UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA
FACULTATEA DE MEDICINĂ
Model integrativ de diagnostic și predicție a
evoluției leziunilor focale hepatice
-REZUMAT-
Conducător ştiinţific,
Prof. Univ. Dr. ION ROGOVEANU
Doctorand,
COSTIN TEODOR STREBA
CRAIOVA
2011
Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Axa Prioritară: 1. Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii
economice şi dezvoltării societăţii
Domeniul Major de Intervenţie: 1.5. Programe doctorale şi postdoctorale în
sprijinul cercetării
Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea
de burse doctorale"
Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8
Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova
1
CUPRINS
PARTEA GENERALĂ
Lista abrevierilor din text ........................................................................... 5
Introducere ................................................................................................. 7
I. EPIDEMIOLOGIE ȘI FACTORI DE RISC ÎN
HEPATOCARCINOM .............................................................................
9
II. DIAGNOSTICUL HEPATOCARCINOMULUI ............................. 17
III. ANALIZA FRACTALĂ A IMAGINILOR MEDICALE .............. 47
IV. REȚELELE NEURONALE ÎN DIAGNOSTICUL MEDICAL AL UNOR AFECȚIUNI COMPLEXE ................................................... 51
V. STADIALIZAREA HEPATOCARCINOMULUI ............................ 54
VI. OPȚIUNI TERAPEUTICE ÎN HEPATOCARCINOM ................. 58
PARTEA SPECIALĂ
OBIECTIVE ............................................................................................... 60
VII. Materiale și metode ........................................................................... 61
VIII. Rezultate ........................................................................................... 88
IX. Discuții .................................................................................................. 137
X. Concluzii ................................................................................................ 150
Bibliografie ................................................................................................. 153
Listă de lucrări ........................................................................................... 173
ANEXE ....................................................................................................... 175
CUVINTE CHEIE: Carcinom hepatocelular, model de diagnostic, ecografie cu
agent de contrast, rețea neuronală, analiză fractală a imaginii.
2
INTRODUCERE
Hepatocarcinomul reprezintă aproximativ 75–90% din tumorile maligne
hepatice, cu o frecvență mai mare în rândul bărbaților. Dintre metodele de
tratament, doar rezecţia chirurgicală sau transplantul hepatic pot oferi
posibilitatea vindecării. Diagnosticul precoce şi stabilirea prognosticului
carcinomului hepatocelular sunt extrem de dificile, datorită absenţei unor
markeri serologici adecvaţi şi a dificultăţilor de interpretare a testelor imagistice.
În prezent analiza fractală a imaginilor de anatomie patologică și în
special compararea dimensiunilor fractale ale elementelor studiate joacă un rol
din ce în ce mai important în diagnosticul de certitudine sau stadializarea
diverselor afecțiuni tumorale.
Importanța utilizării agenților de contrast pentru îmbunătățirea ratei
diagnostice pentru tumorile hepatice a fost demonstrată în multiple studii.
Tehnica de analiză a curbelor intensitate–timp este un procedeu relativ nou de
evaluare a formațiunilor focale hepatice care captează agentul de contrast.
Tomografia computerizată (CT) cu agenți de contrast pe bază de iod
reprezintă în momentul de față una dintre cele mai folosite investigații în
stabilirea diagnosticului de certitudine al hepatocarcinomului. Analiza de către
un operator uman a imaginilor CT native și în timpul fazelor de umplere cu
agenți de contrast oferă o imagine suficient de precisă a localizării și
caracteristicilor morfologice ale unei tumori hepatice. Examinarea CT în
dinamică poate oferi informații importante referitoare la gradul de extensie
tumorală, atât locală cât și la distanță.
Rețelele neuronale sunt în prezent sisteme moderne, accesibile din punct
de vedere al tehnicii, suficient de flexibile și cu o dinamică particulară ce le
recomandă ca mijloace diagnostice semi–independente. Ele sunt actualmente
preferate la nivel mondial metodelor clasice de urmărire și modelare statistică
pentru grupe populaționale cu patologii complexe, cum sunt cele cu afecțiuni
neoplazice maligne.
3
STADIUL CUNOAȘTERII
Carcinomul hepatocelular (CHC) este cea mai frecventă tumoră malignă
primară a ficatului, anual fiind diagnosticate în întreaga lume peste 500 000 de
cazuri noi [1–4]. CHC este o cauză majoră de mortalitate la nivel mondial,
reprezentând a treia cauza de deces prin neoplazii și respectiv a doua cauză de
deces în cadrul cancerelor din sfera digestivă [5–8].
Factorii majori de risc pentru CHC (80–90% din cazuri) includ infecția
cu virus hepatitic B (VHB) și C (VHC) [9, 10], existând de asemenea o asociere
cu consumul de alcool, care pare a avea o acțiune sinergică injuriei virale [9–11].
Pacienții cu risc crescut pentru CHC sunt în special bărbații cu vârste
peste 40 de ani și istoric de ciroză hepatică cu VHB sau VHC [3, 4]. Majoritatea
cazurilor noi este descoperită în urma unui examen imagistic, în special
ecografic, ocazie cu care sunt identificate una sau mai multe mase tumorale
hepatice [5, 8, 9]. Cele mai recente criterii de diagnostic pentru hepatocarcinom
sunt cele adoptate de Asociația Americană de Studiu a Afecțiunilor Ficatului
(AASLD, revizuite în 2010) și Societatea Europeană de Studiu a Ficatului
(EASL, revizuite în 2009).
Stadializarea corectă a tumorii este cheia tratamentului corect care să
asigure supraviețuirea pacientului pe o perioadă maximă [5–8]. Cel mai folosit
sistem de stadializare în prezent este cel elaborat de grupul Barcelona de studiu
al ficatului (BCLC – Barcelona Clinic Liver Cancer). Pentru tumori multiple,
aflate în stadii intermediare, problema stadializării este deosebit de importantă,
deoarece tratamentele curative includ alcoolizarea percutană, radioablația,
chemoembolizarea transarterială sau tratamentul sistemic cu agenți
chimioterapici [1–3, 5, 7].
Deşi ecografia nu poate face distincția între CHC și alte tumori solide ale
ficatului, reprezintă o tehnică disponibilă pe scară largă, neinvazivă şi frecvent
utilizată pentru screening-ul CHC [12–15]. Ghidurile curente de diagnostic
recomandă ecografia cu substanţă de contrast (CEUS – Contrast Enhanced
4
UltraSonography), împreună cu alte tehnici imagistice (tomografia
computerizată sau rezonanţa magnetică cu substanţă de contrast) printre tehnicile
care pot fi utilizate pentru diagnosticul non-invaziv al CHC [15, 16].
Analiza de către un operator uman a imaginilor CT native și în timpul
fazelor de umplere cu agenți de contrast oferă o imagine suficient de precisă a
localizării și caracteristicilor morfologice ale unei tumori hepatice. De asemenea,
examinarea CT în dinamică poate oferi informații importante referitoare la
gradul de extensie tumorală, atât locală cât și la distanță, fiind din acest punct de
vedere superioară examinării CEUS care este oarecum limitată ca și dimensiune
a ariei examinate [17].
Deși introdusă în urmă cu mai bine de 30 de ani [18, 19, 21], modelarea
fractală a formelor naturale a căpătat o importanță deosebită în ultimul deceniu,
în principal datorită evoluției rapide a puterii de calcul ale sistemelor
computerizate obișnuite [18, 23]. Combinarea analizei morfometrice nucleare cu
dispunerea markerilor de angiogeneză reprezintă un element de noutate absolută
în domeniul investigațiilor histologice pentru tumori hepatice primare și
secundare [18–23].
Sistemele de diagnostic ajutate de calculator pot oferi noi posibilități în
diagnosticul și stadializarea patologiei tumorale [24–26]. Rețelele neuronale
artificiale (ANN–artificial neural networks) sunt rezultatul cercetărilor în
informatica medicală, reprezentand o forma de inteligență artificială [26, 27].
Rețelele neurale reprezintă translatarea în limbaj informatic a principiilor de
funcționare ale sistemului nervos central uman. Deși conceptul nu este nou,
existând rețele neuronale aplicate în medicină încă de la mijlocul anilor 1990
[28], avansarea tehnicilor moderne de diagnostic a oferit posibilități noi rețelelor,
care în prezent nu se mai bazează doar pe date clinice, anamnestice și teste
simple de laborator, ci integrează parametrii imagistici sau metode de genetică și
biologie celulalară [29, 30].
5
MATERIALE ȘI METODE
Lotul de studiu. Selecția factorilor de risc Am inclus în acest studiu prospectiv un număr de 112 pacienți (69
bărbați, 43 femei) cu vârste cuprinse între 28 și 87 ani (vârsta medie 61 ± 4,01
ani), care au fost investigați prin metoda ecografiei cu substanță de contrast
(CEUS – Contrast Enhanced UltraSonography) în perioada ianuarie 2009 – Mai
2011, în urma observării unor leziuni focale hepatice în ecografia standard.
Repartiția lotului de studiu a fost făcută în funcție de diagnosticul final
stabilit imagistic prin două metode pe bază de agent de contrast, respectiv CEUS
și examen CT cu substanță de contrast iodată. Pacienții au semnat
consimțamântul informat asupra tuturor procedurilor și tratamentelor primite și
au fost de acord cu folosirea filmelor CEUS și a înregistrărilor CT pentru
prelucrarea computerizată și statistică.
