul uman conţine 30000-35000 de gene, ceea ce corespunde unei medii de 1300-1500 de gene/cromozom uman. Fiecare persoană are câte două copii ale fiecărei gene, câte una moştenită de la fiecare părinte. Alelele sunt forme ale aceleiaşi gene care se caracterizează prin mici diferenţe în secvenţa proprie de ADN. Aceste mici diferenţe determină trăsăturile unice ale fiecărui individ. Cele mai multe gene sunt formate din regiuni denumite exoni care sunt exprimate, cu secvenţe intercalate denumite introni, care nu se exprimă. Intronii sunt transcrişi în preARN mesager (ARN primar) în nucleu, dar sunt înlăturaţi prin clivare din ARN matur, în citoplasmă. Numărul mediu de exoni/genă umană este 9, în timp ce numărul mediu de introni este 8, dar sunt mari variaţii de la această medie: gena distrofinei conţine 79 exoni, în timp ce gena β-globinei conţine doar 3 exoni. Lungimea medie a unui exon dintr-o genă umană este de 145 pb. Alături de exoni şi introni, genele umane conţin o regiune 5’promotor reglatoare situată adiacent în amonte, alte secvenţe reglatoare care cuprind intensificatori (,,enhancers”), inhibitori (,,silencers”) care sunt situate la distanţă de secvenţele codificatoare şi o regiune locus de control (,,LCR”). Primul şi ultimul exon conţin regiuni care nu sunt translatate cunoscute ca 5’UTR şi respectiv, 3’UTR. 5’UTR marchează startul transcripţiei şi conţine un codon de iniţiere care reprezintă situsul de start al translaţiei. 3’UTR conţine un codon de terminare a translaţiei şi coada poliA. Regiunea promotor conţine secvenţele TATA, CG, CAAT care reprezintă situsurile de legătură pentru factorii de transcripţie.
Figura
55. Structura unei gene funcţionale de tip Poli II şi sinteza ARN mesager corespunzător genei.
Imagine preluată din http://nitro.biosci.arizona.edu
83
5.4.4. Sinteza ARN denumită transcripţie, este procesul de transcriere a informaţiei codificată în secvenţa nucleotidelor din ADN, într-o secvenţă de nucleotide din ARN. Mai precis, secvenţa ADN este copiată enzimatic de către ARN polimeraza pentru formarea unei secvenţe complementare de ARN mesager, denumit în aşa fel pentru că poartă mesajul genetic de la ADN la sediul sintezei de proteine. Diferenţa semnificativă între moleculele de ADN şi ARN este prezenţa uracilului (U) în ARN în locul timinei (T) din ADN. În cazul genelor funcţionale, alcătuite din secvenţe de ADN care codifică proteine, primul pas care conduce la exprimarea informaţiei conţinute de genă este sinteza prin transcripţie a ARN mesager care poate fi considerat un intermediar. O unitate de transcriere a ADN (o genă) este translatată apoi într-o proteină. O astfel de unitate conţine secvenţa care codifică proteina şi secvenţe care reglează translaţia, adică sinteza proteică.
Figura 56. Sinteza ARN. Imagine preluată din: http://www.phschool.com/science/biology_place.
Transcripţia este realizată de ARN polimeraze, care sunt de mai multe tipuri, în funcţie de tipul de ARN pe care îl sintetizează.
Figura 57. ARN polimerazele (tipul I, tipull II, tipul III)
84
ARN polimeraza I sintetizează un preARNr de 45S (ARNr precursor), din care se formează ARNr maturi de 28S, 18S şi 5,8S care formează componenta ribonucleică majoră a ribosomilor. ARN polimeraza II sintetizează precursori de ARNmesager, cei mai mulţi ARNsn (,,small nuclear”), microARN (miARN) şi small interferenceARN (siARN) cu rol în expresia genică. Este tipul de sinteză de ARN cel mai studiat, implică o diversitate de factori de transcripţie care sunt necesari pentru legarea ARN polimerazei II la promotor şi care sunt implicaţi într-un control strict al procesului de transcripţie. ARN polimeraza III sintetizează ARNt, ARNr 5S şi alte molecule mici de ARN localizate în nucleu şi citosol. Procesul de transcripţie se află sub un control strict, mecanismele de reglare determină iniţierea acestui proces şi cantitatea de ARN care va fi produs. Transcripţia unei gene de către ARN polimerază poate fi reglată cel puţin prin următoarele mecanisme: 1. Factorii de specificitate modifică specificitatea ARN polimerazei pentru un anumit promotor sau set de promotori, crescând sau scăzând probabilitatea ca ARN polimeraza să se lege de aceştia. 2. Represorii se leagă de secvenţe noncodogene care sunt apropiate sau suprapuse regiunii promotor, împiedicând ARN polimeraza să avanseze de-a lungul catenei ADN, deci împiedicând exprimarea genei. 3. Activatorii intensifică interacţiunea ARN polimerazei cu un anumit promotor, favorizând exprimarea genei, prin interacţiuni cu subunităţi ale ARN polimerazei sau, indirect, prin modificări ale structurii ADN. 4. Intensificatorii (,,enhancers”) sunt situsuri de pe helixul de ADN care leagă activatorii cu scopul de a se forma o buclă a ADN care va aduce un promotor specific în complexul de iniţiere. Aceşti factori generali de transcripţie poziţionează ARN polimeraza la situsul start al secvenţei codogene, consecutiv declanşând transcrierea ADN de către ARN polimerază cu formarea ARN mesager. Procesul de transcripţie (indiferent de tipul de ARN polimerază care îl catalizează) cuprinde 3 etape principale: iniţierea, elongarea şi terminarea. Iniţierea constă în construcţia complexului ARN polimerază pe promotorul genei, proces în care intervin factorii de transcripţie. Polimerazele eucariote nu recunosc direct secvenţa promotorului, legarea ARN polimerazei de acesta fiind mediată de un grup de proteine denumite factori de transcripţie. Numai după ce anumiţi factori de transcripţie se leagă de promotor, ARN polimeraza recunoaşte şi se leagă şi ea la acest situs, formându-se complexul de iniţiere a transcripţiei. O secvenţă promotor bine cunoscută şi conservată în multe organisme eucariote este secvenţa TATA, localizată la aproximativ 25 de nucleotide în amonte de punctul de start al transcripţiei (TSP), alături de alte secvenţe mai slab conservate în evoluţie care includ Elementul de Recunoaştere al TFIIB (BRE), aproximativ 5 nucleotide în amonte ,,upstream”(BREu) şi 5 nucleotide în aval ,,downstream” (BREd)de secvenţa TATA. Ordinea în care se ataşează factorii generali de transcripţie este următoarea: 1. Proteina de legare de TATA (TBP: ,,TATA Binding Protein”) şi un complex preformat de factori proteici ataşaţi TBP (TAF: ,,TBP Associated Factors”), împreună cunoscute ca TFIID (,, Transcription Factor for Polymerase II D”) sau factor de transcripţie
85
pentru polimeraza II D, se leagă la secvenţa TATA. 2. TFIIA alcătuită din trei subunităţi , leagă TFIID dar interacţionează şi cu ADN, stabilizând prima intercţiune. 3. TFIIB se leagă între TFIID şi situsul unde va avea loc interacţiunea proximă cu ARN polimeraza. Legarea TFIIB este parţial specifică, având o anumită preferinţă pentru secvenţele BRE. 4. TFIIF alcătuită din două subunităţi (RAP30 şi RAP74) prezintă anumite similarităţi cu factorul σ de la bacterii şi intră în complexul de iniţiere împreună cu ARN polimeraza II. TFIIF accelerează procesul de polimerizare a ribonucleotidelor. 5. TFIIE intră în complexul de transcripţie şi are rol în modificări conformaţionale ale ARN polimerazei (asemănătoare închiderii şi deschiderii maxilarelor), care permite mişcarea de-a lungul catenei de ADN. 6. TFIIH intră în complexul de iniţiere concomitent cu TFIIE, şi în final se leagă la acest complex. TFIIH interacţionează puternic cu TFIIE. TFIIE influenţează activitatea catalitică a TFIIH, în lipsa TFIIE, TFIIH nu poate desface şi despiraliza helixul de ADN la nivelul promotorului. TFIIH este el însuşi un complex de proteine care conţine pe lângă alte proteine CDK7/complex ciclinH kinaza şi ADN helicaza. TFIIH are trei funcţii: se leagă specific la catena de ADN care trebuie transcrisă şi asigură că se transcrie lanţul corect, despiralizează dublul-helix al ADN în manieră ATP-dependentă, cu formarea ADN monocatenar, datorită activităţii helicazei componente şi are activitate kinazică, fosforilând domeniul C-terminal (CTD) al ARN polimerazei II la aminoacidul serină. Această funcţie kinazică este ,,comutatorul” care declanşează sinteza de ARN de către ARN polimeraza şi marchează sfârşitul etapei de iniţiere şi începutul etapei de elongare. 7. Mediatorul ,,ambaleaz㔺i stabilizează apoi întreg complexul de iniţiere care conţine factorii de transcripţie şi ARN polimeraza II, interacţionând cu intensificatorii (,,enhancers”), secvenţe aflate la distanţă în amonte sau în aval , care intervin în reglarea transcripţiei. Reglarea iniţierii transcripţiei: a) Prin interferenţa unor proteine, este procesul prin care anumite proteine-semnal interacţionează cu promotorul sau cu complexul de iniţiere parţial construit, pentru a preveni finalizarea formării complexului de inţiere al polimerazei, deci iniţierea transcripţiei. b) Inhibiţie prin structura cromatinei, proces în care promotorul este ascuns datorită împachetării cromatinei. Structura cromatinei este controlată de modificări post-translaţionale ale histonelor şi determină modificări esenţiale, în sensul scăderii sau creşterii drastice a nivelului transcripţiei. c) Reglarea prin fosforilare. Cea mai mare subunitate a ARN polimerazei II (Rpb1) are un domeniu C-terminal (CTD) care este ţinta kinazelor şi fosfatazelor. Fosforilarea CTD permite atragerea sau respingerea factorilor implicaţi în transcripţie. CTD constă dintr-un motiv de aminoacizi YSPTSPS repetitiv, dintre care serina şi treonina pot fi fosforilate. Există multe posibilităţi sau combinaţii de fosforilare în aceste secvenţe repetitive de aminoacizi, care se modifică rapid în cursul transcripţiei. Astfel, în timpul ciclului de transcripţie, CTD este fosforilat reversibil, ARN polimeraza II cu CTD nefosforilat se leagă la promotor, în timp ce forma fosforilată
86
este implicată în transcripţia activă. De exemplu, fosforilarea serinei din poziţia 5 a heptapeptidului repetitiv este necesară iniţierii transcripţiei şi este limitată la perioada de interacţiune a ARN polimerazei II cu promotorul şi de eliberare de ARN polimerază a promotorului, fiind realizată prin funcţia kinazică a TFIIH. Fosforilarea în poziţia 2 este caracteristică etapei de elongare şi de procesare a capătului 3’ a preARN mesager. După ce prima legătură este realizată, ARN polimeraza părăseşte promotorul, în această etapă existând tendinţa de a elibera transcripte ARN scurte, trunchiate, proces denumit iniţiere avortivă. .
Figura 58. Formarea complexului de iniţiere activ pe TATA box prin interacţiunea factorilor de
transcripţie cu ARN polimeraza II. Imagine preluată din Scott F. Gilbert ,,Developmental Biology”,
eighth edition.
87
Când transcriptele au o lungime de 23 de nucleotide, poate începe etapa de elongare. Elongarea este sinteza unei copii a ADN în ARN mesager. O catena de ADN, denumită catena matriţă (,,template”) sau noncodogenă este utilizată ca matriţă pentru sinteza ARN mesager. Pe măsură ce procesul transcripţiei este în evoluţie, ARN polimeraza se deplasează de-a lungul catenei matriţă a ADN şi, pe baza complementarităţii bazelor azotate cu secvenţa ADN, creează o copie ARN. ARN polimeraza se deplasează de-a lungul catenei matriţă de ADN în direcţia 3’→5’, catena codogenă fiind utilizată ca referinţă. Se produce o moleculă de ARN în direcţia 5’→3’, o copie exactă a catenei codogene de ADN, exceptând înlocuirea timinei cu uracilul şi a dezoxiribozei cu riboza în ARN mesager format. Ca şi procesul de replicare al ADN, transcripţia (sinteza ARN) implică multiple ARN polimeraze care funcţionează pe aceeaşi catenă matriţă şi multiple cicluri de transcripţie, deci se formează mai multe molecule de ARN mesager prin copierea unei singure gene (o amplificare a unui tip particular de ARN mesager). Etapa de elongare implică şi un control strict al corectitudinii copierii ADN matriţă de către ARN polimeraze (,,proofreading mechanism”) prin care bazele incorect încorporate în ARN sunt excizate şi înlocuite.
Reglarea elongării se realizează prin următorii factori:
a) factorul de elongare TFIIS sau, mai simplu SII activează ARN polimeraza, la fel şi proteinele P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). P-TEF b este componentă a complexului multiproteic Cdk9 (o kinază ciclin-dependentă) care interacţionează şi este activată de ciclinele K, T1, T2. Activitatea kinazică a P-TEF b constă în fosforilarea serinei din poziţia 2 a CTD din ARN polimeraza II, fosforilarea hSPT5 care recrutează enzimele de metilare a capului 5’ a preARN şi recrutarea TAT-SF1 care la rândul său recrutează spliceosomul. În consecinţă, ARN polimeraza este protejată de acţiunea negativă a DSIF (Factorul de Inducere a Sensibilităţii faţă de 5,6 dicloro-1-beta-D-ribofuranozilbenzimidazol) şi a NELF (Factor de Elongare Negativ), începând elongarea eficientă cu formerea ARNm. b) Factorii implicaţi în modificarea structurii cromatinei prin modificări posttranslaţionale a histonelor: fosforilare, acetilare, metilare şi ubiquinare. c) Factorii care influenţează activitatea catalitică a ARN polimerazei II prin creşterea Vmax şi a Km, îmbunătăţind activitatea catalitică a acestei enzime: TFIIF, Elongina şi familia ELL.
88
Figura 59.a.Fosforilarea mediată de TFIIH în domeniul C-terminal al ARN polimerazei II (Pol II) poate
interveni în timpul formării complexului de preiniţiere. ,,DRB sensitivity-inducing factor” (DSIF) şi
,,Negative Elongation Factor” (NELF) facilitează probabil blocarea ARN polimerazei într-o regiune
proximală promotorului şi TFIIS se asociază cu polimeraza blocată. TFIIS stimulează activitatea
intrinsecă de clivare a ARN de către Pol II cu formarea unui nou capăt 3'-OH în situsul activ al Pol II.
Se formează un capăt 5’ metilat al ARN prin adiţia de guanozină metilată prin activitatea polimerazei
şi a ARN(guanin-7) metiltransferazei. b. Factorul pozitiv de elongare-b (P-TEFb) mediază fosforilarea
DSIF, NELF şi Pol II CTD determinând elongare productivă. TFIIS facilitează eliberarea eficientă a Pol II
de pe situsul de pauză în care se afla blocată. NELF disociază de pe complexul de transcripţie şi DSIF,
TFIIS, P-TEFb sunt transportate împreună cu Pol II de-a lungul genei. TFIIF, ELL şi elongina care
stimulează activitatea de elongare a Pol II, sunt de asemenea asociate la complexul de elongare.
Saunders, Leighton J. Core & John T. Lis ,,Breaking barriers to transcription elongation”
Etapa de terminare a transcripţiei constă în desfacerea complexului polimerazei şi terminarea elongării lanţului ARN. Genele care codifică proteinele eucariotelor conţin secvenţa semnal poliA, care determină sfârşitul sintezei lanţului ARN mesager (mediază terminarea transcripţiei de către ARN polimeraza II). Etapa de terminare ar putea fi declanşată de disocierea factorilor de elongare atunci când interacţionează cu secvenţa poliA. Un model alternativ pentru mecanismul de declanşare a etapei de terminare a transcripţiei este modelul ,,torpedo”. Conform acestui model, clivarea secvenţei poliA oferă un capăt 5’ al ARN neprotejat, care este degradat prin activitatea exonucleazelor 5’→3’(exonucleaze ,,torpedou”), şi astfel ar fi indusă disocierea ARN polimerazei de pe matriţa de ADN. S-a demonstrat că transcripturile ARN nascente situate la o distanţă de 1 kb în aval de secvenţa poliA a genei β-globinei umane sunt asociate cu o activitate de clivaj co-transcripţional (CoTC), cu rol în terminarea transcripţiei. Mai exact, secvenţa cu activitate
89
CoTC este o secvenţă de ARN cu activitate autocatalitică, care intră rapid în autoclivaj. CoTC prezintă un capăt ARN 5’ liber, care este recunoscut de exonucleaza 5’→3’Xrn2. Degradarea produsului de clivaj din aval de Xrn2 declanşează terminarea transcripţiei. Exonucleaza se mişcă de-a lungul catenei ADN matriţă împreună cu ARN polimeraza, ca un ,,torpedou” ghidat, dar are acces la ARN nascent după un clivaj endonucleotidic la situsul poliA sau la un situs de clivaj cotranscripţional (CoTC), ajutând la disocierea complexului de elongare al ARN polimerazei.
Figura 60. Modelul ,,torpedo” de terminare a transcripţiei.
5.4.5. Procesarea ARN are sediul în nucleu şi generează ARN mesager matur, ARNt şi ARNr funcţionali, pornind de la transcriptele ARN primare formate în procesul de transcripţie. Procesarea ARN cuprinde maturarea următorilor pecursori ARN: preARN mesageri, preARN ribosomali şi preARN de transfer. Procesarea preARN mesager implică următorii paşi: 1. Adăugarea unui ,,cap” 7-metilguanilat la capătul 5’ are loc imediat după începerea transcripţiei, prin formarea unei legături speciale de tip 5’-5’trifosfat. 2. Poliadenilarea, adăugarea unei ,,cozi” poliA la capătul 3’care conţine aproximativ 250 resturi A. 3. Clivarea ARN sau ,,ARN splicing”, semnificând îndepartarea intronilor şi unirea exonilor. Clivarea implică formarea unui complex de clivare activ denumit spliceosom, prin asamblarea ordonată a particulelor discrete de snRNP ( ribonucleoproteine nucleare mici) pe substratul de ARNhn (ARN heterogen). Spliceosomul este un complex alcătuit din proteine şi ARN de tip special, care îndepărtează intronii din pre-ARN mesager (ARNhn). Procesul
90
este cunoscut sub denumirea de ,,splicing” sau clivarea intronilor. Spliceosomii conţin 5 snRNP : U1,U2, U4,U5, U6 bogate în uridină. Prima etapă este recunoaşterea ARNhn de către U1snRNP şi a altor factori asociaţi non-snRNP, care se leagă la situsul de clivare situat la capătul 5’ a ARNhn. Se formează complexul de angajare E care este ATP independent şi care angajează ARNhn pe calea clivării. U2snRNP este recrutată prin interacţiune cu un factor asociat denumit factor auxiliar U2snRNP şi cu U1snRNP, formându-se complexul A în manieră ATP-dependentă. U2snRNP este ataşat puternic în complexul A de o secvenţă de ramificare denumită ,,branch point sequence” (BPS). Prezenţa unei pseudouridine în U2snRNP opusă situsului de ramificare, determină alterarea conformaţiei duplexului ARN-ARN, cu ieşirea în afară a adenozinei din BPS. Structura alterată a duplexului, plasează gruparea 2’OH a adenozinei din ,,umflătura” produsă într-o poziţie favorabilă pentru pentru primul pas al clivării. TriU4/U5/U6snRNP este recrutat la spliceosom pentru a forma complexul B, care după câteva rearanjări, formează complexul C, adică spliceosomul activ catalitic pentru clivarea intronului. Recrutarea triU4/U5/U6snRNP s-ar părea că are loc prin interacţiuni proteină-proteină şi interacţiuni datorate complementarităţii bazelor azotate între U2snRNP şi U6snRNP. După recrutarea triUsnRNP, au loc rearanjamente ARN-ARN care preced prima etapă catalitică şi au loc rearanjamente moleculare la nivelul spliceosomului activ catalitic. Primul proces de rearanjare implică probabil desprinderea U1snRNP de la situsul de clivare 5’ şi interacţiunea cu U6snRNP, U1snRNP având acţiune inhibitorie asupra interacţiunii U6- situs de clivare 5’. Legarea U2snRNP la BPS este un exemplu de interacţiune ARN-ARN care înlătură o interacţiune ARN-proteină, fiind concret înlăturată proteina SF1 de pe BPS. În spliceosomul activ, conformaţia buclă stem II este favorizată. Nu este clar cum este înlăturată U4 de pe U6snARN, ARN fiind implicat în asamblarea spliceosomului, poate avea funcţia de desprindere a U4 de U6 şi de promovarea a interacţiunii U2/U6snARN. Buclele stem I şi II ale interacţiunii U4/U6 disociază şi porţiunea buclă stem II a U6 se autoînfăşoară pentru a forma o buclă stem intramoleculară, U4 nemaifiind necesară pentru asamblarea spliceosomului. Bucla stem I a U6 formează un helix U2/U6 împreună cu U2snARN. La intronii din grupa I, reacţia de splicing începe la o nucleotidă guaninică, iar la intronii din grupa II, la o nucleotidă adeninică. Reacţia de splicing constă în două reacţii consecutive de transesterificare (transfer de grupări fosfat): 1. O adenină din secvenţa intronului, poziţionată în BPS, aproape de situsul de clivare 3’, în bucla formată prin modificarea conformaţională determinată de prezenţa pseudouridinei în U2snRNP ataşat la spliceosom, realizează un atac nucleofil prin gruparea 2’-OH de la riboză, la nivelul unei guanozine din situsului de clivare 5’, determinând formarea unei legături 2’ 5’ fosfodiesterice (lariat intermediar). 2. Capătul 3’OH liber al primului exon exercită un atac nucleofil asupra situsului de clivare 5’, cu eliberarea intermediarului lariat şi unirea exonilor. În acest mod sunt eliminaţi intronii şi se formează ARN mesager care este exportat din nucleu şi utilizat pentru sinteza proteinelor funcţionale.
91
Figura 61. Mecanismul de acţiune al spliceosomului (clivarea intronilor). Imagine preluată din Bruce
Alberts et al. ,,Molecular Biology of the Cell”, fifth ed.
PreARNt necesită patru tipuri de modificări: 1. Îndepărtarea unei secvenţe de 16 nucleotide de la capătul 5’ prin activitatea RNA-zei P. 2. Îndepărtarea unui intron alcătuit din 14 nucleotide din bucla anticodon prin clivare. 3. Înlocuirea a două resturi uracil de la capătul 3’ al moleculei cu CCA (citozină-citozină-adenină), care este întâlnită în toate ARNt mature. 4. Modificarea unor nucleotide cu alte nucleotide caracteristice: inozină, dihidrouridină, pseudouridină. PreARN ribosomal este alcătuit din trei ARNr maturi: ARNr de 18S, ARNr de 5,8S şi ARNr de 28S, care trebuie separaţi pentru a deveni funcţionali. PreARNr este sintetizat în nucleol. U3snARN şi alţi snARN (,,sn-small nuclear”) bogaţi în uracil împreună cu proteine asociate lor în nucleol intervin în clivarea preARNr. ARNr de 5S este sintetizat în nucleoplasmă şi nu necesită procesare, după sinteză reintră în nucleol pentru a se combina cu ARNr de 28S şi ARNr de 5,8S cu formarea subunităţii ribosomale mari.
92
6. Ribosomii. Translaţia (sinteza proteinelor)
6.1. Caracteristicile ribosomilor. Ribosomii au aproximativ 20nm în diametru şi sunt formaţi din ARN ribosomali (65%) şi proteine ribosomale (35%). Translatează ARN mesager pentru a forma lanţul polipeptidic din aminoacizi furnizaţi de ARN de transfer. S-ar părea că proteinele ribosomale nu au un rol activ în sinteza proteinelor, ele fiind un suport structural cu funcţie de intensificare a funcţiei ARN ribosomali, implicaţi în sinteza lanţului polipeptidic.
Figura 62. Structura ribosomului eucariot. Imagine preluată din http://www.biochem.arizona.edu
Ribosomii sunt ataşaţi membranei reticulului endoplasmic rugos, de unde caracteristica de rugozitate a acesteia, de învelişul extern al membranei nucleului care are continuitate structural-funcţională cu RER, sau sunt liberi- suspendaţi în citosol. Ribosomii ataşaţi de membrane şi cei liberi sunt identici structural, diferă doar distribuţia spaţială dependentă de prezenţa unei secvenţe-semnal ţintă de localizare la nivelul RE. Aceasta înseamnă că atunci când un ribosom sintetizează o proteină cu secvenţă de localizare la nivelul RE, va fi ataşat la RER, iar dacă acelaşi ribosom sintetizează o proteină fără această secvenţă, este liber în cioplasmă. Ribosomii liberi pot fi localizaţi oriunde în citosol, dar nu şi în nucleu şi organite celulare. Proteinele sintetizate de ribozomii liberi sunt eliberate în citosol şi utilizate intracelular. Lanţurile polipeptidice sintetizate în ribosomii ataşaţi RER sunt introduse direct în lumenul RE şi transportate la destinaţie pe calea secretorie: ribosomii ataşaţi RER produc în general, proteine care sunt utilizate la nivelul membranei plasmatice sau sunt exportate prin exocitoză. Ribosomii nu sunt organite celulare tipice, nefiind delimitaţi de membrană fosfolipidică, sunt mai degrabă particule multimoleculare, dar îi putem considera organite celulare fără membrană. Au fost observaţi pentru prima dată după 1950 de George Palade la microscopul electronic ca ,,granule” sau ,,particule dense”, iar în 1958 a fost propusă de Richard B. Roberts denumirea de ,,ribosomi”.
93
6.2. Funcţia ribosomilor. Translaţia începe la capătul 5’ al ARN mesager, la nivelul unor situsuri specifice de iniţiere. Secvenţa 5’terminală a ARN mesager nu codifică aminoacizi, se numeşte secvenţă netranslatată 5’ (5’UTR). ARN mesager eucariot codifică un singur lanţ polipeptidic (ARN mesager monocistronic) şi se termină cu secvenţele netranslatate 3’ (3’ UTR). Translaţia este întotdeauna iniţiată cu aminoacidul metionină, codificat de tripletul nucleotidic (codonul) AUG, excepţie făcând sinteza proteică a mitocondriilor. Ribosomii recunosc şi se leagă de ,,capul” 7-metilguanilat al ARN mesager şi parcurg lanţul nucleotidic până la întâlnirea unui codon de iniţiere AUG. Secvenţele adiacente primului codon AUG afectează iniţierea translaţiei, în consecinţă în multe cazuri se trece peste acest prim codon de iniţiere şi iniţierea apare la un codon AUG în aval de primul. Primul pas în iniţierea translaţiei este legarea iniţiatorului specific, metionil-ARNt şi a ARN mesager de subunitatea ribosomală mică. Subunitatea ribosomală mare aderă la complex, formând un ribosom funcţional, la nivelul căruia se declanşează elongarea lanţului polipeptidic. Un lanţ de ARN mesager poate fi translatat simultan de mai mulţi ribosomi, aflaţi la intervale de 100-200 nucleotide unul faţă de următorul. Un astfel de grup de ribosomi legaţi la acelaşi ARN mesager se numeşte poliribosom sau polisom. Sinteza proteică decurge independent la nivelul fiecărui ribosom, şi cuprinde următoarele etape: iniţierea, elongarea şi terminarea 6.2.1. Iniţierea sintezei proteice necesită mai multe proteine (cel puţin 10) denumite factori de iniţiere eucariotici- eIF. Factorii eIF-1, eIF-1A şi eIF-3 se leagă la subunitatea ribosomală mică 40S, iar eIF-2 în complex cu GTP se leagă cu iniţiatorul metionil- ARNt. ARN mesager este recunoscut şi adus la ribosom de grupul eIF-4 de factori de iniţiere ( eIF-4E recunoaşte ,,capul” 5’ 7-metilguanilat, iar eIF-4G se leagă atât la eIF-4E cât şi la o proteină de legare a ,,cozii” 3’ poliA a ARN mesager, denumită PABP-,,PoliA Binding Protein”). ARN mesager este apoi adus la unitatea ribosomală 40S de eIF4E şi eIF4-G în asociere cu eIF-4A şi eIF-4B, eIF-4G interacţionând cu eIF-3.
Figura 63. Iniţierea sintezei proteice. Imagine preluată din http://www.nature.com.
94
Subunitatea ribosomală 40S cu metionil-ARNt asociat şi factorii de iniţiere proteici ataşaţi, ,,scanează” apoi ARN mesager în căutarea codonului de inţiere AUG. Atunci când acest codon de iniţiere este găsit, eIF-3 declanşează hidroliza GTP de pe eIF-2. Factorii de iniţiere, inclusiv eIF-2-GDP sunt apoi eliberaţi din complex, iar subunitatea ribosomală 60S se leagă de subunitatea 40S pentru a forma complexul ribosomal eucariotic de 80S şi elongarea poate începe.
6.2.2. Etapa de elongare a lanţului polipeptidic. Ribosomul are 3 situsuri pentru legarea ARNt, denumite situs peptidil (P), aminoacil (A) şi situsul exit (E). Iniţiatorul metionil-ARNt se leagă la situsul peptidil.
Figura 64. Etapa de elongare a catenei polipeptidice. Imagine preluată din
Primul pas în elongare constă în legarea următorului aminoacil-ARNt la situsul aminoacil, corespunzător celui de-al doilea codon din ARN mesager. Aminoacil-ARNt este escortat la situsul aminoacil din ribosom de un factor proteic implicat în elongare denumit eEF-1α, complexat cu GTP. GTP este hidrolizat, aminoacil-ARNt corespunzător este inserat la locusul aminoacil şi eEF-1α asociat cu GDP este eliberat. După eliberarea eEF-1α, se formează legătura peptidică între iniţiatorul metionil-ARNt de la locusul peptidil şi al doilea aminoacid, aflat sub forma aminoacil-ARNt la locusul aminoacil. Formarea legăturii peptidice este catalizată de subunitatea ribosomală mare, mai precis de ARN ribosomali ai acestei subunităţi, care realizează transferul metioninei pe aminoacil-ARNt din situsul A, formând un peptidil-ARNt în acest situs, iar ARNt din locusul peptidil rămânând liber. Hidroliza GTP înainte de eliberarea eEF-1α de pe ribosom este etapa limitantă de viteză a elongării lanţului polipeptidic şi furnizează intervalul de timp necesar pentru ca, un aminoacil-ARNt incorect inserat, legat mai slab la codonul ARN mesager care nu corespunde anticodonului din ARNt, să poată disocia de pe ribosom mai curând decât să fie
95
folosit în sinteza proteică. Hidroliza GTP este deosebit de importantă pentru acurateţea sintezei proteice, datorită timpului pe care îl furnizează desfăşurării mecanismului de ,,proofreading” al împerecherii codon-anticodon, înainte ca legătura peptidică să se fi format. Următorul pas în elongare, după formarea peptidil-ARNt în locusul aminoacil, este translocarea, care necesită prezenţa factorului de elongare eEF-2 şi hidroliză de GTP. Translocarea constă în mişcarea ribosomului de-a lungul ARN mesager cu trei nucleotide, poziţionând următorul codon în locusul A rămas gol după translocarea peptidil-ARNt din locusul A în locusul P şi a ARNt liber din locusul P în locusul E. Urmează legarea unui nou aminoacil-ARNt pe locusul aminoacil care induce eliberarea ARNt liber de pe locusul E, ribosomul fiind apt să insereze următorul aminoacid în lanţul polipeptidic în aflat în elongare.
