51
1
1
2
MINISTERUL SĂNĂTĂŢII AL REPUBLICII MOLDOVA
METODE DE INVESTIGAŢII SANITARO - PARAZITOLOGICE
A COMPONENTELOR MEDIULUI AMBIANT
(Indicaţii metodice)
Chişinău - 2011
3
Prezentele Indicaţii metodice au fost elaborate de specialiştii Centrului Naţional de
Sănătate Publică – Vera Lungu, Nina Tălămbuţă, doctor în biologie, Oleg Chihai, doctor
în biologie, Ana Varticean, Svetlana Neaga; Centrului de Sănătate Publică mun. Chişinău
- Valentina Goraş şi sunt destinate medicilor de laborator care activează în laboratoare
bacteriologice şi parazitologice, responsabile de monitoringul parazitologic al mediului.
Ele pot fi utilizate şi ca material didactic pentru pregătirea universitară şi postuniversitară
a lucrătorilor medicali.
Referenţi
Gabriel Obreja, dr. în medicină, conferenţiar universitar, USMF „N. Testemiţanu”.
Dumitru Erhan, dr. habilitat în biologie, Institutul de Zoologie, AŞM
Aprobate la Şedinţa Consiliului de Experţi ai Ministerului Sănătăţii al Republicii
Moldova
Din ” 31 ” martie 2011, Proces verbal nr. 2
4
CUPRINS
1. Destinaţii şi domeniu de aplicare................................................................................7
2. Referinţe normative.....................................................................................................7
3. Monitoringul parazitologic al mediului ambiant....................................................8-13
4. Evaluarea rezultatelor investigaţiilor sanitaro-parazitologice a mediului............13-15
5. Utilajul pentru investigaţii sanitaro-parazitologice................................................... 15
5.1. Aparate, instrumentar, optică................................................................................15-16
5.2. Sticlărie....................................................................................................................16-17
5.3. Reagenţi.................................................................................................................17-18
5.4. Pregătirea reagenţilor............................................................................................18-20
6. Metodologia cercetărilor sanitaro-parazitologice ale componentelor mediului
ambiant........................................................................................................................20
6.1. Investigarea solului.................................................................................................20-21
6.1.1. Metoda de investigare ovoscopică a solului după Romanenko...........................21-23
6.1.2. Metoda larvoscopică de cercetare a solului după Baermann ..............................23-24
6.1.3. Metoda larvoscopică de cercetare a solului după Şupryaga.....................................24
6.1.4. Diferenţierea larvelor de nematode după metoda Коrt.............................................24
6.1.5. Metoda de investigare a solului la chisturi de protozoare patogene după
Padcenko..............................................................................................................24-25
6.2. Investigarea fructelor şi legumelor.........................................................................25-28
6.3. Investigarea apei..........................................................................................................28
6.3.1. Metodele de cercetare a apei potabile şi a apei din bazinele de înot....................28-29
6.3.1.1. Metoda de filtrare...............................................................................................29-30
6.3.1.2. Metoda de coagulare..........................................................................................30-32
6.3.2. Metodele de cercetare a apei din bazinele de suprafaţă........................................32-35
6.3.3 Metodele de cercetare a apelor reziduale...................................................................35
6.3.3.1. Metoda de investigare ovoscopică a apelor reziduale după Romanenko ........35-36
6.3.3.2.Metoda de investigare a apelor reziduale la chisturi de protozoare
patogene după Padcenko ........................................................................................36
5
6.3.4. Investigarea apelor meteorice..............................................................................36-37
6.4. Investigarea nămolului de pe fundul bazinelor acvatice..............................................37
6.5. Investigarea nămolului apelor reziduale.................................................................37-38
6.5.1. Metoda de investigare ovoscopică a nămolului apelor reziduale după Romanenko
............................................................................................................................................38
6.5.2. Metoda de investigare a nămolului apelor reziduale la chisturi
de protozoare patogene după Padcenko.............................................................38-39
6.6. Investigarea rezidurilor zootehnice după Romanenko şi Cerepanov.....................39-40
6.7. Investigarea lavajelor de pe obiecte de uz casnic, mâini şi jucării..............................40
6.7.1. Metoda de investigare ovoscopică a lavajelor..........................................................40
6.7.2. Metoda de investigare a lavajelor la chisturi de protozoare patogene.................40-41
6.8. Investigarea zăpezii după Cernâşov.............................................................................41
6.9. Investigarea rezidurilor menajere solide................................................................41-42
7. Metode suplimentare de investigare parazitologică....................................................42
7.1. Metoda de cercetare parazitologică a particulelor de praf şi a aerului după
Kaledin şi Romanenko...........................................................................................42-43
8. Metode de determinare a viabilităţii agenţilor parazitari……………………………43
8.1. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi ………………………..........43
8.1.1. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi după aspectul exterior..43-46
8.1.2. Metoda Fulleborn ………………………………………………………………....46
8.1.3. Metoda cultivării pe hârtie de filtru în eprubetă (Harada şi Mori)……………..46-48
8.1.4. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi prin metoda de
colorare.................................................................................................................48-49
8.2. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene......................................49
8.2.1. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene după aspectul
exterior.................................................................................................................49-50
8.2.2. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene prin metoda de
colorare.................................................................................................................50-51
9. Concluzie…………………………………………………………………………..51-52
10. Bibliografie…………………………………………………………………….....….52
6
1. Destinaţii şi domeniu de aplicare
Prezentele indicaţii metodice stipulează metodele supravegherii parazitologice
de laborator a componentelor mediul ambiant (sol, apa potabilă, apa bazinelor
naturale, ape reziduale şi sedimentele acestora, dejecţii şi reziduri zootehnice, obiecte
de uz casnic etc.), privind starea sanitară a întreprinderilor comunale, agricole,
alimentare, unităţilor comerciale, instituţiilor şcolare, preşcolare (WC biologice,
instalaţiile de purificare a apelor de uz individual şi colectiv), precum şi testarea
aparatelor, utilajului şi instalaţiilor acestor întreprinderi.
Indicaţiile metodice sunt destinate medicilor de laborator care activează în
laboratoare bacteriologice şi parazitologice, responsabile de monitoringul
parazitologic al mediului precum şi pentru instituţiile de cercetare ştiinţifică în
domeniul epidemiologiei maladiilor parazitare, elaborarea măsurilor de protejare a
mediului ambiant şi ocrotire a sănătăţii populaţiei. Ele pot fi utilizate şi ca material
didactic pentru pregătirea universitară şi postuniversitară a lucrătorilor medicali.
2. Referinţe normative
1. Legea nr.10 din 03.02.2010 Privind supravegherea de stat a sănătăţii publice
2. HG Nr.934 din 15.08.2007 Cu privire la instituirea Sistemului informaţional
automatizat „Registrul de stat al apelor minerale naturale, potabile şi băuturilor
nealcoolice îmbuteliate”
3. HG nr.632 din 18.05.02 Cu privire la studierea, utilizarea şi protecţia apelor
minerale
4. GOST 17.1.2.03-90 „Критерии и показатели качества воды для орошения”
5. HG nr. 737 din 11.06.02 Privind reglementarea funcţionării zonelor de recreere
aferente bazinelor acvatice (p.33-Controlul calităţii apei bazinelor acvatice –
conform RI nr.06.6.3.23)
6. RT nr 597 din 21.08.2007 „Fructe şi legume proaspete destinate consumului ca
atare”
7. SM SR EN ISO/IEC 17025:2006 Cerinţe generale pentru competenţa
laboratoarelor de încercări şi etalonări.
7
3. Monitoringul parazitologic al mediului ambiant
Selectarea factorilor de mediu care urmează a fi supuşi testării parazitologice, în
unităţile cu activitate economică, socială şi de producere, se efectuează de către
medicii epidemiologi, iar în lipsa acestora de către medicii igienişti din Centrele de
Sănătate Publică. Materialul de examinat, volumul şi numărul de probe prelevate, în
unităţile supravegheate sunt incluse în tabelul nr.1. După semnificaţia epidemiologică
unităţile de activitate socială, economică şi de producere sunt grupate în 3 categorii:
1.Categoria I –instituţii, unde supravegherea sanitaro-epidemiologică trebuie să fie la
maxim riguroasă şi severă, includ: unităţile de alimentaţie publică, blocurile alimentare din
instituţiile preşcolare, şcoli, azilurile pentru bătrâni şi persoane cu handicap, orfelinatele
şi casele de copii, sistemele şi instalaţiile de alimentare cu apă a populaţiei ş.a. – în
tabelul 1 sunt menţionate cu semnul**. În aceste unităţi orice abatere de la regimul
sanitaro-epidemiologic va determina spontan contaminarea omului (prin alimente,
apă etc.) cu agenţi parazitari.
2. Categoria II – unităţi, unde supravegherea de laborator privind respectarea
regimului sanitaro-epidemiologic, trebuie să fie la fel de strictă ca şi în cazul
unităţilor din I categorie şi includ: serele, gospodăriile agricole, unităţile de comerţ
ş.a. – în tabel menţionate cu semnul *. Sunt la fel de vulnerabile sub aspect
epidemiologic, dar în condiţia când se respectă cu stricteţe igiena personală şi
comunală, procedurile tehnologice (spălarea mâinilor, fructelor, legumelor,
zarzavaturilor etc.) poate să reducă sau să excludă riscul contaminării cu germeni
parazitari.
3. Categoria III – unităţi, terenuri ce vor fi supuse supravegherii sanitaro-
epidemiologice includ: câmpurile irigate, instalaţiile de epurare, de canalizare şi alte
unităţi de activitate umană – în tabelul 1 – fără menţiune, care prezintă un risc mai
mic de contaminare a omului în cazul respectării normelor sanitare şi regulilor de
igienă personală.
În unităţile menţionate există obiecte (medii), care se vor supune obligator
controlului parazitologic privind prezenţa ouălor de helminţi şi chisturilor de
protozoare patogene. Prezenţa agenţilor parazitari (tab. 1) denotă încălcarea
8
regimului sanitaro-epidemiologic.
Tabelul 1
Cercetările sanitaro-parazitologice efectuate la nivelul diferitor
unităţi de activitate socială, economică şi de producţie
Nr.
d/o
Unitatea
supravegheată
Materialul şi locul de
prelevare a probelor
Periodicitatea
prelevării
Numărul
probelor
1 2 3 4 5
1. Blocurile
alimentare** din
instituţiile
preşcolare, şcoli,
orfelinate, baze de
odihnă, sanatorii,
tabere de odihnă
pentru copii.
Lavaje de pe suprafeţele şi
inventarul de tranşare, de
pe mâinile personalului,
mânere, veselă, tacâmuri şi
probe de apă potabilă.
2 ori/an
20-30
2. Sufrageriile acestor
unităţi**
Lavaje de pe muşamale,
feţele de masă, veselă,
mâinile chelnerilor şi de pe
ştergare.
2 ori/an
20-30
3. Unităţile de
comercializare a
produselor
alimentare.**
Lavaje de pe tejghele,
stilaje, mâinile
realizatorilor, de pe
cântare, de pe mesele unde
se consumă alimentele, de
pe robinetele de apă sau
robinetele rezervoarelor de
păstrare a apei potabile, de
pe echipament.
Fructe, pomuşoare, legume
şi zarzavaturi.
2 ori/an
Se verifică de
2 ori/an până a
fi realizate
către populaţie
20-30
2-3
4. Staţiile de tratare ale
sistemelor
centralizate de
asigurare cu apă
potabilă.**
Apa la punctul de intrare în
staţii şi la punctul de
lansare în sistemul de
distribuţie.
Apa din rezervoare.
În
conformitate
cu prevederile
documentaţiei
normative
vizând
controlul de
calitate a apei
potabile.
5
5. Gospodării
agricole.*
Solul de la suprafaţă şi de
la adâncimea de până la 20
Pentru solul
reânnoit şi
2-3
9
cm.
Apa folosită la irigarea
culturilor agricole.
Legume şi zarzavaturi.
Lavaje de pe mâinile şi
echipamentul personalului,
de pe mobilierul camerelor
de odihnă şi mesele
sufrageriilor.
după aplicarea
îngrăşămintelor
minerale, de
2ori/an, pentru
celelalte – 1
dată/an.
În timpul
irigării.
2 ori: în
perioada de
cultivare şi la
recoltare.
2 ori/an
2-3
2-3
20-30
6. Sisteme de irigare,
rezuduuri organice.*
Solul de la suprafaţă şi la
adâncimea de 20 cm, până
şi după aplicarea
îngrăşămintelor organice.
Ape reziduale, sedimentele
acestora, reziduurile
organice utilizate în calitate
de îngrăşăminte.
Culturi tehnice şi furajere,
uni - şi multianuale.
Ape subterane pe traiectul
sursei freatice: la nivelul,
mai sus sau mai jos (500 m)
de câmpurile irigate.
Lavaje de pe mâinile şi
echipamentul personalului,
de pe mobilierul camerelor
de odihnă şi din sufragerii.
2 ori/an
2 ori/an
2 ori/an
2 ori/an
2 ori/an
2-3
2-3
2-3
2-3
20-30
10
7. Staţiile de epurare a
apelor de
canalizare*:
instalaţii de epurare
mecanică, aero– şi
biostaţii, construcţii
compacte de
epurare, lacuri de
epurare biologică
ş.a.
Apa de evacuare la ieşirea
din instalaţiile de epurare.
Apa din bazinele acvatice
de suprafaţă: la nivelul de
deversare a apelor de
scurgere, mai sus sau mai
jos de locul de deversare
(500m).
Sedimentele de decantare
primară şi secundară, de pe
platformele de nămol,
după decontaminare.
Lavaje de pe mâinile şi
haina de lucru a
personalului, mobilierul
din camerele de odihnă şi
sufragerii.
2 ori/an
2 ori/an
2 ori/an
2 ori/an
2-3
2-3
2-3
20-30
8. Complexele
zootehnice*
Lavaje de pe mânerele
uşilor, mobilierul
camerelor de odihnă,
sufragerii, încăperilor
auxiliare, mâinile şi
echipamentul personalului.
Rezidurile zootehnice.
1 dată/an
1 dată/an
20-30
2-3
9. Băi, bazine de înot* Apă. În băi – cea rece, în
bazine – apa din căzi.
Lavaje de pe mâinile şi
echipamentul personalului,
de pe banchetele din
garderobe, de pe mese,
fotolii, de pe pistele de
ocolire, mânere şi bare.
