MICROBIOLOGIE

1

Introducere

Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot fi

observate decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem

discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în

discuţie şi alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate în cadrul

disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu înrudit cu microbiologia poate fi considerată şi

imunologia.

Se consideră că microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase şi diversificate

forme de viaţă. Pot fi identificate în mediul înconjurător, au rol în descompunerea materiei

organice şi menţin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau

făcând parte din flora normală a diferitelor gazde; o mai mică parte sunt implicate, în

diferite grade, în patologie. În acest caz, bolile infecţioase pot să afecteze o persoană, un

grup de persoane sau o întreagă comunitate. Pe măsură ce bolile infecţioase au fost

identificate a apărut şi disciplina de epidemiologie, născută din necesitatea studiului

izbucnirilor epidemice. Datorită faptului că iniţial nu era cunoscută etiologia epidemiilor,

acestea au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la

cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Există o serie de documente istorice care

atestă existenţa epidemiologiei ca ştiinţă privind patologia în masă, precum tratatele lui

Hipocrate (460-377 înainte de Iisus Christos), cele 7 cărţi „Despre epidemii” şi „Despre aeri,

apă şi locuri”.

Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei ştiinţe relativ simple la un nivel care

a determinat progrese însemnate în diagnosticul, prevenirea şi tratamentul bolilor. În bună

parte datorită aplicaţiilor microbiologiei, speranţa de viaţă a crescut semnificativ. La

începutul secolului, se înregistrau frecvent decese datorită unor cauze infecţioase (difterie,

oreion, pestă, poliomielită, rubeolă, rujeolă, tifos exantematic, tuberculoză, sifilis, varicelă,

variolă, etc).

În acest moment variola este eradicată.

Pentru poliomielită a fost stabilită ţinta eradicării, iniţial pentru anul 2000, ulterior

pentru 2012. Izbucnirea epidemică din 2010 ”a împins” această ţintă peste alţi ani (unica

boală infecțioasă eradicată rămâne variola).

Pentru alte maladii sunt propuse alte ţinte de prevenire şi control iar evoluţia gravă,

letală, survine numai în anumite situaţii (forme clinice avansate, atipice, neglijate).

Datorită cunoştinţelor în domeniul microbiologiei s-au îmbunătăţit condiţiile sanitare, s-

au descoperit şi aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea „tehnologiei

ADN” (în special după anul 1973), bazată pe cunoştinţele acumulate pe parcursul ultimelor

trei-patru decade de studiu şi practică privind genetica microbiană, are o însemnătate

deosebită. Există de un număr de ani posibilitatea inserării de material genetic provenit de

2

la oricare organism viu în bacterii selecţionate şi adaptate astfel încât să poată realiza

„sarcini” speciale, normale la celula donatoare, ajungându-se până la posibilitatea ca tulpini

deEscherichia coli modificate genetic să sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul

bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular.

Microbiologia ca ştiinţă este strict necesară pentru sănătate, pentru menţinerea

sănătăţii şi prevenirea îmbolnăvirilor. Cunoaşterea modului de transmitere a diferitelor

microorganisme reduce numărul cazurilor de toxoplasmoză, tuberculoză sau gripă.

Cunoaşterea noţiunilor privind sterilizarea-antisepsia-dezinfecţia poate permite (în

cazul aplicării corecte în practică a acestor noţiuni) evitarea infecţiilor de spital sau a altor

infecţii produse în unităţi sanitare cu sau fără paturi. Cunoaşterea imunologiei şi

imunopatologiei permite înţelegerea legăturilor şi interrelaţiilor microorganism-gazdă,

precum şi importanţa procedeelor de imunizare şi supravegherea aplicării acestora.

Măsurile generale aplicate pentru evitarea apariției bolilor infecțioase sau a transmiterii

ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunoștințe microbiologice.

Studiul microbiologiei nu este dificil în cazul în care se înţelege faptul că

microbiologia este o ştiinţă foarte logică (cele mai multe principii pot fi învăţate prin

simpla înţelegere a acestora). Pe de altă parte, pe măsură ce reuşeşti să îi descifrezi o

parte dintre taine poţi realiza că este una dintre cele mai fascinante ştiinţe.

Microorganismele au fost descoperite relativ târziu, în 1680, cu toate că primul

instrument de mărire asemănător cu dispozitivele actuale a fost realizat în 1590 de către

Zacharias Janssen.

În 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oară celulele, el a studiat o secţiune

dintr-un dop de plută şi a descoperit că structura plutei era formată din nişte „cutii” micuţe.

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind să examineze ţesătura hainelor fine (deşi

era la bază un vânzător de mărunţişuri), se pare că a fost prima persoană care a văzut şi a

descris diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe

care l-a construit singur, a constat dintr-o lentilă biconvexă într-un cadru metalic, cu o

mărire de până la 270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniţial diferite ţesături, însă

manifestând o curiozitate deosebită a dorit să studieze ulterior apa din bălţi, tartrul dentar,

materiile fecale provenite de la un pacient cu „dizenterie”, etc. A fost mirat să observe în

toate aceste substanţe, mici organisme sferice, altele în formă de „bastonaş”, spirale, unele

aflate în mişcare rapidă, pe care le-a numit „animalicule”. Desenele pe care le-a făcut

probează că a observat cu adevărat bacterii, protozoare şi alte microorganisme. Pornind de

la condiţia sa iniţială, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat

125 de scrisori traduse în engleză şi predate Societăţii Regale din Londra. în plus, 27 dintre

lucrările sale au fost publicate în Memoriile Academiei Franceze de ştiinţe. Se pare că unul

dintre microscoapele originale ale lui van Leeuwenhoek se află în muzeul Universităţii din

Utrecht.

În urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus întrebarea „de unde au apărut aceste

organisme?”. Până la mijlocul secolului al nouăsprezecelea cea mai acceptată teorie a fost

„teoria generaţiei spontane”. Învăţaţii epocii credeau că bacteriile apăreau spontan din

materie anorganică. În 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de „biogeneză”. Această

3

teorie susținea faptul că un organism viu poate să apară numai din alt organism viu.

Controversele între cele două teorii s-au păstrat până în 1861 când Pasteur a infirmat

”teoria generaţiei spontane”. Geniul lui Pasteur a demonstrat că aerul contaminat cu

microorganisme poate cotamina o soluţie sterilă, în schimb aerul steril nu poate să

determine apariția unor bacterii.

Cu mult înainte de a se fi cunoscut faptul că microorganismele sunt cauza bolilor

infecţioase au fost imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu,

Edward Jenner (1796) a arătat că variola ar putea fi prevenită prin vaccinare. Semmelweis a

avut contribuţii importante privind prevenirea răspândirii bolilor în maternităţi şi spitale

utilizând substanţe chimice „dezinfectante”.

Regulile principale (unele valabile şi astăzi) precum şi metodele ştiinţei microbiologice

inclusiv principiile imunizării, utilizarea microbiologiei în medicina preventivă, prevenirea şi

controlul bolilor infecţioase se bazează pe activitatea a doi cercetători înzestraţi atât cu

geniu cât şi cu tenacitate, probabil având şi şansa de a fi trăit în „perioada marilor

descoperiri”, Louis Pasteur (1822-1895) şi Robert Koch (1843-1910). Pe bună dreptate,

perioada 1857-1914 e considerată drept ”epoca de aur a microbiologiei”.

Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei.

Tot el a demonstrat că fermentaţia şi putrefacţia sunt cauzate de organisme vii şi a notat o

asemănare între aceste procese şi bolile infecţioase luând în discuţie degradarea vinurilor şi

berii ca şi „boli” ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin

care a arătat că, atât cât era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat

naştere numai din organisme vii, şi nu din materie moartă. În 1861 a descoperit fenomenul

de anaerobioză şi fermentarea butirică (produsă de Vibrion butyrique, numit

ulteriorClostridium butyricum). După elaborarea procedeului numit „pasteurizare”, a

expus în 1877 teoria pasteuriană cu privire la germeni desfiinţând (așa cum am mai

menționat) „teoria generaţiei spontanee”. Utilizând substanţe simple, de origine naturală şi

gaze, vapori şi arcuri electrice sub temperatură şi presiune crescută, microbiologii şi

biochimiştii pot sintetiza o serie de compuşi organici care au fost descoperiţi iniţial doar în

celulele vii. După studiul fermentării vinului, Pasteur a investigat o boală transmisibilă la

viermii de mătase şi ca rezultat a formulat teoria legată de implicarea germenilor în

producerea unor boli. În ceea ce priveşte maladiile umane, a insistat ca bandajele să fie

curăţate şi instrumentele din spital să fie fierte.

Louis Pasteur a demonstrat în anul 1857, la aproape o jumătate de secol după lucrările

redactate despre vaccinare de către Edward Jenner, legătura dintre infecţii şi

microorganismele susceptibile a fi cultivate şi studiate. în diferite experimente ingenioase,

Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras

din Bacillus anthracis. „Tratamentul profilactic” al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de

material uscat obţinut din măduva spinării de la animalele care au murit de rabie. Joseph

Meister, un băiat muşcat de un câine turbat, a fost primul om a cărui viaţă a fost salvată

prin această metodă fiind protejat de injecţiile făcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a

descoperit bacteriile anaerobe şi a studiat septicemia şi gangrena. Ca atare, a devenit

posibilă punerea la punct a tehnicilor de distrugere şi de control al diferiţilor germeni

4

(stafilococi, streptococi, pneumococi etc). În 1880, Louis Pasteur a demonstrat că putem fi

protejaţi contra bolilor infecţioase prin injectarea unor germeni atenuaţi.

Primul medic care a observat transmiterea infecţiilor în instituții sanitare a fost Ignaz

Semmelweis. Femeile ce nășteau acasă sufereau mai puține infecții comparativ cu cele ce

nășteau la spital. A impus spălarea riguroasă şi ”dezinfectarea” cu clor a mâinilor

personalului înainte de a aplica intra în sala de naștere sau de a consulta o femeie

însărcinată.

Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur în

chirurgie chiar înainte ca bacteriile care determină infecţiiile chirurgicale (nosocomiale) să fi

fost descoperite. Lucrările lui Lister reprezintă baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de

astăzi.

Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumiţi microbiologi germani. El

a extins cercetările lui Pasteur lucrând cu bacterii, alge şi fungi. Fiind foarte interesat de

bacteriologie, a scris una dintre primele cărţi referitoare la bacterii, realizând una dintre

primele clasificări bacteriene în genuri şi specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru

Robert Koch, încurajându-l să îşi publice lucrările cu privire la antrax.

Cu două secole înainte de apariţia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat că anumite

boli sunt provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat că bolile infecţioase ar

putea fi determinate direct de către microorganisme.

Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a

demonstra „teoria microbiană a bolii”. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor

în cultura pură a fost printre cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice

şi a fost în mare parte opera lui Robert Koch. O cultură pură de microorganisme se dezvoltă

atunci când pornim de la un singur tip de microorganism care se dezvoltă în eprubetele test

sau în plăcile cu mediu de cultură (în colonii izolate).în condiţii naturale, mai multe

microorganisme din specii diferite pot coexista în acelaşi mediu. Spre exemplu, în materiile

fecale ale unui pacient cu febră tifoidă, Salmonella typhi se află „amestecată” cu un număr

extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe şi anaerobe) sau chiar şi alte

forme de microorganisme. În cadrul diagnosticului medical microbiologic este importantă

izolarea în cultură pură a germenilor patogeni. În exemplul menţionat, pentru diagnostic

este necesară folosirea metodelor care permit izolarea S. typhi în cultură pură, singura care

permite identificarea şi stabilirea sensibilităţii / rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. în

1876 Koch a izolat în „cultură pură” bacteria care determină antraxul. Pornind de la splina

recoltată de la vite infectate şi procesată pentru a permite obţinerea unui produs patologic;

a fost capabil să infecteze şoareci de laborator utilizând această cultură. Implicat în

cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecţioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a

considerat că reprezintă datele esenţiale pentru a demonstra că un anume germen este

cauza unei infecţii. Aceste date sunt cuprinse în patru postulate, denumite Postulatele lui

Koch, respectiv:

1. Microorganismele care determină boala trebuie să poată fi identificate în toate

cazurile de boală, în relaţie patogenică directă cu simptomele şi leziunile pe care le

determină;

5

2. Microorganismul trebuie să poată fi izolat de la victimele bolii, în cultură pură, pentru

studiul în laborator;

3. Când cultura este inoculată la un animal susceptibil, trebuie să reproducă boala (sau,

cum s-a stabilit ulterior, să inducă apariţia anticorpilor specifici la noua gazdă);

4. Microorganismul trebuie să poată fi izolat din nou în cultura pură din infecţia produsă

experimental.

Utilizând aceste reguli precum şi diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit

bacilul tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum şi modul de transmitere

pentru numeroase alte boli infecţioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodiumetc.).

Descoperirile menţionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei,

parazitologiei şi imunologiei ca ştiinţe. în doar aproximativ 15 ani (după 1880) au fost

descoperite şi izolate în cultură pură microorganisme implicate în multe dintre bolile

infecţioase importante. Aceste descoperiri au făcut posibilă stabilirea ca entităţi bine

definite a medicinei preventive şi respectiv a terapiei specifice (etiologice).

Ilia Mecinikov a evidenţiat modul natural de apărare a organismului faţă de agenţii

infecţioşi prin anumite celule care au proprietăţi fagocitare şi a scris în 1901 primul tratat

de imunologie.

În şcoala germană apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat

toxinele bacteriene, imunitatea umorală şi seroterapia precum şi Paul Ehrlich (1854-1915).

Cercetările lui Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivaţilor

arsenicali în tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult decât atât, în

anul 1878 Ehrlich realizează că există diferenţe de afinitate tinctorială faţă de coloranţii pe

bază de anilină. Această descoperire îl ajută să studieze efectul diferitelor substanţe

chimice, dar stă şi la baza apariţiei coloraţiilor în microbiologie.

Ehrlich arată că mycobacteriile au proprietatea de acido-rezistenţă iar doi ani mai târziu

(1884), cercetătorul danez Christian Gram pune bazele coloraţiei care îi poartă numele şi

care are o remarcabilă utilitate după aproape 125 ani de la această descoperire.

Deşi asistenţa medicală într-o anumită formă a existat încă de la debutul vieţii umane

pe pământ, începuturile nursing-ului profesional au fost realizate de către Florence

Nightingale (1820-1910), care a început munca sa cu mai bine de 140 de ani în urmă, în

cursul războiului din Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaţia dintre

microorganisme şi boală, au necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe

şi mai rafinate decât cele utilizate de „îngerii din Crimeea”.

Descoperirea măsurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de

toxoizi şi antitoxine (în difterie şi tetanos), a serurilor imune (von Behring, Fränkel şi

Kitasato, 1890), a vaccinurilor polio şi rujeolos (Enders, Weller şi Robins 1949; Salk 1954;

Sabin şi alţii, 1954-1967), precum şi utilizarea de gama globuline pentru prevenirea

pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au făcut necesară dezvoltarea de noi concepte şi

educaţie în prepararea şi administrarea acestor substanţe.

Identificarea căilor de transmitere a infecţiilor a condus la dezvoltarea de metode

eficace de prevenire a răspândirii bolilor.în 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic

militar în India, a demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul

6

ţânţarilor. Parazitul a fost vizualizat în eritrocitele umane în 1881 de către Laveran, chirurg

al armatei franceze în Algeria. în 1900 a fost demonstrată transmiterea virusului febrei

galbene de către o specie particulară de ţânţari (Aedes aegypti), în Cuba.

Descoperirea unor teste de diagnostic în domeniul microbiologiei a necesitat o pregătire

microbiologică mai avansată a medicilor, asistentelor şi a altor profesionişti ai sănătăţii în

metode pentru colectarea produselor şi raportarea specifică de laborator, astfel încât

terapia să demareze cât mai precoce. Descoperirea de substanţe chimice specifice (de

exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) şi substanţe antibiotice (de exemplu penicilina,

streptomicina, tetraciclina şi cloramfenicolul) a contribuit la îmbunătăţirea modului de

abordare medicală a problematicii bolilor infecţioase. Primul medicament anti-tuberculos

este descoperit în anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman).

Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fără dezinfecţie şi sterilizare. Industria

laptelui, a conservelor, a hranei ambalate şi congelate sunt dependente de microbiologie.

Sanitaţia sistemelor de apă şi tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorită

cunoştinţelor acumulate prin microbiologie în cursul ultimului secol. în multe moduri

profesiunea medicală şi fiecare latură a ei este dependentă de cunoaşterea, înţelegerea şi

utilizarea informaţiilor din microbiologie.

La şcoala română de microbiologie înfiinţată de profesorii Victor Babeş (1854-1926) şi

Ion Cantacuzino (1863-1934) s-au pregătit multe generaţii de microbiologi, viitori

cercetători şi profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ţara noastră.

Victor Babeş s-a născut la Viena în anul 1854, a studiat la Facultatea de medicină din

Budapesta, apoi în Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condusă de

profesorul Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de

Anatomie patologică la Facultatea de medicină din Budapesta. A fost în acelaşi timp

anatomopatolog şi microbiolog. A fost atât elevul lui Robert Koch, cât şi al lui Louis Pasteur.

A fost numit docent şi profesor la Facultatea de medicină din Budapesta la o vârstă foarte

tânără (27 ani). Cu patru ani mai târziu, în anul 1885, publică împreună cu A.V. Cornil

primul tratat de bacteriologie medicală din lume (în 1891 apare a treia ediţie a tratatului). A

doua ediţie a acestui tratat se află în Biblioteca Institutului Naţional de Cercetare-

Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”. Victor Babeş a demonstrat

importanţa introducerii tehnicilor microbiologice în anatomopatologie. Ar putea fi menţionat

şi faptul că pe parcursul celor 10 ani de activitate la Facultatea din Budapesta, a dat

indicaţiile necesare pentru construirea unui nou Institut de anatomie patologică iar în cadrul

acestuia a unei secţii dedicate bacteriologiei. A evidenţiat proprietăţile neutralizante ale

serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babeş-Ernst), o

nouă metodă de preparare a serului antidifteric etc. în 1886 a fost numit profesor de

anatomie patologică şi bacteriologie la Facultatea de Medicină din Bucureşti. Este

fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza căruia s-a dezvoltat actualul Institut „Victor

Babeş”. În 1889 a preparat vaccin antirabic,ţara noastră fiind a treia ţară din lume

care a reuşit să prepare acest vaccin. A condus institutul creat până aproape de

sfârşitul zilelor sale, care a fost la puţin timp după pensionarea sa.

7

Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fie găsit un spațiu în

care să-şi poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des

întâlnit în istoria medicinei noastre.

Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a fi foarte

asemănătoare peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii

noastre este într-o direcţie pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul

profesorului Victor Babeş, ţinut la Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea

civilizată aşteaptă deci lucruri mari din partea noastră; nu îmbogăţirea oligarhiei

politice în afaceri, certuri politice, persecuţiuni şi denunţuri infame pentru

interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor mai valoroase

achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi ştiinţa,

spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de

exemplu popoarelor din Orient.

Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare

desorganizare, desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi

nepăsare ca ţărănimea să fie azi degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată

peste măsură; politicienii noştri au reuşit să oprime toate valorile, înlocuindu-le

prin clientela lor politică; au adus funcţionarismul, birocratismul, nepotismul la

culme; politicienii noştri în nepăsarea lor pentru interesele ţării au lăsat armata la începutul

războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase prin care a trecut ţara şi din

care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român.

Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu

este o datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l

înlocuim cu o altă putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul.

În adevăr trebue să fim profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom

putea să eşim din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am

contractat-o faţă de lumea civilizată.

Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice,

aceeaşi nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate,

acelaşi egoism care ne-a condus la degenerare ca şi înainte războiului,aşteaptă cu

nerăbdare o schimbare radicală a moravurilor politice care să ne pună în

poziţiunea de a îndeplini măreaţa noastră misiune.

Faţă de aceste adevăruri ar fi trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul

în prag şi să rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre

profunda noastră descurajare; că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze

goale domină şi politica de astăzi şi că mergem orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca

întinderea şi bogăţia acestei ţări binecuvântate să ne asigure un loc de frunte şi stare

economică briliantă, ne găsim astăzi în deplin faliment, expuşi ruinei şi foametei şi mai mult

decât oricând sub dependenţa şi exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari.”

Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într-o

trecere atât de sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia şi

Literele, ştiinţele naturale şi Medicina. Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe

8

parcursul a 9 ani, în laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi

străine, inclusiv latina şi greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru satisfacerea

stagiului militar (genişti, Jilava). A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886,

medicină 1887). Lucrează în Institutul Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină

în 1894 şi este numit profesor suplinitor de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din

Iaşi (1894). A fost numit profesor la Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a

grupat în jurul său un mare număr de tineri medici, care au devenit la rândul lor

îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C. Ionescu-Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D.

Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I. Nicolau, Lidia şi I. Mesrobeanu şi

mulţi alţii).

În perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al

Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, înfiinţează sanatoriile

Bisericani, Bârnova, Nifon, Cărbuneşti, Filaret precum şi primele laboratoare regionale de

bacteriologie şi igienă (Craiova, Galaţi, Constanţa, Iaşi, Sulina). Începe în 1912 prepararea

vaccinului contra febrei tifoide şi a holerei asiatice, ulterior începe prepararea serului

antidifteric. Este numit în 1917 Director al Directoratului Sănătăţii Publice civile şi militare,

calitate în care coordonează combaterea epidemiilor de holeră, tifos exantematic, febră

recurentă. În 1920 începe prepararea serurilor antimeningococic şi anti gangrenos (în

Laboratorul de Medicină experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim

delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai târziu se înfiinţează Institutul de Seruri şi

Vaccinuri, în 1926 începe vaccinarea BCG în România iar în 1928 înfiinţează „Archives

Roumaines de Pathologie Expérimentale et de Microbiologie”. Din păcate, în momentul de

faţă „Romanian Archives of Microbiology and Immunology” (numele actual al revistei, care

a ajuns la volumul cu numărul 69) nu apare listată între publicaţiile recunoscute oficial în

ţara noastră, cu toate că începând cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial

străduindu-se să refacă prestigiul revistei, ca o datorie morală faţă de înaintaşi.

În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de

ministru al sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă

zile înainte de a înceta din viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfiinţarea

Ligii contra Tuberculozei.

Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului

Cantacuzino a fost înfiinţarea în anul1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit

astăzi INCDMI „Cantacuzino” (Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru

Microbiologie şi Imunologie), centru de cercetare ştiinţifică fundamentală şi aplicativă,

centru de învăţământ de specialitate, instituţie care a preparat şi prepară seruri, vaccinuri

şi alte produse biologice utile în diagnosticul bolilor transmisibile.

Alexandru Slătineanu (1873-1939) a organizat învăţământul universitar de

microbiologie la Iaşi (cercetări în domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului

exantematic, etc.).

Constantin Ionescu-Mihăieşti (1883-1962) a abordat teme importante în domeniul

virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice

şi epidemiologiei. A avut contribuţii deosebite în studierea mycobacteriilor şi

9

enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului „Cantacuzino” a cărui

director a fost începând cu anul 1934. A continuat activitatea ştinţifică şi administrativă

promovată de Ion Cantacuzino.

Mihai Ciucă (1883-1969) a dezvoltat o bogată activitate ştiinţifică în domeniul

bacteriologiei şi epidemiologiei, experimental, terapeutic şi clinic. A studiat împreună cu

Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuţii deosebite în domeniul malariei

fiind numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lângă Liga Naţiunilor. A fost profesor de

microbiologie întâi la Iaşi şi din 1934 în Bucureşti fiind al treilea profesor de bacteriologie

din Bucureşti după Victor Babeş şi Ion Cantacuzino.

Alexandru Ciucă  (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din

Bucureşti. Activitatea lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri

hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al

Institutului Cantacuzino.

Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase

(febra tifoidă, febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A

avut contribuţii deosebite în domeniul rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului

război mondial a organizat măsuri de prevenire a tifosului exantematic.

Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în

România, în domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul

Pasteur din Paris şi ulterior a intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”,

lucrând alături de Ion Cantacuzino, Mihai Ciucă, I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician

a devenit şi întemeietorul şcolii moderne de bacteriologie clinică. Tehnicile şi metodele de

diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete şi inovaţii care îi poartă numele atât în

ţară cât şi în străinătate.

Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa

românească, pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică.

După 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat în Reţeaua Internaţională a Institutelor

Pasteur şi a Institutelor Asociate ceea ce a permis obţinerea unor rezultate, importante.

INCDMI „Cantacuzino” trebuie să continue tradiţia înaintaşilor şi să îşi menţină poziţia

importantă în cadrul instituţiilor care se ocupă de sănătatea publică la nivel naţional şi

internaţional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 şi respectiv eforturile

depuse în perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important în acest sens.

George Emil Palade (1912-2008)

Absolvent al facultăţii de medicină din Bucureşti, a desfășurat o prodigioasă activitate

ştinţifică, în Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice şi a

fracționării celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniţial cercetător şi ulterior

profesor de biologie celulară al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al

universităţii Yale din New Haven. Ultimul loc în care George Emil Palade a fost profesor a

fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul

celular.   

Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite

(mitocondria în detaliu cu structura membranei și a cristelor, a definit rolul reticulului

10

endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un

articol publicat în 1955, Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronică ce

reprezenta reticulul endoplasmic rugos şi a explicat legătura între cele 2 structuri şi rolul lor

în eliberarea produşilor de secreţie).

Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi

iniţial ”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici)

rezultând altfel denumirea de „ribozomi”.

În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie.

Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut.

Trebuie avută însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii.

Microbiologul, medicul clinician şi asistenta medicală trebuie să aplice cunoştinţele de

microbiologie în practica de zi cu zi. Deşi anumite tehnici pot fi învăţate din rutină,

persoana cu adevărat profesionistă înţelege faptele ştiinţifice precum şi principiile aflate la

baza acestor tehnici. Profesionistul ştie de asemenea în ce mod ar trebui adaptate aceste

tehnici în cazul anumitor tipuri de pacienţi (ex. pentru cei supuşi chirurgiei cardiace,

pacienţilor care au suferit arsuri pe suprafeţe întinse), ce tehnici trebuie utilizate în sălile de

operaţie, de aşteptare şi în instituţiile unde sunt îngrijiţi copii mici sau foarte mici, cum pot

fi modificate acestea în condiţii de urgenţă (de exemplu în caz de război sau alte calamităţi

produse de om sau calamităţi naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor,

populaţiei, de exemplu referitor la imunizări. Un membru antrenat alechipei medicale

poate să diferenţieze adevărul de interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa

„literatură medicală” scrisă pentru publicul larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass

media, dacă are noţiunile necesare de microbiologie.

Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente

interesată, constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o

aplicabilitate a cunoştinţelor microbiologice.

Povestiri Adevarate1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553)

S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu

Nicolaus Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie,

matematică, poezie, geografie, muzică etc.

Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între

ciumă şi tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de această

minte luminată, în 1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere

epidemiologic, în lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi

tifosul exantematic.

A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de

corecte, dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape în totalitate.

11

Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la

Veneţia [Syphilis sive morbus Gallicus(Sifilisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele

se datorează faptului că se presupune că sifilisul ar fi fost răspândit în Italia de trupe

franceze asediatoare]. În primele două volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte

sifilisul; a descris şi luesul ca entitate în cadrul acestei patologii, a discutat modalităţile de

debut şi chiar diferenţele între cele trei stadii ale bolii. Apar menţionate şi informaţii despre

modalităţi de diagnostic şi „tratament” (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur şi

extracte vegetale etc). În această scriere sunt discutate chiar şi metode de prevenţie. În al

treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date privind călătoriile lui Columb în Indiile de

Vest (se pare că boala era foarte răspândită printre băştinaşi) dar şi o poveste din

mitologie, povestea păstorului Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte

mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin această boală.

Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione („Despre contagiune,

boli contagioase şi tratamentul lor”), publicată tot la Veneţia, la vârsta de 68 de ani, include

toate cunoştinţele şi teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri.

În mod uimitor, cu sute de ani înainte ca aceste aspecte să fie studiate şi parţial

demonstrate ştiinţific de către Louis Pasteur, într-o vreme când bolile erau considerate

drept „pedeapsa zeilor”, teoria „miasmelor morbigene” a lui Hipocrate este combătută iar

Fracastoro emite ipoteza conform căreia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul

unor „fiinţe invizibile” [Seminaria morborum (seminţele bolilor)]. După mai mult de 130 de

ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizează microscopul pentru a studia câteva dintre

microorganisme. În plus, Girolamo Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în

organism: a. pe gură, b. prin respiraţie, c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât,

clasifică „contagiul” drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră,

sifilis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă

(„seminţele morbigene” fiind purtate la distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca

în cazul ciumei). Cu toate că a oferit incredibil de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale

au fost în bună parte confirmate ulterior, la acea vreme nu au fost acceptate iar teoria

„miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp considerată ca fiind valabilă.

Cu toate acestea, se poate spune că Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut în istoria

medicinei ca „părintele patologiei infecţioase”.

revenire sus

 

1.1.2. Robert Koch (1843-1910)

Alături de Louis Pasteur poate fi considerat “părintele bacteriologiei”. În 1905 meritele

sale au fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetările în domeniul

tuberculozei.

S-a născut în 1843 în Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen şi

Hanovra iar în 1866 a absolvit facultatea şi a fost numit medic de circumscripţie. A practicat

medicina în mai multe localităţi germane. În 1868 s-a stabilit în Wolstein (astăzi această

localitate se află în Polonia). În timpul şederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis într-un

laborator improvizat în propria locuinţa. Aici a creat celebrele postulate.

12

Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer şi Davaine dar Robert Koch a

fost cel ce a demonstrat că această bacterie e cauza îmbolnăvirilor cu antrax “cărbune”

(nume dat datorită culorii închise a leziunilor din această boală). Prin studiile amănunţite a

descoperit fenomenul de sporulare şi a fost primul cercetător care a folosit tehnica

fotografiei în microbiologie, el fotografiind câmpurile microscopice.

În 1880 a fost angajat în ministerul sănătăţii unde şi-a continuat cercetările avându-l

colaborator printre alţii pe Lofler. În 1891 s-a înfiinţat Institutul pentru Studierea şi

Combaterea Bolilor Infecţioase din Berlin, instituţie care la 30 de ani de la descoperirea

bacilului tuberculozei a primit numele marelui savant.

Infecţia cu Mycobacterium era o mare problemă în secolul 19. Unul din 7 oameni

suferea de această boală, multe dintre îmbolnăviri evoluând nefast, spre deces. În 1881

Robert Koch a izolat bacilul cauzator şi a reuşit să îl cultive pe medii artificiale. În 1901 la

congresul britanic despre tuberculoză, savantul a dăruit organizatorilor 5 eprubete în care

se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care îi

identificase cu 20 de ani în urmă (în 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a

fost internat şi după câteva zile a murit, se pare, datorită unei tuberculoze miliare; la

necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniţial pe animale de laborator

bacteriile provenite din acest material, ulterior reuşind să le cultive şi în vitro; în 24 martie

1882, Robert Koch a făcut publice descoperirile sale privind izolarea şi identificarea

agentului patogen al tuberculozei).

Cercetările nu s-au oprit aici, Robert Koch continuând să aprofundeze studiul

mycobacteriilor dar abordând şi alte microorganisme. După succesul identificării bacilului

tuberculos a urmat o perioada mai puţin fastă, el încercând să folosească iniţial ”Alt-

Tuberkulin” ulterior ”Neu-Tuberkulin” (un filtrat de cultură bacteriană) ca şi tratament.

Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut şi o parte bună, aceste

încercări reprezentând momentul de pionierat pentru evidenţierea hipersensibilităţii de tip

IV, tuberculinică, iar tuberculina va fi ulterior utilizată în diagnostic și studii epidemiologice.

revenire sus

1.1.3. Institutul Ion Cantacuzino

Institutul Cantacuzino a existat cu mulţi ani înainte de a fi primit prin legea din 1921 o

confirmare pe tărâm administrativ. Încă din anul 1904, doi ani după chemarea profesorului

Cantacuzino la Catedra de Medicină Experimentală de la Facultatea de Medicină,

laboratorul său, destinat iniţial exclusiv învăţământului şi cercetărilor pur experimentale,

instalat în câteva încăperi din institutul de Patologie şi Bacteriologie condus de profesorul

Victor Babeş, a fost însărcinat de către Direcţia Sanitară să studieze metodele de preparare

şi valoarea practică a două ”seruri curative” de mare interes pentru medicină, serul

antistreptococic şi serul antidizenteric. Primele încercări de aplicare la bolnavi s-au arătat

foarte încurajatoare; ca atare s-a trecut de la faza experimentală la prepararea pe o scară

mai întinsă și la utilizarea lor în practică.

În perioada 1910-1913 a început experimentarea şi prepararea vaccinurilor contra

febrei tifoide şi holerei asiatice.

13

Rezultatele obținute convingeau şi pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat

întrebuinţarea acestor metode în combaterea epidemiilor de febra tifoida şi holeră, iar

Serviciul Sanitar al armatei a decis aplicarea consecventă a vaccinării antitifoidice la recruţi

realizând prin aceasta dispariţia aproape completă a cazurilor de febra tifoidă din armată.

Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, într-un modest laborator

de învăţământ, în care încăperea cea mai impunătoare - sala de lucrări practice pentru

studenţi - nu putea primi deodată mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului

crea o atmosferă de munca entuziastă şi dezinteresată, o motivaţie admirabilă printre

colaboratori. Personalul tehnic se întărea, numărul asistenţilor benevoli de asemenea. Prin

activitatea practică, laboratorul putea pune la îndemâna studenţilor mijloace de lucru care

nu puteau fi găsite într-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de

fapt. Războiul din 1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate

înființării, așa cum am menționat. De altfel, istoria ”nu se schimbă”; în ultimii 20 de ani

aproape fiecare pas realizat în dezvoltarea sistemului de sănătate publică din România a

”beneficiat” de câte o problemă de sănătate care a demonstrat autorităților (cel puțin

pentru o perioadă de timp) că este necesară o intervenție concretă.

Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o țarăa întregităa, cu o

populaţie de trei ori mai mare şi care suferise pe timpul şi din cauza ocupaţiei străine. În

reorganizarea sanitară a țării, s-a impus, ca o măsură de primă necesitate, organizarea unui

Institut central de seruri şi vaccinuri, echipat în aşa fel încât să corespundă nevoilor

considerabil crescute ale României Mari, institut de producţie, de cercetare dar și de

învăţământ.

Prin Legea din 1921, grație guvernului de atunci, s-a creat o instituţie având

următoarele scopuri:

- să prepare toate serurile, vaccinurile, precum şi alte produse similare, necesare în

profilaxia şi tratamentul specific al maladiilor infecţioase din țară;

- să facă toate lucrările necesare pentru cercetarea ştiinţifică a acestor maladii şi să

stabilească metodele tip pentru serologie şi de microbiologie;

- să servească drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice şi să-și dea

avizul în ce priveşte introducerea în țară a serurilor şi vaccinurilor ”preparate aiurea”;

- să pregătească medici specialişti în microbiologie;

- să tipărească publicaţii periodice în legătură cu activitatea ştiinţifica a acestui Institut,

precum şi cu activitatea medicală şi biologică din întreaga țară.

Institutul prepara şi da spre întrebuinţare numai serurile şi vaccinurile care făceau

dovada eficacităţii lor. În acelaşi timp, în laboratoarele institutului se  cerceta şi se încercau

metodele noi de diagnostic microbiologic şi serologic, sau de tratament.

Una dintre remarcabilele realizări ale cercetărilor din institut a fost realizarea vaccinului

BCG şi începerea vaccinării tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea

numai în cadrul Institutului Pasteur din Paris.

Astăzi în cadrul institutului există laboratoare naționale de referinţă (multe dintre

acestea fiind certificate internațional, de către Organizația Mondială a Sănătății), inclusiv un

laborator foarte performant de biologie moleculară. Producţia încă mai continuă, chiar dacă

14

preparatele pentru uz uman includ în principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut,

INCDMI ”Cantacuzino” a fost una dintre puținele instituții la nivel mondial care a reușit să

producă în timp util vaccinul gripal pandemic.

În clădirea principală se găseşte sala de curs și lucrări practice în care se predă

bacteriologie, noțiuni de imunologie și micologie, pentru studenţii de anul doi ai facultății de

medicină. La parter există sala de curs și seminarii pentru studenţii din anul cinci,

epidemiologie.

Institutul Cantacuzino rămâne cel mai important centru de cercetare din România. În

ceea ce privește capacitatea de producție, existența acestuia este indispensabilă (oricărei

țări). Avem speranța că în ciuda anumitor ”evenimente” din ultimii ani, nu vom vorbi

niciodată despre Acest Institut la timpul trecut, ci doar la prezent și viitor.

15

2.STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

2. 1. CaracteristiciBacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este

clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi:

- rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma

micelii (ex. bacterii din genurileMycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia);

dacă majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii

care pot fi denumite ca paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia);

- flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.);

- lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma).

Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în

comparaţie cu celula eucariotă

Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariotă / celula procariotă)

Celula eucariotă Celula procariotă

Nucleul - prezintă membrană

- are mai mulţi cromozomi

- prezintă aparat mitotic

- nucleul este tipic,

prezintă nucleol

- nu prezintă membrane

- are un singur cromozom, circular

- absenţa mitozei

- nu este tipic ci apare ca nucleoid

Citoplasma prezintă:

- reticul endoplasmic

- mitocondrii

- lizozomi

- ribozomi 80S

- membrana

citoplasmatică conţine sterol

nu prezintă:

- reticul endoplasmic,

- mitocondrii,

- lizozomi

prezintă ribozomi 70S

membrana citoplasmatică nu conţine

steroli (excepţieMycoplasma)

Peretele

celular

- absent sau compus din

celuloză sau chitină.

- nu prezintă glicopeptid

- are structură complexă, prezentând

glicopeptid, proteine, lipide etc.

Diviziune Mitoză diviziune directă (binară)

Capsula Absentă adesea prezentă

Forma2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea:

16

a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat.

Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii

sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi.

Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta

culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea

în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).

Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele

genuri de bacterii, de ex.:

- stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);

- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă

comună (în diplo);

- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;

b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii),

drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite

(Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în

palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);

c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus);

d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător

mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare

(ex. Actinomyces israelli);

e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).

Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule

„mamă” prezintă un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).

În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu

antibiotice etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care

pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o

examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură

proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă

de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.

Dimensiunile2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi

stadiul de dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor,

de exemplu, pentru coci 0,5-2 µm, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 µm. Dintre bacteriile

vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile

atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 µm / 0,2 µm. Rickettsiile,

chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorită dimensiunilor

17

foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10µm. Formele filamentoase rezultate

după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din

genul Proteus pot prezenta „în mod natural” forme filamentoase, de dimensiuni mari.

Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fishelsoni (60-800 µm / 200-500 µm),

cea mai mare bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie

Gram negativă, potenţial vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între  100–300 µm şi până la

750 µm). (1999)

Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului,

fie clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10× şi

un obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplificare a

dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utilizând alte tipuri de microscoape. Spre

exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe

fluorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate fi mai

redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul

referitor la genul Mycobacterium).

Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea

agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira

spp.), inclusiv mobilitatea acestora.

Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica

examenului microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 1.

2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene

Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între

celula procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne

cât şi structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre

celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele

dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite

numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de:

- perete,

- membrană citoplasmatică,

- citoplasmă (cu ribozomi şi facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) şi de

- nucleu.

2. 3. 1. 1. Peretele bacterian

18

Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipseşte la bacteriile din

genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm.

Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid

parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri

polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri

zaharidice:

- acidul N-acetil-muramic (NAM) şi

- N-acetil-glucozamina (NAG).

Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se

consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele

proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc

legături peptidice prin gruparea terminală COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale

libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de

complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană.

Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”)

şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este

acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid

teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la

peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi

sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile

Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul

listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc.

În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire

dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-

20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre

membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul

periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide,

proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la

acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri

esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool-

acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre

bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile,

vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae,

Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc.

Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o

cantitate substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid-alcool (au

culoare roşie pe fond albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen); această coloraţie continuă să

reprezinte o etapă esenţială în diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele

mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor

nucleotidice sau amplificarea genetică). În afară de mycobacterii (în special M.

tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii „atipice” (non-tuberculous mycobacteria,

NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), există şi alte specii bacteriene care pot

19

apărea colorate asemănător după utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul

difteric (C. diphteriae).

Rolurile peretelui bacterian:

- prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc);

- asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni

interioare care pot ajunge până la 20 atm.);

- flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât

prin flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului;

- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul

bacteriilor Gram-negative etc);

- prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi;

- are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal;

- la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-

cicloserina);

- la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul

periplasmic şi la nivelul membranei externe).

Protoplastul (formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică) reprezintă

bacteria Gram-pozitivă după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acţiunea

lizozimului care lizează mureina. În medii hipotone protoplastul se lizează. Este o structură

care nu se poate multiplica.

Sferoplastul reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parţială a peretelui

(conţine o cantitate mai mică de mureină). Lizozimul poate acţiona asupra peptidoglicanului

numai după alterarea membranei externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone

sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica.

Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul,

spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă

un rol în creşterea şi multiplicarea bacteriană.

Formele L

În 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme

„L”, după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme

noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se

lizozim sau penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea

bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism,

anumite infecţii cronice (de exemplu infecţii ale aparatului urinar).

2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatică

Între perete şi citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm;

poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian.

Electronomicrografic apare formată din 2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar.

Este considerată un „mozaic fluid”, compusă dintr-un film fosfolipidic în care flotează

proteine globulare cu extremităţile polare hidrofile expuse spre spaţiul intracelular,

extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri

de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în

20

dublu strat, au extremităţile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele feţe ale

membranei şi extremităţile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al

membranei. Nu conţine steroli (excepţie Mycoplasma spp).

Rolurile membranei citoplasmatice sunt de:

- filtru selectiv, datorită permeazelor (rol în permeabilitate şi transport);

- barieră osmotică;

- a conţine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi);

- a fi sediul majorităţii activităţilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu

intervine activ în procesele de biosinteză);

- excreţie a unor enzime hidrolitice;

- a interveni activ în procese de biosinteză;

- a contribui la formarea septului transversal (rol în diviziunea celulară);

- a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaţa sa.

Asupra membranei pot acţiona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele).

2. 3. 1. 3. Mezozomii

Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice

de care rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura

chimică a membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un

capăt se pot fixa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului

între cele două celule fiice. Au rol şi în formarea septului transversal.

      2. 3. 1. 4. Citoplasma

La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma

bacteriană, intens bazofilă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot

observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structură mai simplă faţă de

citoplasma eucariotelor. Este constituită dintr-un sistem coloidal format din proteine,

enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale şi apă. Conţine în mod

caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, săruri

etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt).

Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă

pot exista şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial).

La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate

mare, este clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular.

2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol

Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea

lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în

citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din

punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de

70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În

subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine

ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S).

Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm

21

(mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii,

aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul

bacterian fiind foarte intens.

Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în

polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un

moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic

mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom.

Biosinteza proteică

Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.

Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa

de baze azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi

aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul

viitoarei proteine.

Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta

această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare.

Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine.

Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.

ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid

poartă numele de ARNm monocistronic.

La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară

pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm

policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor

procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi

multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial

3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură

moleculă de ARNm policistronic.

De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm.

Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de

terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.

Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a

moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei

20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime

specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi

pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon)

complementar codonului care corespunde aminoacidului.

ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii

ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de

aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.

2. 3. 1. 6. Incluziile

Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere

activă. Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile

22

externe. Pot conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai

genului Corynebacterium, la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor

Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la

germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc.

2. 3. 1. 7. Vacuolele

Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o

membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice

şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.

2. 3. 1. 8. Nucleul

Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a

celulei. Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe

preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN.

Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu

catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el

însuşi, superspiralat. Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană

(şi respectiv numărul de perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea

de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E.

coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea

bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor,

pentru ca materialul genetic să poată fi conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie

compactat într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi

diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi

o cantitate variabilă de ARN.

Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari

(ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare.

Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa

cum am menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există

posibilitatea ca înainte ca prima replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în

acest caz celula bacteriană va putea fi meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale

sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai

multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum

se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai multor

cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică

diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta).

Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi

multiplicare.

Codonul

Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de

ADN formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită

secvenţă un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul

ribozomilor.

Cistronul

23

Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine

independent sinteza unui lanţ polipeptidic.

Gena

Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de

nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei

genetice. Poartă înscrisă în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei

proteine specifice, structurale sau funcţionale (enzime).

2. 3. 2. Structuri facultativeStructurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii),

fimbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă).

2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere

Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care

formează în jurul celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.

La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula.

Există bacterii care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S.

pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică

(Bacillus anthracis etc).

La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în

mediu şi poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu

este vizibilă la microscopul optic.

Roluri:

- factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea;

- rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi;

- permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);

- barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;

- conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre

exemplu, în cazul S. pneumoniaeexistă peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E.

coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.

Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că

prin coloraţia cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un

halou necolorat. Există şi coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss.

Structura antigenică a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia

de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri polivalente sau monovalente

anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor.

2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare

Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în

preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU).

Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe

care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).

24

Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal.

Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri

aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este

plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de

natură proteică (flagelina).

Roluri:

- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie,

asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia

opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din

ATP;

- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip);

- în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi

- monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio

cholerae, Pseudomonas aeruginosa;

- lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);

- peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de

exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.

2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii)

Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât

cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la

microscopul electronic.

Există pili comuni, cu următoarele roluri:

- în aderenţa bacteriană (adezine);

- conţin receptori specifici pentru bacteriofagi;

- antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae.

Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia

îndeplinesc rolul canalului de conjugare.

2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare

Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit

la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost

de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani.

Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este

înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale).

„Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.

Roluri:

- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate

transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi

considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de

reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);

- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.

Sporul poate fi localizat:

- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);

25

- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);

- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).

Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia

Gram (locul sporului rămâne necolorat).

Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.

2. 4. Povestiri adevărate2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tipA în

rândul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia

În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent

de îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60

de cazuri (23 confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre

care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri

administrate prin injecţie intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un

preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat

către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au

dezvoltatedem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie.

În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confirmate au existat

legături familiale sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost:

durere şi edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de

aceste semne, pacienţii au prezentat insuficienţă multi-organică. O caracteristică a

sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu

leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase

leucocite tinere, nesegmentate).

Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi

fragmente tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către

laboratoarele de referinţă din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru

prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele

de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis.

Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă

cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită

condiţiilor precare de obţinere, stocare şi transport ale acestora). Autorităţile au emis

ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla în circulaţie şi această

situaţie ar putea fi considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru populaţia

consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de

la pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen)

a fost Clostridium novyi.Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium

perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică

nu s-ar fi gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii

anaerobi să fie implicaţi, izbucnirea epidemică ar fi putut să rămână fără diagnostic

etiologic.

26

Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată

testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a

demonstrat prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate.

Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde

prin realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi

bacteriile sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns

inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în

situaţiile cu evoluţie spre insuficienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială,

reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece

soluţia de heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în

cazul în care soluţia ar fi fost injectată intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către

mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).

În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe

ar fi fost emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri)

antibioterapia empirică cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării

probelor, procentul de infecţii cu etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare.

S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a

alerta comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri.

2. 4. 2. Capsula bacteriană

Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru

izbucniri epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile

meningococice rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea

mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei

este foarte importantă. Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare,

aderând la celulele umane şi invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în

mare parte, un mister.

Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat

de capsula polizaharidică, cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fluidele

extracelulare. Studii recente au arătat că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea

intracelulară.

Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia

subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a

dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement.

Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită”

structurile proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează

germenul de la liză celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte

eficient proprietăţile, atât extra- cât şi intracelular.

Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare

de celule fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi

multiplicării intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care

diminuează capacitatea de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în

celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil

27

mecanism prin care se produce această supravieţuire ar fi cel al rezistenţei capsulare la

peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente

ale sistemului imun înnăscut.

Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate fi legată de o multitudine de

mecanisme, printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a

peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect,

cu oricare din aceste mecanisme. În particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei

pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către capsula sa, polizaharidică.

În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile

necapsulate sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B,

asemănătoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca

model al CAMPs datorită proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a

germenilor Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor

timp de 45 de minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confirmat că

absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe

culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un

mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei.

2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic

Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar

şi pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul

pentru respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul

preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea

rar); informaţiile obţinute pot fi însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu

diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni

rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic

pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a

materiilor fecale, de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu

albastru de metil, s-au văzut (datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu

capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii cu criptococ, care ulterior s-au identificat

după culturi şi repicări repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este că

schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi

îmbunătăţirea stării pacientului.

2. 5. Evaluarea cunoştinţelor1. Alegeţi afirmaţia falsă:

a. Bacilii au formă rotundă şi se adună în grămezi

b. Haemophilus influenzae este un cocobacil

c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot

examina la microscopul optic

d. Aspectul “in diplo” este caracteristic pneumococilor

28

e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care

nu pot fi vizualizate la microscopul optic

2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevărată următoarea

afirmaţie:

a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conţine mureină

b. Membrana celulară este o structură facultativă

c. Nucleul bacterian este învelit de membrană nucleară şi conţine numeroşi nucleoli

d. Capsula bacteriană reprezintă un factor de virulenţă şi favorizează invazivitatea

e. Bacteriile cu flageli sunt imobile

3. Peretele bacterian:

a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile

b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei)

c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive

d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic

e. Conţine antigene capsulare

4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene:

a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului

b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fimbrii

c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană

d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene

e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel

5. Sporii bacterieni:

a. Nu se distrug prin autoclavare

b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative

c. Nu se vizualizează microscopic

d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central

e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene

3. Fiziologia bacteriană3. 1. Constituţia chimică a

bacteriilor3. 1. 1. Apa: procent, rol

Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu

de dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special

29

apă legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice

care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică

numită tonoplast. Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol

în plutirea acestora.

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de

dispersie, este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii

oxidative etc.

Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp

îndelungat. O metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea).

Studiile ştiinţifice au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp

liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire

de peptidoglican. (1) 

3. 1. 2. Substanţele minerale

Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în

funcţie de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în

compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în

structura fosfolipidelor etc).

Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:

·         favorizează schimburile cu mediul,

·         participă la reglarea presiunii osmotice,

·         pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului

difteric, care condiţionează şi producerea de toxine),

·         activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a

potenţialului de oxido-reducere.

Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+.

3. 1. 3. Glucidele

În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar

glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de

roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor

bacterii etc.

Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui

anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei

respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc).

Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).

3. 1. 4. Proteinele

Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine

complexe, cum ar fi:

·         mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul

hialuronic din structuri de tip capsular),

·         cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),

·         nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).

30

Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul

diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare

biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).

3. 1. 5. Lipidele

Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în

funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un

semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai

mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice,

inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând

parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).

Dintre lipidele bacteriene putem aminti:

·         acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),

·         cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate

mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc).

Dintre acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip

IV).

·         fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema

pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului

bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxică.

3. 1. 6. Pigmenţii

Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de

condiţiile de cultivare.

Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul

tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus).

Trebuie să reţinem încă de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este

doar un caracter orientativ şi nu vom clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în

funcţie de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ

privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu

pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi.

După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:

·         cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);

·         paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de

exemplu la S. aureus sau laStaphylococcus epidermidis);

·         cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas

aeruginosa).

În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc.

în cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul

de laborator se poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context

clinic şi microbiologic.

31

Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie

faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată

de P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic.

3. 1. 7. Enzimele

În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de

a elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi

genetici diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic

în funcţie de necesităţi.

După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în:

·         enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;

·         enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea

selectivă), de exemplu permeazele;

·         enzime intracelulare.

În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze,

liaze, izomeraze etc.

După modul de apariţie, enzimele pot fi:

·         constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului);

·         inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi

compuşi apăruţi în mediu).

Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate

taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu;

studierea acestuia poate avea o deosebită importanţă în identificarea bacteriilor.

3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică:

·         plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu

efect asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);

·         unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.

licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B.

polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi

capitolul nr. 48).

3. 1. 9. Vitaminele bacteriene

Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de

exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E.

coli, riboflavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B.

megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa

florei bacteriene intestinale umane.

3. 1. 10. Factorii de creştere

Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe

baza substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat

incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv,

numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare

pentru Haemophilus influenzae).

32

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin

dependente de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât

nu pot fi cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

3. 2. Metabolismul bacterian3. 2. 1. Nutriţia bacteriană

Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea

de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt

substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în

reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.

În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:

·         bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi

·         bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate

enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).

În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:

·          bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie

anorganică şi

·          bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.

 

Nutriţia principalelor bacterii studiate

Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante

pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul

respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile

paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din

genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie).

Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma:

proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de

cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi

legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate

se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.

Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite

macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este

determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru

proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.

După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri

supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi

activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a

biosintezei).

Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de

căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui

singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi

reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice

33

este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine

specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de

la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul

determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc

numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată

variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.

În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori

specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).

De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este

(poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde

de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de

faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de

legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule

reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare

conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie

allosterică) sau creşte (activare allosterică).

Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând

o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se

dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se

îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent

în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa

înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de

receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi

la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi

capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat

experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe

scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie

de sursă).

Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism

care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea

unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie

tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.

Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la

o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie

responsabilă de:

·         chemotaxie;

·         aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);

·         fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);

·         deplasarea spre acceptorul de electroni etc.

 

3. 2. 2. Respiraţia bacteriană

34

Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de

energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea

ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor

pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce:

AH2 + B <=> A + BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă

sau anaerobă.

Respiraţia aerobă (oxibiotică)

În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia

aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la

un oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător

frecvent utilizat este NADPH-ul.

Enzimele catenei respiratorii sunt:

- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);

- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);

- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre

exemplu citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).

NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin

mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).

Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)

cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.

Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)

În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă

anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se

face la nivelul substratului.

Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia

zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere

taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai

mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP,

iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită

de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă deVibrion butyrique, numit ulterior Clostridium

butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de

obţinerea unor produşi finali.

Sinteza ATP-ului

Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de

fosforilare.

În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)

cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.

În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii

fiind metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).

Energetica respiraţiei bacteriene

Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.

Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.

35

Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.

 

Tipul respirator

În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din

mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1):

- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă

numai în prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic.

Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface

H2O2 toxic pentru celula bacteriană; vezi Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de

respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii

lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;

- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium

botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2.

Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au

catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii

folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este

necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut.

- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc)

se dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta

ambele tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau

citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea

bacteriilor studiate.

- anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează

mici cantităţi de O2.

3. 3. Căi metaboliceMetabolismul glucidic

Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt

degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile

monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care

hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au

o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi.

Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:

a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol

de glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;

b). calea pentozo-monofosfaţilor;

c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).

Metabolismul lipidic

Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi

liberi. Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru

degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime

36

specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana

hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză.

Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi

reprezintă surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de

ATP).

Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea

grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin).

Metabolismul proteic

În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite

polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu

capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de

exemplu D-Ala).

Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:

a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi

proprii de catabolism, utile în identificare);

b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Căi biosintetice particulare3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se

realizează utilizând inclusiv structuri chimice care în lumea vie sunt utilizate numai de către

bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic.

3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului

Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr.

3). Începe prin sinteza în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM).

Această structură se ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care

urmează un lanţ de reacţii biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o

reacţie de transpeptidare în care terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc

reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de

transpeptidaze, un set de enzime numite şi PBPs (penicillin binding proteins) care au

atât activitate de transpeptidaze şi carboxipeptidaze, dar controlează şi gradul de legare a

peptidoglicanului (aspect foarte important în diviziunea celulară). La nivelul lor se pot lega

penicilinele şi alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4).

Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza

acţiunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină,

cicloserină etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu

fluidele organismului. În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor

depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice

compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va

putea produce liza bacteriană (efect bactericid).

3. 4. 3. Sinteza LPZ

37

Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de

subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt

transferate în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate

componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice.

3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare

Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei

extracelulare (poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide

transportoare de provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de

condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest

lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu.

3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă

Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de

rezervă (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o

bacterie la alta.

3. 5. Cultivarea bacteriilor3. 5. 1. Definiţii utile

Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un

anumit biotop.

Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă

(diviziune binară).

Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări

în cultură pură.

Temperatura de dezvoltare

În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;

- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi

apropiate de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la

temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi

nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se

corelează cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se

topeşte sau se solidifică lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi

joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află

în fază lichidă sau solidă, ei afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct

capacitatea de a funcţiona.

- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la

temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt

adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii

graşi din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor

să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.

38

- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi

o temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.

Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.

3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană

Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea

volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se

ajunge la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte

raportul optim dintre volumul şi suprafaţa celulei.

Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu

reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).

3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor

Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la

pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior

să îi putem studia diferitele caractere în vederea identificării.

Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:

·         obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile

propuse,

·         prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi

·         izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în

culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”.

Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul

„însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu

de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales

animale de experienţă folosim termenul „inoculare”.

Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide

sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi

multiplicării bacteriene se numesc medii de cultură.

Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă

numele de cultură bacteriană.

Mediile de cultură

Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale.

Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot

fi cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale

de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule.

Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale.

Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere

necesari), să fie sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită

presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.

Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt

capabile să le sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi

mici. Îndeplinesc anumite roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot fi grupați în:

1.      Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN);

39

2.      Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;

3.      Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime.

Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot

sintetiza purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de

carbon.

Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte.

Aceşti compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură.

Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci  sunt asimilaţi de către bacterii pentru

a-și îndeplini rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de

creştere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numiteauxotrofe. Spre

exemplu, o tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-

triptofan şi va fi desemnată E. coli trp- (2).

Clasificarea mediilor de cultură artificiale

Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după

complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de

transport, de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de

cultură simple (agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe

(agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)

Medii speciale

Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite

bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura

nr. 5).

Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea

altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de

potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care

bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă) (Figura nr. 6)

Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând

dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca

mediu selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau

mediile de îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).

Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate

fi sau nu metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu,

agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-

pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte

exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate

indol uree). (Figurile nr. 7-10).

Colonia izolată

Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este

totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie

este o clonă bacteriană.

Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin

dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei

40

porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se

resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă

neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se

resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge

prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după

trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.

(Schema nr. 1)

Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare

pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia

unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare

(asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30

minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz

cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară

incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate

reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în

condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate

(Figura nr. 11).

Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi

Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu,

care nu este reînnoit şi continueatunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O

populaţie bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă

se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi

evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit

chemostat sau turbidostat).

Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în

concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de

cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul

limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare

constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele

sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare

a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).

În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.

Timpul de generaţie

Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu

raţia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de

generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este

determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru

majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie

poate avea o valoare între 12-27 ore.

Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene

Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial.

Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie

41

caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare

logaritmică; faza staţionară şi faza de declin (Figura nr. 13).

Faza de lag

Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la

condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie

incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu

se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această

fază este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului,

timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru

sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza

a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu. (2)

Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)

Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva

mai mari), citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt

foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau

pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială

durează aproximativ 2-3 ore.

Faza staţionară

Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor

care sunt distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de

creştere devine nulă.

Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea

germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor.

Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile.

Faza de declin

Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv,

se produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi

butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul

celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale

de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care

permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de

sporogeneză devine foarte intens.

Aspectul culturilor pe medii solide

Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea

bacteriilor. Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri

definitive de specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi

în contextul general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc

într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea

între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează:

·         dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici,

sub 1 mm),

·         conturul (circular, lobat, zimţat),

42

·         relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),

·         suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),

·         culoarea (pigmentate, nepigmentate),

·         opacitatea (transparente, opace),

·         consistenţa,

·         aderenţa la mediu,

·         prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14)

Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect

strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie

salină fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată.

Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E.

coli etc). (Figura nr. 15)

Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate.

Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este

conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis,Corynebacterium

diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o

enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex.

aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai

târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar

identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă. (Figura nr. 16)

Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de

bacteriile care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17)

Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.

În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom

putea obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura

se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive.

Fenomenul de „invazie” poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri

biliare, tiosulfat de sodiu etc.

Aspectul culturilor pe medii lichide

Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l.

Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect

particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la

suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5.

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen

mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)

Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede,

formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul

difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)

Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea

culturilor bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul

microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 2.

43

3. 6. Povestiri adevărate3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... născută dintr-o mică neglijenţă

Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a

descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja

cunoscut drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită

descoperirii lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de

neglijenţă în activitatea de laborator.

Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior,

contaminate cu un fung din genulPenicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de

dezinfectat. Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii

sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a

observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care

bacteriile nu s-au dezvoltat.

Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu

proprietăţi bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest

extras penicilină.

A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929.

Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui

extract, şi în anul 1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit

penicilină.

Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul

Howard Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.

3.6.2. O fostă rickettsie rescrie vechile clasificări

În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din

mediul intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre

exemplele stereotipe de bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artificiale.

Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă

minuţioasă de studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au

evoluat progresiv: într-o primă etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artificial, care

reproducea condiţiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în

care Coxiella spp. se multiplică în celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit

ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii şi-a putut desfăşura activitatea

metabolică timp de aproximativ 24 de ore.

Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria

este microaerofilă. Au adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidified Citrate

Cysteine Medium).

Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artificiale ar putea permite studierea

factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de

abordare pentru alţi germeni strict intracelulari. (3-4)

3. 7. Evaluarea cunoştinţelor44

La următoarele întrebări alegeți un singur răspuns corect:

1. Care dintre următoarele bacterii este cromopară?

A. Staphylococcus aureus

B. Staphylococcus epidermidis

C. Pseudomonas aeruginosa

D. Escherichia coli

E. Bacillus anthracis

 

2. Unul dintre următoarele este un microorganism strict aerob:

A. Clostridium tetani

B. Clostridium botulinum

C. Bordetella pertussis

D. Escherichia coli

E. Staphylococcus aureus

 

3. Penicilina se leagă la nivelul:

A. hidrolazelor

B. oxidoreductazelor

C. izomerazelor

D. permeazelor

E. transpeptidazelor

 

4. Se cultivă numai pe gazde vii:

A. Staphylococcus aureus

B. Chlamydia trachomatis

C. Streptococcus pyogenes

D. Streptococcus pneumoniae

E. Haemophilus influenzae

 

5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorită prezenţei

unui substrat?

A. Mediu electiv

B. Mediu selectiv

C. Mediu diferenţial

D. Mediu Lőffler

E. Mediu de îmbogăţire

45

4. Acţiunea factorilor fizici, chimici şi biologici asupra bacteriilor

4. 1. Definiţii de bazăSeptic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei

plăgi).

Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau

nepatogeni.

Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului

ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor,

mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc.

Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de

pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice,

netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO40,1%, detergenți

cationici etc).

Contaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea

radioactivă) care se referă, în general, la contactul cu microorganisme condiţionat

patogene sau patogene (capabile să producă infecţii sauboli infecțioase ).

Decontaminarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici / chimici pentru a îndepărta, a

inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau

46

patogene de pe suprafeţe sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o

sursă de infecţie sau de transmitere a infecției, iar obiectele sau suprafeţele să poată fi

manipulate şi / sau utilizate în siguranţă.

Sanitizarea reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice.

Prezervarea presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse

farmaceutice, vaccinuri, alimente etc.

Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fizici şi / sau chimici pentru a îndepărta

murdăria (materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte,

prin procedee mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru

utilizare în siguranţă sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.

Detergentul este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot fi anionici,

cationici, amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană.

Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă.

Echipamentul de protecţie este un echipament special (îmbrăcăminte, mănuşi, ochelari

etc) purtat de personalul care manipulează produse dezinfectante şi realizează dezinfecţia.

Enzima este o proteină care descompune murdăria într-o formă care poate fi uşor

îndepărtată de produsul de curăţare. Are rol de catalizator pentru reacţie, mărind puterea

de curăţare a produsului. De exemplu: amilaza acţionează asupra urmelor de amidon;

lipaza acţionează asupra urmelor de grăsimi şi uleiuri; proteaza acţionează asupra materiei

proteice.

Produsul de curăţare este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie

organică şi/sau anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, dar nu prezintă activitate

antimicrobiană (bactericidă, virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de

contaminare microbiană.

Spălarea mâinilor este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce flora

tranzitorie prin acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun (Figura nr. 1, Film nr. 1).

Factori care influenţează eficacitatea metodelor de control:

- mărimea populaţiei bacteriene;              

- timpul de expunere la agentul decontaminant (creşterea timpului de expunere creşte rata

distrugerii);

- efectul concentraţiei, a temperaturii și a pH-ului (o concentraţie mai mare creşte rata

distrugerii);

- stabilitatea agentului;

- structura microorganismului etc.

Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor)

din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor

agenţi fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative

asupra ţesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea bolilor infecţioase.

Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune

directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona

asupra florei rezidente.

47

Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu

acţiune directă asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune

asupra florei rezidente.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge

bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari

necapsulate.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge

bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile.

Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiţii bine

definite de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi

reprezintă un potenţial sterilizant chimic (Figura nr. 2).

Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru

sterilizarea dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un

sterilizant chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de

supravieţuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenţei unui singur

microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu

1/1.000.000).

Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant

este eficient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi eficacităţii

antimicrobiene.

Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul

dezinfectant este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat.

Perioada de timp în care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii.

Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor

patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un

mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie

să fie sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie

sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:

- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);

- Metode de sterilizare prin filtrare;

- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi

- Metode chimice de sterilizare.

Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi

metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul

de microbiologie.

Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să

fie sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate,

necontaminate) urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor

contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale

etc. trebuie curăţateperfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste

materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de

laborator este colectată în recipiente speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele

48

vor fi menţinute în amestec dezinfectant până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi

acele (deşi este necesară utilizarea pe scară largă a seringilor şi acelor de unică

întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute,

se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor spăla cu jet de apă pentru

îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3).

Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi

izolate (aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot fi

furnizate în seturi de instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se

face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de

unică utilizare (”disposable”) conferă un plus de siguranță, în pofida unui preţ relativ ridicat.

Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării, prin indicatorii fizici (ex.

termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus

stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacităţii sterilizării cu

ajutorul radiaţiilor, pot fi utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici

Cuprins:

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate

4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scazute

4. 2. 1. 3. Filtrarea

4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc)

4. 2. 1. 5. Ultrasunetele

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate asupra microorganismelor

În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:

·         mezofile (temperatură optimă 30-37ºC),

·         psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi

·         termofile (temperatură optimă 50-60ºC).

Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se

produce după atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare,

mai ales a punţilor de hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare

49

nativă. Ca urmare protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai

sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt

liofilizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul

său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură uscată și

umedă.

 

Sterilizarea prin căldură:

a). Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea

structurilor bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice:

a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi

menţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care

urmează a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau

pentru spatulă (Figura nr. 5, Film nr. 2).

 

Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge

temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient

de sticlă (tub, eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă

sterilizare.

a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr.

6). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui

termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii

în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).

Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă

trebuie să atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot

exista și alte variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan,

pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru

instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la

decălirea oţelului) etc.

Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc,

vată, bumbac, fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din

laborator.

a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există

anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În

cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare

respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea

aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de

spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind

stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră.

În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări

servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea

50

fi supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi,

cadavrele animalelor de experienţă etc.

b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca

mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite

substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical

(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de filtrat etc.

b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi

pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă

realizează

·       la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,

·       la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv

·       134ºC la 2 atmosfere.

Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu

un capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă

sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).

Există mai multe tipuri de autoclave:

- autoclave cu perete simplu

·         verticale

·         orizontale

- autoclave cu manta de aburi

·         verticale

·         orizontale.

În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu,

vertical, la care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de

sterilizare de jos în sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de

un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul

superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi

unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele

există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când,

accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru

evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub presiune,

autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când

presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus

într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de

căldură.

În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă

de metal perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar

faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea

apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:

·                      verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie

până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează

(recomandabil se va utiliza apă distilată);

51

·                      aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate

corespunzător;

·                      închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care

este dotat autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;

·                      conectăm sursa de căldură;

·                      deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne

aer în cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind

mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va

atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;

·                      închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu

de vapori;

·                      presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul

manometrului; atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm

sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata

sterilizării (de ex. 30 minute) ;

·                      după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm

autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii

atmosferice;

·                      deschidem lent robinetul de vapori;

·                      deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;

·                      lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;

·                      atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate

materialele sterilizate.

b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură

umedă care evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin

la 56-100ºC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care

permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele

vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin

încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc

germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi

utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu

se va depăşi în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare

se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.

b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate

în anumite situaţii.

Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă

durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC),

o pasteurizare medie (15 minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-

90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.

Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de

sterilizare, iar mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30

minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii

52

bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei

metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.

^inapoi sus

4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor

Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La

temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată.

Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea

germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa

4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o

durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de

identificare etc.

În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele

posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene.

a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin

formarea de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;

b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în

masă a apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;

c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia

(deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi

păstrată în fiole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

^inapoi sus

4. 2. 1. 3. Filtrarea

Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea

unui lichid printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul

respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare.

De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă,

azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din

ce în ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi

0,025 mm (Figura nr. 11). În vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un

recipient în care se introduce lichidul care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va

colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă

de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin membrana filtrantă.

Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea filtrării.

Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat

filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III),

filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).

Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de

cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la

temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.

^inapoi sus

 4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide

prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile

53

în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre

aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi

atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete de siguranţă biologică şi dorim să

sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care există Mycobacterium

tuberculosis. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de

ex. şi în instituţiile sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13).

Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente,

seringi de unică întrebuinţare etc).

^inapoi sus

4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă

a conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se

mişcă energic şi se izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii

la 50-80ºC. Sporii rezistă acestor efecte.

^inapoi sus

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică

Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra

unor bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta

devine turgescentă şi peretele bacterian cedează.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici

Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte

substanţe chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic

selectiv.

Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,

alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.

Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.

Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.

O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior,

trebuie să existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de

laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin

spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge,

înainte de spălare se vor dezinfecta.

Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de

acţiune, după cum urmează:

a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele,

alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru

antiseptizarea tegumentelor).

b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):

hipermanganatul de potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de

hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi 54

derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi

halogenaţi cu potență mai mare, cum ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -

C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea concentraţiei

corespunzătoare.

c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):

metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu

merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal

(exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], grupările alchil ale formaldehidei,

glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc.

d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări

limitate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se

măsoară activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic),

crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc],

detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de

exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de

exemplu propilenglicolul)].

e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru

de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.

Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi,

hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de

substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor

cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să

aibă concentraţia corespunzătoare, să fie aplicată pentru o durată de

timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică (de

ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în

funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).

În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim

să menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există

numeroase substanţe şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.

Hipocloriţii:

soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),

concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor

activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni,

fungilor (100 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);

efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special

proteine), maselor plastice, detergenţilor.

Derivaţii fenolici:

din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc

ca atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;

soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);

55

concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri

(ex. HIV este inactivat de soluţia 0,5%);

efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.

Glutaraldehida:

cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;

are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor

este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;

datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul

substanţelor prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;

nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de

expunere; ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o

perioada mai mare de timp în containere menţinute închise.

Iodoforii:

sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;

au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni,

fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);

sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;

pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.

Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):

exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea

hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);

sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;

acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt

supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament

electronic etc.);

·         fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se

menţine o presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi

combinat cu această substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi

combinarea cu hidrocarburi fluorinate.

indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;

există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară

efecte carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea

întregului organism);

sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură,

umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la

jumătate timpul necesar pentru sterilizare).

4. 2. 3. Produsele biocide56

Directiva 98/8/CE defineşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active

şi preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în

care sunt furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă

şi să prevină acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism

dăunător, prin mijloace chimice sau biologice” (vezi directiva CE).

Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub

formă de pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect

biocid.

Produsele biocide includ:

produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a

echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora;

produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin

imersie;

produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante,

săpunurile antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare

antibacteriene / antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după

cum sunt denumite de producător);

produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală, ş.a.;

şerveţele umede dezinfectante,

detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau

inhibă multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme).

În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus

thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid.

4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici

4. 2. 4. 1. Interrelaţiile microbiene în cadrul nişelor ecologice proprii

În natură microorganismele nu se dezvoltă izolat. Relaţiile pot fi de comensualism,

simbioză sau antagonism, noţiuni care vor fi prezentate ulterior.

În cadrul relaţiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalităţii mai mari a speciilor

antagoniste sau elaborării de către specia antagonistă a unor substanţe nocive pentru

speciile concurente. Aceste substanţe pot avea (ex. antibioticele şi bacteriocinele) sau nu

(ex. acidifierea mediului) acţiune selectivă.

4. 2. 4. 2. Bacteriofagul

Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7

cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai

Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfiinţează în România un

Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a

virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14):

57

1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu

catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic);

fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150

gene;

2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie,

ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:

- cilindrul axial;

- teaca cozii;

- placa bazală (cu croşetele de fixare);

- fibrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).

Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în

studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.

Relaţii bacteriofag-bacterie

Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:

- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);

- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).

Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.

Ciclul litic are mai multe etape şi anume:

1. Adsorbţia: Ataşarea este specifică. Există receptori strict specifici la nivelul

bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este

iniţial reversibilă (prin fibrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia

fagică modifică permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.

2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele

bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian,

ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;

3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată

şi preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează

un număr însemnat de proteine virale.

4. Maturarea (ansamblarea) fagului

5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi

eliberarea bacteriofagului matur, virulent.

Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi

până la realizarea lizei celulei bacteriene.

Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene

·         în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva

zeci de minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;

·         pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei

zone de liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;

·         dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană,

iar tulpina respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor și această suspensie se

amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri;

58

·         bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi

eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi

ciclul se reia;

·          o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în

timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem

observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii

nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii

virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii

temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic)

 

Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleaşi etape, iniţial.

După adsorbţie şi penetrare, ADN-ul fagic:

·         fie se integrează liniar în cromozomul bacteriei gazdă şi se replică sincron cu

aceasta,

·         fie se circularizează şi ataşat de membrana citoplasmatică se replică sincron cu

diviziunea bacteriei.

Bacteria a devenit lizogenă, se reproduce şi transmite descendenţilor fagul latent

(profag, fag temperat). În anumite condiţii profagul poate deveni fag virulent. Fagul

temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat

(K12).

Proprietăţile bacteriei lizogene:

1. este imună faţă de un fag omolog profagului;

2. pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:

·         transducţia;

·         conversia genetică (cu producerea de exotoxine de către unele bacterii

lizogenizate, cum ar fi toxina difterică, toxina scarlatinoasă, toxina botulinică de tip C etc);

·         recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de doi fagi diferiţi, dar

înrudiţi, eliberează la sfârşitul ciclului litic pe lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care

însumează unele din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;

·         inducţia fagică (sub influenţa unor agenţi inductori, de ex. raze UV, sau spontan,

profagul îşi recâştigă virulenţa, devine fag virulent, şi produce liza bacteriei respective).

Bacteriile lizorezistente nu permit infecţia cu un fag fie datorită lipsei receptorilor

specifici, fie datorită unei stări de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii virulenţi

omologi profagului găzduit.

Fagul defectiv reprezintă profagul care persistă indefinit în stare latentă (nu se

reactivează).

Aplicaţii practice ale fenomenului de bacteriofagie:

·         fagii virulenţi sunt un element de echilibru ecologic în mediul natural de viaţă al

bacteriilor (în nişa ecologică respectivă);

·         fagii temperaţi pot avea un rol deosebit în reasortarea materialului genetic al

bacteriilor, întrucât atunci când se detaşează (inducţie) de cromozomul bacterian pot

antrena porţiuni din ADN-ul bacterian;

59

·         fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorită

specificităţii relaţiei fag-bacterie);

·         anumite mutante ale fagilor se folosesc în ingineria genetică drept vectori ai ADN

recombinant (ex. fagii Charon Lambda);

·         fagii reprezintă un model pentru studii teoretice şi practice privind virusurile şi

oncogeneza, precum şi alte aspecte ale biologiei moleculare;

·         s-au evidenţiat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic şi

antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilităţii la un anumit tip fagic) este una

dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic şi epidemiologic, pentru

identificarea lanţurilor de transmisie a germenilor şi pentru determinarea originii unei

epidemii.

4. 3. Povestiri adevărate4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană

În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe

continentul american, motiv pentru care iniţial a fost dificilă stabilirea cauzelor.

Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire

la raportul risc / beneficii adus declorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi

istoria epidemiei de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate fi influenţată

sănătatea publică de către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod

negativ).

Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor

microorganisme ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de

tipul trihalometanului. În USA se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei

substanţe.

Diverşi oficiali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca

metoda clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit

multă vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă

clorinarea apei va fi stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au

ajuns să prezinte o situaţie foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3

milioane de cazuri de holeră soldate cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a

afirmat că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a

precipitat apariţia unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui

enorm număr de decese datorate infecţiei cu Vibrio cholerae.

A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe

următoarele idei generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care

să se adreseze tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce

îţi propui şi alege varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu

eşti sigur de calea pe care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează

cele mai mici probleme mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează

rezultatele şi asigură-te că iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o

60

problemă şi e. consultă-te în permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile

pe care le-ai stabilit.

Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră.

În final, reprezentanţi oficiali din Peru au afirmat că au decis să aplice clorinarea

intermitent şi nu continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea

continuă) şi nu au fost influenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei

cancerului.

Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că

epidemia de holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi fiind

reprezentaţi de: a. clorinarea intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau

amatoristic făcute la linia de aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor

ilegale de irigaţie la liniile de aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a

avut o presiune scăzută sau nu a existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi

multiplicarea bacteriană este favorizată; e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii

neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor canalizări construite corespunzător, care au permis

refularea apei din zonele poluate în reţeaua de apă potabilă etc.

Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre

aceştia a fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile.

            Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul

44. 8. 2.

4. 3. 2. Epidemia de holeră din Dhaka - bacteriofagii

Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini

de Vibrio cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice

şi de mediu obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în

Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea

limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în

sursele de apă contaminată, sau chiar şi în cazul unor persoane infectate.

Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifici: a. în cadrul

relaţiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior

densitatea bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica

exponenţial şi densitatea bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire

epidemică (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu atât mai mare cu cât densitatea

bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea

epidemică este datorată multiplicării bacteriene, necorelat cu diminuarea densităţii fagice,

introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar putea reduce amploarea izbucnirii

epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia.

În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se

stabileşte între rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.

În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidenţa

infecţiilor, b. densităţile tulpinilor deV. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la

streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifici pentru această tulpină (JSF4),

atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă.

61

Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut fi uşor

monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.

Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de

consumul de apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi

interacţionează independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice

au creat condiţiile unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a

vibrionilor în sursele de apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă,

s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea

rezervorului datorită igienei precare şi astfel epidemia s-a amplificat. După un timp

producţia de fagi a început să crească, datorită concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi

în persoanele infectate. Amplificarea densităţii fagice a dus la un declin al densităţii

bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane infectate, până la dispariţia

cazurilor.

Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi

posibilitatea ca fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi

să ajungă în rezervor (datorită lipsei de igienă). Această amplificare (numerică şi

funcţională) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea /

controlul epidemiilor de holeră.

5. Genetica bacteriană5. 1. Suportul eredităţii

Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.

Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic).

Molecula de ADN conţine codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor

proteine şi se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea

funcţională a eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.

Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu

bacteria „mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură

(având la dispoziţie nutrienţii necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de

pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.

Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui

fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fie prin

apariția spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea,

substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului.

Structura acidului dezoxiribonucleic

ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.

Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G)

sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic.

62

Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al

moleculei adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în

baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită

compoziţie care diferă la diversele specii.

Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a

citozinei şi guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele

eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în

funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în

decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor în general şi a

omului în particular.

Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost

folosite drept fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina fiind

susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este

posibil să fi evoluat în medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor

temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G s-ar fi dezvoltat în locuri mai

protejate.

Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în

funcţie de specie, dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.

Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest

raport diferă la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium

perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7%

la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a

fost precizat de către diverși autori, compoziţia de baze azotate este un index

taxonomic. (1)

La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La

bacteria intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă

de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene

deja secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este

extrem de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din diametrul celular.

ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele

şi complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de

hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a

fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este

cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-

ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei genetice.

Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările

lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe

care au confirmat rezultatele obţinute de Griffith, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc

Carthy demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă

materialul genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la

ribovirusuri).

63

La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale,

datorită legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura

depăşeşte 65ºC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să

se desfacă şi rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică).

Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC.

Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar

prin acest proces se poate stabili relaţia filogenetică între două specii (în funcţie

de procentul de renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E.

coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelaşi izotop (ex.

C14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va fi fracţiunea din ADN

care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza

brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât

denaturarea.

Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie în

tehnologia ADN-ului recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice între diferite specii.

Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad

de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).

 

Genom. Genotip. Fenotip

Genomul reprezintă suma genelor unui organism.

Totalitatea informaţiei genetice a unui organism se numeşte genotip.

Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în

interacţiune cu mediul ambiant se numeşte fenotip.

Funcţiile ADN-ului ca material genetic sunt:

- conservarea informaţiei genetice;

- replicarea;

- transcrierea şi traducerea materialului genetic;

- protejarea materialului genetic propriu („self”);

- reglarea şi controlul activităţii celulare.

Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente

Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic

urmată de diviziune.

Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula

parentală şi identice între ele, pe bază de complementaritate (replicare

semiconservativă). După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene,

fiecare catenă serveşte drept matriţă pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este

una dintre cele mai importante reacţii din lumea vie. Watson şi Crick au fost primii care au

propus modelul semiconservativ de replicare a ADN.

În celula care se dezvoltă rapid, există posibilitatea ca înainte de terminarea primei

replicări să se iniţieze încă o replicare. În acest caz celula bacteriană va putea

64

fi merodiploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori decât în

mod normal) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori decît în

mod normal).

În general, dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa

cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa

cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o

informaţie genetică diferită, pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial (deci sunt

identici cu acesta).

 

Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)

In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare

independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula

eucariotă este diploidă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie să

fie replicat.

Repliconul bacterian este bicatenar şi circular, caracterizat prin:

- o secvenţă nucleotidică specifică marcând începerea replicării;

- gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;

- o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.

Exemple de repliconi:

- cromozomul şi plasmidele bacteriene;

- genomul bacteriofagilor.

Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O

genă structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării

(o proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în

momentul când se ajunge la dedublarea cromozomului.

Cromozomul bacterian funcţionează ca un replicon, fapt dovedit de experienţa în care

fragmentele de ADN introduse într-o celulă bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot

replica dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor putea fi replicate odată cu întregul

cromozom în cazul în care sunt integrate în cromozomul bacterian.

Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică”

apariţia de nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de

eveniment nucleotidul este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este

realizată cu ajutorul ADN-polimerazei I).

5. 2. Hibridizarea acizilor nucleiciReacţia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorită complementarităţii

nucleotidelor (structura primară). Prin această tehnică se poate demonstra înrudirea sau

eventual identitatea a două microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a

secvenţelor nucleotidice.

Din punct de vedere tehnic, cultivăm o bacterie de referinţă (cunoscută) în aşa fel încât

să putem marca ADN-ul cromozomial (însă uneori aceste experienţe se fac prin marcarea

65

ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate fi reprezentată de cultivarea în mediu

cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul

extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente monocatenare.

ADN-ul dublu catenar se reface, dacă fragmentele de ADN (ţintă) ale bacteriei testate au

secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sondă moleculară) de referinţă.

Cu cât gradul de complementaritate dintre sonda moleculară şi ţintă este mai mare, cu atât

structura hibridă formată va fi mai stabilă şi mai greu de disociat. Actualmente sondele

moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.

Utilitatea hibridizării acizilor nucleici

Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării

sondelor nucleotidice, care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme

sau numai unii determinanţi genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat

de specificitatea sondei utilizate. Se apreciază, că pentru a elimina riscul unei hibridizări

întâmplătoare, sonda nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea geneticăconceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis,

dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial.

Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus

la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de

polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR).

ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN,

întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca

„matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer”

(amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt

complementari pentru două secvenţe specifice şi diferite ale ADN-ului ţintă.

Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este

denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care

sunt furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de

ADN-polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor

rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare

dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de

ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii, dacă procesul se repetă de 10 ori şi

la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea

loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în

denaturarea prin căldură (la 94-96ºC), ataşarea primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului

(la 65-75ºC), folosind ADN-polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o

bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus

aquaticus.

Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică

66

PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale

fundamentale.

Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de

recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea

datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator

poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între

probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima

variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de

biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile

erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ)

la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a

rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat.

Principalele măsuri de precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru

separate pentru manipularea produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea

celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi

fără ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă

cu flux laminar de aer.

Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-

ul dublu catenar contaminant.

Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de:

includerea unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-

3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat

din RT-PCR (transcriere inversă).

Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase

PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.

În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt

detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în

situaţia unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu

citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme

decât sunt identificate antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în

identificarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic)

precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor

enterovirusuri.

Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare

prin amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile

identificării agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei

(Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei

(Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis),

gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei

(Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter

pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae),

septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei

67

(Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative

bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt implicate

microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se

izolează relativ dificil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând

pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identificării fenotipice

clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de

altă parte,Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de cultură. Cu alte

cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară.

Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor

grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis

carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cuCoccidioides

immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei

moleculare în domeniul afecţiunilor produse de fungi.

În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de

diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine

parazitară (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum)

sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).

Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în

diagnosticul sau în identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod

suplimentar dorim să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei

moleculare (hibridizarea moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau

neradioactiv, amplificarea genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de

lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de

o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de

ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar

zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în care este necesar

să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte de care are loc o

revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând ADNc); Nested PCR (în care are

loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferiţi) etc. Pe de

altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca o completare esenţială a

unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR;

DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR,

single universal primer-PCR; spoligotyping etc).

5. 4. Organizarea genomului bacterian

Plasmidele

Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:

68

1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi

2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:

- plasmidelor şi

- elementelor genetice transpozabile.

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic

independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul

bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt

transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa

200 kb. Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide

liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există şi

plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar

reprezintă de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate

de ex. la Staphylococcus aureus).

Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în

citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F,

bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă

(de exemplu plasmida R, Col, F etc).

Clasificarea plasmidelor

În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în:

1. plasmide care codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni:

- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae);

- plasmidele de rezistenţă la UV etc.

2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni:

- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică)

etc.

3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:

- hemolizine;

- factori de colonizare;

- enterotoxine sau alte exotoxine etc.

4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare:

- în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu

potenţial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi

dezvoltarea în aceste condiţii se numesc plasmide degradative;

5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine

respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;

6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.

Plasmidele R

Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul

sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite

din: 

- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;

- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).

69

Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două

tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia).

Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia

mediată de bacteriofagi.

Plasmidele „Col”

Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice

de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).

Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare

genetică, transducţie fagică sau prin conjugare.

Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia

omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.

Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)

Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donoare de material

genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) şi

enzimele necesare transferului de ADN.

În funcţie de prezenţa plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de

modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru

categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’.

Bacteriile F -

Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se

comportă ca receptoare de material genetic.

Bacteriile F +

Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule

„masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.

Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)

Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în

cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvenţă

de conjugare şi recombinare. De obicei prezenţa factorului F integrat determină transferul

unui număr variabil de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F.

Bacteriile F’

Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate

recombinant) care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din

acesta, încorporând în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de

„mascul” şi se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’).

Elemente genetice transpozabile

O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă

îşi menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de

la o poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite

(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc la nivelul oricărui

replicon, la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone

specifice unde se va insera (zone „calde”).

70

Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în

trei categorii:

- secvenţe de inserţie (IS);

- transpozoni (Tn);

- bacteriofagi.

Secvenţele de inserţie (IS)

Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în

afară de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor pot

apărea modificări în expresia unor gene sau modificări în rata incidenţei deleţiilor în

regiunile adiacente situsului lor de inserţie.

Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită

importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS6110 se întâlneşte în una sau mai

multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate fi pus în evidenţă prin reacţia

PCR pornind fie de la cultură, fie chiar şi de la produsul patologic, permiţând un diagnostic

mai rapid.

Transpozonii (Tn)

Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă

gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:

- rezistenţa la antibiotice;

- capacitatea de sinteză a unor enzime;

- producerea de enterotoxine;

- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K88 la E. coli);

- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.

Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de

determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a

fost identificat la o tulpină de E. coli. El codifică 3 elemente: tnpA- cu activitate de

transpozază, rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate

beta-lactamazică.

Bacteriofagii

Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că

a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură

lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la

„întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului

nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o

parte din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb)

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacteriană

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un

singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară

transferarea de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor 71

(„acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fie

fac parte din aceeaşi specie fie fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt

diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini

din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune

modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor

ei şi pot exista în principiu două variante:

- variabilitatea fenotipică şi

- variabilitatea genotipică;

Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ,

care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.

Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic

(cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenţilor.

Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:

- mutaţie;

- transfer genetic urmat de recombinare genetică.

Mutaţia

Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene,

ducând la modificări ale mesajului genetic.

Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:

- substituţii;

- inversii;

- inserţii;

- deleţii.

Mutaţia spontană

Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil

se numesc mutaţii spontane.

Mutaţia indusă

Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii

ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi

mutageni, se numesc mutaţii induse.

Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.

Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui

singur codon.

Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta

secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).

Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea

acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.

Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a

secvenţei bazelor nucleotidice persistă.

Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o

bacterie receptor sunt:

- transformarea;

72

- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);

- conjugarea.

Transformarea

Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber

provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie

„competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.

Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare

la virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.

Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a

ciclului celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin

recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un

caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).

Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt

„natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară

tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.

Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:

- transducţie;

- conversie lizogenică.

Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau

extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un

fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte

transductant.

Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au

proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în

imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.

Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele

cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod

accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate

transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare

număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.

Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc

un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C.

diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea

toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A

este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifică un anumit produs

din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică

leucina).

Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic

(cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare

directe. Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.

Receptorii specifici

73

Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de

suprafaţă atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite

„recunoaşterea reciprocă”.

Fiziologia conjugării bacteriene

După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F+ formează cu bacteriile F- „perechi

de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul

de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul

transferat poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la

apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevărată„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv”

Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o

cunoaştere aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate fi utilă atât în obţinerea unor

diagnostice de mare precizie, cât şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în

medicina legală.

Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în 2001 în urma atentatelor teroriste

din SUA, când o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit plicuri având un

praf alb sau maroniu, care în unele cazuri (au existat şi „alarme false”) s-a dovedit a

conţine spori de Bacillus anthracis. Câteva elemente concrete cu privire la situaţia din acea

perioadă vor fi prezentate în capitolul dedicat genului Bacillus.

După cartografierea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat ca fiind posibile circa

3.500 de mutaţii nucleotidice unice. În funcţie de acestea se ştie actualmente, că tulpinile

cunoscute pot fi împărţite în 8 grupe, fiecare grup fiind la rândul său divizat în mai multe

subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibilă variaţie

genetică (nu există „cross-link”-uri între grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis să

reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în scopul punerii

la punct a unor teste, care să identifice cu mare fineţe o anumită tulpină, inclusiv „originea”

acesteia.

Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B.

anthracis folosită în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a

putut să fie stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel

cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02).

Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii

genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de

laborator se poate stabili originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice.

6. Antibiotice şi Chimioterapice74

6. 1. DefiniţieAntibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe

medicamentoase capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor

microorganisme implicate etiologic în bolile infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra

celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra celulelor organismului

gazdă. Aceste substanţe pot fi:

- antibacteriene,

- antivirale,

- antifungice,

- antiparazitare.

În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex.

dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:

·         inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),

·         imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium inflatum),

·         hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),

·         insecticide,

·         ierbicide etc (1).

6. 2. Date cu privire la descoperirea antibioticelor (Figura nr. 1)

Antibioticele au revoluţionat lumea în multe aspecte. Nenumărate vieţi au fost salvate.

Din nefericire însă, există şi aspecte mai puţin plăcute legate în special de apariția și

dezvoltarea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice precum și de înregistrarea diferitelor

reacții adverse. O bază de date recent întocmită arată prezenţa a mai mult de 20.000 de

gene potenţial rezistente (2).

Încă din 1820 chinina a fost folosită drept chimioterapic în tratamentul malariei,

antimalaricele de sinteză fiind introduse în practică o sută de ani mai târziu, în 1926. În

acelaşi an (1926) Fleming testează penicilina pentru efectul ei antimicrobian „in vitro”,

pentru ca în 1946 să se demonstreze în practică utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul

penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie stafilococică). În 1935 sunt descoperite

primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistenţa la aceste molecule a fost

raportată spre sfârşitul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în

anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). În 1949 se pune în evidenţă în

structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanţele

antibiotice cu o astfel de particularitate structurală au primit numele de betalactamine. În

1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat începând cu 1977 de obţinerea

75

inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se

folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducând cu sine

utilizarea în clinică a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg.

Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape

exclusiv în perioada 1946-1950 (numită din acest motiv „era sulfamidelor”). Anul 1948

impune în tratamentul antiinfecţios clasa tetraciclinelor, începînd cu clortetraciclina şi

continuând cu oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina.

Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obţinut în

1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scară largă în clinică începând cu anul 1969.

În 1979 este pus în evidenţă nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariţia

unei noi clase de substanţe antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanţii acestei clase se

numără tienamicina, imipenemul, care este asociat în terapie cu cilastatina. Ulterior s-au

realizat structuri chimice rezistente la acţiunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv

biapenemul şi meropenemul.

În perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina,

ofloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu

activitate pe germenii Gram-negativi (ex. aztreonam).

La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de

antibiotice şi chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin

raţională a acestor medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o

listă a medicamentelor esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar

medicamente betalactamice (penicilină, amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc),

medicamente antituberculoase şi antileproase (clofazimină, dapsonă, ethambutol,

izoniazidă, pirazinamidă, rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase (cloramfenicol,

co-trimoxazol, doxiciclină, eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină,

sulfadiazină etc), medicamente „complementare” (ciprofloxacină, clindamicină, acid

nalidixic etc) dar nu apar pe lista principală nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce

demonstrează cel puţin indirect recomandarea de reducere a utilizării în exces a

medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o legătură directă cu subiectul

prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui document relativ recent

(„How to improve the use of medicines by consumers”, OMS, 2007), adresat atât

specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv

antibiotice şi chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că

editarea acelui manual a fost făcută cu asistenţă financiară de la Comunitatea Europeană.