Figura 65. Elongarea catenei polipeptidice. Imagine preluată din
http://www.ncbi.nlm.nih.gov: Griffiths, A.J.F. et al. ,,An Introduction to Genetic Analysis”
Fiecare etapă de legare a unui nou aminoacid în catena polipeptidică implică resinteza GTP din GDP legat de eEF-1α. Această reacţie necesită un al treilea factor proteic de elongare denumit eEF-1βγ care determină înlocuirea GDP de pe eEF-1α cu GTP. Refacerea eEF-1α-GTP semnifică redobândirea capacităţii acestui factor de elongare ca, în formă legată de GTP, să ducă un alt aminoacil-ARNt în situsul aminoacil al ribosomului.
6.2.3. Terminarea sintezei lanţului polipeptidic. Elongarea continuă până când este translocat un codon stop (UAA, UAG, UGA) în dreptul situsului aminoacil al ribosomului. Celulele nu deţin ARNt cu secvenţe anticodon complementare acestor codoni stop, dar posedă un factor de eliberare RF (,,Release Factor”) care recunosc codonii stop ca semnale de terminare a sintezei proteice. Acest factor de eliberare eRF-1 recunoaşte toţi cei trei codoni stop şi acţionează împreună cu un alt factor proteic de eliberare eRF-3. Aceşti factori de eliberare se leagă la codonul stop din dreptul locusului A şi activează hidroliza legăturii dintre lanţul polipeptidic şi ARNt din locusul peptidil, cu eliberarea lanţului polipeptidic complet sintetizat din ribosom şi a ARNt. Matriţa ARN mesager, ca şi subunităţile ribosomale disociază.
96
Figura 66. Etapele de terminare a sintezei proteice. Imagine preluată din
http://www.ncbi.nlm.nih.gov: Griffiths, A.J.F. et al. ,,An Introduction to Genetic Analysis”
6.2.4.Reglarea translaţiei. Expresia genică este reglată şi la nivel translaţional, prin mai multe mecanisme. Un mecanism de reglare este legarea proteinelor represor la secvenţe specifice ale moleculei ARN mesager. Un alt mecanism de reglare se exercită prin modularea activităţii factorilor de iniţiere a sintezei proteice, mai ales a eEF-2. Acest factor de iniţiere poate fi fosforilat de proteinkinaze cu rol reglator. În forma fosforilată este inhibată conversia GDP în GTP, deci iniţierea translaţiei. Factorul proteic eIF-4E, care recunoaşte capul 5’ 7-metilguanilat al ARN mesager, este cunoscut ca fiind implicat într-un mecanism reglator al translaţiei. Efectul de stimulare a sintezei proteice exercitat de insulină este un efect mediat prin fosforilarea proteinelor asociate cu eIF-4E, rezultând stimularea activităţii eIF-4E şi activarea iniţierii translaţiei. Translaţia este reglată prin stress, prin semnale mitogene sau prin citokine, care activează căi distincte de semnalizare, cu reducerea sintezei de proteine. Premiul Nobel pentru chimie a revenit în 2009 dr. Venkatraman Ramakrishnan, dr.Thomas A. Steitz şi dr. Ada E. Yonath ,,pentru studii asupra structurii şi funcţiei ribosomilor”.
97
7. Reticulul endoplasmic
7.1.Structura reticulului endoplasmic. Reticulul endoplasmic este o reţea alcătuită dintr-un sistem complex de membrane care delimitează cisternele (saci turtiţi). Membranele fosfolipidice ale RE delimitează spaţiul cisternal sau lumenul, care are continuitate cu spaţiul perinuclear.
Din punct de vedere morfologic şi funcţional, RE prezintă trei tipuri de structuri: reticulul endoplasmic rugos (RER), reticulul endoplasmic neted (REN), aflate în relaţie de continuitate structurală, având membrană şi lumen comune şi fiind interschimbabile în funcţie de necesităţile metabolice ale celulei şi reticulul sarcoplasmic (RS) din celulele musculare.
Figura 67. Structuri ale reticulului endoplasmic: reticulul endoplasmic rugos ,,rough ER” şi reticulul
endoplasmic neted ,,smooth ER”.
7.2. Reticulul endoplasmic rugos se caracterizează prin prezenţa pe suprafaţa membranei a numeroşi ribosomi, care conferă membranei aspectul neregulat, rugos. Existenţa ribosomilor legaţi la membrana RER şi funcţia RER în sinteza proteinelor a fost demonstrată de Porter şi colaboratorii în 1945 în microscopie electronică şi prin metode biochimice. Ribosomii nu sunt un constituient structural stabil al RE, ei fiind ataşaţi şi eliberaţi în mod constant de pe membrana RE. Un ribosom se leagă la RE după ce începe să sintetizeze proteinele destinate căii secretorii: proteine pentru export, cu destinaţie extracelulară şi proteine pentru uz intracelular cum sunt enzimele lizosomale, proteinele integrale ale sistemului endomembranelor sau ale plasmalemei. Mecanismul de direcţionare al ribosomilor către membrana RE implică existenţa unei secvenţe-semnal de recunoaştere, situată la capătul N-terminal al proteinei, formată din 16-30 de aminoacizi, respectiv unul sau mai mulţi aminoacizi încărcaţi pozitiv adiacenţi unei secvenţe de 6-12 aminoacizi
98
hidrofobi. Când sinteza proteică începe în ribosomii liberi din citosol, această secvenţă-semnal din proteina nascentă direcţionează ribosomul spre membrana RE şi iniţiază translocarea în lumenul RE. Mecanismul implică o particulă de recunoaştere a semnalului (PRS), care este o particulă ribonucleoproteică citosolică, capabilă de a se lega simultan la secvenţa-semnal din proteina nascentă, la subunitatea ribosomală mare şi la un receptor al particulei PRS, care este o proteină integrală din membrana RE. PRS este formată din 6 polipeptide şi o moleculă de ARN formată din 300 de nucleotide, una din proteinele PRS denumită P54 leagă de fapt secvenţa-semnal din structura lanţului polipeptidic aflat în curs de elongare. Numai după ce complexul PRS/proteină nascentă/subunitate ribosomală mare se leagă la receptorul PRS din membrana RE, PRS eliberează lanţul polipeptidic nascent şi elongarea acestuia continuă la o rată normală de viteză. Fidelitatea procesului este asigurată de o hidroliză asociată a GTP, energia obţinută fiind utilizată pentru eliberarea proteinelor nascente care nu au secvenţă-semnal de pe PRS şi din complexul legat la receptorul pentru PRS. Interacţiunea complexului PRS/lanţ polipeptidic nascent/ribozom cu receptorul PRS este declanşată când GTP se leagă de subunitatea P54 a PRS şi subunitatea α a receptorului PRS. Transferul consecutiv al ribosomului cu lanţul polipeptidic în curs de elongare la un situs al membranei RE unde poate avea loc translocarea permite hidroliza GTP. După disociere, PRS şi receptorul pentru PRS eliberează GDP în citosol unde este reciclat.
Prin legarea particulei semnal de recunoaştere de receptorul propriu din membrana RE, este ataşat şi ribosomul cu proteina în curs de elongare care conţine secvenţa semnal de recunoaştere, care va intra în lumenul RER, proces denumit translocare cotranslaţională.
Figura 68. Ataşarea ribosomului cu lanţul polipeptidic în curs de elongare, purtător al
secvenţei-semnal de direcţionare spre reticulul endoplasmic. Ataşarea este urmată de restabilirea
vitezei normale de elongare a lanţului polipeptidic, care trece în lumenul RER prin translocon.
Imagine preluată din http://www.cytochemistry.net/cell-biology/rer2.htm
99
Ribozomii cu lanţul polipeptidic nascent sunt rapid transferaţi spre translocon, un
canal proteic din membrana RE. Pe măsură ce translaţia continuă, lanţul polipeptidic în curs de elongare trece direct de pe subunitatea ribosomală mare în porul central al transloconului. Transloconul este format din copii multiple ale unui complex denumit Sec61, format din 3 unităţi structurale proteice: o proteină integrală de membrană denumită Sec61α, cu 10 domenii transmembranare de tip α-helix, Sec61β şi Sec61γ, care sunt proteine mici. Aceste copii Sec61 se asamblează pentru a forma canalul transloconului, care poate fi vizualizat în microscopie electronică: canalul cilindric are 5-6nm înălţime, un diametru de 8,5nm, cu un por central de 2nm. Transloconul este un canal cu poartă similar canalelor ionice, cu un mecanism de închidere-deschidere controversat. Dacă transloconul ar fi deschis tot timpul, în lipsa ribosomului ataşat şi a polipeptidului de translocat, molecule mici ca ATP şi aminoacizii ar difuza liber prin porul central. Pentru a menţine proprietatea de barieră cu permeabilitate selectivă a membranei RE, transloconul se deschide numai atunci când are ataşat un ribosom cu un lanţ polipeptidic nascent. Există două ipoteze privind mecanismul de închidere-deschidere al porului: o proteină din lumenul RE blochează porul când nu este ataşat un ribosom pe faţa citosolică a RE sau, conform unei alte ipoteze, complexul Sec61 se găseşte în stare dezasamblată în membrana RE, iar la situsul unde ribosomul şi lanţul polipeptidic sunt aduse la membrana RE de PRS prin legarea de receptorul PRS, are loc asamblarea complexului Sec61.
După ce proteina a ajuns în lumenul RER, secvenţa semnal de recunoaştere este clivată de o semnal-peptidază care este o proteină transmembranară asociată transloconului, ribosomul şi SRP se desprind şi sunt reciclate, fiind reutilizate la nivelul citosolului într-un nou ciclu de sinteză proteică şi respectiv, de ataşare a ribosomilor la membrana RE.
Figura 69. Semnal peptidaza asociată transloconului din membrana reticulului endoplasmic.
Imagine preluată din http://www.mun.ca
Proteina, odată intrată în lumenul RER, este supusă unor modificări care în conferă
structura potrivită pentru îndeplinirea unor funcţii specifice şi pentru localizarea strictă în celulă. Grupările care conferă proteinelor direcţia de localizare se numesc semnale de dirijare şi sunt adăugate posttranslaţional în RER şi aparatul Golgi. Membrana RER este continuă cu membrana nucleară externă, dar nu prezintă continuitate cu membranele aparatului Golgi, astfel încât proteinele vor fi exportate în aparatul Golgi prin transport vezicular. Veziculele de transport prezintă proteine de suprafaţă denumite COPI şi COPII. COPII orientează
100
veziculele către aparatul Golgi, iar COPI determină aducerea veziculelor cu proteine înapoi la RER. În acest mod, RER acţionează concertat cu aparatul Golgi pentru a orienta proteinele nou sintetizate spre destinaţia potrivită. Există şi o a doua cale de export din RE, prin situsuri de contact între membranele RE şi membranele altor organite, care permit transferul unor molecule mici.
7.2.1. Funcţiile RER Proteinele solubile de secreţie şi proteinele de membrană sintetizate la nivelul
reticulului endoplasmic rugos sunt supuse următoarelor 4 tipuri de modificări: 1. formarea legăturilor disulfidice; 2. plierea moleculelor şi formarea proteinelor oligomerice; 3. adiţia şi modificarea resturilor oligoglucidice; 4.clivajul proteolitic specific.
1. Legătura disulfidică între două resturi de cisteină este implicată în stabilizarea structurii terţiare şi cuaternare a proteinelor. Asemenea legături disulfidice sunt întâlnite în structura proteinelor de secreţie şi în domeniul exoplasmic al proteinelor de membrană (proteinele citosolice şi ale organitelor care sunt sintetizate în ribosomii liberi sunt lipsite de legături disulfidice). Sunt esenţiale pentru structura normală şi activitatea enzimatică sau hormonală a proteinelor de secreţie. Formarea legăturilor disulfidice este dependentă de prezenţa în lumenul RE a proteindisulfidizomerazei (PDI), abundentă în RE al celulelor secretorii din organe cum sunt ficatul sau pancreasul. Legătura disulfid din situsul activ al PDI este transferată unei proteine prin două reacţii secvenţiale de transfer tiol-disulfid. Este generată PDI redusă, care se transformă în PDI oxidată prin acţiunea unei proteine din lumenul RE denumită Ero1, care poartă o legătură disulfid care este transferată PDI.
2. Plierea moleculelor şi formarea proteinelor oligomerice. Unele proteine sunt constituite din mai multe lanţuri polipeptidice. Imunoglobulinele, de exemplu, sunt proteine oligomerice, alcătuite din două lanţuri polipeptidice H(heavy) şi două L(light), legate prin legături disulfidice datorită activităţii PDI. PDI contribuie şi la plierea corectă a lanţurilor polipeptidice, stabilizată prin punţile disulfidice. Plierea în conformaţie corectă are loc în RE în decursul a câteva minute de la sinteză. Rapida pliere depinde de activitatea unor proteine din lumenul RE, proteinele chaperone care includ proteindisulfidizomeraza (PDI), ERp29, Grp78, membru al familiei Hsp70, calnexina, calreticulina, peptidilpropil izomerazele. Proteine lumenale omoloage lectinelor, calnexina şi calreticulina, se leagă selectiv la oligozaharide legate la azot (N-linkate) din lanţurile polipeptidice nascente nepliate, prevenind agregarea segmentelor adiacente ale lanţului polipeptidic, pe măsură ce acesta este elongat (previn o pliere prematură, incorectă a proteinelor nou-sintetizate). Alte proteine implicate în plierea proteinelor sintetizate în RER sunt peptidilprolil izomerazele, o familie de enzime care accelerează rotaţia legăturilor peptidil-prolil din secvenţe nepliate ale proteinelor, această izomerizare de tip cis-trans fiind o etapă limitantă de viteză a procesului plierii. Proteinele nu pot părăsi lumenul RE dacă nu sunt pliate corect. Orice mutaţie care determină o pliere incorectă sau incompletă a unei proteine împiedică transferul ei din membrana sau lumenul RE în aparatul Golgi. Aceste proteine incorect pliate se găsesc legate permanent la proteine ale RE denumite chaperone, cum este calnexina. Celulele răspund la prezenţa proteinelor nepliate prin intensificarea transcripţiei genelor care codifică chaperonele din RE şi alţi catalizatori ai plierii, datorită proteolizei unei proteine transmembranare a RE denumită ATF6. Eliberarea prin proteoliză a domeniului citosolic al
101
ATF6 este urmată de importul în nucleu al acestui domeniu proteic, unde exercită funcţia de activare a transcripţiei genelor care codifică chaperonele RE.
Proteinele de secreţie sau cele de membrană şi subunităţile neasamblate ale proteinelor oligomerice sunt degradate în citosol într-un interval de 1-2 ore de la sinteză. Aceste molecule sunt transportate în sens invers prin translocon, ajung în citosol unde sunt degradate perin calea proteolizei mediată de ubiquitine. Enzimele de ubiquitilare sunt localizate pe faţa citosolică a RE şi, prin activitatea lor, determină adiţia de ubiquitină la proteinele incorect pliate, reacţie cuplată cu hidroliza ATP. Polipeptidele poliubiquitinilate rezultate sunt rapid degradate în proteosomi.
4.Glicozilarea (adiţia şi modificarea resturilor oligozaharidice). În reticulul endoplasmic rugos se produce adiţia unui precursor oligozaharid preformat din 14 resturi monoglucidice: trei resturi de glucoză, nouă resturi de manoză şi două resturi de N-acelilglucozamină. Acest precursor este modificat în RE şi aparatul Golgi, dar 5 dintre cele 14 resturi monoglucidice sunt conservate în structura tuturor oligozaharidelor N-linkate ale glicoproteinelor de secreţie sau de membrană. Precursorul oligozaharidic este legat printr-un rest pirofosforil la dolicol, un lanţ lung poliizoprenic ferm ancorat în membrana RE. Oligozaharidul dolicol pirofosforil este format pe membrana RE, printr-un set de reacţii catalizate de enzime ataşate de faţa citosolică sau lumenală a membranei RE, astfel încât porţiunea oligozaharidică să proemine pe faţa lumenală a RE. Urmează etapa de transfer a precursorului format din 14 resturi monoglucidice de pe dolicol, la o asparagină din lanţul polipeptidic nascent care pătrunde în lumenul RE, deoarece numai resturile de asparagină dintr-un tripeptid Asn-X-Thr sau Asn-X-Ser pot constitui substratele enzimei oligozahariltransferaza, care leagă resturile oligozaharidice la atomul de azot al grupului aminic al asparaginei.
Figura 70. Oligozaharidul dolicol pirofosforil. Transferul oligozaharidului de pe dolicol pe
asparagina din lanţul polipeptidic catalizat de oligozaharidtransferaza (E). Imagine preluată din http://www.cryst.bbk.ac.uk.
Două din cele trei subunităţi ale oligozaharidtransferazei sunt proteine integrale ale
membranei RE, ale căror domenii citosolice se leagă la ribosom, orientând a treia subunitate, care este subunitatea catalitică, lângă lanţul polipeptidic în curs de elongare. După transferul precursorului oligozaharidic pe polipeptidul nascent, trei enzime diferite îndepărtează cele trei resturi de glucoză şi un rest particular de manoză, prin activitatea glicozidazelor I şi II.
102
Figura 71. Glicozidazele I şi II din RE. Imagine preluată din http://www.cryst.bbk.ac.uk
Glicozilarea la atomul de azot al asparaginei are un rol determinant în plierea corectă
a glicoproteinelor şi în exportul proteinelor spre destinaţia lor finală. 7.2.2. Sortarea proteinelor specifice RE.
Multe dintre proteinele translocate cotranslaţional în RER rămân şi funcţionează în acest organit, datorită prezenţei în structura lor a unor secvenţe de aminoacizi cu funcţie de semnal specific. Aceste secvenţe sunt formate din patru aminoacizi KDEL (Lis-Asp-Glu-Leu) şi sunt situate la capătul C-terminal. Secvenţele KDEL determină reţinerea proteinelor în RE datorită unor receptori specifici pentru KDEL situaţi în membrana RE.
7.2.3. Reticulul endoplasmic neted
O celulă nu poate să crească sau să se dividă fără biogeneza de membrane necesară ariei extinse a membranelor plasmatice şi endomembranelor. Generarea de membrane este un proces la fel de important ca şi sinteza proteică şi replicarea ADN şi implică sinteza fosfolipidelor, sfingolipidelor şi colesterolului care are loc în mare măsură în reticulul endoplasmic neted. Componentele proteice ale membranelor au un rol funcţional bine stabilit, dar proprietăţile structurale şi fizice ale membranelor sunt determinate de componentele
103
lipidice. Celulele au capacitatea de a importa şi de a sintetiza aceste molecule, în scopul biogenezei membranelor. Celulele sintetizează membrane noi prin expansiunea celor existente, deoarece deşi primii paşi în sinteza lipidelor se desfăşoară în citoplasmă, etapele finale sunt catalizate de enzime legate de membranele celulare preexistente. Acizii graşi sunt transformaţi în esteri ai acidului gras cu coenzima A, care constituie substratul pentru sinteza fosfolipidelor din acilCoA, glicerol 3-fosfat şi precursori ai capului polar, proces catalizat de enzime de pe faţa citosolică a reticulului endoplasmic neted. Restul acil fiind hidrofob, este inclus în bistratul lipidic, iar CoA proemină pe faţa citoplasmică a membranei. Sinteza lipidelor constă din procese enzimatice faziale, enzimele implicate sunt şi ele amfipatice, cu porţiuni hidrofobe inserate în bistratul lipidic şi porţiuni hidrofile care proemină în citosol. Deci, biosinteza lipidelor apare la interfaţa citosol-membrana REN şi începe cu esterificarea glicerol 3-fosfatului cu resturi de acizi graşi din acil CoA, cu formare de acid fosfatidic, cele două lanţuri hidrocarbonat lungi ale acidului fosfatidic ancorează molecula în bistratul lipidic. În etapa următoare, o fosfatază transformă acidul fosfatidic în diacilglicerol, urmând transferul capului polar, de exemplu fosforilcolina este transferată de pe CDP-colină pe grupul hidroxil expus. Fosfolipidele nou sintetizate sunt localizate iniţial în foiţa citoplasmică a membranei REN. Fosfolipidele sunt însă distribuite asimetric în cele două foiţe ale bistratului lipidic al membranei RE şi al altor membrane. Fosfolipidele trec între foiţa citoplasmică şi foiţa exoplasmică prin mişcări flip-flop care au loc cu frecvenţă scăzută, mult mai încet decât mişcările de difuzie laterală în planul membranei. Pentru expansiunea membranelor prin creşterea ambelor foiţe cu o distribuţie asimetrică a fosfolipidelor, componentele fosfolipidice trebuie să realizeze o mişcare flip-flop rapidă şi selectivă. Mecanismul implicat în generarea şi menţinerea asimetriei fosfolipidelor membranare nu este bine cunoscut, dar s-ar părea că sunt implicate proteine integrale de membrană capabile să catalizeze procesul flip-flop,denumite flipaze. Una dintre cele mai bine studiate flipaze este proteina ABCB4, membră a superfamiliei de ABC ATPaze, exprimată în hepatocite, care mută fosfatidilcolina din foiţa citoplasmică în foiţa exoplasmică, în scopul eliberării ulterioare în bilă în combinaţie cu colesterolul şi acizii biliari. Sfingolipidele sunt sintetizate pornind de la sfingozină, un aminoalcool cu lanţ hidrocarbonat lung, nesaturat, produs în REN, prin cuplarea palmitoilCoA cu serina, urmată tot în REN de adiţia unui acid gras pentru a forma N-acilsfingozina (ceramid). Adiţia consecutivă la ceramid a capului polar are loc în aparatul Golgi. Colesterolul este component major, alături de fosfolipide şi sfingolipide, al membranelor celulare. Primul pas în sinteza colesterolului, de transformare a acetilCoA în hidroximetilglutarilCoA are loc în citosol, însă conversia HMG CoA în mevalonat este catalizată de HMG-CoA reductaza, o proteină integrală de membrană din RE. HMG CoA reductaza are domeniul catalitic hidrosolubil în citosol, dar cele opt segmente transmembranare reglatoare ancorează ferm enzima în membrana RE. Mevalonatul este transformat în izopentenilpirofosfat (IPP) şi în stereoizomerul dimetilalilpirofosfat (DMPP), transformare catalizată de enzime cu localizare în citosol. Tot enzime localizate în citosol catalizează condensarea a şase unităţi IPP cu formare de scualen, un intermediar format din 30 de atomi de carbon. Transformarea scualenului în colesterol se realizează prin reacţii catalizate de enzime legate de membrana RE. Colesterolul în exces din celule este esterificat prin activitatea catalitică a acilcolesterolaciltransferazei (ACAT) cu acilCoA provenite din acizi graşi. ACAT este localizată în membrana REN. Colesterolul esterificat este depozitat sub forma de picături lipidice, abundente în celulele ţesuturilor producătoare de hormoni steroizi.
104
Implicarea în sinteza lipidelor, steroizilor şi în metabolismul acestora nu este unica funcţie a REN. Intervine în metabolismul carbohidraţilor, deoarece conţine enzima glucozo-6-fosfataza, care transformă glucozo-6-fosfatul în glucoză în gluconeogeneză. Metabolismul medicamentelor (xenobioticelor) are localizarea principală la nivelul reticulului endoplasmic neted din hepatocite, deşi fiecare ţesut are o anumită capacitate de a metaboliza medicamente. Metabolismul xenobioticelor semnifică transformarea compuşilor xenobiotici lipofili în compuşi cu caracter polar, hidrosolubili şi uşor de eliminat din organism, prin introducerea sau demascarea unor grupări polare în molecula acestor compuşi. Implică anumite căi care pot fi clasificate în reacţiile fazei I şi fazei II :
Faza I:
Oxidarea: implică activitatea sistemului monooxigenazei citocromului P450, sistemului monooxigenazei flavinice, alcooldehidrogenazei, aldehiddehidrogenazei, monoaminooxidazei, peroxidazelor Reducerea: implică reductaza citocrom P450-NADPH şi citocromul 450 redus. Hidroliza: prin esteraze, amidaze şi epoxidhidrolaze
Faza II:
Metilarea prin activitatea metiltransferazelor Sulfatarea prin activitatea glutation S-transferazelor Acetilarea realizată de N-acetiltransferaze, aminoacid N-aciltransferaze Glucuronidarea cu UDP-glucuronoziltransferaze Sinteza acidului mercapturic
REN este bine reprezentat în hepatocite, unde una dintre principalele funcţii este de detoxifiere, prin acest proces fiind îndepărtaţi şi produşi ai metabolismului sau cantităţi crescute de etanol provenite din consumul exagerat de băuturi alcoolice sau barbituricele în supradoze. Pentru realizarea acestor funcţii, în anumite condiţii REN îşi poate dubla suprafaţa timp de câteva zile, revenind la dimensiuni normale după ce agresiunea a încetat.
7.2.4. Reticulul sarcoplasmic
Este un tip special de reticul endoplasmic neted din celulele musculaturii netede şi striate, care nu are funcţii biosintetice, are doar de funcţii de depozitare şi eliberare a ionilor de calciu. O pompă de calciu introduce ionii de calciu în lumenul RS unde calsequestrina leagă şi depozitează calciul la concentraţii mari. Eliberarea ionilor de calciu datorită stimulării electrice are rolul major în cuplarea excitaţiei cu contracţia în cursul contracţiei musculare.
105
A.
B.
Figura 72.A. Ultrastructura sarcoplasmei muşchiului scheletic cu reticulul sarcoplasmic şi mitocondrii.
(www.bu.edu/histology) B. Eliberarea Ca++ din reticulul sarcoplasmic şi declanşarea contracţiei
8.1. Caracterisici generale. Aparatul Golgi, complexul Golgi sau dictiozomul este un organit celular caracteristic tuturor celulelor eucariote, situat în centrul celulei, aproape de nucleu. A fost evidenţiat în 1898 de către doctorul italian Camillo Golgi prin colorarea neuronilor cu nitrat de argint. Aparatul Golgi este o parte a sistemului endomembranar al celulei, constituit din mai multe compartimente distincte funcţional. Dalton şi Felix au stabilit prin microscopie electronică în 1954 că aceste compartimente ale aparatului Golgi sunt formate din nişte săculeţi aplatizaţi suprapuşi(cisterne), în număr de 4-8/celulă, delimitaţi de o membrană simplă, dilataţi la capete şi înconjuraţi de micro şi macrovezicule, generate din aceste cisterne. Forma dictiozomilor variază de la o celulă la alta (în stările patologice au un aspect granulos). Morfologic, biochimic şi funcţional, este un organit format din compartimente cu polaritate distinctă: cis Golgi, Golgi median şi trans Golgi.
Figura 73. Ultrastructura complexului Golgi: faţa cis, compartimentul median, faţa
trans.Imagine preluată din www.uic.edu. 8.2. Funcţia aparatului Golgi.
8.2.1. Rolul aparatului Golgi în transportul vezicular al proteinelor. Proteinele nou-sintetizate sunt proteinele rezidente în RE (în lumen sau încorporate în membrana organitului) sau proteine care sunt împachetate în vezicule de transport anterograd, căptuşite cu proteină COP II, care vor fuziona pentru a forma cisternele compartimentului cis Golgi. Anumite proteine, care conţin secvenţa KDEL, cu localizare normală la nivelul RE, care au fost direcţionate eronat către cis Golgi, sunt retrimise în RE prin vezicule de transport retrograd, care conţin proteina COP I. O cisternă nou formată prin înmugurire de vezicule din RE şi fuziunea veziculelor de transport anterograd este o cisternă care aparţine compartimentului cis. Împreună cu proteinele pe care le conţine, se mută din poziţia cis, din apropierea RE, într-o poziţie trans, mai departe de RE, devenind cisternă mediană Golgi, iar apoi cisternă trans Golgi, proces denumit progresie cisternală. În cursul progresiei cisternale,
107
proteinele rezidente ale aparatului Golgi sunt reciclate: după ce sunt mutate progresiv odată cu cisternele, în direcţie cis-trans, ele sunt transportate retrograd, de data aceasta prin mecanism vezicular, fiind din nou localizate în situsul firesc din cisternele cis, mediane sau trans Golgi. În schimb, proteinele căii secretorii, care au alte destinaţii (nu sunt proteine structurale sau enzime ale RE sau ale aparatului Golgi), ajung într-o reţea complexă de membrane şi vezicule denumită reţeaua trans Golgi (TGN). De aici, proteinele pot fi preluate în cel puţin trei tipuri de vezicule:
1. primul tip de vezicule, după ce înmugureşte din TGN, se deplasează şi fuzionează cu membrana plasmatică, eliberând conţinutul prin exocitoză în mediul extracelular, proces denumit secreţie continuă sau constitutivă. Exemple: secreţia de anticorpi din limfocitele B, secreţia de proteine serice din hepatocite. 2. Un alt tip de vezicule care provin din TGN sunt veziculele secretorii care sunt menţinute în celulă până când apare un semnal care declanşează procesul de exocitoză, în acest caz, secreţia proteinelor este reglată. Exemple: secreţia hormonilor proteici din celulele endocrine (insulina, glucagonul, ACTH), eliberarea neurotransmiţătorilor sau secreţia precursorilor enzimelor digestive. 3. A treia categorie de vezicule provenită din TGN are ca destinaţie finală lizosomul, fiind mai întâi transportate în compartimentul endolizosomal sau endosomal târziu. În acest mod sunt livrate enzimele lizosomale (proteaze, glicozidaze, fosfataze) şi proteine de membrană lizosomale cum sunt H+ ATPazele (pompe din clasa V care asigură pH-ul acid al compartimentului lizosomal). Dacă transportul de la RE la Golgi are loc prin vezicule îmbrăcate cu COP II, transportul retrograd are loc prin vezicule îmbrăcate cu COP I. Veziculele îmbrăcate cu clatrină şi proteine AP transportă proteinele de la TGN sau de la membrana plasmatică la compartimentul endosomal târziu, însă proteina care căptuşeşte veziculele care transportă proteinele pentru secreţie constitutivă sau reglată nu este încă cunoscută.
Figura 74. Transportul anterograd şi retrograd mediat de proteine COP I şi II în complexul Golgi.