1dată/trimestru
1dată/trimestru
2-3
20-30
10. Instituţii de copii*:
preşcolare, şcolare,
internate, orfelinate,
secţiile de copii din
spitale, taberele de
vară de odihnă şi
itremare, taberele
sportive
Lavaje de pe mâinile
copiilor şi ale personalului,
echipamentul, lenjeria de
pat şi corp, jucării, bănci,
mese, materialele didactice
şi inventarul sportiv,
mânerele de la uşi, din
veceuri, de pe robinetele
de apă, scăunele,
2 ori/an
20-30
11
banchete.
Solul de pe terenurile de
joacă, de la intrare şi din
perimetrul construcţiilor,
de-a lungul gardurilor, de
lângă foişoare, din jurul
punctelor sanitare
exterioare şi grădina şcolii.
Nisipul din locurile de
joacă a copiilor.
2 ori/an
2 ori/an
2-3
1-2
11.
Terenurile de joacă*
din parcuri, scuare,
din curţile caselor
etajate etc.
Solul de suprafaţă.
Nisipul.
Lavaje de pe banchete,
tobogane, balansoare,
bârne, scăriţe, de pe
mânerele accesoarelor de
joacă.
1 dată/an
1 dată/an
1 dată/an
2-3
1-2
20-30
12 Plajele în zonele de
recreere
Nisipul.
Apa.
La începutul
sezonului şi
lunar (de 2
ori/lună) pe tot
parcursul
sezonului.
La începutul
sezonului şi
lunar (de 2
ori/lună) pe tot
parcursul
sezonului.
4-5
2-3
13. Azilurile de bătrâni şi
invalizi.
Lavaje din saloane,WC-
uri, blocuri alimentare, de
pe mâinile personalului şi
din blocurile sanitare.
2 ori/an
20-30
14. Secţiile de recepţie şi
distribuţie a
minorilor.
Lavaje din saloane, din sălile
de instruire şi joacă, din
blocurile alimentare, de pe
mâinile personalului şi din
blocurile sanitare.
2 ori/an
20-30
15.
Penitenciare. Lavaje din spaţiile de
muncă, agrement, din
blocurile alimentare şi de
pe mâinile personalului şi
din blocurile sanitare.
2 ori/an
20-30
12
16. Transportul: feroviar,
nautic, aerian şi
terestru.
Lavaje de pe mâinile şi
echipamentul personalului,
de pe banchete, fotolii,
lenjeria de pat şi mânerele
de la uşi.
1dată/an 20-30
17. Atelierele de
prelucrare a pieilor şi
de confecţionare a
hainelor din blană
Lavaje de pe mâini şi
echipamentul personalului,
de pe piei, hainele de piele
şi blană, de pe inventar şi
utilaje, de pe mobilierul
din camerele de odihnă şi
sufragerie.
1dată/an 20-30
18. Localităţi urbane şi
rurale.
Solul de pe străzi, din
curţile particulare, din
gospodăriile obşteşti şi
particulare, din jurul
magazinelor, de pe spaţiile
de plimbare a câinilor,
edificiile sportive şi zonele
de agrement
1 dată/an 8-10
19. Spaţiile destinate
construcţiilor
obiectelor alimentare,
culturale şi cu
destinaţie sportivă
(baze, depozite,
magazine, scuare,
terenuri pentru copii)
Solul
În timpul
distribuirii
loturilor de
construcţii
10-15
4. Evaluarea rezultatelor investigaţiilor parazitologice a mediului
Pentru efectuarea investigaţiilor sanitaro-parazitologice cantitatea solului de
examinat constituie 200g; a sedimentelor de la fundul bazinelor naturale – 200g;
apei potabile – 50 l; apei bazinelor naturale – 25 l; apelor reziduale – 1 l; apelor
neepurate (la intrarea în instalaţiile de epurare) şi rezidurilor zootehnice – 1 l;
probele prelevate după epurarea mecanică – 3 l; după ieşirea din decantorul
secundar, lacurile biologice, câmpurile de filtrare –10 l; sedimentele apelor
reziduale cu umiditatea de 98% - 1 l; sedimentul dehidratat din apele reziduale şi
13
rezidurile zootehnice – 200g.
Pentru investigaţii se prelevează lavaje de pe suprafaţa de 0,25 m2 (0,5 х 0,5
m) sau de pe 10 farfurii, jucării, mânere de la uşi.
Prelevarea probelor de praf se face cu aspiratorul de pe suprafaţa de 0,25 m2,
timpul de aspirare 20 sec.
În concluzia despre starea sanitară a obiectului se indică numărul total de probe
examinate, numărul de probe pozitive, numărul de ouă de helminţi şi chisturi ale
protozoarelor patogene pe specii.
Viabilitatea formelor infestante se determină în cazul depistării unui număr
mare (nu mai puţin de 100), apoi se deduce ponderea аcestora; în cazul depistării a
unui număr mic (1 - 3) de ouă şi chisturi, se indică cifrele absolute.
Rezultatele investigaţiilor se înscriu în „Registrul de evidenţă a investigaţiilor
sanitaro-helmintologice" (forma 379 - e), în care se marchează locul, data de
prelevare şi examinare a probelor, metoda de examinare, cantitatea materialului
examinat (în grame sau litri), rezultatele (în total s-au depistat germeni parazitari,
inclusiv ouă de helminţi, chisturi de protozoare patogene), în medie la 1 kg/l sau pe
1 dm2 de suprafaţă.
Starea parazitologică a componentelor mediul ambiant, se evaluează după
prezenţa sau lipsa agenţilor etiologici a maladiilor parazitare.
Apa potabilă, apele bazineloe de recreaţie, solul de pe teritoriile adiacente din
localităţile urbane şi rurale, câmpurile agricole, ferme, gospodării individuale, sere,
pepiniere, apele reziduale, sedimentele acestora, reziduurile zootehnice evacuate în
colectoarele de suprafaţă, nu trebuie să conţină ouă viabile de helminţi şi chisturi de
protozoare patogene.
Agenţii parazitari nu trebuie să fie depistaţi pe prosoape, jucării, lenjeria de corp şi pat,
muşamale de pe mese, mâinile copiilor şi personalului, pe inventarul de tranşare din blocurile
alimentare, pe mânere de la uşi, vasele de noapte a copiilor şi în blocurile sanitare. Depistarea
ouălor de helminţi şi chisturilor de protozoare patogene pe obiectele cercetate, atestă
nerespectarea regimului sanitaro-igienic în unităţile respective.
14
5. Utilajul laboratorului parazitologic
5.1. Aparate, instrumentar, optică
5.1.1. Nişă de ventilaţie.
5.1.2. Frigider de laborator.
5.1.3. Termostat.
5.1.4. Centrifugă de laborator completată cu rotator pentru eprubete cu volumul
de 10ml şi
asigură regimul de 2500 rot/min.
5.1.5. Instalaţie vacuum de filtrare a apei prin filtre de membrană: pompă
vacuum DP - 08 pressure, instalaţie vacuum pentru filtrare Sartorius sau
alte modele ce posedă capacităţi similare.
5.1.5. Centrifugă verticală (ОПН - 3, ОПН - 8, ЦЛС - 31М, TDL - 5A) sau alte
modele similare, completate cu set de eprubete cu volumul de 200ml şi
asigură regimul de 2500rot/min.
5.1.6. Filtre cu membrană cu diametrul porilor 1,5-3,0 mcm şi diametrul
discului care să coincidă cu diametrul godeului instalaţiei de filtrare, aflată
în posesia laboratorului ("Владипор", "Сарториус", "Миллипор",
"Прагопор"etc).
5.1.6. Microscop "БИОЛАМ" sau "БИМАМ", microscop stereoscopic (МБС).
5.1.7. Lampă de iluminat pentru microscop.
5.1.8. Platină mobilă cu încălzire, pentru microscop.
5.1.9. Balanţe analitice de laborator, clasa a 4-a de precizie, limita maximă 200
g.
5.1.10. Balanţe de laborator de clasa a 4-a de precizie, greutate maximă 1 kg.
5.1.10. Penseteanatomice
5.1.11. Periuţe moi (din perişori de veveriţă sau sobol) pensule de pictat NN
12-18.
5.1.12. Stative pentru eprubete.
5.1.13. Ace de preparare.
5.1.14. Căuşe, spatule, linguri, lopăţele, burghiu Necrasov.
5.1.15. Pungi şi pachete de plastic.
5.1.16. Aparatul Schutell.
5.1.17. Aparatul Goldmann.
5.1.18. Aspirator, perie electrică.
5.1.19. Site cu plasă de metal sau capron (ochiuri de 0,25 - 0,3mm).
5.1.20. Pară de cauciuc de diferite dimensiuni.
5.1.21. Bisturie anatomică.
5.1.22. Foarfece anatomice de diferite dimensiuni.
5.1.23. Cameră pentru numărarea ouălor de helminţi.
5.1.24. Creion de sticlă.
5.1.25. Leucoplast.
5.1.26. Scotch.
5.1.27. Muşama.
5.1.28. Şorţ de muşama.
15
5.1.29. Mănuşi de gumă.
5.1.30. Cântare pentru echilibrarea eprubetelor de centrifugare.
5.1.31. Cuve emailate.
5.1.32. Cuve reniforme.
5.1.33. Cornţang.
5.1.34. Pensete oftalmice.
5.1.35. Stativ Bounsen.
5.1.36. Trepied.
5.1.37. Lămpi de gaz.
5.1.38. Tuburi de cauciuc.
5.1.39. Poplin, percal, satin.
5.1.40. Ansă
5.1.41. Lopăţi.
5.1.42. Cuţite de sol.
5.1.43. Sită de sol cu ochiuri 0,25; 0,5; 1; 3 mm.
5.1.44. Spatule metalice.
5.1.45. Spatule din plastic.
5.1.46. Hârtie de calc.
5.1.47. Pergament.
5.1.48. Cutii de carton.
5.1.49. Aparat Baermann.
5.1.50. Termohidrobarometru.
5.2. Sticlărie
5.2.1. Pahare înalte cu cioc, volum 50-100 ml.
5.2.2. Eprubete de centrifugare gradate, volum 10, 50, 100, 250ml.
5.2.3. Lame cu dimensiunea de 25 х 75 mm; 60 х 120 mm.
5.2.4. Lamele cu dimensiunea de 24 х 24 mm.
5.2.5. Cutii Petri.
5.2.6. Clepsidre de 1, 3, 5 min sau cronometre cu semnal.
5.2.7.Vase pentru prelevarea probelor (apă, sedimente, dejecţii, reziduuri
zootehnice) confecţionate din materiale inerte, care se pot decontamina
prin metode obişnuite: canistre de plastic cu capacitatea de 1; 2; 5; 20 şi
25 l; recipiente din sticlă, ploşti metalice de 30-35 l; bidoane emailate,
căldări de 8– 10l; lighene.
5.2.8. Cilindre gradate cu cioc 1-100, 1-250, 1-500.
5.2.9. Colbe 2-50, 2-100, 1-1000.
5.2.10. Picurători dozatoare după Mann.
5.2.11. Flacoane de sticlă şi plastic cu gura largă de capacitatea 100; 500; 1000;
2000ml cu dop rodat sau cu filet.
5.2.12. Lămpi de spirt.
5.2.13. Densimetre (areometru tip I (A1) cu marcaje 1,000 – 1,600 kg/mЗ.
5.2.14. Pipete dozatoare П1-0Д; П1-0,5; П1-1,0ml.
5.2.15. Cilindre gradate cu cioc de 1,5 - 2,0 l.
5.2.16. Pâlnii de sticlă de diferite mărimi.
5.2.17. Sticle de ceasornic cu diametru diferit.
16
5.2.18. Baghete de sticlă.
5.2.19. Pipete gradate de la 1 până la 10 ml.
5.2.20. Borcane de sticlă cu dop rodat sau cauciuc de diferite mărimi de până la
500 ml.
5.2.21. Borcane de sticlă cu gura largă de până la 2 l.
5.2.22. Borcane de porţelan fără capace de 500 ml.
5.2.23. Borcane de 1 – 5 l cu tub pentru soluţii dezinfectante.
5.2.24. Eprubete.
5.2.25. Căni de porţelan de diferite dimensiuni.
5.2.26. Mojare şipistil de porţelan de diferite dimensiuni.
5.2.27. Pahare de 100; 250; 500; 1000 ml.
5.2.28. Cristalizoare de sticlă.
5.3. Reagenţi
5.3.1. Hidroxid de sodiu, NaOH.
5.3.2. Nitrat de sodiu, p. p. а. (pur pentru analiză)
5.3.3. Nitrat de amoniu sau selitră granulată amoniacală, salpetru de amoniu.
5.3.4. Clorură de zinc.
5.3.5. Nitrat de plumb.
5.3.6. Formaldehidă, 40%.
5.3.7. Nitrat de potasiu sau selitră granulată de potasiu, salpetru de potasiu.
5.3.8. Acid clorhidric 3%.
5.3.9. Ulei de ricină.
5.3.10. Sulfat de fier.
5.3.11. Sulfat de cupru.
5.3.12. Alcool etilic rectificat (C2H5OH), p.c.
5.3.13. Sulfat de zinc (ZnS04 x 7H2O), p.c.
5.3.14. Zaharoză, p. p. а.
5.3.15. Sulfat de magneziu (MgS04), p.p.а.
5.3.16. Tiosulfat de natriu.
5.3.17. Apă distilată.
5.3.18. Soluţie Barbagallo.
5.3.19. Iod cristalin, p. c.
5.3.20. Iodură de potasiu (KI), p. c.
5.3.21. Eozină cristalină, p. c.
5.3.22. Albastru de metilen uscat (pulbere), p. c.
5.3.23. Acid lactic, p. c.
5.3.24. Pancreatină.
5.3.25. Pepsină (se admite şi artificială).
5.3.26. Tripsină.
5.3.27. Bicarbonat de sodiu (Na2CO3), p.p.а.
5.3.28. Sulfat de aluminiu (Al2 (SO4)2).
5.3.29. Sulfat de amoniu ((NH4)2 SO4), p.c.
5.3.30. Clorură de fier (Fe Cl2).
5.3.31. Clorură de sodiu (Na Cl), p.c..
5.3.32. Acid clorhidric (HCl) 30% p.c.
17
5.3.33. Glicerină.
5.3.34. Soluţie Lugol.
5.3.35. Eter.
5.3.36. Acetonă.
5.3.37. Benzol.
5.3.38. Xilol.
5.3.39. Albastru crezil briliant (1:10000).
5.3.40. Clorură de var.
5.3.41. Acid sulfuric.
5.3.42. Bicromat de potasiu.
5.3.43. Ulei de imersie.
5.3.44. Bicromat de potasiu.
5.3.45. Acid lactic.
5.3.46. Soluţie de iod, 5%.
5.3.47. Albastru de toluidină (1:1000).
5.3.48. Safranină (1:10000 alcool 10°С).
5.3.49. Indigocarmină.
5.3.50. Acid pirogalic, 50%.
5.3.51. Roşu neutru (1:1000).
5.3.52. Oranj de acridină.
5.3.53. Corifosfină.
5.3.54. Primulină.
5.3.55. Aurolină.
5.3.56. Sulfat de berlerină
5.3.57. Tripaflavină.
5.3.58. Rivanol.
5.3.59. Acrichină.
5.4. Pregătirea reagenţilor
Cercetările parazitologice se efectuează prin metode de flotaţie cu soluţii saturate.