6. 3. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor

Clasificarea se poate face după:

a) originea lor;

b). efectul bacteriostatic sau bactericid;

c). mecanismul de acţiune;76

d). spectrul de acţiune şi

e). structura chimică (Tabelul nr. 1).

6. 3. 1. În funcţie de originea lor, agenţii antimicrobieni pot fi clasificaţi în următoarele

categorii:

a). Substanţe cu origine biologică elaborate de anumite microorganisme (antibioticele),

de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologică, dar nu

pot fi utilizate în tratamentul infecţiilor umane;

b). Produşi de semisinteză realizaţi pornind de la un nucleu elaborat de un

microorganism, nucleu care suferă apoi prelucrări chimice (de exemplu meticilina);

c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu

acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele).

Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt

produse prin metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este

mai rar întâlnită în limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente

fiind numite „antibiotice” (totuşi trebuie să cunoaştem că există această diferenţă).

6. 3. 2. în funcţie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice şi

bactericide.

Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării

bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele

etc).

Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex.

penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina,

streptograminele etc).

Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic

bacteriostatic, precum şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui

antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).

6. 3. 3. Clasificarea după mecanismul de acţiune

a). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei peretelui celular; au

efect bactericid şi sunt reprezentaţi de antibioticele beta-lactamice (peniciline,

cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina,

cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc;

b). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea funcţiei membranei celulare; au

efect bactericid şi sunt reprezentaţi de polimixine (polimixină B, colistin), gramicidină,

tirocidină, imidazoli, nistatină, amfotericină B etc (ultimele trei fiind medicamente

antifungice);

c). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei proteice la nivelul

ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele,

lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc;

77

d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de

exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina

etc.

Antibioticele beta-lactaminice inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la

bacteriile Gram-pozitive faţă de cele Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în

ceea ce priveşte structura peretelui). Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară

legarea de receptori celulari numiţi PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele

inhibă de exemplu reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice) între lanţurile

adiacente de peptidoglican. Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când

microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-

lactamic. Alte mecanisme de rezistenţă sunt reprezentate de: alterarea porinelor din

membrana externă (Gram-negativi) ceea ce afectează transportul beta-lactaminelor către

sediul de acţiune, mutaţii care afectează structura PBSs şi respectiv afinitatea faţă de beta-

lactamine etc.

Polimixinele (polimixina B, colistinul) acţionează selectiv pe membrana germenilor

Gram-negativi, printr-un mecanism asemănător cu cel al detergenţilor cationici deteriorând

membrana. Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a

microbilor Gram-negativi. Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale

generală. Rezistenţa la polimixine apare rar.

Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina

etc) se ataşează iniţial de o proteină receptoare specifică aflată pe subunitatea 30S a

ribozomului bacterian şi blochează ulterior activitatea normală a complexului de iniţiere

necesar formării de peptide. În final determină dezintegrarea poliribozomilor şi separarea

lor în ribozomi, incapabili de sinteză proteică. Rezistenţa la aminoglicozide apare în special

dacă există o modificare a procesului de transport activ în interiorul celulei bacteriene. La

streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu există un astfel de sistem de transport şi

în aceste condiţii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. În cazul bacteriilor

sensibile, rezistenţa poate apărea de ex. prin producerea de enzime care adenilează sau

fosforilează grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile

reacții adverse putem aminti nefrotoxicitatea și ototoxicitatea.

Ciclinele (ex. tetraciclina) se leagă de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni şi nu

permit introducerea de noi aminoacizi într-un lanţ polipeptidic în curs de formare.

Rezistenţa este de regulă mediată plasmidic, dar şi prin intermediul transposonilor, ducând

de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediază un aflux excesiv de tetraciclină şi

astfel nu se mai pot atinge concentraţiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb în stomac şi

intestin. Sunt bacteriostatice. Acţionează pe germeni gram pozitivi și gram negativi,

spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reacţiile adverse amintim senzațiile

de greaţă, voma, diareea, toxicitatea renală şi hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar.

Cloramfenicolul se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni şi inhibă peptidil-

transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de formare.

Rezistenţa poate apărea de ex. prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a

unei nitrat-reductaze. Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi  gram pozitivi și gram

78

negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă,

salmoneloze sistemice, infecţii severe cu anaerobi. Printre reacţiile adverse cele mai grave

la care poate să ducă enumerăm anemia aplastică cu leucopenie şi agranulocitoză.

Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) şi lincosamidele (lincomicina și

clindamicina) se leagă de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interferând cu formarea

complexului de iniţiere pentru sinteza lanţurilor proteice. Rezistenţa poate apărea datorită

unei alterări a proteinelor ribozomale sau datorită sintezei unei enzime care metilează

reziduuri de adenină la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acționează pe cocii

gram pozitivi și gram negativi, bacili gram pozitivi și unii bacili gram negativi. Pot acționa

pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma și Chlamydia. Sunt

indicate în infecţiile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în

difterie, tuse convulsivă, pneumonii atipice etc. Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă,

vomă, diaree, febră, rash, reacţii anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe

germeni gram pozitivi aerobi şi anaerobi şi pe germeni gram negativi anaerobi.

Rifampicina inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-

dependentă. Acţionează pe mycobacterii, coci gram pozitivi și gram negativi, unii bacili

gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Dintre indicații putem

menționa tratamentul tuberculozei, leprei, infecţiilor stafilococice meticilino-rezistente

sensibile (testarea sensibilității tulpinilor respective este necesară).

Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhibă

sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acţionează pe unii bacili gram

negativi și gram pozitivi, coci gram negativi și gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre

posibilelel reacții adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii.

Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic

(PABA) şi inhibă dihidro-pteroat-sintetaza. Se formează analogi nefuncţionali ai acidului

folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistenţa apare prin alterarea

dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a sulfonamidelor şi este mediată

plasmidic. Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de

celelalte substanţe cu structură similară.

Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhibă reductaza acestui acid.

Sulfamidele şi trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creşterea

bacteriană. Dacă sunt însă utilizate împreună, vor produce o blocare dublă în secvenţa

sintezei de ADN, rezultând o creştere marcată a activităţii lor (sinergism). O astfel de

substanţă, frecvent folosită în practica medicală, este cotrimoxazolul (ex. biseptol),

conţinând sulfametoxazol şi trimetoprim.

Pirimetamina, la fel ca şi trimetoprimul, inhibă dihidro-folat-reductaza.

Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficienţi ai sintezei de ADN;

dar realizează această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei

animale, nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate în terapia antibacteriană.

6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor după spectrul de acţiune

Prin spectrul de acţiune antimicrobiană se înţelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii

asupra cărora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. În practică, trebuie

79

cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniţial al fiecărui preparat antimicrobian, ci şi

modificările ulterioare, survenite în urma apariţiei germenilor rezistenţi.

Spectrul antimicrobian iniţial este stabilit pentru fiecare antibiotic în parte, o dată cu

introducerea sa în terapeutică.

Antibiotice cu spectru „îngust”

Aceste antibiotice pot fi subîmpărţite în două subgrupuri:

- antibiotice cu spectru „de tip penicilinic”, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-

pozitivi şi coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor,

macrolidele, lincosamidele etc;

- antibiotice cu spectru „de tip streptomicină”, active pe bacili Gram-negativi, coci

Gram-negativi, coci Gram-pozitivi. În acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele

etc.

Antibiotice cu spectru „larg”

Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi şi negativi, coci Gram-

pozitivi şi negativi. Sunt active şi pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii,

mycoplasme. În acest grup au fost incluse cloramfenicolul şi tetraciclinele.

La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot adăuga alte antibiotice, cum ar

fi: penicilinele cu spectru lărgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele,

tienamicinele, cefalosporinele din generaţiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide

etc.

6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor şi chimioterapicelor antibacteriene după structura

chimică

1. Antibioticele betalactaminice

a). Penicilinele

- penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);

-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina,

dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina);

- aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina);

- alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul,

ciclacilina, epicilina);

- peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii

(temocilina; în această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi

piperacilina);

- peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina,

azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina);

- alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic +

amoxicilină / ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);

b). Cefalosporinele

- din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);

- din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);

- din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);

- din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).

80

Cefalosporinele se mai pot clasifica şi în:

-          cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);

-          cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola

etc);

-          cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor

(cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc);

-          cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima,

cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc).

c). Alte antibiotice beta-lactaminice

- monobactamii (de exemplu aztreonamul);

- penemii (de exemplu ritipenemul);

-carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina;

cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei);

- oxacefemii (ex. latamoxef);

- carbacefemii (ex. loracarbef).

d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).

2. Glicopeptidele (teicoplanina şi vancomicina);

Vancomicina este utilizată în tratamentul infecţiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se

administrează intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre

reacţiile adverse amintim reacţiile anafilactice, febră, eozinofilie, neutropenie, pierderea

auzului.

3. Aminoglicozidele

- streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);

- kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;

4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);

5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);

6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7.

Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul);

8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus

- cloramfenicolul;

- lincosamidele (lincomicina şi clindamicina);

- acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);

- streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);

- oxazolidinonele (linezolid);

- mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca

răspuns la apariţia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilină etc.

Chimioterapicele

1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);

2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)

3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);

4. Ethambutolul;

5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);

81

6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina,

levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc);

7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);

8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

6. 4. LantibioticeleDenumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, fiind vorba de un grup

special de substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost

clasificate între antibiotice şi bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-

pozitive (ex. din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă

un spectru de activitate specific faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de

vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice.

Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi

3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A

şi B.

Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex.

nisina, subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5.

Lantibioticele îşi au originea în proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice)

sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere

biologic. În privinţa mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate

bactericidă depolarizând membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi

inducând autoliza acesteia. Datorită faptului că există o specificitate a lantibioticelor faţă de

anumite bacterii se consideră că există şi alte mecanisme implicate.

Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau

plasmidic. De ex. în cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene

(15) de Lactococcus lactis, iar informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este

localizată pe plasmidul pTu 32.

Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală

Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina

inhibă tulpinile din genurileStreptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la

o concentraţie ≥ 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă

sporularea bacteriilor din genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor

Gram-negative sau asupra fungilor. Nisina este folosită pe scară largă în industria

alimentară drept „conservant natural” pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi

procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă dezavantajele

nitraţilor şi nitriţilor (produc nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală este

utilizată în unguente cosmetice. Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară

(în tratamentul local al infecţiilor bacteriene).

Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de

germeni care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium

acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina

82

(sintetizată de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru

derivatele de vitamina A şi eritromicină, de ex. în cazurile de acnee juvenilă, eczemă,

foliculite etc.

Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are acţiune

antivirală faţă de virusul Herpes simplex.

6. 5. Rezistenţa microbiană la antibiotice

Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate fi compromisă de dezvoltarea

rezistenţei. Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul

infecțiilor bacteriene cât şi pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru

medicamentele utilizate în tratamentul unor boli cronice.

Trei condiţii trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă:

antibioticul trebuie să poată să ajungă la ţintă într-o concentraţie suficientă;

antibioticul nu trebuie să fie inactivat înainte să se lege de ţintă;

trebuie să existe în celula bacteriană o ţintă vitală susceptibilă la acţiunea

antibioticului.

Cititorul este rugat să consulte și http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx.

Rezistenţa microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a

supravieţui şi de a se multiplica în prezenţa antibioticului.

Fenomenul de rezistenţă la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea

acestora (ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus

aureus rezistent la penicilină sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în

practica medicală.

Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase

afectează multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune

al beta-lactaminelor) au fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă

de acţiunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-

lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).

Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită.

6. 5. 1. Rezistenţa naturală (intrinsecă) reprezintă rezistenţa tuturor membrilor unei

specii bacteriene faţă de un antibiotic şi este determinată genetic, de exemplu rezistenţa

bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G.

6. 5. 2. Rezistenţa dobândită este acea rezistenţă necaracteristică unei specii

bacteriene, dar achiziţionată de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date;

de exemplu, antibioticul acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în care

majoritatea populaţiei bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există tulpini

care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse în

timp ce tulpinile rezistente vor fi „selectate”; această situaţie nu poate fi detectată decât

83

utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi chimioterapice, de ex.

antibiograma difuzimetrică standardizată).

Rezistenţa dobândită poate fi cromozomială sau extracromozomială.

Mecanisme biochimice implicate în rezistenţa la antibiotice

- producerea de către bacterie a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu

penicilinaza stafilococului auriu (codificată plasmidic) care inactivează nucleul beta-

lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-

negative (ex. de enterobacterii);

- scăderea permeabilităţii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de

exemplu formele L);

- elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează

sau anulează acţiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei

respective;

- alterarea ţintei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale);

- amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se astfel prin „diluare”

acţiunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2)

6. 5. 2. 1. Rezistenţa cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii

spontane, la întâmplare, la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea faţă de un

anumit produs antimicrobian (deleţie, substituţie sau adiţie de bază). Prezenţa substanţei

active antimicrobiene serveşte ca un mecanism selector, suprimând organismele sensibile

şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite din organismele mutante, rezistente la

antibiotic. Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10-12-10-7. Mutaţiile

cromozomiale sunt definitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de

antibiotice şi se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă.

Pot fi clasificate în:

·         mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură mutaţie duce

la creşterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la eşuarea tratamentului atunci când

acesta este instituit cu un singur antibiotic.

·         mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale care duc la

creşterea gradată a CMI.

6. 5. 2. 2. Rezistenţa extracromozomială este mult mai frecventă decât cea

cromozomială, reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea

materialului genetic pentru rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii

populaţiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic

sau transpozoni.

Transferul materialului genetic se poate realiza prin:

- transducţie;

- transformare;

- conjugare;

- transpoziţie.

Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian

încorporat în capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru

84

rezistenţa la un antibiotic (factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate

deveni rezistentă la antibioticul respectiv şi este capabilă să transmită descendenţilor

această rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul respectiv.

Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică

încorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l

conţin) într-o altă bacterie.

Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat

prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în

răspândirea rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan

pentru germenul receptor rezistenţa faţă de mai multe antibiotice.

Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente

transpozabile) în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă

şi o porţiune a cromozomului bacterian.

6. 5. 3. Tipuri de rezistenţă

6. 5. 3. 1. Rezistenţa faţă de un agent antimicrobian poate fi:

- monovalentă (monorezistenţa), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic;

- plurivalentă (rezistenţa multiplă, la mai multe antibiotice);

6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta:

- direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);

- încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură

şi/sau mecanism de acţiune asemănător); de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o

tetraciclină conferă rezistenţă la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce

stafilococii rezistenţi la meticilină (MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-

lactamice;

6. 5. 3. 3. După ritmul de instalare, rezistenţa poate fi:

- cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”;

- de ritm intermediar, „tip eritromicină”;

- cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”;

- cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”.

6. 5. 4. Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial

Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de

rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea

tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în

spitale, alte unităţi sanitare sau în ambulator (inclusiv prin fenomenul numit

„automedicaţie”), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi, apariţia şi

transmiterea germenilor de spital, devalorizarea şi pierderea unor medicamente

antibacteriene etc. O problemă deosebită este şi utilizarea medicamentelor antibiotice şi

chimioterapice în domeniul veterinar. Se estimează că anual se consumă circa 100.000

tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună parte în ferme de animale, piscicole etc (Levy

2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de „poluare” a mediului cu

substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”.

85

Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui

să avem în vedere: utilizarea acestora în beneficiul pacientului; evaluarea clinică riguroasă

însoţită de teste de laborator sugestive sau care să confirme infecţia şi respectiv

sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt

timp posibil în cazul pacienţilor cu infecţii severe, ameninţătoare de viaţă; tratamentul

trebuie să fie „ţintit”, să fie îndreptat strict către bacteria care a produs respectiva infecţie,

să se utilizeze calea de administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare, intervalul

între doze, durata optimă a tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele

care vor permite ca acesta să fie compliant şi să respecte indicaţiile medicale.

Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi

chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notificarea şi evaluarea statistică,

publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate

acestea, datele menţionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naţional. În România,

profesioniştii din sistemul sanitar se bazează fie pe experienţa proprie, fie pe datele

statistice din literatura internaţională.

Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii

rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii,

Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile,

Enterobacterspp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M.

tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus

aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de „superbug” se refer la microbi care

duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată datorită mutaţiilor multiple și respectiv

rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate

iar spitalizarea este de durată mare şi poate duce la costuri deosebit de mari. (3)

NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou

descoperită. Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și

inactivează carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această

cauză poate fi ușor transmisă. A fost prima dată identificată în India; a fost ulterior

recunoscută în Pakistan, Bangladesh,  UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7).

6. 5. 5. Date privind  controlul extinderii rezistenţei la antibiotice

Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au

realizat și aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de

curând de către ECDC, pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre

exemplu:

·         controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu

pentru un guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene)

·         achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției

medicale

·         controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe

dintre moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub

alte denumiri comerciale şi în tratamentul animalelor)

·         prevenirea bolilor infecţioase etc.

86

Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru

animale a devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union

Ministers of Health” a adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor

în medicina umană. Prima recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să

întărească un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea

rezistenţei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobiană

(European Antimicrobial Surveillance System – EARSS) oferă date legate de prevalenţa şi

răspândirea majorităţii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe

antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afirmă că „datele pe care EARSS le-a adunat

de-a lungul anilor aduc un mesaj neplăcut dar important: rezistenţa la antibiotice devine o

problemă tot mai mare de sănătatea publica an după an şi doar un efort cumulat poate

schimba această situaţie”. (8)

Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale

tractului respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la

antibiotice și chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt

duşi la creşă sau la altă formă de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva

iniţiative, s-a făcut mult prea puţin în ceea ce priveşte această grupă de vârstă. Ar fi totuși

de menționat înfiinţarea Reţelei de Prescriere şi Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE

(The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network – ARPEC) care are

următoarele scopuri:

·         să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere

pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din

UE

·         să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care

apar între diferite comunităţi şi spitale

·         să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice

administrate zilnic copiilor

·         să colecteze date

·         să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu

Societatea Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric

Infectious Diseases – ESPID)

·         să trimită rezultatele obținute în cadrul fiecărui proiect către toate ţările membre.

(9)

CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice

care cuprinde patru mari puncte:

·         Supraveghere,

·         Prevenire şi Control,

·         Cercetare şi

·         Producţie. (10)

87

6. 6. Noţiuni legate de alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase

Instituirea şi continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durată optimă (nici prea scurtă

şi nici prea lungă, existând recomandări specifice în funcţie de agentul etiologic şi respectiv

în funcţie de patologie) trebuie să urmeze întotdeauna parcurgerea unor etape minimale

care să justifice această opţiune terapeutică. În acest mod s-ar putea evita principalele

erori în utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente în momentul actual, inclusiv la

nivel mondial, erori care favorizează în principal abuzul de antibiotice / chimioterapice şi

permit selectarea de microorganisme rezistente.

6. 6. 1. Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice

Etapa în care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei

Această etapă se bazează pe o serie de date concrete (însă uneori pornim doar de la

ipoteze) într-un anumit contextclinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator. Este strict

necesar să reţinem că întotdeauna există un context şi că nici una dintre informaţii luată

singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu există o prioritate pentru clinică sau o

prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate şi integrate în contextul general.

Pentru a susţine decizia încercăm să răspundem cât mai precis posibil la cel puţin două

întrebări, respectiv:

1. Este în discuţie o infecţie certă sau cel puțin foarte probabilă?

Argumentele principale în favoarea unei infecţii pot fi: creşterea temperaturii, prezenţa

frisoanelor, identificarea unor supuraţii sau inflamaţii locale, modificarea evidentă a stării

generale, icterul (colorarea în galben a tegumentelor şi mucoaselor), prezenţa unor erupţii

la nivel tegumentar sau pe mucoase, modificări ale tranzitului intestinal însoţite de

eliminarea de scaune mai numeroase sau de consistenţă scăzută (diaree), tusea,

condensările pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologică, sindromul

meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza

(atât ca număr cât şi ca procent în analiza formulei leucocitare), testele nespecifice de

inflamaţie (număr de leucocite, VSH, proteină C reactivă, fibrinogen etc.), identificarea

prezenţei bacteriilor la nivel tisular sau în umori în mod normal sterile prin examene simple

în cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc.

Sindromul de răspuns inflamator sistemic (SIRS) sugerează de cele mai multe ori o

infecţie, dar el poate fi produs şi de cauze neinfecţioase (imunologice, cancer,

politraumatisme, alte agresiuni fizice etc.). În acest sindrom este evaluată prezenţa a cel

puţin două din următoarele condiţii: temperatură centrală peste 38°C sau mai mică de

36°C, frecvenţă cardiacă peste 90 de bătăi pe minut, frecvenţă respiratorie peste 20 de

respiraţii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numărul leucocitelor periferice peste 12.000

pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (în bandă).

88

Noţiunea de sepsis include prezenţa infecţiei alături de sindromul de răspuns inflamator

sistemic. În prezent, este recomandată o nouă terminologie care să înlocuiască vechile

denumiri de septicemie, stare septică, septicopiemie etc. Sepsisulreprezintă SIRS

determinat de infecţie. Sepsisul sever se defineşte ca un sepsis asociat cu disfuncţie

organică, hipoperfuzie sau hipotensiune. Şocul septic este sepsisul însoţit de hipotensiune

(indiferent de aportul normal de lichide) şi de anomalii de perfuzie (cel puţin acidoză

lactică, oligurie sau alterarea acută a stării mentale). Hipotensiunea este definită ca

tensiune arterială (maximă) sub 90 mmHg sau reducerea tensiunii arteriale maxime cu

peste 40% faţă de nivelul obişnuit. Prezenţa sau suspiciunea sepsisului, şocului septic sau a

sindromului de disfuncţie multiorganică, chiar şi atunci când nu sunt clar demonstrate,

constituie un argument hotărîtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice

datorită gravităţii deosebite a acestor entităţi clinice. Totuşi, chiar şi în această situaţie nu

există nici un argument logic de a institui antibioticoterapia înainte de a recolta produse

pentru a fi examinate în cadrul diagnosticului bacteriologic direct.

2. Care este terenul pe care s-a instalat infecţia?

Evaluarea terenului, a situaţiei gazdei care urmează a fi tratată, are un rol important în

stabilirea oportunităţii antibioticoterapiei. Infecţiile uşoare, apărute la persoane tinere

anterior sănătoase, de obicei nu necesită tratament cu antibiotice sau chimioterapice.

Aceleaşi infecţii apărute la pacienţii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesară

(şi este indicat să utilizăm medicamente bactericide). Existenţa unor factori favorizanţi

măreşte prezumţia de infecţie şi necesită instituirea terapiei cu antibiotice, chiar în

contextul unor semne fizice (exemplu febră) aparent minore. Aceşti factori sunt de obicei

reprezentaţi de imunodepresia la nivelul întregului organism (la pacienţi cu diabet, ciroză,

cancer, SIDA, politraumatisme, operaţii extinse etc.) sau de imunodepresie locală (datorită

prezenţei unor catetere, sonde, şunturi, proteze implantate etc.). La bolnavii

imunodeprimaţi se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; în această situaţie este

de obicei acceptată asocierea de antibiotice.

Etapa în care se alege medicamentul antimicrobian care urmează a fi administrat

Din gama largă de antibiotice disponibile la ora actuală (peste 250 de molecule

diferite), selectarea celui mai indicat se face după mai multe criterii.

Relativ frecvent, alegerea se bazează pe criteriul prezumţiei etiologice, cu condiţia

începerii diagnosticului microbiologic direct anterior începerii terapiei (nu există nici o

justificare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra întâi antibiotice

şi apoi a-ţi aduce aminte că era preferabil să recoltezi produsul patologic, să îl trimiţi către

laborator în vederea izolării, identificării şi stabilirii sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi

chimioterapice a germenului implicat în respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi

corectată pe baza precizării definitive a etiologiei (cu condiţia ca diagnosticul microbiologic

direct să fi fost „lansat”), dar şi pe baza aprecierii eficienţei clinice şi a efectelor adverse ale

terapiei iniţiale.

În vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmează să îl administrăm

pacientului cu o boală infecţioasă este strict necesar să: a). stabilim diagnosticul etiologic,

să încercăm şi să reuşim diferenţierea infecţiilor bacteriene (tratabile cu antibiotice şi

89

chimioterapice anti-bacteriene) de infecţiile virale; elementele care ne permit orientarea

spre etiologia bacteriană ar fi: un tablou clinic mai sever (există şi infecţii virale foarte

grave, însoţite de modificări substanţiale ale stării generale a pacienţilor), febra mai

„înaltă”, frisoanele, inflamaţia mai accentuată, prezenţa supuraţiilor, leucocitoza (numeric

şi procentual în analiza formulei leucocitare). Trebuie să realizăm de asemenea o

examinare clinică în detaliu a pacientului („din creştet şi până la tălpi”), examenul

microbiologic (inclusiv examinarea microscopică citobacteriologică); b). testăm

sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate şi implicate în infecţia supusă

antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizăm sau primim informaţii privind

diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoaştem proprietăţile farmacologice ale

antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem în vedere şi criteriul economic (raportul cost-

eficienţă); f). analizăm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.

Trebuie de asemenea să avem în vedere şi să decidem care este calea şi modul de

administrare pentru antibioticul ales în funcţie de gravitatea, localizarea infecţiei, caracterul

acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, toleranţa pentru acest antibiotic a

pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare orală) în infecţii

de gravitate medie sau chiar şi în unele infecţii grave, în funcţie de localizare, ca alternativă

pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dacă bacteria izolată îşi păstrează

sensibilitatea faţă de penicilină, dacă gazda nu prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de

penicilină şi dacă vom reţine care este procentul de absorbţie al acestui medicament şi în

acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea

parenterală şi „pe stomacul gol”.

În cazul în care analiza noastră a permis răspunsul la toate întrebările listate mai sus se

vor stabili dozele necesare, intervalele între administrări, durata tratamentului, precum şi

momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul

administrării incluzând metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor şi simptomelor) şi

metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor în ser etc.).

6. 7. Erori în practica antibioticoterapiei

Antibioterapia se află într-un impas constatat clinic prin diferite eşecuri terapeutice (în

cadrul tuturor specialităţilor atât medicale dar mai ales chirurgicale) şi confirmat de

numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate în special în SUA şi Europa de

Vest şi sunt mai puţine şi mai puţin semnificative în ţara noastră; constatările diferitelor

eşecuri există, chiar dacă sunt prezentate de regulă „anecdotic” şi nu în publicaţii

accesibile întregului sistem sanitar). În străinătate, există o tendinţă de a atrage în echipe

mixte microbiologi, farmacişti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizării antibioticelor

şi chimioterapicelor, mai mult, de a pregăti specialişti pentru formarea de echipe

multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor sanitare, pentru limitarea

problemelor legate de numeroasele erori comise în antibioticoterapie (Arnold 2004).

90

Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi

folosirea iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi

chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de

specii sau de tulpini („mutante”) bacteriene cu rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor

adverse la antibiotice şi chimioterapice precum şi modificarea tablourilor clinice „clasice“

ale patologiei infecţioase.

Cel puţin teoretic soluţia ar fi descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai

multe companii farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente

antivirale şi antifungice şi au tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea

producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi

mai la îndemână estefolosirea raţională a medicamentelor antimicrobiene deja existente

şi evitarea erorilor făcute în practica antibioticoterapiei.

Dar, care sunt cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor?

În primul rând este incorect să începem un tratatament antibiotic fără să fi examinat

clinic (complet) pacientul şi fără să utilizăm informaţiile pe care le putem obţine printr-o

anamneză riguroasă. Este incorect să indicăm folosirea acestor medicamente în stări febrile

în care există doar „bănuiala unei infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la

întâmplare” sau „pe încercate” (cu o eventuală eroare suplimentară reprezentată de

schimbarea succesivă a antibioticului în „raţionamentul” că „poate de data aceasta va

merge” fără să încercăm să ne fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe

criterii de probabilitate). „Raţionamente” simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi

chimioterapice (deseori întâlnite în practică, din păcate) nu pot conduce decât la eşec, la

modificarea evoluţiei bolii şi la împiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului („mascare”

clinică şi bacteriologică) şi tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este

adevărat că în România nu există ghiduri şi recomandări privind utilizarea corectă a

antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate peeşantioane reprezentative

statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este reprezentată de studiile

făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea Angelescu

(1998).

În al doilea rând este incorect să utilizăm antibiotice fără a solicita, fără a obţine şi

fără a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medicală,

chirurgicală) şi indiferent de supra-specialitate este necesară cunoaşterea şi utilizarea

corectă a unor noţiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect să începem

antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic. În funcţie de contextul clinic şi

de gravitatea patologiei în cazul căreia presupunem drept etiologie o infecţie bacteriană

este recomandabil să solicităm şi efectuarea unor examene paraclinice de bază

(leucogramă, VSH, radiografie, sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că atunci când

suspicionăm o infecţie bacteriană, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate

chiar şi personal; ca alternativă trebuie să stabilim o foarte bună colaborare între

clinică şi laborator) avem la îndemână posibilitatea şi necesitatea efectuării de preparate

între lamă şi lamelă (native) şi frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.)

din produsul obţinut prin recoltare de la pacientul cu o presupusă infecţie bacteriană.

91

Realizarea şi examinarea frotiurilor poate dura chiar şi numai 5 minute, permiţând în scurt

timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui să indicăm

tratamentul cu antibiotice fără a ţine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. În

cazul unor infecţii grave se poate începe antibioticoterapia, după „criterii de

probabilitate”. Însă, în cazul în care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost

transmis către laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat şi s-a stabilit

care este sensibilitatea la antibiotice şi chimioterapice iar evoluţia clinică şi paraclinică nu

este favorabilă, demonstrând că antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru că avem

rezultate de laborator vom putea „schimba” tratamentul, de această dată pe criterii

ştiinţifice evitând schimbări repetate şi „la întâmplare” sau chiar inducerea unui prognostic

rezervat pacientului supus tratamentului din clinica în care ne desfăşurăm activitatea).

Trebuie să nu greşim şi să luăm în considerare drept agenţi etiologici diferiţi germeni

saprofiţi sau condiţionat patogeni, cultivaţi din focare sau cavităţi septice deschise, sau

izolaţi din produse contaminate în cursul recoltării.

O altă eroare ar fi ignorarea posibilităţii ca germenul izolat să fie doar unul dintre cei 2

sau mai mulţi germeni implicaţi.

Încă din anul doi de studiu se obţin primele date cu privire la toate aspectele descrise

mai sus precum şi cu privire la testarea sensibilităţii la antibiotice (de ex. antibiograma),

metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu trebuie nici subestimată şi nici

supraevaluată (mai ales atunci când este efectuată difuzimetric şi / sau nu este

standardizată).

Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm

datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare în parte şi „scoase” din

contextul general. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator;

datele trebuie interpretate, integrate şi utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de

laborator general. Aceasta reprezintă, după opinia noastră, un aspect esențial al

medicinii pe care dorim să o practicăm la cel mai înalt nivel, în favoarea pacienţilor pe care

trebuie să îi tratăm.

În al treilea rând este incorect să prescriem fără justificare antibiotice şi

chimioterapice, spre ex. în stări febrile neinfecţioase (maladii cu mecanism prin

hipersensibilitate, maladii ale ţesutului colagen, neoplazii etc), în boli infecţioase cu agenţi

patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd să utilizăm penicilină sau orice

alt antibiotic antibacterian în „tratamentul” gripei). Este de subliniat că este incorect să

indicăm antibioterapia (şi să aşteptăm ca indicaţia noastră să aibă efect curativ) în cazul

unor supuraţii colectate neglijând şi / sau temporizând incizia şi drenajul (antibioticul nu

difuzează în focarul purulent; în plus, va fi inactivat la acest nivel).