108
Aceste tipuri de vezicule îmbrăcate se formează prin polimerizarea unor proteine citosolice în membrana donatoare din care înmuguresc veziculele, care la scurt timp de la eliberare îşi pierd învelişul, expunând proteinele necesare pentru fuziunea cu membrana ţintă. Proteinele care leagă GTP, aparţinând superfamiliei GTPazelor, controlează polimerizarea proteinelor care îmbracă veziculele: pentru COP I şi clatrină, GTPaza este ARF, iar pentru veziculele îmbrăcate de COP II, GTPaza este Sar1. Ciclul de legare şi hidroliză al GTP-ului de către aceste GTPaze, controlează iniţierea şi asamblarea învelişului veziculelor, iar după ce veziculele sunt eliberate din membrana donatoare, hidroliza GTP legat la Arf sau Sar1 declanşează dezasamblarea învelişului proteic care căptuşeşte veziculele. Pe de altă parte trebuie să existe un mecanism prin care veziculele de transport să fie capabile de a discrimina între proteinele de membrană şi proteinele solubile, acceptând proteinele solubile care trebuie să avanseze spre compartimentul următor, excluzând proteinele care trebuie să rămână ca rezidente în compartimentul donor de vezicule. Acest mecanism de sortare ar consta în legarea directă a unor secvenţe specifice denumite semnale de sortare, prin interacţiune cu porţiunea citosolică a proteinelor cargo de membrană (învelişul proteic polimerizat acţionează ca o matrice cu afinitate mare de legare a proteinelor). Proteinele solubile care vor ajunge în lumenul unor organite, se leagă de domenii lumenale ale proteinelor cargo ale veziculelor. În următoarea etapă, un alt set de GTPaze, proteinele Rab, participă la orientarea veziculelor spre cea mai apropiată membrană-ţintă. Conversia de la Rab•GDP la Rab•GTP, determină o schimbare conformaţională care permite proteinei Rab să interacţioneze cu o proteină de suprafaţă dintr-o veziculă de transport şi să-şi insereze ancora izoprenoidică în membrana veziculei, urmând interacţiunea cu efectorii Rab care sunt proteine de dimensiuni mari din membrana-ţintă. După ce are loc fuziunea veziculei cu membrana-ţintă, GTP de pe Rab este hidrolizat la GDP, declanşând eliberarea Rab•GDP care este reciclată, participând la un alt ciclu de fosforilare, legare, hidroliză. După această etapă de orientare a veziculelor către membrana-ţintă, urmează fuziunea propriu-zisă, mediată de proteinele SNARE (vSNARE din membrana veziculelor cu tSNARE din membrana-ţintă).
8.2.2. Modificările macromoleculelor la nivelul aparatului Golgi. Complexul Golgi reprezintă o unitate de prelucrare multifazială, în care macromoleculele şi, în primul rând proteinele sunt modificate în stadii succesive, pe măsură ce ele trec de la un compartiment la altul. 8.2.2.1. Glicozilarea la azot a proteinelor. Lanţurile oligozaharidice ale glicoproteinelor sintetizate în RE sunt modificate prin înlăturarea din lanţul oligoglucidic a unor resturi monoglucidice şi prin adăugarea unor resturi monoglucidice noi. Lanţurile oligoglucidice manozice nu li se vor mai adăuga monoglucide noi în complexul Golgi: ele vor fi formate din două resturi de N-acetilglucozamină şi mai multe resturi de manoză, aşa cum s-au format în cursul sintezei lor în reticulul endoplasmic. În schimb, lanţurile oligoglucidice complexe sunt rezultatul modificărilor în aparatul Golgi: pe lângă cele două resturi de N-acetilglucozamină şi resturi de manoză adăugate în reticulul endoplasmic, care alcătuiesc regiunea miez a lanţurilor oligoglucidice complexe, ele sunt formate dintr-o regiune terminală adăugată în complexul Golgi. Această regiune terminală este formată dintr-un număr variabil de resturi triglucidice N-acetilglucozamină- galactoză- acid N-acetilneuraminic şi este adăugată în compartimentul Golgi trans.
109
Figura 75. Regiunile terminale sunt sintetizate prin activitatea catalitică a
glicoziltransferazelor care acţionează în ordine strict determinată şi adaugă resturi monoglucidice
activate prin legarea de nucleozide şi importate din citosol în lumenul Golgi trans prin proteine
transportoare din membrana golgiană. Prima modificare este înlăturarea a trei resturi de manoză,
urmată de adiţia secvenţială a unui rest de N-acetilglucozamină, înlăturarea a încă două resturi de
manoză şi adiţia de fucoză şi două resturi de N-acetilglucozamină. Final, sunt adăugate trei resturi de
galactoză şi trei resturi de acid sialic. Imagine preluată din Cooper,G.M. ,,The Cell A Molecular
Approach”, second edition.
Glicozilarea proteinelor la atomul de azot în complexul Golgi decurge diferit: lanţul oligozaharidic format poate să aibă conţinut diferit în funcţie de structura proteinei şi de cantitatea de enzime de glicozilare disponibile în complexul Golgi al diferitelor tipuri de celule. În consecinţă, proteinele pot ieşi din Golgi cu o varietate de lanţuri oligozaharidice N-linkate.
8.2.2.2. Glicozilarea la oxigen şi asamblarea proteoglicanilor. Unele glicoproteine sunt glicozilate la oxigen, lanţurile oligoglucidice fiind legate la gruparea hidroxil a treoninei sau serinei din structura proteinei.
Figura 76. Structura proteoglicanilor.
110
Este un proces fazial, catalizat de glicoziltransferaze, primul monoglucid adăugat fiind de obicei N-acetilglucozamina, urmată de un număr variabil de alte resturi monoglucidice (zece sau mai multe). Proteoglicanii sunt proteine intens glicozilate la oxigen, în complexul Golgi se asamblează lanţuri poliglucidice pe miezul proteic prin intermediul unui trizaharid de legătură cu rol de primer (amorsă), care este legat la un rest de serină. Trizaharidul amorsă este format din xiloză şi două resturi de galactoză, iar lanţul poliglucidic (glicozaminoglicanic) este format prin polimerizare unor unităţi diglucidice (acid glucuronic/ galactoza- Nacetilglucozamina/N-acetilgalactozamina). Lanţul poliglucidic este modificat în cursul elongării prin reacţii de sulfatare şi epimerizare. În final, proteoglicanii pot fi formaţi din până la 95% din greutatea lor din glucide, care formează lanţuri glicozaminoglicanice neramificate (până la câteva sute), formate prin polimerizarea a aproximativ 80 de resturi monoglucidice. Majoritatea proteoglicanilor sunt secretaţi ca şi componente ale matricii extranucleare, o mică parte fiind glicoproteine integrale ale membranei plasmatice, servind la ancorarea celulei de matrice sau la organizarea macromoleculelor acesteia. Mucusul ce constituie învelişul protector al unor epitelii este un amestec concentrat de proteoglicani şi glicoproteine înalt glicozilate.
8.2.2.3. Sulfatarea proteoglicanilor, glicoproteinelor şi glicolipidelor.
Este ultima modificare a proteinelor înainte de exportul din aparatul Golgi prin mecanism vezicular şi se desfăşoară sub acţiunea sulfat transferazelor, în compartimentul Golgi trans. 8.2.2.4. Modificări proteolitice. Unii hormoni polipeptidici şi alte polipeptide sunt sintetizate sub formă de precursori inactivi, din care moleculele active funcţional sunt eliberate prin proteoliză. Modificările proteolitice încep în TGN şi continuă în veziculele de secreţie, prin activitatea endoproteazelor din membranele TGN sau din membranele veziculelor de transport. Endoproteazele clivează polipeptidele la nivelul a două resturi succesive de aminoacizi bazici: Arg-Arg, Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys din capătul C-terminal, dar procesul de clivare poate să fie complex, cum este cazul proinsulinei, în care clivajul proteolitic are loc la capătul N-terminal al lanţului B şi la capătul C-terminal al lanţului A, care apoi sunt legate în insulina matură, activă, prin legături disulfidice, deci maturarea decurge cu pierderea şi degradarea unui peptid central C. Pentru unele proteine, cum este hormonul somatotrop, înlăturarea secvenţei semnal RE din regiunea N-terminală este singurul clivaj proteolitic al lanţului polipeptidic nativ, după care proteina devine activă. Multe proteine de membrană sau proteine solubile de secreţie sunt însă sintetizate ca precursori polipeptidici lungi (proproteine), de exemplu enzimele lizosomale, albumina serică, insulina, glucagonul şi marea majoritate sunt sortate la nivelul TGN în vezicule de transport, clivajul proteolitic pentru formarea proteinei active având loc în veziculele de transport. Moleculele peptidice cu funcţie de semnal sunt de obicei molecule mici, dar sunt sintetizate eficient în poliribosomii ataşaţi RE, ca poliproteine (copii multiple ale aceleiaşi secvenţe aminoacidice). Moleculele active se obţin prin clivarea lanţului polipeptidic sintetizat iniţial.
8.2.2.5. Agregarea proteinelor în TGN. Este mecanismul prin care anumite proteine ca ACTH, insulina, tripsinogenul sunt sortate şi ajung în veziculele de transport pentru secreţia reglată. Deşi aceste trei proteine nu împărtăşesc o secvenţă comună de aminoacizi care ar avea rol de secvenţă de sortare, ele au
111
aceeaşi proprietate: sortarea lor în vezicule de secreţie reglată este controlată de agregarea proteică selectivă. Veziculele imature ale căii de secreţie reglată, în momentul în care înmuguresc din TGN, conţin deja agregate proteice. Unele studii au arătat că celulele secretorii ale mamiferelor conţin trei proteine: cromogranina A, cromogranina B şi secretogranina II, care formează agregate în condiţiile de concentraţie ionică şi pH din reţeaua trans Golgi, dar nu agregă în condiţiile din lumenul RE. Agregarea selectivă a proteinelor de secreţie cu cromogranina A, cromogranina B şi secretogranina II, ar putea fi mecanismul pe care se bazează sortarea acestor proteine în veziculele de transport specifice căii. 8.2.2.6. Sinteza glicolipidelor şi sfingomielinei. Aparatul Golgi are funcţii în metabolismul lipidic, în sinteza glicolipidelor şi sfingomielinei. Sinteza fosfolipidelor, colesterolului şi ceramidelor are sediul în reticulul endoplasmic neted, însă sfingomielina şi glicolipidele sunt mai apoi sintetizate din ceramide în aparatul Golgi.
Figura 76. Sinteza glicolipidelor şi sfingomielinei pornind de la ceramide. Imagine preluată
din Cooper,G.M. ,,The Cell A Molecular Approach”, second edition.
Sfingomielina este unicul fosfolipid din membranele celulare non-glicerol, sinteza sa pornind
de la transferul unui grup fosforilcolină de pe fosfatidilcolină pe ceramidă. Sfingomielina este
sintetizată pe faţa lumenală a cisternelor Golgi. În sinteza glicolipidelor adiţia de resturi de
glucoză la ceramide are loc pe faţa citosolică a cisternelor Golgi, iar adiţia de alte resturi
monoglucidice are loc pe faţa lumenală. După sinteză ele sunt localizate în foiţa lumenală a
bistratului membranei Golgi şi, după transport vezicular, în foiţa externă a bistratului
membranar, cu grupurile lor polare proeminând la suprafaţa celulei. Lanţurile oligozaharidice
ale glicolipidelor sunt markeri de suprafaţă importanţi în recunoaşterea intercelulară.
112
9. Lizosomii Lizosomii au fost descoperiţi în 1949, de citologul belgian Christian de Duve în urma studiilor efectuate asupra omogenatelor de ficat şi asupra fosfatazei acide. Activitatea fosfatazei acide este mai mare în preparatele în care enzima a fost extrasă în apă distilată, decât în cele în care enzima a fost extrasă în soluţii echilibrate din punct de vedere osmotic. Această constatare a condus la concluzia că enzimele hidrolitice sunt localizate într-un organit specific. După zece ani de la aceste observaţii, lizosomii au fost descrişi direct prin microscopie electronică.
Figura 77. Structura lizosomilor. Imagine preluată din http://bricker.tcnj.edu/micro
9.1. Structura lizosomilor. Lizosomii sunt organite specifice celulei eucariote, delimitaţi de o membrană unică, având dimensiuni cuprinse între 0,1-1,2µm. Conţin 40 de enzime hidrolitice responsabile de digestia celulară controlată a macromoleculelor: proteaze, nucleaze, glicozidaze, amilaze, lipaze, fosfolipaze, fosfataze şi sulfataze. Enzimele sunt hidrolaze acide, interiorul lizosomului având un pH acid, de 4,8, comparativ cu pH-ul citosolic care este de 7,2. De aceea, leziuni ale membranei lizosomale urmate de eliberarea enzimelor în citosol nu afectează celula, enzimele lizosomale fiind inactive la pH-ul neutru al citosolului. Membrana lizosomală deţine proteine transportoare care permit eliberarea în citosol a produşilor finali de digestie ai hidrolazelor lizosomale; au pompe protonice, H+ATPaze din clasa V care menţin pH-ul acid, utilizând energia obţinută din hidroliza ATP pentru a pompa H+ în interiorul organitului. Proteinele membranei lizosomale sunt înalt glicozilate pentru a fi protejate de acţiunea propriilor hidrolaze. Enzimele lizosomale, ca şi proteinele membranei lizosomale, sunt sintetizate în ribosomii ataşaţi RE (cu translocare cotranslaţională) şi procesate în aparatul Golgi. Veziculele de transport care livrează aceste proteine lizosomilor se desprind din TGN. Mecanismul de sortare al hidrolazelor lizosomale este cunoscut şi implică manozo-6-fosfatul, ataşat la oligoglucidele legate de azot ale enzimelor lizosomale. Ataşarea M6P începe în veziculele desprinse din RE şi continuă în compartimentul cis Golgi. Fosforilarea resturilor de manoză este catalizată de N-acetilglucozaminfosfotransferaza şi o fosfodiesterază. Pe faţa lumenală a membranelor TGN există receptorii pentru M6P. Regiunile membranei TGN care conţin complexul receptor M6P-enzima lizosomală se desprind şi formează vezicule de transport îmbrăcate de clatrină spre organite mici, de formă neregulată denumite endosomi timpurii, de unde trec în endosomii târzii, unde are loc procesul de sortare acidă, interiorul endosomilor târzii având pH-ul≈6. Receptorii M6P sunt capabili să lege enzimele lizosomale
113
la pH-ul neutru al lumenului TGN, dar nu şi la pH-ul acid din organitele de sortare. În consecinţă, din organitele de sortare (endosomii târzii) înmuguresc vezicule care reciclează receptorul eliberat înapoi în TGN precum şi vezicule care conţin numai enzimele lizosomale, prin care aceste enzime ajung la destinaţia lor finală, lizosomii. Veziculele care reciclează receptorii hidrolazelor acide nu sunt îmbrăcate de clatrină, sunt vezicule cu retromer, un înveliş care se asamblează în endosomi numai când: 1.se poate lega de domeniul citoplasmic al receptorilor cargo; 2. poate interacţiona direct cu un bistrat fosfolipidic curbat; 3. se poate lega la un fosfatidilinozitol fosforilat (fosfoinozitidă) care acţionează ca marker endosomal. Toate aceste trei condiţii trebuie îndeplinite simultan, retromerul este un ,,detector de coincidenţă” care se asamblează la locul şi momentul potrivit.
Lizosomii sunt organite cu heterogenitate structurală, fiind diferite din punct de vedere morfologic, dar sunt definite de o funcţie comună: degradarea intracelulară a macromoleculelor.
Figura 78. Funcţia lizosomilor. Imagine preluată din http://bricker.tcnj.edu/micro
9.2. Biogeneza lizosomilor. O cale a biogenezei lizosomale este cea de fuziune a veziculelor de transport
înmugurite din TGN cu endosomii care conţin macromolecule preluate din mediul extracelular prin endocitoză. Moleculele internalizate prin endocitoză sunt livrate prin vezicule îmbrăcate de clatrină endosomilor timpurii, unde sunt livrate şi hidrolazele acide provenite din aparatul Golgi. Anumite molecule sunt reciclate către membrana plasmatică, printre care şi receptori care au mediat endocitoza, iar altele trec în endosomii târzii: de exemplu enzimele lizosomale care disociază aici de receptorii manozo-6-fosfat care sunt reciclaţi spre aparatul Golgi sau molecule a căror digestie începe deja în interiorul acestor
114
organite care este un mediu acid. Formarea lizosomului matur presupune pierderea unor componente membranare endosomale trimise către membrana plasmatică sau TGN şi scăderea pH-ului până la valoarea optimă necesară activităţii enzimelor lizosomale. Formarea lizosomilor pe această cale presupune interacţiunea între calea secretorie prin care sunt procesate proteinele lizosomale şi calea endocitozei prin care substratele hidrolazelor acide sunt preluate de la exteriorul celulei, prin vezicule îmbrăcate de clatrină. Există două teorii privind biogeneza lizosomilor pe această cale: formarea lizosomilor prin fragmentarea endosomilor târzii sau formarea unui organit hibrid între endosomi târzii şi lizosomi, urmată de condensarea conţinutului acestui organit şi reciclarea selectivă a constituienţilor membranari. O altă cale de biogeneză a lizosomilor este cea care implică preluarea particulelor internalizate prin fagocitoză. Celule specializate cum sunt macrofagele şi neutrofilele preiau particule mari cum sunt bacteriile, resturi celulare şi celule îmbătrânite. Aceste particule, după preluare formează vacuole de fagocitoză (fagosomi) care fuzionează cu lizosomi, în acest mod conţinutul lor este digerat. Fagolizosomii formaţi pot fi mari şi heterogeni, dimensiunile şi forma lor fiind dependentă de conţinut. Lizosomii sunt responsabili de autofagie, turn-over-ul gradual al componentelor celulare. Procesul pare să înceapă prin înconjurarea organitului care urmează să fie degradat, de o membrană dublă a cărei provenienţă nu este cunoscută. Procesul este reglat într-un anumit mod, organitele sunt selectate precis pentru degradare în lizosomi în scopul remodelării celulare (de exemplu, mitocondrii sau peroxisomi senescenţi sau membrane ale REN care au proliferat pentru a-şi îndeplini funcţia de detoxifiere, iar după îndepărtarea xenobioticului sunt şi ele înlăturate din celulele hepatice). Autofagia este procesul care îndepărtează părţi nedorite ale celulelor diferenţiate intervenind în dezvoltarea şi sănătatea celulară, inclusiv ca adjuvant în mecanismele de apărare împotriva virusurilor şi bacteriilor. Prin autofagie pot fi îndepărtate agregate proteice mari şi chiar organite, situaţii în care capacitatea de acţiune a proteazelor celulare este depăşită. Modul de reglare al procesului de autofagie şi de selectare a organitelor-ţintă este puţin cunoscut, dar sunt implicate mai mult de 25 de proteine diferite în realizarea autofagiei, care include următoarele etape: nucleaţia şi extensia unei membrane care înconjură o porţiune selectată a citoplasmei, formarea autofagosomului delimitat de o membrană dublă, fuziunea cu lizosomul şi digerarea membranei interne a autofagosomului împreună cu conţinutul său. Sistemul de membrane din care provin veziculele care formează învelişul autofagosomilor, precum şi mecanismul de selectare precisă a organitelor-ţintă supuse autofagiei trebuie elucidate.
Figura 79. Electronomicrografia unui autofagosom (stânga) şi a unei vezicule endosomale. Imagine preluată din http://www.helsinki.fi/bioscience/biochemistry/pictures/Figure2IsoEskelinen
115
10.Peroxisomii 10.1. Structura şi caracteristicile generale ale peroxisomilor. Peroxisomii sunt organite delimitate de o singură membrană, cu dimensiuni de 0,2-1µm, care conţin catalază şi una sau mai multe oxidaze generatoare de H2O2, fiind implicate în metabolismul peroxidului de hidrogen în celulele eucariote. Au fost descoperite în TEM de Rhodin în anul 1951 şi denumite microcorpuri, iar denumirea de peroxisomi a fost atribuită după descoperirea conţinutului de uratoxidază, D-aminoacidoxidază şi catalază de către Christian de Duve în 1967. La om lipseşte acid uric oxidaza, ceea ce explică acumulările de acid uric în gută.
Figura 80. Structura peroxisomilor. Imagine preluată din http://bricker.tcnj.edu/micro
Peroxisomii mamiferelor conţin peste 50 de enzime, ficatul şi rinichiul fiind organele în care peroxisomii sunt cei mai abundenţi. Sub efectul unor agenţi de proliferare, volumul lor în celulă poate să crească de 7-10 ori. În fibroblaste şi amniocite, peroxisomii sunt mult mai mici, cu diametrul de 0,1-0,25µm şi sunt mai puţin abundenţi. În celulele capabile de secreţie steroidică (celulele corticosuprarenalei), în celulele adipoase şi în celulele gliale care produc mielină, peroxisomii nu există ca entităţi distincte, ci sub forma unui reticul peroxisomal format prin interconectarea peroxisomilor. În celulele în care are loc proliferarea peroxisomală, există o reţea de peroxisomi, formată prin diviziunea activă a acestora. Descoperiri recente au arătat că celulele mutante cu număr mic de peroxisomi îşi pot reface numărul caracteristic de peroxisomi, după introducerea genei ,,wild type” în celulele respective. 10.2. Funcţiile peroxisomilor. Datorită echipamentului enzimatic obligatoriu, oxidaze-catalază, peroxisomii sunt sediul unor transformări metabolice de tip respirator: respiraţia peroxisomală. Oxidarea substratelor în prezenţa O2 se realizează prin intermediul unor compuşi peroxidici toxici. Substratul RH2 este oxidat în prezenţa O2, procesul fiind catalizat de o oxidază flavin-dependentă:
116
Catalaza utilizează H2O2 pentru a oxida substratele proprii: fenoli, acid formic, formaldehida şi alcoolii:
în acest mod fiind îndepărtat peroxidul de hidrogen toxic. Această reacţie este importantă în ficat şi rinichi, peroxisomii din celulele acestor organe au rol în detoxifiere. Aproximativ 25% din etanolul consumat este oxidat la acetaldehidă prin reacţia de mai sus. Atunci când se acumulează în celule un exces de H2O2, catalaza converteşte peroxidul de hidrogen la apă prin reacţia de mai jos:
O funcţie majoră a peroxisomilor este oxidarea acizilor graşi cu lanţ lung, proces denumit β-oxidare, prin care din molecula AG se îndepărtează succesiv câte doi atomi de C, sub formă de acetil-CoA, transportată în citosol, unde este utilizată în diferite căi metabolice. Reacţia necesită acil-CoA oxidază localizată în peroxisomi dar şi în mitocondrii, unde are loc de asemenea β-oxidarea AG. Peroxisomii şi mitocondriile reprezintă situsurile celulare majore de utilizare a O2, dar spre deosebire de mitocondrii, unde procesele respiratorii au ca finalitate producerea şi conservarea energiei sub formă de ATP, procesele oxidative peroxisomale au ca rezultat disiparea energiei eliberate în cele două etape, oxidazică şi catalazică, sub formă calorică. β-oxidarea peroxisomală are loc în matricea peroxisomului şi constă în patru reacţii consecutive: oxidarea primară (desaturarea acil-CoA la 2-trans-enoil-CoA), hidratarea intermediarului nesaturat la L-3-hidroxiacil-CoA, o a doua reacţie de oxidare cu formarea 3-cetoacil-CoA şi a patra reacţie este una de clivaj tiolitic, cu eliberarea acetil-CoA şi acil-CoA, cu 2 atomi de carbon mai scurt decât lanţul iniţial:
Figura 81. Reacţiile β-oxidării peroxisomale.
117
Reacţiile prezentate mai sus sunt aceleaşi atât în mitocondrie cât şi în peroxisomi, dar enzimele care le catalizează sunt diferite. Prima reacţie a β-oxidării peroxisomale este catalizată de o oxidază flavin-dependentă, care transferă electronii direct oxigenului molecular, peroxidul de hidrogen produs fiind descompus prin acţiunea catalazei.
Acil-CoA oxidaza Enoil-CoA
flavin-dependentă
Figura 82. Prima etapă de oxidare flavin-dependentă în β-oxidarea peroxisomală şi transferul electronilor de pe FADH2 pe O2, cu formarea peroxidului de hidrogen. Imagine preluată din Grisham C.M, Garrett R.H. ,,Biochemistry”, second edition. În mitocondrii, electronii FADH2 sunt introduşi în lanţul transportor de electroni, via ubiquinonă:
Figura 83. Oxidarea FAD dependentă- prima etapă în β-oxidarea mitocondrială este urmată
de transferul electronilor în lanţul transportor de electroni şi are ca finalitate producereea de energie înmagazinată în molecula ATP. Imagine preluată din Grisham C.M, Garrett R.H. ,,Biochemistry”, second edition.
Următoarele două reacţii ale β-oxidării sunt catalizate de o enzimă cu funcţie de hidratază şi dehidrogenază, care are şi funcţie enoil-CoA-izomerazică (de ∆3, ∆2-enoil-CoA izomerază care transferă dubla legătură de pe C3 pe C2), permiţând β-oxidarea AG nesaturaţi. Reacţia finală a β-oxidării peroxisomale este catalizată de o tiolază. Energia provenită din prima reacţie de oxidare din care rezultă H2O2 este disipată sub formă calorică, în timp ce a doua reacţie de oxidare, care decurge cu reducerea NAD+, permite conservarea energiei prin electronii de energie înaltă ai NADH2, care difuzează liber în citosol, membrana peroxisomilor fiind permeabilă pentru aceste molecule (β-oxidarea peroxisomală este eficientă doar pe jumătate în ceea ce priveşte conservarea energiei). Spre deosebire de
118
β-oxidarea mitocondrială, care este inhibată de creşterea concentraţiei mitocondriale de ATP, β-oxidarea peroxisomală este stimulată de creşterea concentraţiei intracelulare de ATP. β-oxidarea peroxisomală generează căldură, fiind implicată în termogeneză. β-oxidarea peroxisomală nu are ca finalitate descompunerea completă a substratelor de AG în acetil-CoA, ci doar o scurtare a lanţului atomilor de carbon. Sistemul de enzime implicate în β-oxidare are activitate catalitică maximă asupra esterilor acil-CoA saturaţi, cu 12-16 atomi de C, apoi activitatea scade treptat pe măsura scăderii numărului de atomi de C ai substratului ( peroxisomii mamiferelor nu sunt capabili să oxideze butiril-CoA şi alţi esteri ai acizilor graşi cu moleculă scurtă, tiolaza fiind inactivă pentru acil-CoA cu lanţ mai scurt de 8 atomi de C). Sistemul de enzime ale β-oxidării peroxisomale are o activitate catalitică scăzută şi în transformarea esterilor CoA ai acizilor graşi cu lanţ foarte lung, de exemplu lignoceroil-CoA, dar această activitate, deşi scăzută este foarte importantă deoarece mitocondriile nu oxidează deloc aceste substrate. Produşii finali ai β-oxidării peroxisomale sunt diferiţi faţă de cei ai mitocondriilor, iar destinaţia lor este diferită: acetil-CoA, acetatul, acetilcarnitina, propionil-CoA şi acil-CoA cu lanţ scurt de atomi de C. Peroxisomii sunt lipsiţi de enzimele ciclului Krebs sau ale cetogenezei, astfel încât unităţile acetil vor difuza prin membrana peroxisomală, fiind preluate şi oxidate în mitocondrii sau utilizate în sinteze de AG, colesterol şi dolicol. Propionil-CoA este oxidată la CO2 în mitocondrii sau pe calea gluconeogenezei, după convertire la succinil-CoA. Acil-CoA cu lanţ scurt pot fi oxidaţi în mitocondrii sau esterificaţi la glicerolipide în RE. β-oxidarea peroxisomală furnizează substrate pentru oxidare mitocondriei, dar furnizează acetil-CoA proceselor de biosinteză celulare, atunci când celulele nu au nevoie de producere de energie. Carnitinacil-transferazele sunt implicate în mitocondrii în transportul substratelor în matrice, în timp ce în peroxisomi sunt situate în matricea peroxisomului şi facilitează transportul spre citosol al produşilor β-oxidării. Prima reacţie în formarea plasmalogenului are loc în peroxisomi. Plasmalogenul este cel mai abundent fosfolipid al mielinei. Deficitul de plasmalogeni determină anomalii profunde în mielinizarea celulelor nervoase, care conduc la boli neurologice-adrenoleukodistrofia. 10.3. Importul proteinelor în peroxisomi. Peroxisomii sunt organite lipsite de ADN şi ribosomi proprii, în consecinţă toate proteinele peroxisomului trebuie importate prin membrana acestui organit. Proteinele peroxisomale sunt importate datorită existenţei unor secvenţe semnal de import situate C-terminal şi N-terminal, secvenţe semnal interne nefiind demonstrate încă. Un semnal proteic specific (PTS sau semnal-ţintă peroxisomal) alcătuit din trei aminoacizi: serină-lizină-leucină (SKL) a fost identificat în domeniul C-terminal al proteinelor cu destinaţie peroxisomală. De fapt, secvenţa tripeptidică C-terminală minimală poate fi definită fără a acoperi întreaga diversitate ca S(C)A-K(H)R-L, localizată între primii 12 aminoacizi C-terminali. De exemplu, D-aminoacidoxidaza de la om are secvenţa C-terminală SHL, proteina 2 de transport sterolic la om are AKL, catalaza la om are SHL. Unele proteine peroxisomale au secvenţa-semnal de adresare peroxisomală localizată la capătul N-terminal al lanţului polipeptidic. Printre aceste proteine sunt şi tiolazele, sintetizate în citosol sub formă de precursori. În timpul importului în peroxisomi, presecvenţa lor este înlăturată de obicei prin proteoliză, dar aceasta nu este o etapă obligatorie a importului. Presecvenţa tiolazelor conţine o secvenţă-semnal de adresare peroxisomală. Dacă presecvenţa este înlăturată, proteina va fi localizată în citosol. Destinaţia peroxisomală a tiolazelor este determinată de o secvenţă-semnal N-terminală de tipul: RLXXXXXQ/HL (cu X sunt notaţi aminoacizii care nu au semnificaţie pentru adresarea peroxisomală- pot să fie orice aminoacizi).
119
10.3.1. Mecanismul importului peroxisomal. Sunt cel puţin 32 de proteine peroxisomale cunoscute, denumite peroxine care sunt implicate în importul proteic peroxisomal, cu consum de energie furnizată prin hidroliza ATP. Există căi diferite de import pentru proteinele matricii peroxisomale, respectiv pentru inserarea proteinelor în membrana peroxisomală. Există două subcomplexe cunoscute ca ,,docking” (Pex8p, Pex13p, Pex14p, Pex17p) şi RING (Pex2, Pex10p, Pex12p) legate printr-o punte alcătuită din Pex8p sau Pex3p, pentru a forma un complex denumit importomer. Pex3p acţionează ca ancoră peroxisomală pentru Pex19p. Importomerul este implicat în importul proteinelor în matrice dar nu şi în membrana peroxisomului. Receptorii PTS1 şi PTS2 (Pex5 şi Pex7) şi proteinele asociate cum este Pex20p poartă proteine cargo din citosol şi interacţionează la început cu subcomplexul ,,docking”.
Figura 84. Structura importomerului, complexul E2 de reciclare a receptorilor PTS Şi ATPazele AAA.
Imagine preluată din http://biology.ucsd.edu/labs/subramani/research.htm.