5.4.1. Soluţia saturată de nitrat de sodiu cu densitatea de 1,38 - 1,40 se prepară:
1000g NaNO3 + 1000 ml de H2O = Soluţie saturată NaNO3
Sarea se adaugă în proporţii mici într-un recipient emailat cu apă fierbinte,
mestecându-se continuu până la dizolvare completă. Soluţia se fierbe, până când la
suprafaţa acesteia apare o peliculă cristalică. Soluţia pregătită după răcire se trece în
alte vase cu capacitate mai mică. Saturaţia soluţiei se determină după sedimentul de
cristale saline sau se măsoară densitatea acesteia cu areometrul.
5.4.2. Soluţia saturată de nitrat de amoniu, cu densitatea 1,3 se pregăteşte similar
cazului precedent, doar că se măsoară 1500 g sare la 1 litru de apă fierbinte.
1500g NH4NO3 + 1000 ml H2O = Soluţie saturată NH4NO3
18
5.4.3. Soluţia Brudastov conţine:
1000 ml H2O + 900 g NaNO3 + 400 g KNO3 = Soluţie saturată Brudastov
După încălzirea şi dizolvarea sărurilor densitatea soluţiei saturate este de 1,47-1,48,
dar după 24 ore aceasta se reduce până la 1,40 - 1,42, motiv care determină pregătirea
soluţiei ex tempore.
5.4.4. Soluţia saturată de tiosulfat de sodiu (tiosulfat de sodiu Na2S03 5H20) cu
densitatea de 1,4 se prepară:
1750 g Na2S03 5H20 + 1000 ml H2O = Soluţie saturată de tiosulfat de sodiu.
Sedimentul de pe fundul vasului se utilizează la prepararea ulterioară a soluţiei
saturate.
5.4.5. Soluţia de sulfat de zinc 33%: 331 g (Zn SO2 x 7 H2O) se dizolvă în 1dm3
de
H2O distilată clocotită.
5.4.6. Soluţia de zaharoză 30%: 300 g zaharoză se dizolvă în 700 ml apă distilată la
70 - 80°C.
5.4.7. Amestec de soluţii saturate în următoarea proporţie: soluţie saturată de
tiosulfat de sodiu (3 părţi) + soluţie saturată de sulfat de magneziu (3 părţi) + apă
distilată (1 parte).
După pregătirea 5.4.5., 5.4.6., 5.4.7. determinăm densitatea acestora cu areometrul la
18°C, care trebuie să constituie 1,25 - 1,26. Dacă densitatea flotantului este mai
scăzută, este necesar adăugarea soluţiilor mai concentrate.
5.4.8. Soluţie Lugol 3%: 1,5g I2 + 3 g KI +100 ml H2O: iniţial se dizolvă KI, apoi se
adaugă I2, se menţine 3 zile la întuneric la 37°C.
5.4.9. Soluţie Formol 2%: 1 parte de formaldehidă 40% se dizolvă în 20 părţi de apă
distilată.
5.4.10. Soluţie Barbagallo: soluţie formol 3% pregătită pe sol. fiziologică (sol. NaCl
0,85%).
5.4.11. Soluţie Eozină 1%.
5.4.12. Soluţie Albastru de metilen 1:50000 (pregătit prin diluţii consecutive).
5.4.13. Suc duodenal artificial: pancreatină 0,5 g+bicarbonat de sodiu 0,9 g+apă
distilată 5 ml.
19
5.4.1.4. Soluţie HCl 1%.
6. Metodologia cercetărilor sanitaro-parazitologice ale componentelor
mediului ambiant
6.1. Investigarea solului
Evaluarea parazitologică a solurilor naturale şi celor degradate se efectuează
prin prelevarea probelor 1 dată/an. Probele se vor recolta din locurile presupuse de a
fi infestate (părţile însorite ale curţilor, din jurul fântânilor, blocurilor sanitare, etc).
Analiza solului de pe teritoriul instituţiilor preşcolare, şcolare, curativ profilactice şi
a zonelor de agrement se efectuează cel puţin de 2 ori/an–primăvara şi toamna.
Evaluarea dinamicii decontaminării solului (ouă de helminţi, chisturi de protozoare
patogene) prevede prelevarea săptămânală a probelor de sol în prima lună şi apoi
lunar pe tot parcursul perioadei de autopurificare. Pentru determinarea contaminării
parazitare a terenurilor agricole în funcţie de sursa de contaminare, cultura plantată
şi relieful localităţii, la fiecare 0,5 - 20,0 ha de teren se marchează o arie desemnată
cu o suprafaţă determinată de 10m x 10m; pe teritoriile unde sunt amplasate
instituţiile de copii şi cele curativprofilactice, terenurile de joacă, haznalele (bazine
subterane pentru canalizare, cloacă), containerele de gunoi, precum şi alte obiecte
care ocupă suprafeţe mici, dimensiunea parcelelor de examinare nu va depăşi 5m x
5 m.
Prelevarea probelor. Punctele de recoltare se selectează conform GOST 17.4.4.02-
84 Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического,
бактериологического, гельминтологического исследования, pe aria desemnată.
În acest scop se recomandă recoltarea probelor de sol de la suprafaţă (0,5 - 2 cm) şi
din profunzime (20 – 25 cm). Recoltarea se va face din unul sau câteva straturi de sol
prin „metoda de plic”, astfel încât fiecare probă va prezenta orizonturile şi straturile
genetice ale respectivului profil de sol. Terenul se curăţă prin îndepărtarea resturilor
mari de pe sol cu o mătură. Suprafaţa se împarte în 5 - 10 parcele egale şi se
recoltează probe de sol de pe fiecare arie desemnată. Recoltarea se face cu ajutorul
unui cuţit, căuş, cu lopăţele, spatule metalice şi burghiu Necrasov (sondă de foraj).
Proba sumară se compune din prelevatele parţiale ale unei suprafeţe de cercetare.
20
Pentru investigarea parazitologică de pe fiecare parcelă se obţine o probă sumară (200
g) de sol, care include 10 probe parţiale a câte 20 g fiecare, recoltate de la suprafaţă
sau la adâncimea de 10 - 20 cm. La necesitate probele pot fi prelevate din straturile
profunde de sol (40 - 60 cm). Solul se recoltează în borcane de sticlă cu dop rodat sau
în pungi de plastic. Se etichetează, marcând locul de prelevare, data, adâncimea,
caracterul terenului cercetat (umbră, soare, tipul solului, prezenţa vegetaţiei, etc.).
Proba sumară se numerotează şi se înregistrează în registru. În timpul transportării şi
păstrării probelor se va evita posibilitatea contaminării cu paraziţi din alte surse.
Investigarea parazitologică a probelor de sol se efectuează în ziua în care
acestea au fost recepţionate în laborator. În cazul imposibilităţii examinării imediate,
probele de sol se păstrează în frigider la 5°С. Pentru examinarea solului contaminat
cu chisturi de protozoare patogene, probele prelevate se păstrează nu mai mult de 2
zile; cu ouă de biohelminţi – până la 7 zile; iar cu ouă de geohelminţi – nu mai mult
de 1 lună.
Alterarea larvelor în ouăle embrionate poate fi evitată prin umectarea şi aerarea
solului, motiv pentru care probele de sol se scot din frigider, se lasă pentru 3 ore la
temperatura camerei, se umectează, după care se pun în frigider. Păstrarea probelor
timp îndelungat (1 lună) necesită aplicarea remediilor conservante. Solul se păstrează
în cristalizor cu adaos de conservanţi (formol 3%, acid clorhidric 3%).
Pregătirea probelor de sol pentru investigare. Probele de sol în laborator se aştern
pe hârtie, calc sau muşama şi se fărâmiţează cu ajutorul unui pistil. Apoi se înlătură
fragmentele vegetale, pietrele, insectele, fragmentele de sticlă, cărbunele, oasele de
animale, gips, calcar ş.a. Proba astfel pregătită se trece într-un mojar, se
omogenizează cu ajutorul unui pistil, se cerne prin sită cu ochiuri de 1mm.
6.1.1. Metoda de investigare ovoscopică a solului după Romanenko
Metoda are drept scop examinarea solului la prezenţa ouălor de helminţi. La
interpretarea rezultatelor se va ţine cont de faptul că solul poate fi contaminat cu
elemente parazitare specifice, atât omului, cât şi animalelor (Ascaris spp,
Trichocephalus spp, Taenia spp, Hymenolepis nana, Toxocara spp, Dipylidium
caninum, etc).
21
Principiu: Ouăle se separa de particulele de sol cu soluţie de NaOH 3% (sol. KOH
3%), iar apoi prin flotaţie (centrifugare) cu o soluţie saturată (NaNO3, NH4NO3,
Na2SO3, etc). După centrifugare se examinează la microscop prelevatul din pelicula
de la suprafaţă.
Tehnica de lucru: Din proba sumară se preiau 25 g de sol în eprubete pentru
centrifugare cu volumul de 250 ml. În cazul în care acestea lipsesc se pot folosi
eprubete cu volum de 80 -100 ml, dar se prelevează nu mai mult de 15 g de sol. În
eprubete se adaugă soluţie de NaOH 3% sau KOH 3% în proporţie de 1:1.
Conţinutul eprubetelor se agită cu mixerul electric sau bagheta de sticlă, se
sedimentează 20 - 30 min, se centrifughează la 800 rot/min timp de 5 min.
Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se spală cu apă, după necesitate, în funcţie
de tipul solului. Pentru solurile nisipoase şi seminisipoase – este suficientă o singură
spălare, pentru cele argiloase şi de cernoziom – 2 - 5 spălări, până când
supernatantul devine transparent. La sediment se adaugă 150 ml (45 ml în eprubetele
cu volum de 100 ml) soluţie saturată de NaNO3 (densitatea 1,38 - 1,40), se
omogenizează şi se centrifughează 1 - 2 min. Eprubetele se montează în stative şi se
completează cu aceiaşi soluţie salină până la 2 - 3 mm sub marginea superioară a
eprubetelor şi se acoperă cu lame. Ouăle se ridică, concentrându-se în pelicula de la
suprafaţa soluţiei saturate. Pentru evitarea pierderilor din pelicula de suprafaţă, între
marginea eprubetei şi a lamei se lasă 10 mm, ca prin acest spaţiu, cu ajutorul unei
pipete, să se adauge soluţia saturată până la atingerea meniscului acesteia cu
suprafaţa de contact a lamei. Apoi lama se retrage atent până la închiderea totală a
eprubetei în aşa fel, încât toată suprafaţa meniscului să adere la suprafaţa lamei,
evitând formarea bulelor de aer. După 20 - 25 min. lama se retrage, întorcând-o cu o
mişcare rapidă cu partea inferioară (umedă) în sus, înlocuindu-se cu altă lamă.
Procedeul se repetă până când în frotiu nu se mai depistează nimic. Pe lama extrasă
se aplică câteva picături de glicerină 30%, se acoperă cu lamelă şi se cercetează la
microscop. Pentru determinarea prezenţei ouălor de helminţi preparatul se
examinează cu obiectivul 8x, iar pentru determinarea gradului de dezvoltare sau
alterare a acestora – cu obiectivul 40x.
22
La necesitate, preparatele se pot păstra în frigider 5 - 7 zile. Pentru evitarea
uscării preparatelor, pe marginea lamelor se picură câteva picături de soluţie de
glicerină 30%. Eficienţa metodei constituie 73,0%, variind între 59,6 - 83,1%.
Notă.
Această metodă prevede respectarea următoarelor cerinţe:
Utilizarea lamelor degresate.
Controlul densităţii soluţiilor saturate cu areometrul (densitate minimă 1,38 –
1,40).
În cazul nerespectării acestor cerinţe pelicula de la suprafaţă nu va adera la lamă,
viteza de flotare a ouălor scade, motiv pentru care acestea nu vor flota în pelicula de
suprafaţă în termenii stabiliţi.
Pentru utilizarea eficientă a timpului de cercetare se recomandă ca în timpul
primei sedimentări a amestecului "sol cu soluţie bazică" să se efectueze pregătirea
lamelor şi lamelelor, inscripţiile în registru. În timpul celei de-a doua decantări -
"solului cu soluţia salină saturată " – se pregăteşte suprafaţa de lucru pentru
microscopie, se curăţă centrifuga şi alt echipament de laborator.
La finele investigaţiei vesela de laborator folosită (eprubetele de centrifugare,
lamele, lamelele, baghetele de sticlă) se cufundă în soluţie de detergent şi se fierb 15
– 20 minute, după care se clătesc minuţios în apă rece curgătoare, apoi distilată.
Eprubetele se păstrează în stative, lamele în borcane cu gâtul larg cu dop rodat, în
amestec Nichiforov sau apă amoniacală. Înainte de folosire lamele nu se şterg, ci se
usucă. Durata investigaţiei – 75 min.
6.1.2. Metoda larvoscopică de cercetare a solului după Baermann
Principiul metodei constă în izolarea larvelor de geohelminţi din solul investigat,
bazată pe hidrotropismul pozitiv şi mobilitatea acestora din sol, în care parazitează
temporar.
Tehnica de lucru. Din proba sumarăde sol se iau 20 g într-o plasă metalică (sau
sită), care se instalează pe o pâlnie de sticlă (diametrul 10 -15 cm), unită la o
eprubetă îngustă cu un tub de cauciuc (aparatul Baermann). Sistemul se montează în
stativ, se umple cu apă caldă (45 - 50°С), sita cu sol se aplică pe pâlnie, în aşa mod,
23
ca partea inferioară a acesteia să contacteze cu apa. Pâlnia cu sol se introduce în
termostat la 37°С pe 4 ore. Larvele de helminţi, datorită termotropismului pozitiv
migrează din sol prin sită în apa caldă, sedimentându-se pe fundul eprubetei. Peste 4
ore eprubeta se desprinde de la pâlnie, se înlătură supernatantul, iar sedimentul se
transferă pe lamă şi se cercetează la microscop. Mai raţional este centrifugarea
prealabilă (1 min – 800 rot/min), pentru sedimentarea larvelor aflate în suspensie.
Durata investigaţiei – 60 min.
6.1.3. Metoda larvoscopică de cercetare a solului după Şupryaga
Într-un pahar se iau 10 g de sol şi se acoperă complet cu soluţie fiziologică (40°С).