Pacienții au fost intervievați pe parcursul internării cu privire la consumul
de alcool, folosindu-se un chestionar adaptat. Am considerat un aport de alcool
susţinut de peste 70 de grame de etanol pe zi, în ultimii cinci ani ca
"semnificativ". S-a consemnat de asemenea mediul de provenienţă (rural/urban).
La toţi subiecţii s-a recoltat Ag HBs şi anticorpii anti-VHC prin determinări
serologice, realizate folosind testul standard enzime-linked immunosorbent
(ELIZA).
Pentru evaluarea factorilor de risc, am folosit testul t Student pentru a
compara mediile variabilelor continue, împreună cu testul exact al lui Fisher şi
chi-pătrat pentru proporţii. Am calculat riscul relativ (RR), într-un interval de
încredere (CI) de 95% pentru determinarea riscului de dezvoltare a CHC la
pacienţii infectaţi cu VHB şi VHC, precum şi importanţa alcoolului ca un factor
de risc. Semnificaţia statistică a fost atinsă pentru o valoare P <0,05.
6
Analiza fractală a imaginilor histologice
Lotul de pacienți
Grupul de pacienți la care a fost disponibil material bioptic fac parte din
lotul de 112 pacienți studiați imagistic, internaţi în Clinica de Gastroenterologie
a UMF Craiova şi Centrul de Cercetare în Gastroenterologie şi Hepatologie
Craiova în perioada ianuarie 2009 – mai 2011. Aceștia au decedat în timpul
spitalizării ca urmare a stadiilor avansate de boală și a complicațiilor. Toate
materialele de biopsie au fost recoltate post–mortem, în conformitate cu criteriile
şi recomandările Comitetului de Etică al spitalului, numai în urma obținerii
acordul scris de la fiecare pacient (la începutul ultimei internări, unde a fost
posibil) şi al familiilor lor.
Pregătirea histologică şi imunohistochimică a probelor
Secțiunile de țesut fixate în formaldehidră și incluse în blocuri de
parafină, cu o grosime de 2 micrometri, au fost supuse tehnicilor standard pentru
colorarea în hematoxilină a cromatinei nucleare, precum şi colorare
imunohistochimică pentru depistarea modelelor vasculare.
Vasele de sânge au fost imunomarcate pe 3–4 lame pentru fiecare caz în
parte. Recuperarea antigenică a fost efectuată prin fierbere în tampon citrat timp
de 20 de minute. Secţiunile au fost apoi incubate peste noapte, cu un anticorp
anti-CD34 (Clona BIRMA-K3, Dako, diluție 1:100). A doua zi, secţiunile au fost
spălate şi semnalul amplificat utilizând un sistem de ABC-HRP (Dako, Golstrup,
Danemarca), şi detectat cu 3'3'diaminobenzidine (DAB) (Dako).
Analiza dimensiunii fractale
Imaginile au fost achiziţionate cu un microscop Nikon Eclipse 90i
(Apidrag, Bucureşti, România) şi o camera de 5 megapixeli cu senzor CCD
(Charge-Coupled Device –senzor optic de înaltă acuratețe), dotat cu obiective
Apo-cromatice cu factori de mărire de 40x și respectiv 60x. Obiective de mare
7
putere au crescut nivelul de detaliu al structurilor observate. Am capturat o serie
de 100 de imagini pentru fiecare caz studiat. Imaginile au fost prelucrate ulterior
cu software-ul NIS-Elemente de procesare a imaginii (Nikon). O semnătură roşu-
verde-albastru a semnalului DAB a fost creată şi toate imaginile au fost în mod
automat segmentate, măștile obținute fiind apoi salvate ca imagini binare care
conţin informaţii despre textura fiecărei imagini inițiale.
Imaginile binare astfel obținute au fost în continuare analizate cu ajutorul
software-ul Image J (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda)
împreună cu plug-in-ul FracLac (A. Karperien - Charles Sturt University,
Australia).
Analiza statistică a datelor
În final, toate datele brute au fost exportate în Excel (Microsoft
Corporation, Redmond, Washington, SUA) şi analizate cu soft-ul GraphPad
Prism pachetul 5.0 pentru statistică (GraphPad, USA).
Am efectuat analiza varianţei (ANOVA – ANalysis Of VAriance. Pentru
siguranța rezultatelor am folosit testul post-hoc Bonferroni pentru comparații
multiple, atât pentru dimensiunile fractale (FD) obținute din regiunile
intratumorale, cât și extratumorale. Perechi de valori medii asociate fiecărui
eşantion prelevat din regiunea tumorală şi din parenchimul înconjurător
corespunzător, au fost apoi analizate prin efectuarea de teste t Student nepereche.
Am considerat valorile p <0,05 ca fiind semnificative statistic.
8
Analiza filmelor de ecografie cu substanță de contrast (CEUS)
Protocol CEUS și selecția secvențelor de interes
Pacienții au fost examinați folosind un ecograf Hitachi EUB-8500 și un
ecograf Hitachi Preirus, modele dotate cu posibilități de examinare mod B, M,
Doppler Color, Doppler Pulsat. Sondele convexe folosite au fost modelul C516
cu gama de frecvențe 2,5-5 MHz. S-a folosit injectarea unui bolus intravenos de
2,4 ml SonoVue (Bracco, Germania), urmată de injectarea a 5 ml soluție salină.
După o scanare prealabilă în mod B s-a efectuat injectarea agentului de
contrast, moment în care a început și examinarea CEUS cu indice mecanic
scăzut, până la 0,19.
Protocolul de analiză cantitativă a filmelor CEUS
Filmele înregistrate (format AVI, 6 cadre pe secundă) și transferate în
unitatea offline (notebook) au fost analizate folosindu-se software-ul Image Pro
Plus (Media Cybernetics, Bethesda, USA). Filmul complet al unei investigații a
fost într-o primă etapă segmentat în trei porțiuni reprezentative, în funcție de
timpii de tranzit hepatic ai agentului de contrast.
Primul segment video a totalizat 200 de cadre (±30 de cadre), urmărind
durata teoretică a întregii faze arteriale (aproximativ 34–40 de secunde), în timp
ce următoarele două segmente analizate au inclus 60 de cadre fiecare,
corespunzând a câte 10 secunde din fiecare fază ulterioară (fazele venoasă și
tardivă. Au fost selectate două regiuni de interes: zona tumorală un segment de
parenchim normal înconjurător, situat la aceeași adâncime cu tumora.
Pentru fiecare cadru al animației programul a prezentat rezultatele sub
forma unui tabel. Acesta a fost exportat în programul Microsoft Excel (Microsoft
Corp., USA) pentru îndosariere și reprezentarea grafică ulterioară. Seturile
distincte de date au fost de asemenea exportate în programul GraphPad Prism 5
(GraphPad, USA).
9
Studiul imagistic CEUS – Prelucrarea statistică a datelor și
introducerea în rețeaua neuronală
Parametri urmăriți în acest studiu au fost reprezentați de: valoarea
maximă a intensității (maximum intensity – IMAX), reprezentată de media
intensităților în fiecare punct al AOI-ului vizat; timpul mediu de tranzit (mean
transit time – MTT), care aproximează timpul în care agentul de contrast nu mai
este reprezentat ca o creștere semnificativă a intensității luminoase în AOI; aria
de sub curbă (area under curve – AUC), care oferă o interpretare paralelă a
impactului variației intensității; indexul de perfuzie (perfusion index – IP),
respectiv o apreciere a vascularizației în aria de interes; panta curbei (rise time –
RT), respectiv o măsurătoare a vitezei de creștere a intensității până la atingerea
pragului superior; cât și timpul până la valoarea maximă (time to peak – TTP),
efectuată de la timpul de intensitate zero.
Pentru a aprecia uniformitatea distribuției intensităților medii pe
parcursul intervalelor înregistrate, am aplicat o regresie liniară pentru fiecare
serie de date, producând astfel o curbă de tip “best-fit”, menită să aprecieze
valoarea teoretică cea mai apropiată în fiecare punct.
Prelucrarea statistică a datelor a constat în aprecierea cantitativă a
valorilor în cele trei faze ale agentului de contrast pentru toți cei 112 pacienți
incluși în studiu, în cele două arii de interes definite pe înregistrările ecografice.
Am folosit testul Wilcoxon signed rank pentru compararea celor două seturi de
date. În continuare am folosit testul de corelație r Spearman, pentru a observa
diferențele semnificative dintre cele trei perechi de curbe obținute în fiecare
etapă succesivă a CEUS. În final, am urmărit în cadrul unei analize multivariate
variațiile distribuțiilor fiecărui parametru studiat (IMAX, AUC, MTT, IP, RT și
TTP). Seriile individuale de puncte corespunzătoare intensităților în fiecare
moment, pentru fiecare tip de pereche tumoră–parenchim, au fost introduse în
cadrul rețelei neuronale dezvoltate în paralel, în corelație cu rezultatele
prelucrării statistice.
