+ All Categories
Home > Documents > Oleg Chiselita Thesis

Oleg Chiselita Thesis

Date post: 28-Jun-2015
Category:
Upload: bogdanionut
View: 362 times
Download: 3 times
Share this document with a friend
141
ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE ŞI BIOTEHNOLOGIE Cu titlu de manuscris C.Z.U.: 579.22+547.917+664.872 CHISELIŢA OLEG CARACTERELE FIZIOLOGO-BIOCHIMICE ALE UNOR DROJDII VINICOLE ŞI PROCEDEE DE OBŢINERE A BIOPRODUSELOR VALOROASE SPECIALITATEA 03.00.07 – MICROBIOLOGIE Teză de doctor în biologie Conducător ştiinţific: Consultant ştiinţific: Autorul Agafia USATÎI doctor habilitat în biologie, profesor cercetător Valeriu RUDIC doctor habilitat în biologie, profesor universitar, academician, Om emerit al Republicii Moldova Oleg Chiseliţa CHIŞINĂU, 2010
Transcript
Page 1: Oleg Chiselita Thesis

ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI INSTITUTUL DE MICROBIOLOGIE ŞI BIOTEHNOLOGIE

Cu titlu de manuscris C.Z.U.: 579.22+547.917+664.872

CHISELIŢA OLEG

CARACTERELE FIZIOLOGO-BIOCHIMICE ALE UNOR

DROJDII VINICOLE ŞI PROCEDEE DE OBŢINERE A

BIOPRODUSELOR VALOROASE

SPECIALITATEA 03.00.07 – MICROBIOLOGIE

Teză de doctor în biologie

Conducător ştiinţific: Consultant ştiinţific: Autorul

Agafia USATÎI doctor habilitat în biologie, profesor cercetător Valeriu RUDIC doctor habilitat în biologie, profesor universitar, academician, Om emerit al Republicii Moldova Oleg Chiseliţa

CHIŞINĂU, 2010

Page 2: Oleg Chiselita Thesis

2

© Chiseliţa Oleg, 2010

Page 3: Oleg Chiselita Thesis

3

CUPRINS

ADNOTĂRI........................................................................................................................ 5

LISTA ABREVIERILOR.................................................................................................... 8

INTRODUCERE……………………………………………………................................. 9

1. DROJDIILE GENULUI SACCHAROMYCES – SURSĂ DE CARBOHIDRAŢI ŞI

ALTE SUBSTANŢE BIOLOGIC ACTIVE.........................................................................

16

1.1. Conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor şi altor substanţe biologic active

în drojdiile genului Saccharomyces.....................................................................................

16

1.2. Activitatea biologică a carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces................... 25

1.3. Influenţa condiţiilor şi modului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme....................................................................................................................

27

1.3.1. Influenţa surselor de carbon şi azot asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme....................................................................................................................

27

1.3.2. Compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie – factori reglatori ai proceselor

biosintetice microbiene........................................................................................................

32

1.3.3. Influenţa factorilor fizici ai mediului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme....................................................................................................................

36

1.4. Concluzii la capitolul 1................................................................................................. 37

2. METODOLOGIA CERCETĂRII ŞTIINŢIFICE............................................................ 39

2.1. Obiectul de cercetare…................................................................................................. 39

2.2. Metode de investigaţie.................................................................................................. 40

3. MORFOLOGIA, FIZIOLOGIA ŞI PARTICULARITĂŢILE SINTEZEI

CARBOHIDRAŢILOR LA TULPINILE DE DROJDII SACCHAROMYCES

CEREVISIAE CNMN-Y-20 ŞI SACCHAROMYCES CEREVISIAE CNMN-Y21

SELECTATE DIN SEDIMENTE DE VIN..........................................................................

42

3.1. Caracteristica taxonomică a tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21 selectate ca producători activi de carbohidraţi.............................

42

3.2. Efectele nutrienţilor şi ale factorilor de mediu asupra multiplicării şi acumulării

carbohidraţilor în celulele drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21..

48

3.2.1. Efectele surselor de carbon asupra multiplicării drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-

20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi biosintezei carbohidraţilor............................................

49

3.2.2. Efectele sărurilor minerale, acetaţilor şi compuşilor coordinativi ai Mn (II) şi Zn

(II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-

Page 4: Oleg Chiselita Thesis

4

Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21...................................................................................... 54

3.2.3. Efectele temperaturii, pH-ului iniţial al mediului nutritiv, duratei de cultivare

asupra multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20

şi S. cerevisiae CNMN-Y-21...............................................................................................

62

3.3 Elaborarea regulamentului de obţinere din drojdii a bioprodusului Glucolev – 20....... 69

3.4. Concluzii la capitolul 3................................................................................................. 78

4. OBŢINEREA BIOPRODUSELOR VALOROASE DIN DROJDIILE

SEDIMENTELOR DE VIN.................................................................................................

80

4.1 Procedee de obţinere a unor fracţii glucidice din drojdiile sedimentelor de vin............ 80

4.2. Procedee de obţinere a bioproduselor complexe din drojdiile sedimentelor de vin..... 91

4.2.1. Studiul compoziţiei biochimice a drojdiilor din sedimente de vin............................ 92

4.2.2. Optimizarea condiţiilor de prelucrare a drojdiilor sedimentelor de vin şi schema

tehnologică de obţinere a produsului proteic furajer Prolevin.............................................

95

4.3. Concluzii la capitolul 4................................................................................................. 106

CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI……………………………................... 107

BIBLIOGRAFIE…………………………………………………….................................. 110

ANEXE…………………………………………………………….................................... 127

Anexa 1: Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de

peşte/ Cererea depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009.............................................................

128

Anexa 2: Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces

cerevisiae-sursă de β-glucani/ Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010...........................

130

Anexa 3: Act de implementare a rezultatelor Nr.1 eliberat de ÎI „Marin-Alexandru” la

30.06.2009............................................................................................................................

132

Anexa 4: Act de implementare a rezultatelor Nr.64A eliberat de CNMN a IMB a AŞM

la 17.05.2010........................................................................................................................

133

Anexa 5: Diploma European Exhibition of Creativity and Inovation „EUROINVENT”

2009 Bronze Medal „Feed for fish larvae and young fish”.................................................

137

Anexa 6: Diplomă Expoziţia Internaţională Specializată „INFOINVENT” 2009 Medalia

de Argint „Bioproduse din drojdiile sedimentelor vinicole pentru furajarea peştilor”........

138

DECLARAŢIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII................................................ 139

CV-ul AUTORULUI........................................................................................................... 140

Page 5: Oleg Chiselita Thesis

5

ADNOTARE Chiseliţa Oleg „Caracterele fiziologo-biochimice ale unor drojdii vinicole şi procedee de

obţinere a bioproduselor valoroase”. Teză de doctor în biologie, Chişinău, 2010. Teza constă

din introducere, 4 capitole, concluzii şi recomandări, bibliografie ce conţine 244 titluri, 6 anexe,

109 pagini conţinut de bază, 20 tabele, 37 figuri. Rezultatele au fost expuse în 18 publicaţii.

Cuvinte-cheie: Saccharomyces cerevisiae, drojdii de vin, carbohidraţi, compuşi coordinativi,

acetaţi, preparate din drojdii.

Domeniul de studiu: 03.00.07 – Microbiologie.

Scopul lucrării: studierea caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu

potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a

bioproduselor valoroase.

Obiective: izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi

fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor;

evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării carbohidraţilor

în celulele drojdiilor selectate; elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii

şi obţinere a biomasei cu conţinut prognozat de carbohidraţi; elaborarea procedeelor de obţinere

a unor bioproduse valoroase din drojdiile sedimentelor de vin.

Noutatea şi originalitatea ştiinţifică. Au fost selectate tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN–

Y-20 şi S. cerevisiae CNMN–Y-21 cu capacitate înaltă de sinteză a carbohidraţilor, stabilite

caracterele morfo-culturale şi fiziologo-biochimice, evidenţiaţi factorii determinanţi de dirijare a

proceselor de biosinteză a carbohidraţilor la tulpinile menţionate. A fost demonstrată eficienţa

melasei şi clorurii de tricloracetat de zinc în stimularea sintezei carbohidraţilor la drojdii.

Problema ştiinţifică. Argumentarea ştiinţifică a căilor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor la

tulpinile de drojdii selectate, utilizând ca reglatori nutrienţii preferenţiali şi factorii fizico-chimici.

Semnificaţia teoretică. Au fost obţinute date noi referitor la răspunsul fiziologic al drojdiilor de

vin la acţiunea factorilor de cultivare dirijată. Lucrarea argumentează posibilitatea valorificării

levurilor din sedimentele de vin pentru obţinerea unor bioproduse valoroase noi.

Valoarea aplicativă: Tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se recomandă pentru

cultivarea industrială în calitate de sursă de preparate glucidice. Tehnologia de procesare a

biomasei drojdiilor din sedimentele de vin se recomandă pentru producerea industrială a

bioproduselor naturale şi obţinerea substanţelor biologic active cu utilizare în diferite domenii.

Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Tulpinile de drojdii selectate sunt depozitate ca

producători de carbohidraţi şi utilizate în cercetările CNMN. Bioprodusul Prolevin R a fost

implementat la crescătoriile piscicole ale Î.I. „Marin-Alexandru”.

Page 6: Oleg Chiselita Thesis

6

РЕЗЮМЕ Киселица Олег „Физиолого-биохимические свойства некоторых винных дрожжей и

способы получения ценных биопродуктов”. Диссертация доктора биологических наук,

Кишинёв, 2010 г. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и рекомендаций,

библиографии, содержащей 244 наименования, 6 приложений, 109 страниц основного

текста, 20 таблиц и 37 рисунков. Результаты исследований представлены в 18 публикациях.

Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, винные дрожжи, углеводы, координационные

соединения, ацетаты, дрожжевые препараты.

Область исследования: 03.00.07 – Микробиология.

Цель работы: изучение физиолого-биохимических свойств некоторых штаммов винных дрожжей с

высоким потенциалом биосинтеза углеводов и разработка способов получения ценных биопродуктов.

Задачи: выделение из винных осадков, отбор и изучение морфо-культуральных и физиолого-

биохимических свойств штаммов дрожжей с высоким потенциалом биосинтеза углеводов;

выявление факторов, которые обеспечивают максимальный уровень продуктивности и

накопления углеводов в клетках отобранных дрожжей; разработка способов направленного

культивирования дрожжей и получения биомассы с прогнозируемым содержанием углеводов;

разработка способов получения ценных биопродуктов из осадочных винных дрожжей.

Научная новизна и оригинальность. Были отобраны штаммы дрожжей S. cerevisiae CNMN–

Y-20 и S. cerevisiae CNMN–Y-21 с высоким потенциалом синтеза углеводов, определены их

морфо-культуральные и физиолого-биохимические свойства, выявлены факторы управления

процессом биосинтеза углеводов у вышеуказанных штаммов. Была доказана эффективность

мелассы и трихлорацетат хлорида цинка в стимуляции синтеза углеводов у дрожжей.

Научная проблема. Научная аргументация способов направленного биосинтеза углеводов

у отобранных штаммов дрожжей, используя в качестве регуляторов необходимые

источники питания и физико-химические факторы.

Теоретическое значение. Получены новые данные относительно физиологического ответа винных

дрожжей на действие факторов направленного культивирования. Работа аргументирует возможность

использования осадочных винных дрожжей для получения новых ценных биопродуктов.

Прикладное значение: Штамм дрожжей S. cerevisiae CNMN–Y-20 рекомендуется для

промышленного культивирования в качестве источника углеводных препаратов. Технология

переработки осадочных винных дрожжей предлагается для промышленного производства натуральных

биопродуктов и получения биологически активных веществ с применением в различных областях.

Внедрение научных результатов. Отобранные штаммы дрожжей хранятся как

продуценты углеводов и применяются в научных исследованиях НКНМ. Биопродукт

Prolevin R был внедрен в рыбных хозяйствах И.П. „Marin-Alexandru”.

Page 7: Oleg Chiselita Thesis

7

ABSTRACT Chiselita Oleg „The physiological and biochemical properties of some wine yeasts and the obtaining

procedures of valuable bioproducts.” Thesis of doctor degree in biology, Chisinau, 2010. The thesis consists

of introduction, 4 chapters, conclusions and recommendations, bibliography, containing 244 references, 6

anexes, 109 pages of the base text, 20 tables and 37 figures. The results are presented in 18 publications.

Key words: Saccharomyces cerevisiae, wine yeast, carbohydrates, coordination compounds,

acetates, yeast preparations.

Field of study: 03.00.07 - Microbiology.

Goal of the work: the studying of physiological and biochemical characteristics of some of wine

yeasts strains with a high potential of carbohydrates biosynthesis and the elaboration of

procedures of obtaining of bioactive products.

Objectives: isolation from the wine sediments, the selection and the studying of their morphological,

cultural, physiological and biochemical characteristics of yeast strains with high potential for the

carbohydrates biosynthesis; the establishing of the medium factors that provides the optimal level of

productivity and the carbohydrates biosynthesis in the selected yeasts; the elaboration of procedures for

directed cultivation of yeasts and the biomass obtaining with an estimated carbohydrate content; the

elaboration of procedures of obtaining of some valuable bioproducts from the wine sedimentary yeasts.

Scientific novelty and originality. For the first time were selected two yeast strains S.

cerevisiae CNMN-Y-20 and S. cerevisiae CNMN-Y-21 with a high potential of carbohydrates

biosynthesis, were established their morphological, cultural, physiological and biochemical

characteristics and factors that determinate the processes of carbohydrates biosynthesis at

mentioned strains. The efficiency of molasses and trichloroacetate chloride of zinc to stimulate

the processes of carbohydrates biosynthesis in the mentioned strains has been demonstrated.

Scientific problem. Scientific argumentation for directing pathways of carbohydrate biosynthesis

at selected yeast strains, using as regulators preferred nutrients and physico-chemical factors.

Theoretical value. The new data on the physiological response of wine yeast on the action of

factors of directed cultivation. The work argues the possibility of the wine sedimentary yeasts

using for a new valuable bioproducts obtaining.

Application value. The strain S. cerevisiae CNMN–Y-20 is recomended for the industrial

cultivation as a source of carbohydrates preparations. The technology of processing of biomass

of wine sedimentary yeasts is recomended for the industrial obtaining of natural bioproducts and

bioactive substances with the utilization in different fields.

Implementation of scientific results. The selected yeast strains are stored as carbohydrates

producers and used in the investigations within CNMN. The bioproduct Prolevin R was

implemented at the fish farms of I.E. „Marin-Alexandru”.

Page 8: Oleg Chiselita Thesis

8

LISTA ABREVIERILOR

ADN - acid dezoxiribonucleic

ARN - acid ribonucleic

ATP – adenozin trifosfat

BAU – biomasă absolut uscată

CNMN – Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene

CS I – chitinsintetaza unu

CS II – chitinsintetaza doi

CS III – chitinsintetaza trei

GAT - glutamintransferaza

GDF - guanozindifosfat

GFI - glicozilfosfatidilinozitol

MGYP - malţ, glucoză, extract de drojdii, pepton

OZT - oligozahariltransferaza

SOD - superoxiddismutaza

S.U. – substanţă uscată

UDF - uridindifosfat

YPG - extract de drojdii, pepton, glucoză

1,3-β-GS - 1,3-β-glucansintetaza

%M – procent la martor

Page 9: Oleg Chiselita Thesis

9

INTRODUCERE

Actualitatea şi importanţa cercetărilor

Una din problemele stringente ale actualităţii este căutarea noilor surse de materie primă

pentru elaborarea preparatelor medicamentoase şi profilactice, suplimentelor alimentare şi

furajere biologic active. În ultimii ani în calitate de aşa surse sunt studiate microorganismele şi în

special drojdiile, capabile să sintetizeze un complex de substanţe bioactive, inclusiv carbohidraţi

care au un rol impunător în activitatea vitală a organismelor vii.

Interesul sporit faţă de polizaharidele bioactive naturale, remarcat în ultimii ani, se

datorează multiplelor aplicaţii ale acestora în cele mai diverse ramuri: industria alimentară,

cosmetologie, medicină, farmaceutică, zootehnie, veterinărie, acvacultură, ecologie şi protecţia

plantelor [125, 152, 168, 175, 206, 207]. În această ordine de idei prezintă un interes deosebit

polizaharidele microbiene, obţinerea cărora din punct de vedere economic este mult mai

avantajoasă decât a celor de origine animală şi vegetală.

În membrana celulară a drojdiilor se conţin mai multe tipuri de glucide, de bază fiind

mananul legat cu proteinele învelişului celular şi glucanul. β-glucanii intră în structura stratului

interior al peretelui celular, iar învelişul exterior al lui este format din manan. β-glucanii

peretelui celular al drojdiilor posedă activitate imunomodulatoare [97, 98, 113, 215, 234, 236],

antivirală şi antibacteriană [165, 183, 201], anticancerigenă [237, 239, 243], de aceea îşi găsesc

utilizare la producerea preparatelor medicamentoase, ca componente ale remediilor

cosmetologice, ca agenţi de viscozitate în industria alimentară [227].

Masa uscată a celulelor de drojdii şi conţinutul de polizaharide variază în funcţie de

specie, precum şi în dependentă de compoziţia mediului şi condiţiile de cultivare. Relaţia

matematică între ele nu a fost însă bine stabilită. Această corelaţie între concentraţia

componentelor mediului, biosinteza carbohidraţilor şi masa de celule uscate este importantă la

cultivarea microorganismelor din punct de vedere al controlului şi optimizării procesului.

Sinteza polizaharidelor microbiene este determinată de componenţa mediului nutritiv

(natura surselor de C, N, P şi concentraţia lor, raportul C/N, ionii metalelor), factorii fizico-

chimici (temperatură, pH-ul, nivelul de aeraţie), durata ciclului periodic de cultivare. În

dependenţă de condiţiile de cultivare ale producătorului se schimbă componenţa chimică a

polizaharidelor, masa lor moleculară, conţinutul cantitativ al părţilor componente, ceea ce are

influenţă nemijlocită asupra viscozităţii lor, parametru ce determină în mare măsură importanţa

lor practică [35, 69, 114].

Relatări referitor la sinteza carbohidraţilor de către microorganisme sunt numeroase, însă

problema selectării unor tulpini cu activitate sporită rămâne a fi actuală, acest fapt fiind

Page 10: Oleg Chiselita Thesis

10

determinat atât de instabilitatea capacităţii de producere caracteristică microorganismelor, cât şi

de lipsa mediilor de cultură, procedeelor de sinteză orientată, specifice producătorului.

Producători de carbohidraţi de performanţă sunt drojdiile genului Saccharomyces [78,

127, 138, 170], activitatea cărora poate fi substanţial sporită prin varierea factorilor de nutriţie,

parametrilor de cultivare, stimulatorilor şi reglatorilor [42, 84, 88, 92, 96, 109, 133, 138, 161,

170, 217, 219, 222, 228, 244].

În acest context importante şi necesare sunt investigaţiile destinate selectării tulpinilor cu

activitate biosintetică înaltă, a defini nutrienţii preferenţiali şi parametrii optimi de cultivare şi

drept rezultat a elabora procedee de sinteză orientată a carbohidraţilor. Din acest punct de vedere

drojdiile genului Saccharomyces – producători recunoscuţi de carbohidraţi bioactivi reprezintă

un obiect biotehnologic de mare perspectivă.

Un interes aparte prezintă obţinerea bioproduselor bogate în carbohidraţi din drojdiile

sedimentelor de vin. Actualmente, în lume se acordă mare atenţie problemei utilizării deşeurilor

generate de industria vinului. Deşeurile de la vinificaţie se caracterizează prin prezenţa

antioxidanţilor naturali, care recent se utilizează în industria alimentară. Mai mult decât atât,

deşeurile de vin ar putea fi eventual utilizate ca bioamendament de sol, îngrăşăminte, ca

adsorbent pentru metale grele şi pentru producerea de polizaharide [146]. Biomasa drojdiilor are

capacitatea de a elimina din organismul uman metalele grele, diferiţi metaboliţi toxici, posedă

acţiune antibacteriană, antivirală şi proprietăţi probiotice. Unele principii bioactive din biomasa

drojdiilor manifestă capacităţi anticancerigene, antisclerotice pronunţate. De asemenea, sunt utile

concentratele şi autolizatele de drojdii, preparatele vitaminice şi enzimatice ce se folosesc în

industria de panificaţie. Sedimentele de drojdii au o preţioasă compoziţie chimică. Ele conţin

până la 25% substanţă uscată, dintre care în %: substanţe minerale - 5-10, carbohidraţi - 25-50,

compuşi azotaţi (calcul după azot)-5-12, proteine-30-75, lipide-2-5. Partea principală a

substanţelor minerale o alcătuiesc derivaţii acidului fosforic (până la 50%) şi diferiţi compuşi ai

potasiului (până la 25%). Carbohidraţii sunt prezentaţi prin hemiceluloze şi polizaharidele

peretelui celular (glucani, manani), glicogen şi monozaharidele din citoplasma celulară.

Sedimentele de drojdii conţin practic toţi aminoacizii cunoscuţi (de la 1 până la 11%) şi

vitamine, care au utilizare largă în farmaceutică. În levurile uscate se conţin până la 22-30%

compuşi ai acidului vinic [8].

Actualitatea utilizării deşeurilor industriei vinicole se datorează cerinţelor crescânde

înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la vinificaţie şi perspectivei elaborării preparatelor

ecologic pure cu valoare biologică şi nutritivă înaltă, în special pentru domeniul alimentar,

farmaceutic, de cosmetice, agricol.

Page 11: Oleg Chiselita Thesis

11

Analiza domeniilor de utilizare şi mecanismelor de acţiune ale carbohidraţilor de origine

microbiană demonstrează importanţa acestor studii şi pune în evidenţă incontestabilitatea

desfăşurării cercetărilor atât în direcţia căutării noilor tulpini de microorganisme producătoare de

aceste substanţe, cât şi de utilizare a surselor netradiţionale de obţinere a lor, cum ar fi drojdiile

din sedimentele de vin.

Reieşind din cele expuse, scopul cercetărilor constă în studierea caracterelor fiziologo-

biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor şi

elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase.

Obiectivele cercetărilor:

٠Izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi fiziologo-

biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor.

٠Evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării

carbohidraţilor în celulele drojdiilor selectate.

٠Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii şi obţinere a biomasei cu

conţinut prognozat de carbohidraţi.

٠Elaborarea procedeelor de obţinere a unor bioproduse valoroase din drojdiile sedimentelor de vin.

Noutatea şi originalitatea ştiinţifică

Pentru prima dată au fost selectate două tulpini de drojdii S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN–Y-21, care se caracterizează prin capacitate înaltă de sinteză a carbohidraţilor

şi stabilite caracterele lor morfo-culturale şi fiziologo-biochimice [4, 18].

În premieră a fost demonstrată posibilitatea dirijării proceselor de biosinteză a

carbohidraţilor la tulpinile S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 prin

includerea în mediul nutritiv a diferitor surse de carbon, acetatului de zinc şi compusului

coordinativ clorură de tricloracetat de zinc. A fost evaluat răspunsul fiziologic al tulpinilor

selectate la acţiunea factorilor fizici ai mediului de cultivare (temperatura, durata cultivării, pH-

ul mediului).

A fost elaborat în premieră regulamentul cultivării S. cerevisiae CNMN –Y-20 cu

utilizarea factorilor optimizaţi, care permite producerea industrială a biomasei de drojdie cu

conţinut maxim prognozat de carbohidraţi.

Au fost obţinute date originale privind compoziţia biochimică a drojdiilor din

sedimentele de vin, elaborată schema tehnologică de prelucrare a acestora şi obţinere a

bioproduselor valoroase ce conţin aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, în special

proteomanani şi β–glucani, ergosterol şi acizi graşi nesaturaţi.

Page 12: Oleg Chiselita Thesis

12

În premieră a fost demonstrat, că bioprodusul obţinut din drojdiile sedimentelor vinicole

are capacitatea de a spori semnificativ viabilitatea, indicii corporali şi caracteristicile productive

ale larvelor şi puietului de peşte [7].

Problema ştiinţifică importantă soluţionată în lucrare constă în argumentarea căilor de

dirijare a biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii selectate, utilizând ca factori reglatori

nutrienţii, stimulatorii specifici şi factorii fizico-chimici de cultivare.

Semnificaţia teoretică constă în stabilirea răspunsului fiziologic al drojdiilor de vin S.

cerevisiae CNMN–Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 la acţiunea factorilor de cultivare,

conform căruia biosinteza carbohidraţilor poate fi dirijată prin varierea surselor specifice de

carbon, unor compuşi coordinativi ai biometalelor, valorilor de temperatură, pH, duratei de

cultivare adecvate cerinţelor tulpinii producătoare.

Lucrarea argumentează posibilitatea valorificării levurilor din sedimentele de vin în

calitate de obiect biotehnologic pentru obţinerea unor bioproduse valoroase noi.

Valoarea aplicativă a lucrării:

٠se propun spre valorificare două tulpini de drojdii S. cerevisiae CNMN–Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN –Y-21 cu un conţinut sporit de carbohidraţi;

٠regulamentul de cultivare dirijată a drojdiei S. cerevisiae CNMN–Y-20 elaborat oferă

facilităţi în obţinerea bioprodusului Glucolev - 20 cu conţinut prognozat de carbohidraţi;

٠tehnologia de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin permite obţinerea

bioprodusului Prolevin R cu destinaţie furajeră.

Aprobarea rezultatelor lucrării. Rezultatele cercetărilor au fost comunicate la

Conferinţa internaţională IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые

технологии и биотехнологии» (Cazani, 2008; 2009), Conferinţa internaţională consacrată

comemorării m.c. al AŞM Petru Ungurean (1894-1975) (Chişinău, 2008), Conferinţa

internaţională a tinerilor cercetători a IV ediţie (Chişinău, 2008), Conferinţa internaţională

„Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и

применения” (Crimeea, Ucraina, 2009), Conferinţa ştiinţifică naţională cu participare

internaţională consacrată celei de-a 50 aniversări de la fondarea Secţiei de Microbiologie

„Probleme actuale ale microbiologiei şi biotehnologiei” (Chişinău, 2009), Expoziţia

internaţională Specializată „MOLDECO” ediţia a VII (Chişinău, 2007), European exhibition of

creativity and innovation „EUROINVENT” (Iaşi, 2009), (anexa 5), Expoziţia internaţională

specializată „INFOINVENT” (Chişinău 2009), (anexa 6), Salonul internaţional al cercetării,

inovării şi inventicii „PROINVENT”, ediţia a VIII-a (Cluj – Napoca, 2010).

Page 13: Oleg Chiselita Thesis

13

Publicaţii la tema tezei. În baza materialelor tezei au fost publicate 18 lucrări ştiinţifice,

inclusiv 5 articole în reviste recenzate (2 în monoautorat), 9 rezumate ale comunicărilor

ştiinţifice, 2 brevete de invenţie.

Cuvinte cheie: Saccharomyces cerevisiae, drojdii de vin, carbohidraţi, compuşi

coordinativi, acetaţi, preparate din drojdii.

Volumul şi structura tezei. Teza constă din introducere, patru capitole, concluzii

generale şi recomandări, şase anexe, cu volumul de bază de 109 pagini. Lucrarea conţine 20

tabele şi 37 figuri. Lista surselor bibliografice citate include 244 titluri.

Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20

şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 sunt depozitate ca producători de carbohidraţi şi utilizate în

cercetări de Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene (Act de implementare Nr. 64A

din 17.05.2010), anexa 4. Bioprodusul Prolevin R a fost implementat la crescătoriile piscicole ale

Î.I. „Marin-Alexandru” (Act de implementare Nr. 1din 30.06.2009), anexa 3.

Capitolul 1. „Drojdiile genului Saccharomyces – sursă de carbohidraţi şi alte

substanţe biologic active” prezintă o analiză amplă şi minuţioasă a publicaţiilor ştiinţifice de

ultimă oră la tema de cercetare, care reflectă următoarele aspecte: compoziţia biochimică a

drojdiilor, conţinutul calitativ şi cantitativ al carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces;

importanţa drojdiilor S. cerevisiae ca producători de carbohidraţi; mecanismele de sinteză a

carbohidraţilor în celulele de drojdii; proprietăţile, efectele biologice şi domeniile de utilizare a

carbohidraţilor din biomasa drojdiilor; căile şi mecanismele de inducere a procesului de

biosinteză a carbohidraţilor.

Capitolul 2. „Metodologia cercetării ştiinţifice”. Aspectele elucidate în capitol ţin de

reflectarea obiectelor de studiu a lucrării, metodelor microbiologice de selectare, izolare şi

clasificare a microorganismelor studiate, metodelor de determinare a carbohidraţilor, proteinelor,

lipidelor şi altor substanţe biologic active, mediilor de nutriţie utilizate la cultivarea drojdiilor şi

substanţelor folosite ca precursori şi stimulatori ai procesului de sinteză a carbohidraţilor la

drojdii. De asemenea, sunt elucidate metodele eficiente de dezintegrare a pereţilor celulari la

drojdii, care facilitează extragerea eficientă a substanţelor biologic active şi obţinerea

bioproduselor din biomasa levuriană. Utilizarea metodelor descrise în acest capitol a permis

obţinerea unor rezultate adecvate şi reproductibile, care elucidează valoarea fundamentală a

cercetărilor şi subliniază aspectul lor aplicativ.

Page 14: Oleg Chiselita Thesis

14

Capitolul 3 „Morfologia, fiziologia şi particularităţile sintezei carbohidraţilor la

tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 selectate din

sedimente de vin” elucidează rezultatele cercetărilor destinate selectării şi obţinerii în cultură

pură a unor tulpini de drojdii de vin cu capacităţi sporite de sinteză a carbohidraţilor. În

continuare a fost cercetată posibilitatea sporirii productivităţii şi sintezei carbohidraţilor de către

tulpinile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21, selectate din sedimentele de

vin, prin includerea în mediul nutritiv a diferitor surse de carbon, (utilizate separat) ca: glucoza,

zaharoza, fructoza, manoza şi melasa des folosite în practica microbiologică. A fost demonstrată

capacitatea tulpinilor de a asimila eficient sursele de carbon cercetate şi posibilitatea majorării

productivităţii şi conţinutului de carbohidraţi în biomasa drojdiilor prin substituirea în mediul

nutritiv Rieder a glucozei prin melasă, zaharoză şi fructoză. La etapa următoare a fost cercetată

influenţa sulfaţilor de mangan şi de zinc, acetaţilor de sodiu şi de zinc, unor compuşi coordinativi

ai Mn (II) şi Zn (II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii în

studiu. S-a demonstrat că compusul coordinativ clorura de tricloracetat de zinc în concentraţii de

5-20 mg/l şi acetatul de Zn în concentraţie de 10-20 mg/l pot fi utilizaţi în calitate de stimulatori

specifici ai sintezei carbohidraţilor şi multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20. În

continuare s-au stabilit parametrii de temperatură, pH şi durată de cultivare optimi pentru

multiplicarea tulpinilor în studiu şi sinteza carbohidraţilor. În baza acestor rezultate a fost

elaborat un procedeu de cultivare a tulpinii de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20, care prevede

dirijarea biosintezei carbohidraţilor prin asocierea surselor specifice de carbon, compusului

coordinativ clorură de tricloracetat de zinc, valorilor de temperatură, pH şi durată de cultivare

adecvate producătorului. În baza procedeului susmenţionat s-a elaborat tehnologia de obţinere a

bioprodusului Glucolev – 20.

Capitolul 4 „Obţinerea bioproduselor valoroase din drojdiile sedimentelor de vin”.

În acest capitol s-a demonstrat că autoliza şi ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu

eficient pentru dezintegrarea pereţilor celulari, în vederea obţinerii carbohidraţilor. Complexul de

polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular al drojdiilor de la vinificaţie este compus

preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi semnificative atât la drojdiile

din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.

Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie mai

adecvat s-a dovedit a fi procedeul cu utilizarea apei, soluţiilor de alcalii şi acizi. Utilizarea acestui

procedeu permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii şi albe a 4 fracţii de glucide: 1)

hidrosolubilă (mono-, dizaharide), 2) alcalinsolubilă (mananproteine), 3) solubilă în acizi (de tip

Page 15: Oleg Chiselita Thesis

15

glicogen) şi 4) insolubilă în alcalii şi acizi (β-glucanii) valorile cărora variază în dependenţă de

provenienţa biomasei.

În continuare s-a constatat că compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin

variază în limite largi. A fost scoasă în evidenţă prezenţa conţinutului echilibrat de proteină

bogată în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, acizi graşi polinesaturaţi, care indică

posibilităţile utilizării drojdiilor din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic

active. Prin investigaţii de evaluare şi optimizare a condiţiilor de obţinere a bioproduselor din

drojdiile de la vinificaţie s-a elaborat tehnologia de obţinere a bioprodusului Prolevin R.

Bioprodusul Prolevin – R (obţinut prin autoliza levurilor din sedimente de la vinuri de masă

roşii) utilizat în proporţie de 48 – 50% la unitate masă în furaje pentru creşterea larvelor şi

puietului de peşte a condus la sporirea semnificativă a viabilităţii larvelor, masei medie a unei

larve şi ihtiomasei generale medii.

Prin urmare, această lucrare dezvăluie mai multe aspecte, scopul final al cărora este

studierea caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii selectate din sedimente de

vin, elaborarea procedeelor de biosinteză dirijată a carbohidraţilor la drojdii şi obţinerea

bioproduselor din drojdiile sedimentelor de vin şi deci prezintă importanţă teoretică, cât şi valoare

aplicativă.

Page 16: Oleg Chiselita Thesis

16

1. DROJDIILE GENULUI SACCHAROMYCES - SURSĂ DE

CARBOHIDRAŢI ŞI ALTE SUBSTANŢE BIOLOGIC ACTIVE

1.1. Conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor şi altor substanţe biologic

active în drojdiile genului Saccharomyces

Microorganismele cunoscute sub denumirea de drojdii nu formează o unitate taxonomică

bine delimitată, ci prezintă un grup artificial complex şi eterogen în care sunt încadraţi taxoni

micotici cu caractere relativ intermediare între organismele procariote şi eucariote. Studiile

întreprinse asupra drojdiilor, intensificate în ultimele decenii, se justifică nu numai prin

aplicaţiile lor practice în industrie, ci şi prin importanţa lor ca model experimental către care şi-

au îndreptat atenţia cercetătorii din cele mai diverse specialităţi – citologie, microbiologie,

biotehnologie, biochimie, biologie celulară, genetică.

Drojdiile sunt folosite în mod frecvent pentru explicarea sau confirmarea unor aspecte

fundamentale de biologie celulară şi moleculară şi, în special, a celor care deosebesc celula

eucariotă de cea procariotă. Potenţialele multiple, pe care le prezintă drojdiile au dus la folosirea

lor pentru înţelegerea multor aspecte legate de originea, evoluţia, compoziţia chimică,

ultrastructura şi rolul fiziologic al unor organite celulare şi la rezolvarea multor probleme de

biologie şi genetică moleculară [1].

În timpul de faţă produsele biotehnologiilor levuriene pătrund tot mai mult în diferite

domenii ale economiei, utilizăndu-se la producerea produselor alimentare, băuturilor alcoolice şi

nealcoolice, biocombustibilului, chimicalelor, fermenţilor, suplimentelor furajere, preparatelor

medicale, în agricultură şi rezolvarea multor probleme ecologice [195].

Celula drojdiilor, similar cu cea a eucariotelor vegetale, are două învelişuri – peretele

celular şi plasmolema (membrana celulară) – care, deşi se individualizează clar unul de altul din

punct de vedere fizic, chimic şi arhitectural, îndeplinesc funcţii, în bună parte, asemănătoare sau

complementare. Proprietăţile de protecţie, reglatoare (selective), informaţionale etc. sunt

rezultatul intimei cooperări funcţionale între aceste două structuri de suprafaţă. În membranele

celulare se află în mediu de la 2 până la 5% de carbohidraţi din masa membranelor. La

majoritatea microorganismelor în componenţa membranelor intră glicolipide şi glicoproteine.

Practic toate bacteriile grampozitive, drojdiile şi ciupercile conţin în regiunea membranei

citoplasmatice acizi teihoici (1-2% B.A.U.) – polizaharide acide (glicerofosfaţi) ce pot forma

compuşi cu glicolipidele şi fosfolipidele (acizi lipoteihoici). Glicolipidele participă la biosinteza

polizaharidelor şi transportul zaharurilor. Acizii teihoici reglează schimbul de ioni (leagă cationii

Page 17: Oleg Chiselita Thesis

17

bivalenţi, ceea ce este necesar pentru funcţionarea normală a fermenţilor localizaţi în

membrană), asigură legătura între membrană şi peretele celular, posedă activitate antigenă [34,

36].

Peretele celular este o structură extracelulară cu o compoziţie foarte variabilă la diferite

grupuri taxonomice. Însă, necătând la diferenţe, această structură extracelulară indiferent de

provinienţa ei prezintă un ansamblu proteico-polizaharidic, care include în calitate de monomeri

glucoza, manoza, galactoza, xiloza, arabinoza, glucozamina şi alţi hidraţi de carbon [145].

Componenţa polizaharidică a diferitor reprezentanţi ai ciupercilor miceliale poate fi

diferită, însă componentele de bază ale peretelui celular pot fi repartizate în două grupe. Prima

grupă este reprezentată de aşa componente structurale ca poliaminozaharide (chitină, chitozan) şi

glucani care au β-(1-3), β-(1-4), β-(1-6) legături, cea de a doua de mananproteine,

galactomananproteine, etc. Studiul carbohidraţilor diferitor specii de microorganisme deseori se

axează pe doi polimeri: chitina şi glucani [44, 75].

În peretele celular al diferitor drojdii au fost identificate xiloza, manoza, fructoza,

galactoza, alte mono- şi dizaharide care indică prezenţa heteroglicanilor [78].

Peretele celular îndeplineşte funcţii importante pentru celulă: reglează nivelul secreţiilor,

are rol homeostatic şi este elementul indispensabil în menţinerea integrităţii şi durităţii celulei

[124].

Peretele celular al drojdiei, denumit de fiziologi regiunea metabolică externă a celulei,

reprezintă circa 1/10 din volumul celulei şi aproximativ 15 - 30% din greutatea substanţei uscate

şi este compus în mare măsură din polizaharide (~ 85%) şi proteine (~ 15%). Analizele

biochimice extensive arată că glucoza, N-acetilglucosamina şi manoza reprezintă 80 – 90%, 1 –

2% şi 10 – 20% din totalul de glucide, respectiv [163].

Cercetările legate de peretele celular al drojdiilor au relevat atât unitatea, cât şi

diversitatea biochimică a acestuia. Unitatea este asigurată de prezenţa a trei componente majore:

glucani, mananproteine şi chitină (figura 1.1), care împreună reprezintă 60 – 80% din substanţa

uscată a peretelui [36]. Diversitatea este consecinţa modificării raporturilor cantitative şi

structurii particulare a unor componente chimice parietale. Variaţiile biochimice pot apărea la

aceeaşi tulpină în funcţie de condiţiile de cultivare şi etapa ciclului de viaţă [112].

Polizaharidele sunt polimeri constituiţi din cel puţin 11 unităţi monozaharidice. Ele pot fi

alcătuite din unul sau mai multe tipuri de monozaharide. Corespunzător se disting

homopolizaharidele şi heteropolizaharidele. Polizaharidele sunt componentele de bază ale tuturor

organismelor vii şi reprezintă majoritatea carbohidraţilor din natură.

Page 18: Oleg Chiselita Thesis

18

Fig. 1.1. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular la drojdii

şi legăturile lor. După Lesage G., 2006 [172]. Legendă:

(A) arhitectura laterală a peretelui celular. β-1-3, β-1-4, şi β-1-6 legături glicozidice sunt reprezentate prin verde, albastru şi portocaliu, respectiv. Mananoproteinele peretelui celular (CWP), pot fi legate de β-1-3-glucan, prin intermediul legăturilor alcalino sensibile (ASB) sau de proteine (PIR), prin intermediul unor legături disulfidice (SS). GPI proteinele peretelui celular (GPI-CWP) sunt anexate la β-1-6-glucan, printr-o ancoră rămăşiţă GPI (GPI real). Legăturile între β-1-3-glucan şi β-1-6-glucan sau proteine PIR sunt încă puţin caracterizate.

(B) Adunarea elementelor constitutive ale septului peretelui celular în timpul înmuguririi la celula mamă şi fiică (imagine din stânga şi mijloc), precum şi în cicatricea pe celula mamă. (imagine din dreapta). Gri deschis - membrana plasmatică, gri închis - inel de chitină, culoare roz - sept chitinos primar, galben – glucan, verde - mananoproteine la baza septului secundar şi albastru - cicatrice chitinoasă la celula mamă.

(C) Structura peretelui celular la ascospori. Glucan-mananoproteinele, chitina şi straturi ditirosin sunt prezentate în verde, albastru şi violet respectiv. Poduri de conectare interspore bogate în chitosan sunt prezentate în albastru.

Carbohidraţii se află în natură sub formă liberă sau de polimeri, de sine stătători şi în

complexe cu acizii nucleici, proteinele, lipidele, fosfaţii. Structura şi compoziţia

microorganismelor în general, şi cea a carbohidraţilor, în particular este foarte diversă şi

complicată. Carbohidraţii microbieni în dependenţă de localizarea lor se împart în intracelulari

(din citoplasmă, membrane şi pereţii celulari) şi extracelulari (din capsule, mucozităţi şi cei

eliminaţi în mediul de cultivare) [34].

În dependenţă de funcţie, carbohidraţii se împart în următoarele grupe: a) de rezervă

(tregaloza, glicogenul amorf sau granular din citoplasmă), b) substanţele structurale ale peretelui

celular (chitina, glucanul, mananul), c) polizaharidele membranei celulare (glicolipidele şi

Page 19: Oleg Chiselita Thesis

19

glicoproteinele), care participă la transportul substanţelor nutritive şi d) polizaharide ce se

elimină în mediu. Ultimele se mai numesc extracelulare.

O proprietate importantă a polizaharidelor este viscozitatea înaltă, gelatinizarea,

elasticitatea şi capacitatea de a forma emulsii apoase stabile. Rolul lor este de a forma o barieră

fizico-chimică între celulă şi mediul înconjurător, ceea ce protejează celula de uscare şi atacurile

patogenilor [36].