Peste 20 min lichidul se toarnă în cutia Petri şi se cercetează la microscop
stereoscopic. După eficienţă, metoda Supryaga nu cedează metodei Baermann.
Durata investigaţiei – 40 min.
6.1.4. Diferenţierea larvelor de nematode după metoda Коrt
Principiul constă în determinarea duratei viabilităţii larvelor de nematode la
adausul de formol 40%. Astfel, larvele de nematode liber vieţuitoare mor mai
repede, decât cele parazite.
Tehnica de lucru. Larvele se transferă în cutia Petri sau pe o sticlă de ceas. În
lichidul cu larve de nematode se adaugă soluţia de formol 40% în raport de 1 : 5.
Nematodele liber vieţuitoare mor în 5 - 8 minute, iar cele parazitare, diminuându-şi
mobilitatea treptat, supravieţuiesc 15 - 20 min. La adăugarea formolului 40% în
raport de 1 : 25, primele mor în 12 min, pe când celelalte (95%) rămânând viabile,
păstrându-şi mobilitatea.
6.1.5. Metoda de investigare a solului la chisturi de protozoare patogene
după Padcenko
Tehnica de lucru. Din proba sumară se iau 25 g de sol într-un mojar, la care se
adaugă treptat apă potabilă, se omogenizează minuţios cu pistilul şi se toarnă într-un
cilindru cu volumul de 1 litru, preventiv umplut cu ¾ din volum cu apă. Amestecul
se agită cu o baghetă de sticlă şi se lasă 15 minute pentru sedimentare. Pelicula
formată la suprafaţa amestecului se înlătură cu o ansă, iar partea lichidă a acestuia se
aspiră cu un sifon într-un cilindru aparte. Sedimentul se spală repetat (nu mai puţin
24
de 3 ori), colectându-se în cilindru toate apele de lavaj. Acestea se lasă pentru
sedimentare pe 24 de ore, după care supernatantul se înlătură. Sedimentul se agită
minuţios, apoi cu pipeta Pasteur se ia o picătură de suspensie pentru examinare la
microscop, între lamă şi lamelă. Sedimentul se cercetează în frotiuri native şi în
preparate colorate cu soluţie Lugol. Se cercetează cel puţin 1 ml de sediment,
calculele fiind raportate la masa totală a acestuia. Investigarea sedimentului se
efectuează în primele 2 - 3 zile. Pentru păstrarea sedimentului (până la 2 luni), se
adaugă un conservant care conţine mertiolat, soluţie formol 40%, alcool etilic 96° şi
soluţie fiziologică (proporţia componentelor în %: mertiolat – 0,0016 - 0,0018;
soluţie formol 40% - 4,1 - 4,4; alcool etilic 96° - 10,4 - 10,9; soluţie fiziologică –
85,4 - 84,6). Conservantul se adaugă la sediment în raport de 1:2 şi se păstrează în
frigider. Durata investigaţiei – 120 min.
Pregătirea frotiurilor. Din amestecul sedimentului cu conservant se ia o picătura pe
lamă, se adaugă o picătura de oranj de acridină (diluată 1:500) şi se cercetează la
microscopul optic sau cu luminescenţă. Se calculă numărul chisturilor necolorate
(vii) şi colorate (moarte, degradate) a protozoarelor patogene de fiecare specie. La
studierea materialului cercetat la microscopul optic chisturile viabile de protozoare
patogene rămân necolorate, iar cele degradate şi moarte se colorează în galben.
Chisturile moarte la microscopul cu luminescenţă au culoare roşie.
6.2. Investigarea fructelor şi legumelor
Recoltarea probelor. Prelevarea probelor se efectuează de asistenţii medicilor
epidemiologi din CSP teritoriale conform SM SR ISO 874:2006 Fructe şi legume
proaspete. Eşantionare. În funcţie de scop, probele se recoltează din grădini şi
livezi, pepiniere individuale de pe câmp, de la pieţe agricole, în ospătării, magazine,
blocuri alimentare a instituţiilor de copii, în instituţii curativo-profilactice, case de
odihnă, tabere de vară pentru copii. Se recoltează probe separate din locuri la umbră
şi la soare, de legume ce stau la sol şi care atârnă pe plantă. La fel se recoltează şi
din locurile unde se depozitează pe iarnă. Pentru fructe, legume, pomuşoare - masa
probei va fi de 0,5 - 1,0 kg., pentru verdeaţă - 0,4 - 0,5 kg. Se colectează în pungi de
polietilenă şi însoţite de trimitere se transportă în laborator.
25
Principiul metodei: În soluţiile saturate (NaNO3, NH4NO3, Na2SO3, etc), ouăle de
helminţi, fiind mai uşoare, se ridică în pelicula de la suprafaţă, care se studiază la
microscop.
Tehnica examinării. În laborator probele se transferă într-o cratiţă şi se adaugă apă
ca să acopere zarzavaturile şi se lasă pe 12 - 16 ore. Apoi se agită manual bine timp
de 5 - 10 min. Zarzavaturile se scot din acest vas şi se clătesc bine în alt vas cu apă
curată. Această apă după clătire se adaugă la prima porţie şi totul se toarnă într-un
cilindru cu vol.1500 - 2000ml. Se lasă să se sedimenteze, apoi se studiază separat
sedimentul căpătat şi supernatantul.
Examinarea sedimentului: Sedimentul se transferă în eprubete de centrifugare cu
volumul de 250 ml (în cazul lipsei acestora pot fi folosite eprubete cu volumul 80 -
100 ml în care se vor adăuga 15 g de sediment) şi se toarnă soluţie de 3% de NaOH
în proporţie 12׃. Cu bagheta de sticlă se agită minuţios 5 - 8 min şi se centrifughează
mai apoi timp de 5 min cu viteza 800 rot/min. Supernatantul se aruncă, iar la
sediment se adaugă apă obişnuită, se agită şi iarăşi se centrifughează,
supernatantntul se aruncă. Procedura se repetă de câteva ori până la obţinerea unui
supernatant transparent. După spălare la sedimentul de sol se adaugă 150 ml soluţie
saturată de NaNO3, se agită minuţios şi se centrifughează în acelaşi regim. După
centrifugare eprubetele se instalează în stativ (în lipsa stativelor pot fi folosite
pahare de sticlă), se mai adaugă soluţie de flotant, lăsând doar 2 - 3 mm până la
marginea eprubetei. Se acoperă cu o lamă, lăsând o fisură prin care, atent, cu pipeta,
se mai adaugă soluţie flotantă până la formarea meniscului ce se lipeşte de lamă (nu
se admite prezenţa bulelor de aer), apoi lama se deplasează în aşa mod ca să acopere
totalmente eprubeta. Este foarte important de a evita scurgerea lichidului flotant din
eprubetă fiindcă poate scade din eficienţa metodei. Se lasă pe 20 - 25 min. apoi, cu o
mişcare rapidă, scoatem lama de pe eprubetă, întorcând-o cu suprafaţa umedă în sus.
În caz de necesitate, în acelaşi mod, pe eprubetă se aplică şi a doua, treia ş.a.m.d.
lamă, până când în preparat nu se mai depistează nimic. Pe lama umedă se aplică 3 -
4 picături soluţie 30% glicerină, se aplică lamela şi se microscopiază atent toată
26
suprafaţa frotiului, numărând şi studiind formaţiunile suspecte. Se calculează
numărul total de ouă, conform speciei, pe toate frotiurile pregătite dintr-o probă.
Examinarea supernatantului: la supernatantul căpătat se adaugă coagulant,
CuSO4, în cantitate de 0,3-0,5g/l. Se agită şi se lasă pentru sedimentare 40 - 50 min.
Supernatantul se înlătură, sedimentul din vas se transferă în eprubete de centrifugare
cu volum 250ml (1 eprubetă la fiecare probă) şi se centrifughează timp de 3 - 5 min.
cu viteza de 1000 rot./min. Supernatantul se înlătură iar la sediment se adaugă 2 - 4
ml sol.1-3% de HCl şi se agită bine pentru a dizolva fulgii din sediment. Se
centrifughează în acelaşi regim. Supernatantul se înlătură, la sediment se adaugă 45
- 80ml. sol de flotant, se agită bine cu baghetă de sticlă şi iarăşi se centrifughează în
acelaşi regim. Mai apoi eprubetele se instalează în stative sau în pahare de sticlă
(dacă stativele lipsesc) şi se mai adaugă soluţie flotantă până ce se va forma
meniscul. Se aplică lama în aşa mod, ca să rămână o fisură între marginea eprubetei
şi lamei, prin care atent, cu pipeta, se va mai adăuga flotant, până ce lichidul
complet se va lipi de lamă, evitând formarea bulelor de aer şi revărsarea flotantului
din eprubetă. Se lasă pe 25 - 30 min. pentru flotare. La expirarea timpului, lamele se
întorc cu suprafaţa umedă în sus printr-o mişcare rapidă, se aplică câteva picături
sol. 30% de glicerină, se acoperă cu lamela şi se microscopiază atent pe toată
suprafaţă. Aceaastă procedură (aplicarea lamei pe eprubeta cu flotant) se va repeta
de câteva ori, până când în frotiu nu se mai depistează nimic. Se calculează numărul
total de ouă, conform speciei, pe toate frotiurile pregătite dintr-o probă. În caz de
necesitate preparatele pot fi păstrate în frigider timp de 5 - 7 zile.
Efectuarea calculelor: se calculă, separat pe specie, numărul total de ouă,
numărând câte din ele sunt viabile. Se sumează numărul de agenţi parazitari din
ambele probe (sediment şi supernatant), care va constitui rezultatul final. Toate
datele obţinute, calculele depline şi toate evenimentele neobişnuite, apărute pe
parcursul determinării, se înregistrează în registrele de lucru şi evidenţă a
rezultatelor obţinute. Durata investigaţiei – 150 min.
La evaluarea gradului de contaminare a zarzavaturilor cu ouă de helminţi pot fi
aplicate două concluzii:
27
Zarzavaturi curate (care nu conţin ouă şi larve de helminţi).
Zarzavaturi contaminate (care conţin, indiferent de număr, ouă şi larve vii
sau moarte de helminţi).
6.3. Investigarea apei
6.3.1. Metodele de cercetare a apei potabile şi a apei din bazinele de înot
Monitorizarea calităţii surselor de apă potabilă (centralizate şi decentralizate) şi
bazinelor de la indicatorii parazitari se efectuează prin tehnicile nominalizate şi sunt
indicate pentru depistarea în apă a chisturilor de protozoare intestinale patogene
(lamblia, amiba dizenterică, balantidul) şi ouălor de helminţi, care prezintă pericol
nemijlocit pentru om când sunt înghiţite
Aceste tehnici nu se aplică pentru depistarea oochisturilor de criptosporidii
deoarece identificarea lor necesită o tehnică de pregătire a probei mai dificilă şi test
sisteme speciale.
Prelevarea şi păstrarea probelor: volumul şi frecvenţa prelevării probelor de apă
potabilă şi apă din bazine de recreaţie se efectuează în conformitate cu SM ISO
5667-5:2010 „Ghid pentru prelevarea apei potabile la staţiile de epurare şi
sistemele de conducte de distribuţie. Controlul calităţii apei din sursele subterane la
indicatorii parazitari se recomandă de efectuat numai în cazurile când câteva
investigaţii anterioare succesive n-au corespuns cerinţelor DN. Prelevarea probelor
se va efectua conform SM ISO 5667-11:2010 „Ghid general pentru prelevarea
apelor subterane”. Probele se vor preleva în vase cu volumul de 10, 20, 50 l, curate
din punct de vedere chimic. Pentru aceasta vor fi spălate cu apă fiartă. Înainte de
prelevare se vor clăti cu apa ce urmează a fi prelevată. Volumul mostrei va fi de 50
l. În laborator probele sunt transportate cu sau fără prelucrarea preventivă.
Prelucrarea se efectuează cu scopul de a micşora volumul ei şi se efectuează prin:
Filtrarea apei prin filtre (diametrul porilor 1,5 - 3,0 mcm) în laboratorul staţiei
de tratare a apei. Până la filtrare filtrele se vor fierbe 10 min în apă distilată
pentru înlăturarea impurităţilor din porii filtrului, care pot împiedica procesul
de filtrare; filtrele folosite se introduc într-un vas de sticlă cu gura largă, la
care se adaugă 30 - 50 ml de apă din proba respectivă. Vasul se închide bine,
28
se marchează, indicând data şi locul prelevării, volumul apei filtrate şi se
transportă în laborator pentru prelucrarea ulterioară. Proba poate fi păstrată la
temperatura de 40C nu mai mult de 1 zi; dacă nu-i necesar de determinat
viabilitatea chisturilor de protozoare şi ouă de helminţi – poate fi păstrată 3 -
4 zile, după ce se adaugă formol în aşa cantitate ca concentraţia lui în
suspensie să fie de 2%.
Folosirea coagulanţilor, sulfatul de fier sau de cupru, în doză de 0,1 - 0,3g/l.
În apă, la locul prelevării, se adaugă coagulantul, se agită minuţios şi se lasă
pentru sedimentare pe 1 - 2 ore. Supernatantul se înlătură, sedimentul se
transferă în vase cu volumul de 1 l şi se transportă în laborator.
Probele ce n-au fost preventiv prelucrate pot fi păstrate la temperatura de 15-200C
nu mai mult de 2 zile.
6.3.1.1. Metoda de filtrare
Principiul metodei: chisturile protozoarelor intestinale şi ouăle de helminţi sunt
depistate la microscopierea sedimentului, obţinut după spălarea filtrelor, prin care
apa preventiv s-a filtrat, mai apoi centrifugate cu soluţie flotantă cu greutatea
specifică de 1,26, în prealabil, diluată nu mai puţin de 4 ori. Sedimentarea chisturilor
de protozoare şi ouălor de helminţi se produce în rezultatul schimbării rapide a
densităţii relative a flotantului, care după diluare ajunge la 1,03 şi mai puţin, ce este
mult mai mică ca densitatea agenţilor parazitari.
Sensibilitatea metodei: pragul de sensibilitate constituie chisturi de lamblii solitare
la 1 l de apă. Eficacitatea metodei depinde de concentraţia iniţială a agenţilor
parazitari în probă, de volumul probei, de transparenţa ei, de intensitatea
fitoplanctonului şi calificarea executorului.