În al patrulea rând, atunci când este necesară antibioterapia, este incorect să alegem

eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (în cazul în care această asociere este

strict necesară), prin necunoaşterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin

nefolosirea antibioticului de elecţie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau

tetraciclinei în angina streptococică la pacientul care nu prezintă hipersensibilizare la

penicilină), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile în focar (infecţia urinară nu se poate

92

trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimină prin bilă sau prin urină sub

formă de metabolit inactiv). În plus nu trebuie să uităm faptul că lucrăm cu bolnavi şi nu cu

boli şi în acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaţii specifice

(ex. hipersensibilizare faţă de antibioticul pe care dorim să îl utilizăm, cu posibilitatea

apariţiei unui şoc anafilactic).

Este incorect să indicăm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al

mecanismului (ex. penicilină G + tetraciclină) sau să indicăm asocierea de antibiotice cu

acelaşi spectru (eroare poate fi dramatică în cazul asocierii a două aminoglicozide sau a

două antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenţia privind

eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacţii adverse serioase (ex. afectarea până la

determinarea apariţiei surdităţii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacţie de

notorietate în cazul aminoglicozidelor (streptomicină, kanamicină, gentamicină, amikacină

etc.).

În al cincilea rând, este incorect să indicăm „din start” antibiotice şi chimioterapice

într-un aşa-zis scop profilactic. Spre ex. în cazul în care pacientul prezintă un panariţiu la

degetul inelar singura atitudine corectă este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea şi

pansarea locală, vindecarea urmând a se produce; nu este necesar ci este chiar

contraindicat să recomandăm administrarea de antibiotice şi chimioterapice. Încă din primii

ani de studenţie se poate reţine faptul că, în principiu, utilizarea antibioticelor în scop

profilactic trebuie privită cu rezerve serioase. Pe de altă parte, trebuie cunoscute situaţiile

în care antibioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă (de ex. înainte şi după efectuarea

unei extrageri dentare, manevră sângerândă, la un pacient care are stenoză mitrală).

În al şaselea rând, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele

necesare de microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medicală, medicină

internă, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau /

şi greşelilor în tehnica de administrare; cunoştinţele acumulate ne permit să avem în

vedere posibilele reacţii adverse şi să evităm situaţii care pot deveni dramatice.

Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în

momentul eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât

pentru evaluarea efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei

fenomenelor toxice (de ex. vom indica substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insuficienţă

renală numai în condiţiile monitorizării valorii creatinei şi creatininei sanguine, a ureei

sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei şi a sedimentului urinar).

Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substanţă antimicrobiană.

Datele farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret

al bolnavului tratat. Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de

administrare, difuziunea în organism (ţesuturi şi fluide), metabolizarea substanţei în

organism, eliminarea (căi şi forme de eliminare) etc.

După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea fi

reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, flebite

etc.), sau la distanţă (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare

93

(erupţii, şoc anafilactic etc.) şi c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea

antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecţii, reacţii autoimune etc.).

În al şaptelea rând, este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia

pe care urmează să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna

cea mai bună variantă posibilă. Considerăm că tăria este atunci când ne recunoaştem

limitele şi nu atunci când încercăm să demonstrăm că acestea nu ar exista.

6. 8. Povestiri adevărate6. 8. 1. Gentamicina administrată în aerosoli

Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac

terorist cu arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate

fi o mai bună formă de apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un

program naţional de protecţie anti-bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă

numele de „BioShield”.

Iniţial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate în

cazul unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinică, Bacillus anthracis,

virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic.

În afară de identificarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de

prevenire / control / combatere.

În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut,

dar condiţionat într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi

respectiv mecanismul de acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel

încât administrarea să poate fi făcută pe care inhalatorie prezintă o serie de avantaje,

spre exemplu: a. eliberare mai rapidă; b. biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai

bună; d. posibilitate de dozare mai bună; e. capacitatea de a ajunge mai uşor şi mai direct

la nivelul organelor afectate. Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul pestei, formele

pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate şi cu cea mai mare

contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boală reprezintă o prioritate.

Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie

trebuie avută în vedere atât pentru tratament cât şi pentru profilaxia post-expunere în

cazul unui atac bioterorist.

Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a

anului 2007.

6. 8. 2. „A da sau a nu da” aceasta este intrebarea!

Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic

adecvat la pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnificativ cu cât se

face mai precoce (de ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic

depinde de capacitatea de a recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia

infecţioasă a stării critice nu face decât să confirme decizia. Dacă va fi incriminată, ulterior,

o altă etiologie a stării critice (IMA, pancreatita acută, HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului

nu afectează în sens negativ evoluţia, aşa cum ar fi fost afectată de întârzierea

94

administrării acestuia. La vârstnici, infecţia urinară poate fi frecvent o cauză de sepsis. La

un pacient vârstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecifică pentru un IMA

(posibil in primele ore), aşteptăm chiar şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la

elucidarea modificărilor EKG, dar dacă sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare

renal, sau altul, atunci mortalitatea poate creşte de la simplu la dublu (17%-30%).

La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu

administrarea antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase.

Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia

care va fi luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte

produse, care pot fi trimise către laborator înainte de începerea tratamentului

antibiotic.

6. 8. 3. S-a întâmplat nu demult în România ...

 Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la

medic pentru o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se

tăiase în marginea unei conserve pe care o desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă

profundă şi secţionase coronar pulpa degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea

abundentă şi îndelungată a plăgii, dar şi durerea pulsatilă la nivelul policelui, apărută după

aproximativ o oră, au fost motivele prezentării la medic. Pacienta a menţionat faptul că

acasă a aplicat apă oxigenată pe plagă (a procedat corect, fiindcă apa oxigenată, prin

efectul de spumare, antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul

leziunii, dar realizează şi o uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel

dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de

pulbere (ceea ce nu este la fel de corect).

La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la

articulaţia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza

plăgii şi efectuând în continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi

apă oxigenată. Leziunea s-a dovedit a fi minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi,

medicul curant cunoştea faptul că pacienta este studentă la facultatea de medicină şi

studiind în diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical,

dar şi cu celelalte cadre medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi membrii

personalului sanitar se pot infecta dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă

măsurile de prevenire şi control. În acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea

unei antibioterapii cu oxacilină (menţionând că stafilococul alb şi auriu „răspund bine”),

timp de cinci zile, pentru a preveni apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de

îngrijorare îl constituia durerea chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un

fenomen însoţitor pentru un panariţiu subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; în

cazul de faţă durerea s-a instalat la o oră de la lezarea zonei).

Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop profilactic, pacienta a acceptat,

convinsă de către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare.

A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine

acest risc, ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe

necesară. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care

95

antibioterapia ar fi putut să fie instituită în scop profilactic (înainte de realizarea

contaminării plăgii) sau metafilactic (în contextul unei inoculări bacteriene prezumtive). O

altă eroare, de această dată a pacientei, a fost aplicarea locală de pulbere antimicrobiană

imediat după lezarea zonei. Evident că riscul apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în

„povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să urmeze antibioterapia timp de trei zile în

loc de cele cinci recomandate; evoluţia a fost favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără

complicaţii. Suntem convinşi că acest lucru a fost posibil nu datorită antibioticelor

administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost minoră, precum şi datorită capacităţii de

răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii similare, să analizeze mai

atent beneficiile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un elocvent

contra-exemplu.

În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut

şi înţeles, iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice

„zgaibă”!

6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante

Nu doar fiinţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de

fermă. Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică

parte din totalul situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor,

medicamentele antimicrobiene sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru

efectul biostimulant.

Încă din anii ’40, antibioticele au început să fie folosite în fermele din toată lumea

pentru capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă

consecinţă este că acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot fi

apoi transferaţi omului. Producţia de carne creşte spre beneficiul câtorva producători, dar

creşte concomitent şi ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei

lumi întregi.

În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care

interzice folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop

decât cel terapeutic s-a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii

europeni, pe deplin convinşi de concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le

interzică complet.

Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca

și cea a antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander

Fleming avertiza în legătură cu uşurinţa cu care pot fi produse microorganisme rezistente la

invenţia sa - penicilina. Nu este nevoie de altceva decât ca acestea să fie expuse la doze

mai mici decât doza bactericidă. Aceasta se întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale

s-au adeverit, începând să apară primele tulpini rezistente.

În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil -

stafilococul auriu rezistent la meticilină (MRSA).

Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor

rezistenţi, sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de

priorităţi. (11)

96

6. 8. 5. Antibiotice fără rețetă?

Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verificarea numărului de

site-uri care oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo

au găsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar

63,8% ofereau o reţetă online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri,

macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6%

exportau spre SUA.

Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în

SUA care nu este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi

care poate contribui la extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice.

Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile

farmaceutice trebuie să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În

timpul anamnezei medicul poate oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la

antibiotice şi posibilele interacţiuni între antibiotice.  Pacienţii au nevoie să fie educaţi în

acest sens! (12)

6. 8. 6.  Și care să fie soluția?

În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S.

aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai

mică parte din aceste tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de

rezistenţă la vancomicină. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate în tratamentul

MRSA şi chiar şi a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă

mult timp până se va dezvolta rezistenţa şi la ele. Este o soluţie inventarea continuă de noi

antibiotice?

Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice

din şase clase diferite incluzând cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult

decât atât, în sudul Asiei şi în China, 60-70% E. coli  sunt rezistente la fluoroquinolone. (13)

Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut?

Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri?

Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau

omul care doreşte pur şi simplu să se informeze?

Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile

învățate ”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai

frecvente erori în utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.

6. 9. Evaluarea cunoştinţelorAlegeți răspunsul corect

1. Neutralizează acţiunea unei clase de antibiotice:

A. nucleul betalactam

B. nucleul carbapenem

C. betalactaminele

D. betalactamazele

97

E. inhibitorii de betalactamaze

 

2. Au/Are efect bactericid:

A. cefalosporinele

B. tetraciclinele

C. sulfonamidele

D. cloramfenicolul

E. eritromicina

 

3. Inhibă sinteza peretelui celular:

A. macrolidele

B. tetraciclinele

C. cloramfenicolul

D. sulfonamidele

E. penicilinele

 

4. În cazul rezistenţei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se

poate realiza prin:

A. transducţie

B. transformare

C. mutaţie spontană

D. conjugare

E. transpoziţie

 

5. NU se obişnuieşte administrarea de antibiotice bactericide la pacienţii cu:

A. cancer

B. SIDA

C. politraumatisme

D. proteze valvulare

E. gripă

7. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice

Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de

vedere didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru

majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei

şi extinderii rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate

98

fi naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa

dobândită este „achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană,

în circumstanţe date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.

Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni

În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod

eficient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi

de administrare „obişnuite”. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt

afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii

speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu

pe kilogram/corp; utilizarea unor căi de administrare speciale – injectare intravenoasă,

intrarahidiană etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o tulpină este

rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem

în vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.

7. 1. Metode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni

Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista

anumite diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:

a. metode de testare a sensibilităţii „in vitro”;

b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).

7. 1. 1. Metode de testare a sensibilităţii in vitro

Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda

de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la

bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită

dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu

pe agar Mueller-Hinton).

Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină

bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici

sunt:

·         Tehnicile calitative

o   antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)

o   antibiograma difuzimetrică comparativă

o   antibiograma difuzimetrică standardizată

o   antibiogramele difuzimetrice rapide

·         Tehnicile cantitative

o   metoda diluţiilor în mediu lichid

99

o   metoda diluţiilor în agar

o   metoda microdiluţiilor în agar

o   metoda „punctelor de ruptură”

o   testul „E”

o   metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.

7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună

Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar

Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin

„inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui

tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se

lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică

microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată.

Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau

cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de

marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu

ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile

peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de

multiplicare a microorganismului testat.

Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie

în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).

Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai sensibil.

Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se

dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4).

Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt

numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor

foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.

7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)

Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de

referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii

Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de

referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.

Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente,

spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru

microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu

termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a

multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează

comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a

microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru

microorganismul testat.

Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale

marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie

100

microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru

care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la

apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm

microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste

noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.

(Figura nr. 5)

7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)

Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar

este standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional,

care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite

(Film nr. 1).

Elementele necesare standardizării sunt:

·         mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare

nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)

o   există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor

microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când

este testată sensibilitatea la aminoglicozide);

o   se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);

o   există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor

microorganisme pretenţioase;

o   grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);

·         inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să

aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa

108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;

·          timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de

2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;

·         concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea

microcomprimatelor (6 mm diametru);

·         alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;

·         păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de

polietilenă, la +4°C);

·         utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;

·         interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară

rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de

referinţă).

Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace

ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.

7. 1. 1. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid

Acest tip de metodă oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de

microorganismul testat. CMI =concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică

101

concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o

acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.

Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi

cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la

16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor,

fără antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul

standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml

de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor

timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă

la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de

tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare

citim şi interpretăm rezultatele.

Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia

finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de

16 mg/ml, diluţia finală va fi 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu

fie prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie

prezentă (Figura nr. 7).

În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător

datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.

În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea

microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie

de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3mg/ml vor fi eficient

inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.

CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la

amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus,

0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentruHaemophilus influenzae,

2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”)

pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.

7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)

Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca

sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (Figura nr. 8).

Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare,

numărul de sectoare fiind corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană.

Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub fără creştere microbiană, fiecare în sectorul

de placă corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va

corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate

(sectoare de placă fără apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va fi

eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să

depăşească de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii

antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul

102

infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la

imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.

7. 1. 1. 6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints)

Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a

defini sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele

sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru

(mm). (1)

Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă

volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe

microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o

anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce

priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan

cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt

incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile

din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic

(considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul

în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată

rezistentă.

Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date:

distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele

obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului

de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modificările

concentraţiilor medicamentului în timp.

”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fie folosit în clinică şi

trebuie să fie revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de

”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii

epidemiologice în ceea ce priveşte modificarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone

geografice. (1-2)

7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”

„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru

diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E

test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu

cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică

permite determinarea valorii CMI. (3)

Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul

standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice în gradient, de ex. la

un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru

fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă). Însămânţăm

microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem radiar

langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii “E-test” pe suprafaţa mediului de

cultură; Film nr. 2).

Principiu:

103

Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca

turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit

microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri.

Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare.

În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-

32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la

35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde

creşterea bacteriană intersectează banda „E test” (Figura nr. 12 ).

Materiale şi reactivi necesari:

·         plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării);

·         bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează

câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC);

·         medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene

necesare efectuării controlului de calitate ;

·         tulpini martor;

·         inocul bacterian;

·         soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea

inoculului bacterian;

·         benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi

antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării (Figurile nr.

13-14. Modul de prezentare a benzilor “E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru

prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani

·         tampoane sterile;

·         standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;

·         pipete Pasteur sterile;

·         foarfece;

·         plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;

·         incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă

îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;

·         sursă de lumină;

·         aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).

Tehnica de lucru (Film nr. 2):

A. Benzile „E test”

·         scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la

temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai

observăm nici o urmă de umezeală

·         înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă

există perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se

mai pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o

foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile

·         scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri

sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat

104

·         păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru

a le proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea

directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)

B. Inoculul bacterian:

·         cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură

bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm

(există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore

până când obţinem densitatea dorită)

·         ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un

standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la

standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu

garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).

C. Inocularea plăcilor:

·         introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat,

rotim de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii

interiori ai tubului;

·         depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să

acoperim complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu

câte o treime);

·         lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile

„E test”.

D. Aplicarea benzilor „E test”:

·         luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus

agentul antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat

cu E (benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe

suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E

test”, banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului);

·         aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine

concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;

·         dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă

lucrăm cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun

la distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată

cu E trebuie să atingă marginea plăcii);

·         banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule

de aer de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în

sus pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul

testării);

·         banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu

mediul de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat);

dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce

şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau

105

un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă

lichidă.

E. Incubarea:

·         timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent

antimicrobian ce urmează a fi testate;

·         incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ul mediului de cultură şi poate afecta

activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele

supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp.,Neisseria

gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).

Interpretarea rezultatelor:

·         putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau

aproape confluentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);

·         ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton);

citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”;

dacă am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-

chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă

de lumină reflectantă şi o lupă;

·         pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie

a hemolizei;

în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai

mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”

(Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dacă zona de inhibiţie nu

intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI se

raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian

de pe banda „E test”;

·         în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii,

rezultatul pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare;

·         raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul

obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate);

·         rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National

Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru

enterobacterii).

7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice

·         Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe

o   metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice,

dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă

o   se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în

mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.

·         Testarea sensibilităţii mycobacteriilor

o   se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al

Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări)

106

o   se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda

rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc (Figura nr. 18).

·         Testarea sensibilităţii altor bacterii

o   există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare

o   spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se

recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a

streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc. (4)

·         Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)

o   ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru

bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud

o   se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid (Figura nr. 19).

·         Testarea producerii de β-lactamaze

o   este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor

care pot produce β-lactamază (ex.Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc)

o   se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine

cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu

spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20).

·         Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex.

ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice,

utilizând criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21).

7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la

antibiotice şi chimioterapice

Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a

optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la

sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care

au la bază tehnicile de biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai

ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii

de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele

clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia

diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor

studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei

truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identificarea M.

tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a

unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice

(Figura nr. 22).

Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR

(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor

linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate

(cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază

alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea

în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor

benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia

107

unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei

(gena rpoB). (5-6)

Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu

ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează

fiecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate

control).

Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care

hibridizează cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai

multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23).

Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite

suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie

în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a

(histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot

fi identificate prin această metodă.

7. 1. 2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice

Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există

unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice,

precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH,

proteina C reactivă etc.

Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru

evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:

·         determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte

umori (Figurile nr. 24-26 - Citirea NEI din hemocultură sub terapie cu ertapenem; Film nr.

3);

·         determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte

umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din

serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant;

se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă

(Figurile nr. 27-29);

·         utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene,

osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de

imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi

cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 –

Citirea NEI, Efectuarea NEB)

·         determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin

metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

108

7. 2. Povestiri adevărate7.2.1. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România,

comparativ cu EU

În statele Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în

ultimii ani către stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii

microbiene fiind într-o permanentă creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele

comunitare. Alături de alţi agenţi patogeni care stau la baza declanşării de infecţii

nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella

spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din totalul

acestor infecţii.

În vederea monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la

antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct

EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) – un program de

supraveghere a sensibilităţii la antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor

izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis

/ faecium, K. pneumoniae şi P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit

a MRSA este realizată începând cu anul 1999.

În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării

sensibilităţii la antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre

acestea, 7.037 (23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au

raportat o incidenţă a infecţiilor cu MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia,

Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precădere în unităţile de terapie intensivă (peste

60% din totalul tulpinilor de MRSA).

Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata

infecţiilor nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu

partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500

şi 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între

1.300 şi 2.000 de tulpini pe an, Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între

150 şi 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an.

În comparaţie cu aceste stateRomânia a raportat în perioada 2002-2006 un număr

foarte scăzut de tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul

de tulpini raportate de Slovenia şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia); în acest

context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnificative.

În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”,

un studiu al cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice

pentru un număr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost

izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini şi din leziuni cutanate, prin hemocultură

etc. Testarea sensibilităţii la antibiotice a fost efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92

(15,61%) tulpini de MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate fi corelat, printre

altele, cu numărul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de

meticilino-rezistenţă este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele

109

şi cotrimoxazolul constituie în prezent alternative terapeutice compromise, rămânând

active (pentru tulpinile identificate în institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi

aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de

26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină

de S. aureus, penicilina este „uitată” complet).

Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei.

Totuşi, faptul că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este

în scădere, reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi

respectiv a celor comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA.

7.2.2. Este începutul sfârşitului erei antibioticelor?

Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta

lactamază sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate fi

copiată cu uşurinţă şi transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care

purta gena NDM a fost izolată de la un pacient suedez de origine indiană care a avut

infecţie urinară în timp ce vizita New Delhi. Studiile arată că între 1 şi 4% dintre bacteriile

Gram negative din sudul Asiei poartă gena NDM.

NDM a fost identificată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile

devenind înalt rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există

cazuri în care nici aceste antibiotice nu sunt eficiente. În prezent nu există alte antibiotice

pentru a distruge bacteriile purtătoare ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite

precum infecţiile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O

încercare pentru tratarea acestor infecţii ar putea fi administrarea unor ”cocktail-uri” de

antibiotice în sparanţa că acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar

există pericolul de intoxicaţie sau a altor reacții adverse.

Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia

estetică această nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui

studiu s-a constat că NDM1 a fost identificată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a

ajuns în Marea Britanie prin intermediul unor pacienţi care s-au întors din aceste ţări după

tratament.

Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)

8. Relaţiile microorganism - gazdă

Fiinţa umană poate intra în contact cu microorganismele încă din perioada intrauterină,

însă acest contact se realizează numai în cazuri patologice (infecţioase, traumatice etc). În

perioada postnatală începe stabilirea relaţiilor operaţionale între fiinţa umană şi populaţia

microbiană din mediul înconjurător, fie prin colonizare saprofitică, fie prin agresiune ce

110

devine evidentă. Imediat după naştere, microorganismele se stabilesc treptat pe

tegumente şi pe majoritatea mucoaselor. Este vorba în principal de microorganismele care

vor alcătui microflora normală a organismului.

Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană

ulterioară, acţionând prin următoarele mecanisme:

- competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă);

- competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism);

- producţia de bacteriocine (colicine, piocine);

- producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;

- stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant)

al exprimării moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte

celule prezentatoare de antigen;

- stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-

numiţii anticorpi naturali.

Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează

antibiotice cu spectru larg, care vor scădea numărul microorganismelor la nivel intestinal şi

vor permite multiplicarea fungilor şi a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca

urmare, la oprirea terapiei pot apărea fenomene de „rebound”, manifestate prin

repopularea tractului digestiv în avantajul enterobacteriilor faţă de germenii anaerobi.

8. 1. Flora microbiană a organismului

Flora microbiană a organismului poate fi divizată în două grupuri:

- flora normal rezidentă, care se găseşte în mod regulat şi care dacă este perturbată se

restabileşte prompt (sau destul de prompt)

- flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioadă variabilă de timp, de la ore la

săptămâni.

 

Flora microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1) 

a). La nivelul tegumentului

În funcţie de contactul cu mediul înconjurător, flora bacteriană prezintă un grad marcat

de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi  Staphylococcus epidermidis,

Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu

germeni coliformi, chiar stafilococi potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă

fără manifestări nete de agresivitate.

b). La nivelul conjunctivei oculare

Conjunctiva este puţin colonizată, deoarece secreţiile lacrimale conţin substanţe

bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini,

inclusiv a bacteriilor. Pot fi totuși identificați Staphylococcus epidermidis,Propionibacterium

spp., Corynebacterium spp.

c). La nivelul mucoasei nazale

111

În mod normal se pot găsi stafilococi aurii şi albi, streptococi, corynebacterii,

pneumococi etc, floră supusă numeroaselor contaminări prin contacte şi traumatisme

locale.

d). La nivelul cavităţii bucale

La nivelul cavităţii bucale flora conţine diferiţi coci şi bacili Gram-pozitivi şi Gram-

negativi, aerobi şi anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precumS. salivarius, S.

sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobiiVeillonella spp.,

Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas

spp.), de origine aeriană sau alimentară. Există o adevărată microbiologie orală, cu

diferenţe în funcţie de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la nivelul dosului limbii

există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100.000.000 bacterii, iar

la nivelul plăcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii

bacteriene diferite, cele dominante fiindStreptococcus sanguis şi Streptococcus mutans).

Placa dentară, cariile şi boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora

normală bucală.

e). La nivelul tractului respirator

Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, fiind supusă unor numeroase

contaminări prin contacte şi traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaţie), streptococi,

corynebacterii, pneumococi etc.

Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu flora cavităţii bucale. Astfel

se pot găsi streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp,

Bacteroides spp.

Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar.

f). La nivelul tractului digestiv

La acest nivel există o diferenţă evidentă în funcţie de segmentele acestuia, exprimate

mai ales prin chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare şi al adultului, la

acest nivel se găsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum şi foarte

numeroşi germeni anaerobi (Bacteroides spp., enterococi) etc, în total existând aproximativ

1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziţia şi

funcţiile florei normale digestive.

g). La nivel urogenital

Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micţiunii bacteriile de pe tractul urinar

inferior sunt cel mai frecvent îndepărtate. Totuşi, în uretra anterioară poate exista o floră

care este cel mai frecvent alcătuită din fungi, staflococi, corinebacterii şi enterobacterii.

Flora vaginală este dominată de lactobacili (flora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite

cu mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp.,

Bacteroides spp. etc. Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil

multiplicării altor germeni (în special patogeni). Mucusul cervical are în plus o acţiune

bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la

restul compoziţia florei este mixtă.

112

8. 2. Flora microbiană normală din sistemul intestinal

Cea mai puţin înţeleasă parte a organismului îndeplineşte funcţii esenţiale fiziologice,

nutriţionale şi de protecţie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce

influenţează anatomia, fiziologia, cât şi patologia umană. Flora normală intestinală

cântăreşte aproximativ 1 kg şi conţine o bună parte din celulele corpului uman.

Speciile bacteriene ce colonizează sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normală

este unică, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziţia ei se menţine

constantă lungi perioade de timp. Astfel a apărut noţiunea de „amprentă microbiană

unică”.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase decât celulele eucariote ale corpului

uman. În colon există cele mai multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul

este organul cel mai activ metabolic din întreg organismul. (Figura nr. 1)

8. 2. 1. Achiziţia florei normale

Înainte de naştere, în condiţii fiziologice, fătul este „germ-free” (nu prezintă

microorganisme). Apoi, întreg corpul uman și implicit şi tractul gastro-intestinal este

colonizat de bacterii aerobe ce aparţin microflorei materne, de ex. Escherichia

coli sauStreptococcus spp.

După aproximativ o săptămână, încep să predomine bacteriile anaerobe.

În cazul în care nou-născutul este hrănit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii

Gram-pozitive, de tipulBifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp.

În cazul alăptării artificiale, situaţie nedorită şi nerecomandată pentru dezvoltarea

sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbiană intestinală va

deveni foarte asemănătoare cu cea a adultului incluzând Enterobacteriaceae şi specii din

genul Bacteroides.

Flora normală a adultului conţine reprezentanţi din toate cele 3 domenii de

viaţă: Eukaryota, Bacteria, Archaea, după cum urmează.

Din domeniul Bacteria, regăsim microorganisme din genurile Bacteroides (care

reprezintă circa 30% din flora

normală),Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostre

ptococcus, Bifidobacterium, Escherichia şi Lactobacillus.

Din domeniul Archaea, regăsim microorganisme din genul Methanobrevibacter.

Iar din domeniul Eukaryota, regăsim microorganisme din

genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus şi respectivPenicillium.

8. 2. 2. Cultivarea în laborator

Majoritatea speciilor bacteriene rezidente în intestin nu au putut fi cultivate pe medii

standard de laborator. Acestea necesită condiţii speciale, cât mai asemănătoare celor din

sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complexă: interacţiunile

dintre factorii secretaţi de bacterii nu sunt înţelese complet, iar efectele per ansamblu ale

substanţelor proprii organismului asupra florei microbiene sunt, de asemenea, puţin

cunoscute.

113

Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, în timp util şi într-un

mod foarte eficient, ADN-ul bacterian.

Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puţin variabilă. S-a

demonstrat că anumite porţiuni ale secvenţei ADNr a diferitor organisme înrudite între ele

sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce următoarea idee: secvenţierea genelor

unor organisme apropiate filogenetic poate fi aliniată foarte precis, astfel obţinându-se o

evaluare mult mai exactă a diferenţelor existente. Cum? Prin compararea zonelor

hipervariabile ale ARNr, extrem de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele

care codifică pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia

şi pentru a specifica ratele de diferenţiere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza

după realizarea secvenţierii ARNr 16S oferă numeroase informaţii asupra evoluţiei

bacteriene şi asupra relaţiilor dintre specii. Iniţiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel

care a propus ulterior clasificarea microorganismelor în sistemul celor trei

domenii Archaea, Bacteria şi Eucarya.

Spre exemplu, într-un studiu s-a analizat prin secvenţierea ARNr 16 S (aparţine

subunităţii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au

descoperit 1.250 secvenţe diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea

nu aparţin  grupurilor taxonomice cunoscute şi clasificate până în momentul de faţă, în timp

ce mai mult de jumătate nu au mai fost descoperite în nici un alt situs sau în afara

organismului.

Până în prezent au fost identificaţi aproximativ 420 membri ai florei normale, făcând

parte din 117 genuri diferite. Se presupune că există peste 1.000 de specii bacteriene în

sistemul nostru intestinal.

Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi următorul:

1. Prelevarea de produs (materii fecale)

2. Depozitarea preparatului în una din următoarele variante:

-procesare imediată

sau

- îngheţare la -80° C

sau

-depozitare într-un aparat de depozitare şi prelucrare special (PSP® Spin Stool DNA Plus

Kit), la temperatura camerei

3.  Purificarea acidului nucleic

      -există și kituri comerciale

      -liza celulară cu ajutorul unui kit

4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utilizând primeri ale căror ţinte sunt regiunile

variabile ale genei ARNr 16S

5. Analiza şi interpretarea rezultatelor

8. 2. 3. Modificări ale florei intestinale normale

Compoziţia florei microbiene normale este influenţată de numeroşi factori, precum stilul

de viaţă, dieta, starea de sănătate versus starea de boală, vârsta. Astfel, dacă este

114

urmărită evoluţia în timp a prezenţei speciilor de Bifidobacterium şiEnterobacteriaceae în

sistemul intestinal, se vor observa diferenţe semnificative:

Bifidobacterium spp. se află în cantitate maximă la copil, în cantitate medie la adult şi

respectiv în cantitate minimă la persoanele în vârstă, în timp ce Enterobacteriaceaele se

află în cantitate maximă tot la copil, în cantitate minimă la adult şi în cantitate medie la

persoanele în vârstă. (Schema nr. 1; Factori ce determină modificarea compoziţiei florei

normale)

De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizează o selecţie prin cooperarea dintre

gazdă şi diferitele bacterii. O serie de factori locali determină o distribuţie neuniformă a

florei, dintre aceştia putem aminti:

-factori fizici:

•      temperatura;

•      gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe);

-factori chimici:

•      pH-ul (între mese, nu există microorganisme la nivel gastric);

•      procentul de H2O;

•      acizii biliari;

•      secreţia pancreatică;

•      nivelele diferiţilor nutrienţi;

•      secreţia locală de imunoglobuline;

•      diferitele substanţe produse tocmai de către bacterie;

-factori mecanici:

•      peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataşa de mucoasă atunci când

peristaltismul este scăzut; iată şi unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-

peristaltice nu sunt benefice în infecţiile digestive); (Tabelul nr. 2)

•      fenomenul de competiţie între diferitele specii bacteriene etc.