10
Studiul imagistic computer tomograf (CT)
Investigația CT a fost efectuată pentru stabilirea diagnosticului de
certitudine acolo unde imagistica ultrasonografică nu a fost suficientă, sau a fost
efectuată înaintea investigației CEUS, în cursul unei prime internări în Clinica de
Gastroenterologie a UMF Craiova şi Centrul de Cercetare în Gastroenterologie şi
Hepatologie Craiova în perioada ianuarie 2009 – mai 2011. În final, toți 112
pacienți au fost investigați prin ambele metode.
Pacienții au fost investigați cu ajutorul unui CT multidetector helical
Siemens Somatom Emotion 6 (Siemens ltd., Germania), folosindu-se un protocol
standard în patru faze, în funcție de momentul administrării agentului de contrast
iodate: pre-contrast, timp arterial, timp portal-venos și fază târzie (faza de
echilibru). Fiecare pacient a primit un bolus de agent de contrast în limita a 100
ml. Au fost realizate patru înregistrări complete în direcție cranio-caudală, cu
următorii parametri: intervalul secțiunilor 1–5 mm, numărul biților stocați 24,
rezoluția 512x512, 220 mA putere efectivă și 120 kVp. Faza arterială a fost
înregistrată până la aproximativ 50–51 secunde din momentul injectării (limite
37–65 secunde), faza portală la 65 secunde (limite 60–70 secunde), faza
terminală fiind înregistrată de la 180 de secunde (limite 170–190).
Imaginile au fost preluate retrospectiv și analizate folosind un protocol
multi–pas de segmentare semi-automată. Seriile de imagini au fost introduse în
software-ul gratuit ImageJ. Am selectat apoi imaginile semnificative, respectiv
secțiunile unde se putea vizualiza în întregime ficatul. Am aplicat un filtru Sobel
pentru identificarea marginilor elementelor prezente în fiecare imagine (în cazul
nostru, marginile organelor prezente în fiecare secțiune CT consecutivă). Am
aplicat apoi un filtru LoG (Laplacian of Gaussian) pentru netezirea marginilor,
extrăgând astfel limitele grosiere ale parenchimului hepatic. În paralel am
efectuat selecția semi-automată a zonelor tumorale folosind filtre LoPass
succesive unei egalizări a histogramei pe nuanțe de gri a zonei parenchimului
hepatic, extrăgând zonele de interes. Astfel, parenchimul normal a căpătat
11
valoarea 0, nivelul intensităților pixel-per-pixel fiind egalizat în funcție de
intensitatea sa de bază. S-au selectat astfel o serie de clasificatori diferiți pentru
zonele tumorale de interes, analizându-se aspectul texturii și alcătuindu-se
“hărți” în tonuri de gri pentru acestea. Am calculat astfel numărul de
caracteristici incluse în fiecare set specific pentru aria de interes în cauză,
numărul și tipul acestora contând pentru aprecierea diagnosticului sau
prognosticului. În ultima etapă rezultatele au fost și ele incluse în cadrul analizei
multifactoriale efectuată cu ajutorul rețelei neuronale.
Selecția clasificatorilor a fost efectuată cu ajutorul unui subsistem al
rețelei neuronale, pe baza selecției automate și antrenării paralele de către un
operator uman. Am alcătuit în prealabil un set de cincisprecezece matrici 4x5
(patru faze diferite – Nativ, arterială, portală și tardivă; respectiv cinci patologii
diferite – hepatocarcinom, metastaze slab vascularizate, metastaze
hipervascularizate, hemangioame hepatice) de clasificatori, respectiv imagini cu
dimensiunea 16x16 pixeli, denumite în continuare CP – clasificatori pozitivi.
Ulterior alegerii CP cu valoare pentru fiecare diagnostic în parte, o a doua
componentă a rețelei neurale a efectuat selecția cazurilor în funcție de numărul
de potriviri între caracteristicile histogramelor CP și histogramele echivalente ale
zonelor hepatice. În continuare, rețeaua neuronală a analizat imaginea pixel cu
pixel, folosind o metodă automată de comparare a asemănării a doi pixeli
învecinați (near-pixel approximation – aproximarea pixelilor apropiați
Am folosit un model bazat pe matrici de co–localizare pe nuanțe de gri
(Gray Level Co-occurrence Matrix – GLCM) după modelul propus de Haralick,
model implementat în plug-in-ul “Texture analyzer” (Cabrera, Statele Unite ale
Americii) dezvoltat pentru aplicația ImageJ (Bethesda, USA). Am calculat astfel
trei descriptori pentru textură: valoarea contrastului, coeficientul de corelație și
valoarea coeficientului de entropie, pentru fiecare set de texturi alese drept
clasificatori pozitivi. Am stabilit în continuare fezabilitatea metodei, testând
reproductibilitatea aplicării ei pentru plaja de patologii diferite studiate.
12
Rețelele neuronale aplicate în modelul de diagnostic și predicție
Având la dispoziție setul de parametrii clinici și paraclinici ai unui număr
suficient de mare de pacienți, am continuat prin aplicarea unui model de rețea
neuronală pentru clasificarea, stadializarea și stabilirea indicației terapeutice
optime pentru pacienții cu CHC sau alte tumori focale hepatice, fie maligne, fie
benigne.
Rețelele neuronale pe care le-am folosit pentru clasificarea tumorilor au
fost de tip feed forward back propagation (cu transmisie anterogradă a datelor și
propagare retrogradă a rezultatului), optim pentru rezolvarea problemelor de
clasificare. Rețelele au dispus de un numar de neuroni de intrare egal cu numărul
parametrilor folosiți, un strat ascuns, precum și un neuron de ieșire (care
furnizează încadrarea rezultatului). Fiecărui parametru de intrare, introdus în
formă numerică (ca valori predefinite sau variabile binare, 0/1), i s-a atribuit o
pondere în funcție de care rețeaua calculează importanța fiecăruia pentru
rezultatul final. Nu am definit ponderi stricte pentru datele de intrare, valorile
acestora fiind stabilite automat în baza setului de antrenare. Funcțiile de transfer
au fost echivalentul sinapselor umane, ele permițând legătura între straturile
neuronale.
O parte din totalul cazurilor a fost folosită pentru antrenarea rețelei, în
timp ce restul datelor au fost implicate în procesul de validare a rezultatelor.
Datele introduse au fost stocate în cadrul unei baze de date dedicată. Prin
procesul de antrenare a rețelei neuronale am realizat modificarea iterativă a
ponderilor datelor de intrare în cadrul algoritmului global astfel încât, după un
anumit timp, acestea sa fie convergente spre o soluție care oferă o corelație
logică între datele de intreare și cele de ieșire.
Rețelele neuronale au fost concepute și aplicate în cadrul toolbox-ului
dedicat din cadrul aplicației MatLab (MathWorks, Massachusetts, Statele Unite
ale Americii). Odată cu introducerea parametrilor complecși în rețeaua neuronală
pentru antrenare, aceștia au fost stocați într-o bază de date dedicată.
13
Prin conlucrarea între sistemul de rețele neuronale și modulele de
prelucrare a filmelor CEUS, analiza automată a imaginilor CT și modeulul de
analiză fractală a imaginilor, am populat baza de date cu o serie de valori pentru
aceste investigații (Figura 1).
Într-o ultimă etapă de dezvoltare am adăugat o interfață web accesibilă
din interiorul unui browser Internet, sau local prin accesarea interfeței clasice.
Figura 1. Schema unui (a) neuron și (b) a unei rețele neuronale.
14
REZULTATE
Statistica descriptivă a lotului de studiu În studiu au fost incluși 112 pacienți, internați în Clinica de
Gastroenterologie a UMF Craiova şi Centrul de Cercetare în Gastroenterologie şi
Hepatologie Craiova în perioada ianuarie 2009 – mai 2011.
Vârstele subiecților au fost cuprinse între 28 și 87 ani, cu o vârsta medie
de 61 ± 4,01 ani (vârstă ± DS – deviația standard). Au predominat subiecții cu
vârste peste 50 de ani (n=82 respectiv 73,2% din întregul lot). Din totalul de 73
pacienți cu tumori hepatice maligne (CHC și metastaze hepatice) un număr de 68
pacienți (93,15%) aveau vârste peste 50 ani. În sublotul pacienților cu
hepatocarcinom s-a observat afectarea preponderentă a bărbaților (n=30, raportul
bărbați : femei fiind de 2,72 : 1).
Riscul relativ (RR) de a dezvolta CHC a fost calculat pentru un interval
de încredere de 95% (CI 95%) la pacienții cu ciroză hepatică, cu VHB, VHC și
consum de alcool. Am observat un risc statistic semnificativ crescut pentru CHC
în cazul pacienților cu ciroză hepatică (RR=6,53; CI95% =3,18 – 13,38), la
pacienții Ag HBs pozitivi (RR=4,51; CI95%=2,48 – 8,21), la pacienții cu Atc
anti-VHC pozitivi (RR=4,91; CI 95% 1,84 – 4,33) și la pacienții consumatori de
alcool (RR=9,165; CI95% 4,43 –18,92). Am identificat o corelaţie între abuzul
de alcool şi pozitivitatea Ag HBs atât la pacienţii cu ciroză hepatică cât şi la cei
cu hepatită cronică (testul chi-pătrat, p <0,001). Ag HBs pozitiv și consumul mai
mare de alcool au fost mai frecvent întâlnite la populația din mediul rural (testul
chi-pătrat, p <0,001).