Complexele receptor-cargo intră în matrice sau sunt introduse în membrana peroxisomului. Pex5p şi Pex20p devin proteine peroxisom-asociate şi protejate faţă de proteaze chiar şi în absenţa subcomplexului RING al importomerului, însă intrarea lor în peroxisom este Pex14p-dependentă. Proteinele cargo sunt eliberate în matricea peroxisomului, iar receptorii eliberaţi sunt exportaţi în membrană, urmând dislocarea şi reciclarea în citosol. Dislocarea/reciclarea receptorilor necesită activitatea unui complex de reciclare ,,E2-like ubiquitin-conjugating enzyme”, Pex4p, două AAA ATPaze, Pex1p şi Pex6p, care interacţionează în manieră ATP-dependentă şi o proteină peroxisomală de membrană PEX26 care oferă situsul de legare al Pex6p. Când acest complex este afectat se produce poliubiquitinarea Pex5p şi Pex20p, urmată de degradarea lor în proteasom.
120
Figura 85. Mecanismul importului proteic peroxisomal
Mutaţii în orice component al importomerului afectează importul proteinelor matricii peroxisomale, sugerând că întregul importomer este implicat în translocarea proteinelor prin membrana peroxisomală. Celulele mutante defective în peroxinele Pex10, Pex12 şi Pex2 nu mai pot încorpora catalaza şi alte proteine în peroxisom. 10.4. Biogeneza peroxisomilor. Creşterea numărului celular al peroxisomilor poate avea loc prin diviziunea organitelor preexistente sau peroxisomii pot fi generaţi ,,de novo”. Proteinele peroxisomale de membrană sau matriceale sunt sintetizate la nivelul ribosomilor citosolici, neataşaţi RER, ulterior fiind importate în peroxisomi. În situaţia generării ,,de novo”, proteinele peroxisomale sunt orientate spre o membrană precursor prin secvenţe-semnal care diferă de secvenţele PTS. Studii cu celule mutante au evidenţiat că Pex19 este receptorul responsabil pentru orientarea proteinelor peroxisomale în membrană, în timp ce Pex3 şi Pex16 sunt necesare pentru inserţia acestor proteine în membrană. Inserarea proteinelor peroxisomale de membrană generează membrane care au toate componentele necesare importului proteinelor din matrice, conducând la formarea peroxisomilor maturi. Procesul de proliferare peroxisomală se bazează pe diviziunea peroxisomilor preexistenţi în celule. 10.5. Proliferarea peroxisomală. Procesul este indus de o mare varietate de molecule de natură amfipatică care au fost denumite agenţi de proliferare peroxisomală. Proliferatorii peroxisomali sunt substanţe de importanţă farmaceutică, industrială şi agricolă, sunt acizi alifatici sau aromatici sau esteri ai acestora . Dar nu orice acid are capacitatea de proliferare peroxisomală, deci procesul nu este provocat de un semnal structural cum este gruparea carboxilică. Printre proliferatorii peroxisomali cei mai cunoscuţi se numără: medicamentele hipolipemiante din familia fibraţilor, substanţe accesorii adăugate în masele plastice (agenţi de plasticizare-ftalaţi şi adipaţi), unele erbicide (acidul 2,4 diclorofenoxiacetic), medicamente
121
de largă utilizare cum este aspirina, substanţe comune în alimente ( acidul fitic constituient al clorofilei, AG din uleiul de peşte, etc.). Hormonii steroizi şi tiroidieni, precum şi acidul retinoic pot fi consideraţi proliferatori peroxisomali de natură endogenă. Proliferatorii peroxisomali nu au efect genotoxic, nu au activitate mutagenă, deci nu afectează integritatea şi structura ADN. Cu toate că peroxisomii sunt prezenţi la majoritatea celulelor eucariote, proliferarea peroxisomală este limitată la un număr redus de organisme, în primul rând la mamifere, fiind remarcabilă la rozătoarele de laborator (şoareci şi şobolani), dar este slabă sau nulă la om, chiar după expunere prelungită la agenţii proliferatori. La organismele în care se manifestă, este un proces specific ţesutului hepatic, provocând inclusiv hepatomegalie şi creşterea activităţii enzimelor implicate în calea β-oxidării AG , la nivel renal proliferarea fiind atenuată atât în ceea ce priveşte numărul şi volumul celular al peroxisomilor, cât şi în privinţa amplificării masei relative şi a activităţii enzimelor. Agenţii de proliferare produc o proliferare profundă a peroxisomilor în hepatocitele rozătoarelor şi primatelor şi creşteri marcate ale activităţii enzimelor β-oxidării acizilor graşi: acil-CoA oxidaze (ACOX), enoil-CoA hidrataza/3-hidroxiacil-CoAdehidrogenaza (enzima bi/trifuncţională PBE), 3-cetoacil-CoA tiolaza, datorită activării rapide şi coordonate a transcripţiei genelor care codifică aceste enzime. Proliferatorii peroxisomali induc la aceste animale carcinoame hepatocelulare după expunere îndelungată, datorită răspunsului pleiotrop tisular-specific indus de aceşti agenţi. Mai precis, în celulele hepatice cu creştere masivă a volumului peroxisomilor determinată de proliferatorii peroxisomali, se modifică reglarea transcripţiei genelor care codifică catalaza şi enzimele producătoare de H2O2, cum este ACOX, astfel încât se dublează activitatea enzimatică a catalazei, dar creşte activitatea ACOX de aproximativ 20 de ori, ceea ce determină acumulări de H2O2 şi alţi radicali reactivi ai oxigenului în celulă, urmate de transformări neoplazice celulare. Ţesuturile umane care nu au un grad semnificativ de răspuns la proliferatorii peroxisomali, este puţin probabil să dezvolte tumori, chiar după expunere cronică la proliferatorii peroxisomali. Mecanismele prin care hepatocitele umane sunt protejate de răspunsul pleiotrop declanşat de proliferatorii peroxisomali nu este elucidat. S-au propus mai multe explicaţii care implică: doza de agent de proliferare peroxisomală, farmacocinetica, biodisponibilitatea acestora, afinitatea agenţilor faţă de situsurile-ţintă din celulele umane, distribuţia izoformelor PPAR (receptorii activaţi de proliferatorii peroxisomali) în celulele-ţintă, natura elementului de răspuns la PPAR din structura genelor-ţintă (PPRE). Activarea transcripţiei genelor-ţintă care răspund la agenţii proliferatori peroxisomali este mediată de PPAR α, β/δ şi γ care sunt un grup de receptori proteici nucleari care funcţionează ca factori de transcripţie şi reglează exprimarea genelor. Sunt codificaţi de gene diferite şi au distribuţie tisulară specifică: PPARα sunt exprimaţi în ficat, rinichi, inimă, muşchi, ţesut adipos; PPARβ/δ sunt exprimaţi marcat în creier, ţesut adipos şi piele; PPARγ1 în toate ţesuturile, PPARγ2 mai ales în ţesutul adipos, iar PPARγ3 este exprimat în macrofage, intestin gros şi ţesut adipos. Descoperirea PPAR a facilitat identificarea PPRE în amonte (upstream) de gena ACOX de la şobolan. PPRE sunt formate din două secvenţe direct repetate AGG(A/T)CA, separate printr-un nucleotid, aşa-numitul motiv DR1 care leagă cu mare afinitate heterodimeri PPAR/RXR (heterodimeri ai receptorului activat de proliferatorii peroxisomali cu receptorul retinoidic X). Formarea acestor heterodimeri este expresia convergenţei căii de proliferare peroxisomală cu calea de semnalizare prin acid retinoic. S-a descoperit existenţa PPRE în promotorul genei ACOX umane sub forma unui motiv DR1, diferenţa este poziţionarea faţă de situsul de iniţiere a transcripţiei, care la şobolan este situată între -570 şi -558, iar la om, PPRE are următoarea secvenţă: AGGTCA•C•TGGTCA şi este situată în amonte de situsul de inţiere al transcripţiei între -1918 şi -1906. Inducţia ACOX este markerul pentru aprecierea intensităţii răspunsului pleiotrop indus de
122
proliferatorii peroxisomali. 10.5.1. Efectele biologice ale PPAR în celulele umane. Deşi în hepatocitele umane există PPAR şi enzimele β-oxidării peroxisomale şi a fost evidenţiat elementul de răspuns la PPAR funcţional în gena ACOX şi alte gene implicate în metabolismul lipidic, şi mai mult, heterodimerii PPARα/RXRα de la şobolan se leagă cu mare afinitate de PPRE de tip DR1 din hepatocitele umane, răspunsul nu include proliferare peroxisomală. Agenţii de proliferare peroxisomală, ca şi alte molecule lipofile (steroizii, acidul retinoic, hormonii tiroidieni, vitamina D3) funcţionează prin interacţiunea cu factorii de transcripţie care conţin receptori ai superfamiliei de receptori nucleari.
Figura 86. Rolul PPAR în organismul uman. După activarea în citoplasmă şi formarea heterodimerilor
PPAR-RXR/RAR (receptor retinoidic X /receptor acid retinoic), complexul heterodimeric este
transportat în nucleu şi leagă specific PPRE (,,peroxisome proliferator response element”) localizat în
Este neclar dacă agenţii proliferatori peroxisomali activează direct PPARα în ţesuturile umane. Controlul transcripţiei genelor implicate în metabolismul lipidic este extrem de complex şi efectul net al proliferatorilor peroxisomali poate depinde de heterodimerizarea, legarea/disocierea factorilor nucleari cu efect pozitiv sau negativ asupra transcripţiei. hNUC1 (PPAR subtip NUC1) izolată din sarcom osteogen, este un represor al PPARα umane. Distribuţia tisulară a hNUC1 nu este elucidată. Există posibilitatea ca hNUC1 să fie o izoformă PPAR dominantă în ficatul uman, iar răspunsul tisular pleiotrop indus de proliferatorii peroxisomali să fie modulat de incapacitatea acestor liganzi de a depăşi mecanismul de represie prin hNUC1. PPARα are un rol important în metabolismul lipidic prin reglarea expresiei genelor care codifică proteine implicate în preluarea AG liberi în
123
celule, în β-oxidarea lor şi în traficul intracelular al colesterolului, dar şi în mecanisme antiinflamatorii. PPARβ şi PPARγ au un rol central în procesele de diferenţiere celulară (reglarea invaziei citotrofoblastului şi reglarea diferenţierii celulelor stem multipotente în celule precursor). PPARγ reglează diferenţierea şi creşterea adipocitelor şi celulelor musculaturii netede vasculare, are deci funcţie anti-proliferativă prin stimularea diferenţierii şi inhibarea migrării celulelor endoteliale în cursul vasculogenezei. Inhibarea creşterii neoplazice prin ligandul TZD (thiazolidenodiona) al PPAR γ confirmă funcţia antiproliferativă. Are activitate antiinflamatorie prin reducerea exprimării TNF-α. Stimulează metabolismul lipidic şi al carbohidraţilor prin creşterea sensibilităţii la insulină a ţesuturilor periferice şi a preluării şi β-oxidării AG.
124
11. Mitocondria 11.1. Caracteristici generale şi structură. Mitocondriile sunt organite întâlnite în cele mai multe celule eucariote, cu diametru de 0,5-10 µm, care generează cea mai mare parte din ATP–ul necesar celulei ca sursă de energie. În afara funcţiei de furnizor de energie, mitocondria este implicată în procese celulare ca: semnalizare, diferenţiere celulară, apoptoză, creşterea celulară şi controlul ciclului celular, senescenţa celulară. Numărul de mitocondrii dintr-o celulă variază în funcţie de tipul tisular, în unele tipuri de celule cu activitate intensă, numărul lor poate ajunge până la câteva mii în funcţie de necesarul de energie (un hepatocit conţine 1000-2000 de mitocondrii, care reprezintă 1/5 din volumul celular). Sunt organite proximale miofibrilelor în miocite şi înconjoară componentele structurale ale flagelului spermatozoidului. Sunt asociate citoscheletului celular, un rol important în stabilirea acestei asocieri având vimentina. Mitocondriile formează, împreună cu citoscheletul, o reţea tridimensională ramificată, care influenţează forma şi funcţiile mitocondriilor. Mitocondriile sunt delimitate de o membrană externă şi o membrană internă între care există un spaţiu intermembranar. Membrana internă formează invaginări denumite criste care proemină în matricea mitocondrială. Mitocondriile deţin genom propriu, genele mitocondriale codifică o parte din proteinele conţinute de acest organit, mitocondriile din miocard fiind constituite din 615 tipuri distincte de proteine cu rol structural şi funcţional.
Figura 87. Structura mitocondriei: membrana externă, membrana internă cu cristele şi matricea mitocondrială cu ADN şi ribosomi. Imagine preluată din Lehninger,D. L. Nelson & M. M. Cox: Principles of Biochemistry, 3rd edition, 2000
Membrana externă este formată din fosfolipide şi proteine de membrană, într-un
raport similar cu cel din membrana plasmatică a eucariotelor (1:1), conţine un număr mare de proteine integrale denumite porine. Porinele formează canale care permit moleculelor de
125
5000 Da sau mai mici să difuzeze prin membrană. Proteine cu molecula mai mare pot să fie transportate prin membrana mitocondrială externă dacă au o secvenţă-semnal de ţintă mitocondrială situată la capătul N-terminal, care se leagă specific de o translocază din membrana externă, care le transportă activ prin membrană. Leziuni ale membranei mitocondriale externe determină difuzia proteinelor în citosol, declanşând apoptoza. Membrana mitocondrială externă se poate asocia cu membrana RE, formând o structură denumită MAM (mitocondrie asociată membranei RE), cu implicare în semnalizarea prin calciu şi în transferul de lipide între RE şi mitocondrie. Spaţiul intermembranar este delimitat între membrana mitocondrială externă şi cea internă. Datorită permeabilităţii membranei externe pentru molecule mici şi ioni, concentraţia acestora în spaţiul intermembranar este aceeaşi ca şi în citosol. Membrana mitocondrială internă formează numeroase expansiuni denumite criste, care îi măresc suprafaţa funcţională, inclusiv activitatea ATP-sintetazică. În mitocondriile hepatocitelor, datorită cristelor, suprafaţa membranei interne este de cinci ori mai mare decât a membranei externe, iar în mitocondriile celulelor musculare care necesită mai mult consum de energie furnizată de ATP, membrana internă formează mai multe criste. Membrana mitocondrială internă conţine proteine care îndeplinesc următoarele funcţii: reacţiile redox din fosforilarea oxidativă, generarea de ATP (ATP sintetaza), transportul metaboliţilor în şi din matrice, importul proteic mitocondrial, fuziunea şi fisiunea mitocondrială. Raportul proteine: fosfolipide este mai mare în greutate moleculară decât cel al membranei externe mitocondriale, de 3:1, adică 1 moleculă proteică la 15 molecule de fosfolipide. Membrana mitocondrială internă conţine un fosfolipid de tip special denumit cardiolipină, care are patru AG în moleculă, contribuind la proprietatea membranei interne mitocondriale de a fi impermeabilă, alături de o altă caracteristică structurală: lipsa porinelor. În consecinţă, proteinele sunt transportate prin membrana mitocondrială internă datorită unor complexe translocază (TIM) sau datorită Oxa1. Există un potenţial de membrană de-a lungul membranei mitocondriale interne, datorat activităţii enzimelor lanţului transportor de electroni. Matricea mitocondrială este spaţiul delimitat de membrana internă, implicat în producerea ATP de către ATP sintetaza localizată în membrana mitocondrială internă. Matricea conţine sute de enzime, cele mai importante fiind cele ale oxidării piruvatului şi β-oxidării AG, precum şi enzimele ciclului acizilor tricarboxilici (Krebs). În matrice se găsesc ribosomii mitocondriali, ARNt, şi câteva copii ale ADN genomic mitocondrial. ADN–ul uman mitocondrial este o moleculă circulară, ca la procariote, formată din 16.569 pb, conţine 37 de gene care codifică 22 ARNt, 2 ARNr şi 13 molecule proteice integrate în membrana mitocondrială internă, alături de proteine codificate de gene din nucleul celular. O mitocondrie conţine 2-10 copii de ADN mitocondrial. Mitocondriile deţin propriul aparat de sinteză proteică, în mitocondrie asamblându-se ribosomi 70 S, ca în celulele procariote şi nu 80S, cum sunt cei asamblaţi în celulă, prin sinteză în nucleol. 11.2. Funcţiile mitocondriilor. 11.2.1. Sinteza ATP prin fosforilarea ADP este funcţia majoră a mitocondriilor, reflectată prin numărul mare de proteine din membrana mitocondrială internă, implicate în această funcţie. Prin glicoliză, în citosol se formează piruvat, care este transportat activ prin membrana mitocondrială internă în matrice, unde este oxidat, cu formare de CO2, acetil-CoA şi NADH. Acetil-CoA este substrat pentru ciclul acidului citric denumit şi ciclul acizilor tricarboxilici sau ciclul Krebs. Enzimele ciclului Krebs sunt localizate în matricea mitocondrială, cu excepţia succinat dehidrogenazei, care este legată la membrana mitocondrială internă. În ciclul Krebs, acetil-CoA este oxidată la CO2 şi sunt produşi cofactori reduşi (trei molecule de NADH şi o moleculă de FADH2), care reprezintă sursa de
126
electroni din lanţul transportor de electroni. Energia redox de la NADH şi FADH2 este transferată oxigenului molecular în mai multe etape din lanţul transportor de electroni. NADH şi FADH2 sunt produse şi în citosol, în cursul glicolizei, şi sunt importaţi prin antiportul malat-aspartat sau prin sistemul glicerolfosfat. Lanţul transportor de electroni cuplează reacţia chimică dintre un donor de electroni (NADH,FADH2) şi un acceptor de electroni (O2) cu transferul de protoni prin membrana mitocondrială internă printr-un set de reacţii biochimice intermediare.
Figura 88. Funcţia majoră a mitocondriei este de a utiliza NAD redus şi FAD redus rezultaţi din
glicoliză sau β-oxidarea AG pentru producerea de energie înmagazinată în moleculele ATP. Imagine
preluată din http://campus.queens.edu/faculty/jannr/index.htm
NADH dehidrogenaza, citocrom c reductaza şi citocrom c oxidaza realizează transferul de electroni şi eliberarea energiei care este utilizată pentru a pompa H+ în spaţiul intermembranar. Acest proces este eficient, dar o mică parte din electroni pot reduce prematur oxigenul, formând specii reactive de oxigen, cum sunt radicalii superoxid, implicaţi în reducerea funcţiilor mitocondriale asociată procesului de îmbătrânire. Pe măsură ce creşte concentraţia protonilor în spaţiul intermembranar, este stabilit un gradient electrochimic de o parte şi de alta a membranei interne. Protonii se reîntorc în matrice prin ATP sintetază, iar energia lor este utilizată pentru sinteza ATP din ADP şi Pi. Acest proces, denumit chemiosmoză a fost descris de Peter Mitchell care a primit premiul Nobel pentru chimie în 1978. În 1997, Paul D. Boyer şi John E. Walker primesc premiul Nobel pentru clarificarea mecanismului de funcţionare a ATPsintetazei.
127
Figura 88. Sinteza de ATP, producerea de radicali superoxid prin inhibarea transportului de electroni
la nivelul complexului III şi producerea de căldură. Imagine preluată din: Brownlee, M. ,,Biochemistry
and molecular cell biology of diabetic complications” Nature 414 (2001), p.813-820
11.2.1.1. Transportorii de electroni. Transferul electronilor de la o moleculă cu energie mare (donor) la o moleculă cu energie mică (acceptor) poate fi separat spaţial într-o serie de reacţii redox intermediare care alcătuiesc un lanţ transportor de electroni. Primii transportori implicaţi în transportul de electroni în membrana mitocondrială internă sunt NAD+/NADH, FAD/FADH2 şi FMN (este un grup prostetic al unor flavoproteine). FMN (FAD) acceptă 2 e- + 2 H+ şi formează FMNH2 (FADH2). FMN, legat la situsul activ al unor enzime acceptă 1 e- pentru a forma radicalul semiredus semiquinonă. Semiquinona acceptă al doilea e- pentru a forma FMNH2. Din moment ce poate accepta sau ceda 1 sau 2 e-, FMN are un rol important în medierea transferului de e- între transportori care transferă 2e- ( de exemplu, NADH) şi transportori care acceptă doar 1e-(de exemplu Fe+++). Coenzima Q (ubiquinona) este extrem de hidrofobă, având un lanţ poliizoprenic. Inelul quinonă poate fi redus la quinol în reacţia:
Q + 2 e- + 2 H+ �� QH2
Atunci când este legată în situsuri specifice în complexele respiratorii, CoQ poate accepta 1 e- şi formează un radical semiquinonă (Q-). Deci, ca şi FMN poate media între donori/acceptori de 1 e- & 2 e- şi funcţionează ca un transportor mobil în interiorul membranei mitocondriale. Hemul este grupul prostetic al citocromilor şi conţine un atom de fier în inelul porfirinic. Gruparea hem a celor trei clase de citocromi diferă prin substituienţii inelului porfirinic şi numai hemul c este legat covalent la proteină prin legături de tip tioester stabilite cu resturile de cisteină. Fierul hemului poate ceda şi accepta 1 e- prin tranziţia între ionul feric şi ionul feros: Fe+++ + e- �� Fe++ . Inelul porfirinic formează un plan, iar fierul
128
hemului este legat la doi liganzi axiali, situaţi deasupra şi dedesubtul planului hem. Citocromii sunt proteine cu grup prostetic hem, care absorb lumina la lungimi de undă caracteristice. Schimbările de absorbanţă în cursul proceselor de oxidoreducere ale fierului din hem furnizează o bază pentru monitorizarea statutului redox al hemului. Citocromul c este o moleculă proteică mică, hidrosolubilă, cu un singur grup hem, în timp ce citocromii a şi a3 sunt de fapt grupuri hem simple, neataşate unui polipeptid. Citocromul c posedă resturi de lizină în jurul grupării hem, care pot interacţiona cu resturi anionice din structura membranei, ataşând citocromul c la membrană atunci când cedează sau acceptă electroni. Centrii fier-sulf (Fe-S) sunt grupări prostetice care conţin 2,3,4 sau 8 atomi de fier complexaţi cu S elementar sau cu S provenit din cisteină. Un asemenea centru cu 4 Fe poate alterna ciclic între stările redox Fe+++ (oxidat) + 1 e- ��Fe++ (redus). Proteinele cu funcţie de transfer de electroni pot conţine mai mulţi centri Fe-S. Aceşti centri Fe-S transferă doar un electron chiar dacă conţin unul sau mai mulţi atomi de fier, datorită strânsei proximităţi a atomilor de fier. Cei mai mulţi constituienţi ai lanţului respirator sunt ancoraţi în membrana mitocondrială internă, iar invaginările în matrice denumite criste cresc suprafaţa membranei. 11.2.1.2. Structura lanţului transportor de electroni. Lanţul transportor de electroni este format din 4 complexe, în interiorul fiecărui complex electronii trec secvenţial prin mai mulţi transportori de electroni. Altfel spus, electronii sunt transferaţi de la NADH la O2 prin mai multe complexe moleculare din interiorul membranei mitocondriale: complexul I, III şi IV plus CoQ şi citocromul c. Există situsuri de legare pentru CoQ în interiorul complexelor cu care aceasta interacţionează, CoQ fiind un cărăuş mobil, care difuzează liber în membrana mitocondrială. Citocromul c este rezident în spaţiul intermembranar şi se leagă alternativ la complexele III şi IV în cursul transferului de electroni. Nu există dovezi ale existenţei unor agregate supramoleculare stabile care să conţină mai multe complexe. Complexele individuale ale lanţului respirator mitocondrial au fost de altfel izolate şi compoziţia lor a fost determinată. Inhibitorii lanţului respirator includ: rotenona care blochează complexul I, antimicina A care blochează transferul de electroni în complexul III, CN- & CO inhibă complexul IV. Complexul I (NADH dehidrogenaza sau NADH ubiquinon oxidoreductaza) catalizează oxidarea NADH şi reducerea CoQ, cu transferul de pe NADH a 2 electroni şi formarea produsului redus, ubiquinol:
NADH + H+ + Q → NAD+ + QH2
Complexul I mută 4 protoni prin membrană, producând gradient protonic. Complexul I nu este numai situsul de intrare a electronilor în lanţul respirator, este şi situsul de producere a radicalilor liberi superoxid. Complexul I al mamiferelor are forma literei L, include 46 de proteine, grupul prostetic FMN şi centre Fe-S. Domeniul periferic care conţine FMN şi acceptă 2e- de la NADH proemină în matricea mitocondrială. Centrii Fe-S sunt localizaţi în domeniul periferic hidrofil, unde formează o cale de transfer al e- de la FMN la coenzima Q. Situsul de legare al CoQ este aproape de interfaţa dintre domeniul periferic şi cel intramembranar. Transferul iniţial de electroni este:
NADH + H+ + FMN � NAD+ + FMNH2
FMNH2 + (Fe-S)ox � FMNH + (Fe-S)red + H+
Apoi FMN este reoxidat prin transferul electronului pe următorul centru fier-sulf :
FMNH + (Fe-S)ox � FMN + (Fe-S)red + H+
129
Electronii trec printr-o serie de centri fier-sulf şi sunt transferaţi coenzimei Q, care acceptă 2 e- şi preia 2 H+ cu formarea coenzimei Q reduse (QH2). Complexul II. FAD, acceptorul iniţial de e-, este redus la FADH2 concomitent cu oxidarea succinatului la fumarat. FADH2 este apoi reoxidat prin transferul electronilor coenzimei Q, printr-o serie de trei centri fier-sulf, cu formarea QH2. Coenzima Q redusă este reoxidată via complex III, furnizând o cale de transfer a electronilor de la succinat în lanţul respirator. Succinatdehidrogenaza ciclului Krebs mai este denumită complex II sau succinat-CoQ reductază.
Complexul III (complex citocrom bc1) acceptă electroni de la coenzima QH2 care este generată prin transferul electronilor în complexele I & II. QH2 transferă secvenţial electronii către 2 molecule de citocrom c, cu transformarea quinolului în quinonă. Prin oxidarea quinolului se formează un gradient protonic: în total 6 protoni- 2 protoni reduc quinona la quinol şi 4 protoni sunt eliberaţi de pe 2 molecule de quinol. Complexul bc1 nu acţionează ca o pompă de protoni, gradientul de protoni se formează prin absorbţie/eliberare asimetrică a protonilor. Citocromul c1, un grup prostetic din complexul III reduce citocromul c, care este donorul de electroni către complexul IV.
Complexul IV (citocrom c oxidaza) preia 4 electroni de la 4 molecule de citocrom c şi îi transferă pe oxigenul molecular (O2), cu producerea a două molecule de apă. În acelaşi timp, mută 4 protoni prin membrană, producând gradient protonic. Citocrom c oxidaza este format din domenii transmembranare de tip α-helix şi este sediul următoarei reacţii:
O2 + 4 H+ + 4 e- � 2 H2O
Cei 4 electroni sunt transferaţi în complex de pe citocromul c simultan. Complexul IV conţine hem a & hem a3, CuA
(2 atomi de Cu adiacenţi) & CuB. O2 reacţionează la un centru binuclear constând din hemul a3 şi CuB. Electronii intră în complexul IV deodată, din citocromul c fiind transferaţi la CuA. Apoi trec via hem spre centrul binuclear:
cit c → CuA → hem a → hem a3/CuB
O2 se leagă la hemul a3, adiacent CuB şi are loc transferul electronilor pe O2.
O2 + 4 H+ + 4 e- � 2 H2O
Teoria chemiosmotică propusă de Peter D. Mitchell, explică cuplarea transportului de electroni cu fosforilarea oxidativă prin gradientul de protoni de o parte şi de alta a membranei mitocondriale interne. Efluxul de protoni creează un gradient electrochimic şi de pH. Gradientul de protoni este utilizat pentru sinteza ATP în complexul F0F1 al ATPsintetazei ATP sintetaza este considerată complexul V al lanţului transportor de electroni. Componenta F0 a ATP sintetazei este un canal ionic prin care protonii sunt transportaţi înapoi în matricea
130
mitocondrială, şi energia liberă produsă în timpul generării formelor oxidate ale transportorilor de electroni (NAD+ şi Q) este eliberată, fiind utilizată în sinteza ATP catalizată de componenta F1 a complexului.