8. 3. Funcţiile florei microbiene normale din sistemul intestinal

8. 3. 1. Flora normală şi sistemul imun

8. 3. 1. 1. Dezvoltarea sistemului imunitar

În studiul unor cercetători de la Harvard Medical School au fost urmărite efectele

colonizării cu Bacteroides fragilis a unor şoareci „germ-free”(crescuţi în mediu steril). Dacă

în lipsa bacteriilor animalele prezentau timusul şi splina incomplet dezvoltate şi un număr al

limfocitelor T CD4+ naive foarte mic, după colonizarea cu Bacteroides fragilis toate

defectele au dispărut. Mecanismul prin care flora determină o dezvoltare normală a

sistemului imunitar se pare că este următorul:

- bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structură

specială;

- PSA este recunoscut şi cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinală;

115

- celulele dendritice îl prezintă limfocitelor T naive şi determină proliferarea limfocitelor

Th1, cu adoptarea unui răspuns imun de tip celular .

Dacă în lipsa florei, organismul tinde spre un răspuns imun de tip umoral, realizat prin

limfocitele Th2, în prezenţa acesteia se echilibrează reacţia sistemului imunitar Th1-Th2.

Astfel, flora microbiană normală „educă” sistemul imun şi contribuie la dezvoltarea şi

funcţionarea normală a acestuia. Toleranţa faţă de bacteriile nepatogene, precum şi

sensibilitatea faţă de bacteriile patogene se dezvoltă începând cu primele zile de după

naştere, iar echilibrul dintre ele este esenţial. (Figura nr. 2)

8. 3. 1. 2. Flora microbiană intestinală ar putea reprezenta cheia în prevenirea

unor stări de hipersensibilitate

Conform acestor explicaţii, în lipsa florei, sistemul imun tinde „să se orienteze” spre un

răspuns de tip umoral. Acest tip de răspuns imun poate fi implicat în apariţia stărilor de

hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreţie excesivă de imunoglobuline. Într-un studiu

al cercetătorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o

hipersensibilitate la nivel respirator, apărută faţă de ovalbumină (un cunoscut alergen) la

şoarecii cu flora normală gastro-intestinală distrusă de antibiotice.

Un alt argument al implicaţiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferenţa

cunoscută dintre compoziţia florei normale a copiilor cu diversele forme de

hipersensibilitate, comparativ cu flora intestinală la copiii sănătoşi; copiii din prima

categorie prezintă un nivel crescut al speciilor de Clostridium difficile şi Staphylococcus

aureus, în timp ce speciile din genurileBacteroides şi Bifidobacteria sunt în cantitate mică.

8. 3. 1. 3. Stresul produs de către sistemul imunitar pare să reprezinte un

semnal de atac pentru bacterii

S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine florei normale la 3% din

oameni, deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea

răspunsului imun, inclusiv în cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină

este „recunoscută” drept o structură negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează

genele de patogenitate. În aceste condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze

răspunsului imun, se multiplică, selectează factori de rezistenţă la antibiotice, secretă

toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolată în sepsis, iar unica

sursă posibilă era reprezentată de flora intestinală). În urma unor intervenţii chirurgicale

majore a fost raportată o frecvenţă crescută a sepsisului cu implicarea Pseudomonas

aeruginosa.

Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate

de cercetători din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu

„intenţionează” să descopere o oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate,

dezvoltă un plan de reacţie.

8. 3. 1. 4. Bacteriile au „propriul sistem imunitar”

La întrebarea privind modul de răspuns al bacteriilor faţă de informaţia genetică

externă sistemului în care se dezvoltă în mod obişnuit, cercetătorii au lansat o serie de

ipoteze. Se pare că bacteriile au capacitatea de a recunoaşte ADN-ul străin. În materialul

nuclear bacteriile deţin proteina H-NS care are funcţia unui receptor pentru moleculele de

116

adenină şi timină din structura ADN-ului existent în mediul exterior. Această proteină

previne activarea lui şi blochează exprimarea informaţiilor ce ar putea dăuna bacteriei. Se

pare că microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de

patogenitate. Cercetătorii sugerează un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute în prezent

drept patogene, în trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia

pestis etc., ar fi devenit patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern).

Aceste studii oferă şi o nouă viziune asupra evoluţiei bacteriilor dar şi asupra utilizării

capacităţii unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La

bacteriile lipsite de H-NS, care nu inactivează structurile genetice umane, producţia de

proteine este mai eficientă.

8. 3. 1. 5. Diferenţierea bacteriilor comensale de cele patogene

Mecanisme ale gazdei

Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care

include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide

binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de

receptori intracelulari. (Figura nr. 3)

Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt:

- enterocitele de suprafaţă;

- celulele M din foliculii limfoizi şi

- celulele intestinale dendritice.

Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA,

chemokine, citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale

către celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă

în continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi

trimit dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le cooptează şi le transportă către

ganglionul limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În ganglion este declanşat

răspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau

reglator, prin limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun.

La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns inflamator sau

chiar poate să apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor inflamatorii care ar putea

fi declanşate de bacteriile patogene.

Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related

molecule) şi NOD2 determină toleranţa faţă de flora normală gastro-intestinală, prin

inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele

intestinale dendritice deprimă la rândul lor reacţia inflamatorie.

Mecanisme ale florei

Toleranţa faţă de flora normală nu este determinată doar de structurile gazdei.

Bacteriile comensale deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul

intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei

(ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediază eludarea mecanismelor de

apărare ale gazdei. Recent s-a demonstrat că secreţia se realizează prin sisteme de

secreţie de tip III (injectarea unor molecule în celulele eucariote, prin intermediul unui

117

flagel) şi de tip IV (transportul ADN-ului sau a unor proteine în celulele eucariote,

asemănător mecanismului de conjugare), mecanisme până acum descrise doar la bacteriile

patogene. (Figura nr. 4)

Flora normală limitează semnalele inflamatorii declanşate de bacteriile patogene prin

următorul mecanism (Figura nr. 5):

- NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene

transmit semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor

determină transcripţia genelor p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine.

- flora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated

receptor) care exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de

asemenea şi cascada inflamatorie.

Spre exemplu, flora intestinală normală scade răspunsul inflamator faţă de Salmonella

typhimurium.

8. 3. 2. Flora microbiană normală inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene

prin „efectul de barieră” sau fenomenul de competiţie

Într-un organism gazdă sănătos, flora normală realizează un „strat protector” de-a

lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei

şi consumă factorii nutriţionali produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale

secretă produşi anti-bacterieni, chemokine, citokine şi IgA. (Figura nr. 6)

În anumite condiţii, spre exemplu atunci când:

- există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;

- este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg);

- există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de

imunosupresie, o modificare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.);

- se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.)

flora microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală.

8. 3. 3. Flora normală intestinală „determină” greutatea fiecărui individ

Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în

polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi

cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de

grăsime în comparaţie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat că:

- Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale;

induce formarea reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în

timp ce

- Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi

prin sinergie cu B. thetaiotaomicronstimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia

caloriilor.

Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbiană normală

intervine în reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)

Primul dintre acestea ar fi influenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice.

S-a demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile

transformându-le în produşi digerabili, astfel crescând extracţia energetică. 

118

O altă ipoteză stabileşte o legătură între flora normală intestinală şi homeostazia

metabolică. O dieta bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel

intestinal: cresc bacteriile Gram negative şi scad bifidobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides

spp.                                             Această modificare determină creşterea nivelului plasmatic

al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un răspuns inflamator cronic de mică intensitate la

nivelul ficatului, al ţesutului adipos şi al hipotalamusului. Apare o creştere în greutate şi o

acumulare excesivă a lipidelor la nivel hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei rezistenţei la

insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8)

Un al treilea mecanism este acela prin care flora normală induce reglarea unor gene ale

gazdei. Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic.

Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât

şi în tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi

cantitate de hrană, prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor.

Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în flora normală a

pacienţilor obezi este cauza sau consecinţa obezităţii?

8. 3. 4. Fermentarea şi absorbţia polizaharidelor în colonul proximal

Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală

îndeplineşte această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu

lanţ scurt de carbon şi gaz.

Microorganismele florei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor

intestinale (epiteliale şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari.

Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă.

Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de floră, au ca efect scăderea pH-ului în

lumenul intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o

rezistenţă scăzută la pH acid.

Prin fermentarea zaharolitică, flora are o importantă funcţie energetică, creşte

reabsorbţia apei, precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe).

8. 3. 5. Alte funcţii          

8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitică în colonul distal - importanţa dietei reduse

în proteine

Prin fermentarea proteolitică flora normală intestinală produce o serie de toxine şi

substanţe cu posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie

directă cu cantitatea de proteine ingerate.

      8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari în cocarcinogeni

Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare

sau hidroliză acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie de cocarcinogeni. Lactobacillus

bifidus blochează acidul colic intracelular şi astfel împiedică formarea de cocarcinogeni.

      8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K

Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides

fragilis şi Escherichia coli participă la sinteza vitaminei K2.

8. 3. 5. 3. Absorbţia vitaminei B12

A fost dovedit rolul florei intestinale normale în absorbţia de vitamină B12.

119

8. 3. 6. Flora microbiană normală - partenerul silenţios în manifestarea bolii

Boala inflamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu

care trebuie luat în discuţie şi aflat în relaţie cu flora intestinală normală. (Figura nr. 9)

Boala inflamatorie intestinală include:

- boala Crohn, în care procesele inflamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la

nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului

subţire; în cazul afectării colonice pot apărea fistule şi abcese în regiunea anală.

- colita ulcerativă include răspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte

interiorul rectului (proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă).

În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi

patologice. Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la

persoanele afectate:

- o predispoziţie genetică;

- lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut;

- „igiena excesivă”în copilărie, cu o insuficientă dezvoltare a răspunsului imun;

- excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi;

- tratament cu antibiotice utilizat frecvent.

Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar fi pierderea toleranţei faţă

de flora normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de

hipersensibilitate şi reacţii autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută.

Compoziţia florei normale este modificată (de ex. specii din genul Clostridium apar în

proporţie mai mare faţă de normal), dar nu s-a putut demonstra dacă aceasta determină

boala sau dacă este doar un efect al inflamaţiei intestinale.

Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată flora normală, spre ex.

neoplazii (digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după

modificarea habitatului (ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul

urinar), obezitate, stări de hipersensibilitate, autism, depresie etc.

8. 3. 7. Farmabioticele

Reprezintă orice formă de „exploatare farmaceutică” a florei normale (probiotice,

prebiotice, sinbiotice).

Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme vii (bacterii, fungi)

cu efecte benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt în general cele

producătoare de acid lactic (scad pH şi împiedică dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura

nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus şi Bacteroides.

Prebioticele reprezintă ingrediente alimentare non-digerabile care afectează în mod

pozitiv gazda, stimulând în mod selectiv creşterea şi/sau activitatea unei sau a unui număr

limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidraţi iar bacteriile stimulate

sunt Bifidobacteria sau bacteriile producătoare de acid lactic.

Sinbioticele sunt produse care conţin atât probiotice, cât şi prebiotice.

Există dovezi ce susţin rolul terapeutic al probioticelor în boala inflamatorie intestinală,

infecţii, cancer, artrită.

120

8. 4. Relaţii microorganism-gazdăCu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză,

convieţuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la

care participă unii coliformi intestinali).

Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microflora normală se află în relaţii

de comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi

creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate fi uşor

tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor)

pot modifica aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din flora normală pot

manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene.

Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în

detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.

Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta

decât în organismul gazdei (de exempluMycobacterium leprae, Treponema

pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi

libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism

(de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

8. 5. Povestire adevăratăRolul şi importanţa florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine

stabilite. Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse

afecţiuni, să afecteze cât mai puţin această floră. O primă idee este utilizarea de antibiotice

cu spectru cât mai „ţintit” (îngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte

„piatra de încercare” a medicilor, credem, o reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice

inutile. Câţi dintre medici nu recomandă scheme după scheme de medicamente anti-

stafilococice doar pentru că la exsudatul faringian se izolează un stafilococ, fie el chiar şi

„auriu”? Mai toţi. Încercăm „sterilizarea” de acel stafilococ, doar dacă pacientul urmează să

primească un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens

imunosupresor, altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe de altă parte, rămâne o întrebare pe

care o punem tuturor generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de

infecţii stafilococice întâlnite şi raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este

menţionat şi testul coagulazei? Însă, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie să

uităm niciodată că utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice, în special a celor

cu spectru larg, afectează uneori decisiv flora microbiană normală a cărei utilitate este în

momentul de faţă binecunoscută.

8. 6. Ştiaţi că .......Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea şi Dezvoltarea

Probioticelor a afirmat: “Lactobacilul este doar o bacterie. Să spui că un produs conţine

lactobacil este ca şi cum ai spune că îl aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi

121

actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care întâmplător  îl cheamă

George Cloney. În cazul probioticelor există diferenţe importante între tulpini”?

....atunci când doriţi să achizionaţi produse ce conţin probiotice ar trebui să le căutaţi

pe acelea pe a căror etichetă este specificată tulpina conţinută şi care oferă cititorilor acces

liber la studiile ştiinţifice de suport? O sursă bună pentru informarea asupra efectelor

variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov.

....puteţi să vă faceţi singuri iaurt cu probiotice? Aveţi nevoie de 1l lapte steril-orice tip,

chiar şi de soia, un iaurt-sursa de probiotice şi de un recipient în care doriţi să faceţi iaurtul.

Cuptorul se încalzeşte timp de 15 minute la 180 grade, se lasă să se mai răceasca timp de

10 minute. Se aşează în cuptor recipientul şi compoziţia pentru iaurt. Se închide uşa de la

cuptor şi se lasă 12 ore, peste noapte. Dacă dimineaţă observaţi că nu a ajuns la

consistenţa dorită mai lăsaţi-l în cuptor timp de 12-24 ore.

9. Patogenitate şi Virulenţă9. 1. Agenţii infecţioşi

Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai

ales germenii patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:

- virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care

provoacă boli infecţioase numite viroze;

- chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în

citoplasma celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;

- mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se

pot dezvolta pe medii artificiale îmbogățite;

- rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu

se pot cultiva în afara celulelor vii;

- bacterii propriu-zise;

- fungi;

- protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;

- metazoare.

În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni,

constituiţi dintr-o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid

nucleic, cu potenţial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a

numeroşi factori fizici şi chimici care inactivează virusurile. Sunt capabili de a se reproduce.

Afectează atât oamenii cât şi mamiferele. Sunt implicaţi etiologic în maladii cu evoluţie

122

lentă, precum encefalopatia spongiformă transmisibilă care include spre exemplu boala

Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatală familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni

degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiformă bovină, începând

cu anul 1996 au fost descrise afecţiuni umane, după consumul de carne de vită; maladia

poartă numele de „Creutzfeldt-Jacob noua variantă”. Principalele manifestări sunt

reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somn-veghe. La o treime din

pacienți, manifestările oculare pot masca demența. Deteriorarea mentală este rapid

progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în medie 7-9 luni. (1)

Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând

un proces infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale

mucoaselor, multiplicarea ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi

vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt influenţate în largă măsură de:

- factorii de patogenitate ai microorganismului;

- factorii de apărare ai gazdei.

9. 2. Patogenitate şi virulenţă. Caracterele de patogenitate ale bacteriilor

Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă

fenomene morbide, patogene, modificări locale, generale şi „functio laesa”. Patogenitatea

este un atribut de specie şi este determinată genetic.

Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este

un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii

depinde de condiţiile în care trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie

bacteriană care a pierdut virulenţa în condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în

anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV /

SIDA). Virulenţa poate fi cuantificabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în

condiţii standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit

DL50, adică doza letală 50%).

Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene

pot fi:

- multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;

- multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general

„exotoxine”).

9. 2. 1. Multiplicarea şi invazivitatea

123

Germenii patogeni se multiplică la poarta de intrare şi invadează organismul prin

formarea de abcese şi prin propagarea din aproape în aproape în „pată de ulei”, dar pot

trece şi direct în circulaţia generală. În acest caz produc infecţii la distanţă. Pentru a avea

loc această succesiune a evenimentelor, germenii trebuie să poată rezista reacţiilor de

apărare nespecifică a gazdei (de exemplu fagocitozei) şi să poată adera de celulele

mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Există o aderenţă nespecifică, de fapt

un proces chimic şi fizic, reversibil, cu implicarea atracţiei hidrofobe, electrostatice dar şi a

mişcării browniene şi a existenţei biofilmului de polimeri. Aderenţa specifică poate fi la

rândul său reversibilă dar, dacă implică suficient de mulţi factori (structurali, diferite forţe

de legătură), poate deveni ireversibilă.

Biofilmul include populaţii bacteriene aparţinând uneia sau mai multor specii,

înconjurate de polimeri extracelulari (EPS -extracellular polymeric substances).

Microorganismele aderă între ele, dar şi la suprafeţe, formându-se o structură

asemănătoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienţilor şi eliminarea

substanţelor reziduale, precum şi comunicarea interbacteriană. Dezvoltarea biofilmului

cuprinde 5 etape (Figura nr. 1):

·         ataşarea reversibilă,

·         ataşarea ireversibilă,

·         maturarea 1,

·         maturarea 2 şi

·         dispersia.

Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare şi de

înfundarea conductelor de apă. Din punct de vedere medical, se pot observa în cazul

endocarditei (pe valve), otitei medii, plăcii dentare şi pot reprezenta o problemă pentru

pacienţii cu fibroză chistică. Biofilmele se dezvoltă şi pe implanturi sintetice cum ar fi:

catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc.

O caracteristică foarte importantă a biofilmelor este reprezentată de rezistenţa crescută

la antibiotice, de până la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt atât EPS, care

acţionează ca o barieră sau care pot chiar inactiva antibioticele, cât şi faptul că în cadrul

biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel încât o activitate metabolică scăzută va

conduce la o asimilarea mai lentă a antibioticelor.

Dintre bacteriile implicate în producerea de biofilme amintim: Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi

β hemolitici etc. (2)

Poate fi luat în discuţie şi „tropismul”, care poate fi specific pentru anumite structuri ale

gazdei [ex. tulpinile de E. coliuropatogene aderă cu ajutorul unei

adezine papG (pyelonephritis-associated pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa

celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din

grupul A, meningococul sau gonococul infectează numai gazda umană).

9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor

- pilii comuni (fimbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe

tipuri de pili, astfel că cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a

124

infecta un anumit tip de ţesut. De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau

Pap, având tropism pentru tractul urinar. (3)

- lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi);

- liganzii (molecule care realizează legături specifice cu anumite molecule

complementare de la nivelul substratului);

- glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei

bacteriene);

- „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe

polimerice extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifică a

bacteriilor într-un strat vâscos);

- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în

cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice);

- adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot fi definiţi drept „adezine”);

- substanţe componente ale peretelui bacterian

- proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un

dimer ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui

bacterian, măsurând de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza

sau opsonizarea de către PMN, în lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la capătul

variabil N-terminal al dimerilor.

- antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella

typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împiedica

acţiunea anticorpilor, are proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid.

Serotipurile care prezintă acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini

de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor două

serotipuri, fiind sursa ideală de antigen Vi, necesar preparării antiserului.

- polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic);

- antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din

lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de

enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă

rezistenţă împotriva sărurilor biliare, complementului (diminuând activitatea MAC –

membrane attack complex) şi fagocitozei; prezintă şi activitate mitogenă, stimulând

diferenţierea policlonală şi multiplicarea limfocitelor B, determinând astfel secreţia de

imunoglobuline, precum IgM şi IgG. LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o porţiune

centrala rugoasă polizaharidică (regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).

- antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus

anthracis) etc.

În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect aflat în

imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria

coloidală DLVO (după numele autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie

există 2 poziţii de stabilitate termodinamică, prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei,

forţelor de tip van der Waals, forţelor electrostatice şi tensiunii superficiale (Schema nr. 1).

125

Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a

particulelor spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest

„minim secundar” corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces

reversibil.

Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice,

hidrofobe) care vor duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate

ireversibil de substrat. Aderenţa se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul

secundar” şi intră în „minimumul primar”. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele

tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea este destinaţia finală, în timp ce

pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o etapă, urmând

penetrarea tisulară şi / sau diseminarea în organism.

9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor

(agresine) (Tabelul nr. 1)

- coagulaza liberă şi/sau legată a S. aureus care transformă fibrinogenul în fibrină şi pe

de o parte poate „masca” bacteria înconjurată de structuri asemănătoare cu ale gazdei, pe

de altă parte poate preveni fagocitarea sau chiar împiedica ajungerea antibioticelor şi

chimioterapicelor la sediul infecţiei;

- leucocidina secretată după ce stafilococul a fost fagocitat şi care transformă leucocitul

în piocit (se inseră în membrana leucocitului şi produce pori sau degradează enzimatic

fosfolipidele de la nivelul membranei);

- producerea unor substanţe care cresc concentraţia intracelulară de AMPc până la

concentraţii ce inhibă fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium

tuberculosis);

- producerea de catalază (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium

fortuitum), glutation peroxidază, superoxid dismutază, citocrom oxidază (Vibrio spp.,

Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhibă sau inactivează radicalii activi de

oxigen;

- producerea unor factori care conferă rezistenţă la enzimele lizozomale, după

fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc);

- producerea de enzime litice:

1. colagenaza (este produsă de Clostridium histolyticum şi Clostridium perfringens şi

distruge colagenul prezent în muşchi facilitând răspândirea procesului infecțios),

hialuronidaza (scindează acidul hialuronic, o componentă a ţesutului conjunctiv),

fibrinolizina (determină liza cheagului prin convertirea plasminogenului în plasmină) etc

(streptococ, stafilococ, unele clostridii);

2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de

exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis);

3. fosfolipaza (toxina a) (realizează hidroliza fosfolipidelor din membrana celulară, prin

îndepărtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens);

4. neuraminidaze (degradează acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella

dysenteriae);

126

5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra

ADN şi ARN, generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc;

6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge

(streptococ, stafilococ, unele clostridii) etc.

- producerea unor substanţe care inhibă sau modifică răspunsul imun

1. IgA proteaza (clivează IgA în regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H.

influenzae);

2. proteina A stafilococică (inhibă opsonizarea);

3. endotoxina care creşte sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α etc;

4. inducerea apariţiei unor reacţii autoimune;

5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicată

în sindromul de şoc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt

printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorată lor poate determina

atât anergie, cât şi hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezultă o secreţie în exces

de IL-2 care interferă cu sinteza altor citokine (TNF-α, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de

superantigene ar fi: toxina pirogenică streptococică (produsă de tulpinile lizogenizate),

enterotoxinele stafilococice (S. aureus), subtanţe cu efecte asemănătoare hormonilor (ex.

toxina stabilă termic produsă de E. coli enterotoxigen) etc.

Fiecare din substanţele de mai sus are un rol bine definit în evoluţia reacţiei inflamatorii

locale.

9. 2. 2. Multiplicare şi toxinogeneză

Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări

celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi

prin „functio laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci).

Din punct de vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni:

9. 2. 2. 1. Exotoxinele

Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu

bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat

plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin

mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas

aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)

Au structură proteică, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar

legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active).

Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din

structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă.

Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală fiind de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg

corp în cazul toxinei botulinice).

127

Au afinitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard,

SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă

(când toxina este deja fixată pe celulele ţintă).

Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale,

toxina putând fi neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.

Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.

Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse

de Clostridium difficile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, fiind

responsabile de o boală diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel

leziuni microscopice, dar şi leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor

identifica noduli.

Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor

structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic

alterarea microfilamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în

morfologia citoscheletului, dar şi alte modificări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea

microvililor). (Figura nr. 5)

Astfel, modificările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: inflamaţia, creşterea

permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine,

acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea

mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea

joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă

de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din

lamina propria; este implicată în diareea inflamatorie.

9. 2. 2. 2. Antitoxinele

Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi

specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare

specifică cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia

specifică. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea

exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).

Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii

preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi

timp cât mai curând posibil.

Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui

manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale

hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la

seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar fi administrarea de

imunoglobuline umane specifice, dacă acestea sunt disponibile.

9. 2. 2. 3. Anatoxinele

Exotoxinele pot fi detoxifiate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a

temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin

puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în profilaxia bolilor

produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum

128

şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric,

antitetanic, antibotulinic etc).

9. 2. 2. 4. Endotoxinele

Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei

externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în

urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor

intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide. (Figura nr. 6)

Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare

indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în

comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei,

leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps,

sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în

apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu

numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie

destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se

identifică 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă.

Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică

este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la

patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor

distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ aflat în circulaţie se

cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin

intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul

inflamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în final poate rezulta şocul.

Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor

stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect

de creştere a fenomenelor inflamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi

sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma

tratamentului.

Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de

mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.

În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:

- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul,

deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;

- Listeria monocytogenes produce o substanţă “endotoxin-like” etc.

9. 3. Apărarea organismului faţă de infecţii

Apărarea organismului faţă de infecţii se realizează prin diferite mijloace nespecifice şi

specifice. Acestea exprimă împreună capacitatea normală de păstrare a homeostaziei

organismului prin rezistenţa faţă de aderarea microorganismelor de celulele ţesuturilor

129

expuse, faţă de colonizarea şi multiplicarea germenilor în organism, prevenind invazia

agenţilor patogeni.

Principalele componente ale apărării antiinfecţioase sunt reprezentate de:

9.3.1. bariera anatomică cutaneo-mucoasă, care acţionează prin:

- Integritatea sa anatomică: Pielea este o barieră în fața invaziei microorganismelor

deoarece este formată din straturi de celule strâns unite între ele, dar şi datorită stratului

de keratină. Descuamarea continuă a straturilor pielii are rol în eliminarea

microorganismelor. În general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecțios poate

debuta în urma unor traumatisme, intervenţii chirurgicale, utilizarea de catetere iv,

intervenției unor vectori. (3)

- Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidină, β-defensină. Acestea au şi rol de

chemokine, favorizând migrarea celulelor cu rol în fagocitoză.

- Mucoasele sunt umede şi deţin mai multe bacterii decât pielea. Majoritatea celulelor

epiteliale secretă aceleaşi peptide ca şi cele ale pielii. În plus conţin salivă, mucus, lacrimi,

cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector şi prin conţinutul crescut de lizozim.

- Prezenţa de:

·         IgA secretorii (sunt secretate IgA şi IgG cu rol în aglutinarea, dar şi blocarea

competitivă a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este

mai mare decât IgG datorită rezistenţei acesteia la proteoliză prin cuplarea cu un

polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare împiedicând pătrunderea

acestora în celule.),

·         lactoferină (proteină cu rol în legarea fierului. Fierul este un element important

pentru supravieţuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizează pielea şi

mucoasele au mecanisme de achiziționare a fierului chiar în prezenţa acestor proteine),

·         alfa 1 antitripsină, lizozim (joacă unul din rolurile cele mai importante, având

efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din

componenţa peptidoglicanilor) etc.;

- pH-ul acid al unor secreţii locale: pH-ul acid şi flora bacteriană au rol în inhibarea

invaziei bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescută  la colonizare.

- Prezenţa microflorei normale, ce constituie nişa ecologică pe care germenii nou veniţi

tind să o ocupe. Flora comensală este un ecosistem cu rol în apărarea împotriva invaziei

microorganismelor  patogene. Mecanismele competitive sunt: competiţia pentru aceleaşi

substanțe nutritive, competiţia pentru aceiasi receptori. Secretă şi bacteriocine, fiind toxice

pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeaşi specie, acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi

toxici.

9.3.2. barierele de organ

- Bariera hematoencefalică: este o barieră fiziologică între sistemul sangvin și sistemul

nervos central (SNC). Aceasta servește la menținerea unei homeostazii constante în SNC.

Această barieră are rolul de filtru, împiedicând pătrunderea în creier a unor substanțe

toxice, germeni patogeni, care se pot afla în sânge. În același timp bariera permite

pătrunderea din sânge a substanțelor nutritive necesare SNC.

130

- Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieţui filtrării în tractul respirator

superior şi traheobronșic. Fluxul turbulent determină depunerea particulelor de dimensiuni

mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le îndepartează din

plămani. Efortul de tuse ajută la eliminare. Secreţiile bronşice conţin substanţe precum:

lizozim, β-defensine, lectine. Când particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor

îndepărtarea este realizată de macrofage şi histiocite. Toate aceste mecanisme de apărare

pot fi învinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere îndelungată.

Poluarea aerului, prezenţa traheostomei, agenţii ”alergici”, defectele genetice etc. pot

diminua mecanismele de apărare ale tractului respirator.

- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentată de aciditatea gastrică şi rolul

antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul şi

descuamarea celulelor epiteliale au şi ele rol în apărarea antimicrobiană.Salmonella

spp. şi M. tuberculosis produc infecţii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul încetinit

favorizează infecţia cuShigella spp. Pierderea joncţiunilor strânse dintre enterocite poate

favoriza translocarea bacteriilor în circulaţie.

- Tractul genitourinar: urina este în mod normal sterilă. Factorii care împiedică

colonizarea bacterienă sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall

(produsă de rinichi şi excretată în cantitate mare în urină). Glicoproteina Tamm-Horsfall

acţionează ca un burete, bacteriile leagându-se de aceasta şi astfel împiedicând

colonizarea ţesuturilor. Tractul urinar inferior este spălat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi,

eliminând organismele patogene. Retenţia urinară este una dintre principalele cauze ale

infecţiilor urinare.

9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10

9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de înglobare şi distrugere a

microorganismelor de către celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se găsesc

în toate ţesuturile corpului, iar celulele PMN şi monocitele circulă prin sânge şi sistemul

limfatic. Chemokinele au rol în iniţierea migrării celulelor fagocitare spre ţesuturi, având rol

în inflamaţie.

Când o bacterie este internalizată într-un fagozom, este distrusă de radicalii de oxigen,

şi de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cuplează cu

moleculele complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor

T, determinând multiplicarea acestora şi activarea răspunsului imun celular şi umoral.

Fagocitoza este mai eficientă în spaţiile intratisulare înguste (alveolele pulmonare),

decât la nivelul suprafeţelor întinse (sinovială) sau în sânge. Opsonizarea favorizează

fagocitoza.

9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement)

9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi)

- interferonii (alfa, beta, gamma);

- interleukinele;

- colony-stimulating factor (CSF);

- citolizinele-factorul de necroză al tumorilor (TNF) alfa şi beta;

- poliperforinele;

131

- factorii de creştere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa şi beta;

- factorii supresori şi inhibitori ai multiplicării.

9.3.7. sistemul imun (umoral şi celular);

9.3.8. alţi factori:

- complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12

- imunitatea de specie (naturală, înnăscută);

- factorii nutriţionali (vitamine, fier, zinc etc): Scăderea fierului seric poate fi rezultatul

răspunsului inflamator. Bacteriile necesită fier pentru creștere. Transferina are rol în

legarea fierului şi transportarea sa în macrofage, scăzând astfel, cantitatea de fier pe care o

pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade în timpul inflamaţiei. Acesta grăbeşte vindecarea

rănilor, are rol în sinteza proteică şi creşte responsivitatea limfocitelor. Persoanele

malnutrite sunt predispuse la infecţii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct

de vedere) sunt vitaminele A şi D. Anecdotic, anterior descoperirii ”tuberculostaticelor”,

tuberculoza se trata prin dietă; pacientul consuma până la 30 de ouă zilnic.

- factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul

proteic produce aminoacizi care ulterior vor fi folosiţi la sinteza celulelor de apărare şi a

proteinelor. Estrogenii au rol în protecţie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T

este   inhibată în timpul sarcinii, astfel pot apărea infecţii severe cauzate de virusul

poliomielitei, streptococii β hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales până în trimestrul

al III-lea de sarcină.

- factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea şi morbiditatea legate de infecţie sunt

influenţate de bagajul genetic. Cauzele pentru această susceptibilitate crescută sunt

polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor,

chemokinelor sau ale receptorilor acestora.