Factorii de risc identificați în cadrul sublotului cu CHC au fost
reprezentați de VHB (n=17 pacienți, 41,46%), VHC (n=13 pacienți, 31,70%),
asociere VHB și VHC (n=6, 14,63%), consum abuziv de alcool fără patologie
virală asociată (n=5 pacienți, 12,19%). Consumul abuziv de alcool a fost decelat
la 30 pacienți (73,1%) dintre care 15 pacienți cu VHB, 7 pacienți cu VHC, 3
pacienți cu asociere VHB și VHC și 5 pacienți fără patologie virală asociată.
15
Ciroza hepatică a fost prezentă la 36 pacienți din sublotul cu CHC (87,8%)
dintre care 15 pacienți cu VHB, 13 pacienți cu VHC, 6 pacienți cu asociere
VHB+VHC și 5 pacienți cu consum abuziv de alcool și fără infecție virală
cronică (Figura 2).
Figura 2. Repartiția cazurilor cu CHC în funcție de afecțiunea hepatică
preexistentă
Metastazele hepatice au avut punct de plecare gastric în 12 cazuri (38%),
colonul în 7 cazuri (22%), pancreasul în patru cazuri (13%), pulmonar trei cazuri
(9%), cancer de sân în trei cazuri (9%) și cancer al prostatei în trei cazuri (9%).
Diametrul formațiunilor nodulare din CHC a variat între 2 cm și 10,7 cm, cu o
medie de 5,08 ± 2,17 cm. Într-o proporție de peste 90% din cazuri (n=38
pacienți) a fost întâlnită forma masivă de CHC. În grupul pacienților cu
metastaze hepatice, dimensiunile au variat între 2 și 13 cm, valoarea medie
situându-se la 5,08 ± 3,15 cm. Am întâlnit formațiuni metastatice multiple la 16
pacienți (50%). În schimb, hemangioamele au variat între 2 și 7 cm diametru, cu
o medie de 3,1 ± 1,31 cm, fiind vorba de multiple formațiuni în cazul a 9 pacienți
(56,25%). Formațiunile steatozice identificate ecografic s-au încadrat între 2 și
6,5 cm în diametru maxim, cu o medie de 3,8 ± 1,28 cm, fiind vorba de
formațiuni multiple la 6 pacienți din totalul de 23.
16
Analiza fractală a imaginilor histologice
Analiza histopatologică
Am observat tumori care conţineau în principal hepatocite de formă
rotund-ovalară, cu nuclei mari și nucleoli unici sau multipli, unele dintre ele cu
halou perinucleoral, precum și insule de celule care conţineau incluziuni
intracelulare. Mai multe celule tumorale prezentau nuclei veziculari fără
nucleoli, nuclei picnotici sau chiar absența nucleului atunci când se aflau în
apoptoză.
Imunomarcarea CD34 a fost absentă în celulele tumorale, fiind prezentă
numai în vase, marcand astfel procesul de angiogeneză. Primele trei cazuri de
CHC (CHC 1–3) au prezentat aspectul de carcinom hepatocelular pe fondul de
ficat steatozic. Am observat, printre celulele tumorale, numeroase hepatocite cu
citoplasma clară și un mic nucleu spre periferie (corespunzător aspectului de
steatoză macroveziculară). Hepatocitele tumorale au prezentat un aranjament
trabecular, cu nuclei heterogeni discariotici, observând de asemenea și hepatocite
binucleare. În acest caz, CD34 a fost intens pozitivă la nivelul vaselor, precum şi
pe membrana mai multor hepatocite tumorale.
Celelalte două cazuri de carcinoame hepatocelulare (CHC 4 și 5) au
prezentat aspectul de tumori neuroendocrine formate din celule tumorale
monomorfe, aranjate în structuri acinare separate prin stromă vasculară. Nu am
identificat expresia CD34 în celulele tumorale, reacția fiind însă pozitivă la
nivelul vaselor. Am putut concluziona cu toate acestea că procesul de
angiogeneză a fost redus în aceste cazuri speciale, care prezintă diferenţiere
neuroendocrină.
Metastazele cancerului pulmonar s-au prezentat ca tumori cu celule mici,
pozitivitate CD34 intensă la nivelul pereților vasculari, cât şi pe membrana
celulelor tumorale.
17
Metastazele cancerelor gastrice și de colon au avut aspectul de
adenocarcinoame slab diferenţiate. Metastazele cancerului de colon au afişat un
număr mare de celule tumorale, cu unele microvezicule şi incluziuni intra-
citoplasmatice cu nuclei pleomorfi heterogeni. În toate cele patru cazuri, am
putut observa un proces marcat de angiogeneză (pozitivitate CD34 intensă la
nivel vascular).
Clasificarea fractală a morfologiei tumorale. Statistică descriptivă și
variabilitatea probelor
Am observat variaţii distincte ale valorii medii pentru fiecare tip specific
de patologie, precum şi variaţiile distincte în vascularizația CHC ce prezenta
diferenţiere neuroendocrină (CHCn). Înregistrarea valorilor minime şi maxime,
precum şi CI 95% ne-a oferit o mai bună imagine de ansamblu a răspândirii
valorilor din fiecare interval.
Astfel, am putut constata faptul că valorile medii pentru fiecare patologie
nu sunt diferite din punct de vedere statistic (p > 0,05) în mediul intratumoral,
atât pentru FD-urile corespunzătoare ariilor nucleare, cât și pentru valorile
obținute pentru ariile de vascularizație imunomarcate cu CD34.
Pentru mediul extratumoral rezultatele au fost similare, neînregistrându-
se diferențe semnificative între valorile medii ale dimensiunilor fractale
corespunzătoare nucleilor dar și vaselor din fiecare pereche de cazuri. Astfel, am
putut folosi în continuare valorile medii dintre seturile corespunzătoare fiecărui
caz dintr-o pereche, simplificând astfel redarea rezultatelor testelor statistice de
comparare multi-grup folosite.
Evaluarea dispunerii cromatinei nucleare
În ceea ce privește dispoziţia cromatinei nucleare, am observat diferenţe
semnificative între cele cinci perechi de grupuri de țesut intratumoral [one-way
ANOVA, F (5, 594) = 205,2, p <0,0001]. Analiza post-hoc utilizând testul
Bonferroni de comparare multiplă a indicat faptul că diferenţele între FD-urile
18
mediane pentru metastazele gastrice și de adenocarcinom colonic nu au fost
statistic semnificative (t = 0,2164, p> 0,05). De asemenea, cum era de asteptat,
cazurile de CHC studiate au prezentat variații minime inter-grup (p> 0,05). Toate
celelalte FD-uri medii au diferit semnificativ (p <0,0001).
În ceea ce priveşte analiza cromatinei nucleare pentru eşantioanele
extratumorale, nu au existat diferenţe semnificative între DF medie (F = 1,16,
one-way ANOVA p> 0,05). Analiza post-hoc de asemenea nu a relevat diferenţe
semnificative (test Bonferroni, p> 0,05). Acest lucru a dovedit omogenitatea
parenchimului hepatic normal în lotul studiat, atunci când arhitectura hepatică
normală este păstrată şi nu se exprimă fenotipuri aberante celulare.Teste t
Student aplicate succesiv pentru fiecare pereche de serii de probe intra- şi
extratumorale au diferenţiat în mod clar între FD-uri specifice (two-tail, p
<0,0001).
Evaluarea CD34 vascular
Am folosit imunomarcarea CD34 pentru a evidenţia axele vasculare, atât
în probele tumorale cât şi în parenchimul înconjurător. Dimensiunea fractală
calculată pentru toate tipurile diferite de tumori, a diferențiat clar metastazele și
tumorile primare [one-way ANOVA, F (5, 594) = 2,441, p <0,0001]. Deoarece
hepatocarcinomul cu neurodiferențiere (CHCn) a fost slab vascularizat în
comparaţie cu celelalte cazuri de CHCs studiate, în analiza post-hoc am putut
observa variaţii semnificative între acestea (t = 5,139, p <0,0001). Toate
metastazele au fost clasificate distinct utilizând modelul vascular, precum și
primele două cazuri de CHC (test Bonferroni, p <0,0001).
Am comparat FD-urile pentru parenchimul normal cu valorile obţinute
pentru țesutul tumoral în fiecare caz și am constatat diferenţe semnificative între
acestea (test t Student, tw-tailed p <0,0001).
Un rezumat grafic poate fi urmărit în figurile 3 și 4.
19
6
Figura 3. Repartiția dimensiunilor fractale medii (mean FDs) pentru cele patru subloturi analizate: (a) – Repartiția intratumorală a cromatinei nucleare; (b) – Repartiția extratumorală, în parenchimul normal, a cromatinei nucleare; (c) – Repartiția valorilor medii pentru dimensiunile fractale corespunzătoare ariilor imunomarcate CD34, respective ariile vasculare de neoformație intratumorale; (d) – Aceeași repartiție pentru țesutul extratumoral, respectiv în parenchimul normal înconjurător.
Figura 4. Reprezentare grafică a valorilor medii și a testelor statistice efectuate pentru compararea acestora, în cazul ariilor nucleare și al dispoziției vascularizației.