11.2.2. Producerea de căldură. În anumite condiţii, protonii pot reintra în matricea mitocondrială fără a trece prin ATP sintetază şi fără a contribui la sinteza ATP. Acest proces este datorat difuziei facilitate a protonilor în matrice. Energia potenţială a gradientului electrochimic de protoni este eliberată sub formă de căldură. Procesul este mediat de un canal proteic denumit termogenin sau UCP1 (uncoupled protein1), a fost descoperit în ţesutul adipos brun, care există la naştere şi dispare cu vârsta şi este responsabil de termogeneză în afara ţesutului muscular. 11.2.3. Funcţia de depozitare a calciului. Concentraţia intracelulară a calciului reglează diferite reacţii din celulă şi este importantă în semnalizarea celulară. Mitocondriile pot depozita calciu, intervin în homeostazia celulară a calciului, prin preluare rapidă a calciului din citosol. Principalul depozit celular de calciu este RE şi există o interrelaţie semnificativă între mitocondrii şi RE în privinţa calciului. Calciul este preluat în matrice de un uniport din membrana mitocondrială internă care este activat prin potenţialul de membrană. Eliberarea calciului din mitocondrie în citosol are loc printr-o proteină de schimb Na+-Ca++ sau prin căile de eliberare ale calciului induse de calciu. Consecutiv eliberării, au loc creşteri ale concentraţiei citosolice a calciului care activează proteine aparţinând căilor de semnalizare celulară (mesageri secundari), care coordonează procese celulare cum este eliberarea neurotransmiţătorilor din neuroni sau a hormonilor din celulele endocrine. Mitocondriile au un rol important în alte procese: reglarea potenţialului membranar, apoptoză, reglarea proliferării celulare, reglarea metabolismului celular, sinteza hemului sau a steroizilor. În ficat, mitocondriile conţin enzime care intervin în metabolizarea amoniacului. 11.3. Replicarea mitocondriilor. Mitocondriile se divid prin fisiune binară, ca şi celulele bacteriene. Spre deosebire de bacterii, mitocondriile pot fuziona. În celulele umane, ADN-ul mitocondrial se replică şi mitocondriile se divid mai ales ca răspuns la necesarul de energie al celulei, şi mai puţin sincron cu ciclul celular. Când necesarul de energie al celulei creşte, mitocondriile cresc şi se divid, iar când necesarul de energie scade, mitocondriile sunt distruse şi devin inactive. Mitocondriile sunt distribuite randomic în celulele-fiice rezultate în urma diviziunii, prin diviziunea citoplasmei. Genele mitocondriale se moştenesc pe linie maternă, din ovul, spre deosebire de genele nucleare care provin atât din nucleul spermatozoidului cât şi din nucleul ovulului. Mitocondriile paternale sunt marcate prin ubiquitinare şi distruse în celulele embrionului. Zigotul conţine puţine mitocondrii care se vor divide pentru a popula celulele organismului adult. Moştenirea uniparentală lasă puţine şanse pentru recombinarea genetică, existenţa recombinării genetice în ADN mitocondrial uman este controversată. 11.4. Relaţia cu procesul de îmbătrânire. Pierderi de electroni din lanţul respirator mitocondrial pot determina formarea speciilor reactive ale oxigenului, având ca rezultat un stres oxidativ semnificativ la nivelul mitocondriilor, cu o rată înaltă a mutaţiilor în ADN mitocondrial. Stresul oxidativ determină un cerc vicios: mutaţii în ADN mitocondrial, anomalii structurale ale enzimelor şi consecutiv, stres oxidativ. Ţesuturile persoanelor vârstnice deţin mitocondrii cu activitate scăzută a proteinelor din lanţul respirator mitocondrial. Boala Parkinson este asociată cu deleţii în genomul mitocondrial care conduc la un nivel ridicat de radicali superoxizi, iar stresul oxidativ determină moartea celulelor neuronale. (vezi Capitolul 16. ,,Apoptoza”)
131
12. Semnalizarea celulară Moleculele-semnal controlează procesele metabolice, creşterea şi diferenţierea celulară, sinteza şi secreţia proteinelor, homeostazia intra şi extracelulară. Moleculele-semnal sunt produse de anumite celule şi produc un răspuns specific în celulele-ţintă care au receptori pentru aceste molecule-semnal. Din punct de vedere chimic, moleculele-semnal sunt o clasă extrem de heterogenă care include molecule mici de tipul acetilcolinei sau molecule mai mari cum sunt proteinele, molecule hidrofile care interacţionează cu receptorii specifici de pe suprafaţa membranei celulare sau molecule hidrofobe cum sunt steroizii, retinoizii, tiroxina, care difuzează prin bistratul lipidic al membranelor celulare şi se leagă de receptori intracelulari. Comunicarea intercelulară prin semnalizare începe printr-o interacţiune de tip receptor-ligand, datorită complementarităţii de structură dintre molecula-semnal (ligandul) şi un situs sau un domeniu structural din molecula receptorului. 12.1. Tipuri de semnalizare celulară. În funcţie de distanţa la care acţionează moleculele-semnal, există trei tipuri de semnalizare celulară: Semnalizarea endocrină este procesul prin care moleculele-semnal denumite hormoni acţionează asupra unor celulă-ţintă situate la distanţă de celulele organelor endocrine care au sintetizat şi secretat hormonii. Moleculele-semnal, adică hormonii endocrini sunt transportaţi la celulele-ţintă prin fluxul sangvin sau prin alte fluide extracelulare. În semnalizarea paracrină, moleculele-semnal sunt eliberate de celule aflate în proximitatea celulelor-ţintă: eliberarea neurotransmiţătorilor la nivelul sinapselor interneuronale sau a sinapselor neuron-celulă musculară sau acţiunea unor factori de creştere. Prin semnalizarea autocrină, celulele răspund la molecule-semnal pe care le eliberează chiar ele. Anumiţi factori de creştere acţionează în acest mod, fiind un tip de semnalizare obişnuit în celulele tumorale, care se caracterizează prin supraexprimarea şi eliberarea unor factori de creştere care stimulează propria proliferare şi a celulelor adiacente, cu creşterea masei tumorale. Există molecule-semnal care sunt molecule integrale ale membranei unei celule şi care se leagă de receptori de pe suprafaţa unor celule adiacente, declanşând diferenţierea acestora. Un alt caz particular este cel al moleculelor-semnal care pot acţiona asupra unor celule-ţintă aflate la distanţă scurtă sau lungă: epinefrina este un neurotransmiţător implicat în semnalizare paracrină şi un hormon endocrin. 12.2. Semnalizarea prin receptori de suprafaţă celulară. Acest tip de semnalizare celulară implică: sinteza şi eliberarea moleculei-semnal de către celule, transportul moleculelor-semnal la celulele-ţintă, legarea moleculei-semnal de un receptor proteic specific, urmată de activarea receptorului printr-o modificare conformaţională, declanşarea unei căi intracelulare de traducere a semnalului de către receptorul activat şi modificări specifice ale funcţiei celulare. Acest tip de semnalizare celulară este specific unor hormoni proteici, factori de creştere, neurotransmiţători care sunt liganzii care prezintă o complementaritate structurală cu un anumit domeniu al receptorului proteic. Răspunsul unei celule la semnale externe depinde de receptorii pe care îi posedă, de căile de traducere ale semnalului pe care legarea semnalului la receptor le activează şi de procesele celulare afectate. Fiecare receptor leagă specific o anumită moleculă-semnal sau un grup restrâns de molecule înrudite chimic. Moleculele-semnal pot însă să se lege la mai multe
132
tipuri de receptori, aparţinând diferitelor tipuri celulare, ceea ce are ca rezultat activarea unor căi diferite de traducere a semnalului şi, în consecinţă răspunsuri celulare diferite. De exemplu, acetilcolina se leagă de receptorul specific de pe suprafaţa celulei musculare striate şi are ca efect declanşarea contracţiei prin activarea unui canal ionic cu poartă dependentă de ligand. Eliberarea acetilcolinei în apropierea unei celule musculare cardiace încetineşte ritmul contracţiei prin activarea unui receptor cuplat cu proteina G, iar legarea acetilcolinei pe receptorul unei celule din acinii pancreatici declanşează exocitoza cu eliberarea granulelor secretorii care conţin enzimele digestive. Deci, receptorii proteici de suprafaţă celulară se caracterizează prin specificitate de legare a unui anumit ligand, complexul receptor-ligand rezultat prezintă o specificitate efectoare pentru că mediază un răspuns celular specific. Există receptori de suprafaţă care deşi leagă diferiţi liganzi, declanşează acelaşi răspuns celular: epinefrina, glucagonul, ACTH se leagă de membrii diferiţi ai familiei de receptori cuplaţi cu proteina G de pe suprafaţa hepatocitului, dar iniţiază aceeaşi cale de semnalizare intracelulară, sinteza AMP ciclic. Acest mesager secundar reglează diferite căi metabolice, deci cei trei hormoni au acelaşi efect asupra celulei hepatice. Răspunsul celular la moleculele-semnal depinde de numărul de receptori de pe suprafaţa unei celule, de afinitatea acestora faţă de anumiţi liganzi şi de concentraţia ligandului în proximitatea celulei-ţintă. Reglarea numărului de receptori specifici pentru o anumită moleculă-semnal influenţează sensibilitatea celulei la un anumit semnal şi influenţează funcţiile şi dezvoltarea celulei. Endocitoza poate reduce semnificativ numărul de receptori expuşi pe suprafaţa unei celule, determinând reducerea răspunsului celular în condiţiile unei concentraţii constante de molecule-semnal. Legarea moleculelor-semnal extracelulare denumite ,,primul mesager” de receptorii specifici membranari conduce la o creştere sau la o descreştere a concentraţiei unor molecule-semnal intracelulare, cu greutate moleculară mică denumite ,,mesageri secundari”: 3’,5’AMPciclic (cAMP), 3’,5’GMPciclic (cGMP), 1,2 diacilglicerol (DAG), inozitol 1,4,5trifosfat (IP3), Ca2+, inozitolfosfolipidele membranare. Activarea receptorului prin legarea semnalului extracelular declanşează transducţia, calea de semnalizare intracelulară cu modificarea concentraţiei intracelulare a mesagerului secundar care va determina alterarea structurii şi funcţiei unor proteine (enzime sau proteine cu alte funcţii). 12.2.1. Receptorii cuplaţi cu proteine G 12.2.1.1. Receptorii cuplaţi cu proteine G care au ca efector adenililciclaza. Proteinele G traducătoare de semnal sunt trimeri constituiţi din trei subunităţi: α, β şi γ. Subunitatea Gα este o GTPază care alternează între forma activă legată de GTP şi forma inactivă legată de GDP. Activarea receptorului prin legarea moleculei-semnal determină activarea proteinei G, care la rândul ei reglează activitatea unei alte proteine denumită proteină efectoare. Astfel de proteine efectoare sunt canale ionice din membrana celulară sau enzime care catalizează formarea mesagerilor secundari: cAMP, DAG, IP3, etc. Heterogenitatea căii de semnalizare având ca traductor proteina G se explică prin faptul că genomul uman conţine gene care codifică 27 Gα, 5 Gβ şi 13 Gγ, care prin combinare în trimeri formează clasa proteinelor G. În stare de repaus, când receptorul este liber, subunitatea Gα este legată de GDP şi complexată cu Gβγ. Formarea complexului receptor-ligand determină schimbul de nucleotide şi Gα•GTP disociază de pe Gβγ, dar subunităţile rămân ancorate la membrană. Activarea proteinei G determină modificarea activităţii proteinei efector, însă activarea durează doar câteva secunde, întrucât activitatea unei GTPaze determină hidroliza GTP legat de Gα şi inactivarea proteinei G. Epinefrina mediază răspunsul organismului la frig sau efort intens, când ţesuturile au o nevoie crescută de a cataboliza glucoză şi acizi graşi pentru a produce ATP. Eliberarea glucozei prin glicoliză şi a acizilor graşi prin lipoliză este declanşată prin legarea epinefrinei
133
sau norepinefrinei la receptorul β-adrenergic de pe suprafaţa celulelor hepatice, respectiv de pe suprafaţa adipocitelor. Legarea epinefrinei la receptorul specific β-adrenergic din membrana miocitelor creşte ritmul contracţiilor inimii, ceea ce produce un flux sangvin intens la nivelul ţesuturilor. Prin legarea de receptorii specifici β-adrenergici din musculatura netedă, determină relaxarea acesteia. Epinefrina are receptori specifici α2-adrenergici în musculatura netedă din tunica vaselor sangvine din tractul intestinal, piele şi rinichi, iar formarea complexului receptor-ligand în acest caz, determină constricţie arteriolară şi reducerea fluxului sangvin la nivelul acestor organe. Toate aceste efecte au ca rezultantă producerea şi furnizarea de energie necesară musculaturii striate în condiţii de stress menţionate. Receptorii epinefrinei sunt receptori cuplaţi cu proteină G, ambele subtipuri de receptori β1 şi β2 sunt cuplaţi cu proteina G stimulatoare (GS), care activează enzima adenililciclaza, care la rândul ei determină creşterea concentraţiei intracelulare de cAMP. Alte două subtipuri de receptori α-adrenergici ai epinefrinei, α1 şi α2, sunt cuplaţi cu alte tipuri de proteine G: α1 cu proteina Gi care inhibă adenililciclaza, α2 cu proteina Gq activează un alt efector, fosfolipaza C, care determină creşterea concentraţiei intracelulare a altor mesageri secundari: IP3 şi DAG. Anumite toxine bacteriene conţin subunităţi care penetrează membrana plasmatică a celulelor-gazdă şi catalizează modificarea chimică a proteinei Gs•GTP, care împiedică hidroliza GTP, Gs rămâne în stare activă, activând continuu adenilatciclaza şi în lipsa stimulului hormonal. Toxina holerică şi enterotoxinele E.coli acţionează în acest mod la nivelul celulelor epiteliului tractului intestinal, consecinţa fiind pierderea apei şi electroliţilor la nivelul lumenului intestinal cu diaree apoasă. Toxina pertussis (Bordetella pertussis) determină modificări chimice ale Gαi , care împiedică eliberarea GDP de pe subunitatea G, blocând proteina Gi în stare inactivă, ceea ce are ca efect creşterea concentraţiei intracelulare a cAMP în celulele epiteliale ale tractului respirator, cu pierdere de fluide şi electroliţi şi secreţie de mucus. Datorită cuplării la proteina G, receptori specifici unor hormoni diferiţi activează aceeaşi cale de semnalizare celulară şi produc aceleaşi răspunsuri celulare: glucagonul şi epinefrina se leagă la receptori diferiţi de pe suprafaţa hepatocitelor, dar ambii receptori sunt cuplaţi şi activează aceeaşi proteină GS care activează adenililciclaza şi declanşează aceleaşi răspunsuri celulare. Efectele cAMP sunt mediate prin proteinkinaza A (PKA), care este denumită proteinkinază dependentă de cAMP. PKA este un tetramer format din două subunităţi reglatoare R şi două subunităţi catalitice C. Cele două subunităţi reglatoare au câte două situsuri distincte pentru legarea cAMP, iar legarea cAMP la ambele situsuri determină demascarea subunităţilor catalitice şi activarea kinazei. Răspunsul celular este dependent de izoforma particulară PKA care se activează şi de substraturile PKA exprimate în respectiva celulă. De exemplu, epinefrina care activează calea de semnalizare intracelulară care determină creşterea concentraţiei AMP ciclic şi activarea PKA, are aceleaşi efecte în celula musculară şi hepatică: activarea glicogenolizei şi inhibarea glicogenogenezei, însă în adipocite, activarea PKA indusă de epinefrină determină fosforilarea şi activarea fosfolipazei care catalizează hidroliza trigliceridelor, cu mobilizarea AG. Activarea PKA în celulele ovariene prin FSH sau LH determină sinteza de estrogeni şi progesteron. PKA acţionează asupra unor substraturi extrem de diferite, dar întotdeauna fosforilează în substrat un rest de serină sau treonină din aceeaşi secvenţă de aminoacizi: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-φ, unde X semnifică orice aminoacid, iar φ semnifică un aminoacid hidrofob. Prin fosforilarea enzimelor acestea trec în formă activă sau, din contră, inactivă. De exemplu, PKA fosforilează şi inactivează glicogensintetaza, dar intensifică şi degradarea glicogenului prin fosforilarea şi activarea glicogenfosforilazkinazei (GPK), care la rândul ei fosforilează şi activează glicogenfosforilaza care degradează glicogenul. Întregul proces se opreşte când
134
epinefrina este îndepărtată şi nivelul intracelular de cAMP se prăbuşeşte, inactivând PKA. O protein fosfatază îndepărtează grupările fosfat de pe glicogensintetază activând-o, şi de pe formele fosforilate ale glicogenfosforilazkinazei şi glicogenfosforilazei, inactivându-le. Această proteinfosfatază este inhibată atunci când PKA este activă, deoarece PKA fosforilează şi activează un inhibitor al fosfoproteinfosfatazei. În condiţiile unei concentraţii intracelulare scăzute de cAMP, PKA este inactivă, inhibitorul nu este fosforilat şi fosfoproteinfosfataza este activă. Este stimulată sinteza glicogenului şi inhibată degradarea lui. Creşterea concentraţiei citosolice a cAMP stimulează exprimarea unor gene care conţin o secvenţă denumită element de răspuns la cAMP (CRE) care leagă o formă fosforilată a factorului de transcripţie denumit proteina de legare a CRE (CRE binding protein sau CREB), situat în nucleu. Legarea neurotansmiţătorilor sau hormonilor la receptori cuplaţi cu proteina GS, activează adenililciclaza, determinând o creştere a cAMP şi eliberarea consecutivă a PKA activă. Anumite subunităţi PKA sunt translocate în nucleu şi fosforilează serina din poziţia 133 a proteinei CREB. CREB fosforilată interacţionează cu un coactivator CBP/300 şi se leagă de secvenţele CRE ale unor gene ţintă stimulând transcripţia acestora. Afinitatea receptorului pentru hormon scade când GDP legat la GS este înlocuit cu GTP. GTP este rapid hidrolizat, se ajunge la inactivarea adenililciclazei şi la scăderea producţiei de AMP ciclic. Pe de altă parte, cAMP fosfodiesteraza hidrolizează cAMP, ceea ce determină întreruperea răspunsului celular. Răspunsul celular poate fi suprimat şi printr-un mecanism de feedback prin produs final, datorat fosforilării unor resturi de serină şi treonină din domeniul citosolic al proteinei GS de către PKA activă. Astfel, expunerea prelungită a celulei la acţiunea unui hormon determină desensibilizarea receptorului β-adrenergic datorită fosforilării GS. Această desensibilizare prin feedback, prin fosforilare catalizată de PKA, poate afecta orice receptor cuplat cu GS, care leagă diferiţi liganzi. Fosforilarea unor aminoacizi din domeniul citosolic al receptorului β-adrenergic, catalizată de kinaza receptorului β-adrenergic (BARK), are loc numai în prezenţa ligandului legat de receptor, afectează exclusiv receptori β-adrenergici activaţi. Resensibilizarea receptorilor se produce prin defosforilări datorate unor fosfataze constitutive. Expunerea celulelor la o cantitate din ce în ce mai mare de hormon determină, datorită acestor mecanisme, o activare mai slabă a căilor de semnalizare celulară decât dacă celula este expusă la un hormon după ce în mediul extracelular hormonul a lipsit. Dacă molecula-semnal este complet îndepărtată, receptorul devine complet defosforilat şi poate răspunde cu maximum de sensibilitate chiar la concentraţii scăzute de hormon. Un alt mecanism de reglare a receptorilor β-adrenergici este β-arestina, o proteină citosolică ce se leagă la receptorii fosforilaţi de BARK şi inhibă complet interacţiunea lor cu proteinele GS. β-arestina se leagă şi de moleculele de clatrină şi proteinele AP care îmbracă veziculele de endocitoză, determinând internalizarea prin endocitoză a receptorilor şi scăderea numărului lor la suprafaţa celulară. 12.2.1.2. Receptorii cuplaţi la proteine G care reglează canale ionice. Receptorii neurotransmiţătorilor sunt receptori cuplaţi la proteine G, iar efectorii unor astfel de receptori sunt canalele de Na+ şi K+ din membrana postsinaptică. Neurotransmiţătorii se leagă la aceşti receptori şi determină deschiderea sau închiderea acestor canale ionice cu poartă dependentă de ligand, conducând la modificări ale potenţialului de membrană. Legarea acetilcolinei la receptorii nicotinici din musculatura striată generează un potenţial de acţiune care declanşează contracţia musculară. Legarea acetilcolinei la receptorii muscarinici are efect inhibitor asupra contracţiei miocardului prin menţinerea hiperpolarizării membranei miocitelor timp de câteva secunde. Activarea receptorului muscarinic după legarea acetilcolinei determină activarea proteinei Gi, conducând la deschiderea canalului pentru K+ şi un eflux de ioni de potasiu care are ca efect hiperpolarizarea membranei
135
plasmatice. Rodopsina, un receptor cuplat la proteina G care este activat de lumină, este localizată la nivelul discurilor membranare din segmentul extern al celulelor cu bastonaşe. Proteina G cuplată la acest receptor este denumită transducină Gt , o celulă cu bastonaş umană având 4x107 molecule de rodopsină , formată din proteina opsină şi pigmentul 11-cis-retinal. După absorbţia luminii, 11-cis retinalul este rapid convertit la izomerul trans, ceea ce determină o modificare conformaţională a opsinei şi activarea acesteia (metarodopsină sau opsină activată). Acest receptor activat interacţionează şi activează proteina Gt. La întuneric, potenţialul de membrană al celulelor cu bastonaş este de -30 mV, mult mai mic decât potenţialul de repaus al altor celule excitabile, cum este neuronul: -60-90 mV. Ca o consecinţă a acestei depolarizării, celulele cu bastonaş secretă continuu neurotransmiţători, iar neuronii bipolari cu care sunt legate prin sinapse sunt stimulaţi continuu. Depolarizarea determină în fapt existenţa unor canale ionice neselective deschise, care permit trecerea ionilor de Na+, K+
şi Ca2+. Absorbţia luminii determină închiderea acestor canale, potenţialul devine şi mai negativ şi sunt eliberaţi din ce în ce mai puţini neurotransmiţători. Această modificare este percepută la nivelul creierului ca lumină. Proteina care realizează conexiunea opsinei activate cu canalele cationice din membrana plasmatică a celulelor cu bastonaş este GMP ciclic, care este sintetizat continuu din GTP printr-o reacţie catalizată de guanilatciclaza, care nu este afectată de lumină. De fapt, absorbţia luminii de către rodopsină induce activarea cGMP fosfodiesterazei, care hidrolizează cGMP la GMP liniar, cu scăderea concentraţiei intracelulare de cGMP în cursul expunerii la lumină. Nivelul intracelular crescut de cGMP la întuneric menţine canalele ionice cu poartă dependentă de cGMP deschise, iar lumina induce descreşterea nivelului intracelular de cGMP şi închiderea canalelor ionice, hiperpolarizarea membranei şi reducerea secreţiei de neurotransmiţători. Trei sau patru molecule de cGMP trebuie să se lege de canalul ionic pentru a-l deschide, această interacţiune alosterică fiind foarte sensibilă la modificări mici de concentraţie intracelulară a cGMP. 12.2.1.3. Receptori cuplaţi la proteine G care au ca efector fosfolipaza C. Există căi de semnalizare celulară care au ca mesager secundar molecule derivate din fosfatidilinozitol. Fosfoinozitidele (PI4,5 bifosfat) sunt clivate de enzime asociate membranei plasmatice denumite fosfolipaze C, cu formarea 1,2-diacilglicerolului (DAG), o moleculă lipofilă care rămâne asociată membranei, şi inozitol 1,4,5 trifosfat (IP3) care difuzează în citosol. Hormonii care se leagă de receptori specifici cuplaţi la proteina Go sau Gq induc activarea fosfolipazei C. Concentraţia intracelulară de Ca2+ este menţinută constantă, sub 0,2µΜ, prin mai multe mecanisme. Pompele Ca2+ATPazice pompează ionii de calciu din citosol în mediul extracelular sau în lumenul unor compartimente celulare, deoarece o modificare mică a concentraţiei intracelulare a Ca2+ determină o varietate de răspunsuri celulare. Legarea unor hormoni la receptorii lor de pe suprafaţa hepatocitelor, adipocitelor şi altor celule determină o creştere a concentraţiei intracelulare a ionilor de calciu, chiar şi atunci când acest ion lipseşte din mediul extracelular, datorită eliberării din lumenul RE prin deschiderea canalelor pentru Ca2+ cu poartă dependentă de IP3 din membrana RE. Această proteină-canal este formată din 4 subunităţi identice, fiecare dintre ele posedă un situs de legare al IP3 în domeniul citosolic N-terminal. Această creştere a concentraţiei intracelulare a Ca2+, mediată de IP3, este tranzitorie, deoarece Ca2+ATPazele localizate în membrana plasmatică şi în membrana RE pompează activ ionii de calciu din citosol la exteriorul celulei şi în lumenul RE. În plus, o grupare fosfat a IP3 este hidrolizată, cu formare de inozitol 1,4 difosfat care nu poate declanşa eliberarea ionilor de calciu din lumenul RE. A fost evidenţiată existenţa în membrana plasmatică a unui canal pentru Ca2+ denumit canal TRP care se deschide ca răspuns la depleţia depozitelor de ioni de calciu din lumenul RE. Această depleţie determină
136
prin mecanism necunoscut o modificare conformaţională a canalelor ionice pentru Ca2+ cu poartă dependentă de IP3 din membrana RE, care le permite acestor proteine canal să se lege de canalele TRP determinând deschiderea acestora din urmă. Diacilglicerolul, rezultat din clivarea fosfoinozitidelor de către fosfolipaza C, activează o familie de proteinkinaze denumite proteinkinazele C (PKC). În absenţa stimulării hormonale, PKC sunt proteine solubile din citosol, inactive. O creştere a concentraţiei citosolice a ionilor de calciu determină legarea proteinkinazei C la membrana plasmatică unde este activată de DAG. Efectul DAG asupra proteinkinazei C necesită formarea unui complex cuaternar între diacilglicerol, Ca2+, proteinkinaza C şi un fosfolipid, probabil fosfatidilserina. Activarea proteinkinazei C în diferite tipuri celulare determină răspunsuri celulare care influenţează creşterea celulară şi metabolismul. Proteinkinaza C poate fosforila factori de transcripţie, ceea ce induce sinteza ARNm care declanşează proliferarea celulară. Activează glicogensintetaza, determină eliberarea de serotonină şi de enzime lizosomale din plachetele sangvine, datorită creşterii concentraţiei intracelulare a Ca2+ induse de trombină este declanşată agregarea plachetară după modificări conformaţionale ale acestor fragmente celulare. Activarea proteinkinazei C declanşează eliberarea de adrenalină din medulosuprarenală, secreţia de aldosteron din corticosuprarenală, eliberarea insulinei din insulele Langerhans. Stimularea prin acetilcolină a receptorilor cuplaţi cu proteine G situaţi la suprafaţa celulelor din pancreas şi parotide determină creşterea concentraţiei de Ca2+ mediată de IP3, urmată de fuziunea veziculelor cu membrana plasmatică şi secreţia de amilaze din pancreas şi parotide, eliberarea acetilcolinei în sinapsele neuromusculare, contracţia musculaturii netede, transportul glucozei şi biosinteza lipidelor în adipocite, degradarea glicogenului în celulele renale. Efectele ionilor de calciu sunt mediate de o proteină citosolică chelatoare de calciu denumită calmodulina. Este o proteină ubiquitară la eucariote, activitatea de mediere vizează multiple efecte celulare ale ionilor de calciu. Structura calmodulinei este identică în toate celulele, având patru situsuri de legare a Ca2+. Legarea calciului va determina o schimbare conformaţională a acestei molecule, care va conduce la o creştere a afinităţii calmodulinei faţă de alte proteine active. Deoarece ionii de calciu se leagă la calmodulină în manieră cooperantă, o mică modificare în concentraţia intracelulară a calciului va determina schimbări importante în nivelul de calmodulină activă. Una dintre enzimele activate de complexul Ca2+/calmodulină este miozinkinaza care reglează activitatea miozinei în celulele musculare. O alta este cAMP fosfodiesteraza care degradează cAMP. 12.2.2. Receptori cu activitate enzimatică asociată sau intrinsecă. O superfamilie de molecule-semnal care au rol fundamental în reglarea dezvoltării sunt factorii de transformare a creşterii TGFβ (,,transforming growth factor β”), din care fac parte proteinele BMP, implicate în osteogeneză, în formarea mezodermului şi în etapele timpurii ale hematogenezei. Un alt membru al superfamiliei, TGFβ1 are capacitatea de a induce transformări fenotipice ale unor celule de cultură. Toate cele trei izoforme ale TGFβ au efecte antiproliferative asupra mai multor tipuri de celule. Alterări ale receptorilor TGFβ sau ale unor molecule proteice din celule implicate în transducţia semnalului căii TGFβ, determină stimularea proliferării şi induce apariţia tumorilor. TGFβ1,TGFβ2 şi TGFβ3 sunt codificate de o singură genă şi exprimate tisular specific sub forma unui precursor. Exprimarea TGFβ este reglată în dependenţă de dezvoltarea ţesuturilor. TGFβ secretat este depozitat în ECM sub forma unui complex latent, inactiv, legat covalent de o proteină LTBP (,,Latent TGFβ Binding Protein”). Interacţiunea LTBP cu trombospondina din ECM sau cu integrine ale suprafeţelor celulare declanşează modificări conformaţionale ale LTBP care conduc la eliberarea dimerilor TGFβ activi, maturi. Eliberarea dimerilor activi TGFβ poate fi determinată şi de digestia LTPP de către metaloproteazele matricii.