Este bine cunoscut faptul că carbohidraţii de rezervă a drojdiilor sunt glicogenul şi

tregaloza [117, 185]. Conţinutul acestor carbohidraţi, în dependenţă de condiţiile de cultivare,

poate ajunge la 25% din substanţa uscată. Tregaloza şi glicogenul se sintetizează ca răspuns la

aşa condiţii nefavorabile de cultivare ca temperaturile înalte şi joase, presiunea osmotică înaltă şi

carenţa în surse nutritive [83, 187, 203, 222]. Tregaloza se sintetizează preponderent la drojdiile

cultivate în condiţii aerobe, iar glicogenul - la cele cultivate anaerob [36, 133]. Funcţia de bază a

tregalozei şi glicogenului este protecţia membranelor celulare şi a proteinelor de denaturare [36,

83]. Complexul de fermenţi ce catalizează biosinteza tregalozei participă şi în reglarea căii

glicolitice la S. cerevisiae [120].

Carbohidraţii din citoplasmă pot forma complecşi cu ADN, ARN, proteinele, lipidele şi

fosfaţii. În afară de funcţia de substanţă de rezervă participă în mecanismele reglatoare ale

celulei ce controlează sinteza diferitor substanţe, creşterea şi multiplicarea celulei. Ca exemplu

pot servi complexele glicogenribosomale care controlează biosinteza proteinelor.

Însă cel mai mare interes ştiinţifico-practic la momentul actual îl prezintă polizaharidele

de bază ale peretelui celular al drojdiilor, şi anume glucanii şi mananii care au cea mai largă şi

vastă utilizare în diverse domenii [125, 152, 168, 175, 206, 207].

Glucanul este un polizaharid complex, prezent la drojdii, compus din unităţi de D-

glucopiranoză legată β-(1→6) şi β-(1→3). Molecula de glucan din peretele S. cerevisiae este

ramificată, fiind formată dintr-un lanţ axial în care reziduurile de D-glucopiranoză sunt β-(1→6)

legate şi catene laterale cu legături β-(1→3). Forma generală a moleculei de glucan poate fi

asemănată cu o panglică lungă şi răsucită având o latură hidrofilă, datorită concentrării grupărilor

hidroxilice, şi alta hidrofobă pe care s-au concentrat grupările metilice. Dacă se admite o

asemenea structură, extinderea suprafeţei peretelui celular poate fi considerată ca rezultat al

alunecării lanţurilor de glucan, unul de-a lungul celuilalt sau clivajul enzimatic al lanţurilor de

glucan preformate prin activarea glucanazelor parietale [171].

Moleculele de glucan se asociază (probabil prin legături de hidrogen laterale), formând

subunităţi microfibrilare similare cu cele de celuloză şi chiar de xilan. La rândul lor,

microfibrilele de glucan se asociază, organizând în interiorul matrixului parietal o reţea cu o

Page 20: Oleg Chiselita Thesis

20

arhitectură şi topografie complicată. Experienţele pe protoplaştii de drojdii au arătat că aceştia

regenerează pe suprafaţa lor o structură reticulară glucanică, dar care pare să difere de glucanii

insolubili ai peretelui nativ, ce rămân după extracţia mananproteinelor [170].

Sinteza peretelui celular la drojdii este localizată pe membrana plasmatică şi este

dependentă de proteinchinazele secretorii şi controlată de un sistem enzimatic echilibrat, care

conţine hidrolaze, glicozidaze, glicoziltransferaze, şi transglicozilaze. Acest sistem numit GH72,

ce conţine 72 de enzime, este prezent în organismele fungice şi posedă funcţia importantă de a

sintetiza unităţile de structură şi a alungi (1-3, 1-6) lanţuri de glucan. Cu toate acestea,

mecanismele moleculare care controlează echilibrul între hidroliză şi transglicozilare în aceste

sisteme nu sunt pe deplin înţelese [131, 144, 210].

β-1,6-glucanul este o componentă specifică esenţială a peretelui celular al S. cerevisiae

care interconectează toate celelalte componente din perete într-un grilaj. Eforturi considerabile

au fost îndreptate la identificarea şi caracterizarea etapelor implicate în biosinteza sa din punct de

vedere genetic şi biochimic. Studiile arată că acest polimer joacă un rol central în structura

peretelui, şi este legat prin intermediul lanţurilor de glucan β-1,3 şi chitină de mananproteine.

Cercetările genetice au identificat genele care duc la defecte de diversă severitate în structura β-

1,6-glucanului, de multe ori cu consecinţe letale. Produsele activităţii acestor gene au fost

localizate în întreaga cale secretorie şi la suprafaţa celulelor. Cu toate acestea, activitatea celor

mai multe dintre aceste gene identificate rămâne necunoscută, ceea ce face neclar în ce măsură şi

mod acestea contribuie la defectarea compoziţiei acestui polimer Date curente structurale şi

genetice au permis dezvoltarea unor modele pentru a prezice evenimentele biosintetice. Pe baza

cunoştinţelor despre sinteza glucanilor şi a chitinei, este probabil că cea mai mare parte a lor se

sintetizează la suprafaţa celulelor, dar necesită în prealabil evenimente cheie intracelulare. [99,

174, 177, 211].

Responsabil de rigiditatea peretelui celular al drojdiilor este β(1-3)-glucanul, care este

sintetizat de 1,3-β- GS (glucansintetaza), localizată pe membrana plasmatică şi care este o

enzimă foarte mobilă, schimbându-şi încontinuu locul de acţiune. Imobilizarea acestei enzime

duce la sinteza neuniformă a glucanilor în pereţii celulari şi, ca rezultat, la liza şi moartea

celulelor de drojdii [122, 231].

Toate investigaţiile de până acum au dat rezultate negative privind prezenţa glucanului la

suprafaţa peretelui celular. Ca urmare, testele imunochimice nu au putut fi utilizate pentru

localizarea glucanului în cadrul peretelui celular de drojdii. Interacţiunea sa cu alte substanţe

chimice parietale poate duce la apariţia unor funcţii noi sau la potenţarea componentelor ataşate.

Page 21: Oleg Chiselita Thesis

21

Faptul, că numai o parte din glucanul parietal este susceptibil la hidroliza acidă blândă denotă, că

glucanul este strâns conexat cu celelalte componente chimice parietale.

Mananii reprezintă cea de a doua componentă majoră a peretelui celular al drojdiilor cu

multiple şi complexe funcţii (structurală, informaţională, imună, protectoare etc.). Mananii

formează, de regulă, complexe stabile cu proteinele peretelui şi se caracterizează printr-o

accentuată eterogenitate, determinată de gradul de polimerizare al unităţilor manozil, de tipurile

de legături ce se stabilesc, de prezenţa şi a altor tipuri de reziduuri ozidice dar şi de modul de

complexare cu alte tipuri de molecule. Molecula mananproteică prezintă un ax principal în care

reziduurile manopiranozice sunt legate α -(1→6) şi numeroase lanţuri laterale cu legături α -

(1→2). O particularitate majoră a componentei glucidice a mananproteinelor din peretele celular

al S. cerevisiae este diferenţierea lanţului polizaharidic într-un miez („core”) şi lanţ periferic

(extern). Miezul se individualizează prin faptul că unele lanţuri laterale sunt ataşate la axul

principal prin legături α -(1→3) şi prin aceea că prima unitate manozică este legată β -(1→4) la

unitatea di-N-acetilchitobioză. Miezul mananproteinelor din peretele celular al drojdiilor este

identic în privinţa multor trăsături structurale cu oligozaharidele similare din glucoproteinele

mamiferelor. Enzimele cheie în N-glicozilarea proteinelor şi sinteza mananproteinelor la drojdii

sunt manoziltransferazele, numite OZT, responsabile de translarea eficientă a proteinelor

glicozilate la locul de sinteză şi alungirea lanţului polizaharidic. Variate studii biochimice şi

genetice au arătat, că setul de OZT la S. cerevisiae este compus din nouă subunităţi: Wbp1,

Swp1, Stt3, Ost1, Ost2, Ost3, Ost4, Ost5, şi Ost6 [134, 229].

O altă cale distinctă de sinteză a mananproteinelor la drojdii este cea care foloseşte ca

unităţi de sinteză O-oligozaharidele, ce constau din lanţuri scurte de până la cinci unităţi de

manoză, cu primele două reziduuri α-1-2 legate şi cele ulterioare α-1-3 legate. Aceste unităţi de

structură sunt legate de proteină în domeniile bogate în serină/treonină. Etapa iniţială a O-

manozilării are începutul în reticolul endoplazmatic, în cazul în care un singur reziduu de

manoză este transferat de la O-dodecil-fosfat-manoză pe reziduurile de serină/treonină, de un

complex de şapte enzime O-manoziltransferaze. Etapele ulterioare se derulează în aparatul Golgi

şi sunt catalizate de manoziltransferaze utilizând GDF-manoza. Manozilfosfaţii servesc ca donori

de zahăr principali în ambele căi de sinteză a mananilor [105, 128, 181, 184].

Un rol important în biosinteza mananilor din pereţii celulari ai drojdiilor S. cerevisiae îl

joacă GFI, codificat de gena MCD4. Scăderea nivelului de GFI ataşat de proteinele din peretele

celular determină de asemenea o scădere a nivelurilor de manan şi o creştere a nivelului de β –

(1,6) glucan alcalinoinsolubil şi chitină în peretele celular [178]. Unele GFI proteine sunt ele

însele transglicozidaze active ce joacă un rol indispensabil în sinteza peretelui celular [126].

Page 22: Oleg Chiselita Thesis

22

Imobilizarea celulelor de S. cerevisiae stimulează biosinteza polizaharidelor şi

mananproteinelor peretelui celular. Imobilizarea are loc datorită reacţiei între grupările

aldehidice ale substratului şi aminogrupele proteinelor disponibile ale suprafeţei celulare. Faptul

acesta duce la majorarea sintezei β-1,3-, β-1,6-glucanilor şi mananproteinelor [151].

Mananproteinele joacă un rol predominant în menţinerea integrităţii peretelui celular,

supus acţiunii diferitor enzime, presiunilor înalte şi temperaturilor scăzute [118].

Lanţurile mananproteice sunt principalele imunogene la drojdii, iar la S. cerevisiae

manoza terminală, legată α (1→3), este şi imunodominantă. Datele sumare privind determinanţii

imunochimici la drojdii sugerează că aceştia au o structură şi funcţie comparabilă cu cea a

antigenelor bacteriene [93, 220].

Studiile referitor la localizarea mananproteinelor în pereţii celulari ai drojdiilor din mai

multe genuri au arătat că ele reprezintă învelişul exterior al peretelui celular, având legături de

diferită natură cu fosfaţii, piruvaţii, acizii glucuronici, etc. Fosfatul din mananproteinele peretelui

celular este sursa majoră a sarcinilor electrice negative de pe suprafaţa celulelor de drojdii [93,

199].

Chitina - alt polizaharid detectat prin diferite metode (acetilare alcalină parţială, difracţie

în raze X, absorbanţă în infraroşu) în pereţii celulari ai multor genuri de drojdii: Hansenula,

Pichia, Zygosaccharomyces, Saccharomyces, Candida, Nadsonia ş.a. Chitina este un

aminopolizaharid cu moleculele liniare constituite în exclusivitate din reziduuri de N-

acetilglucozamină legate β-(1→4). Lanţurile lungi au o greutate moleculară comparabilă cu a

celulozei. Chitina din pereţii celulari ai drojdiilor are, de regulă, caracter amorf. Chitina cristalină

formează o unitate celulară care este ortorombică ( a=4,76Å; b =10,28Å; c =18,25Å), conţinând

4 reziduuri de N-acetilglucozamină. Rezistenţa sa la hidroliza acidă se explică prin hidroliza

legăturilor amidice din lanţurile laterale acetil-aminate, care lasă expuse grupele amino-

cationice. Ea reprezintă circa 1 - 2% din substanţa uscată a peretelui celular al drojdiilor care

înmuguresc şi de 3 ori mai mult la formele fusionabile şi miceliene. Se apreciază, că la drojdiile

care înmuguresc chitina este localizată la nivelul cicatricei mugurale, iar septul transversal

primar ce separă celula mugurală de celula-mamă este constituit numai din acest

aminopolizaharid [172]. Chitina formează în peretele celular un strat intern de microfibrile

cristaline implantate într-un strat amorf. Se presupune că defectele peretelui celular sunt

compensate de majorarea activităţii chitinsintetazei şi creşterea sintezei chitinei [45].

Sinteza peretelui celular, în special sinteza elementelor structurale – chitinei şi glucanilor

este strâns legată de membrana plasmatică şi elementele ei. Aşa, formarea chitinei este

coordonată prin biosinteza fosfatidilcolinei şi sterinelor. Veziculele microorganismelor ce

Page 23: Oleg Chiselita Thesis

23

sintetizează chitină conţin 3 chitinsintetaze, numite CS I, CS II şi CS III, care sunt active la

diferite valori ale pH-ului, în prezenţa ionilor de Mg2+ şi Co2+, iar membranele lor sunt bogate în

lipide [172, 205].

Conform ipotezelor actuale sinteza predecesorului chitinei - UDF-N-acetil-D-

glucozaminei se începe de la [14C] tregaloză [92, 172]. Conform uneia din aceste ipoteze, la

temperaturi înalte tregalozo-6-fosfatul diminuează stabilitatea termică a primei enzime a

biosintezei zaharurilor – glutamin fructozo-6-fosfat-amino-transferazei şi a altor enzime din

metabolismul chitinei. Mutaţiile în sinteza tregalozei sunt înalt pleotrofe şi pot acţiona asupra

metabolismului carbohidraţilor care nu au legătură directă cu sinteza tregalozei. În aşa mod,

sinteza chitinei în peretele celular al fungilor corelează, probabil, cu sinteza lipidelor

membranare şi a tregalozei care stabilizează membranele la stresuri, evitând distrugerea lor

[182].

Chitina are un important rol structural: prezenţa ei conferă peretelui celular o deosebită

rezistenţă la acţiunea unor agenţi fizici, chimici şi biologici. Peretele celular al S. cerevisiae este

o structura elastica care asigură o protecţie osmotică şi stabileşte forma celulei. Stratul interior

este în mare măsură responsabil de rezistenţa mecanică a peretelui şi oferă de asemenea site-uri

de racordare pentru proteinele care formează stratul exterior al peretelui. Stratul exterior de

proteine, de asemenea, limitează permeabilitatea peretelui celular, astfel protejând membrana

plasmatică de atacurile diferitor enzime străine şi altor compuşi care-i perturbează structura.

Principalele caracteristici ale organizării moleculare a peretelui de drojdii sunt acum cunoscute.

Important este, că compoziţia moleculară şi de organizare a peretelui celular poate varia

considerabil. De exemplu, încorporarea multor proteine în peretele celular este temporară şi

depinde mult de condiţiile de mediu. În mod similar, formarea complexelor proteico –

polizaharidice, specifice peretelui celular, este puternic afectată de condiţiile externe, ceea ce

indică asupra unui regulament strict de construcţie a peretelui celular [163].

Drojdiile genului Saccharomyces au o istorie lungă de utilizare în diferite ramuri ale

economiei. Datorită eficacităţii in producerea etanolului, S. cerevisiae fără dubii este cel mai

principal microorganism comercial. Folosit la producerea pâinii, berii şi vinurilor, cel mai vechi

utilizat de om microorganism a stat şi la baza primelor procese biotehnologice din lume. Cu

dezvoltarea metodelor noi ale geneticii contemporane S. cerevisiae din nou se află în prim planul

perfecţionărilor în biotehnologie.

Drojdiile prezintă numeroase avantaje pentru cercetările de inginerie genetică, cu scopul

obţinerii unor preparate farmaceutice şi vaccinuri noi, servind în biotehnologia modernă ca

„instrumente” de manipulare a genelor.

Page 24: Oleg Chiselita Thesis

24

Tulpinile de drojdii S. cerevisiae genetic modificate cultivate pe medii nutritive cu

diferite surse de N, C, P, săruri minerale, ioni ai metalelor, vitamine şi inhibitori ai

scualensintetazei, sintetizează cantităţi esenţiale de farnezolă şi geranilgeraniolă, care au

capacitatea de a fixa moleculele de proteină pe membrana celulară şi posedă capacităţi

antimicrobiene, antivirale şi antitumorale, ce dă posibilitatea de a le folosi la tratarea bolilor

neurodegenerative imune, trombozei, aterosclerozei, cancerului şi la inhibarea procesului de

îmbătrânire a pielii [191].

Tulpina S. cerevisiae 60-Д578 genetic modificată este producător activ al interleukinei-2

umane [66].

Biomasa unei tulpini de drojdii S. cerevisiae cultivată pe medii semisintetice serveşte ca

materie primă pentru producerea unei mărci comerciale de preparate medicinale ce posedă

acţiune antioxidantă, anticitolitică şi antiinflamatoare - „Рексод”. Substanţa funcţională de bază

a preparatului este superoxiddismutaza (SOD) recombinantă a omului. Tehnologia dă

posibilitatea de a obţine cantităţi considerabile de SOD cu o activitate de 500.000 un/mg.

Preparatul are mari perspective de utilizare în oftalmologie, traumatologie, terapia şocurilor

termice şi traumatice, la tratarea maladiilor acute şi cronice ale ficatului, bolilor cardiace, diferitor

stări de gripă şi boli ale pielii [67].

Biomasa drojdiilor S. cerevisiae conţine cantităţi relevante de proteină, bogată în

aminoacizi esenţiali şi imunoactivi: izoleucina, leucina, tirozina, valina, fenilalanina, arginina

etc. [156, 208, 221], ubichinonă (compus glicoproteic) şi diferiţi compuşi lipidici, aşa ca sterolii,

acizii graşi polinesaturaţi: linoleic C18:2 şi α-linolenic C18:3 şi toată gama acizilor graşi

polinesaturaţi ω 3 şi 6, ce se folosesc la tratarea bolilor cardio-vasculare, distrofiei musculare,

paradantozei, diabetului zaharat şi care de asemenea, minimalizează efectul toxic al preparatelor

chimioterapeutice [135, 136, 149, 190 233].

Biomasa de drojdii S. cerevisiae este o sursă excepţională de fosfolipide şi conţine:

lecitina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol şi

fosfatidilinozitol, fapt care relevă, că această biomasă este o materie primă de perspectivă pentru

obţinerea fosfolipidelor destinate producerii medicamentelor [137, 193].

Pentru obţinerea ergosterolului (provitamina D - substanţă antirahitică), larg aplicată în

medicină şi veterinărie, sunt utilizate diferite tulpini de drojdii S. cerevisiae [77, 115 198].

Steroizii hidroxilaţi şi acetilaţi sintetizaţi de drojdiile genului Saccharomyces cultivate pe

medii de cultură ce conţin predecesori ai acestora (∆5 şi ∆4-3ß-hidroxisteroizi, pregnenolon,

dehidroepiandrosteron ş.a.) şi-au găsit utilizare la tratarea maladiilor sistemului imunitar,

Page 25: Oleg Chiselita Thesis

25

diferitor forme ale cancerului, boli ale sistemului cardiovascular şi a maladiilor

neurodegenerative, ca de exemplu boala Parkinson şi Alzheimer [188].

În baza biomasei de drojdii îmbogăţite cu iod şi cu ioni de Cr, Fe, Se, Zn şi Mn se

elaborează preparate curative şi profilactice, diferite suplimente alimentare şi furajere [61, 232].

Esenţială pentru valorificarea drojdiilor de vin este şi prezenţa complexului de vitamine

B. Conform informaţiilor din literatură în biomasa lor este prezentă întreaga gamă a vitaminelor

grupei B, riboflavina, tiamina, acidul nicotinic şi folic [33, 37, 58].

Astfel, S. cerevisiae prezintă un mare potenţial pentru dezvoltarea unor tehnologii

orientate spre producerea substanţelor biologic active de mare valoare, cum ar fi carbohidraţii,

proteinele şi lipidele.

1.2. Activitatea biologică a carbohidraţilor drojdiilor genului Saccharomyces

Carbohidraţii reprezintă cele mai cunoscute şi răspândite substanţe pe Pământ şi se

caracterizează printr-o structură foarte variată. Polizaharidele sunt polimeri biologici cu un rol

impunător în activitatea vitală a organismelor vii, fapt care este determinat atât de complexitatea

lor structurală, cât şi de compoziţia monozaharidică variată şi tipurile de legături glicozidice

dintre acestea. Interesul sporit faţă de polizaharidele bioactive naturale, remarcat în ultimii ani,

se datorează multiplelor aplicaţii ale acestora în cele mai diverse ramuri: industria alimentară şi

cea a cosmeticelor, medicină şi farmaceutică, zootehnie şi veterinărie, ecologie şi protecţia

plantelor, industriile extractibile etc. În această ordine de idei, un interes deosebit prezintă

polizaharidele microbiene, obţinerea cărora din punct de vedere economic este mult mai

avantajoasă celor de origine animală şi vegetală.

Un loc deosebit printre polizaharidele microbiene îl ocupă proteomananii şi β-glucanii, ce

formează straturile externe şi interne ale pereţilor celulari şi sunt componenţii polimerici de bază

a drojdiilor şi bazidiomicetelor, îndeplinind funcţia de barieră osmotică, protecţie contra

agenţilor patogeni, adeziune celulară, de menţinere a structurii şi rigidităţii celulare etc. β-

glucanii drojdiilor au o semnificaţie biomedicală deosebită datorită activităţii lor antivirale şi

antibacteriene [165, 183, 201], imunomodulatoare [98, 113, 215, 236] şi anticancerigene [237,

239, 243]. Derivaţii sulfataţi ai β-glucanilor au demonstrat in vitro activitate antiproliferativă

impotriva celulelor sarcomei 180 (S-180) [240]. Mai mult ca atât, β-glucanii prezintă substanţa

activă de bază la elaborarea noilor vaccinuri anticancerigene polivalente [196]. În combinaţie cu

alte substanţe biologic active, β-glucanii au capacitatea de a reduce disponibilitatea toxinelor din

tractul digestiv, mecanismul acestui proces fiind bazat pe complexarea toxinelor cu catena

polizaharidică cu ajutorul legăturilor de hidrogen şi Van der Waals [242].

Page 26: Oleg Chiselita Thesis

26

În experienţele asupra şobolanilor s-a demonstrat acţiunea inhibitoare a β-glucanilor

asupra paradontozei, influenţa lor reglatoare asupra sistemului hipotalamo-hipofizo-

corticosuprarenal, de stimulare a fagocitozei, precum şi eficacitatea lor în tratarea diabetului

zaharat [91 100].

Există date recente în literatura de specialitate care sugerează posibila aplicare a

derivaţilor β-glucanilor de drojdii în tratamentul artritei [164].

Recent s-au dovedit proprietăţile hipocholesterolemice, anticoagulante, anticitotoxice,

antimutagene, antiproliferative [179] şi antioxidante [213] ale β-glucanilor, făcându-le substanţe

promiţătoare ca promotori de sănătate.

(1-3)-β-glucanul este un marcher pentru diagnosticarea infecţiilor pulmonare cu genul

Aspergillus şi de evaluare a efectului terapeutic al tratamentului administrat [238]. Actualmente

se desfăşoară studii vaste asupra posibilităţii utilizării β-glucanului din drojdiile S. cerevisiae ca

imunomodulator care poate avea o acţiune favorabilă asupra simptomelor de astm şi alte boli

alergice. Acestea sunt primele studii care arată că administrarea subcutanată a particulelor de β -

1-3-glucan duce la creşterea în ser a nivelului de interleukină-10 la astmatici, ce ar face posibilă

modularea sensibilităţii alergice [209].

O direcţie de perspectivă a aplicării β-glucanilor este acvacultura. În experienţele asupra

crevetelor şi peştilor s-au demonstrat efectele acestora asupra diferenţierii celulelor T helper,

profilarea expresiei genice, acţiunea benefică asupra nivelului funcţional prin inducerea de

rezistenta la boli, creşterea viabilităţii şi masei larvelor [106, 154].

Polizaharidele obţinute din S. cerevisiae prezintă un interes special în domeniul

produselor alimentare, iar acest microorganism, datorită faptului că a fost utilizat de către om

pentru fabricarea produselor alimentare de secole, oferă cea mai bună garanţie a inofensivităţii

lor. Administrarea orală a β-D-glucanilor este bine tolerată, nu afectează palatabilitatea

produselor alimentare şi nu are efecte toxice. Efectele lor bioactive şi funcţionale sunt

determinate de greutatea moleculară, gradul de ramificare şi natura acestora. Având în vedere

efectele sănătoase ale β-glucanilor, este recomandată ingestia de alimente bogate în aceste

substanţe. Astfel de alimente sunt legumele, cerealele şi în special fibra de drojdii

Saccharomyces, care conţine β-glucani cu cel mai mare număr de proprietăţi benefice raportate

[152].

Glucanii pot fi folosiţi ca agenţi de îngroşare pentru produsele alimentare, cum ar fi

cremele, îngheţata, sosurile, etc. şi utilizate, datorită capacităţii lor de a absorbi şi reţine cantităţi

mari de apă, pentru stabilizarea emulsiilor şi mărirea viscozităţii produselor. În plus, atunci când

sunt adăugate la produsele alimentare lichide, acestea provoacă senzaţia de o consistenţă grasă,

Page 27: Oleg Chiselita Thesis

27

chiar dacă polizaharidele sunt lipsite de grăsimi libere. Polizaharidele nominalizate sunt adecvate

pentru utilizarea ca adjuvant tehnologic în prepararea produselor de panificaţie, cum ar fi pâinea,

biscuiţii, produsele de patiserie şi altele [227].

Glucomananii drojdiilor posedă acţiune radio-fotoprotectoare semnificativă împotriva

consecinţelor patologice ale expunerii pielii la lumină solară cu lungimea de undă scurtă, razele

ultraviolete (UV), radiaţii. Experienţele in vivo şi in vitro au arătat, că mecanismele de protecţie

a pielii se bazează pe expresia factorului nuclear kappa B indusă de sintaza oxidului nitric,

suprimarea prostaglandinei E2 şi interleukinei 1α. şi, cel mai important, pe stimularea

hematopoezei [206, 230]. Aceste proprietăţi ale polizaharidelor face posibilă utilizarea lor

practică în farmaceutică şi cosmetologie ca parte componentă a diferitor geluri şi creme [68].

Mananoligozaharidele drojdiilor posedă capacităţi de diminuare a acţiunii toxice a

aflatoxinelor, care reprezintă una din cele mai periculoase grupe de micotoxine permanente în

furaje, prin intermediul cărora nimeresc în produsele lactate şi agricole consumate de om [175,

207]. Mecanismul acţiunii este bazat pe capacitatea mananilor de a diminua deteriorarea ADN-

ului, indusă de aflatoxine, prin formarea unui complex supramolecular între toxine şi manan

[176].

Suplimentarea raţiei furajere a animalelor cu pereţii celulelor de drojdii îmbunătăţesc

răspunsul imun împotriva infecţiilor, fapt care se datorează prezenţei mananilor în peretele

celular şi relevă posibilitatea folosirii acestora ca adjuvant în furaje [125].

Caracteristicile importante ale mananilor izolaţi din pereţii celulari de drojdii, cum ar fi

solubilitatea înalta în apă, greutatea moleculară relativ mică (15-30 kDa), proprietăţile

antimutagenice şi antioxidante, bazate pe reducerea radicalilor reactivi de oxigen, sunt

promiţătoare pentru utilizarea lor ca un potenţial protector antimutagenic natural [168].

1.3. Influenţa condiţiilor şi modului de cultivare asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme

1.3.1. Influenţa surselor de carbon şi azot asupra sintezei carbohidraţilor la

microorganisme

Cele mai multe specii de drojdii se dezvoltă pe medii ce conţin zaharuri ca sursă de

carbon, săruri de amoniu ca donori de azot, săruri minerale şi factori de creştere.

Deoarece drojdiile genului Saccharomyces pot asimila numai hexoze, pentru cultivarea

lor se folosesc materiile prime cu conţinut de amidon sau de alţi hidraţi de carbon ce pot fi

scindaţi în hexoze. Tot mai des ca materie primă se utilizează melasa din sfeclă de zahăr, foarte

Page 28: Oleg Chiselita Thesis

28

accesibilă economic, care pe lângă zaharoză mai conţine şi o serie de alţi componenţi, aşa ca

zahărul invertit (amestec de D-glucoză şi D-fructoză), betaina, acizi organici [2].

În cazul obţinerii unor produse de înaltă puritate, folosite ulterior la producerea

chimicalelor, medicamentelor, remediilor cosmetice, adaosurilor alimentare şi furajere, ca sursă

de carbon este utilizată pe larg glucoza [24].

Glucoza este cel mai abundent monozaharid în natură, precum şi sursa de carbon şi de

energie preferată pentru cele mai multe organisme, inclusiv drojdii [94, 153, 169].

Calea pentru catabolismul glucozei în S. cerevisiae este glicoliza, dar o varietate de alte

zaharuri de asemenea poate fi utilizată ca sursă de carbon şi energie prin această cale. Fructoza şi

glucoza sunt uşor fosforilate şi intră în glicoliză în mod direct, în timp ce galactoza şi manoza

sunt mai întâi convertite la glucoză-6-fosfat şi fructoză-6-fosfat, respectiv, înainte de a intra în

glicoliză. Di-, tri- şi oligozaharidele trebuie să fie hidrolizate în monozaharide, care pot intra în

calea glicolitică. Zaharoza, prin urmare, este hidrolizată în glucoză şi fructoză de invertază,

maltoza în glucoză prin maltaze (α-D-glucozidază) şi melibioza în galactoză de melibiaze (α-D-

galactozidaze). Poli- şi trizaharidele constând din unul sau mai multe tipuri de zahăr sunt

hidrolizate în monozaharide printr-o combinaţie de enzime. Rafinoza, de exemplu, este redusă în

monozaharidele galactoza, glucoza şi fructoza prin eforturile combinate ale melibiazei şi

invertazei. Amidonul necesită glucoamilaze pentru a fi hidrolizat până la glucoză [238].

Mecanismele prin care celulele de drojdii detectă prezenţa surselor de carbon în mediul de

cultură au fost investigate de mai mulţi autori [94, 153, 200]. Cele mai multe dintre aceste lucrări

s-au concentrat pe glucoză, cu toate că există date importante privind utilizarea surselor de

carbon, cum ar fi galactoza şi maltoza. S. cerevisiae este o drojdie glucofilă care s-a adaptat

pentru a utiliza optim o gamă largă de concentraţii de glucoză şi alte zaharuri [169]. Această

specie este într-adevăr caracterizată de mai multe mecanisme de înaltă specializare, care să-i

permită să perceapă şi să comunice rapid nivelul de glucoză din mediu mecanismelor de

reglementare a celulei, fapt ce rezultă cu utilizarea rapidă şi totală a glucozei din mediu.

Reglementarea transportului surselor de carbon, nivelul de exprimare a genelor ce reglează calea

glicolitică sunt exemple de mecanisme direct reglementate de glucoză, care permit S. cerevisiae

a răspunde eficient la fluctuaţiile concentraţiei glucozei în mediul nutritiv [119].

Tulpinile de drojdii de vin S. cerevisiae cultivate pe medii de nutriţie cu conţinut mixt de

glucoză şi fructoză, asimilează în primul rînd glucoza, fructoza nefiind asimilată complect. În

acelaşi timp, în mediile ce conţin numai una din aceste 2 hexoze, fructoza este asimilată mai

rapid şi cu o eficienţă mai mare. Însă, în timpul fermentaţiei, această preferinţă nu este un

parametru fix şi depinde de proprietăţile inerente ale tulpinii de drojdie şi condiţiile externe.

Page 29: Oleg Chiselita Thesis

29

Adăugarea de etanol în mediu are un efect inhibitor asupra utilizării fructozei, iar suplimentarea

cu azot asimilabil inhibă utilizarea glucozei [87].

Mecanismul metabolic cel mai proeminent pentru detecţia glucozei implică hexochinaze,

enzime necesare pentru fosforilarea hexozelor înainte de intrarea în glicoliză. Genele

responsabile de gluconeogeneză şi respiraţie, precum şi de utilizarea surselor de carbon

alternative, cum ar fi maltoza sau zaharoza, sunt grav reprimate în prezenţa glucozei sau altor

surse de carbon rapid fermentabile [121].

Glucoza este un compus indispensabil şi strict necesar pentru buna sinteză a peretelui

celular şi funcţia sinergică a glucozidazelor şi tuturor enzimelor implicate în acest proces [214].

Ea este responsabilă de activarea enzimelor membranei plasmatice. Aceste enzime au roluri

multiple în organisme: mediază fluxul de ioni şi protoni în membrana celulară, reglînd pH-ul şi

protejează celula de cationii toxici [80, 86].

UDF-D-glucoza, precursorul şi donatorul de zahăr de bază în procesul de sinteză a β-

glucanului şi a formării peretelui celular, este sintetizat de la D-glucoză. Celulele de drojdii S.

cerevisiae au o rezervă citoplasmatică mare de UDF-D-glucoză care ar putea fi folosită pentru

sinteza peretelui celular [107, 223].

Un număr mare de studii sugerează, că sensibilitatea celulelor la oxidanţi şi stresul

oxidativ depinde de intensitatea metabolismului celular şi de concentraţia de glucoză. De fapt,

celulele de drojdii care folosesc surse de carbon fermentabile şi, prin urmare, se bazează în

principal pe glicoliză pentru producerea energiei sunt mai sensibile la stresul oxidativ.

Întreţinerea şi adaptarea metabolismului energetic joacă un rol important în capacitatea celulei de

a răspunde la deteriorarea ADN-ului. Conţinutul mare de glucoză în mediul de cultivare

declanşează o inhibiţie rapidă a respiraţiei, care este însoţită de o suprimare puternică a

glicolizei. În plus, are loc activarea căii pentozo-fosfat şi acumularea de glicogen şi tregaloză.

Aceste condiţii în cele din urmă duc la o scădere semnificativă a nivelului de ATP [162].

Spre deosebire de drojdiile saharomicete, drojdiile din genul Kluyveromyces au un

răspuns complet diferit la majorarea concentraţiei glucozei în mediul de cultivare. Ca exemplu

poate servi tulpina K. marxianus ATCC 26548, care fiind cultivată în condiţii aerobe, la pH-5,0,

temperatura 30°C şi concentraţii mari de glucoză ca unică sursă de carbon sintetizează până la

71,9% S.U. de proteine şi numai 9,6% S.U. de carbohidraţi [129].

La cultivarea S. cerevisiae pe medii cu glucoză, peptonă, extract de drojdii, extract de

malţ, cu adăugarea ionilor de Mn2+ şi Mg2+, după optimizarea parametrilor de cultivare s-a reuşit

majorarea randamentului de obţinere a β-glucanului în intervalul ± 3,5% şi de biomasă în

limitele ± 5,5% [161].

Page 30: Oleg Chiselita Thesis

30

La cultivarea continuă a S. cerevisiae pe medii cu diferite concentraţii de glucoză s-a

determinat, că conţinutul de β-glucan şi rezistenţa peretelui celular la β-glucanază a fost mai

mare în faza staţionară de creştere şi dezvoltare a drojdiei. Pe baza rezultatelor obţinute a fost

selectată pentru producţia β-glucanului solubil o tulpină de S. cerevisiae cu productivitatea de β-

glucani de 0,095 g/l [170].

Influenţa ingredientelor mediului de cultură, cum ar fi sursa de carbon şi azot, ioni

anorganici, precum şi activitatea enzimelor implicate în sinteza mananproteinelor la S. cerevisiae

a fost evaluată pe mediu de cultură care conţine 4,9 g/100 ml zaharoză, 4,4 g/100 ml pepton, 3,1

g/100 ml extract de drojdii şi 2,2 g/100 ml glicerol. Pe acest mediu sinteza mananului a crescut

de la 82,7 ± 3,4 mg/100 ml la 162,5 ± 3,5 mg/100 ml. A fost evaluată şi influenţa pH-ului iniţial,

volumului inocumului şi a mediului de cultură, temperaturii asupra sintezei mananului. În

conformitate cu datele obţinute, acest parametru a fost maxim la pH- 5, volumul inocumului - 5

ml, temperatura +32°C. Producţia maximă de manani a crescut până la 258,5 ± 9,1 mg/100 ml

[138]. Este evident că producţia de manani este în mod semnificativ influenţată de compoziţia

mediului de cultură şi de condiţiile de cultivare.

Sinteza polizaharidelor la S. cerevisiae este de asemenea influenţată şi de GFI-proteinele

peretelui celular. Diminuarea nivelului acestor proteine în peretele celular duce la scăderea

nivelului de manan şi creşterea nivelului de β-1-6-glucan insolubil şi chitină [178].

După cum a mai fost menţionat, drojdiile pot să crească pe diferite surse de carbon, care

influenţează dezvoltarea lor. Astfel, trebuie să se aştepte la o modificare a compoziţiei şi

structurii peretelui celular induse de natura sursei de carbon. Cu toate acestea, trebuie luat în

considerare şi modul de cultivare, pentru că în flacoane cu agitare parametrii de cultivare, cum ar

fi pH-ul şi disponibilitatea oxigenului sunt stabilite la începutul cultivării şi foarte mult variază în

funcţie de evoluţia dezvoltării microorganismului, în timp ce în reactoare aceşti parametri pot fi

păstraţi constanţi pe tot parcursul procesului de fermentaţie. Cultivarea drojdiei S. cerevisiae în

aceste două moduri diferite în prezenţa diferitor surse de carbon a condus la date relevante

despre structura peretelui celular şi proporţia relativă β-glucan: manan, care a variat în

dependenţă de natura sursei de carbon. Aceste variaţii au fost mai evidente în celulele de drojdii

cultivate în flacoane la agitator, decât în fermentator. În termeni cantitativi, s-a constatat că

drojdiile cultivate în fermentator au avut masa peretelui celular cu 20-35% mai mică şi conţineau

de 2-3 ori mai multă chitină decât drojdiile cultivate în flacoane pe agitator. Studiul conţinutului

de β-glucani în drojdiile cultivate în prezenţa diferitor surse de carbon a arătat o majorare a

cantităţii glucanilor de la 14 ± 2,5% S.U. în culturile crescute pe glucoză, manoză şi zaharoză

până la 21 ± 3% S.U. în cele cultivate pe etanol. În acelaşi timp, la aceste culturi peretele celular

Page 31: Oleg Chiselita Thesis

31

a constituit doar 10-12% din masa uscată, iar celulele au fost mai rezistente la acţiunea litică a

zimolazelor şi a dispozitivelor mecanice de distrugere a pereţilor celulari [78].

Zaharoza ca sursă de carbon şi sulfatul de amoniu ca sursă de azot s-au dovedit a fi

optime pentru sinteza exopolizaharidelor de către tulpina de drojdii Sporobolomyces

salmonicolor AL1. Sinteza polizaharidelor este însoţită de micşorarea pH-ului mediului de la 5,3

iniţial până la 1,7-2,0 final. În timpul procesului de biosinteză, indicele viscozităţii dinamice a

mediului de cultivare cu 5,0% zaharoză şi 0,25% sulfat de amoniu a crescut până la 15,37 mPas,

iar cantitatea de polizaharide a ajuns până la 5,63 g/l la o cultivare la temperatura de +22°C timp

de 120 ore. Polizaharidul extras are un grad înalt de puritate şi este constituit din glucoză

(54,1%), manoză (42,6%) şi fucoză (3,3%) [192].

Acumularea carbohidraţilor de rezervă, glicogenului şi tregalozei în culturile de S.

cerevisiae corelează negativ cu rata specifică de creştere. În acelaşi timp, surplusul de glucoză în

mediul de nutriţie şi limitarea elementelor nutritive N, P, Ca duce la acumularea intensă a acestor

carbohidraţi de stocare [130, 133, 185].

Pentru studierea influenţei surselor de carbon nefermentabile asupra conţinutului de

tregaloză şi glicogen la drojdiile din genul Pichia, acestea au fost cultivate pe medii cu glicerină

şi metanol. La cultivarea pe mediul cu metanol cantitatea tregalozei şi glicogenului acumulat a

fost foarte mic, în special la P. anomala. Însă, tot această cultură pe mediul cu glicerină a

sintetizat cantităţi substanţiale de tregaloză (9,3 mg/g de biomasă umedă). În biomasa de P.

anomala şi P. farinosa cultivate pe medii cu glicerină conţinutul de glicogen de asemenea a fost

mic. Totodată, la creştere pe metanol conţinutul de tregaloză la P. farinosa s-a majorat până la

5,8 mg/g. Pe mediul cu glicerină P. farinosa a sintetizat mai multă tregaloză. Pe acelaşi mediu P.

angusta a acumulat cantităţi esenţiale de glicogen şi tregaloză - 4,9 şi 12,3 mg/g biomasă umedă,

respectiv. Cultivarea drojdiei S. cerevisiae pe mediul cu glicerină duce la majorarea drastică a

conţinutului de glicogen şi tregaloză în biomasă. Acumularea tregalozei se începe la sfîrşitul fazei

lag şi rămâne la nivel înalt pe toată durata fazei staţionare [74].

Cercetătorii Babitskaya V. şi Shcerba V. au studiat sinteza endo- şi exopolizaharidelor de

către Ganoderma lucidum pe medii cu diferite surse de carbon: glucoză, arabinoză, xiloză,

galactoză, manoză, lactoză, amidon, fructoză, zaharoză şi maltoză. Pentru sinteza

polizaharidelor, mai eficiente s-au dovedit a fi glucoza, lactoza şi amidonul. Conţinutul de

endopolizaharide a constituit 8,5-9,5 g/l, de exopolizaharide – 4,0 – 4,8 g/l. Cantitatea de

polizaharide şi productivitatea ciupercii se majorau odată cu creşterea concentraţiei sursei de

carbon în mediu. Însă eficacitate economică optimă (calculată conform raportului dintre

cantitatea de sursă introdusă în mediu şi cantitatea produsului final) s-a obţinut pe mediile cu

Page 32: Oleg Chiselita Thesis

32

concentraţia surselor de carbon de 30 g/l. Mărirea concentraţiei până la 50 g/l nu a dus la

majorarea conţinutului de polizaharide sintetizate. Studiind acţiunea diferitor surse de azot

organice şi anorganice introduse în mediul nutritiv împreună cu cantităţi minime de extract de

porumb (0,2%) asupra sintezei polizaharidelor la G. lucidum, rezultate remarcabile s-au obţinut

numai pentru sulfatul de amoniu. Cantităţi maxime de endopolizaharide s-au obţinut pentru

raportul C:N în mediul nutritiv egal cu 18, iar de exopolizaharide - pentru raportul de 25.

Optimizând mediile nutritive, s-a reuşit o majorare a cantităţii de endopolizaharide sintetizate cu

17,6 – 32,6%, iar de exopolizaharide - cu 29,2– 57,5% [35].