20
Studiul imagistic CEUS
Carcinomul hepatocelular
Figura 5. Curbă intensitate-timp corespunzând unui CHC
Reprezentarea grafică a celor două curbe intensitate-timp
corespunzătoare ariei tumorale și respectiv unei arii de interes parenchimatoase
(Figura 5), situată la aceeași adâncime, a relevat diferențe semnificative între
valorile intensităților medii înregistrate în faza arterială și pe parcursul fazei
portale (p<0,0001). Aceste diferențe nu au fost însă semnificative statistic pe
parcursul fazei tardive, unde curbele intensităților nu au diferit, înregistrându-se
valori ale intensităților asemănătoare, ceea ce corespunde unui wash-out tumoral
precoce (p=0, 6755).
Distribuția valorilor a diferit semnificativ în faza arterială, unde gradul de
încărcare superior al formațiunii tumorale maligne, bine vascularizată, a fost net
superior parenchimului normal (p<0,0001). Valorile au avut distribuții
asemănătoare în fazele portale și tardive, fapt ce a concordat cu observațiile în
timp real ale observatorului uman.
Aria de sub curbă calculată pentru faza arterială a fost un parametru util
pentru aprecierea cantitativă a gradului de încărcare tumorală, reliefând
caracteristicile fiecărei faze de încărcare (p<0,0001). S-a putut observa și aici
0
20000
40000
60000
80000
100000
1200001 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
111
121
131
141
151
161
171
181
191
Tumora
Parenchim
21
încărcarea asemănătoare în faza tardivă a parenchimului tumoral și a celui
hepatic normal.
Am putut observa diferențe semnificative între valorile IMAX
înregistrate în cele două arii de interes (p<0,001). TTP a fost mult mai scăzut în
cazul regiunii tumorale, comparativ cu parenchimul normal, mai slab
vascularizat. MTT a fost similar atât în aria tumorală, cât și în parenchimul
normal. PI a înregistrat valori mai ridicate în interiorul ariei de interes
corespunzătoare tumorii, probabil datorită vascularizației bogate întâlnită în
majoritatea cazurilor de CHC. Rise Time nu a variat semnificativ între cele două
regiuni, arătând că panta curbei de încărcare este similară între cele două arii de
interes.
Metastaze hepatice hipervasculare
Figura 6. Curbă intensitate-timp corespunzând unei metastaze hipervasculare
Folosind testul Wilcoxon signed rank, am observat diferențe
semnificative între valorile medii obținute în fiecare dintre cele trei faze ale
încărcării cu agent de contrast (Figura 6) (p<0,0001). Diferențele s-au menținut
pe parcursul fazei tardive, existând însă fenomenul de wash-out, cu echilibrarea
curbelor, însă tardiv, în afara intervalului de timp necesar “spălării” tumorale în
cazul metastazelor (p<0,0001). Valorile medii au fost semnificativ diferite pe
parcursul celor trei faze, aspect datorat probabil și faptului că aceste metastaze
hepatice au fost bine vascularizate.
0
50
100
150
200
250
1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97 105
113
121
129
137
145
153
161
169
177
185
193
1 Tumora
2 Parenchim
22
Faza portală a avut o distribuție inconstantă a valorilor, coeficientul de
corelație Spearman fiind de –0,154 (p=0,1201). Distribuția valorilor intensităților
medii a fost uniformă pe parcursul fazelor arterială și tardivă. Metastazele
hepatice hipervascularizate nu au prezentat wash-out la fel de precoce, fapt care
le-a diferențiat de cazurile cu hepatocarcinom pe parcursul fazei tardive.. Am
observat diferențe înalt semnificative între zona tumorală și cea de parenchim
normal aleasă ca referință (p<0,0001).
IMAX a diferit semnificativ între zonele tumorală, și respectiv cea de
control (p<0,001). TTP a fost mai crescut în aria tumorală, rezultatul variind însă
semnificativ. MTT a avut valori apropiate în ambele arii urmărite. PI a fost mai
ridicat în aria metastatică, însă a avut o mai mare variabilitate, fără însă a scădea
în vreun caz sub valorile parenchimului normal. RT a fost mult mai rapid în aria
tumorală comparativ cu zona de parenchim de referință, fapt datorat probabil
dinamicii vasculare intratumorale. În cadrul regresiei nonliniare am obținut o
încadrare aproape perfectă a curbei intensitate–timp pentru aria metastatică, cu
aproximativ 99% dintre valori încadrate în model, în schimb parenchimul hepatic
a demonstrat o încadrare inferioară celorlalte cazuri, cu doar 64% dintre valori.
Metastaze hepatice hipovasculare
Figura 7. Curbă intensitate-timp corespunzând unei metastaze hipovasculare
0
5000
10000
15000
20000
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
111
121
131
141
151
161
171
181
191
Tumora
Parenchim
23
În cazul metastazelor hipovasculare (Figura 7), valorile medii au diferit
semnificativ pe parcursul celor trei faze (p<0,001). Variația în fiecare pereche a
fost semnificativă, cu valori pozitive ale coeficienților Spearman, datorate în
principal fenomenului de inversare a curbelor între cele două arii de interes,
parenchimul încărcându-se mai rapid și la valori mai înalte comparativ cu
regiunea tumorală.Variația ariei de sub curbă a evidențiat existența unor
diferențe înalt semnificative între zona de parenchim normal și regiunea tumorală
(p<0,0001).
IMAX pentru zona normală de parenchim a înregistrat o valoare
superioară celei corespunzătoare pentru zona tumorală (p<0,001). TTP a fost și
în cazul acesteia mai crescut în aria tumorală. MTT a avut valori apropiate în
ambele arii urmărite. PI a fost mai ridicat în aria de parenchim normal. RT a
diferit nesemnificativ între cele două arii, fiind mai scăzut în parenchimul
normal, posibil și datorită lipsei de vascularizație intratumorală.
Hemangioame hepatice
Figura 8. Curbă intensitate-timp corespunzând unui hemangiom hepatic
Reprezentarea grafică a celor două curbe intensitate-timp
corespunzătoare ariei hemangiomului și respectiv unei arii de interes
parenchimatoase situate la aceeași adâncime (Figura 8), a relevat diferențe
semnificative între valorile intensităților medii înregistrate pe parcursul celor trei
0200000400000600000800000
10000001200000140000016000001800000
1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100
109
118
127
136
145
154
163
172
Tumora
Parenchim
24
faze de încărcare (p<0,0001). Diferențele s-au menținut și pe parcursul fazei
tardive, unde curbele intensităților au fost diferite, lipsind fenomenul de wash-
out tumoral precoce specific pentru tumora malignă (p=0,0002).
Hemangiomul, fiind o tumoră bine vascularizată, a avut o distribuție a
valorilor intensității semnalului diferită semnificativ în faza arterială față de cea a
parenchimului normal (p<0,0001). Valorile au avut distribuții diferite și pe
parcursul fazelor portale și tardive, datorită absenței wash-out-ului tumoral.
Aria de sub curbă calculată pentru faza arterială a fost un parametru util
pentru aprecierea cantitativă a gradului de încărcare tumorală, acestea diferind
semnificativ pentru cele două zone de interes, în toate cazurile cu hemangiom
hepatic (p<0,0001).
Valorile intensității maxime (IMAX) înregistrate în cele două arii de
interes au diferit semnificativ (p<0,001). În contrast cu tumorile maligne
primitive, TTP a fost mai crescut în cazul regiunii tumorale, comparativ cu
parenchimul normal. MTT a păstrat caracteristicile întâlnite în cazul tumorilor
maligne, având valori apropiate în aria hemangiomului și în parenchimul
normal. PI, așa cum era de așteptat, a înregistrat valori mai ridicate în regiunea
hemangiomului. RT a fost mai rapid în cazul parenchimului, comparative cu
zona hemangiomului.
Steatoză focală
Figura 9. Curbă intensitate-timp corespunzând unei steatoze focale
0
50
100
150
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58
Tumora
Parenchim
25
Prin compararea succesivă a celor două seturi pereche de valori ale
intensității în zonele de interes (Figura 9), pe parcursul celor trei faze de acțiune
a agentului de contrast, nu am observat diferențe semnificative în gradul de
umplere (p>0,05). IMAX a avut o valoare ușor crescută pentru zona steatozică,
în comparație cu parenchimul normal, fără a exista însă diferențe semnificative
din punct de vedere statistic (p>0,05). În contrast cu tumorile studiate, TTP a fost
aproximativ egal în cele două zone. MTT a avut și aici valori apropiate în ambele
arii urmărite.
Analiza variabilității parametrilor derivați din curbele CEUS
intensitate–timp
În continuare, am efectuat o analiză a variabilității parametrilor derivați
din TIC-urile corespunzătoare fiecărei patologii, pentru a stabili fezabilitatea lor
în contextul clinic diagnostic (Tabelul 1).