Tehnica examinării: în cazul când filtrarea apei nu s-a efectuat în alt laborator, apa
pentru investigare, în volum de 50 l, se filtrează prin filtrele, pregătite în prealabil
(diametrul porilor 1,5 - 3,0 mcm). Pe măsură ce ele se îmbibă cu impurităţi în
procesul filtrării, se schimbă, transferându-le cu o pensetă (în prealabil fiartă sau
prelucrată cu alcool) în vase de sticlă cu gura largă, adăugându-se 30 - 50 ml de apă
cercetată, pentru a se păstra umede. Filtrele obţinute după filtrare (la staţia de tratare
29
a apei sau nemijlocit în laborator) vor fi cercetate în modul următor: cu penseta,
fiecare filtru se cufundă într-un pahar cu apă distilată, fixând bine filtrul cu penseta.
Se spală minuţios sedimentul, cu o periuţă moale, apoi filtrul se mai clăteşte odată în
altă porţie de apă distilată. Dacă filtrele folosite au diametrul mai mare de 35 mm, se
recomandă de tăiat cu foarfecele curate în câteva bucăţi pentru a fi mai comod de
spălat. Această procedură e comod de efectuat în cutia Petri. La sfârşitul acestei
proceduri, pentru a evita pierderea de chisturi de protozoare şi ouă de helminţi,
periuţa folosită se spală minuţios în 5 - 10 ml de apă distilată. Lichidul căpătat la
spălarea filtrelor se transferă în eprubete cu volumul de 10 ml şi se centrifughează
timp de 5 min la viteza de 1500 rot/min. Dacă nu-i obligatoriu de determinat
viabilitatea chisturilor şi ouălor de helminţi, sedimentul se transferă în 6-8 ml de
soluţie de 2% de formol şi se agită. În caz contrar, dacă se preconizează
determinarea viabilităţii agenţilor parazitari, la sediment se adaugă apă pentru a-l
spăla. Suspensia căpătată se centrifughează conform regimului precedent,
supernatantul se înlătură, iar la sediment se adaugă 3ml de flotant şi se agită cu o
baghetă de sticlă. Iar se centrifughează 5 min la viteza de 2000 rot/min sau 10 min la
viteza de 1500 rot/min, după ce supernatantul se transferă cu pipeta în eprubete de
centrifugare, se diluează nu mai puţin de 4 ori cu apă distilată. Se centrifughează în
regimul precedent, se înlătură supernatantul, iar sedimentul se transferă pe lamă şi
se microscopiază. Cercetarea unei probe durează 16 ore.
6.3.1.2. Metoda de coagulare
Principiul metodei: chisturile protozoarelor intestinale şi ouăle de helminţi sunt
depistate la microscopierea sedimentelor, obţinute prin coagularea preventivă a
probelor cu sulfat de fier sau de cupru, mai apoi centrifugate cu soluţie flotantă cu
greutatea specifică de 1,26, în prealabil, diluată
nu mai puţin de 4 ori. Sedimentarea chisturilor de protozoare şi ouălor de helminţi
se produce în rezultatul schimbării rapide a densităţii relative a flotantului, care după
diluare ajunge la 1,03 şi mai puţin, ce este mult mai mică ca densitatea agenţilor
parazitari.
Tehnica examinării: proba recepţionată în laborator se mai lasă pe 1 - 2 ore pentru
30
sedimentare, se înlătură supernatantul, iar sedimentul se transferă în eprubete de
centrifugare, cu volumul de 10 - 50 ml, în funcţie de volumul sedimentului, se
centrifughează la viteza de 1500 rot/min timp de 5 min. Supernatantul se înlătură,
iar la sediment se adaugă 3 ml sol. de 1% de HCl pentru dizolvarea fulgilor de
coagulant, se agită şi se repetă centrifugarea. Supernatantul se înlătură iar
sedimentul obţinut se transferă în eprubete cu volumul de 10 ml şi se centrifughează
timp de 5 min la viteza de 1500 rot/min. Dacă nu-i obligatoriu de determinat
viabilitatea chisturilor şi ouălor de helminţi, sedimentul se transferă în 6 - 8 ml de
soluţie de 2% de formol şi se agită. În caz contrar, dacă se preconizează
determinarea viabilităţii agenţilor parazitari, la sediment se adaugă apă pentru a-l
spăla. Suspensia căpătată se centrifughează în regimul precedent, supernatantul se
înlătură, iar la sediment se adaugă 3ml de flotant şi se agită bine cu o baghetă de
sticlă. Se centrifughează 5 min la viteza de 2000 rot/min sau 10 min la viteza de
1500 rot/min, după ce supernatantul se transferă cu pipeta în eprubete de
centrifugare, se diluează nu mai puţin de 4 ori cu apă distilată. Se centrifughează
conformregimului precedent, se înlătură supernatantul, iar din sediment se prepară
preparate pe lame.
În funcţie de scopul investigaţiei preparatul se colorează sau nu. Dacă este
necesar de constatat numai numărul agenţilor parazitari, fără a determina viabilitatea
lor, preparatul nu se colorează sau se colorează cu o picătură de soluţie de Lugol de
3%. Viabilitatea chisturilor de lamblii se va determina la colorarea preparatelor cu
sol. apoasă 1% de eozină. Preparatele pregătite se acoperă cu lamela şi se studiază la
microscop, scanând toată suprafaţa frotiului, mărind imaginea de 100 - 600 ori
(obiectivele 10x, 40x, ocularele 10x, 15x) în sistemul uscat. Pentru determinarea
structurilor interne mai fine la protozoare, care au importanţă în procesul de
identificare, se va folosi sistemul de imersie cu obiectivul 90 - 100 sau microscopia
cu contrast de fază. În aşa mod se va examina tot sedimentul. Efectuarea unei astfel
de investigaţii necesită cel puţin 10 ore/persoană. Rezultatul investigaţiei poate fi
eliberat nu mai devreme de 24 de ore după recepţia probei în laborator.
Rezultatul negativ al testării nu garantează absenţa agenţilor patogeni parazitari în
31
eşantion, astfel încât rezultatele cercetării trebuie să fie prezentate în protocol cu
termenul "nu a fost depistat". Depistarea chiar a unui singur exemplar de agent
patogen parazitar într-o probă de apă potabilă este un indicator epidemiologic
nefavorabil în aprovizionarea cu apă potabilă.
6.3.2. Metodele de cercetare a apei din bazinele de suprafaţă
Prelevarea probelor. Procedura se efectuează conform SM ISO 5667-6:2010
Calitatea apei. Prelevare. Ghid pentru prelevarea probelor din râuri şi cursuri de
apă, SM RM ISO 5667-4:2007 Calitatea apei. Prelevare. Ghid de prelevare a
apelor din lacuri naturale şi artificiale.
Prelevarea probelor de apă se efectueazăîn recipiente curate. Vasele de volume
mari – canistre din plastic, borcane din sticlă, bidoane metalice, sunt spălate cu
atenţie cu apă fiartă şi se clătesc cu apă destinată investigaţiei. Punctele de prelevare
vor fi selectate mai sus şi mai jos de zonele rezidenţiale, în zone de recreere,
taberele de odihnă, inclusiv sportive. Probele de apă se vor colecta în secţiuni
transversale: de la suprafaţă şi la diferite adâncimi, începând de la 10 - 15 cm de la
suprafaţă. Pentru a efectua colectarea de la adâncimi mai mari pot fi folosite sonde
speciale, echipate cu pompă. Proba de apă de la suprafaţa bazinului se va preleva pe
etape, în volume de 1,5 - 2,0 l la intervale de 3 - 5 minute. Aceasta va permite în
timp de 40 - 60 de minute de colectat mostra medie cu volumul de 25 l.
În laborator probele sunt transportate cu sau fără prelucrarea preventivă. Prelucrarea
se efectuează cu scopul de a micşora volumul probei şi se efectuează prin:
Folosirea coagulanţilor, sulfatul de fier sau de cupru, în doză de 0,1 - 0,3g/l.
În apă, la locul prelevării, se adaugă coagulantul, se agită minuţios şi se lasă
pentru sedimentare pe 1 - 2 ore. Supernatantul se înlătură, sedimentul se
transferă în vase cu volumul de 1 l şi se transportă în laborator. Probele ce n-
au fost preventiv prelucrate pot fi păstrate la temperatura de 15 - 200C nu mai
mult de 2 zile.
Filtrarea apei prin filtre (diametrul porilor 1,5 - 3,0 mcm) în laboratorul staţiei
de tratare a apei. Până la filtrare filtrele se vor fierbe 10 min în apă distilată
pentru înlăturarea impurităţilor din porii filtrului, care pot împiedica procesul
32
de filtrare; filtrele folosite se introduc într-un vas de sticlă cu gura largă, la
care se adaugă 30 - 50 ml de apă din proba respectivă. Vasul se închide bine,
se marchează, indicând data şi locul prelevării, volumul apei filtrate şi se
transportă în laborator pentru prelucrarea ulterioară. Dacă nu se poate studia
materialul în ziua de recepţionare, proba poate fi stocată la temperatura de
40C nu mai mult de 1 zi; dacă nu-i necesar de determinat viabilitatea
chisturilor de protozoare şi ouă de helminţi – poate fi păstrată la temperatura
de 40C 3 - 4 zile, după ce se adaugă formol în aşa cantitate ca concentraţia lui
în suspensie să fie de 2%.
Monitorizarea calităţii apei bazinelor de suprafaţă la indicatorii parazitari prin
ehnica nominalizată este indicată pentru depistarea chisturilor de protozoare
intestinale patogene (lamblia, amiba dizenterică, balantidul) şi ouălor de helminţi,
care prezintă pericol nemijlocit pentru om când sunt înghiţite.
Principiul metodei: chisturile protozoarelor intestinale şi ouăle de helminţi sunt
depistate la microscopierea sedimentelor, obţinute după coagularea probei sau
spălarea filtrelor, prin care apa preventiv s-a filtrat, mai apoi centrifugate cu soluţie
flotantă cu greutatea specifică de 1,26, în prealabil, diluată nu mai puţin de 4 ori.
Sedimentarea chisturilor de protozoare şi ouălor de helminţi se produce în rezultatul
schimbării rapide a densităţii relative a flotantului, care după diluare ajunge la 1,03
şi mai puţin, ce este mult mai mică ca densitatea agenţilor parazitari.
Sensibilitatea metodei: pragul de sensibilitate constituie chisturi de lamblii solitare
la 1 l de apă. Eficacitatea metodei depinde de concentraţia iniţială a agenţilor
parazitari în probă, de volumul probei, de transparenţa ei, de intensitatea
fitoplanctonului şi calificarea executorului.
Tehnica examinării: în cazul când filtrarea apei nu s-a efectuat în alt laborator, apa
preconizată pentru investigare, în volum de 25 l, se filtrează prin filtrele (diametrul
porilor 1,5 - 3,0 mcm), pregătite în prealabil. Pe măsură ce ele se îmbibă cu
impurităţi în procesul filtrării, se schimbă, transferându-le cu o pensetă (în prealabil
fiartă sau prelucrată cu alcool) în vase de sticlă cu gura largă, adăugându-se 30 - 50
ml de apă cercetată, pentru a se păstra umede. Filtrele obţinute după filtrare (la staţia
33
de tratare a apei sau nemijlocit în laborator) vor fi spălate în felul următor: cu
penseta, fiecare filtru se cufundă într-un pahar cu apă distilată, fixând bine filtrul cu
penseta. Se spală minuţios sedimentul, cu o periuţă moale, apoi filtrul se mai
clăteşte odată în altă porţie de apă distilată. Dacă filtrele folosite au diametrul mai
mare de 35 mm, se recomandă de tăiat cu foarfecele curate în câteva bucăţi pentru a
fi mai comod de spălat. Această procedură e comod de efectuat în cutia Petri. La
sfârşitul acestei proceduri, pentru a evita pierderea de chisturi de protozoare şi ouă
de helminţi, periuţa se spală minuţios în 5 - 10 ml de apă distilată. Lichidul, căpătat
la spălarea filtrelor sau prin metoda de coagulare, se transferă în eprubete cu
volumul de 10 ml şi se centrifughează timp de 5 min la viteza de 1500 rot/min. Dacă
nu-i obligatoriu de determinat viabilitatea chisturilor şi ouălor de helminţi,
sedimentul se transferă în 6 - 8 ml de soluţie de 2% de formol şi se agită. În caz
contrar, dacă se preconizează determinarea viabilităţii agenţilor parazitari, la
sediment se adaugă apă distilată pentru a-l spăla. Suspensia căpătată se
centrifughează conform regimului precedent, supernatantul se înlătură, iar la
sediment se adaugă 3ml de flotant cu densitatea nu mai mică de 1,26 şi se agită bine
cu o baghetă de sticlă. Se centrifughează 5 min la viteza de 2000 rot/min sau 10 min
la viteza de 1500 rot/min, după ce supernatantul se transferă cu pipeta în eprubete de
centrifugare, se diluează nu mai puţin de 4 ori cu apă distilată. Se centrifughează în
regimul precedent, se înlătură supernatantul, iar din sediment se prepară preparate
pe lame. Dacă este necesar de identificat prezenţa chisturilor de lamblii, preparatul
se colorează cu o picătură de soluţie de Lugol. Preparatele pregătite se acoperă cu
lamela şi se studiază la microscop, scanând toată suprafaţa frotiului, mărind
imaginea de 100 - 600 ori (obiectivele 10x, 40x, ocularele 10x, 15x) în sistemul
uscat. Pentru determinarea structurilor interne mai fine la protozoare, care au
importanţă în procesul de identificare, se va folosi sistemul de imersie cu obiectivul
90 - 100 sau microscopia cu contrast de fază. În aşa mod se va examina tot
sedimentul. Este important, ca procedura să se efectueze de un specialist calificat,
capabil să diferenţieze agenţii parazitari de fitoplancton şi hidrobionţi. Efectuarea
unei astfel de investigaţii necesită 15 ore/persoană.
34
6.3.3. Metodele de cercetare a apelor reziduale
Prelevarea probelor. Procedura se efectuează conform SM RM ISO 5667-10:2007:
Calitatea apei. Prelevare. Ghid pentru prelevarea apelor uzate. Probele apelor
reziduale se prelevează la intrarea şi ieşirea din staţiile de epurare (epurare mecanică,
aero- şi biostaţii, instalaţii compacte, lacuri biologice, câmpuri de filtrare), pe
câmpuri de irigare şi la locul de scurgere în bazinele de acumulare. Volumul
probelor prelevate din apele reziduale trebuie să constituie minimum 1 l până la
intrarea în staţiile de epurare, 3 l după curăţirea mecanică, iar în alte cazuri cca 10 l.
Prelevarea probelor se face cu mănuşi de cauciuc, folosind recipiente de plastic sau
sticlă cu volumul 200 – 500 ml. Mostrele sumare se colectează în vase de sticlă sau
plastic, cu gât larg şi volume respective.