Ca şi în cazul surselor de carbon, S. cerevisiae a dezvoltat mecanisme care permit

utilizarea rapidă şi optimă a mai multor surse de azot preferenţiale şi reprimarea utilizării

surselor de azot mai puţin favorabile. Acest fenomen şi mecanismul de bază au fost denumite

„regulamentul de azot”. Surse de azot, precum amoniacul, glutamatul şi glutamina sunt descrise

ca surse de azot preferenţiale, care asigură o rată de creştere mult mai ridicată decât sursele

considerate sărace, cum ar fi prolina, arginina sau ureea [116, 147]. Pentru a utiliza orice compus

care conţine azot, celule de drojdie trebuie să-l transforme în glutamină sau glutamat. Compuşii

azotaţi se sintetizează în celulele de drojdii, folosind produsele asimilării sursei de carbon şi

glutamatul sau glutamina ca donator de azot [226].

Astfel, drojdiile S. cerevisiae sunt capabile să utilizeze o gamă largă de surse de carbon şi

azot, dar nu toate dintre acestea sunt utilizate cu o eficienţă egală.

1.3.2. Compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie – factori reglatori ai proceselor

biosintetice microbiene

Cercetări vaste, ce ţin de utilizarea compuşilor coordinativi în biotehnologie în scopul

reglării cantitative şi calitative a proceselor de biosinteză a substanţelor bioactive au fost iniţiate

de către academicianul Valeriu Rudic şi continuate de discipolii săi. Aceste cercetări au

demonstrat eficienţa aplicării compuşilor coordinativi în calitate de reglatori ai productivităţii şi

biosintezei substanţelor bioactive (proteine, ficobiliproteine, carotenoizi, polizaharide, lipide,

acizi graşi polinesaturaţi, astaxantină ş.a.) de către diferite tulpini de microalge şi cianobacterii

[9, 10, 14, 15, 23, 26, 71, 204].

Diferite grupuri taxonomice de microorganisme utilizează metalele în diverse scopuri.

Cianobacteriile, de exemplu, utilizează cuprul pentru sinteza plastocianinei tilacoidale, zincul

pentru sinteza anhidrazei carbonice, cobaltul pentru sinteza cobalaminei, magneziul pentru

sinteza clorofilei α, fierul pentru sinteza ficobilinelor, molibdenul pentru sinteza nitrogenazei

heterocistice, manganul pentru funcţionarea sistemului de fotooxidare a apei ş.a. [81, 90, 202].

Page 33: Oleg Chiselita Thesis

33

Cuprul este un metal esenţial pentru toate organismele vii, inclusiv microorganisme,

deoarece mediază o mare varietate de procese biochimice importante. Însă în concentraţii înalte

cuprul este extrem de toxic pentru celula gazdă. Acest caracter paradoxal necesită o procedură

foarte reglementată de acumulare, transport, şi excreţie a cuprului în celulă. Un grup important

de proteine implicate în specificarea acţiunii ionilor de cupru la eucariote sunt metaloproteinele.

Datele microscopiei luminiscente, de emisie şi spectrale demonstrează, ca ionii de cupru sunt

încorporaţi în metaloproteinele celulelor de drojdie S. cerevisiae. Aceste tehnici furnizează

informaţii cu privire la mecanismul de absorbţie a cuprului de către drojdii. Acest mecanism este

compus din 2 etape, prima dintre care durează 6 ore, are o rată de absorbţie înaltă şi este

dependentă de concentraţia iniţială de cupru în mediul de cultivare. A doua etapă are o rată mai

lentă a absorbţiei, dar cinetica este independentă de concentraţia iniţială. În final acest proces

duce la stocarea ionilor cupru sub forma de Cu-metalotionină [194].

Transportul de magneziu în mitocondrii joacă un rol important în Mg2+-homeostaza

celulară şi în regulamentul funcţiilor celulare şi mitocondriale. Studiile fiziologice indică faptul

că absorbţia mitocondrială a Mg2+ este un proces electrogen, dependent de potenţialul negativ al

membranei plasmatice. Dar proteinele implicate în acest proces rămân necunoscute, şi afluxul

ionilor de Mg2+ în mitocondrii se efectuează mai degrabă prin căi de scurgere nespecifice, decât

cu ajutorul proteinelor de transport specifice [157]. Sulful are o importanţă colosală în iniţierea

replicării ADN-ului şi diviziunii celulare, ca parte componentă a enzimelor cheie ale acestui

proces [89]. Ionii de Fe2+ determină conţinutul vitaminei B2 în celulele drojdiilor [232].

Acetaţii, de regulă, acţionează ca inductori în unele procese de biosinteză a principiilor

bioactive [20]. Rolul acetaţilor în procesul de biosinteză a carbohidraţilor, constă în includerea

lor în procesul de biosinteză al acetil coenzimei A, care este o verigă indispensabilă în diverse

procese metabolice. Metabolizarea ulterioară a acetil coenzimei A are loc în ciclul acizilor

tricarboxilici (Krebs) (figura 1.2), care la microorganismele eucariote este o cale metabolică, cu

funcţii energetice şi biosintetice. În aşa mod acetil CoA serveşte ca precursor în procesele de

biosinteză a acizilor graşi, lipidelor, unor aminoacizi şi a carbohidraţilor. Gluconeogeneza începe

de la oxaloacetat, produs intermediar al ciclului Krebs care se petrece în mitocondrii. Deoarece

membrana mitocondriala este impermeabilă pentru acesta, el este convertit în malat sub acţiunea

malatdehidrogenazei mitocondriale, în prezenţa de NADH provenit din degradarea acizilor grasi.

Memebrana mitocondriala fiind permeabila pentru malat, acesta ajunge în citoplasmă, unde este

reconvertit la oxaloacetat sub acţiunea malatdehidrogenazei citoplasmatice. În continuare,

oxaloacetatul ajuns în citosol sub acţiunea fosfoenolpiruvat carboxichinazei formeaza

fosfoenolpiruvatul. Fosfoenolpiruvatul este apoi convertit la fructozo-1,6-bifosfat, prin

Page 34: Oleg Chiselita Thesis

34

parcurgerea în sens invers a reacţiilor glicolizei. Prin pierderea unei molecule de fosfor cu

participarea fructozobifosfatazei, fructozo-1,6-bifosfat este transformat în fructozo-6-fosfat, care

la rândul său sub acţiunea hexozoizomerazei este transformat în glucozo-6-fosfat, care conduce

la formarea de glucoză sau de glucozo-1-fosfat, utilizat în sinteza polizaharidelor.

Fig. 1.2. Ciclul acizilor tricarboxilici (Krebs), după Thomas M. Devlin 2006 [228].

Sunt bine studiate efectele multor ioni bivalenţi: Mn2+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+

si Cd2+ asupra activităţii manoziltransferazelor implicate direct în sinteza mananproteinelor.

Rezultatele au arătat, că activitatea enzimatică a fost diminuată în absenţa ionilor de metal. În

acelaşi timp absenţa ionilor de Mn2+ a dus practic la inhibarea totală a activităţii

manoziltransferazelor [229].

Ionii de Mn2+ întră în componenţa unor metaloenzime reprezentate prin fosfodiesteraze,

glutationsintetaze, acetil-CoA-sintetaze, cu rol în diverse funcţii biosintetice în celula microbiană

(sinteza carbohidraţilor, proteinelor, lipidelor) [20].

Alt microelement indispensabil pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismelor este

Zn, ionii căruia se acumulează preponderent în vacuolele celulare. El este un microelement

important cu proprietăţi antioxidante, care iniţiază numeroase reacţii biochimice şi fiziologice în

celulă. Din multitudinea de enzime zinccomponente, un rol important le revine anhidrazei

carbonice, carboxipeptidazei, fosfatazei alcaline, ADN şi ARN polimerazei, unor dehidrogenaze

Acetat exogen

Page 35: Oleg Chiselita Thesis

35

[148, 197]. Prin intermediul acestora, zincul participă la procesele de oxido-reducere, sinteza

substanţelor biologic active.

Răspunsul drojdiilor S. cerevisiae la disponibilitatea ionilor de Zn2+ a fost investigat la o

rată fixă de creştere în conformitate cu limitarea şi abundenţa sursei de Zn în cultura chemostat

cu adiţionarea diferitor surse de carbon, azot şi aeraţie. Rezultatele au arătat o scădere

substanţială a nivelului de glicogen şi tregaloză în culturile limitate după Zn2+. S-a demonstrat

rolul zincului în reglementarea genelor Zn2+dependente, implicate în depozitarea şi metabolismul

glucidelor. Aceste date sugerează o implicare mai proeminentă a ionilor de Zn2+ în biogeneza şi

funcţiile celulei de drojdie, decât era relevat până în prezent [109].

Acumularea ionilor de Zn2+ în celulele drojdiilor de bere S. cerevisiae (carlsbergensis)

din mediul de cultură, inclusiv din mustul de malţ, este rapidă şi începe imediat după inocularea

tulpinii. În contrast, la debutul fermentării, asimilarea altor cationi bivalenţi, cum ar fi Mg2+ si

Ca2+ nu este la fel de pronunţată. Diminuarea cantităţii de Zn2+ în mediul de cultivare duce la

stoparea esenţială a creşterii şi diviziunii celulelor de drojdii. Aceste date sunt importante, aşa

cum procesele de fermentaţie industrială pot fi ocazional suprimate din cauza deficienţii de zinc

[110].

În acelaşi timp, creşterea optimă este limitată la o gamă îngustă de Zn2+ concentraţii, care

ilustrează echilibrul dintre deficitul de micronutrienţi şi toxicitate [82].

Cultivarea drojdiilor S. cerevisiae pe medii cu includerea unor microelemente, zinc, cupru,

mangan în concentraţie de 0,1 g/l, la diferite condiţii de aerare şi pH stimulează productivitatea

culturii. În condiţii anaerobe prezenţa microelementelor duce la creşterea productivităţii biomasei

cu 10%. La o aerare minimă productivitatea biomasei creşte cu 30%. Valorile optimale ale pH-ului

mediului pentru toate microelementele s-au dovedit a fi 4,0-5,0 [217].

Datele disponibile sugerează că superoxiddismutaza (SOD), care joacă un rol important

în protejarea celulei eucariote împotriva modificărilor oxidative, ce duc la îmbătrânirea celulelor,

conţine cupru şi zinc (Cu-ZnSOD). Epuizarea Cu-ZnSOD în celule de S. cerevisiae duce la o

reducere a nivelului de proteine specifice, responsabile de transportul substanţelor nutritive în

mitocondrii. Aceste modificări duc la mitocondriopatie şi, ulterior, la diminuarea duratei de viaţa

şi afectarea procesului de multiplicare a celulelor de drojdii [159].

Cercetările recente ale savanţilor moldoveni au evaluat efectul stimulator al

compuşilor coordinativi ai manganului şi zincului asupra sintezei carbohidraţilor de către

cianobacterii [20], a SOD de către cianobacterii şi microalge [22].

Deci, din cele menţionate anterior, putem evidenţia rolul important al microelementelor

în procesele metabolice ale microorganismelor.

Page 36: Oleg Chiselita Thesis

36

1.3.3. Influenţa factorilor fizici ai mediului de cultivare asupra sintezei

carbohidraţilor la microorganisme

Factorii fizici ai mediului de cultură au, de asemenea, o influenţă semnificativă asupra

creşterii şi metabolismului microorganismelor. Temperatura de cultivare, pH-ul, aeraţia mediului

şi durata procesului de cultivare determină activitatea fiziologică a culturilor şi acţionează asupra

proprietăţilor şi compoziţiei biochimice a microorganismelor.

Cercetările privind influenţa temperaturii, pH-ului şi aeraţiei mediului de cultivare asupra

sintezei polizaharidelor de către Ganoderma lucidum au arătat, că temperatura de +25-30ºC este

optimală pentru aceste procese. Cultura posedă capacitate de a creşte într-un spectru larg de

valori ale pH-ului de la 3,0 până la 7,5 şi mai sus. Productivitatea maximală după biomasă s-a

determinat la un pH iniţial de 6,0-7,0 şi o aeraţie a mediului de 0,555-0,325 g O2/l oră. Scăderea

pH–lui de la 6,0 la 4,0 şi a aeraţiei până la 0,155 g O2/l oră a dus la intensificarea sintezei

polizaharidelor. Optimizarea condiţiilor de cultivare nu a avut niciun efect asupra compoziţiei

calitative a polizaharidelor, glucanii constituind partea principală a lor [35]. Date similare au

obţinut şi alţi autori [114].

Temperaturile scăzute activează mecanismele responsabile de creşterea şi multiplicarea

drojdiei de vin şi măresc viabilitatea celulelor. În plus, vinurile fermentate la temperaturi scăzute

posedă calităţi organoleptice înalte. Acest fapt corelează cu creşterea sintezei de către drojdii a

acizilor graşi cu catena scurtă (C4-C8), şi a esterilor corespunzători, responsabili de calităţile

organoleptice ale vinului [123].

Şocul termic duce la schimbări radicale în metabolismul celulei, provocând deteriorarea

membranelor, denaturarea şi agregarea proteinelor celulare. Majorarea temperaturii induce

sinteza proteinelor şi tregalozei, care protejează celula de aceste deteriorări. Datele din literatură

ne indică faptul, că în timpul şocului termic la drojdiile S. cerevisiae creşte esenţial concentraţia

formelor active a oxigenului ce conţin anioni superoxidanţi (O2-), peroxid de hidrogen (H2O2) şi

radicali hidroxili (OH-) toxici pentru celulă. Sinteza acestor compuşi toxici duce la distrugerea

membranelor, denaturarea proteinelor şi ADN- ului şi moartea celulelor [108, 218].

Temperatura optimală de creştere şi dezvoltare (µmax 0,159-0,156 oră-1) a tulpinii de

drojdii Yarrowia lipolytica №1 la pH-ul mediului de 4,5 este de 27-28°C. La scăderea

temperaturii până la 23°C se micşorează puţin şi viteza specifică de multiplicare a culturii (µmax

0,143 oră-1), iar majorarea ei până la 29-30°C duce la scăderea esenţială a acestui parametru de

cca 1,9 ori (µmax 0,097 oră-1). Temperatura în acest interval practic nu influenţează asupra

conţinutului de proteină din biomasă. Majorarea temperaturii de cultivare până la 29-30°C

influenţează, însă, conţinutul de microelemente din biomasă (cantitatea de Fe, Zn şi Ca creşte, iar

Page 37: Oleg Chiselita Thesis

37

de P, Mg şi Cu - scăde). pH-ul optim de cultivare la 28°C este de 4,0-5,0 ( µmax 0,198-0,199 oră-

1). În intervalul de pH de la 7,0 până la 3,2 viteza specifică de multiplicare se păstrează la un

nivel înalt (µmax 0,163-0,182 oră-1), iar la scăderea pH-ului mai jos de 3,2 are loc inhibarea

esenţială a dezvoltării drojdiei (µmax 0,043 oră-1) şi activităţi lipolitice a tulpinii [46].

Temperatura optimă de acumulare a biomasei de către Agaricus blazei este de +28°C, iar

de biosinteză a polizaharidelor - de +30°C. Însă polizaharidele sintetizate la această temperatură

se caracterizează printr-o activitate biologică scăzută, în comparaţie cu cele sintetizate la

temperatura de +24°C. Acest fapt se datorează conţinutului sporit de β-glucan în polizaharidele

sintetizate la temperatura mai joasă [103].

Experienţele asupra ciupercii Aspergillus niger au demonstrat, că cantitatea şi calitatea

glucanilor şi chitinei depinde de stadiul ontogenezei şi că acumularea complexului chitino-

glucanic este strâns legată de stoparea proceselor de multiplicare. Prin urmare, procesul de

majorare a cantităţii de chitină şi glucani în celulă este o reacţie de răspuns a acesteia la acţiunea

factorilor nefavorabili ai mediului, adică a factorilor de stres [75].

Procesele de acumulare a biomasei şi polizaharidelor la cultivarea submersă a culturii

Bacillus subtilis practic coincid în timp şi depind mult de temperatura de cultivare şi de pH-ul

iniţial al mediului nutritiv [54].

La cultura de actinomicete Nocardia dassonvillei procesul de biosinteză a polizaharidelor

începe în faza lag de dezvoltare a microorganismului şi îşi atinge maximul în faza staţionară. În

faza de declin sinteza polizaharidelor se micşorează. Componenţa calitativă a polizaharidelor din

citoplasmă şi peretele celular este similară, fiind diferit raportul cantitativ dintre monomerii

constitutivi [166].

Celule de drojdie S. cerevisiae prezintă o durată de viaţă finită, care este în general

dependentă de numărul de diviziuni suportate. Drept consecinţă a îmbătrânirii, celulele de drojdii

suferă modificări în termeni de fiziologie, morfologie şi expresie a genelor. Aceste caracteristici

influenţează absorbţia de zahăr, producţia de metaboliţi, proprietăţile de floculare, care depind de

structura peretelui celular. Proprietăţile de fermentare, potenţialul de floculare şi hidrofobic al

celulelor de drojdii cresc odată cu vârsta. Toţi aceşti parametri în final determină eficacitatea

industrială a tulpinilor de drojdii [104].

1.4. Concluzii la capitolul 1

Sinteza cunoştinţelor acumulate până acum în ceea ce priveşte conţinutul cantitativ şi

calitativ al carbohidraţilor, acţiunea lor biologică impunătoare şi perspectiva utilizării în diverse

domenii ale farmaceuticii, cosmetologiei, veterinăriei, industriei alimentare, precum şi

Page 38: Oleg Chiselita Thesis

38

posibilităţile utilizării drojdiilor S. cerevisiae în calitate de producători ai acestor compuşi

confirmă faptul că:

٠Printre microorganismele capabile să sintetizeze carbohidraţi, specia S. cerevisiae se

evidenţiază ca un producător performant, depăşind esenţial alte microorganisme, proteomananii

şi β-glucanii reprezentând substanţele de bază ale complexelor glucidice fungice.

٠Datorită proprietăţilor antivirale şi antibacteriene, imunomodulatoare şi imunostimulatoare,

hipocolesterolemice, anticoagulante, antitoxice, antimutagene, antiproliferative şi radio-

fotoprotectoare, carbohidraţii sunt recunoscuţi în calitate de substanţe biologic active, cu efect

benefic general asupra organismelor vii şi deschid calea de utilizare în cele mai diverse domenii.

٠Stimularea sintezei carbohidraţilor poate fi obţinută prin varierea componentelor

mediului nutritiv (sursei de carbon şi azot, stimulatorilor şi precursorilor specifici) şi condiţiilor

de cultivare (temperatura, pH-ul, durata de cultivare, aeraţia).

٠Căutarea noilor producători de carbohidraţi şi utilizarea surselor netradiţionale de aceşti

compuşi, cum ar fi drojdiile din sedimentele de vin, a fost şi rămâne actuală în prezent.

Problema de cercetare care rezultă din analiza efectuată constă în necesitatea depistării

producătorilor performanţi, selectarea mediilor şi condiţiilor optime de cultivare a acestora, care ar asigura

obţinerea biomasei cu un conţinut sporit de carbohidraţi ce garantează un efect economic înalt.

Direcţiile de soluţionare a problemei în viziunea autorului acestei lucrări sunt: selectarea

tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză al carbohidraţilor, elaborarea procedeelor de

cultivare a drojdiilor cu un potenţial biosintetic înalt prin asigurarea unei cantităţi maxime de

biomasă cu conţinut prognozat de carbohidraţi, prin aplicarea mediilor de cultură necostisitoare

şi realizarea procesului de cultivare la parametrii fizico-chimici optimi.

Soluţionarea problemei este posibilă prin realizarea scopului acestei lucrări: studierea

caracterelor fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de

biosinteză a carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase, care

va fi atins prin realizarea următoarelor obiective:

٠Izolarea din sedimentele de vin, selectarea şi studierea caracterelor morfo-culturale şi

fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor.

٠Evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim al productivităţii şi acumulării

carbohidraţilor în celulele drojdiilor selectate.

٠Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a tulpinilor de drojdii şi obţinere a biomasei

cu conţinut prognozat de carbohidraţi.

٠Elaborarea procedeelor de obţinere a unor bioproduse valoroase din drojdiile

sedimentelor de vin.

Page 39: Oleg Chiselita Thesis

39

2. METODOLOGIA CERCETĂRII ŞTIINŢIFICE

Cercetările au fost efectuate pe parcursul anilor 2007-2010 în cadrul laboratorului

Oleobiotehnologie al Institutului de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM.

2.1. Obiectul de cercetare

Ca obiecte de studiu au servit tulpinile de drojdii Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20

şi Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21, izolate în cultură pură din microflora spontană a

sedimentelor de la vinul roşu (Cabernet) şi alb (Chardonnay), oferite de Institutul Naţional

pentru Viticultură şi Vinificaţie din Republica Moldova, precum şi biomasa de drojdii din

sedimentele de vin. Tulpinile au fost izolate prin însămânţare în mai multe etape pe medii lichide

şi agarizate, în cadrul laboratorului Oleobiotehnologie al Institutului de Microbiologie şi

Biotehnologie al AŞM. Drept tulpini de referinţă au servit culturile de drojdii Saccharomyces

cerevisiae Rară-Neagră-2 şi Saccharomyces cerevisiae Cabernet-5 din CNMIV [29].

În calitate de reglatori şi stimulatori ai multiplicării, productivităţii şi activităţii

biosintetice a tulpinilor au fost utilizate o serie de zaharuri, acetaţi ai sodiului şi zincului, săruri

minerale şi compuşi coordinativi ai manganului şi zincului.

Zaharuri:

Glucoza, zaharoza, fructoza, manoza. Ca sursă complexă de carbon, azot, microelemente

şi vitamine s-a utilizat melasa.

Compuşii coordinativi:

1. Mn2Ac(2PyFX) – 1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-acetat;

2. Mn2Ac(2PyTCH) - 1,5-Bis(piridin)tiocarbohidrazid-dimangan-acetat;

3. Mn2Cl2(2PyFX) – 1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-diclorură, sintetizaţi de

D-l doctor V.Lozan (Institutul de Chimie al AŞM);

4. [Mn(Gly)2] Cl2 – sintetizat de dl acad. C. Turtă (Institutul de Chimie al AŞM);

5. clorură de monocloroacetat de zinc (LP-1);

6. clorură de tricloroacetat de zinc (LP-2);

7. clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil (LP-3);

8. tartrat de zinc imidazol (acid vinic) (LP-4) – sintetizaţi în laboratorul Chimie

anorganică al USM sub conducerea academicianului A. Gulea.

Săruri minerale:

Sulfat de mangan - (MnSO4•4H2O);

Sulfat de zinc – (ZnSO4•7H2O).

Page 40: Oleg Chiselita Thesis

40

Acetaţi:

Acetat de sodiu – (CH3COONa)•3H2O;

Acetat de zinc – (CH3COO)2Zn•2H2O).

Mediile de cultură:

Rieder: 30,0 g/l glucoză, 3,0 g/l (NH4)2SO4, 0,7 g/l MgSO4•7H2O, 0,5 g/l NaCl, 0,4 g/l

Ca(NO3)2, 1,0 g/l KH2PO4, 10 ml autolizat de drojdii, apă potabilă 1 l, pH- 5,0-6,0 [3].

Must de malţ [2].

YPD: 2% extract de drojdie, 2% pepton, 3% glucoză [79].

MGYP: 10 ml extract de malţ, 10 ml extract de drojdie, 5 g/l pepton, 10 g/l glucoză, 1l

apă distilată, pH-5,5 [161].

2.2. Metodele de investigaţie

În scopul realizării sarcinilor propuse au fost utilizate un şir de metode ce ţin de

determinarea productivităţii tulpinilor de drojdii, precum şi metode de investigare a conţinutului

biochimic al biomasei de drojdii, lichidului cultural şi extractelor obţinute din biomasă.

Caracterele morfologo-culturale şi fiziologice ale tulpinilor de drojdii au fost studiate

conform metodelor descrise în literatura de specialitate [2, 32, 85, 167].

Determinarea productivităţii şi substanţei uscate a tulpinilor a fost efectuată gravimetric

conform [41].

Determinarea numărului de celule la un volum de lichid cultural a fost efectuată

colorimetric conform [36].

Determinarea conţinutului de carbohidraţi în biomasa de drojdii şi lichidul cultural a

fost efectuată conform metodei spectrofotometrice cu utilizarea reactivului antron şi D-glucozei

în calitate de standard [21, 112].

Extragerea fracţionată a carbohidraţilorlor a fost efectuată conform procedeelor

descrise în literatura de specialitate ce au la bază utilizarea soluţiilor alcaline şi acide [28, 72].

Componenţa calitativă a fracţiilor glucidice a fost determinată prin metoda cromatografiei

în strat subţire (CSS) pe plăci Sorbfil. Compoziţia monozaharidică a glucidelor fiecărei probe a

fost determinată prin hidroliza cu soluţie de 1N H2SO4 în fiole sudate, la temperatura de 1000C

timp de 5 ore. Hidrolizatul obţinut a fost neutralizat cu BaCO3 şi centrifugat, supernatantul uscat

la +40 0C [132]. Developarea cromatogramelor a fost efectuată cu revelatori specifici în sistemul

„n-butanol-acid acetic-apă” (4:5:1) prin teste de reactivitate [47]. Plăcile cromatografice au fost

developate cu anilinftalat (aldopentoze – culoare roşie, aldohexoze - culoare cafenie) [132]. În

calitate de martor au fost utilizate glucidele simple din setul standard “SIGMA”.

Page 41: Oleg Chiselita Thesis

41

Extragerea lipidelor din biomasa de drojdii a fost efectuată prin metoda propusă de Folch

şi Bligh, preluată de Kates [160] şi adaptată la obiectul de studiu [5].

Extragerea fosfolipidelor s-a efectuat cu acetonă rece [160].

Extragerea sterolilor din drojdii a fost efectuată după metoda Lucniţkii [64] şi Usatîi [6].

Determinarea componenţei calitative a lipidelor a fost efectuată prin cromatografie în

strat subţire şi densitometrie [52], utilizând martori „SIGMA”.

Acizii graşi au fost determinaţi prin cromatografia gaz lichidă a esterilor metil ai acizilor

graşi [70] la cromatograful „CROM-5” în cadrul Institutului Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi

Tehnologii Alimentare, cu aportul specialistului Soboleva I.

Proteina a fost determinată spectrofotometric conform metodei Lowry [173].

Componenţa aminoacizilor şi azotului aminic au fost determinaţi în hidrolizatele acide

cu ajutorul analizatorului AAA-339 „Microtechna” (Cehia) [53] la Institutul de Fiziologie şi

Sanocreatologie al AŞM.

Pentru optimizarea condiţiilor de spălare, obţinere a autolizatului şi uscare a drojdiilor

din sedimentele de vin, au fost cercetate unele procedee care au la bază utilizarea diferitor

volume de apă, soluţii de NaCl, regimuri de temperatură şi durate de timp propuse în brevetele

de invenţii [59, 62, 63].

Analiza statistică şi regresională a datelor obţinute în 3 serii de determinări a fost

realizată prin metodele propuse de Maximov [50] şi Dospehov [40].

Page 42: Oleg Chiselita Thesis

42

3. MORFOLOGIA, FIZIOLOGIA ŞI PARTICULARITĂŢILE SINTEZEI

CARBOHIDRAŢILOR LA TULPINILE DE DROJDII SACCHAROMYCES

CEREVISIAE CNMN-Y-20 ŞI SACCHAROMYCES CEREVISIAE CNMN-Y-

21 SELECTATE DIN SEDIMENTE DE VIN

Diversitatea carbohidraţilor cu efect fiziologic pronunţat, precum şi spectrul larg al

domeniilor de utilizare al acestora relevă importanţa lucrărilor de selectare a producătorilor activi.

Studiul comparativ cu referinţă la potenţialul biosintetic al drojdiilor este un factor

determinant pentru screening-ul celor mai productive tulpini.

Capacitate de a sintetiza carbohidraţi posedă microorganisme din diferite grupe

taxonomice [75, 95, 101, 102, 141, 155, 166, 212].

Printre producătorii de polizaharide sunt reprezentanţi ai diferitor clase, familii, genuri şi

specii, însă cei mai mulţi aparţin drojdiilor şi bacteriilor. Din rândul drojdiilor din clasa Fungi

imperfecti putem menţiona genurile Candida, Rhodotorula, Torulopsis, iar din clasa Ascomyces

– genurile Saccharomyces, Hansenula, Debariomyces, care conţin până la 40-50% polizaharide

intracelulare [42].

Cercetând componenţa monozaharidică a carbohidraţilor la unele specii de drojdii, s-a

constatat preponderenţa glucozei, manozei, galactozei [51, 72, 73].

Drojdiile genului Saccharomyces sunt recunoscute ca producători performanţi de manani

şi β-glucani [78, 127, 138, 170].

Cercetările legate de structura peretelui celular la drojdiile genului Saccharomyces au

relevat trei componente majore: glucanii, mananproteinele şi chitina, care împreună prezintă în

aproximativ 90% din substanţa uscată a peretelui celular [13, 36, 163].

În vederea completării stocurilor de informaţii privind drojdiile cu potenţial înalt de

producere a carbohidraţilor, sunt necesare cercetări detaliate despre potenţialul bioproductiv al

acestora, componenţa monozaharidică a glucidelor, a zaharurilor complexe сu evidenţierea,

drept rezultat, a tulpinilor de perspectivă în vederea utilizării lor în diverse procese

biotehnologice.

3.1. Caracteristica taxonomică a tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21 selectate ca producători activi de carbohidraţi

Scopul cercetărilor rezumate în compartimentul ce urmează este izolarea din sedimentele

de vin a tulpinilor de drojdii cu capacitate sporită de sinteză a carbohidraţilor şi studierea

caracterelor lor morfo-culturale şi fiziologice.

Page 43: Oleg Chiselita Thesis

43

Obiecte ale studiului au servit tulpinile de drojdii izolate din microflora spontană a

sedimentelor de la vinul roşu (Cabernet) şi alb (Chardonnay), oferite de Institutul Naţional

pentru Viticultură şi Vinificaţie din Republica Moldova. Drept tulpini de referinţă au servit S.

cerevisiae Rară-Neagră-2 şi S. cerevisiae Cabernet-5 din CNMIV [29].

La etapa iniţială, prin mai multe pasaje pe medii agarizate prin metoda diluţiilor zecimale, au

fost izolate circa 700 colonii de drojdii din sedimentele de vin de masă roşu şi alb. Cercetările au

arătat, că caracterele culturale ale acestor drojdii variază în dependenţă de provenienţă. Culturile de

drojdii cu caractere asemănătoare au fost repartizate în 26 grupe (13 grupe provenite din sedimente

vinicole ale vinului alb şi 13 - din sedimentele vinului roşu). Din fiecare grupă a fost selectată câte o

tulpină denumită simbolic A1, A2,......A13 şi R1, R2,......R13. Ulterior la tulpinile selectate, au fost

studiate caracterele morfo-culturale şi determinat conţinutul de carbohidraţi la cultivare pe must de

malţ agarizat la temperatura de +28°C timp de 72 ore. Rezultatele sunt expuse în tabelul 3.1. Valorile

înregistrate ale conţinutului de carbohidraţi variază de la 10,6 la 30,5% S.U. Cantităţile maximale de

carbohidraţi au fost determinate la tulpinile A2 (29,7% S.U.) şi R4 (30,5% S.U.).

În continuare, la 14 din cele 26 tulpini de drojdii, caracterizate prin conţinut înalt de

carbohidraţi, au fost determinaţi indicii productivităţii biomasei şi capacităţii biosintetice la cultivarea

lor în profunzime pe 2 medii lichide - must de malţ şi Rieder, cu compoziţia, g/l: glucoză - 30,0,

(NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii -

10 ml, apă potabilă 1 l, pH- 5,0 [3], cu agitare (200 r.p.m.), la temperatura de +22-23°C timp de 72

ore. Conform rezultatelor obţinute, din cele 7 tulpini de drojdii selectate din sedimentele de vin roşu

(Cabernet), productivitate maximă manifestă culturile R4 şi R8, care au acumulat pe mediul must de

malţ 8,3 şi respectiv 7,3 g/l de biomasă uscată (figura 3.1). La determinarea conţinutului de

carbohidraţi în biomasa drojdiilor cercetate s-a constatat, că în condiţii similare de cultivare

tulpinile sintetizează cantităţi diferite de carbohidraţi şi au valori care variază între 21,3 – 30,8%

S.U., valoarea maximală înregistrându-se la tulpina R4 (figura 3.1).

Productivitatea tulpinilor de drojdii selectate din sedimentele de vin alb (Chardonnay)

variază de la 5,9 până la 7,1 g/l de biomasă uscată pe mediul cu must de malţ. Valorile maximale

au fost remarcate pentru tulpinile A2 şi A3 (7,1 g/l BAU) (figura 3.2). Conţinutul de carbohidraţi

la aceste tulpini pe mediul de cultură dat a variat între 25,8 - 33,1% S.U., valoarea maximală

aparţinându-i tulpinii A2 (figura 3.2).

Deoarece mediul în bază de must de malţ este un mediu natural, compoziţia biochimică a

căruia depinde de mai mulţi factori, în cercetările ulterioare ca mediu de referinţă a fost utilizat

mediul Rieder, care asigură sinteza unor cantităţi aproximativ echivalente de carbohidraţi şi

compoziţia căruia poate fi modificată după necesitate.

Page 44: Oleg Chiselita Thesis

44

Tabelul 3.1. Caracterele morfo-culturale şi conţinutul de carbohidraţi ai unor tulpini de drojdii cultivate pe medii agarizate

№ de ordine

Tulpini de drojdii

Tipul, diametrul coloniei

Consistenţa coloniei

Nuanţa, culoarea coloniei

Carbohidraţi, % S.U. X1± x1

Interval de confidenţă

1 A4 R, ø 4mm rotunde

Păstoasă, lucioasă

Cremă deschis

14,3±0,00 14,33÷14,35

2 A8 S, ø 4mm ovale

Păstoasă, mată

Cremă deschis

16,6±0,26 16,13÷17,03

3 A1 S, ø 4mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă 17,5±1,81 14,33÷20,61

4 A11 S/R, ø 5mm rotunde

Păstoasă, mată

Albă 17,7±0,39 17,02÷18,37

5 A10 R, ø 3mm ovale

Păstoasă, lucioasă

Albă-gălbui 17,9±0,52 17,03÷18,82

6 A7 S, ø 4mm rotunde

Mucoidă, mată

Albă-gălbui 18,6±0,65 17,47÷19,71

7 A6 S, ø 6mm rotunde

Mucoidă, mată

Albă 20,6±0,51 19,72÷21,5

8 A12 S, ø 6mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă-gălbui 21,3±0,91 19,71÷22,85

9 A9 S, ø 5mm apiculate

Mucoidă, mată

Cremă 22,2±0,39 21,5÷22,85

10 A13 S, ø 4mm rotunde

Mucoidă, mată

Albă 22,2±0,39 21,5÷22,85

11 A5 S, ø 3mm ovale

Mucoidă, lucioasă

Albă-gălbui 23,1±0,39 22,4÷23,74

12 A3 S/R, ø 6mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă 25,9±0,52 25,09÷26,88

13 A2 S, ø 5mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă-gălbui 29,7±0,84 28,22÷31,13

14 R11 S/R, ø 4mm rotunde

Grăsoase, mate

Albă 10,6±2,58 6,12÷15,06

15 R5 R, ø 3mm ovale

Păstoasă, mată

Albă 11,3±2,17 7,53÷15,06

16 R12 S, ø 6mm rotunde

Grăsoase, lucioase

Albă-roz 12,8±1,41 10,35÷15,24

17 R7 S/R, ø 4mm rotunde

Păstoasă, lucioasă

Albă-roz 16,7±1,22 14,59÷18,82

18 R2 S, ø 3mm apiculate

Mucoidă, mată

Albă-roz 19,8±0,54 18,82÷20,7

19 R8 S/R, ø 4mm ovale

Mucoidă, mată

Albă 20,0±1,49 17,41÷22,59

20 R1 S, ø 4mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă-roz 20,9±0,95 19,3÷22,59

21 R9 S, ø 5mm rotunde

Mucoidă, mată

Albă 22,3±1,77 19,29÷25,41

22 R13 S, ø 5mm ovale

Mucoidă, mată

Albă-roz 24,7±0,14 24,47÷24,94

23 R6 R, ø 3mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă 25,3±1,29 23,06÷27,53

24 R6 R, ø 3mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă 25,3±1,29 23,06÷27,53

25 R10 S, ø 4mm rotunde

Mucoidă, mată

Albă-roz 30,1±0,55 29,16÷31,06

26 R4 S, ø 5mm rotunde

Mucoidă, lucioasă

Albă-roz 30,5±0,75 29,17÷31,76

Legenda: S – netedă, R – rugoasă, S/R – intermediară. În tabel nu s-au inclus tulpinile cu conţinut scăzut de carbohidraţi.

Page 45: Oleg Chiselita Thesis

45

0

10

20

30

40

R3 R4 R6 R8 R9 R10 R13

Tulpina de drojdii

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

0246810

BA

U, g

/l

Carbohidraţi pe mediul must de malţCarbohidraţi pe mediul RiederProductivitatea pe mediul must de malţProductivitatea pe mediul Rieder

Fig. 3.1. Cantitatea de biomasă şi conţinutul de carbohidraţi la tulpinile de drojdii selectate din sedimentele de la vinul roşu (Cabernet).

010203040

A2 A3 A5 A6 A9 A12 A13

Tulpina de drojdii

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

02468

BA

U, g

/l

Carbohidraţi pe mediul must de malţCarbohidraţi pe mediul RiederProductivitatea pe mediul must de malţProductivitatea pe mediul Rieder

Fig. 3.2. Cantitatea de biomasă şi conţinutul de carbohidraţi la tulpinile de drojdii selectate din sedimentele de la vinul alb (Chardonnay).

În rezultatul selectării se propun în calitate de potenţiali producărori de carbohidraţi

tulpinile de drojdii R4 şi A2 cu capacitatea de a sintetiza până la 30,8 şi respectiv 33,1% S.U. de

carbohidraţi.

În continuare a fost studiată productivitatea, conţinutul de glucide şi componenţa

cantitativă a fracţiilor de carbohidraţi ai tulpinilor selectate la cultivarea lor pe mediile de cultură

Rieder [3] şi YPD cu compoziţia %: 2% extract de drojdie, 2% pepton, 3% glucoză [79], la

temperatura +22 - 23°C, pH-ul 5,5, timp de 5 zile.

Extragerea fracţionată a carbohidraţilor din biomasa de drojdii a fost efectuată conform

procedeului cu utilizarea apei, soluţiilor de alcalii şi acizi (vezi fig. 4.4, cap.4). Conţinutul

cantitativ al carbohidraţilor în biomasă şi în fracţiile obţinute a fost determinat prin metoda

spectrofotometrică [21, 112].

Page 46: Oleg Chiselita Thesis

46

În rezultatul cercetărilor s-a stabilit, că productivitatea ambelor tulpini selectate este mai

înaltă pe mediul YPD - 6,6-6,7 g/l BAU, comparativ cu 3,9-3,5 g/l BAU pe mediul Rieder.

Fracţia β-glucanilor insolubilă în alcalii şi acizi este predominantă la ambele tulpini, independent

de natura mediului de cultivare. Însă, valorile acestei fracţii sunt mai semnificative la cultivarea

tulpinilor pe mediul Rieder şi constituie 22,6 şi 21,0% S.U pentru tulpina R4 şi A2, respectiv.

Tulpinile de referinţă S. cerevisiae Cabernet-5 şi S. cerevisiae Rară-Neagră-2 la cultivare pe

mediul nutritiv Rieder sintetizează mai puţini carbohidraţi decât tulpinile selectate – 24,0 şi

respectiv 21,3% S.U. Fracţia β-glucanilor la aceste tulpini, de asemenea, este fracţia de bază a

carbohidraţilor, însă are valori mai mici şi constituie 16,0% S.U. la S. cerevisiae Cabernet-5 şi

14,2% S.U. la S. cerevisiae Rară-Neagră-2. Rezultatele sunt expuse în tabelul 3.2.

Deci, tulpinile selectate ca perspectivi producători de carbohidraţi posedă o activitate

biosintetică mai înaltă faţă de alţi producători cunoscuţi [78, 79]. În baza acestor rezultate a fost

obţinut un brevet de invenţie [4], vezi anexa 2.

Tabelul 3.2. Productivitatea, conţinutul cantitativ şi calitativ al carbohidraţilor la tulpinile

selectate, cultivate pe medii lichide Tulpina R4 Tulpina A2 S. cerevisiae

Cabernet-5 S. cerevisiae

Rară-Neagră-2 Nr

Parametrul precăutat

Mediul Rieder

Mediul YPD

Mediul Rieder

Mediul YPD

Mediul Rieder

Mediul

YPD

Mediul Rieder

Mediul

YPD

1 BAU, g/l X1± x1

3,9±0,03

6,6±0,06

3,5±0,00

6,7±0,02

3,5±0,30

-

3,3±0,30

-

2 Carbohidraţi, % S.U. X1± x1

33,5±1,45

16,7±1,46

30,5±0,95

14,9±1,14

24,0±0,81

-

21,3±0,80

-

3 Fracţia solubilă în H2O (mono-, di-zaharide), % S.U. X1± x1

1,5±0,26

0,3±0,05

1,5±0,20

0,4±0,05

1,3±0,03

-

1,6±0,03

-

4 Fracţia solubilă în NaOH 3% (mananproteine), % S.U. X1± x1

3,4±0,54

0,8±0,01

5,2±0,17

0,9±0,05

4,1±0,03

-

3,8±0,06

-

5 Fracţia solubilă în H2SO4 2% (de tip glicogen), % S.U. X1± x1

1,7±0,26

0,2±0,05

1,4±0,14

0,3±0,09

1,7±0,11

-

1,2±0,05

-

6 Fracţia insolubilă în alcali şi acizi (β-glucani), % S.U. X1± x1

22,6±0,49

15,3±1,33

21,0±0,56

12,2±0,41

16,0±0,23

-

14,2±0,60

-

7 Σ fracţiilor, % S.U. X1± x1

29,2±1,56

16,7±1,42

29,1±1,08

13,8±0,59

23,1±0,4

-

20,8±0,74

-

Page 47: Oleg Chiselita Thesis

47

Caracterele morfo-culturale şi fiziologo-biochimice ale tulpinilor de drojdii selectate

Pentru a determina apartenenţa taxonomică a tulpinilor R4 şi A2 au fost examinate

caracterele lor morfo-culturale şi fiziologice conform criteriilor clasice [2, 85, 167].