IMAX TTP MTT PI AUC RT QOF CHC Tumoră 0,112 0,105 0,123 0,013 0,106 0,085 0,087 Parenchim 0,064 0,054 0,078 0,025 0,025 0,082 0,055 Metastaze hepatice Tumoră 0,102 0,228 0,121 0,050 0,129 0,261 0,001 Parenchim 0,175 0,123 0,051 0,142 0,055 0,159 0,033 Hemangiom hepatic Tumoră 0,072 0,140 0,020 0,031 0,123 0,137 0,158 Parenchim 0,065 0,115 0,150 0,031 0,135 0,317 0,033 Steatoză focală Tumoră 0,171 0,093 0,085 0,065 0,106 0,122 0,012 Parenchim 0,209 0,092 0,106 0,071 0,104 0,110 0.014
Tabelul 1. Variația parametrilor în subloturile studiate. Se poate observa variabilitatea scăzută a parametrilor, atât pentru zona tumorală cât și în parenchimul normal.
26
Variabilitatea intra–grup pentru înregistrările succesive a fost scăzută
pentru toate tipurile de leziuni examinate, cel mai mare coeficient de variabilitate
fiind de 0,317 pentru timpul de atingere a 90% din intensitatea maximă, în
parenchimul normal al cazurilor cu metastaze hepatice.
Valoarea maximă a coeficientului de variabilitate pentru intensitatea
maximă a fost de 0,209 pentru parenchimul zonei de steatoză focală. Valori mai
mari de 0,1 au mai fost înregistrate și pentru intensitățile maxime ale
metastazelor hepatice și hepatocarcinom, cea mai omogenă dispoziție având-o
seria de hemangioame hepatice. În ceea ce privește timpul până la atingerea
maximului, metastazele hepatice au înregistrat cea mai mare variabilitate, fapt
așteptat de altfel datorită vascularizației diferite în funcție de tumora de bază.
Timpul de tranzit al agentului de contrast a înregistrat de asemenea variații mari
în unele serii, atât pentru parenchim, cât și pentru zona tumorală, fără a exista o
legătură clară între aceste diferențe. Indexul de perfuzie a avut variații constant
scăzute, dovedind o bună omogenitate a acestui parametru. Parametrul cu valori
constant variabile a fost PI, parametru care este legat de panta curbei de creștere
a intensității în faza de captare arterială. Acest lucru nu este surprinzător, aici
înregistrându-se cele mai multe variații datorate heterogenității tipurilor de
vascularizație arterială. Aria de sub curbă a avut în general o variabilitate
scăzută, rezultat obținut în general și pentru calitatea încadrării în modelele
teoretice. În cazul acestui ultim parametru, a fost înregistrat cel mai mic
coeficient de variație (0,001), pentru curbele asociate intensităților medii ale
zonelor de metastază hepatică. Variabilitatea a fost scăzută pentru toate
categoriile de parametri și în cazul tuturor leziunilor examinate, validând criteriul
de selecție al acestor indicatori.
27
Analiza imaginilor CT
Selecția zonelor de interes prin segmentarea imaginilor CT
Am alcătuit astfel serii de 3–5 imagini corespunzătoare fiecărei faze
(arterială, portală și de echilibru). Au fost astfel obținute în total 1792 de imagini
pentru cele 4 faze ale unui număr de 112 de pacienți (media de 4 cadre per fază).
Prin aplicarea succesivă a filtrelor Sobel și LoG, am obținut o
reprezentare automată a limitelor ficatului. Această metodă a selectat corect zona
de parenchim hepatic în 91,57 % din cazuri (n=1641 imagini corect selecționate
din totalul de 1792; repartiția rezultatelor se poate observa în tabelul 2).
Nativ Faza arterială
Faza portală
Faza tardivă
Selecții incorecte 54/448 34/448 31/448 32/448 Selecții corecte (%) 87,94 92,41 93,08 92,85 Tabelul 2. Numărul de selecții incorecte corespunzătoare fiecărei faze. Selecțiile corecte sunt reprezentate procentual.
Selecția clasificatorilor
Am observat diferențe semnificative între valorile histogramelor tuturor
elementelor studiate, putând astfel face distincția între fiecare tip de patologie și
moment al substanței de contrast.
În cadrul analizei folosind matrici de co–localizare pe nuanțe de gri
(Gray Level Co-occurrence Matrix – GLCM), am obținut o variabilitate scăzută
în interiorul fiecărui grup de valori, pentru fiecare situație în particular (p<0,05;
coeficienți de variație < 0,3).
Faza arterială a permis clasificarea corectă a 91,6% dintre metastazele
slab vascularizate, crescând de asemenea simțitor numărul cazurilor de
hepatocarcinom clasificate corect (70,73% comparativ cu doar 24,3% în urma
analizei fazei native). Metastazele intens vascularizate și hemangioamele au fost
în continuare greșit clasificate în 45% și respectiv 56,25% din cazuri, procentele
fiind însă mai bune comparativ cu etapa fără agent de contrast.
28
Faza tardivă a ajutat la identificarea corectă a unui procent semnificativ
crescut de hemangioame, în lipsa fenomenului de wash-out (87,5% încadrare
corectă, maximul atins pentru această categorie de formațiuni) (tabel 3).
Clasificare corectă
Clasificat ca CHC Mh MH H SF
CHC 37/41 0 1 0 0 Mh 0 12/12 0 0 0 MH 4 0 16/20 0 0 H 1 0 1 14/16 0 SF 0 0 0 0 23/23
Tabel 3. Clasificarea în urma analizei fazei de echilibru. Se observă specificitate bună în cazul metastazelor slab vascularizate. De asemenea, se poate observa atingerea specificității maxime pentru hemangiom.
Rata rezultatelor adevărat pozitive, respectiv leziuni maligne corect
clasificate ca CHC, Mh sau MH, a fost de 29/32; rata adevărat negativelor,
respectiv leziuni benigne corect identificate ca hemangioame a fost de 7/10; rata
fals pozitivelor, respectiv hemangioame înregistrate ca tumori maligne (fie
primare sau secundare) a fost 3/10, iar în final rata fals negativelor (tumori
maligne înregistrate greșit ca hemangioame) a fost 3/10 (Tabelul 4).
Clasificate ca Maligne Benigne Total
Valoare reală Maligne 71 2 73 Benigne 2 37 39 Total 73 39 112
Tabel 4. Tabel de frecvență pentru valorile clasificate de către rețeaua neuronală.
Am obținut o acuratețe de 85,7%, cu o sensibilitate de 90,6%,
specificitate de 70%, valoare predictivă pozitivă 90,6% și valoare predictivă
negativă de 70%. Se poate observa că acuratețea maximă este atinsă pentru
metastazele hepatice hipovascularizate (100%), urmată de acuratețea pentru
hepatocarcinom (85,7%), hemangioame hepatice (70%) și în final metastaze bine
vascularizate (66,6%).
29
Testarea rețelelor neuronale în diagnosticul de certitudine CHC.
Clasificarea și prognosticul formațiunilor focale hepatice
Am antrenat în paralel două rețele neuronale care au conlucrat pentru
obținerea unui rezultat final cât mai precis. Prima rețea a primit doar datele
clinice și paraclinice ale pacienților, obținându-se astfel o repartizare a tumorilor
în funcție de malignitate. A doua rețea neuronală a prelucrat în funcție de
parametrii rezultați din investigațiile imagistice cu agent de contrast.
Rețeaua simplă atribuie diagnosticul de benignitate dacă scorul cumulat
al ponderilor se situează cât mai aproape de valoarea 0 și diagnosticul de
malignitate când valorile se situează în jurul valorii 1. Deoarece scorurile
cumulative pentru fiecare diagnostic variază între 0 și 100% probabilitate pentru
un diagnostic, valorile între 0 și 0,49 sunt interpretate ca benigne, în timp ce
scorurile peste 0,50 – 1,50 sunt interpretate ca maligne.
Rețeaua complexă atribuie scoruri de probabilitate pentru fiecare caz
clasificat (în intervalul 1–5), cu aceleași limite de tolerabilitate de ±0,5 (respectiv
50%–100% probabilitate).
Antrenare Validare Testare Valoare finală
Rețea simplă 0,93823 0,94851 0,84907 0,92721 Rețea completă 0,99408 0,99789 0,98484 0,99232 Tabel 5. Distribuția coeficienților R în cadrul fiecărei etape de exploatare a rețelelor neuronale.
Coeficienții de variabilitate pentru rețeaua simplă au avut valori
inferioare celor pentru rețeaua complexă (Tabelul 5). Rețeaua neurală complexă
a atins un prag superior de performanță, ajungând la potențialul maxim în timpul
validării la doar 7 pași de antrenare, comparativ cu rețeaua simplă care a avut
nevoie de 21 de pași pentru a atinge o rată a erorilor suficient de mică pentru a
putea îndeplini criteriile de validare prestabiliți automat de către program.
Distribuția erorilor (respectiv diferențele dintre valorile implicite,
reprezentate de diagnosticul stabilit de medicul curant și valorile stabilite de
30
rețea, respectiv diagnosticul probabil indicat de aceasta) a demonstrat de
asemenea o mai bună acuratețe a rețelei neuronale complexe. Reprezentarea
grafică sub formă de histograme de distribuție a evidențiat omogenitatea
repartiției erorilor în jurul valorii -0,037 pentru rețeaua complexă, în timp ce
rețeaua neuronală simplă a înregistrat valori multiple și în afara acestui interval.
Eroarea standard a rețelei simple s-a situat însă în limite admisibile, respectiv în
intervalul -0,3 +0,9.
