Date post: | 06-Feb-2016 |
Category: |
Documents |
Upload: | martincu-alina |
View: | 29 times |
Download: | 0 times |
Comportamentul mioglobinei în diferite
medii de pH prin spectroscopie UV-vis
Pălăcean (Muntean) Ioana Mirela IMPM II
1.Introducere
Mioglobina este o proteină globularǎ formatǎ dintr-un singur lanț de 154 de
aminoacizi conținând o grupare hem înfasurat de o apoproteină. Este format din opt alfa-
helixuri și un miez hidrofob.
Hemoglobina (care conţine fier) este transportorul de oxigen în sângele animalelor,
iar mioglobina asigură stocarea oxigenului.
Printre proteinele transportoare de oxigen se numără: hemoglobina (Hb),
mioglobina (Mb), citoglobina (Cgb), neuroglobina (Ngb).
Partea responsabilă de legarea oxigenului în globine este un centru de fier coordinat
de porfirină şi care este denumit hem (Figura 1).
Fig. 1 Hemul
Structura tridimensională a hemului. Ionul de Fe++ este reprezentat de sfera gri
centrală; N albastru O roşu, C bleu H alb
În procesele respiratorii, oxigenul este legat de către hemoglobină în plămâni,
transportat prin sânge până la muşchi, unde este cedat mioglobinei, pentru a fi depozitat şi
utilizat.
2. Materiale şi metode
Pentru a determina comportamentul mioglobinei în diferite medii, s-a ales ca
metodă de investigare spectrometria UV-vis. Această metodă este aplicabilă deoarece
mioglobina absoarbe în acest domeniu, datorită posibilităţii tranziţiilor electronice π-π*, din
învelişul proteic, respectiv din hem (datorită legăturilor duble conjugate), şi a tranziţiilor
electronice metal-ligand.
Domeniul util de colectare a spectrelor UV-vis este 260-800 nm, observându-se un
maxim în jur de 280 nm, datorat materialului proteic, mai exact aminoacizilor aromatici.
De asemenea mioglobina prezenta un maxim de absorbţie la aproximativ 407-409 nm
bandă numită Soret sau γ şi în domeniul Vis două benzi datorate tranziţiilor metal-ligand.
Colectarea spectrelor se face în soluţii diluate, pentru a se încadra în condiţiile de
liniaritate a legii Lambert-Beer, însă concentraţia trebuie să fie suficient de mare pentru a
obţine un spectru clar, cu absorbanţele cuprinse în intervalul 0.1-1 unităţi.
Etapele sunt:
Se prepară soluţii tampon pentru valorile de pH 2-13.
Se pregăteşte o soluţie – stoc de mioglobină
Se înregistrează spectrele UV-vis ale mioglobinei ferice în domeniul de pH
2-13
Se explică diferenţele (sau lipsa lor) între spectrele de mai jos, şi se
calculează valoarea pKa
Prepararea soluţiilor tampon
În cadrul experimentelor efectuate în decursul laboratorului, s-a utilizat mioglobină
ferică din inimă de cal şi următorii reactivi: acetat de sodiu, fosfat de potasiu, citrat de
sodiu CAPS.
S-au preparat soluţii tampon de concentraţie 0.2 M (200 mM) şi pH=2-13.
Soluţiile tampon se prepară în apă de cea mai înaltă puritate posibilă.
Soluţiile astfel obţinute, se etichetează şi se păstrează în sticle, de preferinţă închise
la culoare şi la rece. Înainte de a fi folosite, trebuie aduse la temperatura camerei.
Prepararea soluţiei de mioglobină
Pentru metaloproteinele din clasa mioglobinei se recomandă păstrarea în stocuri de
1-5 mM, dacă sunt în soluţie.
Într-un tub Eppendorf s-a preparat aproximativ 1,5 ml soluţie stoc de mioglobină,
dizolvând proteina în apă într-un volum egal de apă. Agitarea soluţiei s-a realizat cu grijă
pentru a evita denaturarea proteinei. Soluţia de mioglobină se pastreaza la rece.
Înregistrarea spectrelor UV-vis ale mioglobinei ferice
Pentru înregistrarea spectrelor, a fost nevoie de un spectru UV-vis, o cuvă de 1 ml,
pipete de tip Eppendorf cu volum reglabil şi soluţiile tampon preparate la pH-uri de: 2-13.