Tulpina R4, izolată din sedimente de la vinul roşu la cultivare pe must de malţ agarizat,

timp de 96 ore formează colonii rotunde, netede, mucoide, lucioase, de culoare alb-roză şi

mărimea 4-6 mm (figura 3.3). Celulele se reproduc prin înmugurire, uneori formează pseudohife,

tipul respiraţiei-aerob, formează asce persistente direct din celula diploidă şi ascospori rotunzi

sau ovali netezi, nu formează peliculă, pe medii lichide la frontiera dintre faza lichidă şi gazoasă

formează un inel caracteristic pe pereţii vasului, nu asimilează nitraţi şi ureaza. Fermentaţia +,

testul diazonium blue B (DBB) - . Asimilează glucidele: D-glucoza, zaharoza, fructoza, D-

maltoza, D-galactoza, D-manoza, D-xiloza, D-tregaloza. Nu asimilează: L-ramnoza, L-

inozitolul, D-manitolul, D-lactoza, D-celobioza, D-sorbitolul şi dulcita.

Temperatura optimă de dezvoltare a tulpinii de drojdii este de +15...20°C, pH-ul 5,5 –

6,5. Tulpina creşte bine pe mediul lichid must de malţ. La cultivare în profunzime pe mediul dat,

tulpina acumulează 8,3 g/l BAU, dintre care 30,8 % S.U. carbohidraţi.

Fig. 3.3. Aspectul coloniilor tulpinii R4 la cultivare pe mediul must de malţ agarizat, (scara 1:2).

Tulpina A2, izolată din sedimente de la vinul alb la cultivare pe must de malţ agarizat,

timp de 96 ore formează colonii rotunde, netede, mucoide, lucioase, de culoare albă-gălbuie şi

mărimea de 4-6 mm (figura 3.4). Celulele înmuguresc polar, uneori formează pseudohife, tipul

respiraţiei-aerob, formează asce persistente direct din celula diploidă şi ascospori rotunzi sau

ovali netezi, nu formează peliculă, pe medii lichide la frontiera dintre faza lichidă şi gazoasă

formează un inel caracteristic pe pereţii vasului. Fermentaţia + ; nitrat - ; ureaza - ; testul

diazonium blue B (DBB) - . Asimilează glucidele: D-glucoza, zaharoza, fructoza, D-maltoza, D-

Page 48: Oleg Chiselita Thesis

48

galactoza, D-manoza, D-tregaloza, D-xiloza. Nu asimilează: L-ramnoza, L-inozitolul, D-

manitolul, D-lactoza, D-celobioza, D-sorbitolul şi dulcita.

Temperatura optimă de dezvoltare a tulpinii de drojdii este de +15...20°C, pH-ul de 4,5 –

5,5. Tulpina creşte bine pe mediul lichid must de malţ. Cultivată în profunzime pe acest mediu,

tulpina acumulează 7,1 g/l BAU, dintre care 33,1% S.U. carbohidraţi.

Conform criteriilor sistematice a fost stabilit, că tulpinile de drojdii R4 şi A2 corespund următoarei

clasificări: încrengătura Eumycota, subîncrengătura Ascomycotina, clasa Hemiascomycetes, ordinul

Endomycetales, familia Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces, specia cerevisiae [2, 85, 167].

Fig. 3.4. Aspectul coloniilor tulpinii A2 la cultivare pe mediul must de malţ agarizat, (scara 1:2).

Tulpinile studiate au fost determinate şi depozitate în Colecţia Naţională de Microorganisme

Nepatogene sub denumirea de specie: (R4) - Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20 şi (A2) -

Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21 ca potenţiali producători de carbohidraţi [18], anexa 4.

Astfel, screening-ul a 26 de tulpini de drojdii din sedimente de vin a evidenţiat un nivel

variat al conţinutului de carbohidraţi în biomasa lor, cuprins între 10,6 – 30,5% S.U., la cultivare

pe mediu must de malţ agarizat.

Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cultivate pe

mediul Rieder se caracterizează prin valori înalte ale conţinutului de carbohidraţi (33,5 şi 30,5%

S.U. respectiv) şi β-glucan, valorile căruia ajung la 21,0 - 22,6% S.U. şi reprezintă obiecte de

perspectivă pentru biotehnologie.

3.2. Efectele nutrienţilor şi ale factorilor de mediu asupra multiplicării şi acumulării

carbohidraţilor în celulele drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21

Eficacitatea procesului biotehnologic bazat pe cultivarea în profunzime a

microorganismelor este determinată de mai mulţi parametri. Factorii de bază care influenţează rata

Page 49: Oleg Chiselita Thesis

49

de creştere şi biosinteza produsului final sunt concentraţia substratului nutritiv, temperatura şi

durata de cultivare, pH-ul mediului, aeraţia.

În funcţie de particularităţile fiziologo-biochimice ale tulpinilor microbiene, necesităţile

nutritive şi parametrii de cultivare sunt specifice fiecărui microorganism.

Scopul investigaţiilor la acest subcapitol este elucidarea preferinţelor nutritive ale tulpinilor

de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 pentru acumularea biomasei şi

sinteza carbohidraţilor în funcţie de sursele de carbon, microelemente sub formă de săruri minerale

sau compuşi coordinativi, precum şi determinarea condiţiilor fizico-chimice optime de cultivare.

3.2.1. Efectele surselor de carbon asupra multiplicării drojdiilor S. cerevisiae

CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi biosintezei carbohidraţilor

Organismele heterotrofe se bazează pe ingestia de molecule organice sau nutrienţi din

mediul înconjurător pentru a susţine producerea de energie şi biomasă. Organismele unicelulare au

o capacitate limitată de a stoca nutrienţi şi sunt, prin urmare, în modul cel mai direct dependente de

disponibilitatea lor. La astfel de organisme au evoluat numeroase mecanisme de adaptare şi

supravieţuire în condiţiile de schimbare permanentă a compoziţiei mediului de nutriţie. Natura

fenomenelor fenotipice, fiziologice şi moleculare induse de aceste schimbări a fost studiată bine,

mai ales la drojdiile S. cerevisiae. Aceste studii au scos la iveală o reţea de mecanisme de detectare

şi de semnalizare, care generează şi transmit informaţii despre starea nutriţională a mediului către

celule, care la rândul său pun în aplicare programe de dezvoltare specifice [119].

Componenţa mediului nutritiv influenţează în mare măsură proprietăţile morfologice şi

fiziologo-biochimice ale celulelor de drojdii. Studiul unor aspecte ale nutriţiei microbiene, legate

de creşterea, productivitatea biomasei, sporogeneza, biosinteza principiilor bioactive şi

dependenţa acestor parametri de condiţiile de cultivare, este necesar pentru elaborarea diferitor

metode de reglare a acestor procese. Optimizarea parametrilor de cultivare şi ca rezultat creşterea

acumulării biomasei şi biosintezei principiilor biologic active influenţează mult calitatea şi

productivitatea procesului biotehnologic, calitatea şi activitatea biologică a preparatelor.

Procesele metabolice sunt influenţate de sursele de nutriţie, de introducerea în mediul de

nutriţie a diferitor precursori ai biosintezei, elementelor chimice indispensabile, vitaminelor şi

stimulatorilor. Cunoaşterea interdependenţei dintre condiţiile de cultivare şi procesele fiziologice

din celulele microbiene permite de a regla creşterea şi dezvoltarea microorganismelor, precum şi

biosinteza produşilor necesari. Astfel, menţinând condiţiile de cultivare necesare, pot fi dirijate,

într-o anumită măsură, procesele fermentative şi acumularea biomasei cu conţinut biochimic

prognozat [42].

Page 50: Oleg Chiselita Thesis

50

Eficacitatea procesului biotehnologic bazat pe cultivarea în profunzime a

microorganismelor este determinată în primul rând de parametrii fizici şi chimici ai mediului de

cultură lichid, de calitatea şi cantitatea surselor de carbon şi azot.

Din cele expuse, este evidentă oportunitatea selectării unor componente ale mediului de

cultivare, care ar putea fi utilizate în scopul sporirii productivităţii drojdiilor şi obţinerii biomasei

cu conţinut sporit de carbohidraţi.

În vederea stabilirii mediului optim ce va asigura cantităţi înalte de carbohidraţi, a

fost evaluat gradul de biosinteză al acestor compuşi la cultivarea tulpinilor S. cerevisiae

CNMN-Y 20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 pe medii nutritive lichide, folosite în practica

microbiologică pentru cultivarea producătorilor de carbohidraţi. Rezultatele sunt expuse în

tabelul 3.3.

Tabelul 3.3. Evaluarea productivităţii şi sintezei carbohidraţilor tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y

20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 la cultivarea pe medii lichide cu compoziţie diversă S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21 Nr Denumirea

mediului

Sursa

bibliografică BAU,

g/l

X1± x1

Carbohidraţi,

% S.U.

X1± x1

BAU,

g/l

X1± x1

Carbohidraţi,

% S.U.

X1± x1

1 YPD Aguilar-Uscanga B. 2007 [79]

6,6±0,06

16,7±1,46

6,7±0,02

14,9±1,14

2 MGYP Kiran M. 2005 [161]

3,8±0,03

13,9±0,20

-

-

3 Must de malţ Anghel I. 1991 [2]

8,3±0,50

30,8±2,30

7,1±0,03

33,1±1,50

4 Rieder Anghel I. 1993 [3]

3,9±0,03

33,5±1,45

3,5±0,01

30,5±0,95

Conform rezultatelor, tulpinile studiate sintetizează cantităţi semnificative de carbohidraţi

pe mediul sintetic Rieder, iar productivitatea este maximală pe mediile mai bogate în azot: YPD

şi must de malţ. Acest fapt se explică prin aceea, că în mediile bogate în azot are loc

multiplicarea rapidă şi acumularea intensă de biomasă, pe când în mediile limitate după azot,

după epuizarea acestuia, se intensifică procesele biosintetice în celulă.

Conform studiilor de specialitate, microorganismele utilizează un număr variat de

substanţe organice ca sursă principală de carbon şi energie.

Glucoza este utilizată pentru cultivarea drojdiilor şi producerea de antibiotice, steroli,

xantan şi diferite heteropolizaharide, acid butiric, tartric, acetic, aminoacizi, etc. [24, 186].

Page 51: Oleg Chiselita Thesis

51

Zaharoza, adăugată în mediul de cultură sub formă de melasă sau pură este utilizată ca substrat

major pentru obţinerea acidului citric, producerea drojdiei de bere, panificaţie şi a adaosurilor

biologic active în baza lor, acizilor organici, aminoacizilor, polizaharidelor [2, 25, 39, 60, 192].

Maltoza prezentă în malţ provenit de la fabricarea berii, este folosită pe larg la prepararea

mediilor de laborator pentru cultivarea drojdiilor [2].

Vital pentru microorganisme este azotul. El este adăugat în mediile de nutriţie sub formă

de săruri de nitraţi sau amoniu [57, 61]. Frecvent se utilizează ureea, extractul sau autolizatul de

drojdie, extractul de porumb, făina de soia şi porumb, pepton, etc. [150, 191, 241].

În această ordine de idei, în faza ulterioară a investigaţiilor a fost studiată influenţa

separată a unor surse de carbon asupra multiplicării tulpinilor de drojdii S. cerevisiae

CNMN-Y 20 şi S. cerevisiae CNMN-Y 21 şi biosintezei carbohidraţilor. Ca mediu nutritiv

de referinţă pentru cultivarea submersă a drojdiilor a fost folosit mediul Rieder [3], deoarece

este un mediu cu o compoziţie biochimică determinată, în care putem substitui sursa de

carbon, celelalte componente rămânând nemodificate. În unele variante experimentale

concentraţia glucozei din mediul Rieder a fost modificată în limitele de concentraţie de la 20

la 100 g/l, iar în alte variante glucoza a fost substituită cu monozaharidele: fructoza (în

concentraţie de la 20 la 100 g/l), manoza (de la 20 la 80 g/l); dizaharidul zaharoza (20 - 100

g/l). De asemenea, în loc de glucoză a fost utilizată melasa – sursă de C, N, microelemente şi

vitamine în concentraţie de 10 - 80 g/l. Cultivarea s-a efectuat pe un agitator rotativ (200 r. p.

m.), la temperatura de 23-25°C, timp de 72 ore.

Rezultatele cercetărilor ale indicilor multiplicării şi sintezei carbohidraţilor pentru

tulpinile S. cerevisiae CNMN –Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 sunt reflectate în

tabelul 3.4 şi 3.5, respectiv.

Prin analiza datelor obţinute s-a constatat, că sursele de carbon prezente în mediul

nutritiv manifestă acţiune selectivă asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor la

tulpinile în studiu.

Productivitatea maximală a drojdiilor s-a înregistrat pe mediul în care glucoza a

fost substituită prin melasă, sporul de biomasă variind în dependenţă de concentraţia

utilizată de la 7,4 până la 192,6% faţă de martor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20

(tabelul 3.4) şi de la 45,8 până la 212,5% faţă de martor la S. cerevisiae CNMN-Y-21

(tabelul 3.5).

Substituirea glucozei din mediul martor cu zaharoză şi manoză nu a influenţat

semnificativ multiplicarea drojdiilor, numărul de celule oscilând în jurul valorilor mediului

martor.

Page 52: Oleg Chiselita Thesis

52

Multiplicarea activă a ambelor tulpini de drojdii a fost observată şi în variantele ce

conţin diferite concentraţii de fructoză. Numărul de celule a fost cu 10,6 – 45,5% mai mare

comparativ cu martorul pentru S. cerevisiae CNMN –Y-20 (tabelul 3.4) şi 5,6 – 37,1%

pentru S. cerevisiae CNMN –Y-21 (tabelul 3.5).

La estimarea activităţii de sinteză a carbohidraţilor am stabilit, că substituirea

glucozei prin sursele de carbon cercetate, cu excepţia manozei, asigură valori mai ridicate

ale conţinutului de carbohidraţi, comparativ cu cele determinate pe mediul de referinţă.

Tabelul 3.4. Influenţa sursei de carbon asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor de către tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20

Nr Sursa de carbon

Conc. sursei de carbon,

g/l

Numărul de celule,

1x 106 ml-1 X1± x1

% M Productivitate BAU

g/l

% M Carbohidraţi, % S.U. X1± x1

% M

1 Glucoza 20 40 60 80

100

11,9±0,42 12,8±0,94 14,7±1,19 14,6±1,60 14,1±0,84

96,7 104,1 119,5 118,7 114,6

2,7 2,4 2,9 2,7 2,7

100 88,9

107,4 100 100

26,2±0,45 27,9±0,74 33,2±3,14 26,6±3,13 27,3±3,78

86,7 92,4

110,0 88,1 90,4

2 Zaharoza 20 40 60 80

100

12,4±1,16 13,9±1,15 13,5±0,51 13,4±0,91 13,0±0,65

100,8 113,0 109,7 108,9 105,7

2,4 2,9 3,3 3,3 2,9

88,9 107,4 122,2 122,2 107,4

29,5±0,39 36,4±3,59 31,6±2,95 30,3±3,67 29,4±4,25

97,7 120,5* 104,6 100,3 97,3

3 Fructoza 20 40 60 80

100

13,6±0,12 16,3±0,05 16,6±0,11 17,5±0,24 17,9±0,02

110,6 132,5* 134,9* 142,2* 145,5*

2,9 3,3 3,5 3,5 3,5

107,4 122,2* 129,6* 129,6* 129,6*

27,3±0,57 30,2±0,03 39,1±0,84 32,5±0,30 30,6±1,38

90,4 100,0

129,5* 107,6 101,3

4 Manoza 20 40 60 80

12,3±0,22 13,0±0,22 14,2±0,45 13,0±0,21

100,0 105,7 115,4 105,7

2,7 2,7 2,7 2,9

100 100 100

107,4

27,6±0,93 25,0±0,31 22,5±0,05 24,0±1,37

91,3 82,8 74,5 79,5

5 Melasa 10 20 40 60 80

14,0±0,80 22,4±1,29 28,7±1,51 34,0±1,21 31,4±2,66

113,8 182,1* 233,3* 276,4* 255,2*

2,9 4,9 6,8 7,9 7,5

107,4 181,5* 251,8* 292,6* 277,8*

32,9±2,69 40,9±2,31 32,8±0,45 31,8±1,32 31,0±0,87

108,9 135,4* 108,6 105,3 101,3

6 Rieder (martor)

30

12,3±0,68

100

2,7

100

30,2±1,26

100

* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

Efect stimulator pentru ambele tulpini S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae

CNMN –Y-21 a fost obţinut la substituirea în mediul nutritiv a glucozei prin zaharoză –

Page 53: Oleg Chiselita Thesis

53

60 g/l, fructoză în concentraţie de 60 g/l, sau melasă – 20 g/l, în prezenţa cărora tulpina

S. cerevisiae CNMN-Y-20 a acumulat cu 20,5 - 35,4% mai mulţi carbohidraţi faţă de

mediul martor, iar tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21, la aceste concentraţii a acumulat cu

38,3 - 43,8% mai mulţi carbohidraţi. Majorarea concentraţiei sursei de carbon în mediul

de cultură până la 80-100 g/l în majoritatea cazurilor condiţionează un efect mai moderat

în acumularea carbohidraţlor de către ambele tulpini.

Efectul moderat al manozei se explică prin necesitatea convertirii ei în fructozo–6 fosfat

înainte de a intra în procesele metabolice.

Tabelul 3.5. Influenţa sursei de carbon asupra multiplicării şi sintezei carbohidraţilor de către tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-21

Nr Sursa de carbon

Conc. sursei de carbon,

g/l

Numărul de celule,

1x 106 ml-1

X1± x1

% M Produc tivitate BAU

g/l

% M Carbohidraţi, % S.U. X1± x1

% M

1 Glucoza 20 40 60 80

100

11,4±0,26 11,9±0,03 13,9±0,32 15,1±0,97 12,4±1,16

91,9 95,9

112,1 121,8 100,0

2,7 2,1 2,4 2,4 2,1

112,5 87,5 100 100 87,5

20,9±1,19 23,6±2,44 21,4±2,10 24,3±4,23 21,9±2,33

92,5 104,4 94,7

107,5 96,9

2 Zaharoza 20 40 60 80

100

13,2±0,33 13,8±0,68 14,0±0,37 13,2±1,20 13,1±0,73

106,4 111,3 112,9 106,4 105,6

2,9 2,4 2,7 2,9 2,4

120,8* 100

112,5 120,8*

100

29,7±1,61 31,4±1,55 26,6±2,74 29,1±1,80 25,4±2,91

131,4* 138,9* 117,7

128,8* 112,4

3 Fructoza 20 40 60 80

100

13,1±0,25 15,3±0,18 16,2±0,33 17,0±0,32 15,9±0,13

105,6 123,4* 130,6* 137,1* 128,2*

2,7 2,9 3,2 3,5 2,9

112,5 120,8* 133,3* 145,8* 120,8*

25,7±0,36 31,8±0,78 32,5±1,29 32,2±1,04 30,5±1,04

113,7 140,7* 143,8* 142,5* 134,9*

4 Manoza 20 40 60 80

13,0±0,22 12,6±0,44 13,4±0,42 10,8±0,22

104,8 101,6 108,1 87,1

2,5 2,4 2,4 2,1

104,2 100 100 87,5

29,1±0,76 22,9±0,22 21,8±0,19 22,0±0,80

128,8* 101,3 96,5 97,3

5 Melasa 10 20 40 60 80

15,3±1,51 25,2±1,58 30,4±2,06 39,6±4,41 38,6±3,95

123,4* 203,2* 245,2* 319,3* 311,3*

3,5 4,8 7,0 7,5 7,4

145,8* 200,0* 291,7* 312,5* 308,3*

27,4±2,34 29,8±0,10 25,8±3,54 28,1±3,06 29,1±0,99

121,2* 131,8* 114,2* 124,3* 128,8*

6 Rieder (martor)

30

12,4±0,55

100

2,4

100

22,6±0,37

100

* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

Efectul benefic semnificativ al celorlalte surse de carbon cercetate asupra procesului de sinteză a

carbohidraţilor se datorează probabil faptului (conform ipotezei lui Berthels [87]), că mecanismele

Page 54: Oleg Chiselita Thesis

54

metabolice la drojdiile de vin sunt îndreptate preponderent spre detecţia şi asimilarea surselor de carbon

preferenţiale, care reprezintă două hexoze (glucoza şi fructoza) uşor fosfatate şi care intră direct în

gluconeogeneză. Glucoza este materia primă de bază în sinteza uridindifosfatglucozei (UDF-D-glucoză),

precursorul şi donatorul de zahăr de bază în procesul de sinteză a β-glucanului şi formării peretelui

celular. În acelaşi timp, în mediile ce conţin numai o singură hexoză, fructoza este asimilată mai

rapid şi la un grad mai înalt ca glucoza [87], fapt care explică rezultatele mai semnificative

obţinute în probele cu fructoză în comparaţie cu cele cu glucoză. Efectul pozitiv al zaharozei, care

prezintă prin sine un dizaharid, este şi el explicabil, ţinând cont de faptul, că ea este uşor

hidrolizată de invertază în glucoză şi fructoză, iar a melasei, prin compoziţia biochimică bogată.

Generalizând rezultatele obţinute privitor la rolul carbonului se poate afirma, că drojdiile

S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 metabolizează eficient melasa, fructoza,

glucoza şi zaharoza. Primele 2 asigură o creştere activă şi o acumulare semnificativă de glucide,

iar ultimele influenţează pozitiv numai procesul de biosinteză a carbohidraţilor.

Aşa dar, un efect benefic asupra productivităţii tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN –Y-21 şi sintezei carbohidraţilor exercită substituirea glucozei (30 g/l) în

mediul nutritiv Rieder prin melasă (20 g/l) şi fructoză (40 şi 60 g/l), care se propun pentru

cultivarea tulpinilor de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21, în

calitate de sursă de carbon şi energie, cu scopul majorării productivităţii şi conţinutului de

carbohidraţi în biomasă.

Rezultatele cercetărilor pot fi valorificate la diversificarea mediilor nutritive pentru

cultivarea drojdiilor producătoare de carbohidraţi.

3.2.2. Efectele sărurilor minerale, acetaţilor şi compuşilor coordinativi ai Mn (II) şi

Zn (II) asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae

CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21

Tot mai vaste devin cercetările bazate pe studierea capacităţii diferitor compuşi fiziologic

activi de a influenţa şi regla creşterea şi productivitatea microorganismelor. Activitatea

biosintetică a microorganismelor, în general, şi a drojdiilor, în particular, este în dependenţă

directă atât de condiţiile de cultivare (temperatura, pH-ul mediului, durata de cultivare), cât şi de

prezenţa cantităţilor suficiente ale oligoelementelor în mediul de cultivare. În această ordine de

idei, un loc deosebit le revine compuşilor coordinativi, care se utilizează cu succes în industrie,

agricultură, medicină. Astfel, preparatele medicamentoase, ce conţin în calitate de substanţe

active complexe metalice ale cuprului, zincului, manganului, cobaltului şi altor metale, se

utilizează în tratamentul unor afecţiuni (procese inflamatorii, ulcer, cancer, diabet, boli

Page 55: Oleg Chiselita Thesis

55

cardiovasculare şi ale sistemului nervos) graţie acţiunii lor antiinflamatorii, antitumorigene,

antimicrobiene şi antivirale.

Compuşii coordinativi sunt prezenţi în organismele vii sub formă de complexe a ionilor

metalici (Fe, Cu, Mg, Mn, Mo, Co, Zn ş.a.) cu proteine (metaloproteine), vitamine, enzime ş.a.

Metaloproteinele joacă un rol important în multe procese biologice, aşa ca respiraţia, fotosinteza,

protecţia de acţiunea substanţelor toxice. Majoritatea enzimelor-cheie în lanţurile metabolice

conţin în calitate de centru activ atomi ai metalelor, în special ai celor de tranziţie. Datorită

acestui fapt, metalele şi, în special, complexele metalice, influenţează vădit procesele metabolice

în celulă [20].

Studiul literaturii de specialitate ne-a permis să evidenţiem necesitatea microorganismelor

în metale. O mare importanţă o au diferiţi ioni necesari pentru asimilarea substratului nutritiv,

sau în calitate de cofactori ai biosintezei carbohidraţilor. Unii, ca de exemplu cei de fosfor (în

cantităţi excesive) acţionează ca inhibitori ai sintezei hidraţilor de carbon. Alţii, ca cei ai Fe2+, au

efect pozitiv asupra biosintezei carbohidraţilor de către Pseudomonas aeruginosa şi sintezei

levanzaharazei de Ganoderma oxidans. Ionii de Zn2+, Mn2+ sunt necesari pentru biosinteza

glucanului la Rhizobium japonicum şi mananului la S. cerevisiae, ionii de Mg2+ şi Ca2+ au impact

pozitiv asupra sintezei dextranilor Leuconostoc mesenteroides şi exopolizaharidelor Azotobacter

vinelandii [34].

Numeroasele cercetări realizate la cultivarea unor tulpini de microorganisme (bacterii,

drojdii, ciuperci), în scopul reglării proceselor de biosinteză cu utilizarea unor compuşi

coordinativi ai metalelor de tranziţie, confirmă eficienţa aplicării lor pentru dirijarea

productivităţii şi biosintezei principiilor bioactive de către diferite grupe taxonomice de

microorganisme [11, 30].

În acest context, scopul cercetărilor a constat în estimarea influenţei unor sulfaţi,

acetaţi şi compuşi coordinativi ai Mn (II) şi Zn (II) în calitate de stimulatori ai procesului de

biosinteză a carbohidraţilor, şi multiplicării drojdiilor de vin în vederea elaborării unor

procedee noi de dirijare a biosintezei carbohidraţilor.

Obiecte ale studiului au servit tulpinile de drojdii producători activi de carbohidraţi S.

cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 [4, 18], izolate în cultură pură din

microflora sedimentelor de drojdii de la vinurile roşii (Cabernet) şi albe (Chardonnay).

Ca medii nutritive de referinţă au servit mediul MGYP cu următoarea compoziţie, g/l:

glucoză – 10, peptonă – 5, extract de drojdii – 3, must de malţ – 3, apă distilată – 1l [161] şi

mediul Rieder [3].

Page 56: Oleg Chiselita Thesis

56

Cultivarea tulpinilor s-a efectuat la temperatura +23 - 25°C, timp de 120 ore, pe un

agitator rotativ (200 r.p.m.). Mostrele experimentale au fost prelevate la 24; 48; 72; 96 şi 120 ore

de cultivare a drojdiilor.

Ca reglatori ai proceselor biosintetice au fost cercetaţi: din gama sărurilor minerale -

sulfatul de mangan (MnSO4•4H2O) şi sulfatul de zinc (ZnSO4•7H2O); din gama acetaţilor -

acetatul de sodiu (CH3COONa)•3H2O şi acetatul de zinc (CH3COO)2Zn•2H2O); din gama

compuşilor coordinativi - 3 compuşi coordinativi ai Mn (II) cu diferiţi liganzi:

٠[Mn2Ac(2PyFX)–1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-acetat],

٠[Mn2Ac(2PyTCH)-1,5 Bis(piridin)tiocarbohidrazid-dimangan-acetat],

٠[Mn2Cl2(2PyFX)–1,7-Bis(piridin)malonodihidrazid-dimangan-diclorură)],

sintetizaţi de dl doctor V. Lozan şi un compus al manganului [Mn(Gly)2] Cl2, sintetizat de dl

acad. C. Turtă în Institutul de Chimie al AŞM; 4 compuşi ai Zn (II): clorură de monocloroacetat

de zinc (LP-1); clorură de tricloroacetat de zinc (LP-2); clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄

dipiridil (LP-3); tartrat de zinc imidazol (acid vinic) (LP-4), sintetizaţi în laboratorul Chimie

anorganică al USM sub conducerea dlui academician A. Gulea.

Pentru a selecta compuşii de perspectivă, s-a comparat nivelul multiplicării şi

productivităţii tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cu cantitatea de

carbohidraţi în biomasa obţinută.

Efectele acţiunii sulfaţilor de Mn(II) şi Zn (II)

De obicei, în componenţa mediilor de cultivare se includ microelemente sub formă de

săruri anorganice, în special sub formă de sulfaţi sau acetaţi, care pot reprezenta surse de

cofactori ai sistemelor enzimatice. Unii autori indică, că componenţii minerali şi organici ai

apelor subterane pot fi folosiţi ca o nouă sursă nutritivă pentru cultivarea drojdiilor. Folosirea

acestor ape la cultivarea drojdiilor duce la majorarea productivităţii, permeabilităţii membranei

citoplasmatice, stabilizării structurilor celulare, activarea fermenţilor complexelor zimazic şi

maltazic, biosintezei proteinei, carbohidraţilor, substanţelor minerale şi a aminoacizilor,

substanţe ce determină valoarea lor biologică [55, 56].

Ţinând cont de importanţa oligoelementelor în procesul de cultivare a microorganismelor,

în experienţele noastre a fost cercetată influenţa sulfatului de mangan şi sulfatului de zinc asupra

activităţii tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20. Sărurile au fost incluse în mediul nutritiv MGYP în

concentraţie de 5 mg/l. Iniţial s-a cercetat efectul sulfaţilor de mangan şi zinc asupra multiplicării

în dinamică a drojdiilor timp de 120 ore. Rezultatele studiului sunt prezentate în figura 3.5. S-a

Page 57: Oleg Chiselita Thesis

57

stabilit că maximul de multiplicare este înregistrat după 72 ore de cultivare pentru MnSO4•4H2O

şi după 96 ore - pentru ZnSO4•7H2O.

20406080

100120140

24 48 72 96 120Durata de cultivare, ore

% M

MnSO4 5 mg/l ZnSO4 5 mg/l martor

Fig. 3.5. Influenţa sulfatului de Mn2+ şi sulfatului de Zn2+ asupra multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 cultivată pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Următoarea etapă a studiului a fost stabilirea efectului sărurilor asupra conţinutului de

carbohidraţi în biomasa drojdiei (figura 3.6). S-a constatat că sinteza carbohidraţilor practic nu

este influenţată de către compuşii cercetaţi. Efectul moderat, cât al MnSO4•4H2O, atât şi al

ZnSO4•7H2O în concentraţia studiată, asupra productivităţii drojdiei şi acumulării carbohidraţilor

la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 denotă faptul, că aceşti compuşi nu pot fi incluşi în lista

factorilor limitativi de cultivare a drojdiilor de vin.

0

20

40

60

80

100

120

productivitate endopolizaharide exopolizaharide

% M

MnSO4 5 mg/l ZnSO4 5 mg/lmartor

Fig. 3.6. Influenţa sulfatului de Mn2+ şi sulfatului de Zn2+ asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor, la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Page 58: Oleg Chiselita Thesis

58

Efectele acţiunii acetaţilor de Na şi Zn (II)

Pornind de la aceea că acetaţii, de regulă, acţionează ca inductori în unele procese de

biosinteză a principiilor bioactive [20], în continuare s-a urmărit influenţa acetatului de sodiu şi

acetatului de zinc, adăugaţi în mediul nutritiv Rieder în concentraţie de 10, 20, 30, mg/l, asupra

multiplicării tulpinilor de drojdii şi sintezei carbohidraţilor.

Analiza rezultatelor a arătat, că efectul acetaţilor este variabil şi depinde de metal,

concentraţie şi specia de drojdii. Spre exemplu, acetatul de zinc în concentraţie de 10 şi 20 mg/l

sporeşte conţinutul de carbohidraţi în biomasa tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu 26 şi 14 %

respectiv faţă de martor (figura 3.7).

1030507090

110130150

10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30

CH3COONa (CH3COO)2Zn CH3COONa (CH3COO)2Zn

S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21conc., mg/l

% M

Numărul de celule Carbohidraţi Martor

Fig. 3.7. Influenţa acetatului de sodiu şi acetatului de zinc asupra multiplicării tulpinilor S.

cerevisiae CNMN-Y-20, S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe mediul Rieder, % faţă de martor.

Majorarea conţinutului de carbohidraţi are loc pe fundalul descreşterii multiplicării.

Asupra tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-21 compuşii chimici cercetaţi au avut un efect moderat,

în unele cazuri stimulând productivitatea şi inhibând uşor sinteza carbohidraţilor.

Efectele acţiunii compuşilor coordinativi ai Mn(II) şi Zn (II)

Pentru evidenţierea modului în care compuşii coordinativi influenţează dinamica

procesului de multiplicare a tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21,

compuşii Mn2Ac(2Py FX), Mn2Cl2 (2Py FX) şi Mn2Ac(2PyTCH) au fost incluşi în mediul de

cultivare MGYP în patru concentraţii (figura 3.8). S-a stabilit că în mediul în care s-a utilizat

compusul Mn2Ac(2PyTCH) maximul multiplicării este înregistrat după 48-72 ore de cultivare,

Page 59: Oleg Chiselita Thesis

59

ceea ce demonstrează că faza de accelerare a ritmului de creştere intervine mai rapid faţă de cea

în cazul utilizării sulfaţilor de mangan şi zinc.

50

70

90

110

130

150

170

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Mn2Ac(2PyFX) Mn2Cl2(2PyFX) Mn2Ac(2PyTCH) conc., mg/l

% M

24 ore 48 ore 72 ore 96 ore martor

Fig. 3.8. Influenţa compuşilor coordinativi ai Mn (II) asupra dinamicii multiplicării tulpinii S.

cerevisiae CNMN-Y-20 la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Investigaţiile influenţei compuşilor coordinativi asupra productivităţii şi procesului de

biosinteză a carbohidraţilor de către drojdiile de vin au demonstrat, că compusul

Mn2Ac(2PyTCH) în concentraţia de 10-15 mg/l are efect pozitiv neesenţial asupra conţinutului

de endopolizaharide la drojdia S. cerevisiae CNMN-Y-20, fiind cu 7-11% mai mare faţă de

martor (figura 3.9), iar compuşii Mn2Ac(2PyFX), şi Mn2Cl2(2PyFX) exercită efect neutru.

Compusul coordinativ al manganului cu aminoacidul glicina [Mn(Gly)2] Cl2, inclus în

mediul de cultivare Rieder în concentraţie de 5-20 mg/l, s-a evidenţiat prin efect specific în

funcţie de specia de drojdii (figura 3.10). S-a constatat influenţa moderat stimulatoare (cu 18%

faţă de martor) asupra biosintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi

acţiunea inhibitoare pentru tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21. Efectul pozitiv al compusului

probabil poate fi datorat îmbinării reuşite dintre metal şi glicină, care influenţează pozitiv

activitatea manoziltransferazelor implicate în sinteza mananproteinelor, un component de bază al

carbohidraţilor drojdiilor de vin [229].

Pentru compuşii coordinativi ai zincului observăm următoarele: în seriile de experienţe

menite să elucideze în dinamică influenţa acestora s-a constatat, că din 4 compuşi cercetaţi

atenţie deosebită în calitate de stimulator al multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20

merită compusul Zn LP-2 – clorură de tricloracetat de zinc, care în concentraţie de 5 şi 20 mg/l,

după 48 ore de cultivare a drojdiei, influenţează pozitiv procesul de multiplicare a celulelor,

Page 60: Oleg Chiselita Thesis

60

numărul acestora la un volum de mediu majorându-se cu 17% comparativ cu martorul (figura

3.11).

30

50

70

90

110

130

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Mn2Ac(2PyFX) Mn2Cl2(2PyFX) Mn2Ac(2PyTCH)

conc., mg/l

% M

productivitate endopolizaharideexopolizaharide martor

Fig. 3.9. Influenţa compuşilor coordinativi ai Mn (II) asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

1030507090

110130

5 10 20 5 10 20

[Mn(Gly)2] Cl2 [Mn(Gly)2] Cl2

S. cerevisiae CNMN-Y-20 S. cerevisiae CNMN-Y-21

conc., mg/l

% M

Numărul de celule Carbohidraţi Martor

Fig. 3.10. Influenţa compusului coordinativ [Mn(Gly)2] Cl2 asupra multiplicării tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20, S. cerevisiae CNMN-Y-21 şi sintezei carbohidraţilor la cultivare pe

mediul Rieder, % faţă de martor.

Ulterior s-a studiat capacitatea tulpinii de a sintetiza carbohidraţi (figura 3.12). După cum

reiese din rezultatele reflectate în figură, compusul Zn LP-2 - clorură de tricloracetat de zinc se

caracterizează prin proprietăţi de stimulare a sintezei endopolizaharidelor. În concentraţie de 5 şi

10 mg/l compusul intensifică sinteza carbohidraţilor intracelulari, cu 18 şi 25 % respectiv faţă de

martor (figura 3.12).

Page 61: Oleg Chiselita Thesis

61

60708090

100110120130

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Zn LP -1 Zn LP -2 Zn LP -3 Zn LP -4

conc., mg/l

% M

24 ore 48 ore 72 ore 96 ore 120 ore martor

Legendă: ZnLP-1 - clorură de monocloroacetat de zinc; ZnLP-2 - clorură de tricloroacetat de zinc; ZnLP-3 - clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil; ZnLP-4 - tartrat de zinc imidazol (acid vinic).

Fig. 3.11. Influenţa compuşilor coordinativi ai Zn (II) asupra dinamicii multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

60708090

100110120130140

5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 20

Zn LP -1 Zn LP -2 Zn LP -3 Zn LP -4 conc. mg/l

% M

productivitate endopolizaharideexopolizaharide martor

Legenda: ZnLP-1 - clorură de monocloroacetat de zinc; ZnLP-2 - clorură de tricloroacetat de zinc; ZnLP-3 - clorură de tricloroacetat de zinc γ, γ΄ dipiridil; ZnLP-4 - tartrat de zinc imidazol (acid vinic)

Fig. 3.12. Influenţa compuşilor coordinativi ai Zn (II) asupra productivităţii tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi sintezei carbohidraţilor, la cultivare pe mediul MGYP, % faţă de martor.

Acest studiu ilustrează influenţa neunivocă a oligoelementelor Mn (II) şi Zn (II), utilizate

în diferite forme chimice, asupra productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile de vin.

Rezultatele obţinute denotă, că MnSO4•4H2O şi ZnSO4•7H2O având un efect moderat, nu pot fi

aliniaţi la factorii care limitează metabolismul drojdiilor de vin.

Un important factor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor sunt acetaţii utilizaţi în

procesele de cultivare ale drojdiilor în studiu. Rezultatele indică un răspuns specific al tulpinilor

Page 62: Oleg Chiselita Thesis

62

de drojdii la prezenţa acetaţilor în mediul de cultivare. Pentru tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20

s-a constatat o corelare a acţiunii acetatului de Zn(II) cu concentraţiile utilizate, astfel că

creşterea concentraţiei de (CH3COO)2Zn•2H2O) de la 10 la 30 mg/l duce la scăderea conţinutului

de carbohidraţi în biomasa drojdiei.

Cercetările prin care s-a încercat stimularea biosintezei carbohidraţilor la unele drojdii de

vin prin suplimentarea mediului de cultivare cu compuşi coordinativi ai Mn (II) şi Zn (II) ca

surse de cofactori ai sistemelor enzimatice şi ca stimulatori ai biosintezei carbohidraţilor au dus

la rezultate, prin care putem afirma eficienţa înaltă a clorurei de tricloracetat de zinc.

Proprietăţile reglatoare ale complexelor coordinative ale metalelor studiate asupra productivităţii

şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21

sunt determinate cât de metal, atât şi de natura ligandului.

Efectul pozitiv al compuşilor chimici sub formă de acetaţi ai Zn (II) asupra procesului de

sinteză a carbohidraţilor poate fi explicat atât prin faptul includerii ionilor de Zn2+, în calitate de

cofactori strict necesari, în enzimele cheie pentru biosinteza glucanilor şi mananilor de către

microorganisme şi în special drojdii [34], cât şi prin implicarea lor în reglarea genelor Zn2+-

dependente responsabile de depozitarea şi metabolismul glucidelor [109].

Astfel, includerea în mediul de cultură a compusului ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de

zinc în concentraţie de 5 şi 20 mg/l a relevat o sporire maximală a multiplicării drojdiei S.

cerevisiae CNMN-Y-20 cu 17%. Acest compus a avut efect maximal şi asupra procesului de

acumulare a carbohidraţilor în biomasa drojdiilor. Adăugat la mediul de cultivare în concentraţie

de 5-10 mg/l, compusul ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de zinc a majorat substanţial conţinutul

de carbohidraţi în biomasa drojdiilor S. cerevisiae CNMN-Y-20.

Reieşind din cele relatate, compusul coordinativ ZnLP-2 - clorură de tricloracetat de zinc

se recomandă a fi utilizat în calitate de stimulator specific al sintezei carbohidraţilor şi

multiplicării la cultivarea submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20.

3.2.3. Efectele temperaturii, pH-ului iniţial al mediului nutritiv, duratei de cultivare asupra

multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor la drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21.

Cei mai importanţi factori fizici care reglează creşterea şi metabolismul

microorganismelor sunt temperatura de cultivare, pH-ul şi aeraţia mediului. Aceşti factori

influenţează solubilitatea sărurilor, compoziţia ionică a substraturilor, morfologia şi structura

celulelor, determină activitatea fiziologică a culturilor şi acţionează asupra proprietăţilor pereţilor

celulari, transportului de substanţe nutritive, proceselor şi reacţiilor chimice din membrane,

Page 63: Oleg Chiselita Thesis

63

vitezei de creştere şi multiplicare, structurii populaţiei şi, de asemenea, capacităţii de a asimila

una sau alta sursă nutritivă [38, 88, 225].

Drojdiile utilizate în industrie manifestă diferite cerinţe de hrană şi condiţii specifice de

mediu. În general, orice microorganism are nevoie de o sursă de energie, concentraţii optime de

elemente nutritive, alte cerinţe specifice.

Tulpinile genului Saccharomyces în majoritatea sa sunt culturi mezofile [3, 96]. Un factor

semnificativ de influenţă asupra creşterii, dezvoltării şi activităţii biosintetice a

microorganismelor este temperatura. Sub acţiunea temperaturii se modifică durata etapelor de

dezvoltare a microorganismului – lag-faza, faza exponenţială, faza staţionară şi termenii de

manifestare a activităţii biochimice - biosinteza enzimelor, proteinelor şi altor substanţe biologic

active [84].

Valoarea pH-ului este, alături de temperatură, un parametru important în procesele de

biosinteză. În general microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, în care

viteza specifică de creştere atinge valoare maximă. pH-ul mediului de cultivare influenţează

activitatea sistemului enzimatic corespunzător, care se implică nemijlocit în procesele de

biosinteză. Pentru drojdiile genului Saccharomyces domeniul optim se situează între valorile

de pH 4-5 şi prezintă avantajul unui risc mai scăzut de contaminare bacteriană, ceea ce este în

mod deosebit de apreciat în cazul unei cultivări industriale.

Până în prezent a fost acumulat un material teoretic şi experimental amplu privind

influenţa temperaturii şi pH-ului mediului de cultivare asupra creşterii şi biosintezei hidraţilor

de carbon la microorganisme din diverse clase şi genuri.