Din analiza curbelor de performanță (Return Operator Characteristics)
am dedus faptul că rețeaua neuronală complexă este mai eficientă comparativ cu
cea simplă (p=0,0163; interval de încredere 95% 0,0108 – 0,107). Acest rezultat
poate fi tradus prin faptul că un subiect este clasificat corect în aproximativ
97,3% din cazuri pentru rețeaua complexă, respectiv în aproximativ 91,4%
pentru rețeaua simplă (Figura 10 și Tabelul 6). Valorile prag la care rețelele au
înclinat spre un alt diagnostic decât cel corect au fost în majoritatea cazurilor
extrem de scăzute.
Figura 10. Curbele ROC (Return Operator Characteristics) corespunzătoare celor două rețele neuronale, în ceea ce privește clasificarea benign–malign: Rețeaua simplă, care conținea doar datele clinice și paraclinice ale pacienților, și rețeaua complexă, care conținea și parametrii imagistici corespunzători studiilor cu agent de contrast.
31
AUC SE 95% CI Rețea complexă 0,973 0,0160 0,924 – 0,995 Rețea simplă 0,914 0,0288 0,847 – 0,959 Comparația între cele două ROC-uri Diferența între arii 0,0590 Eroare standard 0,0246 95% CI 0,0108 – 0,107 Statistică Z 2,401 Nivel de semnificație P = 0,0163
Tabelul 6. Cele două curbe ROC au demonstrat o diferență semnificativă din punct de vedere statistic, cu un nivel foarte înalt de încredere.
% Rețea simplă Rețea complexă Sensibilitate 93,2 97,3 Specificitate 89,7 97,4 PPV 94,42 98,6 NPV 87,57 95,06
Tabel 7. Performanța rețelelor neuronale pentru distincția benign / malign. PPV = positive predictive value, valoare predictivă pozitivă; NPV = negative predictive value, valoare predictivă negativă.
Clasificare corectă
Clasificat ca CHC Mh MH H SF
CHC 41/41 0 0 0 0 Mh 0 12/12 0 0 0 MH 0 0 18/20 2 0 H 0 0 1 15/16 0 SF 0 0 0 0 23/23 Tabelul 8. Clasificarea efectuată de rețeaua neuronală complexă, folosind datele imagistice complexe. CHC – Hepatocarcinom; Mh – metastază hipovasculară; MH – metastază hipervasculară; H – hemangiom; SF – Steatoză focală.
Rețeaua complexă a demonstrat o performanță superioară celei simple
(Tabelul 7), clasificând corect un total de 109 cazuri din 112, comparativ cu 103
clasificări pozitive pentru rețeaua simplă (Tabelul 8). Pentru toate cele trei
cazuri rețeaua a oferit însă un grad de siguranță scăzut, de sub 80%. Totuși,
rețeaua simplă a dovedit o fiabilitate foarte bună, cu o sensibilitate de peste 93%
în evidențierea tumorilor maligne, având de asemenea o specificitate de aproape
90%.
32
CONCLUZII
• Diagnosticarea precoce și stadializarea corectă a tumorii este cheia
tratamentului adecvat, capabil să asigure supraviețuirea pacientului pe o
perioadă maximă. Studiul desfășurat în cadrul Clinicii de
Gastroenterologie a Universității de Medicină și Farmacie din Craiova și
Centrului de Cercetare în Gastoenterologie și Hepatologie Craiova în
perioada ianuarie 2009 – mai 2011 pe 112 pacienți a permis o analiză
corectă a fiabilității parametrilor și variabilelor studiate prin metodele de
diagnostic folosite.
• Introducerea analizei fractale, cu măsurarea dimensiunii fractale, constituie
o metodă nouă de cuantificare a markerilor tisulari în probele histologice
recoltate din tumorile maligne hepatice. Folosirea sa în contextul
diferențierii mai multor tipuri de tumori hepatice maligne reprezintă o
noutate la nivel mondial, care oferă în viitor posibilitatea cuantificării cu
precizie a status-ului tumoral, dovedindu-și de asemenea utilitatea în
stabilirea originii tumorilor hepatice.
• Studiul desfășurat mi-a permis dezvoltarea unui sistem medical expert,
capabil să folosească tehnici de analiză fractală a imaginilor medicale în
vederea identificării și cuantificării markerilor specifici de prognostic,
pentru coroborarea cu datele clinice și paraclinice în cadrul unei rețelele
neuronale complexe.
• Acești parametri (intensitatea maximă a agentului de contrast, timpul până
la atingerea acestei valori, timpul mediu de tranzit, panta curbei de
încărcare și aria de sub curbă) au fost studiați în cadrul fiecărei clase, iar
rezultatele au putut fi introduse în sistemul expert bazat pe rețele neuronale,
crescând semnificativ acuratețea sa diagnostică.
• Examinarea CT cu agenți de contrast specifici permite diagnosticul pozitiv
al CHC când este efectuată în dinamică. Utilitatea diagnostică este dublată
33
de posibilitatea evaluării gradului de extensie tumorală. Am folosit o rețea
neuronală pentru selectarea și clasificarea automată a unei serii de
caracteristici particulare, specifice pentru fiecare tip de formațiune focală
hepatică.
• Cele mai bune rezultate au fost obținute în etapele CT care evaluează
dinamica vasculară, unde rețelele neuronale au putut clasifica un număr
semnificativ crescut de formațiuni tumorale (102 din 112 formațiuni corect
clasificate, comparativ cu doar 34 din 112 formațiuni în cazul imaginilor
native).
• Preluarea datelor clinice și paraclinice ale pacienților a antrenat rețeaua
neuronală, care a putut departaja corespunzător afecțiunile maligne de cele
benigne hepatice în 103 cazuri din totalul de 112. Sensibilitatea acestei
metode a fost astfel de 93,2%, cu o specificitate de 89,7%.
• Adăugarea datelor provenite din analiza curbelor intensitate–timp rezultate
în urma analizei înregistrărilor CEUS a sporit considerabil acuratețea
diagnostică a rețelei (sensibilitate și specificitate semnificativ crescute –
97,3% respectiv 97,4%).
• Analiza curbelor ROC a confirmat această observație, fiind obținută o arie
de sub curbă de 0,973 pentru rețeaua complexă, comparativ cu 0,914 pentru
cea simplă. Mai mult, acești parametri au permis încadrarea formațiunilor
focale hepatice în cinci clase distincte, sporind acuratețea diagnostică în
diferențierea CHC.
34
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v1.2, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Adresă web: http://globocan.iarc.fr, accesat în 10/08/2011.
2. Shariff MIF, Cox IJ, Gomaa AI, Khan SA, Gedroyc W, Taylor-Robinson SD. Hepatocellular Carcinoma: Current Trends in Worldwide Epidemiology, Risk Factors, Diagnosis and Therapeutics. Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 2009; 3(4): 353–367.
3. Venook AP, Papandreou C, Furuse J, de Guevara L. L. The incidence and epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective. Oncologist, 2010; 15 Suppl 4:5-13.
4. El-Serag HB. Hepatocellular Carcinoma N Engl J Med, 2011; 365:1118-1127.
5. Constantinescu I, Nedelcu F, Toader MA. Clical and Therapeutical Importance of HBV Genotyping in Romania. J Med Life, 2008; Apr-June;1(2):165-73.
6. Bruix J, Sherman M; Practice Guidelines Committee, American Association for the Study of Liver Diseases. Management of hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2005; 42(5): 1208–1236.
7. Bruix J, Sherman M. American Association for the Study of Liver Diseases. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology, 2011; 53 (3):1020–1022.
8. Ciurea T, Săftoiu A. Tumorile hepatice. În: Hepatologie clinică, sub redacţia Paulina Ciurea, Tudorel Ciurea, Editura Medicală Universitară Craiova, 2000, pag. 313-344.
9. Malaguarnera G, Giordano M, Paladina I, Berretta M, Cppellani A, Malaguarnera M. Serum markers of hepatocellular carcinoma. Dig Dis Sci, 2010; 55(10): 2744–2755.
10. Colli A, Fraquelli M, Casazza G, Massironi S, Colucci A, Conte D, Duca P. Accuracy of ultrasonography, spiral CT, magnetic resonance, and alpha-fetoprotein in diagnosing hepatocellular carcinoma: a systematic review. Am J Gastroenterol, 2006; 101:513-523.
35
11. Ignee A, Jedrejczyk M, Schuessler G, Jakubowski W, Dietrich CF. Quantitative contrast enhanced ultrasound of the liver for time intensity curves-Reliability and potential sources of errors. Eur J Radiol, 2010; 73(1): 153 – 158.
12. Salvatore V, Borghi A, Sagrini E, Galassi M, Gianstefani A, Bolondi L, Piscaglia F. Quantification of enhancement of focal liver lesions during contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Analysis of ten selected frames is more simple but as reliable as the analysis of the entire loop for most parameters. Eur J Radiol, 2011 Feb 21. [Epub ahead of print]
13. Goertz RS, Bernatik T, Strobel D, Hahn EG, Haendl T. Software-based quantification of contrast-enhanced ultrasound in focal liver lesions--a feasibility study. Eur J Radiol, 2010; 75(2): e22–26.
14. Singh P, Erickson RA, Mukhopadhyay P, Gopal S, Kiss A, Khan A, Ulf Westblom T. EUS for detection of the hepatocellular carcinoma: results of a prospective study. Gastrointest Endosc, 2007; 66:265-273.