137
TGFβ induce exprimarea unor molecule ale adeziunii celulare şi ale ECM. Legarea TGFβ de receptorii celulari specifici stimulează celulele să sintetizeze şi să secrete factori de creştere care balansează efectul de inhibare a creşterii exercitat de semnalele TGFβ, de aceea TGFβ au fost consideraţi iniţial ei înşişi factori de creştere. Receptorii TGFβ, odată activaţi fosforilează şi activează un tip particular de factor de transcripţie, rezultatul acestei activări, adică răspunsul celular depinde de alţi factori de transcripţie existenţi în celula respectivă. Există trei tipuri de receptori TGFβ: RI, RII şi RIII. Cel mai abundent este RIII, un proteoglican de suprafaţă celulară denumit βglican. RI şi RII sunt proteine transmembranare dimerice care au domenii citosolice cu activitate serin/treoninkinazică. RII este o kinază care se autofosforilează în lipsa TGFβ. Legarea TGFβ induce formarea complexelor care conţin câte două copii de RI şi RI, ca urmare RII fosforilează resturi de serină şi treonină din RI adiacentă feţei citosolice a membranei plasmatice, în acest mod RI kinaza devenind la rândul ei activă. Receptorii activaţi TGFβ îşi exercită activitatea catalitică asupra unor factori de transcripţie denumiţi proteine Smad, care sunt de trei tipuri: Smad reglate de receptor (R-Smad), co-Smad şi Smad antagoniste sau inhibitoare (I-Smad). R-Smad conţine două domenii MH1 şi MH2 , iar domeniul N-terminal MH1 conţine situsul specific de legare la ADN şi o secvenţă semnal de localizare nucleară (NLS) necesară pentru importul nuclear al proteinei. În forma inactivă, nefosforilată a R-Smad, NLS este mascat şi domeniile MH1 şi MH2 sunt asociate în aşa manieră încât proteina nu se poate lega la ADN sau la co-Smad. Fosforilarea R-Smad de către RI separă domeniile şi permite legarea importinei la NLS. Se formează complexul R-Smad cu co-Smad şi importina mediază translocarea complexului în nucleu. După disocierea importinei, complexele Smad cooperează cu alţi factori de transcripţie pentru a activa transcripţia genelor-ţintă. Toate celulele mamiferelor secretă cel puţin o izoformă TGFβ şi cele mai multe au receptori TGFβ pe suprafaţa lor, însă datorită faptului că proteinele Smad activate interacţionează cu seturi diferite de factori transcripţionali în diferite tipuri de celule, răspunsurile celulare obţinute variază în funcţie de tipul celular. Semnalizarea celulară prin Smad este reglată de proteine denumite SnoN şi Ski, identificate ca oncoproteine, deoarece determină proliferare celulară anormală după supraexprimare în fibroblaste. SnoN şi Ski se leagă la complexele Smad, blocând activarea transcripţiei şi determinând rezistenţa celulelor la acţiunea de inhibare a creşterii prin TGFβ. După stimulări îndelungate ale celulei cu TGFβ este posibil să apară nivele crescute de SnoN Şi Ski, ca şi I-Smad, mai ales Smad7, care blochează capacitatea RI de a activa prin fosforilare proteinele R-Smad. Multe tumori umane sunt determinate de mutaţii care produc alterări ale receptorilor TGFβ şi ale proteinelor Smad, celulele tumorale fiind rezistente la inhibarea creşterii indusă de TGFβ: cancerele pancreatice umane sunt determinate de o deleţie a unei gene care codifică un tip de Smad; retinoblastomul, cancerul de colon, gastric şi hepatic, proliferările maligne ale celulelor T şi B se datorează unor alterări ale receptorilor TGFβ de tip I sau II. O altă clasă de receptori cu activitate enzimatică asociată sunt receptorii citokinelor, asociaţi la nivelul domeniului lor citosolic cu un membru al familiei de proteintirozinkinaze denumită familia JAK kinazelor. Receptorii tirozinkinazici (RTK) au activitate enzimatică intrinsecă, proteintirozinkinazică, la nivelul domeniului citosolic. Liganzi ca interferoni, eritropoietina, hormonul de creştere, interleukine (IL-2, IL-4) se leagă pe receptorii citokinelor şi liganzi ca insulina, factorul de creştere epitelial (EGF), factorul de creştere al fibroblastelor (FGF), neurotrofina şi alţi factori de creştere se leagă pe receptorii tirozinkinazici şi declanşează formarea receptorilor dimerici, activi, prin modificarea conformaţiei monomerilor preexistenţi. Receptorii dimerici sunt deci formaţi prin asocierea a două kinaze, care se fosforilează reciproc la nivelul unui rest de tirozină din situsul de activare. Ca urmare a fosforilării, acest situs se mişcă spre exterior, permiţând ATP şi moleculelor substratului proteic să se lege la aceste kinaze. Kinazele activate fosforilează în
138
continuare alte resturi de tirozină din domeniul citosolic al receptorului, fosfotirozinele fiind situsuri de ancorare ale domeniilor SH2 sau PTB caracteristice multor proteine ale căii de transducţie intracelulară a semnalului. Prin ancorare, aceste proteine sunt la rândul lor activate prin fosforilare de către kinazele asociate sau intrinseci ale acestor receptori şi aduse în apropierea moleculelor substratului, activând calea de semnalizare intracelulară. Sunt ancorate astfel mai multe proteine formându-se complexele de multiancorare cu rol în traducerea semnalului. Citokinele sunt o familie de proteine mici care controlează aspecte ale creşterii şi diferenţierii tipurilor celulare specifice. De exemplu, interleukina 2 este esenţială pentru proliferarea celulelor T ale sistemului imun. Interleukina 4 este esenţială pentru formarea celulelor mature B producătoare de anticorpi. Factorul de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF) induce diferenţierea unui tip particular de celulă stem pluripotentă din măduva osoasă în granulocite. Trombopoietina induce diferenţierea megacariocitelor, din care prin fragmentare se formează plachetele sangvine, cu rol în hemostază. Eritropoietina este o citokină care induce diferenţierea celulelor roşii ale sângelui, sintetizată de celule renale prin activarea factorului de transcripţie HIF 1α, sensibil la nivelul de oxigen din sânge. Eritropoietina se leagă la receptorul specific EpoR, al cărui domeniu citosolic este asociat kinazei JAK2. Eritropoietina leagă monomerii EpoR, pe care îi aduce aproape unul de celălalt declanşând fosforilarea lor reciprocă la tirozina din situsul de activare. Se produce activarea kinazei. Resturile de fosfotirozină servesc ca situsuri de legare pentru un grup de factori de transcripţie denumiţi STAT. Bineînţeles, toate aceste proteine STAT au un domeniu N-terminal SH2 care leagă fosfotirozine, un domeniu central care conţine situsul de legare la ADN şi un domeniu C-terminal cu un rest de tirozină care va fi fosforilat de JAK kinaze, conducând la activarea STAT şi disocierea de pe receptor. STAT disociate formează un dimer prin interacţiunea fosfotirozinelor din domeniile lor SH2, dimerizarea expunând situsul NLS. Dimerul STAT importat în nucleu, se leagă la o secvenţă ADN denumită enhancer, fiind un activator al transcripţiei genei ţintă. În eritroblaste, stimularea prin eritropoietină induce transcripţia genei care codifică Bcl-xL. Această proteină previne moartea celulară programată (apoptoza), permiţând eritroblastelor să prolifereze şi să se diferenţieze în eritrocite. Receptorii tirozinkinazici (RTK) leagă factori de creştere şi insulina. După interacţiunea cu ligandul, se produce activarea receptorului, a activităţii tirozinkinazice, care stimulează consecutiv calea Ras-MAP kinazelor şi alte căi de traducere a semnalului, cu implicare în supravieţuire, proliferare, diferenţiere celulară şi reglarea metabolismului celular. Alterări ale structurii RTK datorate unor mutaţii în genele care codifică aceşti receptori au fost asociate cu diferite forme de cancer. RTK mutante trimit celulei semnale de activare a proliferării în lipsa factorilor de creştere. Supraproducţia receptorului EGF în anumite forme de cancer mamar explică proliferarea tumorală în condiţiile unor nivele normale de EGF. RTK sunt monomeri şi interacţiunea cu ligandul determină formarea dimerilor RTK. Receptorul insulinei formează dimeri prin legături disulfidice în absenţa ligandului, însă interacţiunea cu insulina determină modificări conformaţionale care activează receptorul. În receptorul dimeric, kinaza unei subunităţi fosforilează unul sau mai multe resturi de tirozină din situsul de activare al celeilalte subunităţi, acest situs de activare fiind în proximitatea situsului catalitic al celuilalt monomer. Se produce modificarea conformaţională care permite legarea ATP sau a substratelor proteice la receptorul activat. Este intensificată activitatea kinazică a domeniului citosolic al receptorului, iar fosfotirozinele sunt situsuri de ancorare pentru proteine adaptor, care au domenii SH2, SH3 sau PTB, care leagă componente proteice ale căilor de traducere cum sunt cele care activează Ras. Proteinele Ras sunt proteine care leagă GTP, alternând între starea activă şi starea inactivă care este Ras•GDP. Activarea Ras este accelerată de un factor de conversie al
139
guaninnucleotidelor (GEF), care se leagă de complexul Ras•GDP, determinând disocierea GDP. GTP, prezent în celule la concentraţii mai mari decât GDP, se leagă spontan la Ras libere, cu eliberarea GEF şi formarea Ras•GTP. Hidroliza GTP la GDP dezactivează Ras, dar dezactivarea necesită şi asistenţa unei proteine activatoare a GTPazelor (GAP), care se leagă de fosfotirozinele RTK activate şi intensifică activitatea GTPazică intrinsecă de 100 de ori. Atât proteinele trimerice G cât şi proteinele Ras sunt membre ale superfamiliei GTPazelor. Alterarea Ras în celulele umane prin mutaţii genice (proteinele Ras oncogenice au o mutaţie în poziţia 12) sunt asociate cu cancerele. Aceste proteine mutante nu pot hidroliza GTP şi contribuie la transformarea malignă. Înlocuirea glicinei din poziţia 12 cu un alt aminoacid blochează asocierea cu GAP şi în acelaşi timp blochează proteina în stare activă, legată de GTP. Activarea RTK este urmată de legarea unei proteine citosolice GRB2 prin domeniul SH2 la fosfotirozina receptorului. GRB2 are două domenii SH3 care leagă şi activează Sos, o proteină GEF, care activează hidroliza GTP legat de Ras. Activarea Ras induce formarea la nivelul membranei a unor complexe de semnalizare care conţin trei proteinkinaze care acţionează secvenţial. Cascada de kinaze culminează cu activarea MAP kinazelor, serin/treoninkinaze cunoscute şi sub numele de ERK. După importul în nucleu MAP kinazele pot fosforila factori de transcripţie care reglează transcrierea genelor care codifică proteine cu rol important în reglarea ciclului celular şi diferenţierii celulare. Activarea MAP kinazelor în diferite tipuri celulare conduce la răspunsuri celulare diferite, iar activarea sa în una şi aceeaşi celulă poate fi consecinţa stimulării prin hormoni diferiţi. Complexul Ras•GTP se leagă la domeniul reglator N-terminal al Raf, o serin/treoninkinază care este în acest mod activată. Hidroliza GTP din Ras•GTP eliberează Raf activă, care fosforilează şi activează MEK. MEK, la rândul ei, fosforilează şi activează MAP kinazele care fosforilează multe alte proteine. Ca şi proteina mutantă în poziţia 12 Ras (RasD), mutantele Raf sunt codificate tot de oncogene. În celulele în repaus, fără stimulare hormonală, Raf este o proteină citosolică cu o conformaţie în care domeniul reglator N-terminal este legat la domeniul catalitic (kinazic) pe care îl inhibă. Această conformaţie inactivă este stabilizată de interacţiunea cu un dimer al proteinei 14-3-3 care se leagă la resturi de fosfoserină dintr-un număr mare de proteine implicate în căi de semnalizare. Interacţiunea Raf cu Ras•GTP ancorat în membrană determină o modificare conformaţională a Raf care o disociază de proteina 14-3-3 şi înlătură efectul de inhibiţie a activităţii kinazice a Raf. Interacţiunea factorilor de creştere cu celule de cultură aflate în G0 determină o creştere rapidă a expresiei a mai mult de 100 de gene diferite, denumite gene de răspuns timpuriu deoarece sunt induse înainte ca celulele să intre în faza S. O astfel de genă codifică factorul de transcripţie c-Fos, care împreună cu alţi factori de transcripţie cum este c-Jun, induc expresia multor gene care codifică proteine necesare celulei pentru parcurgerea ciclului celular. Secvenţa enhancer a genei care codifică c-Fos conţine un element denumit SRE (Serum Response Element) denumit aşa pentru că leagă numeroşi factori de transcipţie activaţi la rândul lor prin căi de semnalizare celulară declanşate de numeroşi factori de creştere din ser. Aceste căi de semnalizare pot fi activate de MAP kinaze, dar şi de proteinkinaza A din calea adenozinmonofosfatului ciclic sau de proteinkinaza C din calea fosfoinozitidelor. MAP kinazele active induc transcripţia genei c-Fos prin modificarea a doi factori de transcripţie: factorul complex ternar (TCF) şi factorul de răspuns seric (SRF). Mai precis, în citosol, MAP kinazele fosforilează şi activează o altă kinază- proteina p90RSK, care este translocată în nucleu, unde fosforilează o serină din SRF. După translocarea în nucleu, MAP kinazele fosforilează direct tot la un rest de serină TCF. Asocierea TCF fosforilat cu două molecule de SRF fosforilat formează un trimer activ care se leagă la secvenţa SRE din ADN.
140
RTK şi receptorii citokinelor pot iniţia şi căile de semnalizare IP3/DAG prin activarea unei izoforme a fosfolipazei C (PLCγ). Domeniile SH2 ale izoformei γ a PLC se leagă de fosfotirozine din receptorii activaţi, în acest mod fosfolipaza C fiind poziţionată aproape de substratul său, PIP2 legat la membrană. În acelaşi timp, activitatea kinazică a receptorului determină fosforilarea resturilor de tirozină din PLCγ legată la membrană, intensificând activitatea hidrolazică a acesteia. Anumiţi receptori ai citokinelor sau RTK activaţi pot iniţia o altă cale de traducere a semnalului denumită calea fosfatidilinozitol-3 kinazei, prin recrutarea acestei enzime la membrană. PI-3 kinaza are un rol important în căi de semnalizare esenţiale în proliferarea celulară şi prevenirea apoptozei. Una dintre cele nouă izoforme ale PI-3 kinazelor codificate de gene umane a fost bine studiată şi s-a constatat că are o subunitate p110 cu activitate catalitică şi o subunitate 85 cu un domeniu SH2 care se leagă la resturi de fosfotirozină din domeniul citosolic al RTK sau receptorilor citokinazici activaţi. PI-3 kinaza este poziţionată lângă substratul fosfoinozitidic şi catalizează formarea PI-3,4difosfatului sau PI3,4,5 trifosfatului care acţionează ca situsuri de ancorare pentru proteine implicate în căi importante de traducere a semnalului. O astfel de proteină este proteinkinaza B, o serin/treoninkinază. Pe lângă domeniul catalitic, PKB conţine un domeniu PH care se leagă la fosfatul din poziţia 3 a PI3,4 difosfatului sau a PI3,4,5 trifosfatului, în acest mod PKB fiind localizată la nivelul membranei plasmatice, iar situsul catalitic al PKB este demascat devenind activ. După activarea completă a PKB prin interacţiunea în planul membranei cu o altă kinază PDK1 care produce o fosforilare a PKB, PKB fosforilează direct numeroase proteine cu diferite funcţii celulare. Astfel de proteine sunt proteinele pro-apoptotice Bad, a căror activare previne apoptoza. PKB activată promovează supravieţuirea celulelor prin fosforilarea factorului Forkhead-1. În absenţa factorilor de creştere, Forkhead-1 este nefosforilat şi localizat în nucleu, unde activează transcripţia unor gene care codifică proteine proapoptotice. Când celulele sunt stimulate de factori de creştere, PKB devin active şi fosforilează Forkhead-1, care leagă în această stare proteine 14-3-3, fiind sechestrat în citosol. Inactivarea PKB favorizează apoptoza, iar mutaţii care alterează proteina Forkhead-1, astfel încât sunt afectate serinele care sunt situsurile de fosforilare prin activitatea PKB, iniţiază apoptoza şi în prezenţa PKB activă. Fosforilarea prin PI-3 kinază este reversibilă. PTEN fosfataza poate înlătura grupările fosfat ataşate la resturi de serină, treonină şi tirozină, are capacitatea de a înlătura grupările fosfat din poziţia 3 a PI 3,4,5 trifosfatului, ceea ce are ca efect declanşarea apoptozei. Receptorul insulinic este un receptor dimeric tirozinkinazic care poate iniţia calea Ras-MAP kinazelor, conducând la modificări în exprimarea genelor. Insulina poate stimula inţierea căii PI-3 kinazelor, cu activarea PKB. În hepatocitele, celulele musculare sau adipocitele stimulate de insulină, PKB activată determină scăderea glicemiei prin importul glucozei în celule şi stimularea glicogenogenezei. Mecanismul prin care PKB activă determină transportul glucozei în celule nu este pe deplin elucidat, dar s-ar părea că este determinat de mutarea transportorului GLUT4 al glucozei din membrane intracelulare în membrana plasmatică. Atât în ficat cât şi în musculatură, stimularea prin glucoză activează glicogen sintetaza (GS) care catalizează sinteza glicogenului din UDP-glucoză. În celulele în repaus, în absenţa insulinei, glicogensintetazkinaza 3 este activă şi fosforilează glicogensintetaza blocându-i activitatea. PKB activă fosforilează şi inactivează GSK 3, astfel GS este activă şi catalizează sinteza glicogenului. 12.2.3. Căi care implică clivare proteolitică indusă de semnal. Aceste căi de semnalizare sunt ireversibile deoarece un component este clivat proteolitic. Una dintre aceste căi este calea NF-kB care permite celulelor să răspundă rapid la condiţii determinante de stres. Mecanismul specific constă în fosforilare urmată de degradare
141
ubiquitin-mediată a unei proteine inhibitor, cum este factorul de transcripţie NF-kB, care este principalul reglator transcripţional din celulele sistemului imun. NF-kB este rapid activată în celulele imune ca răspuns la infecţii, inflamaţii, la citokinele proinflamatorii cum este TNFβ şi interleukina-1 secretate de celule adiacente ca răspuns la infecţie şi la alţi factori de stres, cum sunt radiaţiile ionizante. Cele două subunităţi ale heterodimerului NF-kB împărtăşesc aceleaşi regiuni omoloage în domeniul N-terminal care permit dimerizarea lor şi legarea de ADN. În celulele în repaus NF-kB este sechestrat în citosol în formă inactivă, fiecare monomer fiind legat de o moleculă inhibitoare care maschează şi secvenţele de localizare nucleară. După stimulare, în câteva minute, este activată o kinază care fosforilează două resturi de serină din proteina inhibitoare a NF-kB. O ubiquitin-ligază se leagă apoi de aceste fosfoserine ale inhibitorului, declanşând degradarea proteolitică de către proteasom. Degradarea inhibitorului expune şi secvenţa de localizare nucleară a NF-kB, care este importat în nucleu unde activează transcripţia unei multitudini de gene-ţintă (mai mult de 150 de gene), printre care şi a celor care codifică citokine şi chemokine cu funcţia de atragere a altor celule imune şi fibroblaşti la situsul infecţiei, ca şi a genelor receptorilor care leagă proteinele ce permit neutrofilelor să migreze din fluxul sangvin în ţesuturi. NF-Kb stimulează exprimarea genei iNOS, enzima inductibilă care produce oxid nitric, care este toxic pentru celulele bacteriene şi exprimarea genelor unor proteine antiapoptotice care previn moartea celulelor imune. Acest factor de transcripţional activează expresia unor gene fie ca răspuns direct la patogeni/stres, fie ca răspuns indirect la acţiunea moleculelor semnal eliberate de celule infectate sau lezate (citokine sau interleukine).
Una dintre genele a cărei exprimare este activată de NF-kB este gena inhibitorului NF-kB, care leagă NF-kB în nucleu şi îl transportă în citosol, inactivându-l prin feedback negativ. NF-kB este implicat în răpunsul inflamator şi imunitate, dar şi în dezvoltarea normală datorită faptului că stimulează exprimarea unor proteine antiapoptotice, evitându-se apoptozele excesive care ar determina degenerare de organe, prin moartea unor celule care în mod normal, trebuie să supravieţuiască. O altă cale de semnalizare care implică proteoliza unui component este calea Notch-Delta. Receptorul Notch şi ligandul său Delta sunt proteine transmembranare, cu numeroase secvenţe repetitive de tip EGF în domeniul extracelular. Au rol în mecanisme de diferenţiere celulară de tipul inhibiţiei laterale, prin care celule adiacente, echivalente din punct de vedere al potenţialului de diferenţiere, devin capabile să urmeze căi de diferenţiere total diferite. Se previne astfel de exemplu, formarea a prea multor precursori ai celulelor nervoase din stratul de celule nediferenţiate. Proteina Notch este sintetizată ca proteină monomer membranară în RER, unde leagă presenilina1, o proteină membranară cu mai multe domenii transmembranare. Complexul format ajunge în aparatul Golgi unde are loc o clivare proteolitică care generează o subunitate extracelulară şi o subunitate transmembranar-citosolică, care rămân asociate prin legături slabe, non-covalente, în absenţa interacţiunii cu ligandul Delta din altă celulă. Legarea Delta declanşează o primă clivare proteolitică, o a doua clivare în regiunea hidrofobă transmembranară a receptorului Notch este catalizată de presenilina1 şi are ca rezultat eliberarea domeniului citosolic al Notch, care este translocat în nucleu. Presenilina 1 este o proteină a cărei genă prezintă mutaţii la pacienţii cu formă autozomal dominantă a maladiei Alzheimer. Modificarea patologică majoră este acumularea plăcilor de amiloid în creier. Aceste plăci de amiloid conţin agregate de peptide mici alcătuite din 42 de aminoacizi denumite Aβ42, care derivă din clivarea precursorului amiloidului, o proteină de suprafaţă specifică neuronilor. Clivarea precursorului amiloidului este catalizată de α sau β secretaze. γ secretazele catalizează o a doua clivare, care implică aceeaşi metaloprotează denumită TACE ce clivează şi Notch, generând peptide alcătuite din 26 de aminoacizi care nu au efecte nocive. Clivarea iniţiată de β secretaze determină apariţia peptidelor patologice Aβ42, clivarea fiind intensificată de presenilina1 mutantă de la
142
pacienţii cu maladie Alzheimer, ceea ce duce la formarea plăcilor de amiloid şi moartea neuronilor. Date recente sugerează că presenilina este o protează care determină stimularea clivării Notch şi APP, este un component alături de secretaze, al complexului de proteoliză al acestor proteine.
143
13. Ciclul celular
13.1. Etapele ciclului celular. Ciclul celular are 4 faze majore: faza G1 în care are loc sinteza ARN şi a proteinelor, este o fază de pregătire pentru faza S în care se desfăşoară sinteza de ADN şi replicarea cromozomilor, urmează faza G2 şi faza M (mitoza). Cromozomii sunt structuri condensate ale cromatinei, vizibile în microscopia optică, formate din două molecule de ADN rezultate din replicare, care împreună cu histonele şi alte proteine ale cromatinei, alcătuiesc cele două cromatide-surori, unite la nivelul centromerului. În interfază, membrana nucleului este continuă, în relaţie structural-funcţională cu RE. În profază, învelişul nuclear se dezintegrează, se retrage în RE şi aparatul Golgi, care formează vezicule. Microtubulii formează fusul de diviziune şi captează cromozomii prin intermediul cinetocorului. În metafază, cromozomii migrează în placa metafazică, la centrul fusului de diviziune. Anafaza se caracterizează prin separarea cromatidelor-surori şi migrarea cromozomilor unicromatidici spre cei doi poli ai fusului de diviziune. În telofază microtubulii fusului de diviziune se dezasamblează, cromozomii se decondensează, se formează învelişul nucleului celor două celule-fiice, la fel şi sistemul de endomembrane după citokineză (diviziunea fizică a citoplasmei, cu formarea celor 2 celule-fiice). Celulele rezultate în urma mitozei intră în faza G1, au un număr diploid de cromozomi, moştenit de la celula parentală. Ciclul celular al celulelor umane este parcurs în intervalul de 24 de ore, din care mitoza se desfăşoară în 30 de minute, faza G1 durează aproximativ 9 ore, faza S în jur de 10 ore, iar faza G2 aproximativ 4-5 ore. Celulele diferenţiate ies din ciclul celular în timpul fazei G1, intră în faza G0 unde supravieţuiesc zile, săptămâni sau toată viaţa fără a se divide din nou (neuronii). Anumite celule aflate în faza G0 se pot reîntoarce în ciclul celular, pe care îl parcurg şi se divid , procesul fiind strict reglat prin mecanisme de control ale proliferării celulare. Fibroblaştii şi limfocitele pot fi stimulate să reintre în ciclul celular şi să se dividă din nou.
Figura 89. Ciclul celular. Imagine preluată din http://iam2be.net/cancer
144
13.2. Reglarea ciclului celular. În controlul ciclului celular un rol central îl au ciclinele, subunităţi reglatoare ale proteinkinazelor denumite ciclin-dependent proteinkinaze (CDK). Concentraţia diferitelor tipuri de cicline creşte şi descreşte pe măsură ce celula progresează prin ciclul celular şi interacţionează cu molecule specifice ale CDK, subunităţi catalitice inactive, fără activitate enzimatică, în lipsa asocierii cu o subunitate reglatoare (un anumit tip de ciclină).
Figura 90. Reglarea ciclului celular.
Celula este stimulată să parcurgă ciclul celular şi să se dividă prin exprimarea unor complexe G1 ciclin-CDK, care fosforilează şi activează factorii de transcripţie ai genelor care codifică enzimele implicate în replicarea ADN. Este activată şi transcripţia genelor care codifică S-ciclin-CDK. În faza G1 târzie, G1ciclin-CDK declanşează prin fosforilări degradarea inhibitorilor fazei S, care sunt poliubiquitinilaţi şi clivaţi de proteasom. Ciclin-CDK caracteristice fazei S devin, în consecinţă active, activează enzimele replisomului, care îşi încep activitatea la situsurile de origine ale replicării. În faza S sunt sintetizate complexele M ciclin-CDK, care însă sunt menţinute inactive, inhibate prin fosforilarea unor situsuri specific din molecule, astfel încât replicarea ADN să fie completă, iar mecanismele reparatorii ale erorilor din replicarea ADN să aibă la dispoziţie timpul necesar pentru a-şi îndeplini rolul. Prin defosforilarea ulterioară, M ciclin-CDK devin active
145
şi declanşează procesele de condensare a cromozomilor, dezintegrarea învelişului nuclear, asamblarea fusului de diviziune, alinierea cromozomilor în placa metafazică. Promovarea anafazei are un efector important, complexul de promovare a anafazei (APC), care este o poliubiquitinligază multisubunitară. În timpul fazei M, APC poliubiquitinează proteine care apoi sunt degradate de proteasom. Una dintre proteinele degradate în acest mod este securina. Această proteină inhibă degradarea proteolitică a proteinelor de legare a cromatidelor surori. Atât timp cât APC este inhibată, securina este activă, şi cinetocorii se pot ataşa pe centromere, devin ataşaţi şi microtubulilor fusului de diviziune, iar cromozomii se aliniază în placa metafazică. APC devine activă, poliubiquitinează securina, care este degradată, cromatidele sunt eliberate prin degradarea proteinelor de legătură dintre ele, şi este iniţiată anafaza, cromatidele segregă şi sunt transporate spre polii opuşi ai fusului de diviziune. În anafaza târzie, APC determină poliubiquitinarea M ciclin-CDK care sunt degradate prin proteoliză: proteinele fosforilate de M ciclin-CDK sunt defosforilate de proteinfosfataze active constitutive şi sunt declanşate următoarele procese: decondensarea cromozomilor, reconstituirea învelişului nuclear, reasamblarea aparatului Golgi şi citokineza, separarea celor 2 celule-fiice. În consecinţă, degradarea în scop reglator a unor proteine la tranziţia prin punctele critice ale ciclului celular determină caracterul ireversibil al acestei tranziţii (parcurgerea ciclului celular într-un singur sens): G1→S, metafază→anafază, anafază→telofază şi citokineză. Factorii de creştere extracelulari sunt mitogeni pentru că induc sinteza G1 ciclin-CDK. Punctul din faza G1 târzie în care progresia celulei prin ciclul celular devine independentă de mitogeni se numeşte punct de restricţie (celula intră în faza S şi parcurge întreg ciclul celular). Studiul ciclului celular se realizează pe celule din cultură care necesită factori de creştere pentru stimularea proliferării celulare. Legarea acestor factori de creştere pe receptorii specifici celulari declanşează o cascadă de reacţii de traducere a semnalului care are ca răspuns celular transcrierea unor gene şi sinteza proteinelor corespunzătoare, implicate în controlul ciclului celular. Aceste celule din culturi, în prezenţa factorilor de creştere ies din G0 şi depăşesc punctul de restricţie 14-16 ore mai târziu, intră în faza S după încă 6-8 ore. 13.3. Moleculele specifice implicate în reglarea ciclului celular. Reglarea ciclului celular este realizată de o familie de kinaze dependente de cicline (CDK): CDK1, CDK2, CDK4, CDK6. Celulele umane exprimă mai multe tipuri de subunităţi reglatoare ale acestor kinaze: ciclinele A şi B care funcţionează în faza S, G2 şi începutul mitozei, 3 tipuri de cicline D şi o ciclină E care sunt ciclinele fazei G1 şi sunt esenţiale pentru depăşirea punctului de restricţie. Celulele aflate în G0, în lipsa factorilor de creştere nu exprimă nici cicline, nici CDK. Procesele de reglare prin APC afectează numai ciclinele B care au o secvenţă conservată de aminoacizi denumită secvenţă de degradare, care este recunoscută de APC ubiquitinligaza, în timp ce ciclinele G1 nu au o asemenea secvenţă. Adăugarea factorilor de creştere la culturi cu celule aflate în faza G0 este urmată de transcripţia mai multor gene: gene de răspuns rapid şi gene de răspuns întârziat, în funcţie de rapiditatea cu care apare ARN mesager corespunzător. Transcripţia genelor de răspuns rapid are loc la câteva minute după adiţia factorilor de creştere, cu declanşarea traducerii semnalului şi a răspunsului celular prin care sunt activaţi factori de transcripţie preexistenţi în nucleu sau citosol. Răspunsul rapid se datorează preexistenţei factorilor de transcripţie, care nu sunt sintetizaţi ca răspuns la
146
acţiunea factorilor de creştere, în consecinţă, nu intervin inhibitori ai transcripţiei sau translaţiei care să întârzie sinteza factorilor de transcripţie şi exprimarea genelor de răspuns rapid. Factorii de transcripţie sunt doar activaţi prin fosforilare sau prin îndepărtarea unui inhibitor. Unele gene de răspuns rapid codifică factorii de transcripţie ai genelor de răspuns întârziat, care codifică la rândul lor ciclina E şi CDK2, CDK4, CDK6. Asemenea factori de transcripţie ai genelor de răspuns întârziat sunt c-Fos şi c-Jun. Forme mutante ale c-Fos şi c-Jun sunt exprimate de retrovirusuri oncogene (v-Fos şi v-Jun) implicate în stimularea proliferării şi transformarea malignă a celulelor infectate. Sinteza ciclinelor D este reglată şi la nivelul translaţiei: factorii de creştere determină activarea căii PI3 şi ca răspuns activarea unui factor de iniţiere a elongaţiei care stimulează translaţia ARNm corespunzător ciclinelor D. TGF-β inhibă translaţia ARNm al ciclinelor D, deci inhibă proliferarea celulară. Factorii EF2 sunt codificaţi de gene de răspuns târziu şi activează transcripţia şi exprimarea genelor replisomului, genelor ciclinelor E (faza G1 târzie), genelor ciclinelor A (determină tranziţia fazaG1→faza S), genelor CDK2 (CDK caracteristice fazei S) şi propriilor gene. Interacţiunea EF2 cu o proteină codificată de o genă supresoare a tumorilor denumită protein Rb determină represia transcripţiei. Se formează un complex de interacţiune între EF2, protein Rb şi histon-deacetilaze: histonele deacetilate determină condensarea cromatinei şi inactivarea transcripţiei. CDK1 este necesară pentru intrarea în faza M, complexul cicline E- CDK2 determină activarea complexelor de prereplicare. Ciclina A este necesară pentru sinteza ADN (intrarea în faza S), iar ciclina B sintetizată în faza S târzie are o concentraţie crescută în G2→metafază care descreşte în anafaza târzie. Activitatea complexelor ciclin-CDK este reglată prin inhibitori ai CDK (CIP) care recunosc, leagă şi inactivează toate complexele ciclin-CDK şi INK care se leagă specific doar de CDK 4 şi 6 şi inhibă trecerea prin G1.
13.4. Puncte de control în reglarea ciclului celular: 1. Punctul de control al ADN nereplicat în fazele S şi G2 previne activarea factorilor fazei M (MPF) înainte ca replicarea ADN să fie completă (Cdc25). 2. Punctul de control al asamblării previne iniţierea prematură a anafazei (Mad2 şi alte proteine care controlează şi inhibă degradarea securinei prin APC). 3. Punctul de control al segregării cromozomilor previne telofaza şi citokineza până când cromozomii nu sunt corect segregaţi, astfel încât celulele-fiice să moştenească un set complet, adecvat de cromozomi. O GTP-ază denumită Tem1 activează o fosfatază Cdc14 care activează la rândul ei APC şi factorul specific APC denumit Cdh1. Ciclinele B au rol în degradarea şi inactivarea MPF. 4. Punctul de control al leziunilor ADN opreşte ciclul celular la tranziţia G1/S până când leziunea este reparată: rol important au proteinele supresoare ale tumorilor ATM/ATR, Chk1/2, p53. Proteina p53 activează p21 care determină arestarea celulelor în G1 şi G2. Proteina p53 este o proteină proapoptotică.