Aşa de exemplu, tulpina de drojdii S. cerevisiae CEN.PK133-7D are optimul de creştere

la +30°C şi pH-ul mediului de cultivare 5,0. Modificările pH-ului cauzează unele fluctuaţii în

nivelurile de β-glucan, manan şi chitină, dar nu a existat nici o relaţie evidentă între aceste

fluctuaţii şi pH-ul mediului. Proporţia relativă a β-1,6-glucanului în fracţiunea β-glucanilor a

scăzut cu circa 40% la creşterea pH-ului de la 4,0 la 6,0, iar sensibilitatea celulelor la zimolaze a

crescut. Deşi creşterea temperaturii de cultivare de la 22 la +37°C a dus la majorarea nivelului de

chitină şi conţinutului β-1,6-glucan în fracţiunea β-glucanilor, aceste fluctuaţii nu au influenţat în

mod vădit nivelul de manani. Micşorarea conţinutului de O2 dizolvat în mediul de cultivare

conduce la o reducere de până la 25% din masa peretelui celular şi de 3 ori a conţinutului de

chitină, în timp ce nu au existat schimbări majore în nivelul de β-glucani şi manani. Scăderea

conţinutului de chitină ar putea fi cauzată de reducerea activităţii glutamintransferazei (GAT) în

celulele hipoxice, ca urmare a represiunii acestei enzime de către proteinfosfataze a căror

activitate este crescută în condiţii anaerobe [92, 219, 244]. Aceste observaţii sunt în concordanţă

Page 64: Oleg Chiselita Thesis

64

cu alte date din literatură, care indică, că drojdiile de bere cultivate la pH 3,5 au dobândit o

rezistenţă mai mare la β-1,3-glucanază, decât cele cultivate la 5,5 şi această rezistenţă a fost

asociată cu inducţia sintezei glicozilfosfatidilinozitol (GFI)-proteinelor peretelui celular [158].

Astfel, optimizând regimul de fermentare, pot fi activizate sistemele metabolice

responsabile de multiplicarea şi biosinteza carbohidraţilor în celula de drojdii. Pentru o

caracterizare mai completă a capacităţii de creştere a tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21, scopul cercetărilor în acest subcapitol constă în stabilirea temperaturii,

pH-ului şi duratei de cultivare optime multiplicării şi acumulării carbohidraţilor de către tulpinile

în studiu.

Pentru a studia acţiunea temperaturii de cultivare asupra multiplicării şi biosintezei

carbohidraţilor, au fost cercetate regimurile de temperatură +15, 20, 25 şi 30°C. Tulpinile au fost

cultivate pe mediul nutritiv Rieder modificat (30 g/l glucoză au fost substituite cu 20 g/l melasă),

pH-5,5. Cultivarea s-a realizat pe un agitator rotativ (200 r.p.m.). Mostrele au fost prelevate la

24, 48, 72 şi 96 ore de cultivare.

În rezultatul cercetărilor am stabilit, că temperatura optimă pentru multiplicare este de

+15°C, la care tulpinile cultivate timp de 48 ore (S. cerevisiae CNMN-Y-20) şi 72 ore (S.

cerevisiae CNMN-Y-21) acumulează o cantitate maximală de celule la o unitate de volum.

Majorarea temperaturii de cultivare până la +30ºC induce o încetinire a procesului de

multiplicare a celulelor (figurile 3.13, 3.14).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 24 48 72 96Durata de cultivare, ore

15ºC

20ºC

25ºC

30ºC

Fig. 3.13. Efectul temperaturii de cultivare asupra multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN –Y-20.

Acest fapt poate fi explicat prin creşterea esenţială a concentraţiei compuşilor toxici

(formelor active ale oxigenului ce conţin anioni superoxidanţi, peroxid de hidrogen (H2O2) şi

radicali hidroxili (OH-)) în celulele de drojdii la cultivarea lor la temperaturi înalte. Sinteza

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

Page 65: Oleg Chiselita Thesis

65

acestor compuşi duce la distrugerea membranelor, denaturarea proteinelor şi ADN-ului şi

moartea celulelor [108, 218].

05

1015202530354045

0 24 48 72 96

Durata de cultivare, ore

15ºC

20ºC

25ºC

30ºC

Fig. 3.14. Efectul temperaturii de cultivare asupra multiplicării tulpinii S. cerevisiae CNMN –Y-21.

În ansamblu, rezultatele obţinute confirmă datele din literatură, conform cărora

temperaturile scăzute stimulează creşterea şi multiplicarea drojdiilor de vin, iar schimbarea

temperaturii de cultivare duce la modificarea duratei etapelor de dezvoltare a drojdiilor [84, 123].

Referitor la acumularea carbohidraţilor s-a stabilit, că tulpinile S. cerevisiae CNMN –Y-

20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21 manifestă activitate maximală în regimurile de cultivare +20 şi

+25°C (figura 3.15). Majorarea temperaturii de cultivare până la +30°C duce la încetinirea

procesului sintezei hidraţilor de carbon în ambele cazuri. Acest fapt poate fi explicat prin

reducerea activităţii glicoziltransferazelor, responsabile de sinteza polizaharidelor peretelui

celular la drojdii în condiţii de majorare a temperaturii.

10

15

20

25

30

35

15 20 25 30

Temperatura de cultivare,°C

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-20Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21

Fig. 3.15. Influenţa temperaturii de cultivare asupra acumulării carbohidraţilor la tulpinile S. cerevisiae CNMN –Y-20 şi S. cerevisiae CNMN –Y-21.

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

Page 66: Oleg Chiselita Thesis

66

În continuare a fost cercetată capacitatea de multiplicare şi de biosinteză a carbohidraţilor la

tulpinile în studiu în condiţii diferite de pH al mediului de cultivare. A fost utilizat mediul nutritiv

Rieder modificat (30 g/l glucoză au fost substituite cu 20 g/l melasă) cu diferite valori ale pH-ului

iniţial: 3,5; 5,5; 6,5; şi 8,0. Temperatura de cultivare a fost menţinută la valoarea de +20°C. Pentru

evaluarea dinamicii schimbării pH-ului mediului nutritiv au fost preluate mostre la 12, 24, 48 şi 72

ore de cultivare.

Din rezultatele cercetărilor (figurile 3.16, 3.17) este evident, că ambele tulpini de drojdii

posedă un puternic mecanism de reglare a pH-ului mediului de cultură, activitatea acestuia fiind

atât mai pronunţată, cu cât este mai nefavorabil pH-ul iniţial al mediului. Stabilizarea valorilor pH-

ului pentru ambele tulpini se produce după 48 ore de cultivare.

123456789

0 12 24 48 72

Durata de cultivare, ore

pH-u

l

pH iniţial-3,5pH iniţial-5,5pH iniţial-6,5pH iniţial-8,0

Fig. 3.16. Evoluţia în timp a pH-ului mediului de cultivare la tulpina S. cerevisiae CNMN –Y-20.

1

3

5

7

9

0 12 24 48 72

Durata de cultivare, ore

pH-u

l pH iniţial-3,5pH iniţial-5,5pH iniţial-6,5pH iniţial-8,0

Fig. 3.17. Evoluţia în timp a pH-ului mediului de cultivare la tulpina S. cerevisiae CNMN –Y-21.

Page 67: Oleg Chiselita Thesis

67

În literatură se indică, că majoritatea drojdiilor cresc şi se dezvoltă la valorile de pH 3,0 –

8,0. La categoria acestora pot fi raportate şi drojdiile de vin S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S.

cerevisiae CNMN-Y-21. Comparând numărul de celule şi conţinutul de carbohidraţi la drojdiile

cultivate pe mediul Rieder, constatăm o asemănare în ceea ce priveşte atitudinea culturilor faţă

de pH (figurile 3.18, 3.19). pH-ul optim al multiplicării şi biosintezei carbohidraţilor de către

aceste tulpini coincide şi are valoarea de 5,5.

Efectul se explică prin aceea, că la pH 5,5 sunt active majoritatea enzimelor

microorganismului implicate în sinteza substanţelor bioactive şi multiplicarea celulară. Limitele de

pH scăzut, specifice creşterii drojdiilor de vin, diminuează posibilitatea de contaminare bacteriană.

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4

pH-ul iniţial

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

26,5

27

27,5

28

28,5

29

29,5

Carbohidraţi Numărul de celule

Fig. 3.18. Influenţa pH-ului mediului asupra multiplicării celulare şi sintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4

pH-ul iniţial

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

24

26

28

30

32

34

Carbohidraţi Numărul de celule

Fig. 3.19. Influenţa pH-ului mediului asupra multiplicării celulare şi sintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-21.

3,5 5,5 6,5 8,0

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

3,5 5,5 6,5 8,0

Page 68: Oleg Chiselita Thesis

68

Este cunoscut, că sinteza unui anumit produs la microorganisme este asociată cu fazele

proceselor de creştere. Din aceste considerente este important de a stabili pentru tulpinile de

drojdii selectate, relaţiile dintre procesul de multiplicare a populaţiei şi biosinteză a

carbohidraţilor în dinamică. Cercetările au fost efectuate la cultivarea tulpinilor pe mediul

nutritiv Rieder cu pH-ul 5,5, la temperatura de +20°C, pe un agitator rotativ (200 r.p.m.),

concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, timp de 7 zile. La fiecare 24 ore de cultivare au fost

prelevate probe pentru a cerceta multiplicarea tulpinilor şi conţinutul de carbohidraţi în biomasă.

Datele ce reflectă dinamica multiplicării şi biosintezei hidraţilor de carbon ai tulpinilor în

studiu sunt prezentate în figurile 3.20 şi 3.21.

10

15

20

25

30

35

0 24 48 72 96 120 144 168

Durata de cultivare, ore

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

0

5

10

15

20

25

Carbohidraţi Numărul de celule

Fig. 3.20. Dinamica multiplicării şi acumulării carbohidraţilor la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-20.

10

15

20

25

30

35

0 24 48 72 96 120 144 168

Durata de cultivare, ore

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

0

5

10

15

20

25

Carbohidraţi Numărul de celule

Fig. 3.21. Dinamica multiplicării şi acumulării carbohidraţilor la tulpina

S. cerevisiae CNMN –Y-21.

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

celu

le, 1

x 10

6 ml-1

Page 69: Oleg Chiselita Thesis

69

La analiza rezultatelor obţinute s-a constatat, că la ambele tulpini multiplicarea şi

acumularea biomasei este intensă în primele 48 ore de cultivare, după care aceste procese se

stabilizează şi începe faza staţionară de dezvoltare a culturilor.

O acumulare semnificativă de glucide în biomasa drojdiilor (30,9% S.U. – S. cerevisiae

CNMN-Y-20 şi 27,5% S.U. – S. cerevisiae CNMN-Y-21) se produce începând cu 120 ore de

cultivare submersă, valori care practic nu se modifică pe parcursul următoarelor 48 ore de cultivare.

Majorarea conţinutului de carbohidraţi în biomasă în faza staţionară de dezvoltare a

drojdiilor poate fi explicată prin diminuarea conţinutului de azot în mediul de cultură, fapt ce

duce la stoparea proceselor de multiplicare şi activizarea proceselor biosintetice a

microorganismului şi poate fi considerat o adaptare la condiţiile mediului nutritiv. Aceste date

corelează cu datele altor autori [170].

Aşa dar, culturile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă

capacitate de a creşte într-un spectru larg de valori ale temperaturii şi pH –ului. Temperatura

optimă de multiplicare a tulpinilor în studiu este de +15°C, iar de biosinteză a hidraţilor de carbon

+20°C.

Tulpinile cercetate posedă un mecanism puternic de autoreglare a pH-ului mediului de

cultivare. pH-ul optim de multiplicare coincide cu cel al biosintezei carbohidraţilor şi are valoarea

de 5.5. Tulpinile în studiu acumulează cantitatea maximală de celule la o unitate de volum după

48 ore de cultivare în profunzime pe mediul Rieder, iar valori maximale ale conţinutului de

carbohidraţi s-au înregistrat în faza staţionară de dezvoltare a acestora după 120 ore de cultivare.

3.3. Elaborarea regulamentului de obţinere din drojdii a bioprodusului Glucolev – 20

În baza principiilor bioactive microbiene se produc diferite tipuri noi de suplimente

alimentare şi furajere. Drojdiile S. cerevisiae, S. carlsbengesis, S. delbruecki şi S. boulardii sunt

folosite la elaborarea unor adaosuri alimentare destinate bolnavilor ce suferă de diferite forme de

hepatită cronică sau acută, cancer, ciroză, hipertonie şi alte maladii. Adaosurile normalizează

nivelul glutamatpiruvattransaminazei, fosfatazei alcaline şi dehidrogenazei şi dau posibilitate de

a obţine rezultate pozitive la tratarea acestor boli [140, 189].

Cu utilizarea biomasei drojdiilor de vin Saccharomyces vini sunt produse o serie întreagă

de preparate cu proprietăţi pre- şi probiotice aşa ca: „Рекицен-РД 100 г”, „Фервитал”,

„Эубикор” şi altele, ce conţin aminoacizi esenţiali, microelemente, vitamine (în special ale

grupei B şi D), pectină şi fibre alimentare. Preparatele sunt recomandate pentru normalizarea

microflorei tractului gastro-intestinal, pentru tratarea sindromului metabolic al obezităţii şi

diabetului, ajută la dispariţia senzaţiilor de greaţă, vomă şi a arsurilor gastrice, posedă acţiune

Page 70: Oleg Chiselita Thesis

70

antiinflamatorie accentuată. În caz de procese infecţioase şi imunodeficienţă activizează

segmentul humoral al sistemului imunitar (creşte concentraţia imunoglobulinelor). Preparatele

diminuează nivelul glucozei în sânge şi nivelul colesterinei, măreşte potenţialul antioxidant al

organismului, ajută la procesul de digestie in cazul unor maladii ale ficatului, stomacului şi

intestinelor [58, 139].

Cercetătorii ruşi Abramov şi Cotenco au determinat, că tulpinile Saccharomyces

oviformis Y-2635 şi Saccharomyces vini Ф-5, cultivate pe diverse medii nutritive, au biomasa cu

o valoare biologică înaltă datorită conţinutului sporit de riboflavină, tiamină, acid nicotinic şi

folic [33].

Una din variantele optimale pentru obţinerea preparatelor proteico-vitaminice şi un aspect

important al utilizării drojdiilor este autoliza biomasei lor. Valorile biologică şi nutritivă înalte

ale autolizatelor de drojdii se explică prin faptul, că în timpul procesului de autoliză, sub acţiunea

propriilor fermenţi, are loc distrugerea biopolimerilor drojdiei, ceea ce măreşte accesibilitatea

substanţelor biologic active din biomasă. Alt aspect important al procesului de autoliză constă în

faptul, că pe durata lui are loc distrugerea acizilor nucleici şi repartizarea produselor

descompunerii între fazele lichidă şi solidă ale autolizatului [76].

Producerea preparatelor proteico-vitaminice cu destinaţie furajeră şi alimentară se poate

cumula cu tehnologia de autoliză a drojdiilor şi de obţinere a siropurilor glucozo-galactozice [49].

Reieşind din cele menţionate, scopul cercetărilor în acest subcapitol este elaborarea

regulamentului de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi obţinere din drojdii a

bioproduselor valoroase.

Dat fiind faptul, că în experienţele anterioare au fost stabiliţi parametrii optimi de

cultivare şi sinteză a carbohidraţilor (temperatura, pH-ul iniţial al mediului nutritiv, durata de

cultivare) şi efectele stimulatoare ale unor surse de carbon, acetaţi, compuşi coordinativi asupra

productivităţii şi biosintezei carbohidraţilor, scopul cercetărilor ulterioare constă în elaborarea

unui mediu nutritiv, care ar asigura o cantitate de biomasă maximă cu un conţinut sporit de

carbohidraţi la tulpinia S. cerevisiae CNMN-Y-20.

Pentru rezolvarea obiectivelor propuse, tulpina a fost cultivată în condiţiile prestabilite:

temperatura +20°C, concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, pH-ul iniţial - 5,5 durata de cultivare -

120 ore, în 5 variante de medii nutritive cu compoziţia, g/l:

Varianta 1 - melasă – 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -

0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, apă potabilă 1 l;

Varianta 2 – glucoza – 30,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4,

KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, cloruruă de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l;

Page 71: Oleg Chiselita Thesis

71

Varianta 3 – glucoza – 30,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2

- 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, acetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l;

Varianta 4 - melasă - 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -

0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, cloruruă de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă

potabilă 1 l;

Varianta 5 – melasă-20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 -

0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, acetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l.

Ca mediu de referinţă a servit mediul Rieder.

Rezumând rezultatele prezentate în figura 3.22 putem concluziona că productivitatea şi

conţinutul maximal de carbohidraţi 4,9 g/l BAU şi respectiv 44,6% S.U. (ceea ce este cu 63,3%

şi respectiv 44,3% mai mult faţă de varianta martor) a tulpinii se realizează pe mediul în

compoziţia căruia au fost incluse melasa (20 g/l) şi compusul coordinativ cloruruă de

tricloracetat de zinc (10 mg/l) - varianta 4 de mediu.

20

25

30

35

40

45

50

Martor(Rieder)

1 2 3 4 5

Variantele mediului de cultivare

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

0

1

2

3

4

5

6

BA

U, g

/l

Carbohidraţi Productivitate

Fig. 3.22. Productivitatea şi conţinutul de carbohidraţi la drojdia S. cerevisiae CNMN-Y-20 la cultivare submersă în condiţiile prestabilite pe medii cu diferită compoziţie biochimică.

Rezultatele obţinute experimental demonstrează influenţa factorilor de mediu asupra

multiplicării şi activităţii vitale a celulei microbiene şi reacţionarea acesteia prin modificări de

biosinteză şi a duratei etapelor de dezvoltare. Corelarea dată prezintă un mecanism puternic de

reglare a relaţiilor ,,microorganism - mediu,, şi creează posibilităţi de orientare a proceselor

metabolice la drojdii în scopuri de utilizare practică.

Efectul pozitiv manifestat de influenţa simultană a tuturor factorilor fizico-chimici

permite de a propune un procedeu nou de cultivare dirijată a drojdiilor şi obţinere a biomasei cu

conţinut sporit de carbohidraţi. Schema de realizare a procedeului este prezentată în figura 3.23.

Page 72: Oleg Chiselita Thesis

72

Procedeul propus prevede cultivarea submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 –

producător activ de carbohidraţi, pe mediul cu următoarea compoziţie g/l: (NH4)2SO4 - 3,0,

MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl - 0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml,

melasă - 20,0, clorură de tricloracetat de zinc - 10 mg/l, apă potabilă 1 l, pH- 5,5.

Procesul de cultivare decurge conform parametrilor optimizaţi: temperatura mediului

în timpul procesului de cultivare se menţine +200C, pH-ul iniţial al mediului 5,5, durata

procesului de cultivare 120 ore, agitare permanentă.

Fig.3.23. Schema realizării procedeului de obţinere a biomasei de drojdii cu conţinut sporit de carbohidraţi.

Avantajul procedeului constă în majorarea productivităţii tulpinii S. cerevisiae

CNMN-Y-20 cu 63,3% şi a conţinutului de carbohidraţi cu 44,3% faţă de procedeul martor.

Reieşind din cele menţionate şi în baza rezultatelor cercetărilor s-a elaborat

tehnologia de obţinere a bioprodusului Glucolev - 20 cu conţinut sporit de carbohidraţi.

Schema tehnologică de obţinere a bioprodusului Glucolev – 20 este prezentată în figura 3.24.

Tehnologia propusă e bazată pe:

٠Utilizarea tulpinii de drojdie S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu potenţial înalt de

biosinteză a carbohidraţilor.

Cultivare la temperatura +20°C, pH-ul iniţial al mediului - 5,5,

concentraţia O2 în mediu - 7,3 mg/l, durata cultivării 120 ore.

Centrifugare

Prepararea mediului de cultivare în baza mediului Rieder (în care 30 g/l glucoză se substituie cu 20 g/l

melasă). Sterilizare la 1210C, timp de 30 minute, la 1,0

atmosferă.

+10 mg/l clorură de tricloracetat de zinc (condiţii sterile).

Inocularea S. cerevisiae CNMN-Y-20, 50 ml/l

Biomasa Determinarea carbohidraţilor

Lichidul cultural

Prepararea inoculumului (1,5-2 x106 ml-1 celule) prin cultivarea S. cerevisiae CNMN-Y-20 pe mediu

must de malţ lichid timp de 48 ore, t+20°C

Page 73: Oleg Chiselita Thesis

73

٠Cultivarea tulpinii producătoare conform procedeului de cultivare submersă ce

include:

- utilizarea la etapa fermentării a melasei şi clorurei de tricloracetat de zinc;

- utilizarea parametrilor de temperatură, pH, durata de cultivare, optimizaţi pentru

producătorul dat;

- obţinerea a 4,7...5,0 g/l biomasă uscată cu un conţinut de carbohidraţi de

44,2...45,3% S.U., proteină 39,2...40,0% S.U., lipide 7,0...8,0% S.U.;

٠Separarea biomasei de lichidul cultural.

٠Autoliza biomasei de drojdii conform procedeului elaborat [17, 19].

٠Uscarea produselor.

٠Determinarea compoziţiei biochimice.

٠Ambalarea, marcarea bioproduselor.

Fig. 3.24. Schema tehnologică de obţinere a bioprodusului Glucolev – 20.

Separarea biomasei de lichidul cultural prin centrifugare la 3000 r.p.m., timp de 20 min.

Lichid cultural, Concentrare prin evaporare la +60-

65°C în vid, sterilizare timp de 1 oră la 1 atm.

Autoliza suspensiei la +55°C timp de 8-12 ore cu adăugare a 3-5 ml acid acetic la 1 l de

suspensie

Determinarea compoziţiei biochimice

Dozarea, ambalarea, marcarea bioproduselor

Bioprodusul Glucolev - 20

Uscarea autolizatului până la greutate constantă la +60°C în vid.

Cultivarea submersă a producătorului pe mediul nutritiv cu parametrii fizico-

chimici optimizaţi timp de 120 ore.

Biomasa Prepararea suspensiei biomasă:apă (1:4) după

substanţă uscată

Page 74: Oleg Chiselita Thesis

74

• Caracteristica producătorului

Tulpina de drojdie S. cerevisiae CNMN-Y-20, selectată din sedimente de vin roşu,

este depozitată în Colecţia Naţională de Microorganisme Nepatogene şi brevetată ca

producător de β-glucani [4].

Proprietăţile morfologice, culturale şi fiziologice ale tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-

20 sunt descrise în subcapitolul 3.1.

• Descrierea procesului de cultivare dirijată a drojdiei S. cerevisiae CNMN-Y-

20 şi obţinere a bioprodusului Glucolev – 20

Procesul constă din trei etape de bază:

I – Obţinerea materialului semincer (inoculum).

II – Procesul de cultivare submersă a drojdiei şi biosinteză a carbohidraţilor.

III – Obţinerea produsului finit.

I. Obţinerea materialului semincer (inoculum)

Materialul semincer se cultivă în două generaţii:

I - în tuburi pe medii agarizate;

II - în baloane cu medii lichide.

a) Cultivarea materialului semincer în tuburi cu gel înclinat

S. cerevisiae CNMN-Y-20 se însămânţează în tuburi cu must de malţ agarizat. Mediul

pregătit se toarnă câte 6-7 ml în tuburi cu volumul de 13 ml, se sterilizează în autoclav la

temperatura de 115-118°C timp de 25 minute. După sterilizare, mediul din tub se înclină.

Însămânţarea în tuburi se efectuează transferând celulele de pe suprafaţa mediului

solid cu ajutorul ansei. Tuburile se incubează la temperatura de 20°C, 5 zile, după ce cultura

poate fi folosită ca material semincer pentru cultivare în baloane.

Materialul semincer se păstrează pe must de malţ agarizat în frigider la temperatura de

+ 4...+5°C, pe parcursul a 1-2 luni.

Fiecare lot de material semincer trebuie să fie paşaportizat. Pe tub se indică:

٠Denumirea drojdiilor;

٠Numărul lotului şi data pregătirii;

٠Data controlării lotului şi activitatea biosintetică;

٠Rezultatele controlului acestui lot asupra prezenţei sau lipsei microflorei străine;

٠Termenul valabilităţii.

b) Cultivarea materialului semincer în baloane

Page 75: Oleg Chiselita Thesis

75

Pentru obţinerea inoculatului în baloane se utilizează cultura de drojdii S. cerevisiae

CNMN-Y-20, cultivată anterior pe mediul agarizat înclinat.

Cultivarea are loc în baloane Erlenmeyer cu volumul 500 ml, a câte 100 ml mediu

lichid must de malţ, care se sterilizează la 112-1150C timp de 30 minute.

Materialul semincer se cultivă pe parcursul a 48 ore, pe agitator rotativ (200 r.p.m.) la

temperatura +200C.

Calitatea materialului semincer se controlează prin microscopie sau recoltându-l în

bulionul nutritiv. Apariţia spumei excesive ne indică infectarea culturii de drojdii.

Materialul semincer steril (maiela) cultivat în baloane (inoculum) poate fi utilizat

timp de 10 zile, se păstrează la temperatura de +4 +60C în frigider.

II. Procesul de cultivare submersă a drojdiilor şi biosinteză a carbohidraţilor

Procesul tehnologic constă din următoarele etape:

٠Pregătirea baloanelor pentru cultivare;

٠Pregătirea mediului nutritiv steril;

٠Însămânţarea culturii de drojdii pe mediul nutritiv;

٠Cultivarea submersă a producătorului

a) Pregătirea baloanelor pentru cultivare

Baloanele Erlenmeyer cu volumul 1000 ml destinate cultivării preventiv se

sterilizează 1 oră la temperatura de 160°C.

b) Pregătirea mediului nutritiv steril

Pentru cultivarea submersă a culturii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se utilizează mediul

cu următoarea compoziţie g/l: melasă - 20,0, (NH4)2SO4 - 3,0, MgSO4•7H2O - 0,7, NaCl -

0,5, Ca(NO3)2 - 0,4, KH2PO4 - 1,0, autolizat de drojdii - 10 ml, clorură de tricloracetat de

zinc - 10,0 mg/l, apă potabilă 1 l, pH- 5,5. Procesul de sterilizare la 1210C, timp de 30

minute, la 1,0 atmosferă.

c) Însămînţarea culturii de drojdii pe mediul nutritiv

Inoculumul se adaugă în mediul nutritiv sterilizat şi răcit în volum de 5-10 % din

volumul mediului de fermentare aproximativ 1,5-2 x106 ml-1 celule.

d) Cultivarea submersă a producătorului

Procesul de cultivare decurge conform următorilor parametri:

٠Temperatura mediului în timpul procesului de cultivare se menţine +200C;

٠pH-ul iniţial al mediului 5,5;

٠Durata procesului de cultivare 120 ore, agitare permanentă;

Page 76: Oleg Chiselita Thesis

76

٠Nu se permite poluarea cu microfloră străină.

III. Obţinerea produsului finit

Procesul tehnologic constă din următoarele etape:

٠Separarea biomasei celulare de lichidul cultural prin centrifugare;

٠Autoliza biomasei;

٠Concentrarea şi sterilizarea lichidului cultural;

٠Uscarea biomasei autolizate;

٠Determinarea compoziţiei biochimice a bioproduselor;

٠Dozarea, ambalarea, marcarea bioproduselor.

a) Separarea biomasei celulare de lichidul cultural

La finalul procesului de cultivare, se efectuează separarea biomasei de drojdii de

lichidul cultural, prin centrifugare, timp de 20 minute la 3000 (r.p.m.).

b) Autoliza biomasei

Autoliza biomasei se petrece conform procedeului descris în [17, 19].

c) Concentrarea şi sterilizarea lichidului cultural

Lichidul cultural colectat în condiţii aseptice se concentrează la temperatura de 60-

65°C pentru a mări concentraţia substanţelor biologic active la un volum de lichid şi se

sterilizează prin autoclavare timp de 1oră la 1 atm.

d) Uscarea biomasei autolizate

Biomasa autolizată se usucă până la greutate constantă la +60-65°C.

e) Determinarea compoziţiei biochimice a bioproduselor

Cu utilizarea metodelor biochimice se determină compoziţia bioproduselor.

f) Dozarea, ambalarea, marcarea bioproduselor

Bioprodusul se ambalează steril în pachete a câte 3 sau 5 g. Se indică denumirea,

destinaţia, condiţiile şi termenul de păstrare.

Caracteristica biochimică a bioprodusului Glucolev – 20

Bioprodusul Glucolev – 20 se caracterizează prin conţinut înalt de carbohidraţi

(44,2% S.U.) (figura 3.25). Din conţinutul sumar de carbohidraţi circa 77,3% revin β-

glucanilor, circa 11,5% mananilor, valorile celorlalte fracţii de glucide oscilează între

5,2 şi 5,9% din suma fracţiilor (figura 3.26).

Page 77: Oleg Chiselita Thesis

77

7,1%

44,2%

9,5%

39,2%

ProteinăCarbohidraţiLipide

Fig. 3.25. Compoziţia biochimică a bioprodusului Glucolev – 20, % S.U.

77,3%

5,2%11,5%

5,9%

Fracţia solubilă în H2O (mono-dizaharide) Fracţia solubilă în 3% NaOH (mananproteine)Fracţia solubilă în 2% H2SO4 (glicogen) Fracţia insolubilă în alcali şi acizi (β-glucani)

Fig. 3.26. Componenţa fracţionară a carbohidraţilorlor bioprodusului Glucolev – 20, % din suma fracţiilor.

O parte semnificativă a bioprodusului Glucolev – 20 o constituie proteinele,

alcătuind 39,2% S.U. (figura 3.25), care se caracterizează printr-un conţinut bogat de

aminoacizi esenţiali - 36,8% şi imunoactivi - 56,1% din suma aminoacizilor identificaţi.

Se poate evidenţia conţinutul înalt de aminoacizi esenţiali: valina, treonina, leucina,

lizina şi imunoactivi: glicina, alanina, serina, acid asparagic şi glutamic (tabelul 3.6).

A treia componentă majoră a bioprodusului o constituie lipidele, conţinutul

cărora este de 7,1% S.U. (figura 3.25), inclusiv acizii graşi nesaturaţi: palmitoleic C16:1

– 56,2% şi oleic C18:1 – 31,0% din suma acizilor graşi.

Page 78: Oleg Chiselita Thesis

78

Tabelul 3.6. Conţinutul de aminoacizi în bioproprodusul Glucolev – 20, % din sumă

Aminoacizii Conţinutul, % Acidul cisteinic 0,6 Taurina 0,3 Acidul asparagic** 11,8

Treonina* 4,8 Serina** 5,3 Acidul glutamic** 27,1

Prolina 3,2 Glicina** 5,1

Alanina** 5,9 Valina* 4,5

Cisteina** 0,9 Metionină* 0,1 Izoleucina* 3,9

Leucina* 6,5 Tirozina* 3,1 Fenilalanina* 3,6 Triptofan* 1,0 Ornitina 0,2

Lizina* 8,0 Histidina 2,8

Arginina* 1,3 * - aminoacizi esenţiali; ** - aminoacizi imunoactivi.

Aşadar analiza comparativă a compoziţiei biochimice şi efectele benefice ale produselor

glucidice estimate în literatura de specialitate [125, 152], asemănătoare cu cea a bioprodusului

Glucolev -20, ne permite să propunem bioprodusul obţinut prin tehnologia elaborată, pentru

utilizare în industria farmaceutică ca aditiv alimentar şi preparat nutraceutic.

3.4. Concluzii la capitolul 3

٠Culturile de drojdii izolate din sedimentele de vin prezintă un nivel variat al conţinutului

de carbohidraţi în biomasă, cuprins între 10,6 – 30,5% S.U. şi caractere morfo-culturale diferite

la cultivare pe mediul cu must de malţ agarizat.

٠Tulpinile de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 cultivate pe

mediu Rieder se caracterizează prin valori înalte ale conţinutului de carbohidraţi (33,5 şi 30,5%

S.U. respectiv) şi conţinut înalt de β-glucan, valorile căruia ajung la 21,0 - 22,6% S.U. şi

reprezintă obiecte de perspectivă pentru biotehnologie.

Page 79: Oleg Chiselita Thesis

79

٠Drojdiile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 metabolizează

eficient melasa, fructoza, glucoza şi zaharoza. Primele 2 asigură o creştere activă şi o acumulare

semnificativă de carbohidraţi, iar ultimele influenţează pozitiv numai procesul de biosinteză a

carbohidraţilor.

٠Pentru cultivarea tulpinii de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 în scopul majorării

productivităţii şi conţinutului de carbohidraţi în biomasă, în calitate de sursă de carbon şi energie

este adecvată utilizarea melasei în concentraţie de 20 g/l sau fructozei în concentraţie de 60 g/l, şi

a melasei în concentraţie de 20 g/l sau fructozei în concentraţie de 40 g/l pentru tulpina S.

cerevisiae CNMN-Y-21.

٠Compusul coordinativ clorură de tricloracetat de zinc în concentraţie de 10 mg/l se

manifestă în calitate de stimulator specific al multiplicării şi sintezei carbohidraţilor la cultivarea

submersă a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20.

٠Acetatul de zinc în concentraţie de 10 şi 20 mg/l prezintă efect de stimulare cu 14...26% a

biosintezei carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.

٠Culturile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă capacitatea de a

creşte într-un spectru larg de valori ale temperaturii şi pH –ului. Temperatura optimă de

multiplicare a tulpinilor în studiu este de +15°C, de biosinteză a hidraţilor de carbon +20°C,

durata de cultivare 120 ore.

٠Combinarea aplicării surselor de carbon preferenţiale şi stimulatorilor cu varierea

condiţiilor de cultivare (temperatura, pH) permite de a spori esenţial (cu 44,3%) conţinutul

carbohidraţilor la tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20.

٠Regulamentul de cultivare a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 permite valorificarea

maximală a potenţialului biosintetic şi asigură obţinerea concomitentă a 2 bioproduse valoroase:

Glucolev -20 (biomasă de drojdii autolizată) şi concentratul lichidului cultural.

Problema ştiinţifică soluţionată în acest capitol a constat în selectarea tulpinilor înalt-

productive de drojdii din sedimentele de vin şi evidenţierea factorilor care asigură un nivel optim

al productivităţii şi acumulării carbohidraţilor în biomasă.

Page 80: Oleg Chiselita Thesis

80

4. OBŢINEREA BIOPRODUSELOR VALOROASE DIN DROJDIILE

SEDIMENTELOR DE VIN

Drojdiile din sedimentele de vin sunt considerate deşeuri ale industriei vinicole şi nu

sunt valorificate. În Republica Moldova numai 70% din materia primă se foloseşte pentru

obţinerea produsului final, iar 30% din cauza lipsei tehnologiilor de utilizare a deşeurilor se

pierd. Anual cantitatea totală a acestor pierderi constituie 100-200 mii tone. Anume deşeurile

constituie problema ecologică principală a industriei vinicole. Realizările tehnico-ştiinţifice

actuale permit de a găsi căi de utilizare a deşeurilor de la vinificaţie cu obţinerea unui profit

economic uneori mai înalt decât profitul de la producerea vinului şi rezolvarea multor

probleme ecologice [8].

Actualitatea utilizării deşeurilor industriei vinicole se datorează cerinţelor crescânde

înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la vinificaţie şi perspectivei elaborării

preparatelor ecologic pure cu valoare biologică şi nutritivă înaltă, în special pentru domeniul

alimentar, farmaceutic, de cosmetice, agricol.

Drojdiile de vin, care după recuperarea alcoolului sunt aruncate, pot servi ca o

excelentă sursă de bioproduse deosebit de valoroase (concentrate proteico–vitaminice bogate

în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, lipide, bogate în acizi graşi polinesaturaţi, ergosterol -

provitamina D, glucide, etc.). Produsele din drojdiile de vin pot fi obţinute la un preţ

convenabil pentru a putea fi acceptate de potenţialii beneficiari.

4.1. Procedee de obţinere a unor fracţii glucidice din drojdiile sedimentelor de vin

În prezent, carbohidraţii sintetizaţi de microorganisme sunt utilizaţi pe larg în diferite

sfere de activitate a societăţii: medicină, cosmetologie, industria farmaceutică, alimentară, alte

domenii. Utilizarea pe larg a carbohidraţilor microbieni este determinată de proprietăţile lor:

viscozitate, caracterele reologice, capacitatea de gonflare, specificul de interacţiune cu structuri

determinante.

În farmaceutică polizaharidele se utilizează ca substrat pentru pregătirea

medicamentelor: emulgatori sau stabilizatori ai suspensiilor, agenţi de adeziune a

componentelor în comprimate, etc. Polizaharidele asigură stabilitatea şi rezistenţa îndelungată

a produselor terapeutice. Totodată, polizaharidele pot fi aplicate ca remedii medicamentoase.

Produsul „Zimozan”, sub formă de suspensie de polizaharide extrase din drojdiile S. cerevisiae

(ca substanţă activă se prezintă glucanii), se utilizează pentru stimularea leucopoiezei [236]. Β-

glucanii posedă proprietăţi imunomodulatoare pronunţate [113, 142, 180].

Page 81: Oleg Chiselita Thesis

81

Mananii extraşi din drojdia Rhodotorula rubra sunt componentul de bază la producerea

remediului terapeutic „Ronassan”, care micşorează conţinutul de colesterol şi trigliceride în serul

sanguin, îmbunătăţeşte indicii imunologici [48].

Polizaharidele microbiene sunt utilizate ca gelifianţi la prepararea produselor cosmetice: în

creme, şamponuri, loţiuni, ca tampon hidrofil şi substanţă gonflabilă. Firma „Skincode” a brevetat

şi utilizează în toate tipurile de produse cosmetice produsul, extras din drojdiile de panificaţie cu

substanţa activă glucan (carboximetilglucan), ce posedă activitate de stimulare a mecanismelor de

protecţie a pielii. β-1-3-glucanii se utilizează la tratamentul bolilor pielii [111, 216].

În alimentaţie polizaharidele se utilizează, sub formă de peliculă, pentru produsele

alimentare (caşcaval), în calitate de stabilizator la fabricarea îngheţatei, la producerea sucurilor

de fructe, ca agenţi de viscozitate a siropurilor şi gemurilor, altor produse culinare [227].

Importanţa practică a polizaharidelor microbiene necesită studii detaliate privitor la

componenţa calitativă şi cantitativă a lor.

La microorganisme, în dependenţă de specie, conţinutul de carbohidraţi variază de la 20

la 60%. Spre exemplu, polizaharidele peretelui celular al S. cerevisiae constituie aproximativ

90% din masa peretelui celular. Compoziţia biochimică a carbohidraţilor peretelui celular al

drojdiilor poate varia în funcţie de specie, condiţii şi medii de cultivare, alţi factori,

componentele majore fiind glucanii, mananproteinele şi chitina [34, 36].

Pentru extragerea diferitor clase de carbohidraţi se utilizează diferite procedee. Glucanii

şi mananii parietali din drojdiile de vin, care se deosebesc prin solubilitatea în apă, alcalii şi

acizi, pot fi extraşi din pereţii celulari prin metoda alcali-acidă [12].

Mai multe fracţii polizaharidice din celulele drojdiei Rh. rubra au fost extrase după o

schemă elaborată prin utilizarea hidroxidului de sodiu şi etanolului [72].

Studiul realizat asupra relevării şi separării carbohidraţilor algali a permis extragerea

fracţionată a mono- şi dizaharidelor solubile în alcool, a fracţiei carbohidraţilor hidrosolubili,

fracţiei polizaharidelor de tipul hemicelulozei şi pectinei, fracţiei polizaharidelor de tipul

celulozei [28].

Posibilităţile de utilizare practică a polizaharidelor microbiene şi metodele de obţinere a

unor fracţii de carbohidraţi din drojdii nu sunt pe deplin elucidate. Studiul detaliat al

carbohidraţilor microbieni va deschide noi perspective şi va contribui la lărgirea posibilităţilor

industriei microbiologice.

Scopul cercetărilor în acest subcapitol constă în stabilirea metodelor eficiente de extracţie

a carbohidraţilor din drojdiile de la vinificaţie şi identificarea componenţei calitative a acestora.

Page 82: Oleg Chiselita Thesis

82

Ca obiect de studiu au servit drojdiile din sedimentele de vin roşu (Cabernet) şi alb

(Chardonnay), oferite de Institutul Naţional de Viticultură şi Vinificaţie în anul 2008.

Determinarea substanţei uscate, conţinutul sumar de carbohidraţi, extragerea fracţionată,

purificarea şi conţinutul calitativ al carbohidraţilor au fost efectuate prin metodele descrise în

capitolul 2.

Pentru început a fost studiat conţinutul sumar de carbohidraţi în biomasa drojdiilor din

sedimentele de vin. S-a determinat că drojdiile provenite de la vinul roşu conţin 23,2±0,13%

S.U. de carbohidraţi, iar cele provenite de la vinul alb - 31,1±0,54% S.U. Drojdiile din

sedimentele cercetate în anii precedenţi conţineau 28,4±0,31% S.U. carbohidraţi pentru cele

provenite de la vinul roşu şi 33,6±0,43% S.U. - pentru cele de la vinul alb.

Ţinând cont de rezistenţa mecanică deosebită a peretelui celular al drojdiei de vin,

biomasa microbiană a fost supusă unor tratamente pentru spargerea peretelui celular şi eliberarea

conţinutului acestuia. Aceste tratamente au inclus:٠autoliza drojdiilor,٠dezintegrarea cu

ultrasunet.

٠Autoliza a fost efectuată conform procedeului elaborat şi descris [17, 19], care constă

din 2 etape:

٠Purificarea sedimentelor: a) spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de 1:3,

timp de 10-15 minute. Decantarea fazei lichide. b) spălarea biomasei de drojdii cu soluţie de

bicarbonat de sodiu de 1 % sau 5 % în proporţie de 1:3, urmată de separarea biomasei de la

supernatant prin decantare.

٠Autoliza drojdiilor. Prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare

congelată, purificarea sedimentelor prin spălare cu apă sau soluţie de 1% de NaCl (în volum 1:3),

efectuarea autolizei drojdiilor (biomasă:apă - 1:4 după substanţă uscată) timp de 8 ore, având ca

factor de inducţie acidul acetic glacial (3 sau 5 ml la 1 l suspensie drojdii) şi temperatura de

+550C.

٠Dezintegrarea biomasei de drojdii prin ultrasonare a fost efectuată la frecvenţa de 22

Hz timp de 1, 2 şi 3 minute. Metoda prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare

congelată. Biomasa de drojdii se diluează cu apă distilată în raport de 1:3 pentru sporirea

eficacităţii procesului de distrugere a pereţilor celulari.

Conţinutul de carbohidraţi a fost determinat în autolizatul integral şi în fracţia pereţilor

celulari separată de supernatant prin centrifugare.

