Date post: | 16-Jan-2016 |
Category: |
Documents |
Upload: | mihaela-carnuta |
View: | 9 times |
Download: | 0 times |
Microscopie optica.Microscopie optica.Masuratori cu microscopul opticMasuratori cu microscopul optic
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Tehnici de microscopieTehnici de microscopie
Microscopie Microscopie opticaoptica• Microscopie optica de transmisieMicroscopie optica de transmisie• Microscopie de baleiaj utilizand lasereMicroscopie de baleiaj utilizand lasere
➢ Microscopie confocalaMicroscopie confocala➢ Microscopie in camp apropiatMicroscopie in camp apropiat
Microscopie Microscopie electronicaelectronica• Microscopie electronica de transmisieMicroscopie electronica de transmisie• Microscopie electronica de baleiajMicroscopie electronica de baleiaj
Microscopie Microscopie de forta atomicade forta atomica
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Componentele unui microscopComponentele unui microscop
OcularulOcularul (1) – contine lentilele (1) – contine lentilele ocular; valori tipice ale maririi: 5x, ocular; valori tipice ale maririi: 5x, 10x si 2x10x si 2x
Obiectivul Obiectivul (2); valori tipice ale (2); valori tipice ale maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x si 100x; interschimbabilesi 100x; interschimbabile
MasaMasa (3) – sustine proba de (3) – sustine proba de examinatexaminat
Sursa de luminaSursa de lumina (4) – situata (4) – situata sub masasub masa
CondensorulCondensorul (5) – sistem de (5) – sistem de lentile si diafragme care lentile si diafragme care controleaza cantitatea de lumina controleaza cantitatea de lumina prin proba si focalizarea luminiiprin proba si focalizarea luminii
MacrovizaMacroviza (6) si (6) si microvizamicroviza (7) (7)
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie opticaMicroscopie optica Microscopie optica de transmisieMicroscopie optica de transmisie
• Lumina traverseaza proba microscopica; Lumina traverseaza proba microscopica;
• Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale probeiprobei
• Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a vizualiza mai bine anumite componente celulare etc.vizualiza mai bine anumite componente celulare etc.
• Imaginea finala este virtuala, marita si rasturnataImaginea finala este virtuala, marita si rasturnata
A
BA’
B’
A”
B”
F1
F1’ F2 F2’
Ob
Oc
e
Formarea imaginii intr-un microscop opticAB – obiect
A’B’ – imagine intermediara
A’’B’’ – imagine finala
Ob – lentila obiectiv
Oc – lentila ocular
F1, F1’ – focare obiectiv
F2, F2’ – focare ocular
f1 – distanta focala obiectiv
f2 – distanta focala ocular
e – distanta intre F1’ si F2
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Putere separatorie η=1/d
Rezolutie d = 1,22λ/(2nsinu)
λ - lungimea de unda a luminii folosite
n – indicele de refractie al mediului dintre obiectiv si preparat
u – unghiul de apertura al obiectivului
nsinu = NA (apertura numerica a obiectivului)
Putere P = tga2/AB
Grosisment G = P/4 = e/4f1f2
G = tga2/tga1
G = A”B”/AB
G = GobGoc
Microscopie opticaMicroscopie optica
Parametrii unui microscop opticParametrii unui microscop optic
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Activitate experimentalaActivitate experimentala
Caracterizarea dimensiunii intr-o Caracterizarea dimensiunii intr-o populatie de celule eritrocitarepopulatie de celule eritrocitare
Obiective:Obiective:
• Calibrarea microscopului (determinarea factorului de conversie CF)
• Masurarea diametrului a 20-30 hematii seleactate aleator de pe un frotiu de sange
• Calculul mediei si deviatiei standard• Prezentarea grafica a rezultatelor
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Activitate experimentalaActivitate experimentala
Micrometrul ocular = Micrometrul ocular = reticulreticul
Micrometru obiectivMicrometru obiectiv – diviziuni de 10 – diviziuni de 10 µµM / 20 M / 20 µµM (dupa cum este indicat pe M (dupa cum este indicat pe micrometru)micrometru)
Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina factorul de factorul de conversieconversie ( (CFCF) al microscopului () al microscopului (µµM/div)M/div)
Micrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sangeMicrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sange
ΦΦ celulacelula ( (µµ M) = NM) = Ndivdiv x CF x Ob x CF x Obcalibrarecalibrare/Ob/Obmasuraremasurare ( (ΦΦcelulacelula = diametrul unei celule; N = diametrul unei celule; Ndivdiv = = numarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obnumarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obmasuraremasurare = = obiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obobiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obcalibrarecalibrare = marirea obiectivului = marirea obiectivului cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF))cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF))
Calibrarea microscopului
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html
Micrometru ocular (reticul)
Micrometru obiectiv
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Activitate experimentalaActivitate experimentalaReticul (micrometru ocular)
Determinarea CF si masurarea diametrului eritrocitar
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Activitate experimentalaActivitate experimentalaAnaliza datelor
Measured diameter
d1 X1
d2 X2
d3 X3
.