147
14. Apoptoza
14.1. Caracteristici şi cauze. Apoptoza (moartea celulară programată) este un proces caracteristic celulelor care alcătuiesc organismele multicelulare. Cuprinde evenimente celulare biochimice şi morfologice caracteristice: pierderea asimetriei bistratului lipidic membranar, pierderea adeziunii celulelor, fragmentarea nucleului, condensarea cromatinei, fragmentarea moleculelor de ADN. Spre deosebire de necroză, care este o moarte celulară traumatică, rezultat al unei agresiuni acute asupra celulei, apoptoza este un proces normal şi avantajos pentru dezvoltarea organismului. Într-un organism adult normal mor zilnic datorită apoptozei între 50 şi 70 bilioane de celule, iar în organismul unui copil, între 20-30 bilioane de celule. În decursul unui an balanţa dintre proliferare şi distrugere celulară prin apoptoză implică o masă de celule egală cu greutatea unui individ. Apoptoza este consecinţa infecţiilor virale, a unor condiţii de stres celular, a lipsei nutrienţilor. Apoptoza este determinată de leziunile ADN apărute prin acţiunea unor factori chimici, UV, radiaţii ionizante. Unul dintre mecanisme implică genele supresoare ale tumorilor (p53). Decizia pentru moarte prin apoptoză poate fi luată de celula însăşi, de ţesuturile adiacente sau de sistemul imun, cu scopul de a înlătura celule deteriorate. 14.2. Importanţa apoptozei. Apoptoza are un rol important în prevenirea cancerelor, orice eveniment care interferă cu mecanismele de declanşare a apoptozei sau cu exprimarea genelor supresoare ale tumorilor poate declanşa proliferarea celulară şi transformarea malignă. Apoptoza intervine în menţinerea numărului relativ constant de celule ale unui organism: celulele deteriorate sunt înlăturate prin apoptoză, care balansează proliferarea celulară (rata mitozelor este balansată de rata apoptozei). Dacă acest echilibru este distrus şi celulele se divid în ritm mai rapid decât ritmul în care mor prin apoptoză, apar tumori, sau dacă celulele se divid în ritm mai lent are loc o pierdere de celule din ţesuturi. Apoptoza intervine în dezvoltarea normală. Datorită fragmentării celulelor prin apoptoză şi fagocitării resturilor celulare, nu sunt eliberate enzime celulare care ar putea afecta ţesuturile adiacente şi o proliferare celulară selectivă însoţită de apoptoze selective modelează organismul în cursul dezvoltării embrionare. Diferenţierea limfocitelor T şi B este un proces complex care generează o paletă diversă de celule imature, precursori potenţial dăunători organismului, care sunt înlăturaţi prin apoptoză. Limfocitele T citotoxice îşi autoinduc apoptoza prin deschiderea unor pori în membrană, datorită secreţiei de perforină. Prin pori se eliberează enzime (granzima B) care activează caspazele. 14.3. Mecanismul apoptozei. Apoptoza este un proces controlat prin semnale extracelulare (inductori extrinseci) sau prin semnale intracelulare (inductori intrinseci). Semnalele extracelulare sunt toxine, hormoni, factori de creştere, NO, citokine care traversează membrana sau se leagă de un receptor membranar şi induc traducerea semnalului şi declanşarea răspunsului celular pozitiv (declanşator) sau negativ (represor, inhibitor) al apoptozei. Legarea unui ligand la receptorul specific celular poate iniţia apoptoza- inducţie
148
pozitivă sau poate determina represia activă a apoptozei- inducţie negativă. Semnalele intracelulare sunt sintetizate ca răspuns al celulei la stres determinat de: legarea glucocorticoizilor la receptorii nucleari, căldură, radiaţii, privare de nutrienţi, infecţii virale, hipoxie, creşterea concentraţiei intracelulare de Ca2+ şi activează proteine reglatoare ale apoptozei a căror ţintă este funcţia mitocondrială sau proteinele adaptor ale mecanismelor apoptotice. 14.3.1. Reglarea apoptozei prin mecanism mitocondrial. Scăderea funcţiei mitocondriale şi a respiraţiei aerobe determină moartea celulară prin apoptoză. Proteinele implicate în reglarea apoptozei afectează în mod diferit mitocondriile: datorită creşterii permeabilităţii membranelor mitocondriale, efectorii apoptotici ies din mitocondrii. De exemplu, NO disipă potenţialul de membrană, ceea ce are ca efect creşterea permeabilităţii membranelor mitocondriale. Efectorii apoptotici care ies din mitocondrii sunt SMAC (activatori mitocondriali secundari ai caspazelor) care ajung în citosol şi se leagă de inhibitori ai proteinelor apoptotice (IAP), declanşând apoptoza. Proteinele proapoptotice sunt cisteinproteaze denumite caspaze, care determină degradarea componentelor celulare. Un alt grup de efectori apoptotici care sunt exportaţi din mitocondrii sunt citocromii c, care în citosol leagă Apaf-1, ATP şi pro-caspaze, formându-se complexele denumite apoptozomi. Apoptozomul clivează pro-caspaza care este un precursor inactiv, cu eliberarea formelor active ale caspazelor: caspaza 9 activă care, la rândul ei activează caspaza 3 efectoare. Proteinele Bcl-2, codificate de gene antiapoptotice, scad permeabilitatea membranelor mitocondriale. 14.3.2. Traducerea directă a semnalelor proapoptotice (mecanisme directe de iniţiere a apoptozei) 1. Apoptoza indusă de TNF (factori de necroză tumorală), citokine sintetizate şi secretate de macrofagele activate. Celulele umane au două tipuri de receptori care leagă specific TNF: TNFR1 şi TNFR2. Legarea TNF pe TNFR1 va declanşa activarea caspazelor prin domeniul citosolic R1 al receptorului denumit TRADD (,,TNF receptor associated death domain”). Interacţiunea TNF-TNFR1 determină activarea unor factori de transcripţie implicaţi în supravieţuirea celulară şi răspunsul inflamator. Producţia de TNF anormale poate declanşa boli autoimune. 2. Apoptoză indusă de ligand Fas, care se leagă pe receptorul Fas, al cărui domeniu citosolic FADD (,, Fas associated death domain”) devine activ şi formează împreună cu caspaza-8 şi cu caspaza-10 un complex DISC (,,death-inducing signaling complex”). Activarea caspazelor proteolitice determină modificări caracteristice ale morfologiei celulare: micşorarea celulei care devine sferică consecutiv acţiunii caspazelor asupra citoscheletului, citoplasma devine densă, cu organite strâns împachetate, are loc condensarea cromatinei în pachete compacte lângă învelişul nuclear (proces denumit picnoză), apoi învelişul nuclear devine discontinuu, ADN se fragmentează (procesul denumit cariorexis) şi nucleul se desface în corpi de cromatină. Urmează înmugurirea membranei celulare, celula fiind ruptă în vezicule denumite corpi de apoptoză care sunt fagocitaţi, fără a produce răspuns inflamator. Procesul de fagocitare a corpilor de apoptoză se numeşte eferocitoză , declanşat de expunerea unor molecule cum este fosfatidilserina pe suprafaţa celulară. Fosfatidilserina ajunge din foiţa internă a bistratului lipidic în cea externă prin activitatea catalitică a scramblazei.
149
Figura 91. Căile apoptotice. Imagine prelucrată după www.hixonparvo.info/model.html
14.4. Căi apoptotice defective. Supraexprimarea unui inhibitor al apoptozei, proteina X-linkată (XIAP) care se leagă de caspaza-9 şi suprimă activitatea activatorului apoptozei citocrom c este una dintre căile prin care celula evită apoptoza. În consecinţă, celulele deteriorate continuă să se dividă (în acest mod apare proliferarea tumorală din cancerul pulmonar). Acumularea proteinei supresoare a tumorilor p53 în celule prin activarea transcripţiei genelor care codifică această proteină sub efectul α- şi β-interferonilor intensifică apoptoza celulelor tumorale. Proteina p53 previne proliferarea tumorală a celulelor prin oprirea ciclului celular în faza G1, pentru ca celula să aibă timp aibă timp să repare leziunile ADN şi induce apoptoza dacă mecanismele reparatorii ale ADN sunt deficitare şi leziunile se menţin. Dereglarea unor asemenea mecanisme favorizează apariţia tumorilor. Infecţiile virale pot declanşa apoptoza celulelor infectate dacă virusurile respective interferă în anumite căi de semnalizare prin interacţiune cu receptori celulari, sau interferă mecanismul de supresie a tumorilor prin proteina p53. Exprimarea proteinelor virale împreună cu proteinele MHC pe suprafaţa celulelor infectate determină recunoaşterea acestora de celulele sistemului imun (NK , limfocite T citotoxice) şi declanşarea apoptozei prin semnale sintetizate de aceste
150
celule. Unele gene virale codifică proteine omoloage unor inhibitori ai apoptozei: omologi ai Bcl-2 (virusul Epstein-Barr), omologi ai inhibitorilor activării caspazelor sau determină blocarea TNF şi Fas sau inhibarea p53 (virusul hepatitei B). Infecţia cu HIV (virusul imunodeficienţei umane) determină depleţia limfocitelor T helper CD4+. Un mecanism de depleţie constă în declanşarea apoptozei prin enzime sintetizate de HIV care dezactivează proteina antiapoptotică Bcl-2 sau prin interferenţa cu mecanismul proapoptotic mediat de Fas. Proteinele HIV determină scăderea expunerii glicoproteinelor CD4 pe suprafaţa lfT helper (markeri membranari ai lfT helper). Celulele CD4+ infectate pot primi semnale apoptotice de la limfocite T citotoxice.
151
15. Proliferarea şi diferenţierea celulară
15.1. Celulele-stem. Celulele-stem au capacitatea de a se reînnoi prin diviziune mitotică, au potenţialul de a regenera ţesuturi în timpul vieţii organismului şi de a se diferenţia într-o diversitate de celule specializate. Celulele-stem au două proprietăţi fundamentale: 1. Capacitatea de a tranzita numeroase cicluri de diviziune celulară cu menţinerea statutului de celulă nediferenţiată. 2. Potenţa, care este capacitatea de diferenţiere în tipuri de celule specializate (celule puripotente/totipotente, care dau naştere oricărui tip de celulă diferenţiată, matură). Se pot clasifica în: Celule-stem embrionare, care se diferenţiază în cursul dezvoltării embrionare în toate tipurile de celule specializate ale embrionului. Celule-stem din organismul adult care reprezintă sistemul reparator al organismului, cu menţinerea turn-over-ului normal al organelor regenerative: piele, intestine, sânge. Clasificarea celulelor-stem se poate face după criteriul potenţei: Totipotente- pot construi un organism complet viabil. Prin fuziunea ovulului cu spermatozoidul se formează zigotul, prin diviziuni succesive ale zigotului la 4-5 zile de la fecundare se formează blastocistul. Masa internă de celule ale blastocistului este formată din celule totipotente. Pluripotente- sunt descendenţi ai celulelor totipotente (celule derivate din cele trei straturi germinative: ectoderm, mezoderm, endoderm) din care se diferenţiază aproape toate tipurile de celule specializate. Multipotente- se pot diferenţia în celule specializate aparţinând unor grupuri înrudite de celule Oligopotente- se pot diferenţia în câteva tipuri de celule mature (celulele-stem limfoide sau mieloide) Unipotente- se pot diferenţia într-un singur tip de celule, au proprietăţi de autoreînnoire (celulele-stem musculare). Celulele-stem embrionare sunt pluripotente, formează cele trei straturi primare ale embrionului: ectoderm, mezoderm, endoderm, care la rândul lor se pot diferenţia în cele 200 de tipuri de celule specializate ale organismului adult. Deţin factori de transcripţie specifici: Oct-4, Nanog, Sox2 cu rol în supresia genelor care determină diferenţierea şi menţin pluripotenţa. Deţin antigeni specifici de suprafaţă de tipul glicolipidelor SSEA3/SSEA4 sau antigene keratansulfat Tra-1-60, Tra-1-81. Celulele-stem adulte sunt celule-stem întâlnite în organismele dezvoltate, adulte. Celula-stem adultă are capacitatea de a se divide şi de a crea celule identice cu ea dar şi capacitatea de a se divide şi de a crea celule mai diferenţiate, mai specializate decât ea. Celulele-stem adulte pluripotente sunt rare şi puţine ca număr (sângele cordonului ombilical).
152
Cele mai multe celule-stem adulte sunt multipotente, se diferenţiază în celule identice cu ţesutul de origine, de exemplu celulele-stem mezenchimale, adipoase, endoteliale, etc. Celulele-stem se caracterizează prin două tipuri de diviziune: diviziune simetrică din care rezulta două celule-stem identice cu celula-mamă şi diviziune asimetrică din care rezultă o celulă stem şi o celulă progenitor cu capacitate redusă de autoreînnoire datorită segregării diferite a unor receptori celulari şi a altor proteine cu funcţii importante. Celulele progenitor sunt cele care se diferenţiază în celule specializate. 15.2. Diferenţierea celulară. Este procesul prin care o celulă formează o altă celulă cu grad mai mare de specializare. Din zigotul format prin fecundarea ovulului cu spermatozoidul se formează datorită proceselor de diferenţiere organismul multicelular alcătuit din mai multe tipuri de celule şi ţesuturi specializate. Organismul adult este format din 1014 celule care conţin o copie proprie a genomului şi, cu excepţia hematiilor adulte, sunt celule cu număr diploid de cromozomi, somatice, diferenţiate, specializate pentru diferite funcţii. Organismul adult conţine şi celule germinale (gameţii) precum şi celulele-stem adulte. Celulele-stem ale organismului adult se divid şi formează celule-fiice diferenţiate în cursul reparării ţesuturilor şi procesului normal de turn-over celular. Diferenţierea constă în modificări ale formei şi dimensiunii celulelor, ale potenţialului de membrană, modificări metabolice şi ale semnalizarii celulare datorită modificării exprimării genelor, dar nu şi a secvenţei primare a ADN. Se produc modificări celulare fizice şi fiziologice, dar genomul rămâne acelaşi. În cursul embriogenezei au loc diviziuni celulare coordonate, specializări celulare, procese de migrare celulară şi apoptoze. Primele diviziuni ale zigotului denumite clivări se caracterizează prin lipsa creşterii celulare, citoplasma se reduce la jumătate în celulele-fiice, genomul devine activ şi controlează dezvoltarea embrionară ulterioară. Clivările au loc în interiorul zonei pellucida, o membrană fermă cu important conţinut glicoproteic, care a înconjurat de la început ovulul şi a fost penetrată de spermatozoid. La 1 oră de la fecundare, zigotul se divide în două celule identice, în a 8-a etapă de diviziuni celulare grupul de celule format devine compact prin interconectare datorită unor joncţiuni de tip permeabil (,,gap junctions”), în care conexinele delimitează porul ce permite schimbul de ioni şi molecule mici între celule. După compactare se formează stadiul embrionar denumit morula, al cărei strat extern de celule prezintă polaritate (un pol al unei celule diferă de celălalt pol). În a 5-a zi de dezvoltare embrionară, datorită exprimării diferenţiate a unor gene în celulele morulei, are loc cavitaţia (se formează o cavitate plină cu lichid denumită blastocel), apare un nou stadiu embrionar, blastocistul şi începe specializarea celulară. Dispare zona pellucida, ceea ce va permite creşterea embrionului. Se încheie astfel faza de preimplantare din dezvoltarea embrionară. Blastocistul este format dintr-un strat extern de celule denumit trofoblast, provenit din stratul extern de celule cu polaritate al morulei, şi o masă internă de celule (ICM), provenite din celulele apolare ale stratului intern al morulei. Sursa primară de energie în primele etape de diviziune ale embriogeneză denumite clivări sunt piruvatul, lactatul şi aminoacizii, în timp ce celulele blastocistului uman deţin transportorul membranar al glucozei denumit GLUT8 şi receptori membranari pentru factorul de creştere IGF-1 (,,insulin like growth factor”). Zigotul şi celulele apărute prin clivările din embriogeneza timpurie (faza de preimplantare) sunt celule-stem totipotente, celule care se pot diferenţia în toate tipurile de
153
celule. Pierderea unor celule în această etapă, care sunt prelevate din embrionul obţinut prin FIV, în scopul obţinerii unui diagnostic genetic preimplantare, poate fi compensată de celelalte celule-stem embrionare. Celulele masei interne a blastocistului au proprietate de pluripotenţă, din ele se vor forma toate ţesuturile embrionului şi ţesuturi extraembrionare. În ziua a 8-9 după fecundare, blastocitul este implantat în uter . Trofoblastul se diferenţiază în două straturi: unul intern denumit citotrofoblast şi celălalt extern denumit sinciţiotrofoblast, care va realiza implantarea blastocistului în endometru prin formarea unor proiecţii digitiforme denumite vili corionici şi a unor spaţii denumite lacune care conţin sânge matern. ICM se diferenţiază în hipoblast şi epiblast, din hipoblast prin diferenţiere se formează endodermul extraembrionar, care va da naştere la sacul vitelin, iar epiblastul formează ectodermul primitiv sau embrionar şi ectodermul amniotic. Procesele de diferenţiere menţionate determină formarea gastrulei (ziua a 14-a după fecundare). Între ziua a 14-a şi a 16-a a dezvoltării embrionare, apare şanţul primitiv. Ectodermul primitiv se diferenţiază în straturi germinale: în ectoderm embrionar şi datorită şanţului primitiv sunt delimitate endodermul embrionar şi mezodermul embrionar (şi mezodermul extraembrionar). Celulele endodermului se vor diferenţia în celulele epiteliale ale tubului digestiv, cu excepţia epiteliilor cavitătii bucale, faringelui şi părţii terminale a rectului , în celule epiteliale ale glandelor digestive, inclusiv cele ale ficatului şi pancreasului, în epiteliile urechii externe şi cavităţii timpanului, în celulele traheei, bronhiilor, alveolelor pulmonare, în celulele vezicii urinare şi parţial ale uretrei; prin diferenţiere din celulele-stem ale endodermului se formează celulele foliculilor tiroidieni şi celule ale timusului. Mezodermul formează prin diferenţiere celulară miocitele din musculatura scheletică, celulele scheletului, celulele dermului, celulele ţesuturilor conjunctive, ale sistemului urogenital, celulele miocardului, ale splinei şi elementele figurate ale sângelui. Ectodermul formează sistemul nervos central, cristalinul, analizorii, ganglionii şi nervii, celulele pigmentare, epiderma, foliculii piloşi şi glandele mamare. Celulele primordiale germinale se desprind din regiunea proximală a epiblastului şi migrează în mezodermul extraembrionic, evitând anumite evenimente care ar conduce aceste celule pe calea diferenţierii în celule somatice. Mecanismele de evitare a diferenţierii în celule somatice sunt mecanisme epigenetice. 15.3. Mecanismele diferenţierii celulare. Celulele specializate exprimă un subset al genelor care alcătuiesc genomul speciei, fiecărui tip celular fiindu-i caracteristic un anumit model (pattern) de reglare a expresiei genice. Diferenţierea implică trecerea de la un mod de reglare a expresiei genice la un alt mod. Rolul central în diferenţiere revine unor procese moleculare aparţinând unor căi de semnalizare, diferenţierea fiind declanşată de anumite molecule-semnal cum sunt factorii de creştere. Activarea în etapa finală a unui factor de transcripţie sau a unei proteine asociate citoscheletului declanşează diferenţierea. Diviziunea celulară asimetrică conduce la formarea unor celule-fiice cu soartă distinctă în ceea ce priveşte diferenţierea: celulele progenitor totipotente. Celulele-progenitor rezultă în urma citokinezei datorită distribuţiei neuniforme a unor molecule cu rol reglator provenite din celula-mamă pluripotentă. Celulele progenitor moştenesc un set diferit de proteine faţă de cel al celulei-stem din care provin, şi un patern diferit de diferenţiere. Exprimarea unor gene stimulează proliferarea celulelor ICM şi/sau epiblastului, menţine pluripotenţa şi caracterul de celule nediferenţiate ale acestora. Există mecanisme de
154
reglare genetică care, dimpotrivă, orientează celula spre o anumită cale de diferenţiere sau determină implantarea embrionului în uter. Decizia între a prolifera şi a se diferenţia este o decizie critică pe care o celulă trebuie să o ia de câteva ori în cursul dezvoltării şi un rol central au mecanismele epigenetice de reglare a diferenţierii. Epigenetica se referă la modificări ale expresiei genice care nu alterează secvenţa primară a ADN. Majoritatea schimbărilor epigenetice se produc pe parcursul vieţii, dar unele se transmit de la o generaţie la alta. Printre procesele specifice epigenetice se numără: paramutaţia, bookmarking-ul (memoria celulară, transmiterea patternului expresiei genice în timpul mitozei celulelor-fiice), amprentarea genomică, reprimarea expresiei genice, inactivarea cromozomului X, reglarea modificărilor histonice, metilarea ADN. Epigenetica studiază fenomenele biochimice care permit acidului dezoxiribonucleic să se exprime într-o manieră diferită, datorită activării sau reprimării anumitor gene, dar fără a provoca schimbări la nivelul secvenţei genice. Celulele unui organism multicelular sunt omogene din punct de vedere genetic, dar heterogene din punct de vedere structural şi funcţional, datorită exprimării diferite a genelor. Multe din aceste modificări în expresia genică apar în cursul dezvoltării, dar sunt ,,reţinute, memorate” în cursul mitozelor. 15.3.1. Metilarea ADN este o modificare post-replicare predominantă în citozinele secvenţelor de dinucleotide CpG (citozină→5’metilcitozină). Se produce iniţial un val de demetilări în timpul clivărilor, urmat de metilare genomică de novo după implantarea embrionului. Metilarea este un proces intens în gastrulă, dar descreşte pe măsură ce au loc diferenţieri, în celulele specializate. Metilarea ADN este un eveniment rar în dezvoltarea postgastrulaţie, dar des întâlnit în stabilirea de linii celulare in vitro sau în celulele tumorale. Dinucleotidele CpG reprezintă 1% din genomul uman, 80% fiind metilate. CpG nemetilate sunt grupate în ,,insule” de CpG care sunt situate în regiunile reglatorii 5’ ale genelor. În anumite procese cum este cancerul, insulele CpG din promotorii unor gene achiziţionează o hipermetilare neobişnuită, care determină inactivarea transcrierii genelor în celulele respective, dar şi în generaţiile descendente de celule (,,heritable transcriptional silencing”). De fapt, metilarea ADN poate influenţa expresia genică în două moduri: blocarea fizică a interacţiunii cu gena a proteinelor implicate în reglarea transcripţiei, fiind astfel blocată transcrierea genei sau, al doilea mecanism probabil mai important, constă în legarea la ADN metilat a unor proteine cunoscute sub denumirea de proteine de legare a domeniului metil-CpG, urmată de recrutarea unor proteine adţionale în acest locus, cum ar fi histon-deacetilazele sau alte proteine de remodelare a cromatinei care contribuie la formarea cromatinei compacte, inactivă transcripţional. Acest proces are un rol central în dezvoltare, în cursul diferenţierii celulare. Pe de altă parte, pierderea unei astfel de proteine de legare a domeniului metil-CpG denumită MeCP2 (,,Methyl-CpG-binding Protein 2”) este implicată în sindromul Rett, iar MBD2 (Methyl-CpG binding domain protein 2) mediază inactivarea transcripţională a genelor hipermetilate în celulele tumorale, cum sunt genele supresoare ale tumorilor. La om, procesul de metilare al ADN este catalizat de trei enzime, ADN metil transferazele 1, 3a şi 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b). DNMT3a şi DNMT3b sunt metiltransferazele care catalizează metilarea de novo, stabilind pattern-urile de metilare ale ADN în dezvoltarea embrionară timpurie. DNMT1 este metiltransferaza care copiază pattern-ul de metilare al ADN în catenele-fiice în cursul replicării ADN.
155
15.3.2. Modificările histonelor. Histonele sunt ţinta unor modificări posttranslaţionale variate, care includ acetilarea lizinelor, metilarea argininelor şi lizinelor, fosforilarea serinelor şi treoninelor sau ubiquitinarea şi sumoilarea lizinelor. Aceste modificări apar atât în regiunea amino-terminală a histonelor, care proemină pe suprafaţa nucleosomilor, dar şi în regiunea lor central- globulară. Modificarea chimică a histonelor afectează funcţia cromozomilor prin cel puţin două mecanisme. Primul mecanism ar consta în modificarea încărcării electrice a histonelor, cu modificarea conformaţiei moleculei şi a interacţiunii cu ADN. Al doilea mecanism propune aceste modificări chimice ale histonelor ca situsuri de legare a bromodomeniilor sau cromodomeniilor care sunt domenii din moleculele unor proteine care reglează transcripţia.
Figura 92. a) histon acetiltransferazele (HAT) generează pattern-uri de acetilare (Ac) recunoscute de alţi reglatori
ai transcripţiei, cum sunt bromodomeniile care conţin factorii TAFII250, PCAF şi GCN5 cu rol în ,,deschiderea”
cromatinei şi activarea genelor. b) histona H3 metilată, legată de proteinele HP1/Swi6 ale cromodomeniului
asociat heterocromatinei, stabileşte un domeniu de cromatină inactivă transcripţional. Imagine prelucrată după
Patrick A. Grant. ,,A tale of histone modifications”.
Acetilarea şi deacetilarea grupărilor ε-amino din resturile de lizină ale histonelor sunt implicate în activitatea de transcripţie: histonele acetilate sunt asociate cu cromatina activă transcripţional, iar histonele deacetilate, cu cromatina inactivă transcripţional. Acetilarea histonelor este asociată replicării ADN, asamblării nucleosomilor şi împachetării cromatinei, precum şi interacţiunilor proteinelor non-histonice cu nucleosomii. Histona H3 este înalt conservată în evoluţie, iar grupările amino ale lizinelor din poziţia 9, 14, 18 şi 23 din H3 şi ale lizinelor din poziţia 5, 8,12 şi 16 din histonele H4, sunt frecvent modificate. Neutralizarea sarcinilor electrice pozitive din partea amino-terminală a acestor histone prin acetilare, reduce afinitatea de legare a ADN
156
datorată grupărilor fosfat cu încărcare negativă, dar şi interacţiunile dintre histonele nucleosomilor adiacenţi sau dintre histone şi alte proteine reglatoare. Scăderea afinităţii de legare a ADN şi a interacţiunilor cu alte molecule ale cromatinei favorizează activarea transcripţiei, deoarece permite interacţiunea factorilor de transcripţie şi ARN polimerazei cu promotorii genelor. Proteine reglatoare ale transcripţiei ca Gcn5 şi PCAF au activitate de histonacetiltransferaze (HAT) şi sunt asociate cu alţi activatori transcripţionali în complexe multisubunitare care reglează specificitatea şi recrutarea Gcn5 la promotori ai genelor-ţintă. Intervin în asociere cu activitatea complexelor de remodelare ale cromatinei ATP-dependente SWI/SNF care permit factorilor de transcripţie accesul la structurile ţintă din cromatină. Au fost identificate peste douăzeci de molecule proteice cu activitate enzimatică care generează pattern-uri specifice de acetilare ale histonelor libere sau asociate nucleosomilor: superfamilia GNAT (Gcn5 N-acetytransferases), care include proteine implicate în iniţierea transcripţiei, elongării (Elp3), modificării histonelor sau inactivării telomerelor (Hat1). Familia p300/CBP HAT sunt proteine cu înaltă omologie de secvenţă cu GNAT cu funcţie de coactivatori transcripţionali. Familia MYST de HAT cuprinde membrii care îi dau numele: MOZ (oncogenă umană asociată leucemiei acute mieloide), Ybf2/Sas3, Sas2 şi Tip60. Alte acetiltransferaze sunt factori transcripţionali bazali, de exemplu TAFII250, component al complexului TFIID complex, sau cofactori ai receptorilor nucleari: ACTR şi SRC1. Au fost raportaţi HAT care modifică supresorul p53 al tumorilor şi factorii bazali de transcripţie TFIIE şi TFIIF. Histonele acetilate sunt recunoscute specific, bromodomeniul din factorii de transcripţie şi HAT ca TAFII250, PCAF şi Gcn5 este un domeniu proteic care permite recunoaşterea preferenţială a histonelor când sunt acetilate la resturi specifice de lizină. Acetilarea histonelor precede şi stabilizează recrutarea complexelor ATP-dependente de remodelare a cromatinei. Gcn5 stabilizează interacţiunea SWI/SNF cu un promotor, interacţiune mediată mai precis prin bromodomeniul Gcn5. Recrutarea Gcn5 şi acetilarea histonelor precede recrutarea complexului SWI/SNF în timpul interacţiunii cu promotorul interferon-β, transactivarea prin receptorii nucleari RAR/RXR implică acetilarea histonelor anterior acţiunii SWI/SNF. Deacetilarea histonelor este catalizată de histon deacetilaze, multe identificate ca fiind corepresori ai transcripţiei. Regiuni specializate ale cromatinei ca telomerii, centromerii şi alţi loci inactivi transcripţional sunt domenii hipoacetilate ale cromatinei. Inhibarea activităţii histondeacetilazelor şi inactivarea situsurilor de hipoacetilare în histonele H4 determină discontinuităţi în structura înalt condensată a cromatinei. Fosforilarea histonelor are un rol important în transcripţia genelor, repararea ADN şi condensarea cromatinei. Fosforilarea serinei din poziţia 10 a H3 este corelată cu activarea genelor în celulele mamiferelor. Fibroblaştii, în prezenţa EGF, declanşează o fosforilare rapidă a serinei din poziţia 10 şi inducţia genelor de răspuns rapid cum este c-Fos. Fosforilarea este catalizată de kinaza Rsk-2 şi celulele provenite de la pacienţi cu sindrom Coffin- Lowry deficitari în Rsk-2, nu prezintă fosforilări ale serinelor din poziţia 10 şi nici inducţia genelor c-Fos ca răspuns la EGF. Mecanismul incriminat ar fi adiţia grupărilor fosfat încărcate negativ la cozile histonice şi neutralizarea sarcinilor pozitive ale acestora, reducând afinitatea pentru ADN. Activitatea histonacetiltransferazelor creşte pe substrate fosforilate la serinele din poziţia 10, iar mutaţii care afectează serinele din poziţia 10 a histonelor scad activarea transcriţiei prin Gnc5. De exemplu, fosfoacetilarea histonelor H3 din structura genelor
157
c-Jun şi c-Fos favorizează activarea acestor gene. Acelaşi mecanism de fosforilare mediază alterarea structurii condensate a cromatinei, favorizând accesul proteinelor implicate în mecanismele reparatorii ale leziunilor ADN. Metilarea histonelor este implicată în activarea transcripţiei. Metilarea are loc preferenţial la lizinele din poziţiile 4, 9 şi 27 ale histonelor H3 şi la lizinele din poziţia 20 ale histonelor H4, lizinele pot fi mono-, di- sau trimetilate. Proteina umană SUV39h1 metilează selectiv lizina din poziţia 9 a histonei H3. Supraexprimarea SUV39H1 induce formarea de heterocromatină în locaţii normal eucromatinice, probabil metilarea favorizează legarea proteinelor specifice ale heterocromatinei. Proteina specifică heterocromatinei HP1 leagă cu mare afinitate H3 care au fost metilate la lizine din poziţia 9 de către SUV39H1 şi este inactivată transcripţia. Regiunile de tip cromodomeniu ale HP1 mediază aceste intracţiuni cu metillizinele. Metilarea lizinelor din poziţia 9 interferă cu fosforilarea serinei adiacente din poziţia 10 catalizată de Ip11/kinaza aurora şi este inhibată de acetilarea anterioară a lizinelor din poziţia 9. Cozile histonice nemodificate favorizează metilarea mediată de SUV39H1 şi răspândirea heterocromatinei.
15.3.3. Interferenţa ARN (RNAi). Este un proces de inactivare genică (,,gene silencing”) controlat de RISC (,,RNA-induced silencing complex”) şi iniţiat de molecule dublu-catenare de ARN care interacţionează cu componentul catalitic al RISC, endonucleaze denumite argonaut. ARN dublu catenar poate fi de origine exogenă, achiziţionat de celule prin infecţii cu ribovirusuri (ARN viral) sau prin infectarea în timpul manipulărilor în laborator, este importat în citoplasmă şi clivat în fragmente scurte. Clivarea ARN este catalizată de enzima Dicer, se formează fragmente scurte, alcătuite din 21-25 perechi de baze şi câteva baze excedentare neîmperecheate la ambele capete ale fragmentelor. Aceste specii moleculare mici de ARN de origine endogenă se numesc siARN (,,small interference ARN”). siARN sunt complementare unui singur ARN mesager ţintă, induc clivarea unui singur ARN mesager specific. ARN dublu catenar de origine endogenă este sintetizat ca pre-microARN, prin transcripţia genelor care îi codifică, genomul având gene care nu codifică proteine, ci diferite specii de ARN. După sinteză, pre-microARN este exportat din nucleu şi clivat în citoplasmă de enzima Dicer. miARN au complementaritate parţială cu ARN mesager ţintă, recunoaşte şi leagă mai multe tipuri de ARN mesager cu secvenţă similară şi inhibă translaţia. miARN are deci efect represor al translaţiei, probabil prin inhibarea interacţiunii factorilor de iniţiere a translaţiei cu coada poliA a ARN mesager. miARN intervine în acest mod în dezvoltare, în morfogeneză şi în menţinerea statutului de celule nediferenţiate sau incomplet diferenţiate al celulelor-stem. miARN sunt implicaţi în formarea tumorilor prin intervenţie în mecanismele de reglare ale ciclului celular, dar intervin şi în mecanismele de supresie tumorală. RNAi poate declanşa activarea unor gene, siARN şi miARN care sunt complementare promotorilor unor gene pot intensifica transcripţia acelor gene.