Din analiza rezultatelor obţinute se vede, că în biomasa de drojdii dezintegrată cu

ultrasunet timp de 2 minute se conţin 45,7% S.U. de carbohidraţi pentru drojdiile de la vinul roşu

şi 41,9% S.U. - pentru cele de la vinul alb. Autoliza biomasei la temperatura de 550C cu

Page 83: Oleg Chiselita Thesis

83

adăugarea acidului acetic de asemenea duce la rezultate bune, conţinutul de carbohidraţi

ajungând în drojdiile de la vinul roşu până la 42,7% S.U., şi în cele de la vinul alb - până la

48,4% S.U. În fracţia pereţilor celulari s-a determinat o cantitate de glucide mai mică comparativ

cu fracţia integrală, ceea ce poate fi explicat prin absenţa mono- şi dizaharidelor, care sunt

eliminate cu faza lichidă. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 4.1.

Tabelul 4.1. Conţinutul de carbohidraţi în drojdiile sedimentelor vinicole supuse autolizei şi

dezintegrării cu ultrasunet, (% S.U. X1± x1) Drojdii din sedimente de la vinul roşu Drojdii din sedimente de la vinul alb Fracţia

Autoliza

550C

Autoliza 550C+ acid

acetic

Ultra sunet 1 min

Ultra sunet 2 min

Ultra sunet 3 min

Autoliza

550C

Autoliza 550C+ acid

acetic

Ultra sunet 1 min

Ultra sunet 2 min

Ultra sunet 3 min

Integrală

40,8± 0,01

42,7± 0,33

38,5± 1,40

45,7± 1,89

42,9± 0,01

45,2± 1,80

48,4± 0,87

42,6± 0,98

41,9± 0,01

37,5± 1,61

Pereţi celulari

28,2± 0,85

29,6± 0,57

23,1± 0,57

42,5± 0,79

30,0± 0,01

36,9± 0,90

36,7± 0,29

36,2± 1,21

38,9± 2,12

32,3± 1,99

Astfel, rezultatele au condus la concluzia, că maximumul de eficienţă a spargerii celulei se

obţine prin ambele procedee. Dar, deoarece din punct de vedere economic procesul de autoliză este

mai puţin costisitor, ca metodă de distrugere a pereţilor celulari al drojdiilor din sedimente de vin

se propune autoliza la +550C cu adăugarea acidului acetic (5 ml la 1l de suspensie).

Unii autori relatează despre prezenţa la drojdii a diferitor fracţii de carbohidraţi,

predominante fiind mananii şi glucanii. Conform informaţiilor despre structura peretelui celular

al drojdiilor, în stratul exterior se află proteomananii solubili în alcalii, iar stratul interior

insolubil în alcalii este prezentat de microfibre de chitină asociată cu β-1,3, 1,6 glucani [172].

În baza acestor argumente, dar şi din necesitatea de a stabili prezenţa tuturor grupelor de

carbohidraţi, în cercetările noastre ca bază au fost utilizate 2 metode de extracţie, prima propusă

de Tihomirova (1998), care prevede extracţia cu alcool, apă şi alcalii a carbohidraţilor din

drojdiile genului Rhodotorula [72], şi a doua aplicată de Rudic et al. (2008), conform căreia

extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din alge se efectuează cu apă, alcool şi acid

sulfuric [28], metodele fiind ajustate de noi pentru drojdiile de la vinificaţie.

În primul set de experienţe, fracţiile de carbohidraţi din drojdiile sedimentelor de vin au

fost obţinute conform schemei descrise în figura 4.1, fiind aplicate procedee de extragere cu

alcool, apă şi alcalii. Ca material de lucru a servit biomasa drojdiilor din sedimentele de vin

păstrată la congelator -180C, decongelată, spălată 1-2 ori cu apă în raport de 1:3, timp de contact

15 min. şi biomasa drojdiilor supusă adăugător autolizei în termostat la + 550C, în prezenţa

acidului acetic (5ml la 1 l de suspensie), timp de 8 ore, cu agitare periodică.

Page 84: Oleg Chiselita Thesis

84

Fig. 4.1. Schema extracţiei fracţionate cu alcool, apă şi alcalii a carbohidraţilor din biomasa drojdiilor de la vinificaţie, după Tihomirova [72].

Procedeul de extragere fracţionată a complexului de carbohidraţi se desfăşoară conform

operaţiunilor tehnologice: probele se prelucrează cu alcool etilic de 80 % în raport de 1:2, pe baie

de apă 70-800C, timp de 15 min. se supun centrifugării la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura

se repetă de 3 ori, supernatantele se reunesc. Aceasta este fracţia I. Sedimentul rezultat se

tratează cu apă distilată în raport de 1:2 pe baie de apă 40-450C, timp de 10-15 min. şi se

centrifughează la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura se execută de 3 ori, supernatantele unite

formează fracţia II.

În continuare sedimentul rezultat este tratat cu NaOH 3%, raport 1:3, pe baie de apă la

1000C, timp de 1 oră (pentru extragerea proteomananilor). Probele se centrifughează la 6000

r.p.m. timp de 20 min. În continuare precipitatul se spală de 2 ori cu apă distilată şi se

centrifughează. Supernatantele reunite se neutralizează cu acid acetic glacial, se centrifughează şi

Drojdii de la vinificaţie congelate /decongelate sau autolizate

Extracţia cu alcool etilic 80%, raport 1:2, 70-800C, 15 min. (3 ori)

Supernatant. Fracţia I Precipitat

Carbohidraţi extraşi cu alcool

Extracţia cu apă, raport 1:2, 40-450C, 10 min. 3 ori

Supernatant. FracţiaII Precipitat

Extracţia cu NaOH 3%, raport 1:3, 1000C, 1 oră

Precipitat. Fracţia IV

Carbohidraţi insolubili în alcalii

Carbohidraţi extraşi cu apă

Carbohidraţi solubili în alcalii

Supernatant. Fracţia III

Page 85: Oleg Chiselita Thesis

85

se obţine fracţia III solubilă în alcalii, care conform informaţiilor din literatură conţine proteo-

manani [12].

Sedimentul rezultat de la extracţia cu NaOH 3% constituie fracţia IV insolubilă în alcalii.

Conform unor surse bibliografice de specialitate [12, 143], această fracţie insolubilă în alcalii

este constituită din glucani fibrilari.

În rezultatul analizei colorimetrice cu reactivul antron a fracţiilor obţinute din drojdiile

congelate/decongelate s-a constatat, că fracţia IV insolubilă în alcalii este fracţia majoră a glucidelor

drojdiilor, care constituie 17,7% S.U. pentru drojdiile provenite de la vinul roşu şi 24,8% S.U. pentru

cele provenite de la vinul alb. Fracţia III a carbohidraţilor solubili în alcalii la drojdiile provenite de la

vinul roşu constituie 3,0% S.U. La drojdiile provenite de la fermentaţia vinului alb această fracţie

constituie 4,5% S.U. Împreună aceste 2 fracţii constituie circa 92% din suma carbohidraţilor la

drojdiile de la vinul roşu şi circa 96% la drojdiile de la vinul alb. Rezultatele sunt prezentate în

tabelul 4.2.

Tabelul 4.2. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin congelate/decongelate obţinute prin extracţie cu alcool, apă şi alcalii, după Tihomirova [72]

Drojdii din sediment de

la vinul roşu

Drojdii din sediment de

la vinul alb

№ Fracţia

% S.U. X1±x2 % din Σ fracţiilor

% S.U. X1±x2 % din Σ fracţiilor

I Alcoolsolubilă 1,3±0,05 5,7 0,9±0,07 2,8

II Hidrosolubilă 0,4±0,07 1,9 0,3±0,01 1,0

III Solubilă în alcalii 3,0±0,03 13,5 4,5±0,33 14,7

IV Insolubilă în alcalii 17,7±0,31 78,8 24,8±0,99 81,4

V Σ Fracţiilor 22,5±0,15 100 30,5±0,6 100

În tabelul 4.3 sunt expuse rezultatele analizei fracţiilor similare, obţinute din drojdiile

supuse autolizei. Ca şi în cazul precedent, majoră este fracţia IV insolubilă în alcalii, constituind

31,7% S.U pentru drojdiile provenite de la vinul roşu şi 35,0% S.U. pentru cele de la vinul alb.

Aceste valori, cât şi ale celorlalte fracţii sunt de 1,5-2 ori mai mari ca în cazul drojdiilor nesupuse

autolizei, ceea ce denotă eficacitatea autolizei ca metodă de distrugere a pereţilor celulari.

În următorul set de experienţe, pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi

ca bază a fost utilizată metoda fracţionării în 4 etape cu utilizarea alcoolului, apei şi acidului

sulfuric aplicată pentru alge de Rudic şi coaut. [28] şi ajustată de noi pentru drojdii. Ca material

Page 86: Oleg Chiselita Thesis

86

de lucru a servit biomasa drojdiilor din sedimentele de vin, păstrată la congelator -180C, spălată

şi supusă aceloraşi tratamente ca şi în setul precedent de experienţe.

Tabelul 4.3. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin supuse autolizei obţinute prin extracţie cu alcool, apă şi alcalii, după (Tihomirova 1998) [72]

Drojdii din sediment de la vinul roşu

Drojdii din sediment de la vinul alb

№ Fracţia

% S.U. X1±x2 % din Σ fracţiilor

% S.U. X1±x2 % din Σ fracţiilor

I Alcoolsolubilă 2,8±0,03 6,8 4,6±0,65 9,4

II Hidrosolubilă 2,0±0,01 5,0 2,9±0,01 5.8

III Solubilă în alcalii 4,1±0,09 10,1 6,5±0,42 13,2

IV Insolubilă în alcalii 31,7±0,56 78,1 35,1±0,7 71,5

V Σ Fracţiilor 40,7±0,48 100 49,0±0,36 100

Fracţionarea biomasei de drojdii a fost executată în 4 etape. La prima etapă au fost extrase mono-

şi dizaharidele cu alcool etilic de 80 %, în raportul 1:2, pe o baie de apă, la temperatura +70-800C, timp de

15 min., după ce amestecul a fost centrifugat la 6000 r.p.m. Procedura a fost efectuată de 3 ori,

supernatantele s-au reunit - fracţia I. Precipitatul a fost tratat cu apă caldă în raportul 1:2, pe o baie de apă

la temperatura +40-450C, timp de 10-15 min., după care a fost centrifugat. Procedura a fost repetată de 3

ori, supernatantele s-au reunit. Astfel, a fost obţinută fracţia II compusă din polizaharide coloidale.

Polizaharidele de tipul hemicelulozei şi compuşilor pectici au fost extrase prin hidroliza

precipitatului cu o soluţie de 2% de H2SO4 pe o baie de apă la temperatura +1000C, timp de 5 ore.

Extractul a fost centrifugat la 6000 r.p.m. Precipitatul a fost spălat repetat cu apă. Supernatantul s-

a reunit cu apele de spălare a precipitatului şi s-a neutralizat cu BaCO3 - fracţia III.

Fracţia a IV-a (polizaharidele de tipul celulozei) a fost obţinută prin hidroliza restului

probei (precipitatului) cu soluţie de 80% de H2SO4, timp de 2 ore. Extractul obţinut a fost

neutralizat cu BaCO3. Schema obţinerii fracţiilor glucidice este expusă în figura 4.2.

În toate fracţiile a fost determinat conţinutul de carbohidraţi după metoda colorimetrică

cu reactivul antron. Rezultatele cercetărilor au demonstrat, că fracţia III obţinută din drojdiile

autolizate constituie 12,3% S.U. la cele de la vinul roşu şi 23,6% S.U. la cele de la vinul alb.

Aceeaşi fracţie III, extrasă din sedimentul numai congelat/decongelat este de 2 ori mai mică.

Fracţiile I şi II din drojdiile congelate/decongelate de asemenea sunt de 2-2,5 ori mai mici ca cele

din drojdiile supuse autolizei, fapt ce denotă eficacitatea autolizei. Fracţia IV în toate probele

constituie de la 16,9 până la 17,3% S.U. Rezultatele sunt expuse în tabelul 4.4.

Page 87: Oleg Chiselita Thesis

87

Fig. 4.2. Schema extragerii fracţionate cu alcool, apă şi acid sulfuric a carbohidraţilor din biomasa drojdiilor de la vinificaţie, după Rudic şi coaut. [28].

Tabelul 4.4. Componenţa fracţionară a carbohidraţilor din drojdiile sedimentelor de vin obţinute prin extracţia cu alcool, apă şi acid sulfuric, după Rudic şi coaut. [28]

Drojdii de la vinul roşu

cong./decong.

Drojdii de la vinul roşu autolizate

Drojdii de la vinul alb

cong./decong.

Drojdii de la vinul alb autolizate

№ Fracţia % S.U. X1±x2

% din Σ fracţii

lor

% S.U. X1±x2

% din Σ fracţii

lor

% S.U. X1±x2

% din Σ fracţii

lor

% S.U. X1±x2

% din Σ fracţii

lor

I Alcool solubilă

1,4±0,03 5,9 2,2±0,03 6,6 1,6±0,12 5,5 3,8±0,78 8,1

II Hidro solubilă

0,7±0,16 3,0 1,2±0,01 3,6 0,9±0,03 3,0 2,2±0,33 4,6

III Hidrolizată cu H2SO4

2% 5,1±0,46 21,1 12,3±0,27 37,4 10,2±0,68 34,3 23,6±0,25 50,7

IV Hidrolizată cu H2SO4

80% 16,9±0,14 70,0 17,3±0,08 52,4 16,9±0,55 57,1 17,1±0,18 36,6

V Σ Fracţiilor

24,2±0,13 100 33,0±0,39 100 29,7±0,29 100 46,7±1,54 100

Drojdii de la vinificaţie congelate / decongelate sau autolizate

Extracţia cu alcool etilic 80%, raport 1:2, 70-800C, 15 min, centrifugare 6000 r.p.m.,

20 min.,3 ori

Supernatant. Fracţia I Precipitat

Carbohidraţi extraşi cu alcool

Extracţia cu apă raport 1:2, 40-450C, 10 min. 3 ori

Supernatant. FracţiaII Precipitat

Hidroliza în H2SO4 (2%), 1000C, 5 ore, centrifugare,

neutralizare cu BaCO3

Precipitat

Hidroliza în H2SO4 (80%), temp. camerei, 2 ore,

centrifugare. Fracţia IV

Carbohidraţi extraşi cu apă

Carbohidraţi hidrolizaţi în H2SO4 (2%)

Supernatant. Fracţia III

Page 88: Oleg Chiselita Thesis

88

Pentru a identifica complexul de carbohidraţi extraşi din biomasa drojdiilor de la

vinificaţie, a fost utilizată metoda cromatografiei în strat subţire pe plăci Sorbfil. Analiza

rezultatelor a arătat, că fracţia III extrasă cu soluţie NaOH 3% (conform procedeului I) are ca

monozaharide constituente D-manoza, fapt ce ne permite să afirmăm că la utilizarea solventului

dat din biomasa de drojdii a fost extras mananul, parte componentă a peretelui celular al

drojdiilor.

Fracţia III extrasă cu soluţie H2SO4 2% (conform procedeului II) are ca monozaharide

constituente D-glucoza şi D-manoza, fapt care se explică prin aceea, că în acest caz am extras

mananii şi fracţia glicogenului solubilă în soluţii de acid.

Aşadar, în rezultatul cercetărilor s-a constatat eficienţa înaltă a ambelor metode de

extracţie fracţionată a carbohidraţilor din biomasa de drojdii. Cantităţi apropiate de carbohidraţi

au fost stabilite pentru fracţiile I şi II obţinute prin ambele metode. Însă, variaţiile semnificative

ale conţinutului fracţiilor III şi IV, care se presupune că sunt constituite din manani şi β-glucani,

argumentează necesitatea efectuării cercetărilor de perfecţionare a procedeelor cunoscute şi a

elabora altă schemă de obţinere a polizaharidelor din drojdiile sedimentelor de vin.

În baza rezultatelor obţinute, în continuare cercetările au fost axate pe separarea

fracţionată succesivă a carbohidraţilor conform solubilităţii lor în apă, alcalii şi acizi. Ca cerinţe

de bază au fost respectate: randamentul de extragere cât mai înalt şi puritatea produselor extrase.

Ca material de lucru au servit drojdiile rezultate în urma fermentării vinurilor de masă

roşii şi albe, păstrate la congelator la -18°C.

La prima etapă probele au fost supuse extracţiei cu apă distilată în raportul de 1:2

(biomasă : apă) pe o baie de apă la temperatura +40-450C, timp de 10 -15 min., după care au fost

centrifugate la 6000 r.p.m. timp de 20 min. Procedura a fost executată de 2 ori, iar supernatantele

au fost reunite. Astfel, a fost obţinută fracţia I, care reprezintă glucidele hidrosolubile (mono- şi

dizaharide), sedimentate din faza lichidă cu etanol de 96%, în raportul de 1:2 (supernatant :

alcool). Aplicând metoda spectrofotometrică cu reactivul antron a fost stabilit, că fracţia I

constituie 2,9 - 3,4% S.U. în dependenţă de provenienţa drojdiilor (figura 4.3). Componenţa

calitativă a glucidelor fracţiei este practic similară în toate probele.

Prin cromatografierea în strat subţire a glucidelor fracţiei I a fost identificată prezenţa

pentozelor şi hexozelor – glucoza, manoza, fructoza, arabinoza şi galactoza. Glucoza şi fructoza

sunt principalele monozaharide care formează „zahărul liber reducător”. Aceste două

monozaharide împreună cu zaharoza formează „zahărul total liber”. Zahărul total liber se extrage

cu uşurinţă din produse vegetale cu alcool etilic, separându-se astfel de glucidele neconstitutive

Page 89: Oleg Chiselita Thesis

89

(amidon, fructozani), precum şi de cele cu rol constitutiv (celuloza, hemiceluloza, etc.). Fracţia I

pe lângă glucide conţine proteine hidrosolubile, acizi nucleici, alţi polimeri uşor solubili în apă.

Sedimentul (fracţia pereţilor celulari) a fost tratat cu o soluţie de 3% de NaOH în raportul

precipitat:sol. alcalină - 1:3, la temperatura1000C, timp de 1 oră şi apoi centrifugat. Procedura a

fost repetată de 2 ori. Precipitatul a fost spălat repetat cu apă distilată. Supernatantele s-au reunit,

constituind fracţia II, care reprezintă glucidele solubile în alcalii - mananproteinele, precipitate

din soluţie cu etanol de 96% în raport de 1:2 (supernatant:alcool). La drojdiile

congelate/decongelate fracţia II variază de la 3,1 până la 3,9% S.U. (figura 4.3).

05

10152025303540

Car

bohi

draţ

i, %

S.U

.

Drojdii din sedimente dela vin roşu

Drojdii din sedimente dela vin alb

Fig. 4.3. Raportul cantitativ al fracţiilor de carbohidraţi la drojdiile din sedimentele de vin.

Sedimentul rămas, insolubil în alcalii, a fost identificat drept un complex de polizaharide

formate numai din glucoză, denumite în general glucani sau glucozani. Din această clasă fac

parte glicogenul şi celuloza. În continuare, sedimentul susmenţionat a fost tratat cu soluţie de

H2SO4 de 2% (pentru eliminarea glicogenului) în raportul precipitat:acid 1:2, pe o baie de apă la

temperatura +1000C, timp de 1 oră, fiind apoi centrifugat. Extracţia a fost repetată de 2 ori.

Precipitatul a fost spălat repetat cu apă, iar supernatantele reunite, rezultând fracţia III

reprezentată de glicogen. Fracţia III constituie, în dependenţă de provenienţa drojdiilor, 3,6 -

7,6% S.U. (figura 4.3).

Sedimentul rămas, insolubil în alcalii şi acizi, după spălări succesive cu apă, alcool etilic,

centrifugare şi uscare a fost identificat ca fracţia IV, reprezentând fracţia β-glucanilor. În drojdiile

sedimentelor de vin ea este dominantă cantitativ indiferent de provenienţa lor şi variază între 16,3

şi 17,4 % S.U. la drojdiile provenite din sedimentele vinurilor roşii şi albe, respectiv (figura 4.3).

Schema de realizare a procedeelor propuse este prezentată în figura 4.4.

Page 90: Oleg Chiselita Thesis

90

Astfel, procedeul propus se deosebeşte de procedeele cercetate prin aplicarea succesivă a

alcaliilor şi acizilor, ceea ce dă posibilitate de a separa fracţiile alcalinosolubile de cele solubile

în acizi, obiectiv irealizabil prin utilizarea altor procedee.

Fig. 4.4. Schema extragerii fracţionate cu apă, alcalii şi acizi a carbohidraţilor din biomasa

drojdiilor de la vinificaţie.

Acest procedeu permite obţinerea din drojdiile sedimentelor de vin a 4 fracţii glucidice:

1) hidrosolubilă (mono- şi dizaharide), ce constituie 2,9 – 3,4% S.U., 2) alcalinosolubilă

(manani) - 3,1 – 3,9% S.U., 3) solubilă în acizi (de tip glicogen) - 3,6 - 7,6% S.U., 4) insolubilă

în alcalii şi acizi (β-glucani) - 16,3 - 17,4 %S.U. în dependenţă de originea biomasei.

Rezultatele obţinute referitor la compoziţia şi conţinutul cantitativ al glucidelor din

drojdiile sedimentelor de vin roşu şi alb au o importanţă majoră pentru utilizarea lor practică ca

Drojdii de la vinificaţie congelate / decongelate sau autolizate

Extracţia cu apă raport biomasă-apă 1:2, 40-450C, 10-15 min. 2 ori.

Centrifugare la 6000 rot./min. 20 min.

Supernatant. Precipitat

Fracţia I Carbohidraţi extraşi cu apă şi

precipitaţi cu alcool în raport 1:2

Extracţia cu NaOH 3%, raport 1:3, 1000C, 1 oră, 2 ori. Spălare repetată cu apă, centrifugare la

6000 rot./min. 20 min.

Supernatant. Precipitat

Extracţia cu H2SO4 (2%) în raport 1:2, 1000C, 1 oră, 2 ori.

Spălare repetată cu apă, centrifugare la 6000 rot./min.

20 min.

Precipitat

Spălare repetată cu apă, alcool etilic, filtrare, uscare la 40-450C

- Fracţia IV – carbohidraţi insolubili în alcalii şi acizi

FracţiaII Carbohidraţi extraşi cu soluţii slabe alcaline şi precipitaţi cu

alcool în raport 1:2

Fracţia III Carbohidraţi extraşi cu soluţii slabe de acid şi precipitaţi cu

alcool în raport 1:2

Supernatant. neutralizare cu BaCO3

Page 91: Oleg Chiselita Thesis

91

una din surse alternative pentru obţinerea polizaharidelor valoroase pentru medicină,

cosmetologie, industria alimentară şi alte domenii ale economiei ţării.

Generalizând rezultatele obţinute în subcapitolul 4.1, putem conchide, că autoliza şi

ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu eficient pentru distrugerea peretelui celular, valorile

obţinute de carbohidraţi variind între 42,7 - 48,4% S.U. comparativ cu 23,2 - 31,1% S.U. în

sedimentele nesupuse tratamentelor susmenţionate.

Complexul de polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular al drojdiilor de la

vinificaţie este compus preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi

semnificative atât la drojdiile din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.

Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie se

propune procedeul de extracţie cu utilizarea apei, soluţiilor slabe de alcalii şi acizi.

Utilizarea acestui procedeu, permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii

şi albe a 4 fracţii de glucide: 1) hidrosolubilă (mono- dizaharide), 2) alcalinsolubilă

(mananproteine), 3) solubilă în acizi (de tip glicogen), 4) insolubilă în alcalii (β-glucanii).

4.2. Procedee de obţinere a bioproduselor complexe din drojdiile sedimentelor de vin

În baza principiilor bioactive microbiene se elaborează diferite tipuri noi de suplimente

alimentare şi furajere. Din seria companiilor producătoare de suplimente fac parte aşa firme

cunoscute, cum ar fi Alltech (Nicolasvilli, Kenttukki, SUA); Biokon (Leksington, Kenttukki,

SUA); Biotal (Izen Preari, Minesota, SUA). Graţie interesului faţă de problema în discuţie,

cercetările privind evidenţierea de noi surse pentru obţinerea principiilor bioactive au fost reluate

şi continuate în mod intensiv.

În grupul denumit generic „drojdii de vin” sunt incluse şi speciile genului

Saccharomyces, care pot fi active în condiţiile existente în mustul de struguri, caracterizat printr-

un conţinut sporit de glucide şi pH acid. Cantitatea depunerilor de drojdii variază între 5-12 %

din volumul vinului.

Determinarea componenţei biochimice a biomasei drojdiilor de la vinificaţie, ca resurse

secundare, este importantă pentru obţinerea preparatelor de perspectivă. Actualitatea acestei

direcţii se datorează cerinţelor crescânde înaintate problemei de utilizare a drojdiilor de la

vinificaţie şi perspectivei elaborării preparatelor ecologic pure, precum şi sporirii importanţei lor

biologice şi nutritive pentru necesităţile economiei republicii, în special pentru sectorul zootehnic.

Scopul cercetărilor în subcapitolul 4.2 constă în determinarea componenţei biochimice a

drojdiilor din sedimentele de vin, eficientizarea prelucrării lor pentru obţinerea diferitor tipuri de

suplimente furajere.

Page 92: Oleg Chiselita Thesis

92

4.2.1. Studiul compoziţiei biochimice a drojdiilor din sedimente de vin

Cercetările au avut ca material biologic drojdiile de vin din sedimente de la vinurile de

masă roşii (varianta I), albe (varianta II), oferite de colaboratorii Institutului Naţional pentru

Viticultură şi Vinificaţie şi sedimente de la vinurile de masă albe de la Fabrica de vinuri din

Străşeni (varianta III) în anul 2006. Pentru înlăturarea impurităţilor mecanice, drojdiile au fost

spălate (1 volum sediment + 3 volume apă) şi filtrate.

În primul set de experienţe a fost studiat conţinutul de proteină şi aminoacizi. Analizând

datele conţinutului de proteină, se constată că valorile acesteia variază de la 41,3 la 52,2% S.U.

în dependenţă de provenienţa drojdiilor (figura 4.5). Azotul total constituie 8,3% S.U. (varianta

I), 6,6% S.U. (varianta II) şi 7,6% S.U. (varianta III).

0

10

20

30

40

50

60

varianta I varianta II varianta III

Con

cent

raţia

, % S

.U.

Proteină Azotul total

Fig. 4.5 Conţinutul de proteină şi azot total în drojdiile din sedimente vinicole.

Valoarea nutritivă a proteinelor depinde de calitatea aminoacizilor. În general, drojdiile

de vin sunt valoroase prin conţinutul înalt al aminoacizilor şi din acest punct de vedere ele sunt

comparabile cu carnea.

În rezultatul cercetării conţinutului de aminoacizi în biomasa drojdiilor de la fermentarea

vinului roşu şi alb a fost stabilit, că cantitatea sumară a aminoacizilor alcătuieşte 42,7 - 67,9%

S.U. Drojdiile se caracterizează printr-un conţinut înalt de aminoacizi esenţiali 20,4 – 29,8%

S.U. (tabelul 4.5), în special treonină, valină, izoleucină, leucină, lizină şi arginină.

Conţinutul aminoacizilor imunoactivi constituie 28,7 - 40,7% din totalul aminoacizilor

identificaţi (tabelul 4.6). Drojdiile de la vinurile roşii (varianta I) conţin cantităţi importante de

serină, glicină, alanină, valină. În drojdiile provenite de la vinurile albe prevalează acidul

asparagic (3,0 % S.U.) şi arginina (7,2 % S.U.) (variantele II şi III).

Page 93: Oleg Chiselita Thesis

93

Astfel, sedimentele de drojdii de la fermentarea vinurilor roşii şi albe constituie o bună

sursă de proteine, valoarea nutritivă a cărora este condiţionată de conţinutul înalt al

aminoacizilor esenţiali şi imunoactivi. Drojdiile din sedimentele de vin pot fi unul din

componentele de bază eficiente pentru elaborarea suplimentelor nutriţionale şi adaosurilor

furajere.

Tabelul 4.5. Conţinutul de aminoacizi esenţiali în drojdiile de la vinificaţie, % S.U

Aminoacizii Varianta I Varianta II Varianta III

Treonina 2,7 2,5 1,7

Valina 2,1 1,2 1,4

Metionina 0,1 0,01 0,01

Izoleucina 3,7 2,2 2,2

Leucina 4,9 3,1 4,1

Fenilalanina 1,9 1,2 1,3

Lizina 4,7 3,4 4,3

Histidina 2,0 0,9 1,2

Triptofan - - -

Arginina 6,2 5,9 7,2

Total 28,4 20,4 29,8

Tabelul 4.6. Conţinutul de aminoacizi imunoactivi în drojdiile de la vinificaţie, % S.U

Aminoacizii Varianta I Varianta II Varianta III

Acid asparagic 1,3 3,0 2,6

Treonina 2,7 2,5 1,7

Serina 6,2 1,9 2,7

Acid glutamic 11,6 9,7 10,8

Glicina 4,9 1,9 2,1

Alanina 5,2 1,9 2,1

Valina 2,1 1,2 1,4

Cisteina 0,5 0,4 0,5

Triptofan - - -

Arginina 6,2 5,9 7,2

Total 40,7 28,7 31,1

Page 94: Oleg Chiselita Thesis

94

În cadrul următoarei etape de lucru, în drojdiile din sedimentele de vin a fost studiat

conţinutul de carbohidraţi. Carbohidraţii, compuşi, produşi de multe microorganisme, inclusiv de

drojdii, sunt unii din principiile bioactive des utilizate în industriile alimentară, cosmetică,

farmaceutică. Peretele celulei de drojdie este alcătuit în proporţie de 90% din glucani, mananproteine

şi chitină. Drojdiile din sedimentele de vin sunt deosebit de valoroase, deoarece conţin mai multe

tipuri de polizaharide, care sunt reprezentate în special de glucani, manani, glicogen [12].

Pentru a determina conţinutul carbohidraţilor în biomasă, drojdiile de vin au fost spălate

pentru separarea impurităţilor mecanice (resturi de pieliţe şi seminţe) şi lăsate 24 ore la

temperatura ambiantă. Rezultatele cercetărilor demonstrează, că drojdiile din sedimentele de vin

conţin 28,4 - 35,5% S.U. de carbohidraţi (tabelul 4.7).

Studiul lipidelor, ca substanţe de rezervă cu un înalt nivel energetic, demonstrează că

conţinutul lor ajunge la 5,4-6,6% în biomasa uscată a drojdiilor de la vinificaţie (tabelul 4.7), cea mai

mare valoare fiind obţinută la drojdiile de la vinurile albe de la INVV. Compoziţia lipidelor din

drojdii este deosebit de variată şi importantă pentru obţinerea emulgatorilor, deoarece conţin clase de

compuşi organici, în special fosfolipide, care formează emulsii stabile [43, 188, 193, 224, 233, 241].

Tabelul 4.7. Conţinutul carbohidraţilor şi lipidelor în drojdiile de la vinificaţie, % S.U. X1± x1

Principii bioactive Varianta I Varianta II Varianta III

Carbohidraţi 28,4 ± 0,31 33,6 ± 0,43 35,5 ± 0,10

Lipide 6,1 ± 0,20 6,6 ± 0,15 5,4 ± 0,10

Profilul componenţei fracţionare a lipidelor stabileşte prezenţa fosfolipidelor, sterolilor,

acizilor graşi liberi, mono-, di- şi trigliceridelor (tabelul 4.8). Conţinutul fosfolipidelor diferă în

variantele cercetate şi oscilează între 3,7 şi 4,4% din suma fracţiilor lipidice. Conţinutul acizilor

graşi liberi în biomasa drojdiilor variază în limitele 4,4 - 8,6%, mono- şi digliceridele constituie

10,2 - 15,5% din suma fracţiilor lipidice, iar conţinutul trigliceridelor este de 17,4 - 22,1%.

Drojdiile de la vinificaţie se caracterizează prin conţinutul înalt al sterolilor (provitamina D),

care constituie până la 14,3% din suma lipidelor (varianta I).

Proprietăţile lipidelor din membrana celulară în mare măsură depind de gradul de

saturare a acizilor graşi. Activitatea biologică a acizilor oleic, linolic, linolenic este importantă

prin implicarea lor în numeroase procese fiziologice. Conform datelor din literatură, drojdiile de

vin din genul Saccharomyces conţin în jur de 80,7...88,2% acizi graşi nesaturaţi, în care

prevalează acidul palmitoleic (pînă la 47,9% din sumă) şi acidul oleic, care constituie

32,8...56,5% din suma acizilor graşi [42]. Cercetările privind spectrul de acizi graşi din lipidele

Page 95: Oleg Chiselita Thesis

95

drojdiilor de la vinurile roşii şi albe evidenţiază o compoziţie deosebit de valoroasă, conţinutul

de acizi esenţiali faţă de suma acizilor identificaţi constituind: linolic 5,6 – 8,0% şi linolenic 3,2 -

5,6%. Conţinutul procentual al acizilor graşi saturaţi variază de la 20,9 la 39,1%, cel al acizilor

nesaturaţi constituie 60,9 – 79,9% (tabelul 4.9). Compoziţia biochimică a lipidelor indică

posibilitatea utilizării lor în cosmetologie.

Tabelul 4.8. Componenţa fracţionară a lipidelor la drojdiile de la vinificaţie, (% din suma fracţiilor) Principii bioactive Varianta I Varianta II Varianta III

Fosfolipide 4,4 4,2 3,7 Sterine 14,3 13,1 11,0

Acizi graşi liberi 8,6 5,7 4,4 Mono-,digliceride 12,4 10,2 15,5

Trigliceride 17,4 18,5 22,1 Eteri de sterine şi ceruri 37,1 42,6 36,9

Tabelul 4.9. Conţinutul principalilor acizi graşi în lipidele drojdiilor de la vinificaţie

Acizii graşi, % din sumă Suma acizilor, % Varianta

C14:0

(miris

tinic)

C16:0

(pal

mitic)

C16:1

(palmit

oleic)

C18:0

(stea

ric)

C18:1

(ole

ic)

C18:2

(lino

lic)

C18:3

(lino

lenic)

Satu

raţi

Nesatu

raţi

I 16,8 9,5 40,9 12,7 10,0 6,8 3,2 39,1 60,9

II 9,3 7,7 58,6 4,0 13,3 8,0 - 20,9 79,9

III 16,8 17,7 23,4 0,9 29,9 5,6 5,6 35,5 64,5

Aşadar, drojdiile din sedimentele de vin prezintă o sursă valoroasă de proteină ce conţine

practic toţi aminoacizii esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi, lipide bogate în fosfolipide,

gliceride, ergosterol (provitamina D), acizi graşi esenţiali [16]. După compoziţia biochimică

drojdiile de vin îmbină în mod specific proprietăţile utile şi pot constitui una din componentele

de bază eficiente pentru elaborarea suplimentelor nutriţioniste, adaosurilor furajere,

concentratelor vitaminice, remediilor cosmetice.

4.2.2. Optimizarea condiţiilor de prelucrare a drojdiilor sedimentelor de vin şi

schema tehnologică de obţinere a produsului proteic furajer Prolevin

Standardele UE referitor la asigurarea calităţii nutreţurilor cu impact asupra sănătăţii

animalelor interzic utilizarea pulberilor de origine animală în furajarea animalelor şi păsărilor.

De aceea necesarul de proteină furajeră trebuie suplinit din alte surse. Din sursele

Page 96: Oleg Chiselita Thesis

96

neconvenţionale fac parte proteinele furnizate de microorganisme, alge etc. Drojdiile din

sedimentele de vin pot asigura cerinţele în substanţe proteice şi pot fi utilizate pentru producerea

unor biopreparate în baza produselor metabolice (aminoacizi, carbohidraţi, steroli,vitamine, etc.).

Un aspect important al utilizării drojdiilor este obţinerea autolizatelor din biomasa lor.

Valoarea biologică şi nutritivă înaltă a autolizatelor de drojdii se explică prin faptul, că în timpul

procesului de autoliză, sub acţiunea propriilor fermenţi are loc distrugerea biopolimerilor

drojdiei, ceea ce măreşte accesibilitatea substanţelor biologic active din biomasă.

În baza autolizatelor de drojdii sunt elaborate o serie de suplimente alimentare biologic

active „Нагипол”, „Aвимин”, eficacitatea cărora în calitate de preparate bioreglatorii a fost

demonstrată printr-un şir de experienţe clinice [76].

Una din variantele optimale pentru obţinerea preparatelor proteico-vitaminice este

autoliza biomasei diferitor tulpini de drojdii. Pentru a asigura necesităţile economiei în preparate

proteico-vitaminice de înaltă calitate la un preţ convenabil pentru beneficiari, se propun

următoarele metode: 1) Realizarea autolizei numai cu utilizarea enzimelor native specifice

tulpinii date şi respectarea parametrilor de timp şi temperatură; 2) Utilizarea în calitate de

materie primă a sedimentelor de drojdii de la uzinele de bere şi vinificaţie; 3) Producerea

preparatelor proteico-vitaminice cu destinaţie furajeră şi alimentară cu cumularea tehnologiilor

de autoliză a drojdiilor şi de obţinere a siropurilor glucozo-galactozice [49].

O fază importantă în procesul de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin este

purificarea lor (eliminarea impurităţilor, rămăşiţelor de alcool, sărurilor acidului tartric,

diminuarea acidităţii) şi uscarea ulterioară a autolizatelor în condiţii optime de temperatură

pentru a asigura conţinutul maxim al substanţelor biologic active în biomasa uscată.

Ca obiecte de cercetare au servit drojdiile din sedimentele de vinuri roşii şi albe de la

INVV, prelevate în anul 2007.

Pentru selectarea condiţiilor de spălare, obţinere a autolizatului şi uscare a drojdiilor din

sedimentele de vin au fost testate unele procedee, care au la bază utilizarea diferitor volume de

apă, soluţii de NaHCO3, regimuri de temperatură şi durată propuse în brevetele de invenţie [59,

62, 63].

Iniţial în scopul stabilirii parametrilor optimi de purificare (eliminarea impurităţilor, rămăşiţelor

de alcool, diminuarea acidităţii) a drojdiilor din sedimentele de vin, acestea au fost supuse spălării cu:

a) apă în proporţie de 1:3 – (Varianta 1); 1:5 – (Varianta 2), la temperaturi de +5, 10, 150C,

timp de 10, 15, 30, 40 min., urmată de separarea biomasei prin decantare.

b) soluţie de bicarbonat de sodiu de 1% - (Varianta 3); 5% - (Varianta 4); 10% - (Varianta

5) în proporţie de 1:2, urmată de separarea biomasei prin decantare.

Page 97: Oleg Chiselita Thesis

97

Eficacitatea a fost apreciată după valorile pH-ului biomasei (indice precăutat la

elaborarea furajelor şi suplimentelor furajere). Ca martor a servit pH-ul iniţial al sedimentelor de

drojdii. Din analiza datelor se constată, că valorile iniţiale ale pH-ului sedimentelor variază în

limitele 3,7 – 3,8. Valorile pH-ului practic rămân neschimbate în probele cu diferite durate de

spălare cu apă, raporturile sediment:apă sau diapazonul de temperaturi ale apei utilizate pentru

spălare. Astfel, tratamentul sedimentelor de drojdii cu soluţia de bicarbonat de sodiu de 1%; 5%;

10% în proporţie de 1:2 duce la diminuarea acidităţii biomasei de drojdii. Valorile optime ale

pH-ului, ce corespund normelor de elaborare a furajelor şi suplimentelor furajere [49], se obţin în

varianta a 3-a pentru drojdiile de la vin roşu şi în varianta a 4-a pentru drojdii de la vin alb, în

care a fost utilizată soluţia de bicarbonat de sodiu (NaHCO3) de 1% şi 5%, respectiv (figura 4.6

A şi B).

A

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5

Varianta

pH-u

l

martor I spălare II spălare

B

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5

Varianta

pH-u

l

martor I spălare II spălare

Legendă: 1 - Biomasă : apă (1:3); 2 - Biomasă : apă (1:5); 3 - Biomasă : NaHCO3 1% (1:2); 4 - Biomasă: NaHCO3 5% (1:2); 5 - Biomasă : NaHCO3 10% (1:2)

Fig. 4.6. Valorile pH-ului sedimentelor de drojdii de la vinul roşu (A) şi alb (B), purificate prin spălare.

Astfel, în scopul evitării majorării preţului final al produselor, pentru purificarea

sedimentelor de drojdii vinicole de impurităţi, rămăşiţe de alcool, diminuarea acidităţii, se

propun, în dependenţă de scopul utilizării produsului finit, procedeele ce includ:

٠spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de 1:3, timp de 10-15 min. (1-2 ori) şi

decantarea fazei lichide;

٠spălarea biomasei de drojdii cu soluţie de bicarbonat de sodiu de 1% sau 5% în proporţie

de 1:2, urmată de separarea biomasei de supernatant prin decantare.

Page 98: Oleg Chiselita Thesis

98

În al doilea set de experienţe, obiectivul de bază al cercetărilor a fost de a spori valoarea

nutritivă a suplimentului furajer prin aplicarea autolizei drojdiilor.

Pentru optimizarea condiţiilor de autoliză a drojdiilor ca material de lucru a fost

folosită biomasa de drojdii de vin purificată, care a fost supusă diferitor condiţii de autoliză:

٠o variantă a fost termostatată la temperatura de 37 şi 550C timp de 12, 24, 48 ore;

٠altă variantă a fost preventiv supusă congelării/decongelării, la -180C, apoi termostatării

în condiţiile descrise în varianta a).

Estimarea randamentului procedeelor utilizate a fost efectuată prin microscopia

autolizatului, determinarea proteinei totale, în unele cazuri a conţinutului de azot aminic, care

este proporţional cantităţii aminogrupelor eliberate.

Astfel, valorile conţinutului de proteină pentru ambele tipuri de drojdii sunt mai mari în

mostrele obţinute prin metoda de autoliză a biomasei congelate de drojdii în condiţiile utilizării

temperaturii de +550C şi durata de 12 ore (tabelul 4.10, 4.11). Conţinutul de proteină în

variantele cu drojdii congelate de la vinul alb constituie 26,8% S.U, iar în variantele cu drojdii

congelate de la vinul roşu - 39,9% S.U. Drojdiile ne congelate necesită o durată mai lungă pentru

autoliză, astfel că conţinutul maximal de proteină se obţine în mostrele autolizate la temperatura

+550C timp de 48 ore. Ca martor au servit drojdiile din sedimente de la vinul roşu şi alb

nesupuse congelării/decongelării şi autolizei. Estimarea efectuată prin microscopia autolizatelor a

confirmat faptul, că gradul de distrugere a peretelui celular al drojdiilor supuse autolizei la +370C

şi +550C este diferit. În acest caz microscopia probelor autolizate poate servi ca un indiciu

orientativ.