Testarea eficienţei instalaţiilor de epurare, la indicatorii parazitologici, se
efectuează în câteva etape: în proba prelevată la intrarea în instalaţia de epurare, cele
ulterioare se prelevează, ţinând cont de durata fiecărei etape de epurare. După
decantarea primară - peste 2,5 ore, după bazinul de aerare – 8,5 ore, după decantorul
secundar – 0,5 ore şi după etapa de clorinare peste 11 ore. Probele se etichetează,
parametrii acestora se înregistrează în registru şi se transportă la laborator, unde se
păstrează la răcoare cel mult 1 zi.
6.3.3.1. Metoda de investigare ovoscopică a apelor reziduale după
Romanenko
Principiul metodei: În soluţiile saturate (NaNO3, NH4NO3, Na2SO3, etc), ouăle de
helminţi, fiind mai uşoare, se concentrează în pelicula de la suprafaţă.
Tehnica de lucru. În fiecare probă de apă reziduală se adaugă unul dintre următorii
coagulanţi: sulfat de aluminiu (Al2(SO4)3), sulfat de fier (FeSO4), sulfat de cupru
(CuSO4) în doza de 0,5 - 0,6 g/l şi se agită minuţios. Limpezirea totală are loc după 40
- 50 minute. Supernatantul se aruncă, sedimentul se trece în eprubete (250 ml) şi se
centrifughează 3 min la 1000 rot/min. Supernatantul se înlătură, iar la sediment se
adaugă 2 - 4 ml de acid clorhidric (HCl) 1 - 3% pentru dizolvarea fulgilor de
coagulant. Amestecul se agită şi se centrifughează. Supernatantul se aruncă, iar
sedimentul se prelucrează conform metodei Romanenco de investigare ovoscopică a
35
solului.
Pentru reducerea timpului de prelucrare primară a probei şi volumul de
investigare, se recomandă introducerea prealabilă a coagulantului în recipiente, până
la prelevarea probei. Coagularea are loc imediat după colectarea apei în recipient, iar
în laborator va fi adus numai sedimentul obţinut. Eficienţa metodei constituie 86%,
variind între 82 şi 91%.
Procedeul determinării speciei şi viabilităţii agenţilor parazitari se va executa de un
specialist calificat, capabil să diferenţieze agenţii parazitari. Examenul unei probe
durează 75 min.
6.3.3.2. Metoda de investigare a apelor reziduale la chisturi de protozoare
patogene după Padcenko
Tehnica de lucru. Probele de apă reziduală se sedimentează timp de 12 – 16 ore.
Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se trece în eprubete şi se centrifughează 5
min la 1000 rot/min. Supernatantul se înlătură, sedimentul se transferă pe lame, se
adaugă conservantul în raport de 1:2 (mertiolat – 0,0016-0,0018; soluţie formol 40%
- 4,1-4,4; alcool etilic 96° - 10,4-10,9; soluţie fiziologică – 85,4-84,6) şi se
cercetează la microscop. Sedimentul se păstrează în frigider până la 2 luni.
Chisturile viabile ale protozoarelor rămân necolorate, iar cele degradate se colorează
în violet. Eficiența metodei este în mediu cca 90%. Examenul unei probe durează
50 min.
6.3.4. Investigarea apelor meteorice
Prelevarea probelor: se va efectua în conformitate cu SM RM ISO 5667-10:2007
Calitatea apei. Prelevare. Ghid pentru prelevarea apelor uzate. Pentru determinarea
gradului de nocivitate parazitologică a apelor meteorice este prevăzută prelevarea
probelor din canalele naturale, apărute ca rezultat al stocării apelor pluviale. Probele
se prelevează din fluxul de apă în recipiente separate (sticlă, plastic) cu gât larg
închise cu dop. Volumul probei constituie 1 l.
Colectarea probelor se poate efectua şi prin alte metode aşa-numitele
„capcane”. Pe cursurile principale ale apelor meteorice se sapă gropi cu dimensiunea
de 0,5 х 0,5 х 0,1 m, în care se acumulează apele pluviale. Această metodă facilitează
colectarea probelor de apă concomitent cu stratul superior de sol. Proba de apă se
36
prelevă în recipient (sticlă, plastic), iar proba de sol (0 - 1cm) în pungi de plastic (200
g). Probele se etichetează, se fac înscrieri în registru şi se expediază la laborator,
unde sunt păstrate în frigider maxim o zi.
Tehnica de lucru. Investigarea parazitologică a apelor meteorice se efectuează
conform metodelor de cercetare a solului şi apelor reziduale descrise anterior
(Romanenko; Padcenko).
6.4. Investigarea nămolului de pe fundul bazinelor acvatice
Prelevarea probelor: Se va efectua în conformitate cu SM RM ISO 5667-12:2007
Calitatea apei. Prelevare. Ghid general pentru prelevarea sedimentelor de fund.
Probele de nămol se prelevează din bazinele acvatice mai sus şi mai jos de nivelul de
revărsare a apelor reziduale. Probele se prelevează şi din locurile de pompare a apei
şi de revărsare a apelor meteorice din localităţi, gospodăriile fermiere şi individuale.
Pentru colectarea probelor se utilizează: escavatoare şi tuburi de diversă
construcţie. Colectarea manuală sau mecanizată a probelor se efectuează de pe mal
sau cu ajutorul bărcilor. Probele prelevate în volum de 200 g se colectează în
recipiente de sticlă sau plastic cu gât larg închise cu dop, se etichetează, se
înregistrează în registru şi se expediază la laborator, unde sunt păstrate în frigider.
Tehnica de lucru. Din proba sumară se preiau 4 probe a câte 25 g în eprubete de
centrifugare (250 ml), se adaugă 150 ml de apă şi se agită cu o baghetă de sticlă. Se
centrifughează 5 min la 1000 rot/min, apoi supernatantul se aruncă, iar sedimentul se
agită din nou cu 150 ml de apă. Procedeul sa repetă de 3 - 5 ori, până când
supernatantul devine transparent. Sedimentul spălat se cercetează conform metodelor
de investigare parazitologică a solului (Romanenco; Padcenco).
6.5. Investigarea nămolului apelor reziduale
Prelevarea probelor: se va efectua în conformitate cu SM RM ISO 5667-13:2007
Calitatea apei. Prelevare. Ghid general pentru prelevarea probelor de nămol din
canalizaţii şi instalaţii de tratare şi epurare a apelor uzate. Probele nămolului umed
(97 - 98% umiditate) din decantoarele primare şi cele secundare, precum şi de pe
platformele cu nămol ale instalaţiilor de epurare se iau cu ajutorul unui căuş în porţii
separate a câte 100 - 200 ml şi se toarnă în recipiente de sticlă (plastic) cu volum de
37
1 l, care se închid ermetic cu dop rodat (înşurubare).
Probele deshidratate (până la 70% umiditate) se iau cu un făraş sau cu o lopăţică
în porţii a câte 50 g din 4-5 locuri ale platformei de nămol (cu timp de expunere de 2
- 3 ani), se comasează într-o probă cu masa de 200 - 250 g. Probele se colectează în
pungi de plastic sau borcane cu capac, se etichetează, se înregistrează în registru şi
se expediază la laborator, unde se păstrează în frigider timp de 1 - 2 zile.
6.5.1. Metoda de investigare ovoscopică a nămolului apelor reziduale
după Romanenko
Tehnica de lucru. Nămolul umed se deshidratează: 100 – 150 ml de nămol se pun în
eprubete cu volum de 250 ml (30 - 45 ml în eprubete cu volum de 80 - 100 ml) şi se
centrifughează 5 min la 1000 rot/min. Supernatantul rezultat se aruncă, iar la
sediment se adaugă apă curată, se agită cu o baghetă de sticlă timp de 1 - 2 minute şi
apoi se centrifughează. Spălarea sedimentului se repetă de 2 - 3 ori.
Spălarea nămolului deshidratat (umiditatea de 70% şi mai şi puţin) se
efectuează analogic. În eprubete mari (250 ml) se agită 25 g nămol cu 150 ml de apă
şi se centrifughează. După spălare, în eprubetă se adaugă 3 – 5 g de nisip pur şi se
omogenizează. Sedimentul se cercetează conform metodelor de investigare
ovoscopică a solului (Romanenko).
6.5.2. Metoda de investigare a nămolului apelor reziduale la chisturi de
protozoare patogene după Padcenko Tehnica de lucru. Proba nămolului umed (98% umiditate) în volum de 1 l sau 0,2
kg, în caz de densitate crescută (70% umiditate), se omogenizează într-un cilindru,
adăugându-se treptat apă potabilă până la volumul total de 1,5 l. Suspensia obţinută
se toarnă într-un cilindru cu capacitatea de 2,0 l şi se sedimentează. Peste 15 minute
supernatantul se aspiră în alt cilindru cu volum de 5,0 l, iar sedimentul se spală
repetat (2 – 3 ori) cu apă prin agitare într-un cilindru cu capacitatea de 2,0 l.
Supernatantul obţinut după spălări repetate se adună într-un cilindru mare şi se
sedimentează 12 - 16 ore. Supernatantul se extrage cu ajutorul unui sifon, iar
sedimentul se cercetează la microscopul optic sau cu luminescenţă conform
metodelor de investigare a apelor reziduale după Padcenko.
6.6. Investigarea reziduurilor zootehnice după Romanenko şi Cerepanov
38
Prelevarea probelor. Probele de bălegar şi reziduuri zootehnice se prelevează din
colectoarele de bălegar în porţii separate a câte 0,1 – 0,2 l din 5 – 10 puncte. Proba
medie sumaă în volum de 1 litru se colectează în recipiente (sticlă, plastic) cu gât
larg şi dopuri rodate. Fracţiunea bălegarului deshidratat (70% umiditate) cu masa de
200 g se prelevează în pungi de polietilenă sau în borcane. Probele se etichetează, se
înregistrează în registru şi se expediază în laborator. În cazul imposibilităţii analizei
probelor de bălegar în ziua expedierii la laborator, se permite păstrarea acestora în
frigider sau în alt loc la temperatura între 0° şi 20°С timp de 2 zile. Pentru a evita
procesele de putrefacţie în bălegar şi în reziduurile zootehnice se adaugă 3 - 5
picături de toluol.
Tehnica de lucru. Într-un mojar se plasează 100 g de bălegar fracţie solidă, se
adaugă 300 ml de apă şi se omogenizează. Amestecul obţinut se filtrează printr-un
tifon dublu. Filtrarea se efectuează sub jet de apă. Filtratul se trece în eprubete şi se
centrifughează 3 minute la 1500 rot/min. Supernatantul se aruncă, iar la sediment se
adaugă soluţie saturată de nitrat de sodiu (NaNO3) şi se centrifughează. Apoi în
eprubete se adaugă aceiaşi soluţie de flotaţie (până la formarea meniscului), se
acoperă cu lamă, peste 25 de minute se scoate atent, se întoarce cu suprafaţa umedă
în sus, se aplică 1 - 2 picături de glicerină de 30% şi se studiază la microscop pelicula
superficială. Efectuarea investigaţiei durează 75 min.
6.7. Investigarea lavajelor de pe obiecte de uz casnic, mâini şi jucării
Prelevarea probelor. Pentru investigarea parazitologică a obiectelor de uz casnic se
prelevează lavaje de pe veselă, feţe de masă şi muşamale, mobilier, lenjerie de corp şi
de pat, echipament, vase de noapte, jucării, uşi, bănci, inventar sportiv, balustrade; de
pe mâinile copiilor, personalului instituţiilor pentru copii, blocurilor alimentare,
chelnerilor, angajaţilor sistemelor de irigare care folosesc apele uzate, sedimentele lor
şi reziduurile zootehnice, personalului instalaţiilor de tratare şi epurare a apei.
Lavajele se prelevează din cantine, magazine, instituţiile preşcolare şi şcolare,
taberele de odihnă şi sport, întremare, casele de copii, instituţiile curativ-profilactice,
cămine, biblioteci, teatre, muzee, frizerii, piscine, băi, săli de sporturi, ferme, sere,
ateliere de prelucrare a pieilor şi a articolelor din blană.
39
Pentru prelevarea lavajelor se folosesc tampoane compacte de vată şi capron,
periuţe din blană de veveriţă, umectate cu hidroxid de natriu (NaOH) 1%, cu soluţie
de glicerină de 10% sau detergent. Într-o probă (eprubetă) se pot aduna lavaje de pe
câteva obiecte de acelaşi tip. Lavajele de pe mâini se prelevează individual pentru
identificarea colaboratorilor iresponsabili de igiena personală. Prelevarea probelor se
efectuează într-o anumită consecutivitate. În instituţiile pentru copii probele se
prelevă mai întâi din blocul alimentar, apoi cantină, sala de joacă, dormitor,
spălătorie, iar în final din blocul sanitar. Este necesar ca în toate instituţiile pentru
copii să fie prelevate probe nu mai puţin de 2 ori în an (vara şi iarna). În focarele,
unde se întreprind măsuri de asanare, lavajele trebuie preluate de 1 - 3 ori în
semestru. Norma de timp pentru o investigare, inclusiv cu recoltare - 28 min, fără
recoltare – 7 min.
6.7.1. Metoda de investigare ovoscopică a lavajelor
Tehnica de lucru. Periuţele sau tampoanele după lavaj, se introduc în eprubete şi se
spală cu hidroxid de natriu (NaOH) 1% sau soluţie de glicerină 10%. Conţinutul
eprubetei se centrifughează, supernatantul se înlătură, iar sedimentul se cercetează la
microscop între lamă şi lamelă.
Pentru prelevarea ouălor de helminţi de pe mâini, (degete, spaţii subunghiale) se
recomandă spălarea acestora cu periuţa înmuiată în soluţie de bicarbonat de natriu
(Na2 HCO3) 2 - 3% sau soluţie de hidroxid de natriu (NaOH) 1%. Apele de lavaj se
centrifughează, iar sedimentul se cercetează la microscop între lamă şi lamelă.
Sedimentul de asemenea se poate filtra în aparatul Goldman, iar filtrele se
cercetează la microscop.
6.7.2. Metoda de investigare a lavajelor la chisturi de protozoare patogene
Tehnica de lucru. Tampoanele de vată sau periuţele, după fiecare lavaj, se spală în
apă, apoi lichidul se toarnă într-un cilindru înalt cu volumul de 0,5 – 1 l, în care se
adaugă apă după capacitatea cilindrului. Bucăţelele de hârtie, ţesături şi alte particule
mari, care se ridică la suprafața lichidului, se înlătură cu o ansă, iar supernatantul
obţinut, după spălări repetate, se adună într-un cilindru mare şi se sedimentează 12 -
16 ore. Supernatantul se extrage cu ajutorul unui sifon, iar sedimentul se cercetează la
40
microscopul optic sau cu luminescenţă conform metodelor de investigare a apelor
reziduale după Padcenko.