.
.
.
.
.
.
.
dn Xn
Rezultate experimentale (n celule)
• Diametrul mediu:
• Deviatia standard:
n
XX
n
i∑= 1
∑ −=n
i XXn 1
2)(1σ
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Materiale suplimentareMateriale suplimentare
http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.html
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.html
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.htmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html
http://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htmhttp://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htm
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
ApendixApendix
• Diferite tipuri de microscopieDiferite tipuri de microscopie• ImaginiImagini
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscoape optice specialeMicroscoape optice speciale
• UltramicroscopulUltramicroscopul➢ Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se
formeaza pe baza luminii difuzateformeaza pe baza luminii difuzate
• Microscopia in contrast de fazaMicroscopia in contrast de faza➢ Pentru obiecte transparente; imaginea este formata Pentru obiecte transparente; imaginea este formata
pe baza diferentei de faza indusa luminii care pe baza diferentei de faza indusa luminii care travereseaza medii optice diferite, din preparatul travereseaza medii optice diferite, din preparatul microscopicmicroscopic
• Microscopia de fluorescentaMicroscopia de fluorescenta➢ Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul
este iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibileste iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibil
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Imagini de microscopie opticaImagini de microscopie optica
http://www.ptei.org
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie de fluorescentaMicroscopie de fluorescenta
http://neuroscience.nih.gov
Neuron hipocampic marcat cu YFP (yellow fluorescent protein)
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie in contrast de fazaMicroscopie in contrast de faza
http://www.wallawalla.edu/academics/departments/biology/rosario/inverts/Porifera/Mycale_adhaerens.html
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie optica folosind lasereMicroscopie optica folosind lasereMicroscopie confocalaMicroscopie confocala
Raza laser este focalizata succesiv in Raza laser este focalizata succesiv in sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila reconstructia 3D ulterioara, pe baza reconstructia 3D ulterioara, pe baza imaginilor seriateimaginilor seriate
Microscopie in camp apropiatMicroscopie in camp apropiatDistanta dintre preparat si obiectiv este mai Distanta dintre preparat si obiectiv este mai
mica decat lungimea de unda a radiatiei laser mica decat lungimea de unda a radiatiei laser utilizateutilizateNu mai apar artefacte de difractieNu mai apar artefacte de difractiePermite rezolutii la nivel molecularPermite rezolutii la nivel molecular
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie confocalaMicroscopie confocala
http://www.meade.com/dsi/gallery/molecular_probes.html
Imagine de fluorescenta a unei celule endoteliale, folosind trei markeri: rosu pentru mitocondrii, verde pentru citoschelet si albastru pentru nucleu
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopia electronica de Microscopia electronica de transmisietransmisie
•Utilizeaza lentile electromagnetice
Imagine a jonctiunii neuromusculare
Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica
Microscopie electronica de baleiajMicroscopie electronica de baleiaj
www.bacteria-world.com
•Vizualizarea suprafetelor