Tabelul 4.10. Conţinutul de proteină în autolizatele drojdiilor din sedimentul de la vinul alb în

dependenţă de temperatură, durata autolizei şi congelarea/decongelarea biomasei Drojdii din sedimente

necongelate

Drojdii din sedimente

congelate/decongelate

Nr d/o

Varianta

Proteină,

% S.U.

X1± x1

% - Martor Proteină,

% S.U.

X1± x1

% - Martor

1 Martor 19,6±0,19 100 20,9±0,57 100 2 37 0C / 12 ore 17,4±1,02 88,6 20,9± 0,65 100 3 37 0C / 24 ore 14,0±0,82 71,5* 20,6 ±1,48 98,7 4 37 0C / 48 ore 17,6±0,20 89,6 20,3 ±1,96 97,3 5 55 0C / 12 ore 23,9±1,24 121,7* 26,8 ±0,14 128,2* 6 55 0C / 24 ore 24,6±2,32 125,7* 26,3 ±0,72 126,0* 7 55 0C / 48 ore 25,0±2,08 127,8* 24,8 ±0,87 118,5*

* - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

Page 99: Oleg Chiselita Thesis

99

Tabelul 4.11.Conţinutul de proteină în autolizatele drojdiilor din sedimentele de la vinul roşu în dependenţă de temperatura, durata autolizei şi congelarea/decongelarea biomasei

Drojdii din sedimente

necongelate

Drojdii din sedimente

congelate/decongelate

Nr

d/o

Varianta

Proteină,

% S.U. X1± x1

% - Martor Proteină,

% S.U. X1± x1

% - Martor

1 Martor 31,8 ±0,46 100 35,7± 0,35 100 2 37 0 C / 12 ore 26,2 ±1,38 82,3* 30,8 ±4,59 86,3 3 37 0 C / 24 ore 27,0± 0,93 84,8* 29,7 ±4,13 83,1*

4 37 0 C / 48 ore 26,9 ±1,40 84,4* - -

5 55 0 C / 12 ore 31,9 ±0,57 100,2 39,9 ±0,32 112,0 6 55 0 C / 24 ore 35,1 ±0,45 110,4 40,3 ±2,82 112,9*

7 55 0 C / 48 ore 36,4 ±0,30 114,3* 36,3 ±1,50 101,6 * - veridicitatea în comparaţie cu martorul - p<0,05

În conformitate cu rezultatele obţinute a fost stabilit, că autoliza drojdiilor sedimentelor

vinicole decurge mai eficient conform procedeelor:

٠pentru drojdiile congelate – autoliza la temperatura de +550C timp de 12 ore, amestecare

periodică.

٠pentru drojdiile necongelate – autoliza la temperatura de +550C timp de 48 ore,

amestecare periodică.

În următorul set de experienţe pentru sporirea gradului de autoliză şi scindare a proteinei

ca factor de inducţie al autolizei celulelor de drojdii au fost folosite diferite combinaţii de

substanţe chimice şi temperatură. Au fost cercetate 5 variante:

Varianta I (martor) – a fost utilizată lizocima, enzimă folosită în industria alimentară

pentru producerea suplimentelor nutritive [65]. Drojdiile sedimentelor de vin păstrate timp de 2-

3 luni la 12-200C au fost încălzite până la 370C, la masa lor au fost adăugate 0,1- 0,2% lizocimă,

s-au amestecat şi s-au expus la temperatura dată 1,5-2,0 ore. În continuare a fost adăugat zahărul

în proporţie de 1:2, s-a omogenizat la 50-550C, amestecul obţinut fiind menţinut timp de 2-3 zile.

În toate variantele experimentale biomasa păstrată la -18°C a fost purificată prin spălare

cu apă în raport 1:3, timp de 5-10 min. (1-2 ori). După decantarea fazei lichide, suspensia de

drojdii (biomasă+apă -1:4 după substanţă uscată) a fost supusă autolizei la temperatura +55°C

prin adăugarea componenţilor respectivi:

Varianta II – 3 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie;

Varianta III – 5 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie;

Varianta IV – temperatura de +550C;

Page 100: Oleg Chiselita Thesis

100

Varianta V – soluţie de 1% de NaHCO3

Toate variantele au fost supuse autolizei timp de 4, 8, 12, 24 şi 48 ore.

Produsul obţinut a fost uscat în vid la +550-600C până la substanţa absolut uscată de 90%.

Controlul procesului a fost efectuat după valorile azotului aminic şi proteinei.

Rezultatele dinamicii valorilor azotului aminic şi proteinei în procesul de autoliză a

drojdiilor sunt expuse în figurile 4.7 şi 4.8.

0

1

2

3

4

I II III IY Y

Varianta

Azo

t am

inic

, % S

.U.

autoliza 4 ore autoliza 8 ore autoliza 12 oreautoliza 24 ore autoliza 48 ore

Fig. 4.7. Evoluţia valorilor azotului aminic (% S.U.) în procesul de autoliză

a drojdiilor de la vinul alb.

0

10

20

30

40

50

I II III IY Y

Varianta

Pro

tein

a, %

S.U

.

autoliza 4 ore autoliza 8 ore autoliza 12 oreautoliza 24 ore autoliza 48 ore

Fig. 4.8. Evoluţia valorilor proteinei (% S.U.) în procesul de autoliză

a drojdiilor de la vinul alb.

Valorile maxime ale conţinutului de azot aminic în autolizat se evidenţiază după 4-8 ore

în varianta III (în care s-a utilizat 5 ml acid acetic glacial la 1 l suspensie). Valorile azotului

aminic constituie 3,0-3,5% S.A.U, ceea ce depăşeşte martorul cu 20,0-44,9% (figura 4.7). În

varianta martor, în care ca factor de inducţie a autolizei a fost utilizată lizocima, valorile azotului

Page 101: Oleg Chiselita Thesis

101

aminic constituie 2,1- 2,8% S.A.U. Rezultatele obţinute relevă faptul că acidul acetic contribuie la

sporirea randamentului procesului de autoliză şi scindare a proteinei drojdiilor din sedimentele de vin.

În cazul analizei rezultatelor evoluţiei conţinutului de proteină se constată, că în

autolizatele variantelor experimentale II-V scindarea proteinelor diferă semnificativ faţă de

varianta I (martor) după 24-48 ore (figura 4.8).

Datele obţinute la analiza pH -ului autolizatelor variantelor experimentale nu prezintă

diferenţe substanţiale faţă de martor.

Reieşind din sinteza rezultatelor obţinute, putem aprecia că variantele optimale de

obţinere a autolizatului din drojdiile sedimentelor de vin congelate sunt variantele cu utilizare a 3

sau 5 ml acid acetic glacial, temperatura de +550C, durata procesului de 4 sau 8 ore [19].

Optimizarea condiţiilor de uscare şi obţinere a preparatelor din drojdiile

sedimentelor de vin

Pentru a standardiza produsul finit după conţinutul de substanţă uscată a fost utilizat

procedeul de uscare în dulapul de uscare cu vid (SPT-200).

Pentru aceasta au fost cercetate 3 variante:

٠Concentrarea prin evaporarea lichidului din centrifugatul autolizei la temperatura de

+650C timp de 4, 8, 12 ore, urmată de filtrarea şi sterilizarea în autoclav, în regim moderat, câte 30

min. 3 zile consecutiv pentru a putea fi propus ca produs lichid bogat în substanţe biologic active.

٠Uscarea fracţiei pereţilor celulari la temperatura +65 şi 1050C timp de 12 - 24 ore.

٠Uscarea autolizatului integral la temperatura +65 şi 1050C timp de 12 - 24 ore.

Gradul de uscare a fracţiei pereţilor celulari şi autolizatului integral a fost evaluat după

conţinutul de substanţă uscată (greutatea părţii solubile a autolizatului) în raport cu valorile iniţiale.

Rezultatele demonstrează, că conţinutul substanţei uscate 90% de la masa iniţială se

obţine în regimul de uscare pentru:

٠concentrarea centrifugatului autolizei prin evaporare (pentru a spori conţinutul de principii

bioactive la o unitate de produs finit) se petrece la temperatura +650C timp de 4-8 ore.

٠pereţii celulari la temperatura de +650C timp de 12 ore.

٠autolizatul integral la temperatura de +650C timp de 12-18 ore.

În baza rezultatelor obţinute privind eficientizarea parametrilor de prelucrare a drojdiilor

din sedimentele de vin este propusă schema tehnologică de obţinere a bioproduselor valoroase

din biomasa drojdiilor (figura 4.9), care include etapele:

٠purificarea drojdiilor din sedimente;

٠autoliza drojdiilor;

Page 102: Oleg Chiselita Thesis

102

٠uscarea produselor;

٠determinarea conţinutului biochimic al produselor;

٠ambalarea bioproduselor.

Fig. 4.9. Schema tehnologică de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de

vin şi obţinere a 3 bioproduse.

Descrierea etapelor tehnologice de obţinere a bioproduselor din drojdiile de la vinificaţie:

٠Purificarea drojdiilor din sedimente.

Purificarea drojdiilor din sedimentele de vin de impurităţi, rămăşiţe de alcool, săruri ale

acidului tartric, aciditate se efectuează prin spălarea biomasei de drojdii cu apă în proporţie de

1:3, timp de 10-15 minute, urmată de separarea biomasei de la supranatant prin decantare.

٠Autoliza drojdiilor.

Drojdii din sedimentele de vin proaspete sau decongelate

Purificare

Spălare cu apă în proporţii 1:3 timp de 10-15 min. 1-2 ori

Decantare

Suspensie: biomasă + apă 1:4

Autoliza

Drojdii decongelate + 3-5 ml acid acetic gl. la 1 l suspensie,

t=55°C, 4-8 ore

Drojdii proaspete + 3-5 ml acid acetic gl. la 1 l

suspensie, t=55°C, 12 ore

Uscarea produselor

1. Centriugatul autolizei se concentrează la

temperatura de +650 C în vid timp de 4-8 ore

2. Pereţii celulari se usucă la temperatura de +650C în vid timp de

12 ore

3. Autolizatul integral se usucă la temperatura de +650C în vid timp de 12-18 ore

Prolevin

Determinarea compoziţiei biochimice

Cântărirea, ambalarea, marcarea produselor

Page 103: Oleg Chiselita Thesis

103

Prevede utilizarea drojdiilor proaspete sau păstrate în stare congelată, purificate. În

biomasa purificată de drojdie (biomasă:apă -1:4 după substanţă uscată) se adaugă acid acetic

glacial (3-5 ml la 1 l suspensie drojdie) şi amestecul se supune autolizei la +550C timp de 4-8

ore, cu agitare periodică.

Autolizatul integral se usucă, sau prin centrifugare se separă în 2 fracţii – centrifugatul

autolizei şi pereţii celulari.

٠Uscarea produselor:

a) centrifugatul autolizei se concentrează la temperatura de +650C timp de 4-8 ore;

b) pereţii celulari se usucă la temperatura de +650C timp de 12 ore;

c) autolizatul integral se usucă la temperatura de +650C timp de 12-18 ore.

٠Componenţa biochimică şi particularităţile fizico-chimice de bază ale produselor:

Se determină conţinutul de proteină, glucide, lipide, aminoacizi, steroli utilizând procedee

biochimice cunoscute.

٠Ambalarea, marcarea bioproduselor:

Pulberea de preparat se condiţionează cantitativ şi se ambalează în pachete. Pe etichetă se

imprimă: denumirea preparatului, destinaţia, numărul seriei obţinute, componenţa, volumul, data

obţinerii şi data expirării, modul de utilizare. Termenul de valabilitate 1 an de la data obţinerii,

bioprodusul se păstrează la temperatura camerei.

Centrifugatul autolizei – primul bioprodus obţinut conform schemei este un produs

lichid şi reprezintă un extract proteico-vitaminic, care conţine cantităţi semnificative de mono- şi

dizaharide.

Pereţii celulari – al doilea bioprodus este un produs solid în componenţa căruia întră β-

glucani, proteomanani şi lipide.

Autolizatul integral – al treilea bioprodus se prezintă sub formă de pulbere, în

componenţa căruia intră un complex de principii bioactive.

Studiul conţinutului de principii bioactive în bioprodusele Prolevin obţinute din

drojdii procesate conform schemei tehnologice elaborate.

În continuare este expusă compoziţia biochimică a acestui bioprodus denumit Prolevin.

Ca material de cercetare au servit drojdiile din sedimente de vin de roşu (Cabernet) şi alb

(Chardonnay), oferite de ÎNVV în anul 2008.

Conform rezultatelor obţinute, compoziţia biochimică a bioproduselor Prolevin R şi

Prolevin A variază în limite largi în funcţie de originea sedimentelor de vin (tabelul 4.12).

La analiza datelor scrise în tabelul 4.12 se constată, că bioprodusele conţin în cantităţi

echilibrate proteine, carbohidraţi, lipide, ergosterol. Se evidenţiază conţinutul ridicat în proteină,

Page 104: Oleg Chiselita Thesis

104

bogată în aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, unii din care nu pot fi sintetizaţi de animale şi om,

astfel încât aceştia trebuie incluşi în hrană în proporţii corespunzătoare (tabelul 4.13).

Tabelul 4.12. Compoziţia biochimică a bioproduselor Prolevin obţinute din drojdiile

sedimentelor de vin roşu şi alb, % S.U. X1± x1 Componente Prolevin – R

(drojdiile sedimentelor de la vinul roşu)

Prolevin – A (drojdiile sedimentelor

de la vinul alb)

Proteine 36,8±0,57 26,8±0,14 Carbohidraţi 44,9±0,71 27,6±1,04

Lipide, inclusiv 15,8±2,36 13,7±0,86 Ergosterol 10,5±0,23 6,5±0,37

Rezultatele studiului compoziţiei lipidelor din aceste bioproduse denotă prezenţa

conţinutului înalt de steroli (35,7-38,2%), fosfolipide (10,2-13,5%), gliceride (inclusiv mono-di-

şi trigliceride), acizi graşi liberi utili pentru organismul uman şi animal.

Bioprodusele conţin cantităţi importante de acizi graşi nesaturaţi, aşa ca oleic, linoleic,

linolenic, şi saturaţi palmitic şi arahinic (tabelul 4.14).

Tabelul 4.13. Conţinutul de aminoacizi în bioprodusele Prolevin obţinute din drojdiile de la vinificaţie (% din suma aminoacizilor)

Aminoacizii Prolevin - R Prolevin - A Acidul cisteinic 2,2 2,2 Taurină 0,1 0,5 Acidul asparagic** 7,3 11,2 Treonină* 3,8 4,6 Serină** 4,8 6,0 Acidul glutamic** 22,4 18,6 Prolină 4,6 4,7 Glicină** 5,2 4,9 Alanină** 5,8 5,5 Valină* 4,9 5,1 Cisteină** 0,9 0,9 Metionină* 0,1 0,1 Izoleucină* 3,3 3,9 Leucină* 8,0 6,8 Tirozină* 3,7 3,6 Fenilalanină* 4,3 4,0 Triptofan* 2,4 1,7 Ornitină 0,3 0,1 Lizină* 9,9 10,0 Histidină 3,9 3,7 Arginină* 1,7 1,6

* - aminoacizi esenţiali; ** - aminoacizi imunoactivi

Page 105: Oleg Chiselita Thesis

105

Tabelul 4.14. Conţinutul de acizi graşi în bioprodusele Prolevin obţinute din drojdiile de la vinificaţie, (% din suma acizilor identificaţi)

Acizi graşi Prolevin - R Prolevin - A C 12:0 (laurinic) 2,3 6,9 C 14:0 (miristinic) 2,5 2,4 C 16:0 (palmitic) 35,9 37,6 C 16:1 (palmitooleic) 3,5 8,9 C 17:0 (margarinic) 0,8 1,3 C 18:0 (stearic) 7,3 9,6 C 18:1 (oleic) 8,1 5,9 C 18:2 (linoleic) 25,5 10,2 C 18:3 (linolenic) 7,2 2,2 C 20:0 (arahinic) 1,1 - Suma acizilor graşi saturaţi 49,9 57,7 Suma acizilor graşi nesaturaţi 44,2 27,3 Coeficient de saturaţie C s 1,1 2,1

Aşadar, bioprodusele obţinute conform procedeelor propuse prezintă un complex de

principii bioactive- aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, acizi graşi (omega-3) polinesaturaţi,

carbohidraţi, ergosterol şi pot fi propuse ca suplimente alimentare, furajere, produse cu efect

sanogen.

În colaborare cu cercetătorii laboratorului Ihtiologie al Institutului de Zoologie al AŞM a

fost testat în condiţii experimentale furajul pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte, în care

unul din ingrediente a fost bioprodusul Prolevin – R (produs obţinut prin autoliza levurilor din

sedimente de la vinuri de masă roşii). Bioprodusul Prolevin - R utilizat în proporţie de 48...50 %

la unit. masă în furajul pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte a condus la sporirea

semnificativă a viabilităţii larvelor (cu 22,2%), masei medie a unei larve (cu 19,0%)şi ihtiomasei

generale medii (cu 45,2%) faţă de martor [7, 31].

Astfel, rezultatele cercetărilor efectuate în cadrul subcapitolului 4.2. au demonstrat, că

compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin variază în limite largi. A fost scoasă în

evidenţă prezenţa conţinutului echilibrat de proteină bogată în aminoacizi esenţiali şi

imunoactivi, carbohidraţi, acizi graşi polinesaturaţi, care indică posibilităţile utilizării drojdiilor

din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active.

Prin investigaţiile de evaluare şi optimizare a condiţiilor de obţinere a bioproduselor din

drojdiile de la vinificaţie a fost elaborată tehnologia care include etapele: purificarea biomasei de

drojdii din sedimente; autoliza drojdiilor conform procedeului nou; uscarea produselor conform

parametrilor optimizaţi; determinarea componenţei biochimice a bioproduselor; ambalarea şi

marcarea lor.

Page 106: Oleg Chiselita Thesis

106

Bioprodusul Prolevin – R utilizat în proporţie de 48…50 % la unitate masă în furaje

pentru creşterea larvelor şi puietului de peşte contribuie la sporirea semnificativă a viabilităţii

larvelor, masei medii a unei larve şi ihtiomasei generale medii.

4.3. Concluzii la capitolul 4

٠Autoliza şi ultrasonarea drojdiilor prezintă un procedeu eficient pentru spargerea

pereţilor celulari, valorile obţinute de carbohidraţi fiind în jur de 42,7 - 48,4 % S.U. comparativ

cu 23,2 - 31,1 % S.U. în sedimentele nesupuse tratamentelor susmenţionate.

٠Complexul de polizaharide care alcătuieşte baza peretelui celular a drojdiilor de la

vinificaţie este compus preponderent din glucani şi proteomanani, identificaţi în cantităţi

semnificative atât la drojdiile din sedimentele de la vinurile roşii, cât şi în cele de la vinurile albe.

٠Pentru extracţia fracţionată a complexului de carbohidraţi din drojdiile de la vinificaţie

se propune procedeul de extracţie cu utilizarea apei, soluţiilor slabe de alcalii şi acizi. Utilizarea

acestui procedeu permite obţinerea din drojdiile provenite de la vinurile roşii şi albe a 4 fracţii de

glucide: 1) hidrosolubilă (mono- dizaharide), 2) alcalinsolubilă (mananproteine), 3) solubilă în

acizi (glicogenul), 4) insolubilă în alcalii şi acizi (β-glucanii).

٠Compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele vinicole variază în limite largi. Se

evidenţiază conţinutul înalt de proteină (41,3-52,2% S.U.), bogată în aminoacizi esenţiali (20,4-

29,8 %S.U.) şi imunoactivi (28,7-40,7% S.U.), carbohidraţi (28,4-35,5% S.U.), acizi graşi

polinesaturaţi C18:2 linolic, C18:3 linolenic, care indică posibilităţile utilizării drojdiilor din

sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active valoroase.

٠Bioprodusul Prolevin obţinut conform tehnologiei elaborate prezintă un complex de

principii bioactive- aminoacizi esenţiali şi imunoactivi, acizi graşi (omega-3) polinesaturaţi,

carbohidraţi, ergosterol şi pot fi propuse ca suplimente, furajere, produse cu efect sanogen.

Bioprodusul Prolevin – R utilizat în proporţie de 48...50 % la o unitate de masă în furaje pentru

creşterea larvelor şi puietului de peşte a condus la sporirea semnificativă a viabilităţii larvelor,

masei medii a unei larve şi ihtiomasei generale medii faţă de martor [7], anexa 1.

Problema ştiinţifică soluţionată în acest capitol a constat în determinarea compoziţiei

biochimice a drojdiilor din sedimentele vinicole şi elaborarea procedeelor de obţinere a

bioproduselor în baza lor.

Page 107: Oleg Chiselita Thesis

107

CONCLUZII GENERALAE ŞI RECOMANDĂRI

Teza de doctorat „Caracterele fiziologo-biochimice ale unor drojdii vinicole şi procedee de

obţinere a bioproduselor valoroase” reflectă rezultatele cercetărilor, efectuate conform

obiectivelor trasate, obţinerea cărora a asigurat atingerea scopului final - studierea caracterelor

fiziologo-biochimice ale unor tulpini de drojdii de vin cu potenţial sporit de biosinteză a

carbohidraţilor şi elaborarea procedeelor de obţinere a bioproduselor valoroase.

Analiza situaţiei în domeniul de cercetare referitor atât la compoziţia, activitatea

biologică înaltă şi diversele domenii de utilizare a carbohidraţilor din drojdii, cât şi oportunitatea

utilizării drojdiilor din sedimentele de vin ca sursă de substanţe biologic active în general, a

evidenţiat actualitatea direcţiei de cercetare.

Pornind de la varietatea mare a substanţelor cu activitate biologică înaltă, care pot fi

obţinute din microorganisme, la prima etapă au fost examinate în calitate de materie primă

pentru obţinerea carbohidraţilor drojdiile genului Saccharomyces. Pentru studiu au fost izolate

din sedimente de vin culturi de drojdii în baza a două criterii: productivitatea şi conţinutul de

carbohidraţi. În baza rezultatelor obţinute au fost selectate două tulpini de drojdii S. cerevisiae

CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 de interes biotehnologic cu o productivitate înaltă şi

un conţinut înalt de carbohidraţi. În continuare asupra tulpinilor selectate au fost efectuate

cercetări aprofundate, având drept scop obţinerea prin cultivare submersă a biomasei de drojdii

cu un conţinut prognozat de carbohidraţi cu utilizarea mediilor nutritive, în care în calitate de

sursă de energie s-au folosit diferite surse de carbon şi azot, iar în calitate de precursori şi

stimulatori specifici ai procesului de biosinteză a carbohidraţilor - sulfatul de mangan şi sulfatul

de zinc, acetaţii de Na şi Zn, compuşi coordinativi ai Mn(II) şi Zn(II), diferite regimuri de

temperatură, pH şi durată a procesului de cultivare.

Astfel, a fost demonstrată experimental influenţa factorilor de mediu asupra multiplicării

şi activităţii vitale a celulei microbiene şi reacţionarea acesteia prin modificări de biosinteză şi a

duratei etapelor de dezvoltare. Corelarea dată prezintă un mecanism puternic de reglare a

relaţiilor microorganism - mediu şi creează posibilităţi de orientare a proceselor metabolice la

drojdii în scopuri de utilizare practică.

Rezultatele obţinute au servit drept reper pentru elaborarea unui procedeu de cultivare

dirijată a tulpinii S. cerevisiae CNMN-Y-20 în vederea obţinerii biomasei cu un conţinut sporit

de carbohidraţi, care prevede utilizarea în mediul nutritiv a sursei de carbon preferabile, clorurii

de tricloracetat de zinc şi factorilor de mediu optimizaţi (temperatura, pH-ul iniţial, durata de

cultivare). A fost elaborat regulamentul de obţinere a bioprodusului Glucolev -20, care prevede

Page 108: Oleg Chiselita Thesis

108

utilizarea în calitate de materie primă a biomasei de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 cu

conţinut sporit de carbohidraţi, obţinute prin procedeul descris, autoliza masei celulare pentru a

distruge pereţii celulari şi a majora disponibilitatea principiilor bioactive.

Deoarece în ultimul timp tot mai des este abordată problema utilizării deşeurilor

industriei vinicole în vederea obţinerii substanţelor biologic active şi evitării poluării mediului,

următoarea etapă de cercetări a fost orientată spre elaborarea unei tehnologii de procesare a

drojdiilor din sedimentele de vin cu scopul obţinerii unor bioproduse naturale valoroase cu

utilizare în diferite domenii. Schema elaborată în cadrul acestei lucrări este clară şi simplu de

realizat, ceea ce asigură succesul economic al implementării ei industriale. Rezultatele obţinute

în cadrul acestor studii au stat la baza elaborării unui nou bioprodus Prolevin-R utilizat la

furajarea larvelor şi puietului de peşte.

Prin urmare, scopul înaintat în faţa acestui studiu şi obiectivele formulate pentru fiecare

etapă ale cercetării au fost realizate integral. Problema ştiinţifică importantă ce ţine de

argumentarea căilor de dirijare a biosintezei carbohidraţilor la tulpinile de drojdii selectate,

utilizând ca factori reglatori nutrienţii, stimulatorii specifici şi factorii fizico-chimici de cultivare

a fost rezolvată, iar rezultatele pot fi exprimate prin următoarele concluzii:

٠Studiul caracterelor morfologice, culturale şi fiziologo-biochimice a permis de a evidenţia

două tulpini de drojdii, ulterior depozitate în CNMN sub denumirea de Saccharomyces cerevisiae

CNMN-Y-20 şi Saccharomyces cerevisiae CNMN-Y-21. Tulpinile prezintă interes în calitate de

producători de carbohidraţi (30,8 şi respectiv 33,1% glucide S.U) la cultivare pe mediul nutritiv

cu must de malţ. Tulpina S. cerevisiae CNMN-Y-20 este brevetată ca producător de β-glucani

[4].

٠Productivitatea tulpinilor S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21

sporeşte esenţial (cu 81,5 – 100,0% la biomasă şi cu 31,8-35,4% la carbohidraţi) în cazul

substituirii glucozei în mediului nutritiv Rieder cu melasă în cantitate de 20 g/l.

٠Din compuşii chimici testaţi a fost evidenţiat în calitate de stimulator compusul

coordinativ clorura de tricloracetat de zinc, care în concentraţia de 10 mg/l în mediul de cultivare

asigură sporirea cantităţii de carbohidraţi cu 25,0%.

٠Tulpinile S. cerevisiae CNMN-Y-20 şi S. cerevisiae CNMN-Y-21 posedă capacitatea de

a creşte într-un larg diapazon a valorilor de temperatură şi pH. Optimul pentru biosinteza

carbohidraţilor este temperatura +20°C, pH-5,5 durata de cultivare 120 ore.

٠Tehnologia elaborată, bazată pe elemente noi – tulpină înaltproductivă, mediu nutritiv

eficient, parametri de temperatură, pH, durată de cultivare, specifici producătorului, permite

Page 109: Oleg Chiselita Thesis

109

obţinerea a 4,7-5,0 g/l bioprodus Glucolev-20 cu un conţinut de carbohidraţi de 44,2% la S.U.,

fracţia majoră constituind-o β-glucanii – 77,3% din suma fracţiilor glicidice.

٠Compoziţia biochimică a drojdiilor din sedimentele de vin variază în limite largi şi se

evidenţiază printr-un conţinut înalt de proteină (de la 41,3 la 52,2% S.U) bogată în aminoacizi

esenţiali şi imunoactivi, carbohidraţi (28,4 - 35,5% S.U.), lipide (5,4 – 6,6% S.U.) acizi graşi

polinesaturaţi (60,9 – 79,9% din suma acizilor identificaţi) şi indică asupra posibilităţii utilizării

drojdiilor din sedimentele de vin în calitate de sursă de substanţe biologic active.

٠Tehnologia elaborată de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin, bazată pe

procedee de purificare, autoliză şi uscare, permite obţinerea concomitentă a 3 bioproduse

proteico-glucidice valoroase.

Recomandări practice:

٠Tulpina de drojdii S. cerevisiae CNMN-Y-20 se recomandă pentru cultivarea industrială,

conform regulamentului elaborat şi utilizare în calitate de sursă de preparate glucidice cu un

spectru larg al domeniilor de aplicare.

٠Biotehnologia de procesare a biomasei drojdiilor din sedimentele de vin se recomandă

pentru producerea industrială a bioproduselor naturale proteice şi glucidice cu utilizare în diferite

domenii.

٠Bioprodusul Prolevin R se recomandă pentru utilizare în calitate de supliment la furajarea

larvelor şi puietului de peşte, animalelor şi păsărilor.

Page 110: Oleg Chiselita Thesis

110

BIBLIOGRAFIE

1. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1989, vol. 1. 384 p.

2. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1991, vol. 2. 385 p.

3. Anghel I. ş.a. Biologia şi tehnologia drojdiilor. Bucureşti: Editura Tehnică, 1993, vol. 3. 308 p.

4. Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces cerevisiae-

sursă de β-glucani/ Chiseliţa O. ş.a. (MD). Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010.

5. Brevet de invenţie. 1930 G2,MD, C11B 1/10 Procedeu de extragere a lipidelor din drojdii/

Usatîi A. ş.a. (MD). Cererea depusă 2000.05.29, BOPI nr. 5/2002.

6. Brevet de invenţie. 3570 G2, MD, C12P 33/00 Procedeu de obţinere a ergosterolului din

drojdii Saccharomyces/ Usatîi A. ş.a. (MD). Cererea depusă 2007.09.07, BOPI nr. 4/2008.

7. Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de peşte/ Usatîi A.,

Chiseliţa O. ş.a. (MD). Cererea depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009.

8. Bulimaga C. Deşeuri viniviticole: Formarea şi tehnologiile de prelucrare, tratare şi valorificarea

lor. Chişinău, 1999. 40 p.

9. Bulimaga V. ş.a. Evaluarea schimbărilor calitative ale proteinelor sumare extrase din biomasa

cianobacteriei S. platensis, cultivată în prezenţa unor compuşi coord. ai Zn(II). În: Anale ştiinţ.

ale USM, Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2004, p. 84-87.

10. Bulimaga V. Studiul acţiunii unor compuşi coordinativi heteropolinucleari ai fierului asupra

conţinutului în biomasa de spirulină a unor substanţe cu efect antioxidant. În: Anale ştiinţifice

ale USM, Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2005, p. 224-227.

11. Burţev S. Substanţe bioactive ale streptomicetelor (Biosinteza şi perspectivele utilizării).

Autoref. tezei de dr. hab. în biologie. Chişinău, 2002. 39 p.

12. Buţu A., Tudora C. Studii de eficientizare a prelucrării şi valorificării drojdiilor de vin. In:

Rom. Biol. Scienc., 2004, vol. 2(1,2), p. 99–108.

13. Buţu A., Tudora C. Optimisation studies for polysaccharides extraction from the parietal

component of wine yeast. In: Rom. Biol. Scienc., 2005, vol. 3(1-2), p. 93-102.

14. Cepoi L. Particularităţile fiziologo-biochimice de cultivare a algei roşii marine P. cruentum

CNM-AR-01-sursă de substanţe bioactive: Autoref. tezei de dr. în biol. Chişinău, 1995. 21 p.

15. Chiriac T. Biotehnologia cultivării spirulinei şi obţinerii produselor cu conţinut prognozat de

zinc şi principii bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. în biologie. Chişinău, 2003. 23 p.

16. Chiseliţa O. ş.a.. Componenţa biochimică a drojdiilor din sedimente vinicole. În: Buletinul

AŞM, Ştiinţele vieţii, 2008, vol. 1, p.132-137.

17. Chiseliţa O. ş.a. Utilizarea sedimentelor de drojdii – deşeu al industriei vinicole. În: Mediul

ambiant, 2009, nr. 2(44), p. 23-26.

Page 111: Oleg Chiselita Thesis

111

18. Chiseliţa O. Studii privind izolarea din microflora sedimentelor vinicole a unor tulpini de

drojdii cu potenţial sporit de biosinteză a carbohidraţilor. În: Mediul ambient, 2009, nr. 4(46) p.

26-29.

19. Chiseliţa O. Studii de eficientizare a prelucrării sedimentelor de drojdii de la vinificaţie. În:

Studia Universitatis, 2009, nr. 6(26) p. 107-111.

20. Cojocari A. Paricularităţile fiziologo-biochimice şi biotehnologice ale tulpinii N. linckia (Roth)

Born et Flah CNM-CB-03 sursă de substanţe bioactive. Teza de dr. în biologie. Chişinău,

2006. 139 p.

21. Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetală. Tehnici speciale de laborator. Chişinău: USM,

2001. 173 p.

22. Efremova N. Elaborarea procedeelor de obţinere a preparatelor antioxidante pe baza

substanţelor bioactive ale cianobacteriilor şi microalgelor. Autoref. tezei de dr. în biol.

Chişinău, 2009. 29 p.

23. Ghelbet V. Endo- şi exopolizaharidele algei roşii P. cruentum CNM-AR-01. Biotehnologii de

obţinere şi perspective de utilizare. Autoref. tezei de dr. în biologie. Chişinău, 2003. 21 p.

24. Moldoveanu D., Militaru C., Moldoveanu I. Microbiologie şi Inginerie genetică. Bucureşti,

2001. p. 46-50.

25. Oniscu C., Caşcaval D. Inginerie Biochimică şi Biotehnologie. Iaşi, 2002. 451 p.

26. Rudi L. Utilizarea unor compuşi coordinativi ai Zn(II) cu aminoacizi în reglarea lipidogenezei

la S. platensis. Chişinău. Cerc. în dom. Chimiei, Realizări şi perspective. Ed. Ştiinţa 2003, vol.

2. p. 218-221.

27. Rudic V. ş.a. Studii asupra complexului de glucide ale cianobacteriei N. linckia (Roth.) Born et

Flah CNM CB 03. Anale ştiinţ. ale USM. Seria „Ştiinţe chimico-biologice”, 2003, p. 187-189.

28. Rudic V. ş.a. Despre compoziţia biochimică a unor complexe glucidice algale. În: Studia

Universitatis. Seria „Ştiinţe ale naturii”. Chişinău, CEP USM, 2008, nr. 7(17), p. 33-38.

29. Taran N. ş.a. Levuri active autohtone de colecţie. Perspective de implementare şi producere. În:

Realizări inovative în domeniul viti vinicol. Tezele conf. internaţionale consacrate comemorării

m.c. AŞM P. Ungurean (1894-1975), INVV, 2008, p. 174-177.

30. Usatîi A. Bazele fiziologo-biochimice şi biotehnologice de cultivare a drojdiilor oleogene şi

obţinerea preparatelor bioactive. Autoref. tezei de dr. hab în biologie. Chişinău, 2002. 36 p.

31. Usatîi A., Chiseliţa O.ş.a. Eficienţa utilizării noului bioprodus din drojdiile de la vinificaţie în

hrana larvelor de peşte. În: Buletinul AŞM, Ştiinţele vieţii, 2009, nr. 1(307), p. 101-104.

32. Zarnea G., Mihăescu Gh., Velahorschi T. Principii şi tehnici de microbiologie generală.

Bucureşti, 1992. vol. 1. 141 p.

Page 112: Oleg Chiselita Thesis

112

33. Абрамов Ш. А., и др. Содержание витаминов в дрожжах рода Saccharomyces в

зависимости от состава питательной среды. В: Прикл. биохимия и микробиол. 2003, т.

39(4), с. 438-440.

34. Аркадьева З. А., и др. Под ред. Егорова Н. С. Промышленная микробиология: Учебное

пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биотехнология». М.: Высш. шк., 1989.

688 с.

35. Бабицкая В. Г., и др. Факторы, влияющие на образование полисахаридов G. lucidum. В:

Прикл. Биохим. и Микробиол. 2005, т. 41(2), с. 194-199.

36. Бурьян Н. И. Практическая микробиология виноделия. Симферополь: Таврида, 2003. 560 с.

37. Вржесинская О. А., Коденцова В. М. Соотношение витаминов В1 и В2 как способ

идентификации пивных и пищевых дрожжей. В: Вопр. Питания. 2004, т.73(3), c. 22-25.

38. Горшина Е. С., Скворцова М. М., Бирюков В. В. Технология получения биоактивной

субстанции. В: Биотехнол. 2003, т. 2, c. 45-53.

39. Градова Н. Б., Бабусенко Е. С. Белково-полимикроэлементные БАД на основе биомассы

дрожжей. В: Биотехнология: состояние и перспективы развития. Мат. конгр. ч.2,

Москва, 2005, c. 104.

40. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта. Москва: Колос, 1985. 336 c.

41. Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. МГУ, 3-e изд.,

1995. 224 с.

42. Залашко М. B. Физиологическая регуляция метаболизма дрожжей. Мн.: Навука i

тэхнiка, 1991. 332 c.

43. Залашко М. В., Салохина Г.А., Королева И. Ф. Влияние стрессовых воздействий на

состав липидов дрожжей. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2000, т. 36(1), с. 37-40.

44. Ившина Т. Н., и др. Выделение хитин-глюканового комплекса из плодовых тел

шляпочных грибов. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2009, т. 45(3), с. 348-353.

45. Калебина Т. С., и др. Универсален ли механизм «хитиновой репарации» у дрожжей?

Докл. РАН. 2004, т. 399(4), с. 554-557.

46. Камзолова С. В., и др. Исследование влияния температуры, pH и концентрации этанола

на максимальную удельную скорость роста и состав биомассы мутантного штамма Y.

lipolytica №1. В: Микробиология, 1996, т. 65(2), c. 202-207.

47. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. в 2-х т. М.: Мир, 1981. т.1. 615 с., т.2. 523 с.

48. Литвинова Е. В., и др. Лекарственные средства на основе субстанций микробного

происхождения. В: Современное состояние и перспективы развития микробиологии и

биотехнологии. Сборник трудов международной конф. Минск, 2008, т. 2, с. 60-62.

Page 113: Oleg Chiselita Thesis

113

49. Луканин А. В., Кривой Б. А., Вышелесский А. Б. Автолизаты-белково-витаминные и

кормовые добавки. В: Биотехнология: состояние и перспективы развития. Мат. конгр.

ч.2, Москва, 2005, c. 268.

50. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии. Москва: МГУ, 1980. 280 c.

51. Мамеева О. Г., и др. Внеклеточные полисахариды дрожжей C. albidus (Saito) skinner. В:

Mikpoбiол. i бiотехнол. 2008, т. 1, c. 29-34.

52. Новицкая Г. Н. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии

фосфолипидов. М.,Наука, 1974. 82 с.

53. Овчиников Ю. А Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Перевод с

англ., M. Наука, 1974. 462 с.

54. Осадчая А. И., и др. Способность бактерий рода Bacillus гидролизовать ксилан. В:

Мiкробiол. i Бiотехнол. 2009, т. 7 с. 63-69.

55. Патент 2084519 РФ C12N1/18, Cпособ получения питательной среды для выращивания

хлебных дрожжей./ Абрамов Ш. А., и др. (RU) Прикасп. инст. биол. рес. Дагестанского

НЦ РАН. № 5048579/13, Заявл. 29.04.92.; Опубл. 20.07.97 Бюл.№20. c. 270.

56. Патент 215179 РФ C12N1/16, C12N1/18 Cпособ получения сушеных дрожжей./ Абрамов

Ш. А., и др. (RU) Прикаспийский инст. биол. ресурсов Дагестанского научн. центра

РАН №99107057/13. Заявл.31.03.1999; Опубл.27.06.2000, Бюл. №18. c. 138.

57. Патент 2220590 РФ МПК7 А23К 1/65, С12N 1/16; Способ получения кормового белка на

основе зернового сырья./ Воробьева Г. И., и др. (RU) Федер. гос. унитар. Предпр. «Гос.

НИИ биосинт. белк. веществ».-№2002108581/13; Заявл.04.04.02; Опубл.10.01.04, Бюл. №1.

58. Патент 2233320 РФ МПК7 С12/N 1/16; №2001104412/13; Способ получения биол.

активного препарата, (БАД) к пище пребиотического действия, приводящая к коррекции

метаболического синдрома и лекарственный препарат для регуляции микробиоценоза

желудочно-кишечного тракта./ Гриневич В. Б. Заявл.13.02.01; Опубл.27.07.04, Бюл.№21.

59. Патент 2105503 РФ A23L1/30, Способ получения биоактивной пищевой добавки./

Дмитриев А. Д., и др. (RU) № 96124734/13, Заявл. 30.12.96 Опубл. 27.02.98.

60. Патент 2201445 РФ МПК7 С12/N 1/18, Способ получения сухих дрожжей./ Дмитриев К.

С., и др. (RU) ОАО «Самар. дрожжев. з-д», Приволжск. мал. науч. общ. фирма патент.

услуг и работ «Потенциал». - №99105859/13; Заявл.22.03.99; Опубл.27.03.03, Бюл. №9.

61. Патент 2203941 РФ МПК7 С12N 1/18, Способ получения дрожжей, обогащенных

йодом./ Корнеев А. Д. (RU) №2002100308/13, Заявл.14.01.02; Опубл.10.05.03, Бюл. №13.

62. Патент 2136172 РФ A23J1/18, Способ получения биoактивных веществ./ Крылов И. А., и

др. (RU) Ф. "Филантроп Интерн.", №98122876/13, Заявл. 23.12.98, Опубл. 10.09.99.

Page 114: Oleg Chiselita Thesis

114

63. Патент 2087531 РФ C12N1/06, C12N1/16, Способ получения пищевого биоактивного

продукта переработки дрожжей./ Латов В. К., и др. (RU) №96109949/13, Заявл. 28.05.96,

Опубл. 20.08.97.

64. Патент 2080389 РФ, C12P33/00, C07J9/00, Способ получения эргостерина./ Лукницкий

Ф. И., и др. (RU) АООТ"Фармакон", №93007910/13; Заявл.10.02.1993; Опубл.27.05.1997.

65. Патент 2248137 РФ С1 А23L, Способ получения пищевой добавки-обогатителя./

Садовой В. В., Васюкова О. Н. CКГТУ №2003129755/13 Заявл.06.10.2003,

Опубл.20.03.05.

66. Патент 2230781 РФ МПК7 С12N 1/19, С07К 14/55, Штамм дрожжей S. cerevisiae 1-60-

Д578 (MSIL) – продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его

получения./ Смирнов М. Н., Падкина М. В., Самбук Е. В. (RU) ООО «Биотех».-

№200235928/13; Заявл.27.12.02; Опубл.20.06.04, Бюл. №17.

67. Патент 2186848 РФ МПК7 С12N 9/02 Способ выделения СОД./ Соловьева Л. Я., и др.