Înainte de colectarea spectrelor, aparatul a fost calibrat cu etalonul de soluţie
tampon de pH corespunzător fiecărei probe. După calibrarea aparatului au fost adăugaţi în
cuvă 10 μl de mioglobină. Concentraţia mioglobinei în cazul fiecărei probe a fost aceeaşi.
Colectarea spectrelor s-a făcut în soluţii diluate, pentru a se încadra în condiţiile de
liniaritate a legii Lambert-Beer. La lungimea de undă maximă λ, s-a citit absorbanţa
soluţiei; aplicându-se legea lui Lambert-Beer:
A=ε*l*c,
Înainte de a înregistra orice spectru, trebuie să facem linia de zero a aparatului cu o
soluţie tampon sau apă, aceasta fiind soluţia blanck. Astfel, injectăm în cuvă soluţia tampon
pentru pH=6, pe care o aşezăm în spectrometru şi înregistrăm spectrul. Extragerea probelor
din soluţiile stoc s-a făcut de fiecare dată cu un vârf de pipetă nou de tip Eppendorf.
Rezultatele au fost prelucrate în Excel.
3. Rezultate şi discuţii
Influenţa pH-uluiLa pH-uri mici se observă o scădere bruscă a absorbanţelor, ceea ce ne indică
denaturarea proteinei. În cazul acestor probe, concentraţiile relativ mari de protoni 10 -1 –
10-4 M, afectează legăturile de hidrogen intramoleculare care se rup, distrugând structura
terţiară a proteinei. Odată cu creşterea pH-ului şi implicit scăderea excesului de protoni din
soluţie, legăturile dintre lanţurile de aminoacizi nu mai sunt afectate de prezenţa H+. În
acest caz, intensitatea benzii Soret înregistrată este in jurul valorii de 400nm . In (figura 2)
Fig. 2 Spectre UV-vis ale mioglobinei ferice
În domeniul 600-650 nm spectrele se intersectează într-un punct, numit punct
isosbestic, care indică prezenţa în probe a două specii aflate în echilibru (Figura 3).
Fig.3 Punctul isosbestic
Pentru determinarea pKa, s-a reprezentat grafic absorbanţa corectată soluţiei în
funcţie de pH, valoarea acesteia fiind determinată din grafic. Absorbanţa corectată s-a
calculat folosind formula:
Ac = Ai - Amin
Ac – absorbanţa corectată, Ai – absorbanţa la pHi, Amin – absorbanţa minimă în
intervalul de pH 5-12, la aceeaşi lungime de undă. Este de preferat alegerea lungimii de
undă la care se calculează pKa să fie aleasă din zona în care benzile nu se suprapun, şi
diferenţele de absorbanţă sunt sesizabile, cum ar fi banda Soret.
Lungimea de undă aleasă a fost 408 nm.
Figura 4 .Determinarea pKa-ului mioglobinei
Modificările care apar la spectrele din domeniul de pH 5-13, sunt datorate tipului de
ligand al Fe2+ şi stării de spin a acestui centru metalic.
Pe domeniul de pH în care proteina este în stare nativă, pH>4, se poate defini o
constantă pKa similară constantei de aciditate din chimia analitică, care însă indică punctul
de echivalenţă dintre Fe în stare de spin înalt sau jos. Graficul din Figura 4 arată
dependenţa echilibrului [Fe-OH2] ↔ [Fe-OH] în funcţie de pH, iar pKa determinat este 13.
4. Concluzii
Din datele obţinute s-a observat că matricea proteică a fost distrusă doar la pH-uri
mici, în experimentul nostru la pH<5, însă prezenţa excesivă sau absenţa protonilor, în
soluţiile apoase, poate influenţa tăria ligandului, prin deprotonarea apei legată la fier.
Capacitatea de coordinare a metalului este influenţată de starea sa de oxidare, în
cazurile prezentate Fe în starea superioară de oxidare este hexacoordinat, iar în starea
inferioară fiind pentacoordinat.
La pH acid are loc denaturarea mioglobinei, în schimb la pH bazic nu se
denaturează .