15. Albrecht T, Blomley M, Bolondi L, Claudon M, Correas JM, Cosgrove D, Greiner L, Jäger K, Jong ND, Leen E, Lencioni R, Lindsell D, Martegani A, Solbiati L, Thorelius L, Tranquart F, Weskott HP, Whittingham T. EFSUMB Study Group. Guidelines for the use of contrast agents in ultrasound. Ultraschall Med 2004; 25: 249–256.
16. Lencioni R, Piscaglia F, Bolondi L. Contrast-enhanced ultrasound in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology, 2008; 48: 848–857.
17. Baron RL, Brancatelli G. Computed Tomographic Imaging of Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology, 2004; 127: S133–S143.
18. Pirici D, Mogoantă L, Mărgăritescu O, Pirici I, Tudorică V, Coconu M, Fractal analysis of astrocytes in stroke and dementia, Romanian Journal of Morphology and Embryology, 2009, 50(3):381–390.
19. Antonio Di Ieva. Angioarchitectural morphometrics of brain tumors: Are there any potential histopathological biomarkers? Microvascular Research, 2010; 80:522–533.
20. Streba CT, Pirici D, Mogoanta L, Comanescu M, Rogoveanu I, Sandulescu L, Bold A. Fractal Analysis Differentiation Of Nuclear And Vascular Patterns In Hepatocellular Carcinomas And Hepatic Metastasis. J of Hepatol, Suppl. 1 (52), 2010: S351.
21. Streba CT, Rogoveanu I, Vere CC, Mogoanta L, Lilea G. Differentiation between normal hepatic parenchyma, hepatocellular carcinoma and
36
metastasis, on histological images, using image fractal analysis. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1. 2010:148-149.
22. Streba CT, Rogoveanu I, Vere CC, Pirici D, Baloseanu C. Correlations between fractal dimension of vascular axel disposition and dimension in immunostained images of hepatocellular carcinoma and various liver metastasis. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1. 2010:149.
23. Streba CT, Pirici D, Vere CC, Mogoantă L, Comănescu V, Rogoveanu I. Fractal analysis differentiation of nuclear and vascular patterns in hepatocellular carcinomas and hepatic metastasis. Rom J Morphol Embryol, 2011; 52(3):845-854.
24. Jiang J, Trundle P, Ren J.. Medical image analysis with artificial neural networks. Computerized Medical Imaging and Graphics, 2010; 34:617–631.
25. Chiu JS, Wang YF, Su YC, Wei LH, Liao JG, Li YC. Artificial neural network to predict skeletal metastasis in patients with prostate cancer. Journal of Medical System, 2009; 33: 91–100.
26. Kondo C, Kondo T, Ueno J. Three-dimensional medical image analysis of the heart by the revised GMDH-type neural network self-selecting optimum neural network architecture. Artificial Life and Robotics, 2009; 14(2):123–128.
27. Markaki VE, Asvestas PA, Matsopoulos GK. Application of Kohonen network for automatic point correspondence in 2D medical images. Computers in Biology and Medicine, 2009; 39:630–635.
28. Guo D, Qiu T, Bian J, Kang W, Zhang L. A computer-aided diagnostic system to discriminate SPIO-enhanced magnetic resonance hepatocellular carcinoma by a neural network classifier. Computerized Medical Imaging and Graphics, 2009; 33(8):588–592.
29. Zhang X, Kanematsu M, Fujita H, Zhou X, Hara T, Yokoyama R, Hoshi H. Application of an artificial neural network to the computer-aided differentiation of focal liver disease in MR imaging. Radiol Phys Technol, 2009; 2(2):175–182.
30. Mittal D, Kumar V, Saxena SC, Khandelwal N, Kalra N. Neural network based focal liver lesion diagnosis using ultrasound images. Comput Med Imaging Graph, 2011; 35(4):315–323.
37
PUBLICAȚII DIN LUCRAREA DE DOCTORAT
Lucrări in extenso publicate în reviste cotate ISI cu factor de impact:
1 Streba CT, Pirici D, Vere CC, Mogoantă L, Comănescu V, Rogoveanu I. Fractal analysis differentiation of nuclear and vascular patterns in hepatocellular carcinomas and hepatic metastasis. Rom J Morphol Embryol;52(3): pp 845-54. 2011
2 Larisa Sandulescu, I. Rogoveanu, T. Ciurea, Maria Victoria Comanescu, C. T. Streba, A. G. Ionescu, Alice Oproaica, M. Ene. Immunohistochemical study of stellate cells in patients with chronic viral hepatitis C genotype 1. Rom J Morphol Embryol, 52(1): pp 137–143. 2011
3 C. C. Vere, Daniela Neagoe, C. T. Streba, Ileana Prejbeanu, G. Ianosi, Violeta Comanescu, D. Pirici. Steatosis and serum lipid patterns in patients with chronic viral hepatitis: differences related to viral etiology. Rom J Morphol Embryol; 51(3): pp 509–514. 2010.
4 Vere CC, Streba CT, Streba LM, Ionescu AG, Sima F. Psychosocial stress and liver disease status. World J Gastroenterol; 15(24): pp 2980-2986. 2009
5 Letiţia Adela Maria Streba, Doina Cârstea, P. Mitruţ, C. C. Vere, Nicoleta Dragomir, C. T. Streba. Nonalcoholic fatty liver disease and metabolic syndrome: a concise review. Rom J Morphol Embryol; 49(1): pp 13-20. 2008
Lucrări publicate in extenso, publicate în reviste cotate indexate în baze de date internaționale, cotate B+:
1 Vere Cristin Constantin; Streba Costin Teodor; Rogoveanu Ion; Nita-Stefanescu Liliana; Ionescu Alin Gabriel. Cirrhosis and chronic viral hepatitis as risk factors for Hepatocellular Carcinoma: Romanian single-clinic experience. Maedica. 5(4), pp 265–270, 2010
Lucrări publicate în rezumat în suplimente ale unor reviste cotate ISI, prezentate la conferințe internaționale:
1 Streba CT, Mogoanta L, Streba LM, Vere CC, Carstea D. Metabolic and biochemical correlations in nonalcoholic fatty liver disease. Gut/Enteroscopy, vol. 58, Suppl. II: p A121, 2009
2 Pirici D, Mogoanta L, Oprea B, Streba CT. Fractal analysis of nuclear and vascular patterns in gastric adenocarcinomas. Gut/Enteroscopy, vol. 58, Suppl. II: pp A422-423 2009
3 C.T. Streba, D. Pirici, L. Mogoanta, M. Comanescu, I. Rogoveanu, L. Sandulescu, A. Bold; Fractal Analysis Differentiation Of Nuclear And Vascular Patterns In Hepatocellular Carcinomas And Hepatic Metastasis. J of Hepatol, Suppl. 1 (52): pp S351, 2010
38
4 Streba CT, Rogoveanu I, Sandulescu LD, Mogoanta L, Comanescu M, Vere C, Nita-Stefanescu L, Ciurea T, Predescu D. Immunohistochemical study of the expression of citokeratines in the embryonic liver, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Gut/Enteroscopy, vol. 59, Suppl. II: A121, 2010
Lucrări publicate în rezumat în suplimente ale unor reviste cotate ISI, prezentate la conferințe naționale:
1 Streba CT, Vere CC, Niță-Ștefănescu Liliana, Salan E, Ionescu AG, Țapu F. Epidemiology and risk factors of the hepatocellular carcinoma associated with cirrhosis or viral hepatitis: a retrospective study in a single Romanian clinic. Volum rezumate: A II-a Sesiune de comunicări științifice „Victor Babeș” 3-4 iunie, București. Pag. 41-42. 2010
1 Ion Rogoveanu, Larisa Sandulescu, Elena Cioboata, Mihai Ioana, Costin Teodor Streba, Alexandru Dragos, Ciurea Tudorel. Correlations between the abl 1 gene expression and the stage of fibrosis in patients with chronic C hepatitis. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1: p 13, 2010
3 Sandulescu Daniela Larisa, Rogoveanu Ion, Comanescu Maria Victoria, Costin Teodor Streba, Oproaica Alice, Marius Ene, Ciurea Tudorel. Immunohistochemical study on stellate cells in patients with chronic hepatitis C. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1: p 55. 2010.
4 Costin Teodor Streba, Ion Rogoveanu, Cristin Constantin Vere, Laurentiu Mogoanta, Georgiana Lilea. Differentiation between normal hepatic parenchyma, hepatocellular carcinoma and metastasis, on histological images, using image fractal analysis. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1: pp 148-149. 2010.
5 Costin Teodor Streba, Ion Rogoveanu, Cristin Constantin Vere, Daniel Pirici, Cristina Baloseanu. Correlations between fractal dimension of vascular axel disposition and dimension in immunostained images of hepatocellular carcinoma and various liver metastasis. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease, vol. 29, Suppl. 1: p 149, 2010
Cereri de brevet depuse la OSIM:
Cerere de brevet intitulată “Sistem automat mobil pe bază de rețele neuronale pentru clasificarea formațiunilor hepatice focale și prognosticul cancerului hepatic”, documentație depusă la OSIM cu achitarea taxei de înregistrare pe data de 22.09.2011.