(RU) №2001112992/13; Заявл.16.05.01; Опубл.10.08.02, Бюл. №22.

68. Патент 2216595 РФ МПК7 С12Р 19/04, С08В 37/00, Способ получения бета-глюканов

клеточной стенки дрожжей./ Тонева-Давидова Е. Г. (RU) ЗАО «ТЗФ ВАИГ».

№2002130728/13; Заявл.18.11.02; Опубл.20.11.03, Бюл. №32.

69. Пирог Т. П., Кузьминьска Ю. В. Влияние условий культивирования продуцентов

экзополисахаридов на их синтез и физ.-хим свойства. В: Бiополiм. i клiтина. 2003, т.

19(5), c. 393-413.

70. Прохорова М. И. Методы биохимических исследований. Ленинград, 1982. 272 с.

71. Рудик В., и др. Продуктивность и биохимический состав S. platensis (Nordst.) Geitl. Calu-

835) при культивировании в присутствии кординационных соединений Zn(II). В:

Альгология, 2003, т. 13(3), с. 322-329.

72. Тихомирова О. М., Витовская Г. А., Синицкая И. А. Изменения в составе клеточных

полисахаридов Rh. rubra (DEMME) Lodder в процессе биосинтеза экзоманнана. В:

Микробиология, 1998, т. 67(1), с. 79-84.

73. Тихомирова О. М., и др. Полисах. клеток C. laurentii (Kufferath) skinner – продуцента

внеклеточного гетерогликана. В: Микробиология, 1998, т. 67(1), с. 73-78.

74. Tюркел С. Сравнительный анализ накопл. гликогена и трегалозы у метило-и

неметилотрофных дрожжей. В: Микробиология, 2006, т. 75(6), c. 737-741.

75. Феофилова Е. П. и др. Состав и содержание хитин-глюканового комплекса в онтогенезе

гриба A. niger. В: Прикл. Биохим. и Микробиол. 2006, т. 42(6), с. 624-628.

Page 115: Oleg Chiselita Thesis

115

76. Яшин Т. А., Волфович Д. И., Куликова В. П. Биологически активные пищевые добавки

на основе дрожжевых автолизатов. В: Биотехнология: состояние и перспективы

развития. Мат. конгр. ч.2, Москва, 2005, c. 173.

77. Abe F., Hiraki T. Mechanistic role of ergosterol in membrane rigidity and cycloheximide

resistance in S. cerevisiae. In: BBA, 2008, vol. 1, p. 1-10.

78. Aguilar-Uscanga B., Francois J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in

response to growth cond. and mode of cultiv. Lett. in Appl. Microbiol. 2003, vol. 37, p. 268-274.

79. Aguilar-Uscanga B., et al. Effect of A. tequilana juice on cell wall polysaccharides of three S.

cer. strains from different origins. In: Antonie van Leeuwenhoek. 2007, vol. 91(2), p. 151–157.

80. Alexis N. Campetelli, et al. Activation of the plasma membrane H+-ATPase of S. cerevisiae. by

glucose is mediated by dissociation of the H+-ATPase acetylated tubulin complex. In: FEBS J.,

2005, vol. 272(22), p. 5742-5752.

81. Andrews S., Robinson A., Rodriguez F. Bacterial iron homeostasis. In: FEMS Microbiol. Rev.,

2003, vol. 27, p. 215-231.

82. Annegret Boch, et al. Loss of Zhf and the tightly regulated zinc-uptake system SpZrt1 in S.

pombe reveals the delicacy of cell. zinc balance. In: FEMS Y. Res. 2008, vol. 8(6), p. 883–896.

83. Argiielles J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeast: a comparative analysis.

In: Arch. Microbiol. 2000, vol. 174, p. 217-224.

84. Barberis M., et al. Cell size at S phase initiation: an emergent property of the G1/S network In:

PLoS Comput. Biol., 2007, vol. 13, 3(4):e64.

85. Barnett J. A., Payne R. W., Varrow D. Yeasts: Characteristics and Identification. 3-rd edition,

Cambridge Univ. Press, 2000. 1150 p.

86. Belinchón M. M., Gancedo J. M. Glucose controls multiple processes in S. cerevisiae. through

diverse combinations of signaling pathways. In: FEMS Y. Res. 2007, vol. 7(6), p. 808–818.

87. Berthels N. J., et al. Discrepancy in glucose and fructose utilisation during fermentation by S.

cerevisiae wine yeast strains. In: FEMS Y. Res. 2004, vol. 4(7), p. 683-689.

88. Beuse M., et al. O2, pH value, and carbon source induced changes of the mode of oscillation in

synchronous continuous cult. of S. cer. In: Biotechnol. Bioeng. 1999, vol. 20, 63(4), p.410-417.

89. Blank H. M., et al. Sulfur metabolism actively promotes initiation of cell division in yeast. In:

PLoS One, 2009, vol. 24, 4(11):e8018.

90. Blenkowe D., Morby A. Zn(II) metabolism in prokaryotes. In: FEMS Microbiol. Rev., 2003,

vol. 27, p. 291-331.

91. Breivik Torbjorn., et al. Solubleβ-1,3/1,6-glucan from yeast inhibits experimental periodontal

disease in Wistar rats. In: J. of Clin. Periodont., 2005, vol. 32(4), p. 347-352.

Page 116: Oleg Chiselita Thesis

116

92. Bulik D. A., et al. Chitin synthesis in S. cererevisiae in response to supplementation of growth

medium with glucosamine and cell wall stress. In: Eukaryot. Cell, 2003, vol. 2(5), p. 886-900.

93. Caridi A. New perspectives in safety and quality enhancement of wine through selection of

yeasts based on the parietal adsorption activity. In: Int. J. of Food Microbiol., 2007, vol.

120(1,2), 30, p. 167-172.

94. Carlson M. Glucose repression in yeast. In: Curr. Opin. Microbiol. 1999, vol.2, p.202–207.

95. Chagas B., et al. Extraction and purification of cell wall polysaccharides from P. pastoris

biomass. In: New Biotechnol., 2009, vol. 25(1), p. 214-218.

96. Charoenchai C., Fleet G., Henschke P. Effects of temperature, ph and sugar concentration on

the growth rates and cells biomass of wine yeasts. In: Am. J. of Enol. And Viticul., 1998, vol.

49, p. 283-288.

97. Chau G. P., et al. Beta-1,3-glucan effect on sow antibody production and passive

immunisation of progeny. In: Food and Agric. Immunol., 2009, vol. 20(3), p. 185-193(9).

98. Chaung H. C., et al. Immunomodulatory effects of beta-glucans on porcine alveolar

macrophages and bone marrow haematopoietic cell-derived dendritic cells. In: Vet Immunol

Immunopathol., 2009, vol. 131(3,4), p. 147-157.

99. Chavan M. T. et al. Genetic, biochemical, and morphological evidence for the involvement of

N-glycosylation in biosynthesis of the cell wall ß1,6-glucan of S. cerevisiae. In: Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 2003, vol. 100, p. 15381-15386.

100. Chen Jiezhong, Seviour Robert. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans. In:

Mycol. Res., 2007, vol. 111(6), p. 635-652.

101. Chen W., et al. Optimization for the production of exopolysacch. from F. fomentarius in

submerged culture and its antitumor effect in vitro. In: Biores. Technol., 2008, vol. 99(8), p.

3187-3194.

102. Chi Z., Fang Y. Exopolysaccharides from marine bacteria. In: J. Ocean Univ. China, 2005,

vol. 4(1), p. 67-74.

103. Chin-Hang S., Ko-Jung L., Bor-Jiun W. Effects of culture temperature on the production of

bioactive polysaccharides by A. blazei in batch cultures. In: J. of Chem. Technol. &

Biotechnol., 2007, vol. 82(9), p. 831-836.

104. Chris D. P., David E. Q., Smart K. A. The impact of brewing yeast cell age on fermentation

performance, attenuation and flocculation. In: FEMS Y. Res., 2003, vol. 3(2), p. 149–157.

105. Conde R., Cueva R., Larriba G. Rsc14-controlled expression of MNN6, MNN4 and MNN1

regulates mannosylphosphorylation of S. cerevisiae cell wall mannoproteins. In: FEMS Y.

Res., 2007, vol. 7(8), p. 1248–1255.

Page 117: Oleg Chiselita Thesis

117

106. Dalmo Roy A., Bogwald Jarl. ß-glucans as conductors of immune symphonies. In: Fish &

Shellfish Immunol., 2008, vol. 25(4), p. 384-396.

107. Danac R., et al. Synthesis of UDP-glucose deriv. modified at the 3-OH as potential chain

terminators of β-glucan biosynthesis. In: Carbohydrate Res., 2008, vol. 343(6,5), p. 1012-1022.

108. Davidson J. F., et al. Oxidative stress is involved in heat-induced cell deatherior S. cerevisiae.

In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93(10), p. 5116-5121.

109. De Nicola R., et al. Physiological and transcriptional responses of S. cerevisiae to zinc

limitation in chemostat cultures. In: Appl. Environ. Microbiol., 2007, vol. 73(23), p. 7680-7692.

110. De Nicola R., Graeme M. W. Accumulation and cellular distribution of zinc by brewing

yeast. In: Enz. and Microbial Technol., 2009,vol. 44(4,6), p. 210-216.

111. Dergunova M. A., et al. Characterization of the novel chemically modified fungal polysaccharides

as the macrophage stimulators. In:Int. Immunopharm. 2009, vol. 9(6), p. 729-733.

112. Dey, P. M. & Harborne, J. B. Methods in Plant Biochemistry. Carbohydr. Academic Press,

1993. vol. 2. 529 p.

113. Eicher, S. D., et al. Supplement vitamin C and yeast cell wall β-glucan as growth enhancers in

newborn pigs and as immunomodulators after an endotoxin challenge after weaning. In: J. of

Animal Sci., 2006, vol. 84(9), p. 2352-2360.

114. Fang Q. H., Zhong J. J. Effect of initial pH on production of ganoderic acid and

polysaccharides by submerged fermentation of G. lucidum. In: Proc.Biochem. 2002,vol.

37(7), p. 769-774.

115. Fei Shang, Zheng Wang and Tianwei Tan. High-cell-density cultivation for co-production of

ergosterol and reduced glutathione by S. cerevisiae. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol.,

2008, vol. 77(6), p. 1233-1240.

116. Forsberg, H., Ljungdahl, P. O. Genetic and bioch. analysis of the yeast plasma membrane

Sy1p-Ptr3p-Sy5p sensor of extracellular amino acids. In: Mol. Cell Biol. 2001, vol. 21, p.

814–826.

117. Francois J., Parrou J. Reserve carbohydrates metabolism in the yeast S. cerevisiae. In: FEMS

Y. Microbiol. Rev., 2001, vol.25, p. 125-145.

118. Fumiyoshi Abe. Induction of DAN/TIR yeast cell wall mannoprotein genes in response to high

hydrostatic pressure and low temperature. In: FEBS Lett., 2007, vol. 581(25), p. 4993-4998.

119. Gagianoa M., Bauera F. F., Pretorius I.S. The sensing of nutritional status and the relationship

to filamentous growth in S. cerevisiae. In: FEMS Y. Res., 2002, vol. 2(4), p. 433-470.

120. Gancedoa C., Carmen-Lisset F. The importance of a functional trehalose biosynthetic

pathway for the life of yeasts and fungi. In: FEMS Y. Res., 2004, vol. 4(4,5), p. 351-359.

Page 118: Oleg Chiselita Thesis

118

121. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. In: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, vol.

62, p. 334–361.

122. Garcia, P., Tajadura, V., Sanchez, Y. The Rho1p Exchange Factor Rgf1p Signals Upstream

from the Pmk1 Mitogen-activated Protein Kinase Pathway in Fission Yeast. In: Mol. Biol.

Cell, 2009, vol. 20(2), p. 721-731.

123. Gemma Beltran, et al. Integration of transcriptomic and metabolic analyses for understanding

the global responses of low-temperature winemaking fermentations. In: FEMS Y. Res., 2006,

vol. 6(8), p. 1167–1183.

124. Gomez A., et al. Slt2 and Rim101 Contribute Independently to the Correct Assembly of the

Chitin Ring at the Budding Yeast Neck in S. cerevisiae. In: Eukar. Cell, 2009, vol. 8(9), p.

1449-1459.

125. Gómez-Verduzco G., et al. Dietary supplementation of mannan-oligosaccharide enhances

neonatal immune responses in chickens during natural exposure to Eimeria spp. In: Acta Vet

Scand., 2009, vol. 51, p. 11-18.

126. Gonzalez M., Lipke P. N., Ovalle R. Chapter 15 GPI Proteins in Biogenesis and Structure of

Yeast Cell Walls. In: The Enzymes, 2009, vol. 26, p. 321-356.

127. Gonzalez-Ramos D., Cebollero E., Gonzalez R. A. Recombinant S. cerevisiae Strain

Overproducing Mannoproteins Stabilizes Wine against Protein Haze. In: Appl. and Environ.

Microbiol., 2008, vol. 74(17), p. 5533-5540.

128. Goto M., et al. Protein O-Mannosyltransferases B and C Support Hyphal Development and

Differentiation in A. nidulans. In: Eukaryot. Cell, 2009, vol. 8(10), p. 1465-1474.

129. Gustavo G. Fonseca, et al. Physiology of the yeast K. marxianus during batch and chemostat

cultures with glucose as the sole carbon source. In: FEMS Y. Res., 2007, vol. 7(3), p.422-435.

130. Guillou V., et al. Role of reserve carbohydrates in the growth dynamics of S. cerevisiae. In:

FEMS Y. Res., 2004, vol. 4(8), p. 773-787.

131. Hashimoto K. Comprehensive analysis of glycosyltransferases in eukaryotic genomes for

structural and functional character. of glycans. In: Carbohydr. Res. 2009, vol. 344(7), p.881-887.

132. Hayashi T., et al. Calcium spirulan, an inhibitor of enveloped virus replication, from a blue-

green alga S. platensis. In: J. of Natur. Product, 1996, vol.59(1), p. 83-87.

133. Hazelwood L. A., et al. Identity of the growth-limiting nutrient strongly affects storage

carbohydrates accumulation in anaerobic chemostat cultures of S. cerevisiae. In: Appl

Environ Microbiol., 2009, vol. 75(21), p. 6876-6885.

134. Hese K., et al. The yeast oligosaccharyltransferase complex can be replaced by STT3 from L.

major. In: Glycobiol., 2009, vol. 19(2), p. 160-171.

Page 119: Oleg Chiselita Thesis

119

135. Hisashi Yazawa, et al. Production of polyunsaturated fatty acids in yeast S. cerevisiae and its

relation to alkaline pH tolerance. In: Yeast, 2009, vol. 26(3), p. 167–184.

136. Hisashi Yazawa, et al. Improvement of polyunsaturated fatty acids synthesis by the

coexpression of CYB5 with desaturase genes in S. cerevisiae. In: Appl. Microbiol. and

Biotechnol., 2010, vol. 87(6), p. 2185-2193.

137. Hong-Chi T., et al. Lipidome profiling of S. cerevisiae reveals pitching rate-dependent

fermentative performance. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2010, vol. 87(4), p. 1507-

1516.

138. Hong-Zhi L., et al. Statistical optimization of culture media and conditions for production of

mannan by S. cerevisiae. In: Biotech. and Bioprocess Engineering, 2009, vol. 14(5), p. 577-583.

139. http://www.yarapteka.ru/modules.php?name=spr&inf=425.

140. http://www.kirkmanlabs.com/products/probiotics/saccharomyces/Saccharomyces C

141. Hu Shu-Hui, et al. Antihyperglycemic effect of polysaccharides from fermented broth of P.

citrinopileatus. In: Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2006, vol. 70(1), p. 107-113.

142. Huff G. R., et al. Limited Treatment with β-1,3/1,6-Glucan Improves Production Values of

Broiler Chickens Challenged with E. coli. In: Poultry Science, 2006, vol. 85(4), p. 613-618.

143. Hunter K. W. Jr., Gault R. A., Berner M. D. Preparation of microparticulate β-glucans from S.

cerevisiae for use in immune potentiation. In: Lett. in Appl. Microbiol., 2002, vol. 35, p. 267-271.

144. Hurtado-Guerrero Ramon, et al. Molecular Mechanisms of Yeast Cell Wall Glucan

Remodeling. In: J. of Biol. Chem., 2009, vol. 284(13), p. 8461-8469.

145. International Application No. PCT/JP2006/317212 C13K 1/02, B09B 3/00 Method of

producing saccharide compositions starting with biomass. Hisamatsu M., Furujyo A. Oji

Paper Co., Ltd. WO/2007/026817, F. Date:31.08.06, P. Date:08.03.07.

146. Ioannis S. Arvanitoyannis, Ladas D., Mavromatis A. Potential uses and applied of treated

wine waste. In: Int. J. of F. Science & Technol., 2006, vol. 41(5), p. 475–487.

147. Iraqui I., et al. Amino acid signaling in S. cer.: a permease-like sensor of external amino acids

and F-Box protein Grr1p are required for transcriptional induction of the AGP1 gene, which

encodes a broad-specificity amino acid permease. In: Mol. Cell Biol. 1999, vol. 19, p. 989–

1001.

148. Iwanyshyn W., Han G., Carman G. Regulation of phospholipid synthesis in S. cerevisiae by

zinc. In: J. Biol. Chem., 2004, vol. 279(21), p. 21976-21983.

149. Jami B. O’Quin, Robert T. Mullen, John M. Dyer. Addition of an N-terminal epitope tag

significantly increases the activity of plant fatty acid desaturases expressed in yeast cells. In:

Appl. Microbiol. and Biotechnol., 2009, vol. 83(1), p. 117-125.

Page 120: Oleg Chiselita Thesis

120

150. Jin H., Fang H., Zhuge J. Byoproduct formation by a novel glycerol-producing yeast C.

glycerinogenes with different O2 supplies. In: Biotechnol. Lett., 2003, vol.25(4), p. 311-314.

151. Jirku V., Masak J., Cejkova A. Yeast cell attachment: A tool modulating wall composition

and resistance to 5bromo-6azauracil. In: Enz. and Microb. Technol., 2000, vol. 26(9,10), p.

808-811.

152. Joaquín Pérez-Guisado. Argumentos a favor de la incorporación de los β-D-glucanos a la

alimentación. In: Endocrinol. y Nutrición, 2007, vol. 54(6), p. 315-324.

153. Johnston M. Fasting, feasting and fermenting: glucose sensing in yeast and other cells. In:

Trends Genet., 1999, vol. 15, p. 29–33.

154. Jorunn Skjermo, et al. Evaluation of β-(1→3, 1→6)-glucans and High-M alginate used as

immunostimulatory dietary supplements during first feeding and weaning of Atlantic cod (G.

morhua L.). In: Aquaculture, 2006, vol. 261(3), p. 1088-1101.

155. Joung Han Yim, et al. Antiviral effects of sulfated exopolysaccharides from the marine

microalga G. impudicum strain KG03. In: Mar. Biotechnol., 2004, vol. 6(1), p. 17-25.

156. Judith Dietvorst, et al. Amino acid residues involved in ligand preference of the Snf3

transporter-like sensor in S. cerevisiae. In: Yeast, 2010, vol. 27(3), p. 131–138.

157. Julian Weghuber, et al. Mutational analysis of functional domains in Mrs2p, the

mitochondrial Mg2+ channel protein of S. cerevisiae. In: FEBS J., 2006, vol. 273(6), p. 1198-

1209.

158. Kapteyn J. C., et al. Low external pH induces HOG1-dependent changes in the organization

of the S. cerevisiae cell wall. In: Mol Microbiol., 2001, vol. 39(2), p. 469-479.

159. Karachitosa A., et al. Cu, Zn-SOD is necessary for proper function of VDAC in S. cerevisiae

cells. In: FEBS Lett., 2009, vol. 583(2), p. 449-455.

160. Kates M. Separation of lipid mixtures. Techniques of Lipidology, Elsevier, 1988. p. 186-278.

161. Kiran M. Desai, et al. Use of an artificial neural network in modeling yeast biomass and yield

of β-glucan. In: Process Biochem., 2005, vol. 40(5), p. 1617-1626.

162. Kitanovic A., et al. Metabolic response to MMS-mediated DNA damage in S. cerevisiae is

dependent on the glucose concentr. in the medium. In: FEMS Y. Res., 2009, vol. 9(4), p. 535-

551.

163. Klis F. M., et al. Dynamics of cell wall structure in S. cerevisiae. In: FEMS Microbiol. Rev.,

2002, vol. 26, p. 239-256.

164. Kogan G., et al. Antioxidant properties of yeast (1-3)-β-d-glucan studied by electron

paramagnetic resonance spectroscopy and its activity in the adjuvant arthritis. In: Carbohydr.

Polymers, 2005, vol. 61(1), p. 18-28.

Page 121: Oleg Chiselita Thesis

121

165. Kogan G., Kocher A. Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health

protection. In: Livestock Sci., 2007, vol. 109(1,3), p. 161-165.

166. Kotia N., Lomtatidze Z. Peculiarites of cell wall ultrastructure of N. dassonvilei. Georg. Med.

News, 2006, vol. 7(136), p. 125-128.

167. Kreger-Van Rij N.J.W. General classification of the yeasts. The yeast: Ataxonomic study,-3rd.

ed. Ed. N.J.W. Kreger-Van Rij-Amsterdam Elesevier Biomed. Preis, 1984. 1082 p.

168. Krizková L., et al. Antioxidant and antimutagenic activity of mannan neoglycoconjugates:

mannan-human serum albumin and mannan-penicillin G acylase. In: Mutat. Res., 2006, vol.

606(1,2), p. 72-79.

169. Kruckeberg A. L., Walsh M. C., Van Dam K. How do yeast cells sense glucose? In: Bio.

Essays, 1998, vol. 20, p. 972–976.

170. Kwang S. K., Hyun S. Y. Production of soluble β-glucan from the cell wall of S. cerevisiae.

In: Enz. and Microb. Technol., 2006, vol. 39(3), p. 496-500.

171. Latgé Jean-Paul. The cell wall: a carbohydrates armour for the fungal cell. In: Mol.

Microbiol., 2007, vol. 66(2), p. 279-290.

172. Lesage G., Bussey H. Cell Wall Assembly in S. cerevisiae. In: Microbiol. and Mol. Biol.

Rev., 2006, vol. 70(2), p. 317-343.

173. Lowry O. H., et al. Protein measurment with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem.,

1951, vol. 193, p. 265-275.

174. Machi K., et al. Rot1p of S. cerevisiae is a putative membrane protein required for normal

levels of the cell wall 1,6-ß-glucan. In: Microbiol., 2004, vol. 150, p. 3163-3173.

175. Madrigal-Santillán E, et al. Inhibitory effect of mannan on the toxicity produced in mice fed

aflatoxin B1 contaminated corn. In:Arch. Environ Contam. Toxicol., 2007, vol. 53(3), p. 466-472.

176. Madrigal-Santillán E, et al. Investigation on the Protective Effect of alpha-Mannan against the

DNA Damage Induced by Aflatoxin B(1) in Mouse Hepatocytes. In: Int. J. Mol. Sci., 2009,

vol. 10(2), p. 395-406.

177. Magnelli P., Cipollo J., Abeijon C. A refined method for the determination of S. cerevisiae

cell wall composition and ß1,6-glucan fine structure. In: Anal. Biochem., 2002, vol. 301, p.

136-150.

178. Maneesri Jaruwan, et al. Deletion of MCD4 involved in (GPI) anchor synthesis leads to an

increase in β-1,6-glucan level and a decrease in GPI-anchored protein and mannan levels in

the cell wall of S. cerevisiae. In: J. of Biosci. & Bioeng., 2005, vol. 99(4), p. 354-360.

179. Mantovani M. S., et al. β-Glucans in promoting health: Prevention against mutation and

cancer. In: Mut. Res./Rev. in Mut. Res., 2008, vol. 658(3), p. 154-161.

Page 122: Oleg Chiselita Thesis

122

180. Morales R., et al. Effects on productive parameters and digestive mucosa of broilers caused

by feed supplemented with cell walls S. cerevisiae, beta-glucans and mannoproteins. In:

Poultry Sci., 2008, vol. 87(1), p. 173-178.

181. Nilsson T., Au C. E., John J. M. Bergeron. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi

apparatus. In: FEBS Lett., 2009, vol. 583(23), p. 3764-3769.

182. Nishida O., et al. Superior molasses assimilation, stress tolerance, and trehalose accumulation

of baker’s yeast isolated from dried sweet potatoes (hoshi-imo). In: Biosci. Biotechnol.

Biochem., 2004, vol. 68(7). p. 1442-1448.

183. Novak M., Vetvicka V. Glucans as Biological Response Modifiers. In: Endocrine Metabol. &

Immune Disorders-Drug Targets, 2009, vol. 9(1), p. 67-75.

184. Okamoto M., et al. The Cytoplasmic Region of {alpha}-1,6-Mannosyltransferase Mnn9p Is

Crucial for Retrograde Transport from the Golgi Apparatus to the Endoplasmic Reticulum in

S. cerevisiae. In: Eukaryot Cell, 2008, vol. 7, p. 310-318.

185. Paalman J. W., et al. Trehalose and glycogen accumulation is related to the duration of the G1

phase of S. cerevisiae. In: FEMS Y. Res., 2003, vol.3(3), p. 261-268.

186. Paraggio M., Fiore C. Screening of S. cerevisiae wine strains for the production of acetic acid.

In: World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(7), p. 743-747.

187. Parrou J., et al. Dynamic responses of reserve carbohydrates metabolism under carbon and

nitrogen limitation in S. cerevisiae. In: Yeast, 1999, vol. 15, p. 191-203.

188. Patent Australian 780186 С12Р 033/00 Method for preparing steroids modifieds by yeast

fermentation./ Cauet G., et al. Transgene S.A.№200076726, F.Date:04.10.00, P. Date:03.03.05.

189. Patent US 6753008 А61К 47/00, С12N 13/00. Dietary supplements beneficial for the liver./

Cheung L. Y. Ultra Biotech Ltd. №10/187112; F.Date:28.06.02; P.Date:22.06.04.

190. Patent US 6867024 А23L 1/30, Ubiquinone composition and methods related thereto./

Chokshi Dilip. Pharm. Lab., Inc.-№ 10/126476; F.Date:19.04.02, P.Date:15.03.05.

191. Patent US 6689593 С12N 9/02 С12Р 7/02, Production of farnesol and geranylgeraniol./

Millis J. R., Maurina-Brunker J., McMullin T. W. Arkion Life Sciences LLC.-№09/909558,

F.Date:20.07.01, P. Date:10.02.04.

192. Pavlova K., et al. Production and characterization of an exopolysaccharides by yeast. In:

World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(4), p. 435-440.

193. Philippis R., et al. Phospholipids and fatty acyl composition of S. cerevisiae. as affected by O2

and low growth temperature. In: Vitis: Viticulat. and Enol. Abstr., 2000, vol. 39(1,2). p.52-56.

194. Presta A., Stillman M. J. Incorporation of copper into the yeast S. cerevisiae identification of

Cu(I)-metallothionein in intact yeast cells. In: J. of Inorg. Bioch., 1997, vol. 66(4), p.231-240.

Page 123: Oleg Chiselita Thesis

123

195. Pretorius I. S., du Toit Maret, van Rensburg P. Designer yeasts for the fermentation industry

of the 21st century. In: Food Technol. and Biotechnol., 2003, vol. 41(1), p. 3-10.

196. Rafael Ojeda, et al. Preparation of multifunctional glyconanoparticles as a platform for

potential carbohydrates-based anticancer vaccines. In: Carbohydr. Res., 2007, vol. 342(3,4),

p. 448-459.

197. Rebar E., Miller J. Design and applications of engineered zinc finger proteins. In: Bio. Tech.

Inter., 2004, vol. 16(2), p. 20-24.

198. Reiner S., et al. S. cerevisiae a model to study sterol uptake and transport in eukaryotes. In:

Biochem. Soc. Trans., 2005, vol. 33, p. 1186-1188.

199. Robert J. Karreman, et al. The stress response protein Hsp12p increases the flexibility of the

yeast S. cerevisiae cell wall. In: (BBA) - Proteins & Proteomics, 2007, vol. 1774(1), p. 131-

137.

200. Rolland F., Winderickx J., Thevelein J. M. Glucose-sensing mechanisms in eukaryotic cells.

In: Trends Biochem. Sci., 2001, vol. 26, p. 310–317.

201. Rondanelli M., Opizzi A., Monteferrario F. The biological activity of beta-glucans. In:

Minerva Med., 2009, vol. 100(3), p. 237-245.

202. Rosenzweig A. Metallochaperones: Bind and deliver. In: Chem. Biol., 2002, vol. 9, p. 673-677.

203. Roustan J. L., Sablayrolles J. M. Trehalose and glycogen in wine-making yeasts:

Methodological aspects and variability. In: Biotechnol. Lett., 2002, vol. 24(13), p. 1059-1064.

204. Rudic V., et al. The influence of some coordination compounds of Zn(II) on productivity and

biochemical compositions S. platensis (Nordst.)Geitl.Calu-835. „Metal Elements in

Environment, Medicine and Biol.” Publishing House „Eurobiot”, 2002, vol. 5, p. 339.

205. Ruiz-Herrera J., González-Prieto M. J., Ruiz M. R. Evolution and phylogenetic relationships

of chitin synthases from yeasts and fungi. In: FEMS Y. Res., 2002, vol. 1(4), p. 247-256.

206. Ruszova E., et al. Photoprotective effects of glucomannan isolated from C. utilis. In:

Carbohydr. Res., 2008, vol. 343(3), p. 501-511.

207. Sampaio B. A., et al. The capacity of manno-oligosaccharides, thermolysed yeast and active

yeast to attenuate aflatoxicosis. In: World J. Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 20(5), p.

475-481.

208. Sankaranarayanan R., et al. The NMR solution structure of subunit G (G61–101) of the

eukaryotic V1VO ATPase from S. cerevisiae. In: (BBA) - Biomembranes, 2010, vol.

1798(10), p. 1961-1968.

209. Sarinho E., et al. Production of interleukin-10 in asthmatic children after Beta-1-3-glucan. In:

Allergol. et Immunopathol., 2009, vol. 37(4), p. 188-192.

Page 124: Oleg Chiselita Thesis

124

210. Scrimale T., et al. The Unfolded Protein Response Is Induced by the Cell Wall Integrity

Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Cascade and Is Required for Cell Wall Integrity

in S. cerevisiae. In: Mol. Biol. Cell, 2009, vol. 20(1), p. 164-175.

211. Shahinian S. & Bussey H. β-1,6-Glucan synthesis in S. cerevisiae. In: Mol. Microbiol., 2000,

vol. 35(3), p. 477-489.

212. Shu C. H., Wen B. J. Enhanced shear protection and increased production of an anti-tumor

polysaccharides by A. blazei in xanthan-supplemented cultures. In: Biotechnol. Lett., 2003,

vol. 25(11), p. 873-876.

213. Silke C. J., et al. Antioxidative activity of (1-3), (1-6)-β-d-glucan from S. cerevisiae grown on

different media. In: LWT-Food Sci. and Technol., 2008, vol. 41(5), p. 868-877.

214. Simons J. F., Ebersold M., Helenius A. Cell wall 1,6-ß-glucan synthesis in S. cerevisiae

depends on ER glucosidases I and II, and the molecular chaperone BiP/Kar2p. In: EMBO J.,

1998, vol. 17(2), p. 396-405.

215. Soltanian S., et al. The protective effect against V. campbellii in A. nauplii by pure β-glucan

and isogenic yeast cells differing in β-glucan and chitin content operated with a source-

dependent time lag. In: Fish & Shellfish Immunol., 2007, vol. 23(5), p. 1003-1014.

216. Son H. J, et al. Effects of β-glucan on proliferation and migration of fibroblasts. In: Curr.

Appl. Physics, 2005, vol. 5(5), p. 468-471.

217. Stehlik-Tomas V., et al. Zinc, copper and manganese enrichment in yeast S. cerevisiae. In:

Food Technol. and Biotechnol., 2004, vol. 42(2), p. 115-120.

218. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress. In: Curr. Opin. Microbiol., 1999, vol. 2(2), p.188-194.

219. Stuart G. R., et al Transcriptional response to mitochondrial NADH kinase deficiency in S.

cerevisiae. In: Mitochondrion, 2009, vol. 9(3), p. 211-221.

220. Stuart M. L, Charles A. S. The molecular basis for the immunogenicity of C. neoformans

mannoproteins In: FEMS Y. Res., 2006, vol. 6(4), p. 513–524.

221. Sylvain Brohée, et al. YTPdb: A wiki database of yeast membrane transporters. In: (BBA) -

Biomembranes, 2010, vol. 1798(10), p. 1908-1912.

222. Tai S. L., et al. Acclimation of S. cerevisiae to low temperature: a chemostat-based

transcriptome analysis. In: Mol Biol Cell, 2007, vol. 18(12), p. 5100-5112.

223. Takuji O., Yoshifumi J. Reconstruction de novo pathway for synthesis UDP-glucuronic acid

and UDP-xylose from intrinsic UDP-glucose in S. cerevisiae. In: FEBS J., 2006, vol. 273(12),

p. 2645-2657.

224. Tan T., Zhang M., Gao H. Ergosterol production by fed-batch fermentation of S. cerevisiae.

In: Enz. and Microb. Technol., 2003, vol. 33(4), p. 366-370.

Page 125: Oleg Chiselita Thesis

125

225. Tang Y. J., Zhong J. J. Role of O2 supplied in submerged ferm. of G. lucidum for production

of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. IN: Enz. and Microb. Technol., 2003, vol.

32(3,4). p. 478-484.

226. Ter Schure E. G., Van Riel N. A., Verrips, C. T. The role of ammonia metabolism in nitrogen

catabolite repression in S. cerevisiae. In: FEMS Microbiol. Rev., 2000, vol. 24, p. 67–83.

227. Thammakiti S., et al. Preparation of spent brewer's yeast β-glucans for potential applications

in the food industry. Int. J. of Food Sci. & Technol., 2004, vol. 39(1), p. 21-29.

228. Thomas M. Devlin.Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. 6-th ed., Edited by

John Wiley & Sons, Inc., Publ., 2006, p. 543-550.

229. Toshihiko K., Yasunori C., Yoshifumi J. S. cerevisiae α1,6-mannosyltransferase has a

catalytic potential to transfer a second mannose molecule. In: FEBS J., 2006, vol. 273(22), p.

5074-5085.

230. Tubiana M. Prevention of cancer and the dose-effect relationship the carcinogenic effects of

ionizing radiations. In: Cancer Radiother., 2009, vol. 13(4), p. 238-258.

231. Utsugi T., et al. Movement of yeast 1,3-β-glucan synthase is essential for uniform cell wall

synthesis. In: Gen. to Cells, 2002, vol. 7(1), p. 1-9.

232. Varga E., Maraz A. Yeast cells as sources of essential microelements and vitamins B1 and B2.

In: Acta alim., 2002, vol. 31(4), p. 393-405.

233. Veen M., Lang C. Production of lipid compounds in the yeast S. cerevisiae. In: Appl.

Microbiol. and Biotechnol., 2004, vol. 63(6), p. 635-643.

234. Velazquez E. A., et al. Immunological Response to (1,4)-α-d-Glucan in the lung and spleen of

endotoxin-stimulated juvenil rats. In: Basic & Clinical Pharm. & Toxicol., 2009, vol. 105(5),

p. 301-306.

235. Vivier M., Lambrechts M., Pretorius I. Co-regulation of starch degradation and dimorphism

in the yeast S. cerevisiae. In: Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1997, vol. 32, p. 405–435.

236. Volman J. J., Ramakers J. D., Plat J. Dietary modulation of immune function by beta-glucans.

In: Physiol Behav., 2008, vol. 23(94(2), p. 276-284.

237. Volman J. J., et al. Dietary (1>3), (1>4)-beta-D-glucans from oat activate nuclear factor-

kappa B in intestinal leukocytes and enterocytes from mice. In: Nutr. Res., 2010, vol. 30(1),

p. 40-48.

238. Wakako N., et al. Clinical significance of (1→3)-β-d-glucan in a patient with invasive sino-

orbital aspergillosis. In: Auris Nasus Larynx, 2009, vol. 36(2), p. 224-227.

239. Weihua Ni, et al. Preparation of a glucan from the roots of R. crataegifolius Bge. and its

immunological activity. In: Carbohydr. Res., 2009, vol. 344(18,14), p. 2512-2518.

Page 126: Oleg Chiselita Thesis

126

240. Xiaohua W., Lina Z. Physicochemical properties and antitumor activities for sulfated

derivatives of lentinan In: Carbohydr. Res., 2009, vol. 344(16), p. 2209-2216.

241. Xue Dong-hua, et al. Screening of yeast strains for the biosynthesis of ergosterol. J.

Changchun Univ. Technol., 2003, vol. 24(3), p. 16-18.

242. Yiannikouris A., et al. Influence of pH on Complexing of Model β-D-Glucans with

Zearalenone. In: J.of Food Protect, 2004, vol. 67(12), p. 2741-2746.

243. Yoon T. J., et al. Anti-tumor metastatic activity of β-glucan purified from mutated S.

cerevisiae. In: Int. Immunopharm., 2008, vol. 8(1), p. 36-42.

244. Zheng N, et al. Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-

protein ligases. In: Cell, 2000, vol. 18(102(4), p. 533-539.

Page 127: Oleg Chiselita Thesis

127

ANEXE

Page 128: Oleg Chiselita Thesis

128

ANEXA 1

Brevet de invenţie. 3792 G2, MD, A01K 61/00 Furaj pentru larve şi puiet de peşte/ Cererea

depusă 2008.08.07, BOPI nr. 1/2009.

Page 129: Oleg Chiselita Thesis

129

Page 130: Oleg Chiselita Thesis

130

ANEXA 2

Brevet de invenţie. 4048 B1, MD, C12N 1/16 Tulpină de drojdie Saccharomyces cerevisiae-sursă

de β-glucani/ Cererea depusă 2010.02.11, BOPI nr. 6/2010

Page 131: Oleg Chiselita Thesis

131

Page 132: Oleg Chiselita Thesis

132

ANEXA 3

Act de implementare a rezultatelor Nr.1 eliberat de ÎI „Marin-Alexandru” la 30.06.2009.

Page 133: Oleg Chiselita Thesis

133

ANEXA 4

Act de implementare a rezultatelor Nr.64A eliberat de CNMN a IMB a AŞM la 17.05.2010.

Page 134: Oleg Chiselita Thesis

134

Page 135: Oleg Chiselita Thesis

135

Page 136: Oleg Chiselita Thesis

136

Page 137: Oleg Chiselita Thesis

137

ANEXA 5

Diploma European Exhibition of Creativity and Inovation „EUROINVENT” 2009 Bronze Medal

„Feed for fish larvae and young fish”.

Page 138: Oleg Chiselita Thesis

138

ANEXA 6

Diplomă Expoziţia Internaţională Specializată „INFOINVENT” 2009 Medalia de Argint

„Bioproduse din drojdiile sedimentelor vinicole pentru furajarea peştilor”.

Page 139: Oleg Chiselita Thesis

139

Declaraţia privind asumarea răspunderii

Subsemnatul, Chiseliţa Oleg, declar pe răspundere personală că materialele prezentate în

teza de doctor sunt rezultatul propriilor cercetări şi realizări ştiinţifice. Conştientizez că, în caz

contrar, urmează să suport consecinţele în conformitate cu legislaţia în vigoare.

Chiseliţa Oleg ______________ ______________

Data

Page 140: Oleg Chiselita Thesis

140

CV AL AUTORULUI

Nnme, prenume:

CHISELIŢA Oleg.

Data şi locul naşterii:

28 august 1972, or. Floreşti, R. Moldova

Studii:

1989-1995 Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea de Biologie şi Pedologie, Specialitatea

„Biologie”.

1995-1998, 2007-2008 Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM, doctorand la

specialitatea „Microbiologie”.

Activitatea profesională:

1995-1998, 2007-prezent Institutul de Microbiologie şi Biotehnologie al AŞM, cercetător

ştiinţific.

Domenii de activitate ştiinţifică:

Microbiologie. Biotehnologie.

Specializare în domeniul biologiei drojdiilor, sintezei orientate a substanţelor biologic active.

Elaborarea procedeelor de cultivare dirijată a drojdiilor.

Elaborarea procedeelor de prelucrare a drojdiilor din sedimentele de vin şi obţinere a

biopreparatelor.

Lucrări ştiinţifice publicate 25, dintre care:

Articole în reviste recenzate -10, dintre care 3 în monoautorat;

Teze ale comunicărilor ştiinţifice-9;

Brevete de invenţie-3.

Participări la foruri ştiinţifice internaţionale:

Conferinţa internaţională IX Международная конференция молодых учёных

«Пищевые технологии и биотехнологии» (Cazani, 2008; 2009), Conferinţa internaţională

consacrată comemorării m.c. al AŞM Petru Ungurean (1894-1975) (Chişinău, 2008), Conferinţa

internaţională a tinerilor cercetători a IV ediţie (Chişinău, 2008), Conferinţa internaţională

„Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и

применения” (Crimeea, Ucraina, 2009), Conferinţa ştiinţifică naţională cu participare

internaţională consacrată celei de-a 50 aniversări de la fondarea Secţiei de Microbiologie

Page 141: Oleg Chiselita Thesis

141

„Probleme actuale ale microbiologiei şi biotehnologiei” (Chişinău, 2009), Expoziţia

internaţională Specializată „MOLDECO” ediţia a VII (Chişinău, 2007), European exhibition of

creativity and innovation „EUROINVENT” (Iaşi, 2009), Expoziţia internaţională specializată

„INFOINVENT” (Chişinău 2009), Salonul internaţional al cercetării, inovării şi inventicii PRO

INVENT, ediţia a VIII-a (Cluj – Napoca, 2010).

Participarea la proiecte ştiinţifice naţionale:

Proiect instituţional (2006-2010) „Fundamentarea ştiinţifică a sintezei orientate a

substanţelor bioactive de către microorganisme” 06. 411. 015 F.

Proiect al tinerilor cercetători în sfera ştiinţei şi inovării (2007-2008) „Evaluarea

principiilor bioactive a levurilor de la vinificaţie ca sursă pentru obţinerea biopreparatelor”

07.411.11 IND A.

Proiect al tinerilor cercetători în sfera ştiinţei şi inovării (2009-2010) „ Procesarea

drojdiilor rezultate în urma vinificării în scopul obţinerii carbohidraţilor pentru utilizare în

diverse domenii” 09.819. 08. 03. IND F.

Cunoaşterea limbilor: română, rusă, spaniolă, portugheză.

Date de conntact:

Chiseliţa Oleg

MD 2028 Chişinău, str. Academiei 1, of. 202, tel. +373 (22) 73 80 13.

e-mail: [email protected]


Recommended