6.8. Investigarea zăpezii după Cernâşova
Prelevarea probelor. Probele de zăpadă se colectează în săculeţe-filtre speciale.
Acestea reprezintă o instalaţie în formă de pungă cu diametrul 30 – 50 cm,
confecţionată din satin, rips, percal, bumbac cu ochiuri de 0,08–0,04 х 0,04–0,012
mm. Marginea săculeţului este dispusă cu şiret, care strânge gura acestuia.
Săculeţele cu zăpadă sunt ţinute la temperatura camerei suspendate deasupra unor
recipiente. După topirea zăpezii pe fundul săculeţelor rămâne un sediment. Fundul
săculeţelor se umectează cu glicerină. Apoi se strâng, se ambalează în pungi de
polietilenă şi se expediază la laborator, unde se păstrează în frigider.
Tehnica de lucru. În laborator sedimentul din săculeţe se spală cu apă (0,5 l). Apele
de spălare se transferă în eprubete (250 ml) şi se centrifughează 15 min la 1500
rot/min. Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se etalează pe lamă şi se cercetează
la microscop.
6.9. Investigarea reziduurilor menajere solide
Prelevarea probelor. Probele de reziduuri menajere solide se prelevează din
sectoarele particulare şi comunale, instituţii preşcolare şi şcolare, spitale (secţii de
boli infecţioase), uzinele de sortare şi reciclare a deşeurilor. Se propun două
modalităţi de colectare a probelor:
а) din reziduurile menajere nefărâmiţate se înlătură obiectele mari, inclusiv şi
hârtia, cârpele, oasele, care nu prezintă semne de impurificare cu fecale, iar din
masa de reziduuri rămase se preiau pentru cercetare 200 – 250g;
b) din reziduurile menajere fărâmiţate, se preiau probe a câte 200 - 250 g.
Probele se ambalează în pungi de plastic, se etichetează, se înregistreză în
registru şi se expediază în laborator.
Tehnica de lucru. Proba de reziduuri menajere solide nefărâmiţate se pune într-o
cuvă nu prea mare cu 1 – 1,5 l de apă. Se spală minuţios toate porţiile de reziduuri, iar
obiectele rugoase şi puternic impurificate se spală cu periuţa în acelaşi recipient.
Lavajele se toarnă într-un borcan de sticlă (2-3 litri) cu gât larg şi cu dop rodat,
41
cauciuc sau plută, acoperit cu peliculă.
Proba de reziduuri menajere solide fărâmiţate se pune într-un borcan (2 – 3 l)
cu 1 – 1,5 l de apă şi se macerează timp de 1 oră. Borcanele cu lavaje se agită manual
sau în agitator 15 - 20 min. Se lasă 1 oră pentru sedimentare, după care supernatantul
se aruncă, înlăturând şi impurităţile solide de la suprafaţa apei. Sedimentul se toarnă
în eprubete mari (250 ml), borcanul se spală cu puţină apă, adăugându-se în aceiaşi
eprubetă. Se centrifughează timp de 3 - 5 min la 600 rot/min. Supernatantul se
înlătură, iar sedimentul se cercetează la microscopul optic sau cu luminescenţă
conform metodelor de investigare parazitologică a solului (Romanenko, Padcenko).
7. Metode suplimentare de investigare parazitologică
7.1. Metodă de cercetare parazitologică a particulelor de praf şi a aerului
după Kaledin şi Romanenko
Pentru colectarea prafului se foloseşte o cameră care reprezintă un cilindru
metalic cu lungimea de 120 mm şi diametrul intern de 27 mm (lăţimea standard a
unei lame). Peretele cilindrului prezintă o fisură de aspirare de 2 х 25 mm. În
interiorul cilindrului sunt montate 2 tije, care fixează lama în poziţie diametrală,
orientată longitudinal. Un capăt al cilindrului se acoperă cu dop demontabil iar
celălalt se racordează la aspirator.
Pe suprafaţă lamei se aplică un strat subţire de soluţie de glicerină 50% în formă
de bandă cu lăţimea de 1,5 - 2 cm şi lungimea de 4 - 5 cm. Lama se montează în
cameră în aşa fel, încât suprafaţa acoperită cu glicerină să fie îndreptată spre
orificiul de aspirare. Camera se închide cu dop, apoi se include aspiratorul şi se
colectează praful.
În timpul colectării probelor orificiul de aspirare a camerei trebuie să fie
îndreptat spre suprafaţa cercetată la distanţă de 2 - 3 mm şi să fie deplasată uniform
deasupra acesteia. Pentru o probă se colectează praful de pe o suprafaţă de până la
0,25 m2 timp de 15 - 20 sec, din aer – 60 sec. După colectarea probelor aspiratorul se
deconectează, se deschide camera şi se scoate lama. Pe suprafaţa lamei, acoperită cu
glicerină, se vor vedea clar urme de praf, reprezentând un preparat care poate fi
examinat la microscop (mărirea х 7 sau 10). Dacă preparatul obţinut este prea gros,
42
acesta se diluează cu 1 - 2 picături de apă sau soluţie de glicerină de 50%. La
microscop printre particulele de praf se observă foarte bine şi ouăle de helminţi.
Examinarea preparatelor se poate efectua imediat după colectarea probelor sau în
laborator. Prelevarea probelor de praf şi aer, nemijlocit pe lamă, acoperite cu soluţie
lipicioasă, exclude aplicarea filtrelor, centrifugarea, pregătirea lavajelor, în timpul
cărora pot avea loc pierderi ale ouălor de helminţi sau deteriorarea acestora.
Pentru colectarea şi examinarea probelor se poate folosi o bandă lipicioasă de
celofan cu un strat de lipici de 3 mm. Banda se aplică pe diferite obiecte de uz casnic,
după care se cercetează la microscop, adăugând câteva picături de ulei de ricină.
Banda cu lăţimea de 20 mm şi lungimea de 8 cm trebuie fixată cu partea lipicioasă
pe diverse suprafeţe cercetate de 6 - 8 ori, în funcţie de gradul de prăfuire a
obiectului, apoi aceasta se aplică pe o lamă. Preparatul se poate păstra câteva zile. În
laborator banda se desprinde, iar în locul acesteia se aplică câteva picături de ulei de
ricină sau vaselină (pentru îndepărtarea bulelor de aer) şi se cercetează la microscop
cu obiectivul x7 sau 10. Cu ajutorul benzii lipicioase nu se poate efectua colectarea
probelor de praf de pe hârtie (cărţi), jucăriile de pluş şi obiectele moi.
8. Metode de determinare a viabilităţii agenţilor parazitari
Viabilitatea agenţilor parazitari se determină după aspectul exterior, prin
metoda coloranţilor vitali şi prin procesul de cultivare (embrionare) în condiţii
optime.
8.1. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi
8.1.1. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi după aspectul
exterior
Ouăle de helminţi se studiază la microscop cu obiectivul de intensitate mică,
apoi mare. La ouăle deformate şi la cele moarte, membrana este ruptă sau îndoită
spre interior, citoplasma este tulbure, deteriorată. Ouăle aflate în faza segmentării,
au blastomeri de dimensiuni diferite, formă neregulată, deseori excentrice, fiind
amplasaţi spre un pol. Uneori se întâlnesc ouă cu anomalii, care prezintă deformări
externe, dar care se dezvoltă normal. Larvele vii de Ascaris spp prezintă
granulozităţi mărunte numai în partea medie a corpului, iar pe măsura devitalizării
43
larvelor, aceasta se răspândeşte pe tot corpul, formând vacuole mari şi strălucitoare
care conţin hialină, numite „fire perlate”.
Pentru determinarea viabilităţii ouălor mature de Ascaris spp, Trichocephalus
spp, Enterobius vermicularis se provoacă mişcări active ale larvelor prin încălzirea
uşoară a preparatului (până la 37°C), presând lamela cu o pensetă. Larvele infestante
de Ascaris spp prezintă o teacă hialină situată la extremitatea cefalică, iar larvele de
Trichocephalus spp după finisarea dezvoltării în ou prezintă un stilet, care poate fi
observat numai la intensitatea mare a microscopului. Larvele moarte indiferent de
localizare (ou, exterior) au corpul deteriorat: structura internă devine granulată, iar
corpul lipsit de claritate. În corp se evidenţiază vacuole, iar pe cuticulă – rupturi.
Viabilitatea oncosferelor de Taenia solium, Taenia saginata etc., se determină
după mişcarea embrionilor hexacanţi sub acţiunea fermenţilor digestivi. Ouăle
etalate pe sticla de ceas cu suc gastric sau lichid duodenal artificial (pancreatină -
0,5 g, bicarbonat de sodiu – 0,09 g, apă distilată – 5 ml), se pun în termostat la 36-
38°C pentru 4 ore. Embrionii vii eclozează. În 6-8 ore la 38°C, membrana
oncosferelor vii se dizolvă în suc gastric (HCl, pepsină) sau soluţie alcalină de
tripsină. Dacă ouăle de Taenia spp se menţin la 36-38°C, în soluţie de sulfat de
sodiu 1%, sau hipoclorit de natriu 20%, sau apă clorată 1%, embrionii vii eclozează,
păstrându-şi viabilitatea timp de o zi. Oncosferele imature şi cele moarte se zbârcesc
şi se măresc brusc, iar apoi sunt supuse procesului de „dizolvare” în timp de 10
min–2 ore. Embrionii vii de Taenia spp se mişcă activ la temperatura de 36 - 38°C
în amestec de soluţie clorură de sodiu 1%, hidroxid de natriu 0,5% şi bilă.
Viabilitatea metacercarilor de Fasciola spp, colectate de pe plante şi alte
obiecte, pe păşuni mlăştinoase şi din bazinele acvatice, se verifică prin etalarea lor
pe o lamă în soluţie fiziologică la microscop cu platină caldă. La încălzire, larvele
încep să se mişte în interiorul chistului.
Pentru determinarea viabilităţii ouălor de Hymenolepis nana cea mai simplă
metodă se consideră metoda Ionin: în ouăle vii perechea mediană de cârlige
embrionare este situată paralel celor laterale sau la baza acestora formează un unghi
care este mai mic de 45°. În ouăle moarte perechile laterale cu perechea mediană
44
formează la bază un unghi mai mare de 45° sau cârligele sunt dispersate haotic;
uneori are loc zbârcirea embrionului, apariţia granulozităţii. Mai sigură este metoda
bazată pe apariţia mobilităţii oncosferelor în caz de schimbare bruscă a temperaturii:
de la 5 - 10° C până la 38 - 40°C.
Determinarea viabilităţii ouălor imature de nematode se studiază în cutii Petri,
menţinând ouăle de Ascaris spp în soluţie de formalină 3% preparată pe soluţie
izotonică de clorură de natriu (0,85%) la temperatura de 24-30°C; ouăle de
Trichocephalus spp – în soluţie de acid clorhidric 3% la temperatura de 30 - 35°C;
ouăle de Enterobius vermicularis – în soluţie izotonică de clorură de natriu la 37°C.
Cutiile Petri se recomandă a fi deschise 1 - 2 ori pe săptămână, pentru aerare şi
umectare suplementară a hârtiei de filtru. Monitorizarea procesului de dezvoltare a
ouălor de helminţi, are loc cel puţin 2 ori în săptămână. Lipsa semnelor de
dezvoltare timp de 2 - 3 luni demonstrează inviabilitatea lor. Ca semne de
dezvoltare a ouălor constituie apariţia procesului de diviziune prin segmentarea
conţinutului şi formarea blastomerilor separaţi. În primele zile se dezvoltă până la
16 blastomeri, care trec în stadiul următor – de morulă.
Ouăle de Ancylostomatidae pentru embrionare se menţin într-un cilindru de
sticlă (cu înălţimea de 50 cm şi diametrul de 7cm) acoperit cu un dop. Amestecul
din părţi egale de nisip steril, cărbune de lemn şi materii fecale cu ouă de
Ancylostomatidae, diluat cu apă până la consistenţă semilichidă, se toarnă atent pe
fundul cilindrului cu ajutorul unui tub de sticlă. Embriogeneza durează 1 - 2 zile în
întuneric (25-30°C) şi se soldează cu eclozarea larvelor rabditiforme, care peste 5 -
7 zile devin filariforme: larvele se urcă pe pereţii cilindrului şi sunt observate chiar
şi cu ochiul liber.
Ouăle de Trematoda (Fasciolidae, Paramphistomatidae, Opisthorchidae) şi
Cestoda (Pseudophyllidea) care pentru dezvoltare necesită prezenţa apei, sunt
cultivate pe sticlă de ceas în plăci Petri sau în alt vas cu apă. Se va ţine cont de
faptul că ouăle de Fasciola evoluează mai rapid la întuneric. În ouăle vii la
temperatura de 22 - 24°C peste 9 - 12 zile se dezvoltă miracidiul. Examinarea
microscopică a ouălor de trematode aflate în dezvoltare, permite observarea
45
mişcărilor lente a larvei. Miracidiul de Fasciola spp eclozează din ou numai la
lumină.
8.1.2. Metoda Fiulleborn.
Larvele de Ancylostomatidae, Trichostrongylidae, Dictyocaulidae şi
Strongylidae (subordinul Strongylata) se recoltează pe agar-agar în cutii Petri cu
cărbune activat. După expunerea în termostat la temperatura de 25 - 300C timp de 5
- 6 ore larvele se extind pe agar-agar, lăsând o urmă din bacterii.
8.1.3. Metoda cultivării pe hârtie de filtru în eprubetă (Harada şi Mori).
Principiu. Larvele din probă sau cele provenite din ouăle existente în probă, se
concentrează lent în decurs de câteva zile, din materiile etalate pe hârtie de filtru,
fiind atrase de apă.
Materiale necesare: eprubete 18/180 mm, benzi de hârtie de filtru 10/150 mm,
microscop.
Tehnica de lucru: pe o coală de hârtie se aşează benzile de hârtie de filtru. Cu o
baghetă de sticlă se întind aproximativ 0,5g (cât un bob mare de porumb) materii
fecale, pe 2/3 din lungimea unei benzi de hârtie de filtru (aproximativ 10cm), lăsând
o porţiune albă la unul din capete. Într-o eprubetă se toarnă aproximativ 7 ml apă
distilată (înălţimea de 2 - 3 cm). Cu o pensetă se introduce hârtia de filtru în
eprubetă, cu partea curată în apă, iar partea cu materii fecale în sus. Eprubeta se
acoperă cu o bucată de celofan de 5 × 5 cm, care se fixează cu un ineluş de cauciuc
sau cu aţă. Preparatele, astfel pregătite în eprubete, se păstrează la 25 - 28°C timp de
10 - 16 zile şi se citesc zilnic, începând din ziua a treia de la pregătire. Pe eprubetă
se marchează datele de evidenţă. Apoi se îndepărtează cu o pensă celofanul şi se
flambează gura eprubetei pentru a distruge eventualele larve infestante. Acestea se
pot ridica sub capacul de celofan. Se lucrează cu atenţie în mănuşi de cauciuc.