15.4. Căi particulare de reglare a diferenţierii celulare.
Proteina Shp2, codificată de gena PTPN11, este o proteintirozinfosfatază cu rol în reglarea creşterii şi diferenţierii celulare. Intervine în transformarea oncogenă. Are rol reglator în semnalizarea celulară prin reglarea fină a puterii semnalului din diferite căi de semnalizare, ceea ce are ca finalitate reglarea transcripţiei unor gene implicate în diferenţiere şi în migrarea
158
celulară. Scăderea exprimării Shp2 prin RNAi previne diferenţierea celulară.
Oct4 (octamer4) codificată de gena POU5F1, este un factor de transcripţie activ iniţial ca factor maternal în oocit şi rămâne activ în embrion în faza de preimplantare. Exprimarea Oct4 reprezintă un marker al fenotipului nediferenţiat şi al tumorilor. Are rol în menţinerea statutului de celulă nediferenţiată, cu capacitate de autoreînnoire al celulelor-stem, reglează pluripotenţa. Scăderea exprimării Oct4 în celulele ICM determină diferenţierea acestora în celule ale straturilor germinale. În timp ce Oct4 persistă în celulele ICM, nu se regăseşte în celulele trofoblastului care se diferenţiază în citotrofoblast şi sinciţiotrofoblast sau în celulele diferenţiate de diferite tipuri care apar după gastrulaţie; se exprimă în celulele-stem germinale. Formează heterodimeri cu proteina Sox2 sau cu E1A (care rol de co-activatori), exercită rol reglator al transcripţiei unor gene prin legarea la ADN. Oct4 acţionează asupra unor gene-ţintă cum este gena FGF-4 (,,fibroblast growth factor-4”).
Proteinele trithorax şi grupul de proteine polycomb au un rol important în reglarea epigenetică a dezvoltării şi diferenţierii celulare, prin modificări chimice ale cromatinei. Complexul represor polycomb 2 (PRC2) mediază represia transcripţiei prin di-şi trimetilarea lizinei din poziţia 27 a lizinei din histonele H3.
UTX şi JMJD3 sunt histondemetilaze H3K27 implicate în reglarea transcripţiei genelor HOX şi în dezvoltare. Prin activitatea lor demetilează H3, dislocă complexul represor PRC2, ceea ce conduce la activarea transcripţiei genelor HOX şi la diferenţiere celulară.
Jmjd1a şi jmjd2c codifică demetilaze H3K9, sunt reglate de Oct4. Scăderea exprimării jmjd1a şi a jmjd2c determină diferenţiere celulară acompaniată de reducerea exprimării genelor specifice celulelor-stem embrionare şi inducerea exprimării genelor specifice liniei de celule specializate.
JMJD2A demetilează H3K9Me2 din regiunea promotor a genelor asociate pluripotenţei (Tcl1, Tcfcp2l1, Zpf5) şi activează exprimarea acestor gene.
JMJD2C este reglator pozitiv al Nanog, factor de transcripţie implicat în proliferarea celulelor-stem (activează exprimarea genelor pluripotenţei). Semnale extracelulare ca Nanog, LIF (factorul inhibitor al leucemiei), BMP (,,bone morphogenetic protein”) determină susţinerea caracterului de celulă-stem pluripotentă capabilă de autoreînnoire prin reglarea exprimării genelor pluripotenţei. Semnale intrinseci ca FoxD3, p53, Oct4 reglează exprimarea Nanog şi menţinerea pluripotenţei. Oct4 şi Sox2 se leagă de promotorul genei Nanog în celulele-stem embrionare.
Nanog represează GATA-6 prin legare de promotorul genei. Exprimarea genelor GATA-6 determină diferenţierea celulelor ICM în celule ale endodermului visceral, în timp ce GATA-4 este exprimată în celule ale endodermului visceral şi parietal.
Proteinele Ronin pot compensa pierderea activităţii Oct4 printr-un mecanism de acţiune diferit, dar paralel. Ronin este un represor care previne transcrierea genelor implicate în diferenţierea celulară prin modificări chimice ale histonelor. Caspaza-3 clivează şi reduce nivelul intracelular de Ronin şi Nanog.
BMP interacţionează cu receptori specifici de suprafaţă celulară, traducerea
159
semnalului având ca efect mobilizarea proteinelor din familia SMAD cu rol în dezvoltarea cordului, SNC, cartilajului, oaselor şi patternului embrionar. BMP4 şi inhibitorii săi reglează polaritatea embrionului. BMP4 reglează diferenţierea celulelor mezenchimale derivate din mezoderm, activează gene în celulele epiblastului, ca urmare acestea migrează şi formează şanţul primitiv. SMAD activate de BMP induc exprimarea proteinelor Id care acţionează ca inhibitori ai diferenţierii. Id au rol important în angiogeneză, neurogeneză şi osteogeneză, reglând răspunsul celular la BMP şi TGF-β.
Wnt sunt molecule-semnal care după legarea de receptorul lor specific determină activarea căii de semnalizare care duce la creşterea nivelului intracelular de β-catenină, prin inhibarea complexului axină-GSK-3-APC care degradează proteolitic β-catenina. β-catenina care se acumulează intracelular pătrunde în nucleu, interacţionează cu anumiţi factori de transcripţie (TCF/LEF) care activează exprimarea specifică a unor gene implicate în diferenţiere. De exemplu, după interacţiunea cu TCF3, acest factor de transcripţie scade exprimarea Nanog care menţine pluripotenţa celulelor-stem. Wnt sunt factori de creştere ai celulelor-stem, promovează proliferarea şi diferenţierea acestora în celule progenitor multipotente din mezoderm şi endoderm, stimulează gastrulaţia, formarea şanţului primitiv, stimulează diferenţierea celulelor mezodermale cu potenţial hematopoietic (Wnt1şi3), proliferarea celulelor-stem neuronale (Wnt1) în regenerarea celulelor sistemului nervos.
FGF (,,fibroblast growth factor”) sunt agenţi mitogeni, au efecte reglatoare şi morfologice, au rol esenţial în dezvoltarea embrionară prin proliferarea celulelor endoteliale şi organizarea lor fizică în structuri tubulare; promovează angiogeneza, repararea ţesuturilor şi mucoaselor lezate (formarea ţesuturilor de granulaţie) prin proliferarea, diferenţierea şi migrarea celulelor epiteliale. În dezvoltarea embrionară stimulează deci proliferarea şi diferenţierea celulară, au rol regulator în migrarea celuleor şi apoptoză. În organismele adulte au rol esenţial în repararea tisulară. Receptorii acestor factori de creştere fac parte din clasa receptorilor tirozinkinazici.
Calea LIF-STAT3: STAT3 reglează direct exprimarea factorilor de transcripţie Myc. Activarea receptorului citokinei LIF (LIF-R), este urmată de recrutarea STAT3 la complexul receptor, unde este activat de Jak (Janus kinaze), se produce dimerizarea STAT3, translocarea în nucleu şi activarea genelor-ţintă prin exprimarea cărora este menţinută pluripotenţa şi capacitatea de autoreînnoire a celulelor-stem murine. LIF şi Wnt promovează pluripotenţa prin activarea unor căi separate de semnalizare celulară, care însă converg, având un efector comun, factorul de transcripţie Myc. La om însă, celulele-stem embrionare se diferenţiază în prezenţa familiei de citokine Il-6 (din care face parte şi LIF) şi se pierd markerii pluripotenţei: Nanog, Oct4, TRA-1-60, deci nu poate fi prevenită diferenţierea. Celulele-stem mezenchimale adulte au un potenţial de diferenţiere în mai multe linii celulare. Expresia Il-6 este crescută în celulele-stem mezenchimale comparativ cu nivelul de exprimare din derivaţii lor condrogeni, osteogeni, adipogeni. Celulele măduvei spinării secretă mari cantităţi de Il-6 care scad dramatic în cursul diferenţierii osteogene. Il-6 este necesară pentru proliferarea celulelor MS, protecţia faţă de apoptoză, inhibă diferenţierea adipogenă şi condrogenă.
Calea Il-6→ ERK1/2 menţine pluripotenţa şi inhibă diferenţierea celulară. Il-6 activează STAT3 şi ERK1/2 (MAPK) în celulele-stem cardiace. Stimularea prin LIF determină inducţia genelor specifice celulelor endoteliale (VE-caderine, CD31, Flk-1, GATA-4, GATA-6). Il-6 induce diferenţierea celulelor-stem neurale în neuroni glutamat responsivi şi celule astrogliale. Activarea căii MAPK/CREB (,,mitogen activated protein kinase/cAMP response element
160
binding protein”) prin Il-6 stimulează neurogeneza, iar activarea STAT3 promovează gliogeneza.
ERK5 (kinaza 5 reglată de semnale extracelulare), care este membru al proteinkinazelor activate de mitogeni, la fel ca ERK1/2 exercită roluri importante în diferenţierea şi proliferarea celulară şi în migrarea celulară în cursul dezvoltării sistemului cardiovascular şi diferenţierii neurale. ERK activate fosforilează factori de transcripţie ca c-Myc sau Elk1 şi proteinkinaze, ceea ce are ca efect inducţia unor gene-ţintă ca c-Fos care contribuie la proliferarea celulară.
Proteinele REST (,,RE1-silencing transcription factor”) blochează exprimarea miRNA prin inactivarea genelor corespunzătoare ( REST controlează transcripţia a 11 tipuri de miRNA). Nivelul intracelular crescut de REST din celulele-stem conduce la inactivarea genelor miRNA-21, scăderea exprimării miRNA-21 care inactivează ARNm corespunzător markerilor pluripotenţei: Oct4, Nanog, Sox2, c-Myc etc. ceea ce determină menţinerea statutului de celule pluripotente, nediferenţiate. Scăderea nivelului REST favorizează exprimarea miRNA care degradează ARNm al markerilor de nediferenţiere, reduce capacitatea de proliferare, favorizând diferenţierea.
Inducţia genelor FGF/MAPK şi a genelor PI3K favorizează diferenţierea celulelor hepatice şi ale intestinului din masa de celule multipotente ale endodermului.
Factori de transcripţie care reglează exprimarea genelor implicate în diferenţiere, dezvoltare embrionară şi semnalizare sunt membrii Forkheadbox (FOX). Unul dintre membrii acestei familii de factori de transcripţie, FOXA1 leagă stabil nucleosomi şi distruge structura înalt organizată a cromatinei şi împreună cu alte proteine reglatoare intermediare între H1 linker şi factorii de transcripţie tradiţionali, creează o regiune expusă a cromatinei care permite legarea altor factori de transcripţie.
Proteinele ,,Groucho-related” Gro/Tlc/Grg sunt corepresori care reglează segmentarea embrionului, pattern-ul dorsoventral, neurogeneza şi căile de semnalizare Notch şi Wnt. Groucho se leagă de situsurile reglatoare ale genelor-ţintă şi determină dizlocarea complexelor activatoare ale transcripţiei acestor gene şi recrutarea proteinelor represoare de tip histon-deacetilaze. Celulele nediferenţiate ale endodermului exprimă Grg1 şi Grg 3. În timpul diferenţierii în celule specializate ale ficatului şi pancreasului, nivelul intracelular de Grg scade, ceea ce permite activarea exprimării setului de gene ale celulei specializate. FOXA1 recrutează Grg la nivelul situsurilor de reglare ale genelor, prevenind exprimarea lor nepotrivită, dar scăderea Grg permite activarea rapidă a transcrierii genelor şi specializarea celulară.
15.5. Proliferarea tumorală. Cancerele sunt o clasă de boli în care anumite celule prezintă creştere necontrolată şi diviziuni peste limita normală ( se depăşeşte limita Hayflick), urmate de invazie şi distrugerea ţesuturilor adiacente şi câteodată şi metastaze (răspândire în organism prin sânge şi limfă). Sunt determinate de anomalii ale materialului genetic induse de carcinogeni sau de erori apărute în cursul replicării ADN asociate cu mecanisme deficitare de reparare ale acestor leziuni. Apariţia cancerului implică de multe ori cauze ereditare. Anomaliile genetice afectează două clase de gene: 1. oncogenele care odată activate, conferă noi proprietăţi celulelor (creştere hiperactivă şi diviziuni peste limita normală, protecţie faţă de apoptoză, capacitatea de a se stabili în diverse medii tisulare). 2. inactivarea genelor supresoare ale tumorilor.
161
Celulele tumorale se caracterizează prin pierderea acurateţei mecanismelor de replicare a ADN, pierderea controlului ciclului celular, a orientării şi adeziunii în ţesuturi şi modificarea interacţiunii cu celulele sistemului imun. Erorile (mutaţiile) care se produc se fixează în descendenţă, la celulele-fiice, în lipsa eficienţei unor mecanisme reparatorii ale ADN sau datorită dereglării mecanismelor senescenţei şi apoptozei. Prezenţa carcinogenilor, a radiaţiilor şi hipoxia determină acumularea erorilor şi transformarea malignă. Mutaţiile pot afecta chiar mecanismele de corecţie, reparatorii ale ADN şi consecinţa este o acumulare a erorilor. Se poate produce o mutaţie care să afecteze o cale de traducere a semnalului. Mutaţiile pot determina mobilizarea, migrarea celulelor din ţesutul de origine şi invazia ţesuturilor sănătoase. Unele mutaţii afectează telomerii. Cancerele reprezintă un lanţ de efecte cauzate de câteva erori care conduc la erori mai severe. Apariţia tumorilor maligne este explicată prin erori care conduc la mai multe erori. O altă caracteristică este evoluţia clonală. Dacă 10.000 000 000 de celule ale tumorii sunt distruse prin terapie, este suficient să rămână 10 celule tumorale care se autoreplică sau trimit semnale determinante de erori spre alte celule, şi procesul reîncepe. Debutul tumorii urmat de progresie spre stadii tot mai invazive se numeşte evoluţie clonală. Mutaţiile ADN sunt produse de agenţi mutageni, iar mutaţiile care determină apariţia cancerelor sunt produse de agenţi mutageni care se numesc carcinogeni: fumatul, de exemplu,,oferă 50 de carcinogeni, printre care nitrozaminele şi hidrocarburile aromatice policiclice. Sunt carcinogeni care nu sunt mutageni: alcoolul stimulează rata diviziunilor celulare, astfel încât mecanismele reparatorii ale ADN au mai puţin timp să repare erorile produse în timpul replicării ADN. Infecţiile virale sunt cauza a aproximativ 15% din cancerele umane (infecţii cu Papilomavirus, virusul hepatitei B, virusul hepatitei C, virusul Epstein-Barr, virusul limfotrofic uman-HTLV). Virusurile pot determina transformări acute datorită unei oncogene virale supraactive care se exprimă în celula-gazdă şi determină transformarea imediată a acesteia în celulă tumorală. Virusurile pot determina transformări lente, atunci când genomul viral este inserat lângă o proto-oncogenă a genomului celulei-gazdă şi promotorul viral sau un alt factor de reglare a transcripţiei din genomul viral declanşează supraexprimarea proto-oncogenei, urmată de transformarea malignă a celulei-gazdă. Hormonii sunt carcinogeni non-mutageni, stimulează creşterea celulară excesivă: în statut hiperestrogen datorită stimulării se poate ajunge la cancer de endometru. Disfuncţiile sistemului imun din infecţiile cu HIV pot conduce la apariţia sarcomului Kaposi, limfomului non-Hodgkin, iar deficitele imune comune variabile sau deficitul de IgA cresc riscul apariţiei cancerelor. Deficitul imun din infecţia cu HPV (Papilomavirus) favorizează apariţia cancerului anal sau de cervix. Ereditatea poate furniza defecte ale unor gene implicate în mecanisme de protecţie faţă de cancere. Defecte moştenite ale genelor BRCA1/BRCA2→cancer mamar/ovarian, ale genelor MEN (tip1, 2a, 2b)→neoplazii endocrine; ale genei p53→osteosarcom, cancer de sân, sarcom al ţesuturilor moi, tumori cerebrale, ale genei APC→polipoză adenomatoasă familială şi carcinom de colon, defecte moştenite care favorizează apariţia HNPCC (,,hereditary nonpolyposis colorectal cancer”), cancerului uterin, cancerului gastric, cancerului ovarian. Aberaţiile numerice cromozomiale cum este trisomia 21 (sindromul Down) favorizează apariţia leucemiilor şi cancerului testicular la indivizii afectaţi. Cancerele nu sunt boli transmisibile, o formă de transmitere este doar cea prin placentă, de la mamă la făt în cazul leucemiei acute, limfoamelor, melanomului şi carcinoamelor. Mecanismele fiziopatologice au la bază alterarea genelor implicate în creştere şi diferenţiere. Este incriminată o paletă largă de defecte genetice de la aberaţii numerice cromozomiale până la mutaţii care afectează o singură nucleotidă. Oncogenele pot fi gene normale care sunt supraexprimate foarte intens sau gene care au suferit mutaţii şi care exprimă în celulă noi prorietăţi (proprietăţile fenotipice ale celulei
162
tumorale). Genele supresoare ale tumorilor inhibă diviziunea celulară şi favorizează supravieţuirea, iar defectele acestor gene favorizează proliferarea tumorală. Mutaţiile la scară mare care determină transformare malignă sunt: •amplificarea genomică- mai multe copii ale unui locus cromozomial care conţine oncogene •translocarea- două locususuri cromozomiale separate devin anormal fuzionate ( între cromozom din perechea 9 şi din perechea 22, urmată de exprimarea unei proteine de fuziune denumită proteina BCR-abl care este o tirozinkinază oncogenă) Proliferarea tumorală poate fi declanşată de mutaţiile la scară mică: •în promotorul unei gene, afectând exprimarea genei •în secvenţa codificatoare, consecinţa este sinteza unei proteine cu funcţie sau stabilitate alterată
•integrarea materialului genetic viral care influenţează exprimarea oncogenelor celulei- gazdă.
163
Listă de abrevieri
AA- aminoacizi
ADN- acid dezoxiribonucleic
AG- acizi graşi
Ala- alanină
ARN- acid ribonucleic
ARNm- acid ribonucleic mesager
ARNr- acid ribonucleic ribosomal
ARNt- acid ribonucleic de transfer
Arg- arginină
Asn- asparagină
ATP- adenozintrifosfat
ADP- adenozindifosfat
AMP- adenozinmonofosfat
cAMP- adenozinmonofosfat ciclic
cGMP- guanozinmonofosfat ciclic
CDK- kinaze dependente de cicline
CDP- citozindifosfat
CD- cluster of differerentiation
CoA- coenzima A
CTP- citozintrifosfat
DAG- diacilglicerol
ELL- elongation factor RNA polymerase II
EMC- matricea extracelulară
FADH2- flavinadenindinucleotid redus
FAD- flavinadenindinucleotid oxidat
FMN(H2)-flavinmononucleotid oxidat(redus)
FSH- hormon foliculostimulant
GAG- glicozaminoglicani
Gly- glicină
GTP- guanozintrifosfat
HA- acid hialuronic
ICAM- intercellular adhesion molecule
Il- interleukină
LDL- low density lipoprotein
LH- hormon luteinizant
NAD(P)H- nicotinadenindinucleotid(fosfat) redus
PIP2- fosfoinozitolfosfat
Pro- prolină
PSGL-1-
RHAMM-
RER- reticul endoplasmic rugos
RS- reticul sarcoplasmic
Ser- serină
TEM- microscopie electronică cu transmisie
TSH- hormon tireostimulant
Tn- troponine
TNF-α- factor de necroză tumorală alfa
TF- factori de transcripţie
UDP- uridindifosfat
UTP- uridintrifosfat
164
Lista aminoacizilor cu abrevierile lor
Aminoacizii nepolari (hidrofobi)
aminoacid Cod din trei litere
Cod din o literă
glicina Gly G
alanina Ala A
valina Val V
leucina Leu L
izoleucina Ile I
metionina* Met M
fenilalanina Phe F
triptofan Trp W
prolina Pro P
Aminoacizi polari (hidrofili)
serina* Ser S
treonina* Thr T
cisteina* Cys C
tirozina* Tyr Y
asparagina Asn N
glutamina Gln Q
* aminoacizi care conţin sulf *aminoacizi care pot fi fosforilaţi
165
Aminoacizi încărcaţi negativ:
acid aspartic Asp D
acid glutamic Glu E
Aminoacizi încărcaţi pozitiv:
lizina Lys K
arginina Arg R
histidina His H
166
Bibliografie selectivă
1. Agger K., Cloos P.A.C., Christensen J., Pasini D., Rose s., Rappsilber J., Issaeva I., Canaani E., Salcini A.E., Helin K. ,,UTX and JMJD3 are histone H3K27 demethylases involved in HOX gene regulation and development”, Nature 449(2007): p.731-734
2. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. ,,Molecular Biology of the Cell”, fifth edition, Garland Publishing Inc., 2007
3. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. ,,Essential Cell Biology”, third edition, Garland Publishing Inc., 2009
4. Anderson G.J., Darshan D. ,, Small-molecule dissection of BMP signaling”, Nature Chemical Biology 4(2008): p.108-115
5. Avruch J., Khokhlatchev A., Kyriakis J.M.,,Ras activation of the Raf kinase: tyrosine kinase recruitment of the MAP kinase cascade”. Recent Progress in Hormone Research 56: p.127–155
6. Becker W.M., Kleinsmith L.J., Hardin J., Bertoni G.P. ,,World of the Cell”, seventh edition, Benjamin Cummings/Prentice Hall, 2008
7. Benga Gh. ,,Introducere în Biologie Celulară şi Moleculară”, Ed. Medicalã Universitară, Cluj-Napoca, 2005
8. Berger J., Moller D.E. ,,The mechanisms of action of PPARs” Annual Review of Medicine 53(2002): p.409–435
9. Böttcher R.T., Niehrs C. (2005),, Fibroblast Growth Factor Signaling during Early Vertebrate Development”, Endocrine Reviews 26 (1): p.63-77
11. Brouwers N., Sleegers K., Van Broeckhoven C. (2008). ,,Molecular genetics of Alzheimer's disease: an update” Annals of Medicine 40 (8): p.562–583
12. Brownlee, M. ,,Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications”, Nature 414(2001): p.813-820
13. Cartwright P., McLean C., Sheppard A., Rivett D., Jones K., Dalton S.(2005) ,,LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism”, Development 132(5): p.885-96
14. Citron M., Westaway D., Xia W., Carlson G., Diehl T., Levesque G., Johnson-Wood K., Lee M., Seubert P., Davis A., Kholodenko D., Motter R., Sherrington R., Perry B., Yao H., Strome R., Lieberburg I., Rommens J., Kim S., Schenk D., Fraser P., St George Hyslop P., Selkoe D.J. (1997) ,,Mutant presenilins of Alzheimer's disease increase production of 42-residue amyloid beta-protein in both transfected cells and transgenic mice”. Nature Medicine 3 (1): p.67–72
15. Cooper G.M., Hausman R.E. ,,The Cell: A Molecular Approach”, fifth edition, ASM Press& Sinauer Associates, 2009.
16. Dance M., Montagner A., Salles J.P., Yart A., Raynal P. ,, Ras/Mitogen-activated protein kinase (ERK1/2) pathway” Cellular Signaling 2008 20(3):P.453-459
17. Erdmann R., Schliebs W., ,,Peroxisomal matrix protein import: the transient pore model” , Nat. Rev., Mol. Cell Biol. 6 (2005), p.738–742.
18. Garrett R. H., Grisham C. M. ,, Biochemistry ”, Thomson Brooks/Cole, Cengage Learning, 2008
20. Grant P.A. ,, A tale of histone modifications” Genome Biology 2001, 2(4):reviews0003.1–0003.6 (http://genomebiology.com/2001/2/4/reviews/0003)
21. Griffiths A.J.F., Wessler S.E., Lewontin R.C., Gelbart W.M., Suzuki D.T., Miller J.H. ,, An Introduction to Genetic Analysis ” , eighth edition, W.H.Freeman, 2005
22. Helmreich E.J.M. ,,The Biochemistry of Cell Signaling”, Oxford University Press,2001
23. Jacob, F., Perrin, D., Sanchez C., Monod J. ,,Operon: a group of genes with the expression coordinated by an operator”, C. R. Hebd. Seances Acad. Sci., Vol. 250(1960)p.1727–1729
24. Jennings B.H., Ish-Horowicz D. ,,The Groucho/TLE/Grg family of transcriptional co-repressors” Genome Biology 2008, 9: p.205
25. Kisseleva B., Bhattacharya S., Braunstein J., Schindler C.W. ,,Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges” Gene 285 (1-2): p.1–24
26. Leonard W.J. ,, Role of Jak kinases and STATs in cytokine signal transduction” International Journal of Hematology” 2001, 73(3): p.271-277
27. Lewin B. ,,Genes VIII”, Prentice Hall, 2004 28. Lodish H., Berk A., Kaiser C. A., Krieger M., Scott M.P., Bretscher A., Ploegh H.
protein that regulates β-adrenergic receptor function” Science 248(1990): p.1547–1550 30. Luo W., Johnson A.W., Bentley D.L. ,,The role of Rat1 in coupling mRNA 3’-end
processing to transcription termination: implications for a unified allosteric-torpedo model”, Genes&Development 20(2006)p.954-965
31. Makarov E.M., Makarova O.V., Urlaub H., Gentzel M., Will C.L., Wilm M., Lührmann R. ,,Small nuclear ribonucleoprotein remodeling during catalytic activation of the spliceosome”. Science 298 (2002):p.2205–2208.
33. McCubrey J.A., Steelman L.S., Chappell W.H., Abrams S.L., Wong E.W., Chang F., Lehmann B., Terrian D.M., Milella M., Tafuri A., Stivala F., Libra M., Basecke J., Evangelisti C., Martelli A.M., Franklin R.A. ,, Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance”, Biochimica et biophysica acta (2007), 1773(8): p.1263-1284
34. Lehmann O.J., Sowden J.C., Carlsson P., Jordan T., Bhattacharya S.S. (2003) ,,Fox's in development and disease” Trends in Genetics 19 (6): p.339–344.
35. Liu X, Rubin JS, Kimmel AR (2005). "Rapid, Wnt-induced changes in GSK3beta associations that regulate beta-catenin stabilization are mediated by Gα proteins". Current Biology 15 (22): p.1989–1997
36. Loh Y.H., Zhang W., Chen X. ,, Jmjd1a and Jmjd2c histoneH3Lys9 demethylases regulate self-renewal in embryonic stem cells”, Genes&Development 21(2007): p.2545-2557
37. Metzler D.E., Metzler C. ,,Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells”, second edition, Harcourt/Academic Press, 2001
38. Mixich F., Ardelean T. ,,Principii fundamentale de biologie moleculară”, Ed. Medicala Universitara, 2002;
39. Moldoveanu E., Popescu L.M. ,,Apoptoza- Mecanisme Moleculare”, ediţia a II-a, Editura Universitară ,,Carol Davila”, Bucureşti, 1999
168
40. Moore M.J., Query C.C., Sharp P.A. ,,Splicing of precursors to messenger RNAs by the spliceosome”, The RNA World. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993:p.303–357.
41. Moore M.J., Query C.C., Sharp P.A. ,,Splicing of precursors to messenger RNAs by the spliceosome”, The RNA World. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993:p.303–357.
42. Morgan D.O. ,,The Cell Cycle: Principles of Control”, New Science Press, 2007 43. Morris K.V. ,,Epigenetic Regulation of Gene Expression”- ,, RNA and the Regulation
of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity”, Caister Academic Press ,2008 44. Moustakas A. ,,Smad signalling network”, Journal of Cell Science 115: p.3355–3356 45. Murray R.K., Bender D.A., Botham K.M., Kennelly P.J., Rodwell V.W., Weil P.A.
,,Harper’s Illustrated Biochemistry”, 28th edition, The McGraw-Hill Companies, 2009 46. Nelson D.L., Cox M.M. ,, Lehninger Principles of Biochemistry”, third edition,
W.H.Freeman, 2000 47. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. (2000),,Quantitative expression of Oct-3/4 defines
differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells”, Nature Genetics 24 (4): p.372–376
48. Petrescu I. ,,Biochimie” vol.1 ,,Constituienţii chimici ai celulei”, Presa Universitară Clujeană, 1998
49. Petrescu I. ,,Biochimie” vol.2 ,,Reacţii chimice în celula vie”, Presa Universitară Clujeană, 1998
50. Platta H., Erdmann R. ,,The peroxisomal protein import machinery” FEBS Letters 581:p.2811-2819
51. Rodda D.J., Chew J.L., Lim L.H. (2005). ,,Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2” The Journal of Biological Chemistry 280 (26): p.24731–24737
52. Robertson K.D., Uzyolgi E., Lian G. et al. (1999). ,,The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a, 3b: Coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors”, Oxford Journals: Nucleic Acids Research 27 (11): p.2291–2298
53. Rodriguez C., Noe V., Cabrero A., Ciudad C.J., Laguna J.C. ,,Differences in the Formation of PPARa-RXR/acoPPREComplexes between Responsive and Nonresponsive Species upon Fibrate Administration”, Molecular Pharmacology 58(2000): p.185-193
54. Ross M.H., Kaye G.I., Pawlina W. ,,Histology: A Text and Atlas”, fourth edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2002
57. Schuettengruber B., Chourrout D., Vervoort M., Leblanc B., Caval G. ,,Genome Regulation by Polycomb and Trithorax Proteins”, Cell 128(4)2007: p.735-745
58. Tarba C. ,,Biomembrane, transport şi energetică celulară”, Editura Academiei Române, 1996
59. Tsuchiya S., Okuno Y., Tsujimoto G. ,,MicroRNA: Biogenetic and Functional Mechanisms and Involvements” Journal of Pharmacological Sciences 101(2006), p. 267 – 270 (2006)
60. Zhang S.Q., Yang W., Kontaridis M.I., Bivona T.G., Wen G., Araki T., Luo J., Thompson J.A., Schraven B.L., Philips M.R., Neel B.G. ,, Shp2 regulates SRC family kinase activity and Ras/Erk activation by controlling Csk recruitment”, Mollecular Cell. 2004 13(3): p.341-355
169
61. Zwaka T.P. ,,Ronin and Caspases in Embryonic Stem Cells: A New Perspective on Regulation of the Pluripotent State” Cold Spring Harbour Symposia on Quantitative Biology 2008; 73: p.163-169;
63. Wu J., XieX.(2006) ,,Comparative sequence analysis reveals an intricate network among REST, CREB and miRNA in mediating neuronal gene expression”, Genome Biology 7(9): R.85
64. Ying Q-L., Nichols J., Chambers J., Smith A. ,, BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3”, Cell 115 (3)2003: p.281-292