Eprubetele se aşează în baia de apă fierbinte la 50°C pentru 15 min (pentru
neutralizarea larvelor care mor la această temperatură), după care conţinutul se agită
şi se toarnă rapid într-o eprubetă de 15 ml pentru sedimentarea larvelor. După
centrifugare supernetantul se aruncă, iar sedimentul se cercetează microscopic între
lamă şi lamelă cu obiectivul 7 x 10(8) pentru larvometrie şi determinarea raportului
46
esofag/lungimea larvei şi cu obiectivul 7 x 40 pentru detaliile orificiului bucal şi
extremităţii caudale.
Larvele de Strongyloides spp, Strongylata, care se găsesc de la început în
probă, migrează activ spre apă, între ziua 3 - 8 de la preparare. Larvele de
Ancylostomatidae, care eclozează din ouă în mediul exterior, în cazul de faţă în
eprubetă, migrează după aproximativ 7 - 10 zile şi până în ziua 15 - 16.
Pentru diagnosticul diferenţiat al larvelor filariforme (infestante) se vor folosi datele
tabelului 2.
Tabelul 2
Diferenţierea morfologică a larvelor filariforme
Larva filariformă
Specia Dimensiuni Caracteristici
Ancylostoma
duodenale
Lungimea:
corpului cca 660
μm: teaca – 720
nm
Teaca fără striaţii: proeminenţa
bucală neevidenţiată, extremitatea
anterioară teşită; diametrul tubului
intestinal mai mic decât dilatarea
esofagului (bulbus), extremitatea
posterioară (coada) teşită.
Necator
americanus
Lungimea:
corpului cca 590
μm: teaca – 660
nm
Teaca prezintă striaţii, îndeosebi în
partea caudală; proeminenţa
bucală pigmentată; extremitatea
anterioară rotunjită; tubul
intestinal în partea anterioară are
acelaşi diametru ca şi (bulbusul)
dilatarea esofagului; extremitatea
posterioară (coada) ascuţită.
Strongyloides
stercoralis
Lungimea
corpului cca 500
μm
Teaca lipseşte; esofagul are o
dilatare (bulbus) şi ocupă ½ din
lungimea corpului; coada teşită
sau ramificată în două părţi.
Trichostrongylus
spp
Lungimea
corpului cca 750
μm
Extremitatea posterioară curbată,
prezintă o protuberanţă; teaca
caudală scurtă; 16 celule
intestinale triunghiulare dispuse în
2 rânduri cu unghiurile ascuţite
spre extremităţile corpului;
lumenul intestinal are formă de
linie frântă (zigzag).
47
8.1.4. Determinarea viabilităţii ouălor şi larvelor de helminţi prin metoda
de colorare
Identificarea elementelor parazitare (ouă, larve) pe baza evidenţierii
structurilor vii şi celor moarte se execută prin diferite procedee de coloraţie pe
material biologic nefixat. Rezultatele se obţin imediat sau după un interval de timp
scurt. Criteriul principal al viabilităţii oului, reprezintă colorarea embrionului şi nu a
membranei. Însă, când membrana oului devitalizat păstrează încă permeabilitatea
selectivă şi nu permite pătrunderea coloranţilor în interior, embrionul mort nu se va
colora. Aşadar, numai colorarea embrionului, întotdeauna, denotă despre
devitalizarea oului.
Pentru colorare se poate utiliza albastru de metilen dizolvat în soluţie de acid
lactic cu hidroxid de sodiu (albastru de metilen 0,05g, hidroxid de sodiu 0,5g, acid
lactic 15ml). În ouăle vii vopseaua nu pătrunde, pe când în cele moarte embrionii se
colorează în verde.
Tehnica de colorare a ouălor de Ascaris spp cu albastru crezil de briliant
(1:10000): pe lamă se etalează o picătură de suspensie cu ouă şi o picătură de soluţie
colorantă. Preparatul se acoperă cu lamela, care se presează uşor. La microscop se
determină numărul de larve eclozate şi gradul de impregnare a acestora cu colorant.
În continuare, acelaşi preparat se examinează repetat la interval de 2-3 ore. Larvele
vii se consideră cele eclozate nedeformate şi necolorate. Larvele moarte, fie că se
vopsesc parţial sau total în timpul deteriorării acestora.
Viabilitatea ouălor de Ascaridia galli (parazitează la păsări) se determină prin
aplicarea soluţiei de iod 5%, care timp de 1 - 3 secunde colorează în portocaliu
embrionii din ouăle moarte.
Ouăle moarte de Opisthorchis felineus şi oncosferele de Taenia solium se
colorează cu albastru de toluidină (1:1000), iar oncosferele moarte de Taenia
saginata – cu albastru de crezil briliant (1:10000). În acest caz se colorează
embrionii şi membranele atât din ouăle vii, cât şi din cele moarte. De aceea, după
colorare, ouăle de Trematoda şi oncosferele de Cestoda se spală cu apă curată şi
apoi se colorează suplimentar cu safranină (soluţie 1:10000 în alcool la 10°C).
48
Alcoolul extrage vopseaua din membrane, iar safranina le colorează în roşu.
Drept rezultat, ouăle cu embrionul viu se colorează în roşu, cele cu embrionul
mort – în albastru, iar membrana acestora rămâne roşie. Embrionii morţi din
oncosferele de T. saginata se colorează rapid (câteva minute) în roşu purpuriu
sau roz cu safranină şi în albastru, dacă se foloseşte albastru de crezil briliant
(1:4000) sau indigocarmină (1:1000 – 1:2000). Embrionii vii nu se colorează nici
după 2 - 7 ore.
Pentru determinarea viabilităţii ouălor de Hymenolepis nana se recomandă
aplicarea următorilor coloranţi:
1. Albastru de crezil briliant (1:8000). După 1 oră de la aplicare, în ouăle moarte
se colorează cel mai intens oncosfera, evidenţiindu-se clar pe fundalul pal sau
incolor al oului;
2. Safranina (1:8000 – expunerea 2 ore şi 1:5000 – expunerea 3 - 5 ore);
Acid pirogalic 50% în raport de 1:2 – expoziţia 1 oră, la 29 - 30°C (cu cât mai joasă
este temperatura, cu atât mai mult va dura procesul de impregnare).
8.2. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene
8.2.1. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene după
aspectul exterior
Estimarea vizuală a probabilităţii de viabilitate a chisturilor de protozoare patogene
se petrece conform următoarelor criterii, ce confirmă viabilitatea:
• integritatea membranei exterioare (fără întreruperi, deprimări, bombaje,
contracţii);
• structura internă clară a chisturilor: nucleul clar vizibil, fără granulaţii, la chisturile
de Giardia se văd, de asemenea, axostilul, aparatul flagelar, corpul medial.
Chisturile de lamblia – au forma ovală , dimensiunea de 10 - 14 microni în lungime
si 6 - 10 microni în lăţime, chisturile imature conţin 2 nuclee, cele mature – 4,
situate la polul anterior a chistului. Membrana chisturilor este exprimată clar si pe
marea parte parcă se desprinde de protoplasmă, ce este una dintre diferenţele
caracteristice ale chisturilor de Giardia de alte elemente. În interiorul chistului, de-a
lungul liniei mediale, se văd 2 axostili, oblic sau transversal sunt amplasaţi
49
corpusculii parabasali (2 - în cele imature şi 4 - în mature), deseori se observă şi
aparatul flagelar.
Chisturile amibei disenterice – sunt rotunde, rareori au forma ovală, dimensiunea 10
- 16 microni; chisturile tinere conţin 1 sau 2 nuclee şi cariosoma sub formă de stea,
amplasată în centrul chistului; chisturile mature - 4 nuclee. Atât la chisturile tinere
cât şi la cele mature, nucleele se află în diferite secţiuni. Membrana este biconturată
şi are aspectul unei aure transparente. Chisturile mononucleare conţin o cantitate
mare de glicogen, care este în formă de vacuole mari, cu un contur difuz, de obicei,
ocupă mai mult de jumătate din chisturi şi soluţia Lugol l - e colorează în maro
închis.
Trebuie să se ţină cont de faptul că în apa de suprafaţă pot fi prezente chisturile de
Entamoeba dispar, identice cu chisturile de amiba disenterică, dar nu au proprietăţi
patogene pentru om. În acest caz, în protocolul de studiu, se vor face notiţe despre
identificarea amibelor, fără specificarea speciei. Pentru identificarea ulterioară este
nevoie de studii suplimentare. Cu toate acestea, această situaţie trebuie să fie un
semnal al bunăstării epidemiologice.
Chisturile balantidului – au forma rotundă, regulată, membrana biconturată, bine
pronunţată, dimensiunea medie de aproximativ 50 mcm. În interiorul chistului
conţine nucleul mare, în formă de fasole. Protoplasma este omogenă, glicogenul este
pulverizat uniform. Sub membrană, în unele chisturi, se evidenţiază o aprofundare,
care prezintă citostomul redus - o organelă corespunzătoare cu începutul tubului
digestiv la multicelulare. Învelişul ciliar lipseşte.
8.2.3. Determinarea viabilităţii chisturilor de protozoare patogene
prin metoda de colorare
Viabilitatea chisturilor de Giardia se poate determina, colorând preparatul cu o
picătură de soluţie apoasă de eozină de 1%: chisturile viabile de Giardia nu
recepţionează culoarea în primele 5 minute, cele moarte se colorează imediat în roz.
Prin urmare, această colorare trebuie să fie utilizată numai în cazul în care studiul
microscopic al frotiului durează nu mai mult de 5 minute. Deseori, microscopia
preparatului durează 15 - 30 de minute, de aceia, în aceste cazuri, soluţia apoasă 1%
50
eozină se va picura sub lamelă cu pipeta cu atenţie, fără a schimba poziţia frotiului,
în punctul în care s-au depistat chisturile de Giardia.
9. Concluzie
Frecvenţa înaltă a parazitozelor la om şi animale, favorizează poluarea
mediului ambiant cu forme invazionale libere (ouă de Ascaris spp, Trichocephalus
spp, Opisthorchidae, oncosfere de Taeniidae, chisturi de Amoebida, Giardia
intestinalis, Balantidium coli, oochisturi de Toxoplasma gondii, Cryptosporidium
parvum, Sarcocystis spp, etc).
Identificarea formelor infestante ale agenţilor parazitari (ouă, larve, chisturi,
oochisturi) reprezintă cel mai demonstrativ indicator al situaţiei sanitaro-
epidemiologice nefavorabile (poluare cu fecale) al mediului ambiant şi prezintă un
interes sporit pentru sănătatea publică, motiv pentru care, concomitent cu cercetările
bacteriologice, chimice şi virusologice, sunt necesare şi investigaţiile sanitaro-
parazitologice ale componentelor mediului ambiant. Monitoringul sanitaro-
parazitologic al mediului (habitatului) uman este o parte componentă importantă în
activitatea Serviciului de Supraveghere de Stat a Sănătăţii Publice. Agenţii patogeni
ai invaziilor parazitare pot fi depistaţi în sol, apă, obiecte de uz casnic, pe legume,
zarzavaturi, în organismul gazdelor definitive, intermediare şi celor complementare.
Măsurile sanitaro-igienice şi profilactice de decontaminare a surselor de
invazie şi monitoringul sanitaro-parazitologic sistematic al funcţionării staţiilor de
tratare a apei potabile, de epurare a apelor reziduale şi reziduurilor zootehnice, de
neutralizare a impurităţilor şi reziduurilor până la evacuarea în bazinele de suprafaţă
sau trenurile pentru îngrăşăminte şi irigare a culturilor la etapa actuală sunt
primordiale.
Metodologia investigaţiilor sanitaro-parazitologice pune în evidenţă riscul
infestării omului şi animalelor, precum şi poluării mediului ambiant cu forme
invazionale. În baza evaluării indicilor gradului de contaminare parazitară a
componentelor mediului ambiant, dinamicii diminuării gradului de infestare şi de
morbiditate a populaţiei umane şi animalelor, se prognozează dinamica modificării
riscului de infestare şi condiţiile de ameliorare a situaţiei parazitologice. Rezultatele
51
investigaţiilor sanitaro-parazitologice permit evaluarea gradului de contaminare a
mediului cu agenţi parazitari, riscului de infestări noi, date necesare la planificarea
activităţilor antiepidemice şi curativ-profilactice precum şi la evaluarea eficacităţii
lor.
10. Bibliografie
1. Legea nr.10 din 03.02.2010 Privind supravegherea de stat a sanatatii publice.
2. HG Nr.934 din 15.08.2007 Cu privire la instituirea Sistemului informaţional
automatizat. „Registrul de stat al apelor minerale naturale, potabile şi băuturilor
nealcoolice îmbuteliate”.
3. HG nr.632 din 18.05.02 Cu privire la studierea, utilizarea şi protecţia apelor
minerale.
4. GOST 17.1.2.03-90 „Критерии и показатели качества воды для орошения”
5 HG nr. 737 din 11.06.02 Privind reglementarea funcţinării zonelor de recreere
aferente bazinelor acvatice.(p.33-Controlul calităţii apei bazinelor acvatice –
conform RI nr.06.6.3.23).
6. RT nr 597 din 21.08.2007 „Fructe şi legume proaspete destinate consumului ca
atare”
7.Методические указания МУК 4.2.796-99 "Методы санитарно-
паразитологических исследований"
8. Методические указания МУК 4.2.1884-04 „Санитарно-микробиологический
и санитарно- паразитологический анализ поверхностных водных обьектов”.
9. Методические указания МУК 4.2.964-00 „Санитарно-паразитологическое
исследование воды хозяйственного и питьевого использования”.
10. SM SR EN ISO/IEC 17025:2006 Cerinţe generale pentru competenţa
laboratoarelor de încercări şi etalonări
11. SM RM ISO 5667-4,7,10,12,13:2007: Calitatea apei. Prelevare.
12. SM ISO 5667-1,5,6,11:2010: Calitatea apei. Prelevare.
13. SM SR ISO 874:2006 Fructe şi legume proaspete. Eşantionare.
14. ГОСТ 17.4.4.02-84 Почвы. Методы отбора и подготовки проб для
химического, бактериологического, гельминтологического исследования.
15. ГОСТ 17.4.4.01-81 Почвы. Номенклатура показателей санитарного
состояния.
16. Ghid naţional de biosiguranţă pentru laboratoare, 2010