- stresul: Stresul creşte susceptibilitatea organismului la infecţii.

- sistemul nervos central.

9. 4. Povestiri adevărate9. 4. 1. LPZ și CID

Coagulare intravasculară diseminată în cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un

prematur cu nutriţie parenterală totală (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-

negativi)

În primăvara anului 2007, într-o maternitate din Bucureşti s-a născut pe cale naturală

un prematur cu vârsta de gestaţie de 30 săptămâni şi greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar

7 (la 5 minute de la naştere). Mama copilului a prezentat în cursul sarcinii infecţii urinare

recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore înainte de naştere a avut loc ruperea

prematură a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implică riscul

producerii de infecţii).

Prematurul a prezentat de la naştere o detresă respiratorie, pentru care a necesitat

ventilaţie cu presiune pozitivă continuă şi nutriţie parenterală totală (având, în plus,

intoleranţă digestivă). Nutriţia parenterală continuă a presupus cateterizarea venoasă

132

centrală a copilului. Întrucât această cateterizare, asociată cu ventilaţia asistată cresc riscul

infecţios al nou-născutului, s-a instituit antibioterapia empirică de protecţie cu ampicilină şi

gentamicină.

Evoluţia copilului a fost iniţial favorabilă timp de o săptămână, pentru ca ulterior acesta

să dezvolte o patologie digestivă manifestată prin abdomen meteorizat (mărit de volum),

vărsături bilioase şi scaune sanguinolente, asociate cu febră (39°C).

S-a pus diagnosticul clinic şi radiologic de enterocolită ulceronecrotică (necroză

intestinală de etiologie incertă) şi sepsis neonatal.

Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens

pozitive. Culturile din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli.

Hemocultura a fost negativă, ceea ce nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul

a primit tratament cu antibiotice anterior recoltării probelor.

Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID

(coagulare intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie

pulmonară, trombocitopenie, timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină

crescute, hipofibrinogenemie, prezenţa în cantitate mare a produşilor de degradare ai

fibrinei). S-a instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină (la care E. coli se

dovedise a fi sensibil), cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar. Starea

copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat,

ca ultimă alternativă, o transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în

sistem IPPV – Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluţia copilului a fost în

continuare nefavorabilă, hemoragia pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în final

la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare.

Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID.

Discuţii

Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut fi precizată cu certitudine (medicii au suspicionat,

totuşi, ca sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei).

Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit

factori de risc major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal

a favorizat diseminarea pe cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat

sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID.

Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de

gravitate care a condus în final la decesul copilului.

9. 4. 2. Infecțiile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la

pacienții transplantați renal

Tânăr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune și diabet zaharat tip 1, transplantat

renal în urmă cu 28 luni se internează pentru febră, durere în flancul stâng, și o scădere în

greutate de peste 10 kg în ultima lună. De aproximativ 6 luni pacientul acuză dureri

intermitente în flancul stâng. În ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de

furunculoză și celulită fesieră. Culturile efectuate evidențiază un Stafilococ auriu meticilino-

rezistent, cu următoarele rezultate la antibigramă: rezistent la oxacilină, eritromicină, dar

sensibil la vancomicină, biseptol, tetraciclină, rifampicină, linezolid. Leziunile au fost

133

incizate și drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol și a

efectuat decolonizarea nazală cu mupirocin. (4)

În cursul anamnezei, pacientul relatează raporturi sexuale cu persoane de același sex și

i se efectuează serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuată

fără complicații cu tacrolimus, micofenolat mofetil și prednison.

La examenul obiectiv: temperatura 36,9˚C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvența

respiratorie 19/min.

Analizele de laborator evidențiază o leucocitoză (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de

107 mm/h, Proteina C reactivă 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.

Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe

8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului

vertebral L5 și a procesului stâng transvers.

Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent.

Culturile în anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.

A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de

tratament cu linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit

apoi Biseptol încă 8 săptămâni.

După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă

0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au înregistrat recăderi.

În afară de identificare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru

evidențierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea

genică responsabilă de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)

Discuţii: Infecțiile reprezintă complicațiile cele mai frecvente la pacienții transplantați.

Infecțiile cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecții intraspitalicești și

au devenit o problemă de sănătate publică. (6)

Un alt factor de risc important pentru infecția cu Stafilococ este și diabetul zaharat.

Leucocidina Panton–Valentine este un factor solubil, care permit multiplicarea şi

invazivitatea stafilococului. Determină liza polimorfonuclearelor și monocitelor. Este

considerată un factor de virulență, care determină creșterea severității bolii atât în

afecțiunile cutanate, cât și în osteomielită sau pneumonii necrotizante.

9. 5. Evaluarea cunoștințelor1. Prionii sunt constituiţi din:

A. ADN-înveliş proteic                                                                                                 

B. ARN-înveliş proteic

C. o particulă proteică

D. miez glucidic + înveliş proteic

 

2.      Lactoferina are capacitatea de legare a:

A.    fierului

B.     zincului

134

C.     cuprului

D.    magneziului

 

3.   Biofilmul:

A.  reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii

B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele

C. se poate dezvolta pe un cord transplantat

D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină

E.   cuprinde bacterii și polimeri extracelulari 

 

4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor:

A. coagulaza, glicocalixul, capsula

B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi

C. leucocidina, catalaza, hemolizine

D. antigenul K, pilii, capsula

 

5. Una dintre următoarele reprezintă o substanţă ce modifică răspunsul imun:

A. neuramidaza

B. Ig A proteaza

C. pilii

D. “noroiul”

Noţiuni de imunologieImunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al

Microbiologiei, studiind mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de

agresiunea din cursul procesului infecţios.

În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii.

În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi,

Lucanus a considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”.

Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele

care mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că

pustulele care apăreau pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care

mulgeau se asemănau, au dus la concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În

1796, Jenner a realizat una dintre primele experienţe pe om (a inoculat secreţie din

pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreţie de la pacienţi cu variolă, iar

copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă). Cu toate acestea, reacţiile în „mass-media”

vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile din poza de la RM

Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur

şi Metchnikoff. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi

împotriva antraxului şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să

denumească procedeul de inoculare cu germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de

135

boală, vaccinare(probabil pentru că Jenner a obţinut primele sale rezultate recoltând şi

inoculând produsul obţinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von

Behring şi S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior au

realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început

să se discute în 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste

studii şi multe altele, care ar merita dedicarea unui volum întreg, mult amplificate în

deceniile care au urmat sunt mai departe „în continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri

chiar şi în prezent.

Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc)

ar putea fi asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme

de control, sisteme de comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care

există implicare importantă şi din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în

exemplul privind situaţia la nivelul unei ţări, „soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT

citotoxice, celulele NK) pot avea atât o activitate efectoare cât şi de control şi retro-control

(îşi „depăşesc” limitele de „simpli soldaţi”).

S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?

Să nu uităm faptul că în fiecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile

microorganisme: bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în

nici un mod, altele au efecte benefice faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte

dintre microorganisme pot duce la apariţia unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun

„a fost nevoit” să găsească modalităţi prin care să „lupte” împotriva microorganismelor

patogene şi condiţionat patogene.

Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri

proprii modificate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care

în mod normal protejează organismul de eventualele infecţii pot fi implicate în

determinarea unor leziuni tisulare sau de organ.

Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu

mult mai complexă), o definiţie a imunităţii ar putea fi următoarea: imunitatea

reprezintă o reacţie faţă de orice structură non-self (fie microorganism sau o

substanţă străină de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o

celulă sau structură proprie care a suferit modificări.

Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi

discipline. Având drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit

să le introducem în „Manualul de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în

revistă” a organelor, celulelor, moleculelor şi mecanismelor implicate în imunitate.

Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate definiţiile şi explicaţiile; pentru aceasta

cititorul va trebui să parcurgă fiecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar

scop didactic; în realitate fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât

pot fi explicate într-un „simplu manual” sau chiar şi decât ar putea fi acestea explicate de

oamenii de stiinţă, în acest moment. Ceea ce noi cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-

un ocean”.

136

Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în

cazul în care acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele,

mucoase etc) şi să pătrundă în ”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de

imunitatea înnăscută.

Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de

orice fel (recunoaşterea nu este specifică) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi

răspunsul inflamator.

Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor.

Aceasta din urmă este specifică deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule

specifice pentru a „lupta” strict împotriva acestui antigen.

O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată de

capacitatea limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un

anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu

acelaşi antigen, limfocitele îl vor recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult

mai rapid.

Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor fi

furnizate în capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul

pătruns în organism este captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC)

(macrofage, celule dendritice, limfocite B etc).

Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o

anumită parte a lui numită epitopprezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare

maximă şi poate declanşa un răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC,

prelucrat în lizozomi iar epitopii rezultaţi vor fi prezentaţi limfocitelor în complex cu

moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente

pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un răspuns

imun.

Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după

cum există două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine

care pot activa oricare din cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după

proliferare şi blastizare) secretă imunoglobuline (anticorpi) implicate în răspunsul imun

umoral.

Antigenele pot fi clasificate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/

timoindependente etc.

Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi

independente prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene

endogene timodependente prezentate pe MHC I.

În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară

răspunsul imun? O parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum

măduva osoasă hematogenă (sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B)

şi timusul (sediul maturării limfocitelor T) şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a

splinei unde se desfăşoară răspunsul imun umoral şi este iniţiat cel celular care se

desfăşoară apoi la locul infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10).

137

Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine

balanţa între un răspuns imun eficace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui

RI exagerat). Când această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de

hipersensibilitate.

Povestire adevărată: Povestea vaccinului

Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de

mic el a fost interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele sunt

protejate de variolă, zvon pe care l-a auzit şi el.

La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit

chirurg din Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat

o prietenie adevărată. Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge

uman. A câştigat experienţă în biologie şi bineînţeles, în chirurgie.

De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola.

Punând lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar

putea avea o oarecare legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o

tânără lăptăreasă, Sarah Nelms, care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe

mâini şi braţe. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la băiatul unui

servitor în vârstă de 8 ani, James Phipps. Ulterior, băiatul a prezentat febră şi discomfort în

zona axilară. La 9 zile a prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut apetitul dar ziua

următoare era iar bine. În iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu

material dintr-o leziune nou apărută de variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că

Jenner a concluzionat că acesta era protejat complet.

În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind

experimentul şi observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai

experimentat pe câţiva oameni, Jenner a publicat o mică carte numită “O incursiune în

cauzele şi efectele vaccinului antivariolic, o boală descoperită în unele din ţările vestice ale

Angliei, mai ales înGloucestershire şi cunoscută sub numele de variola vacilor”.

Cuvântul latin pentru vacă este “vacca” iar pentru variola vacilor este “vaccinia”. Jenner

a decis să denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei

părţi. În prima parte Jenner prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor

transmisă la vaci. Teoria a fost infirmată în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza

că infecţia cu variola vacilor protejează de infecţia cu variolă umană. În cea de-a doua parte

sunt continuate observaţiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a

fost o discuţie lungă, în parte polemică, legată de descoperirile şi problemele variate legate

de variolă. Reacţiile la această publicaţie au fost din cele mai diverse.

Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu

găsise nici măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor

care prezintă rezistenţă la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul

acestui studiu i-a confirmat teoria. În ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea

vaccinării s-a răspândit rapid în întreaga Anglie şi până în 1800 a atins majoritatea ţărilor

Europene (Jenner a vaccinat în 1801 populaţia din Cluj şi Târgu Mureş, apoi această

procedură s-a extins în întreaga ţară în următorii 31 de ani (1).

138

Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut

intenţia să se îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000

pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a

fost şi subiectul ridiculei şi atacurilor, nu doar al onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-

a continuat activităţile în slujba vaccinării.

Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifică de control a bolilor infecţioase

prin folosirea deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar

a fost primul care a oferit un status ştiinţific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care

a vaccinat primul împotriva variolei.

La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată

viaţa şi de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere,

dar epidemiile arătau că boala încă nu era ţinută sub control. În 1950 s-au implemantat mai

multe măsuri de control şi variola a fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America

de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci când

Adunarea Mondială a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de consecinţele

catastrofale ale variolei în 63 de ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de

Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai

1980 Adunarea Mondială a Sănătăţii a anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat

ca toate ţările să înceteze vaccinarea. (2)

Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă

introducem puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul

benefic pe care l-a avut această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea

rămâne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficienţă. Pe această cale

dorim să sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii acestei cărţi în ceea ce priveşte

vaccinarea şi să infirmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să circule în ultimul

timp.

10. Organele cu rol în imunitate10. 1. Organele suşă (stem)

10. 1. 1. Sistemul hematopoietic şi celulele stem

Sistemul hematopoietic cuprinde organele stem cu funcţie dublă, hematologică şi

imunologică. Celula multipotentă, primordială („suşă”, „stem”, „matcă”) se formează iniţial

la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul hematopoietic din ficatul embrionului.

Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice (vezi şi 11.1.). Din celulele

stem multipotente rezultă celulele liniei limfocitare (din care iau naştere limfocitele B şi T)

şi celulele liniei mieloide (precursoare pentru liniile eritrocitară, megakariocitară, monocito-

macrofagică şi granulocitară).

10. 1. 2. Mezodermul embrionar şi ficatul fetal

Organele care conţin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieţii

embrionare şi fetale, într-o anumită succesiune. În primele săptămâni de viaţă, ele sunt

139

situate în mezodermul intra-embrionar şi extra-embrionar (sacul vitelin). La făt, celulele

stem migrează şi se localizează la nivel hepatic. În cea de-a zecea săptămână de viaţă

intrauterină, apar primele celule stem în os. după cea de-a 20-a săptămână, la fătul uman,

hematopoieza devine exclusiv medulară.

10. 1. 3. Măduva osoasă

Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odată cu vârsta: la copil, toate oasele au

funcţie hematopoietică; la adult, teritoriul hematopoietic se restrânge la oasele trunchiului

şi bazinului, atingând un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele

vârstnice, funcţia hematopoietică se menţine la nivelul sternului, vertebrelor şi al oaselor

coxale.

10. 2. Organele limfoide primareorganele limfoide primare, numite şi centrale, sunt situate în afara căilor de acces şi

circulaţie antigenică. În aceste organe diferenţierea apare precoce, în viaţa embrionară,

înaintea celor secundare. Proliferarea limfocitară este intensă şi independentă de

stimularea antigenică.

Organele limfoide primare au următoarele roluri:

·       permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) şi B (dependente de măduva

roşie hematogenă / bone marrow - la mamifere).

·       găzduiesc primele stadii de diferenţiere, până la limfocitele T sau B mature, apte

să recunoască structurile antigenice şi să fie stimulate de antigene.

·       efectorii imuni „învaţă” la acest nivel să recunoască şi să tolereze constituenţii

propriului organism (auto-recunoaştere şi toleranţă faţă de „self”).

Un limfocit T sau B matur care a părăsit timusul, respectiv măduva osoasă hematogenă,

nu mai revine niciodată la acest nivel, cele două organe fiind în afara căilor de recirculare a

limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare.

10. 2. 1. Timusul

Timusul se formează în perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial.

 Încă din stadiul de dezvoltare fetală, timusul este prezent în cavitatea toracică, fiind

dispus retrosternal, ca un organ bine diferenţiat, deja funcţional. Agenezia acestei regiuni

duce la apariţia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenitală timică

sau boala „pipernicirii”), caracterizat prin tulburări ale imunităţii celulare şi implicit prin

susceptibilitate crescută la infecţii (respiratorii, digestive şi cutanate, produse în special de

fungi şi virusuri şi mai rar de către bacterii), tetanie neonatală (datorată absenţei

paratiroidelor) şi malformaţii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot,

micrognatism, atrezie de esofag etc).

Timusul este un organ situat în mediastinul anterior şi superior, retrosternal, format din

doi lobi uniţi printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentaţi de

septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alcătuit din 2 zone: corticală (la

exterior) şi medulară (la interior). Iniţial se dezvoltă zona corticală.

140

Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la

pubertate - dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie

lentă, fără să dispară total).

În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus

de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele

mici, denumite şi timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor

epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structurează în noduli limfatici.

În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii  lui

Hassal (formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, fiind mereu înlocuite cu alte celule

similare), caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi

ca dimensiuni, probabil datorită contactului cu microorganismele din flora normală, dar şi

contaminării cu alte microorganisme. Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage

şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate decât cele din zona corticală. La

acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor.

Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată

eliberate în circulaţie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut

structurile non-self şi prin selecţie negativă celulele care ar fi dat reacţii autoimune.

Populaţia limfocitară aflată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la

acţiunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele

cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are

loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea

supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară

sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din zona corticală. (Figura nr. 1)

Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă:

·       rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T

mature, cu achiziţia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare şi

diferenţiere are loc, în principal, în regiunea corticală. Celulele achiziţionează progresiv

markeri ai limfocitului T adult: molecule CD2, CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă

selecţie, pozitivă şi negativă. Înselecţia pozitivă, timocitele care recunosc antigenele

străine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC

clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), în timp ce acele limfocite care

nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele

care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic

autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere.

În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are

loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune (experienţele

realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase a dus,

pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule

timice). (Figura nr. 2)

·       rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina,

timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii

dintre ei influenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele

141

limfoide periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii

despre factorii timici:

Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi

crescând sinteza de IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH.

Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării

protimocitelor în MOH.

Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral).

Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T.

10. 2. 2. Măduva osoasă hematogenă la mamifere

La mamifere, se menţine divizarea funcţională în limfocite T şi B, dar nu există bursa lui

Fabritzius. Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă

hematogenă (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât

de măduva din oasele late cât şi din oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor

lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se fibrozează, iar măduva activă

rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar

selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirmă existenţa unei autonomii a

acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea

umorală, ducând la dispariţia perturbărilor.

Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:

1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi

primele stadii ale seriei T şi B;

2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să

colonizeze organele limfoide secundare.

La nivelul măduvei există mai multe tipuri de celule: celule „cap de serie” şi celule

tinere care derivă din acestea, celule din seria granulocitară, celule din seria

megakariocitară, celule din seria eritrocitară, celule din seria monocito-macrofagică,

celulele din seria limfoidă (dar nu există LT, ci doar protimocite, limfocite T nediferenţiate).

10. 3. Organele limfoide secundare

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite şi periferice sau efectoare, este

tardivă faţă de cea a organelor limfoide primare, atingând dezvoltarea deplină numai după

stimularea antigenică. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii

limfatici, splina şi organele limfoide ataşate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plăci

Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantonează limfocitele T provenite din timus şi

limfocitele B provenite din măduva osoasă hematogenă, migrate pe calea torentului

circulator. În organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa în urma contactului

cu antigenele.

În anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici

sau din splină, se găsesc grupuri de celule, constituite în special din limfocite B, denumite

foliculi sau noduli limfatici. Înaintea stimulării antigenice, aceşti foliculi primari sunt în 142

repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinând un aspect dens,

caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite „naive”, deoarece nu au avut contact

cu antigenul. După circa 3-6 zile de la stimularea antigenică, foliculii primari se transformă

în foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, înconjurat de o zonă mai întunecată. În

jurul foliculului există o zonă marginală puţin vizibilă, constituită din limfocite B cu

memorie. Foliculul secundar persistă câteva săptămâni după care redevine folicul primar.

Organele limfoide secundare cuprind următoarele grupe:

10. 3. 1. Ganglionii limfatici

Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezintă structuri imune, organizate, situate la

„intersecţiile” traseelor limfatice. Au următoarele roluri:

·         colectează structurile antigenice care traversează teritoriul vaselor limfatice

aferente (libere sau captate de macrofage şi/sau de celulele dendritice);

·         induc un răspuns imun faţă de antigenele de tip celular, în regiunea paracorticală

(dând naştere la limfocite T specifice) sau faţă de antigene de tip umoral, în foliculii limfatici

cu limfocite B active, maturate în măduva osoasă hematogenăşi

·         stochează informaţiile imune datorită limfocitelor cu memorie dar au rol şi în

diseminarea răspunsului imun prin circulaţia limfocitelor pe calea traseelor limfatice

eferente, către torentul circulator şi ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice,

digestive sau respiratorii.

În secţiune anatomo-patologică transversală remarcăm la exterior o zonă

corticală (cuprinde în special limfocite B, „instruite” la nivel medular, aglomerate sub

formă de noduli limfatici. În mijlocul nodulilor se află centrii germinativi. Foliculii cresc mult

în dimensiuni după infecţie, iar ganglionii limfatici devin palpabili şi dureroşi.

Sub zona corticală se află zona paracorticală (cuprinde în special limfocite T). În

mijloc se află zona medulară, în care se găsesc atât limfocite B cât şi limfocite T. În

ganglionii limfatici se mai găsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2)

10. 3. 2. Splina

Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, având însă şi alte funcţii:

·         joacă rolul unui „filtru” care în mod nespecific îndepărtează/elimină complexele

antigen-anticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex.

cu Plasmodium spp., Babesia microti);

·         are o eficienţă remarcabilă în îndepărtarea/eliminarea microorganismelor slab

opsonizate precum şi celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.);

·         eliminarea hematiilor degradate, îmbătrânite;

·         reglarea volumului sângelui etc.

Pe secţiune, splina are o culoare roşie, cu formaţiuni albe diseminate, numite

corpusculii Malpighi (foliculi splenici).

Splina este compusă din două tipuri de ţesuturi: pulpa roşie implicată în distrugerea

hematiilor şi pulpa albă, corespunzătoare ţesutului limfoid. Aceasta din urmă este

organizată sub forma unor grupări de limfocite T dispuse în imediata vecinătate a

arteriolelor (manşoane de limfocite T - teaca limfatică periarterială), iar spre periferia

143

acestora se găsesc cordoane de limfocite B (zona marginală). Se consideră că zona bogată

în limfocite T este zona timo-dependentă, în timp ce zona cu limfocite B este

zona medulo-dependentă.

Vascularizaţia splinei are o serie de particularităţi. Artera splenică intră prin hilul splenic

iar ramificaţiile sale, arterele trabeculare, urmează cloazoanele conjunctive. Din aceste

artere se nasc ramificaţii, arterele centrale înconjurate de manşoane de limfocite T, vase

care asigură irigaţia foliculilor limfatici şi artere penicilate care intră direct în contact cu

sinusurile venoase ale pulpei roşii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele

postcapilare situate în zona sinusului marginal. (Figura nr. 3)

la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de către celulele reticulare. După

24 de ore, antigenul se regăseşte la nivelul centrului germinativ al foliculului sau în zona

timo-dependentă.

La periferia foliculilor splenici se găsesc plasmocite. La acest nivel are loc sinteză de

anticorpi (în special după stimuli antigenici „solubili”, veniţi pe calea torentului circulator).

După sinteză, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin şi pot ajunge în tot

organismul. Splina reprezintă un organ în care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM şi

diferenţierea spre LB cu memorie în cadrul RI primar.

Splina are şi rol în sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din

clivarea enzimatică a porţiunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la

rândul ei are rol în creşterea funcţiei fagocitare a PMN şi în chemotactism).

Hipofuncţia splenică şi în special splenectomia favorizează apariţia unor infecţii grave,

inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate şi microorganisme care parazitează

eritrocitele. Este necesară aplicarea unei strategii de prevenire a infecţiilor, incluzând

vaccinarea şi uneori profilaxia cu antibiotice şi chimioterapice.

10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated

lymphoid tissue)

Căile respiratorii, tractul digestiv şi cel uro-genital sunt înconjurate pe toată lungimea

lor de ţesut limfoid difuz (sau nodular), bogat în limfocite B şi plasmocite care secretă sIgA.

Datorită particularităţilor funcţionale, MALT se subdivide în:

·      Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue)

reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringiană, linguale) şi

structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregaţi şi ţesut limfoid

difuz în strânsă asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la

fel ca şi splina. Amigdalele au un rol protector important în regiunea esofagiană, faringiană

şi a arborelui traheobronşic, constituind un prim obstacol împotriva infecţiilor. Cu toate că

după amigdalectomie nu rezultă infecţii severe, decizia privind această operaţie trebuie

luată numai după o analiză critică, punând în balanţă atât beneficiile cât şi posibilele urmări

negative. Structurile adenoide se inflamează frecvent în timpul copilăriei (după diferitele şi

frecventele infecţii respiratorii) şi deseori, crescând în dimensiuni, trebuie extirpate;

·       Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue)

cuprinde plăcile Peyer şi formaţiunile limfoide ale apendicelui (secretă IgA), limfocitele

intra-epiteliale şi limfocitele sub-epiteliale. Plăcile Peyer reprezintă aglomerări de celule

144

limfoide (la nivelul jejunului, duodenului şi ileonului). După infecţii bacteriene se măresc şi

se pot uni în adevărate „cordoane” limfoide. Nu au vase limfatice proprii;

·       Sistemul imunitar asociat arborelui bronşic (BALT - bronchus associated lymphoid

tissue);

·       Sistemul imunitar asociat căilor uro-genitale, prezent în special la nivelul vaginului;

·       Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid

tissue).

Laptele matern conţine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul născut faţă de

infecţiile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentară, dar sIgA poate fi

primit în timpul alăptării, asigurând protecţia nou-născutului şi sugarului faţă de o serie de

patogeni, în primele luni de viaţă.

În organele limfoide secundare, distribuţia limfocitelor şi a celorlalte celule imune este

controlată de citokine şi chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors)

(citokine implicate în reacţii inflamatorii) au un rol deosebit de important în dezvoltarea

normală a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceşti mediatori, acest

lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune în

evidenţă care este rolul lor.

Molecula MIP-3β face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T

prezintă receptori. Datorită acestei substanţe, limfocitele T se localizează cu stricteţe în

zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3β se numeşte CCR7, iar la cobaii la care

receptorii CCR7 au fost distruşi s-a observat absenţa marcată a zonelor timodependente şi

un răspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina

MIP-3β şi pentru că sunt prezente în zonele timodependente, atrag acolo limfocite T

mature. Receptorul CCR7 este prezent în proporţie mică şi la nivelul limfocitelor B, lucru

care explică migrarea acestora prin zonele timodependente către foliculii limfatici.

10. 4. Povestire adevăratăApendicele vermiform, o prelungire a cecumului, reprezintă un organ ce aparţine GALT

(Gut Associated Lymphoid Tissue). Rolul GALT este de a interveni în apărarea mucoasei

tractului digestiv, având în alcătuire ţesut limfoid abundent organizat în structuri

specializate (amigdale, apendice, plăci Peyer) sau distribuit difuz în submucoasa peretelui

tubului digestiv.

La scurt timp după naştere, apendicele, fiind un segment al intestinului gros, devine

colonizat de flora enterică ce populează cecumul şi colonul. Este presupusă ideea că un

contact îndelungat al ţesutului limfoid din componenţa apendicelui cu flora comensală a

intestinului, contribuie la menţinerea toleranţei imune faţă de populaţiile bacteriene.

Aşadar, funcţia apendicelui diferă de cea a plăcilor Peyer sau a amigdalelor prin faptul că

nu apără organismul de microorganisme potenţiat patogene nou-pătrunse în organism, ci

favorizează desfăşurarea relaţiei simbiotice între gazdă şi germenii saprofiţi.

145

Inflamarea apendicelui (apendicită) este o afecţiune frecvent întâlnită în secţiile de

chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedură de rutină, având puţine riscuri (în

general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afirmă că apendicectomia

(desfăşurată în cazul unei apendicite acute şi nu atunci când nu există de fapt această

afecţiune) are efecte benefice în scăderea incidenţei dezvoltării colitei ulcerative. S-a

constatat că la pacienţii suferinzi de apendicită la vârste tinere care au fost supuşi

operaţiei, a scăzut riscul de apariţie a colitei ulcerative cu până la două treimi. Se pare că

efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine în urma procedurii

chirurgicale. Însă apendicectomia nu reprezintă o soluţie în cazul celor la care boala s-a

instalat deja.

Colita ulcerativă este o boală inflamatorie a intestinului caracterizată prin apariţia

ulceraţiilor în peretele colonului, diaree cu sânge şi crampe abdominale. Cauzele instalării

bolii sunt multiple, de natură genetică, cauză autoimună, alimentaţie necorespunzătoare.

Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera în cancer de colon sau cancer rectal.

Chiar dacă apendicectomiile au devenit „floare la ureche” pentru mulţi medici chirurgi

iar pacienţii nu se tem de o operaţie „uşoară”, este de reţinut faptul că diagnosticul trebuie

instaurat corect de către medic care adesea uită că durerea la nivelul zonei inghinale

drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicită şi nu se mai oboseşte să mai facă

alte teste, realizând uneori o operaţie inutilă şi netratând până la urmă suferinţa

pacientului.

10. 5. Verificaţi-vă cunoştinţeleLa întrebările următoare, alegeţi un singur răspuns corect.

1.Care este diferenţa dintre organele limfoide primare şi cele secundare?

1. localizarea lor: cele primare au localizare viscerală, cele secundare se localizează

în mucoase;

2. în organele limfoide primare nu apare răspunsul imun faţă de un antigen, pe când

în cele secundare da;

3. nu există diferenţe între cele două tipuri de organe;

4. organele limfoide secundare sunt sediul formării şi diferenţierii limfocitelor, iar

organele limfoide primare sunt destinaţiile la care ajung limfocitele mature.

 

2. Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în

ansamblu?

1. splina;

2. ganglionul limfatic;

3. timusul;

4. măduva osoasă hematogenă.

 

3. Ce este fenomenul de selecţie a limfocitelor?

146

1. un mecanism prin care se generează un răspuns imun împotriva unei

substanţe non-self;

2. un proces generalizat ce are loc în toate organele limfoide, având ca rezultat

limfocite B şi T mature;

3. un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite să intre în

circulaţia sanguină (5% din limfocitele T totale);

4. totalitatea reacţiilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celulă

secretoare de anticorpi).

 

4. Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei?

1. rol în distrugerea hematiilor îmbătrânite;

2. rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar;

3. rol în apărarea mucoaselor, aparţinând MALT;

4. rol în selecţia şi maturarea limfocitelor T.

 

5. Care este afirmaţia adevărată?

1. un folicul secundar prezintă, din punct de vedere histologic, o zonă periferică şi un

centru germinativ;

2. plăcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente în timus;

3. ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaţiei sanguine;

4. în măduva osoasă hematogenă se maturează atât limfocitele T, cât şi limfocitele B.

11. Celulele imunităţii11. 1. Celula „stem”

Celula multipotentă, primordială, „suşă”, „stem”, „matcă”, se formează la circa 3

săptămâni de la nidaţia zigotului, iniţial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior în ţesutul

hematopoietic din ficatul embrionului. După naştere, celula „stem” ar mai putea fi pusă în

evidenţă în măduva oaselor late şi lungi (la copii) şi în măduva oaselor late (la adulţi); un

număr foarte mic de celule „stem” mai pot fi identificate în circulaţie.

Primul derivat al celulei „stem” este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care

seamănă foarte mult cu celula „stem” dar deţine probabil un „semnal de orientare” către

măduva roşie hematogenă sau către timus. Există și un alt derivat, limfoblastul (lymphoid

progenitor).

Celula „stem” se află la originea tuturor liniilor hematopoietice. În funcţie de gradul de

potenţialitate există celule „stem” totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M,

147

GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de

autoîntreţinere („self-renewal”) şi generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici.

Răspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se

aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uşor de distrus de către

radiaţii dar nu şi de către chimioterapice.

Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă

speranţă: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave

(considerate astăzi ca fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nediferenţiaţi se pot

divide şi dezvolta într-o multitudine de alte tipuri de celule, putând duce la formare de

ţesuturi şi organe. Cercetătorii estimează că aceste celule ar putea fi folosite, în viitor,

pentru repararea diferitelor structuri distruse sau în suferinţă, dar chiar şi pentru „sinteza”

de organe. Totuşi, sunt încă destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate.

(Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)

11. 2. Celulele implicate în răspunsul imun

Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, în diferite măsuri, în imunitate. Aşa

cum am menţionat anterior, aceste celule acţionează ca nişte adevăraţi „soldaţi” (de ex. LT

citotoxice, celulele NK), care pot avea atât o activitatea efectoare cât şi de control şi retro-

control („depăşindu-şi condiţia” de „simpli ostaşi”).

Limfocitele T şi B suntelementele centrale alerăspunsului imun specific.

Celulele NK sunt celule fundamentale (alături de fagocite) în imunitatea înnăscută.

Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele şi

mastocitele acţionează în diferite momente ale răspunsului imun.

Plachetele sanguine intervin în lupta anti-parazitară iar globulele roşii participă la

eliminarea complexelor imune.

Celule pot reacţiona în mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex.

granulocitele PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele

dendritice etc) sau pot participa la o reacţie specifică, condiţionată de structura moleculelor

antigenice, prin intermediul receptorilor (ex. limfocitele).

Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de

diferenţiat morfologic (în microscopia obişnuită sau chiar şi în microscopia electronică).

Pe baza caracterelor morfologice, este totuşi posibilă identificarea a două tipuri de

limfocite:

- limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numărul

total al limfocitelor); aici se încadrează majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor

dendritice şi rarelor celule stem hematopoietice aflate în circulaţie.

- limfocitele mari cu granulaţii (large granular lymphocytes), reprezentând circa 5-

15% din totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigaşe în mod natural /

„natural killer”) şi limfocitele T citotoxice.

148

Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară.

Dacă folosim culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifici [ex.

fitohemaglutinină, concavalină A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed

mitogen) etc] sau a unor antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior „în repaus”

cresc în dimensiuni, prezintă modificări la nivelul nucleului (cromatină fină, citoplasmă mai

abundentă şi mai albastră pe frotiu), fiind denumiteimunoblaste.

11. 3. Clasificarea limfocitelorClasificarea limfocitelor se realizează pe baza:

·         funcţiilor şi

·         identificării markerilor celulari.

Funcţiile limfocitelor.

S-a demonstrat că pe lângă limfocitele B, există o mare varietate funcţională de

limfocite T [ajutătoare (helper, LTh), supresoare, citotoxice sau „responsabile” de

imunitatea celulară]. Funcţionalitatea limfocitelor este dificil de studiat în practica curentă,

mai ales că o singură celulă poate avea mai multe funcţii.

Una dintre tehnicile de cercetare curentă, citometria în flux, utilizează anticorpi

monoclonali obţinuţi în urma imunizării şoarecilor cu limfocite umane normale sau

patologice. Markerii celulari sunt înregistraţi cu prefixul CD, termen derivat din „cluster of

differentiation” (clasă de diferenţiere), nomenclatură stabilită în anul 1982. De atunci au

fost identificaţi peste 300 markeri sau sub-markeri CD.

Celulele stem hematopoietice şi diferitele celule cu rol în imunitate pot fi împărţite în

grupe şi subgrupe.

Pentru activarea limfocitelor este nevoie de două semnale:

·         unul care provine de la antigen

·         altul provenit de la moleculele accesorii de pe suprafața APC (B7/CD80) pentru LT

sau de pe LTh (CD40L) pentru LB.

Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte

semnale antigenice și nici nu se activează pentru a reacționa față de primul semnal

antigenic.

Etapele activării limfocitelor:

·         sinteza de citokine dar și de receptori pentru acestea de către limfocitele naive

dar mature

·         proliferarea limfocitară (expansiunea clonală) - în unele infecții numărul LT poate

crește de 50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori

·         transformarea limfocitelor naive în limfocite efectoare cu rol în eliminarea

antigenului

·         diferențierea limfocitelor efectoare în limfocite cu memorie.

Așadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite:

·         naive – mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmează să fie

distruse în cazul în care într-o perioadă de 1-3 luni nu au contact antigenic

149

·         efectoare

·         cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.

11. 3. 1. Limfocitele T (LT) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor)

Limfocitele T sunt majoritare în circulaţia sanguină, reprezentând circa 70% din totalul

limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) şi1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la

nivelul organelor limfoide secundare în zone speciale: zona paracorticală a ganglionilor,

manşonul limfoid în jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate în principal

în imunitatea mediată celular. Pe de o parte participă la eliminarea structurilor străine dar

şi a structurilor proprii modificate (prin îmbătrânire, în urma unei infecţii, cu multiplicare

neoplazică) iar pe de altă parte cooperează cu limfocitele B în răspunsul imun umoral. De

fapt, funcţiile exercitate de LT sunt mult mai complexe.

Cea mai importantă funcţie a limfocitelor T este inducerea unui răspuns sau a unei

reacţii imune specifice la antigene, prin recunoaşterea unor peptide antigenice fixate pe

moleculele MHC (complex major de histocompatibilitate). În acest scop pe limfocitul T

există un receptor pentru antigen (TCR), asociat întotdeauna cu un complex molecular

transductor CD 3.

Linia limfocitară T se maturează în două organe: (a) măduvă osoasă şi (b) timus.

Din celula stem hematopoietică multipotentă (CD34+, CD38-), prima diferenţiere

conduce la apariţia CFU-L (colony forming unit-lymphocyte) comună limfocitelor T şi

B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care rezultă protimocitul. Protimocitul părăseşte măduva

roşie hematogenă şi se cantonează în corticala timică.

Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiată la om, astfel încât datele se obţin prin

extrapolarea informaţiilor obţinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele şi

apoi timocitele imature se găsesc în corticala timică (subcapsular), în contact cu celulele

epiteliale şi cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate

foarte mare de multiplicare. Se deplasează prin cortex spre joncţiunea cortico-medulară şi

vin în contact cu celulele dendritice şi cu macrofagele. La acest nivel are loc o nouă

multiplicare relativ intensă. Este de remarcat faptul că în cursul acestui proces, doar 1-5%

din celulele tinere ajung limfocite T mature. Restul, de cel puţin 95% din celule, mor prin

apoptoză.

Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct)

celulă - celulă, cu o celulă prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirectă) de către

citokine: IL-1, IL-6, IFN-g şi IL-2. Limfocitul produce la rândul său atât IL-2 cât şi lanţul a al

receptorului Il-2, contribuind la activarea altor LT specifice.

LT sunt activate doar de către antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf

16.1.2.); procesul se desfășoară la distanță de locul de pătrundere al antigenului, și anume

în organele limfoide secundare unde o APC îi prezintă structurile antigenice. Consecința

activării LT este transformarea acestuia în limfoblast T.

Tipuri de limfocite T150

Limfocitele T ajutătoare (T helper, CD4+) (LTh/Th)

Limfocitul Th este un veritabil „coordonator”, orientând răspunsul imun (RI) către RI

celular sau către RI umoral. Există cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 și Th17):

-               limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influenţa unor stimuli moleculari, ex.

IL-4, IL-12, se vor transforma în limfocite Th1 sau în limfocite Th2);

-               limfocitele Th1 sintetizează limfotoxină, IL-2, IFN-γ, TNF-α și TNF-β

o   au rol foarte important în apărarea anti-virală, şi anti-neoplazică (dar și în apărarea

anti-fungică și anti-bacteriană),

o   sunt implicate mai ales în RIC,

o   stimulează switch-ul izotipic spre IgG2 și IgG3,

o   amplifică rolul citotoxic al macrofagelor și stimulează proliferarea LTc;

-               limfocitele Th2 sintetizează IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13;

o   au rol mai ales în RIU,

o   sunt implicate în reacţiile de hipersensibilitate,

o   stimulează proliferarea LB și secreția de anticorpi;

o   sunt stimulate de semnale venite de la bazofile și eozinofile (papaina duce la sinteza

de IL-4 de către bazofile care duce la stimularea răspunsului Th2) (1).

-               limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprimă funcția altor limfocite (CD4+,

CD8+, LB, NK); secretă Il-10 (inhibă Th1 și Th2, deci RIU și RIC) și TGF- β (inhibă răspunsul

imun); sunt CD4+ și CD25+;

-               relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se găsesc la

interfaţa dintre mediul extern şi mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul

tractului gastro-intestinal); sintetizează IL-6, IL-17 și TNF-α;

o   au rol de protecţie la nivelul acestor suprafeţe,

o   studii recente au aratat că sunt implicate în inducerea și exacerbarea autoimunității

și inflamației (datorită IL-17),

o   activează RIC (importante în RI prin recrutarea neutrofilelor și macrofagelor la locul

infecției),

o   sunt în relație cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii și mediază

toleranța imună (2),

o   secreția lor este stimulată de IL-23,

o   LTh-17 cu memorie reacționeaza față de antigenele Candida albicans (3).

Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+)

Se referă în principal la LT CD8+, cu toate că această proprietate a fost observată şi la

unele LT CD4+, cu următoarele diferențe:

·         LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprimă molecule HLA

I (HLA - human leukocyte antigen system)

·         LTc CD4+ îşi limitează funcţia la celulele care exprimă molecule HLA II.

Au mai multe roluri, de ex. realizează „supravegherea imunologică” prevenind

multiplicarea anarhică a celulelor. Dacă de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea

de a le recunoaşte, de a se multiplica/activa şi de a le distruge. În această „supraveghere”,

LTc sunt ajutate de celulele NK.

151

Distrugerea antigenelor este indusă prin două mecanisme:

·         inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al ”morții celulare”, ceea ce

duce la fragmentarea ADN-ului celulei țintă;

·         ”atacul” asupra celulei țintă prin perforine (proteine ce rup membrana

plasmatică sau lizozomală) și granzine(serin proteaze care lizează substraturi sau

activează diverse proteaze) sintetizate și eliberate de către LTc.

LTc au un rol important în apărarea împotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor

este intensificată de IFN-g.

Importanța activității litice a LTc a fost demonstrată atât experimental (pe modele

animale) cât și la pacienți care prezentau defecte ale citotoxicității. Există sindroame

genetice transmise autozomal recesiv în cadrul cărora este afectată citotoxicitatea sau

prezentând mutații la nivelul genei ce codifică informația pentru sinteza de perforine.

Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlării infecțiilor virale, mai ales cu

CMV, EBV și HSV (4).

Limfocitele T inductoare ale hipersensibilităţii întârziate

Sunt celule care secretă IL-2 şi în acelaşi timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T,

macrofage şi celulele NK.

Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+)

Limfocitul T supresor este o celulă CD8+, ca şi LT citotoxic.

Limfocitele Ts au rol în reglarea răspunsului imun, menţinându-l în limite normale.

În lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhică a unei clone

de limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structură

antigenică).

În mod normal, între populaţiile de limfocite Th şi Ts există un echilibru, care se

cuantifică prin raportul Th/Ts, raport care trebuie să fie supraunitar. Exemplul cel mai

cunoscut în care valoarea raportului devine subunitară este infecţia HIV / SIDA.

O parte dintre limfocitele T nu au funcţie efectoare şi se transformă în LT cu memorie.

Limfocitele T γδ (γδ T cells)

Limfocitele T γδsunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului

inflamator și manifestă citotoxicitate față de diverse ținte.

Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fără a fi necesară

prezentarea în conjuncție cu MHC.

Reacționeaza față de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de grupările fosfat din

diverși compuși precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN și ARN). Teste efectuate pe

animale de laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania

spp., Mycobacterium spp., Plasmodium și Salmonella spp. au arătat un nivel de protecție

mediu realizat de aceste limfocite.

Se acumulează la nivelul focarului inflamator în boli cu implicare imună precum artrita

reumatoidă sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscută).

Sunt implicate atât în imunitatea înnăscută cât și în cea adaptativă, prin

·         secreția de citokine și chemokine

·          abilitatea de a ajuta LB să se transforme în limfocite cu memorie.

152

Limfocitele T NK (NKT cells)

Limfocitele T NKintervin în RIP și produc cantități crescute de IL-4. ”Împrumută”

proprietăți atât de la LT cât și de la NK.

11. 3. 2. Limfocitele B (LB) (Figura nr. 2 – Maturarea limfocitelor)

Limfocitele B reprezintă 5% până la 15% din limfocitele din sânge (300 până la 600

elemente/mm3) şi constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni şi splină.

Rolul lor esenţial este sinteza anticorpilor, în cursul RIU specific. Au fost denumite astfel

deoarece s-a descoperit că la păsări LB se dezvolvă în bursa lui Fabricius. La om LB se

dezvoltă în măduva osoasă hematogenă (bone marrow).

Limfocitele B provin (la om şi la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+,

CD38-). Toată linia limfocitară B (celule imature sau mature) are markeri specifici de

suprafaţă CD19 şi CD20, utilizaţi pentru identificarea celulelor B (ex. în citometria în flux);

identificarea prin aceeaşi metodă a markerului CD10 permite încadrarea în stadiul de

limfocit matur.

Limfocitul B părăseşte măduva osoasă şi trece în „zonele B” din organele limfoide

secundare (ganglioni limfatici, splină etc). LB „naiv” (virgin) este pregătit pentru a răspunde

stimulului antigenic, deşi se găseşte în stare de repaus, în aşteptarea primei stimulări

antigenice. În acest stadiu, LB are următoarele caracteristici:

·       exprimă la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM şi IgD;

·       exprimă receptori pentru interleukinele IL-1 şi IL-4;

·       exprimă receptori pentru complement CR1 (CD35) şi CR2 (CD21). Ultimul

recunoaşte fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului.

Acesta contribuie la activarea limfocitului B.

·       exprimă receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru

transformarea limfoblastică a limfocitelor B, dar şi receptori pentru endotoxine bacteriene

(LPZ).

Transformarea unui LB naiv într-un LB activ şi apoi în plasmocit necesită intervenţia

succesivă a citokinelor (ca într-o „cascadă”).

Activarea are loc datorită recunoaşterii antigenice dar şi datorită secreţiei de IL-1 de

către celula prezentatoare de antigen (APC) şi respectiv secreţiei de IL-4 de către Th2.

Limfocitul B activ exprimă receptori pentru alte interleukine, în special IL-5 şi IL-6 şi

lanţul a al IL-2. LB se va divide şi va da naştere la numeroase celule identice în foliculul

limfoid secundar.

Limfocitul B se diferenţiază progresiv într-un limfoblast sau imunoblast care secretă

IgM. Sub acţiunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipică (isotypic switch) de la IgM

la IgG, IgA sau IgE; în urma acestei comutări plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De

153

exemplu, sub acţiunea IL-4 are loc comutarea izotipică a IgM în IgG sau IgE iar sub acţiunea

IL-5 în IgA.

Există şi limfocite B active care nu se transformă în plasmocite ci persistă sub formă

de limfocite B cu memorie, cu o durată de viaţă lungă (asigurând spre exemplu protecţia

faţă de o nouă îmbolnăvire, de ex. după scarlatină/infecție cu streptococul piogen de grup

A, lizogenizat).

Limfocitul B are următoarele funcţii: 1. Prezentarea antigenelor către LT; 2. Sinteza

imunoglobulinelor (anticorpilor). În cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de

la răspunsul primar cu secreţie predominentă de IgM, la un răspuns secundar cu

predominenţa IgG sau mai rar a IgA sau IgE. În cazul antigenelor timo-independente, se

menţine sinteza anticorpilor din clasa IgM.

Limfoblastul (lymphoid progenitor) dă naștere la trei linii celulare (LT, LB și NK). Există o

genă (Pax5) care este esențială pentru maturarea LB (5).

11. 3. 3. Celulele NK (Natural killer cells)

Numele de celule NK a fost dat acestei populaţii celulare datorită puterii lor citotoxice

spontane, fără a avea nevoie de un stimul imun sau de prezenţa MHC (complexul major de

histocompatibilitate). Numite iniţial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule

nule (pentru că pe suprafaţa lor nu fuseseră, încă, puşi în evidenţă receptori), în final au

fost numite celule NK („ucigaşe în mod nativ”, „natural killer”).Fac parte dintre limfocitele

mari cu granulaţii (large granular lymphocytes).

Se găsesc în măduva osoasă hematogenă, splină și în sângele periferic.

Celulele NK reprezintă o linie primordială de apărare a organismului (imunitatea

înnăscută), pe care îl ajută să elimine celulele modificate datorită unor infecţii, sau celulele

modificate neoplazic, în special în neoplazii hematologice (ex. leucemie).

Spre deosebire de limfocitele Tc

·         celulele NK nu au TCR (au însă, de ex., receptori pentru molecule de IgG),

·         în cazul celulelor NK nu există răspuns imun secundar (de memorie).

11. 4. Celulele prezentatoare de antigen (antigen presenting cells)

Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI

specific, este asigurată de două categorii de celule prezentatoare de antigen (APC):

- celulele profesionale / specializate

·         celulele dendritice,

·         monocitele / macrofagele și

154

·         limfocitele B;

- celulele ocazionale (îndeplinesc funcţia doar în anumite condiţii de activare celulară)

·         neutrofilele,

·         celulele endoteliale şi

·         celulele epiteliale.

Celulele prezentatoare de antigen (APC) au următoarele funcții (Figura nr. 3):

·         recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endocitează și

prelucrează,

·         transportă antigenele native de la țesuturi la organele limfoide secundare,

·         prezintă antigenele native LT urmând selecția clonei de limfocite specifice acelui

antigen,

·         activează fie LTc fie LTh.

Celulele dendritice se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând

sângele și organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se

extinde și în spațiile dintre celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice

microorganism aflat în acea zonă. Celulele dendritice posedă două sisteme de

supraveghere imunologică:

·         macropinocitoză (în fiecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă

pasiv apariția antigenului care să le stimuleze),

·         au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de

particule.

Sunt clasificate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în

trei mari clase și şase tipuri:

a). Celule dendritice tisulare

·         celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între

derm și epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale),

·         celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor;

b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare)

·         celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide

secundare,

·         celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare;

c). Celule dendritice circulatorii

·         celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, aflate în tranzit,

·         celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, aflate în tranzit.

Toate celulele dendritice au origine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară -

CDS (o parte dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu).

Pot să îndeplinească funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi

sintetizează molecule MHC II (cu excepţia CDF).

Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă

și se transformă în CDS. De aici pot urma două căi:

·         în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi

iau calea vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide

155

secundare unde se transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu

MHC II.

·         în interstițiu se transformă în CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (și urmează

drumul de mai sus), fie trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină

unde fie

o   ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă filtre pentru

antigenele solubile,

o   ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID.

Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în

funcție de locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale.

Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri

numeroase, lungi şi efilate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor

dendritice se găsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se

dispun în grămezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule văluroase.

Au rol important în maturizarea precursorilor LT.

Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat

cu MHC și ar putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din

organismul uman și să genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat

selecției negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.).

Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor.

Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom

primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în

peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot

„încărca” aceste peptide. Fago-lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel,

peptidul de pe MHC II se exprimă la suprafaţa externă a macrofagelor.

Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia

de APC, respectiv:

·         cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în

răspunsul inflamator,

·         celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape

1.      captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori);

2.      endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic);

3.      prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rămâne un

epitop, format dintr-o haptenă cu specificitate maximă şi o proteină „carrier”);

4.      conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată

autoîntreţinerea RI în timp);

5.      prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule

MHC. Sistemul MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul

gamma (IFN-g). După contactul cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a;

TNF-a activează RI şi procesul inflamator local.

Limfocitele B pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare

metabolică. Au capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i

156

prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-

dependente necesită cooperarea LB-LT). Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi

FcγR şi pot sintetiza molecule MHC II.

LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afirmă faptul că LB au o

mai mare eficienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele.

LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în

măduva osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul

BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi

epitopii în complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale

către alte LB prin citokine şi molecule de suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se

transformă în limfoblaste B, apoi în plasmocite care vor secreta anticorpi.

11. 5. Sistemul mononuclear fagocitar (sistemul MM)

Monocitele / macrofagele reprezintă o linie celulară cu funcţie importantă în

imunologie, prin intervenţia lor în imunitatea naturală, în prezentarea antigenică şi în

reacţia imună specifică. Principalele funcţii ale sistemului MM sunt reprezentate de:

·         recunoaşterea structurilor străine (non-self) sau modificate,

·         fagocitarea, prelucrarea şi prezentarea acestora (în context MHC),

·         citotoxicitate, citostatism,

·         secreţie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-α) şi

·         reglarea reacţiilor în cadrul răspunsului imun.

Macrofagele, alături de celulele dendritice şi celulele epiteliale, formează sistemul

reticulo-histiocitar (SRH).

Macrofagele pot fi observate în toate ţesuturile. Se formează în măduva osoasă

hematogenă, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast şi când devin mature poartă

numele de monocite. În acest stadiu, moleculele MHC II fie nu există fie sunt slab

exprimate, ca semn al unui status funcţional redus (devin foarte bine reprezentate după

stimulare).

Monocitele circulă în sânge 6-8 ore, după care migrează în ţesuturi unde iau nume

diferite şi îndeplinesc funcţii diferite: histiocite în ţesutul conjunctiv; celule gliale (microglii)

în ţesutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer în ficat;

macrofage splenice; macrofage peritubulare în rinichi; macrofage ganglionare, în măduva

osoasă şi timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele

dendritice, care pot avea, la rândul lor, o capacitate fagocitară faţă de limfocitele în

apoptoză).

Monocitele / macrofagele prezintăreceptori pentru carbohidraţi, receptori pentru M-CSF,

receptori pentru imunoglobuline şi complement.

În cadrul procesului de recunoaştere, fagocitare şi prelucrare a structurilor străine sau a

structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile

157

fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor

specifice, necesare stimulării răspunsului imun.

Citotoxicitatea exercitată de macrofage poate fi

·         directă (în cursul procesului de fagocitoză),

·         în urma contactului cu membrana celulei ţintă sau

·         prin citotoxicitate mediată celular, dependentă de anticorpi (ADCC) (în acest caz,

anticorpii se fixează cu capătul Fab pe epitopii celulei ţintă şi cu fragmentul Fc de

macrofag).

Macrofagul produce substanţe litice cu care perforează membrana celulei ţintă

(asemănător cu acţiunea ADCC a celulelor NK).

Macrofagele secretă un număr foarte mare de substanţe:

·         cea mai mare parte a factorilor sistemului complement,

·         enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze),

·         proteine cu rol în adeziunea celulară (ex. fibronectină),

·         factori de coagulare,

·         interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de creştere al trombocitelor/fibroblastelor,

factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc.

Etapele fagocitozei (Schema nr. 1):

1.      Migrarea macrofagelor la locul infecției,

2.      Aderarea macrofagelor la celula țintă,

3.      Ingestia celulei țintă,

4.      Formarea fagolizozomului,

5.      Inactivarea intracelulară a celulei țintă,

6.      Digestia intracelulara a celulei țintă.

Iată câteva studii interesante legate de funcţiile macrofagelor și modul în care acestea

interacționează cu diferitele microorganisme.

Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulență

ai Mycobacterium tuberculosis. S-a demonstrat că LAM este incorporat în plutele lipidice din

interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducând la

reducerea maturării fagozomilor şi protejând astfel celula fagocitată (6).

Toxina pertusis (TP) produsă de Bordetella pertussis este implicată în tusea convulsivă.

S-a studiat interrelația dintre TP și macrofagele alveolare în cursul procesului infecțios. La

un lot de șoricei s-au ”eliminat” macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea

manifestărilor procesului infecțios, cu toate că imediat s-a produs un influx de neutrofile la

locul infecției. Mai mult decât atât, lipsa macrofagelor a dus la declanșarea procesului

infecțios chiar și cu tulpini care erau deficitare în sinteza TP (7).

Endocardita poate fi cauzată de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat,

dar se pare că monocitele au un rol important. Deși celulele monucleare din sângele

periferic sintetizează titruri crescute de IL-12, monocitele tind să dispară. Acest lucru scoate

în evidență faptul că monocitele infectate streptococic se transformă în celule dendritice

secretoare de IL-12 și nu în macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la

subiecți sănătoși au fost infectate cu șase tulpini de streptococi orali. S-a observat că

158

monocitele stimulate de aceste antigene exprimă fenotipul și funcția celulelor dendritice

(8).

Mai multe studii au arătat că M. leprae activează puține macrofage și celule dendritice.

S-a demonstrat că la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de

citokine ce inhibă monocitele. M. leprae este implicat atât într-o stimulare cât și într-o

inhibare a monocitelor (9).

11. 6. Alte celule implicate în răspunsul imun

Neutrofilele

Sunt cele mai abundente granulocite din circulația periferică.

Neutrofilele intervin în:

·         imunitatea naturală prin fagocitoză şi

·         imunitatea specifică, datorită receptorilor proprii pentru imunoglobuline şi

complement, în colaborare cu limfocitele şi alte APC.

Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecţios sunt:

·         complexele Ag-Ac,

·         subcomponenta C5a a sistemului complement,

·         derivaţii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4).

După fagocitare, PMN utilizează pentru degradarea structurilor străine diferite enzime

precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze).

Sunt generaţi şi radicali activi de oxigen.

S-a studiat relația între neutrofile și macrofage în cadrul infecției cu Mycobacterium

tuberculosis. După infectarea experimentală a cobailor, neutrofilele au fagocitat microbul și

au secretat IL-8 și TNF-α (cu rol activator asupra macrofagelor). Neutrofilele și macrofagele

au fost prelevate și cultivate împreună și separat, apoi infectate. IL-8 a fost detectată la

nivele mult crescute în culturile care conțineau atât macrofage cât și neutrofile în

comparație cu situația în care culturile conțineau separat macrofage, respectiv neutrofile.

S-au folosit mai multe tehnici de cultivare și s-a ajuns la concluzia că și TNF- α este la un

nivel mai înalt în culturile ce conțineau ambele tipuri de celule. Ulterior, cultura a fost

tratată cu anticorpi policlonali anti TNF-α iar răspunsul macrofagelor la stimularea

neutrofilelor infectate a fost complet anulat. Acest studiu demonstrează că TNF-α produs de

neutrofilele infectate ar putea fi responsabil de activarea macrofagelor alveolare (10).

Eozinofilele

Eozinofilele reprezintă în mod normal între 1% şi 3-5% din leucocitele sanguine.

Procentul eozinofilelor creşte în alergii sau în infecţiile parazitare.

Funcţia lor fagocitară, prin receptorii de IgG şi IgE şi mecanismul ADCC, este relativ

limitată. Totuşi, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor

conţin produşi toxici pentru diferiţi paraziţi.

159

Pe de altă parte, eozinofilele produc histaminază şi arilsulfatază care inactivează

histamina şi respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceşti factori se reduce

răspunsul inflamator şi migrarea leucocitelor în focarul infecţios.

Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor în cadrul imunității înnăscute și

adaptative îndreptate împotriva infecțiilor cu paraziți. Nu a fost dovedit că eozinofilele ar

iniția răspunsul imun față de paraziți. Plecând de la ipoteza că eozinofilele ar putea fi celule

prezentatoare de antigen în infecțiile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit

parazit și s-a examinat expresia diferiților markeri de suprafață implicați în activarea

celulară. S-a remarcat o creștere de 6 ori a CD69 și MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula

costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorată

și prin cultivarea lor împreună cu LTCD4+. Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma

LT naive în LTh2 producătoare de IL-5 (11).

Bazofilele şi mastocitele

Conţin granule metacromatice şi receptori pentru IgE. Au rol în reacţia de

hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalul mediator în declanşarea HS de tip I este

histamina.

Ambele sunt implicate în apărarea anti-parazitară.

Mastocitele nu se găsesc în cantitate mare în sânge, dar sunt întâlnite la nivelul

țesuturilor conjunctive în apropierea vaselor sanguine și limfatice, aproape de sau în

interiorul nervilor și sub epiteliile organelor care vin în contact cu mediul extern (plămân,

intestin, piele).

Bazofilele se diferențiază și maturează în măduva osoasă hematogenă, apoi circulă

prin sânge. Atât bazofilele cât și mastocitele secretă citokine dar spre deosebire de

mastocite, bazofilele secretă și IL-4. A fost studiat un eventual rol în diferențierea

limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesită IL-4) (12).

A fost demonstrată prezența bazofilelor în ganglionii limfatici, în apropierea LT ca și

faptul că secreția de IL-4 poate fi declanșată de un stimul independent de IgE (13).

Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boală în care apare hiperplazia

mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, măduvei

osoase hematogene, ficatului, splinei și ganglionilor limfatici. Incidența bolii este de 3-

7/1.000.000 locuitori. Poate apărea la orice vârstă (valorile cele mai mari sunt înregistrate

în primii doi ani de viață și în decada a treia și a patra). Se datorează mutației genei ce

activează factorul de creștere pentru mastocite.

Plachetele

Plachetele au un rol accesoriu în reacţia imună. Ele conţin serotonină şi exprimă

receptori pentru IgG şi IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă şi eliberează

substanţe care cresc permeabilitatea capilară şi activează sistemul complement. Datorită Ig

fixate pe membrana lor, plachetele pot adera la paraziţi şi pot elibera radicali liberi ai

oxigenului cu efect toxic pentru aceştia.

Globulele roşii

Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la ţesuturi şi bioxidul de carbon la

plămâni, globulele roşii deţin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul

160

complexelor imune din sânge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii

pentru complement.

11. 7. Evaluarea cunoștințelor1.       Una din următoarele afirmaţii legate de celula stem este adevărată:

     A.    Se formează la circa 3 luni de la nidaţia zigotului;

     B.     Dă naştere hemocitoblastului şi limfoblastului;

     C.     Poate fi găsită în măduva spinală;

     D.    Se află la originea unor linii hematopoietice.

2.      Legat de limfocite, o afirmaţie este falsă:

     A.    LT sunt majoritare în sânge;

     B.     LT se găsesc în paracorticala ganglionilor şi manşonul limfoid din jurul arterelor

centrale splenice;

     C.     LT induc o reacţie specifică antigenică;

     D.    LB au rol esenţial în sinteza anticorpilor în cursul RIC specific.

3.       LTh:

     A.    LTh1 stimulează switch-ul izotipic spre IgM;

     B.     LTh0 sunt limfocite tinere care dau naştere celorlalte tipuri de limfocite;

     C.     LTh2 sunt implicate în apărarea antineoplazică;

     D.    LTh17 duc la reacţii de hipersensibilitate;

     E.     LTh0 generează inflamaţie tisulară.

4.      Una din următoarele celule nu este APC:

     A.    Celula Langerhans;

     B.     Celula dendritică;

     C.     Monocitul/macrofagul;

     D.    LT

5.       Eozinofilele:

     A.    Procentul lor creşte în alergii sau infecţii parazitare;

     B.     Sunt majoritare în infecţiile bacteriene;

     C.     În mod normal reprezintă 50% din leucocitele sanguine;

     D.    Pot duce la o boală numită mastocitoză.

12. Complexul major de histocompatibilitate12. 1. Definiţie şi istoric

Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde

unor moleculele exprimate pe membrana celulară.

161

Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme

alternative = alele în cadrul unei specii;alloantigenul induce răspuns imun atunci când este

transferat la indivizii din aceeaşi specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului;

exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor

cutanate sau de organ.

Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă

face parte din aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o

nouă grefare, cu acelaşi tip de ţesut, eliminarea este mai rapidă.

Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de

histocompatibilitate [primul rol identificat pentru acestea (dar existenţa lor nu este

legată doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ].

Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifică pentru

sinteza de proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate).

Există antigene majore de histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în

care eliminarea grefelor are loc, de regulă, tardiv).

Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive:

·       Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe

grefe tumorale prelevate de la un şoarece şi grefate la altul, au arătat că grefa este

respinsă în caz de histo-incompatibilitate sau tolerată în caz de histo-compatibilitate.

Rejetul sau toleranţa sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major

numit H2 la şoarece şi a mai multor sisteme minore. Ulterior, existenţa MHC a fost

confirmată la toate mamiferele, regiunea fiind denumită în funcţie de specie (ex. H2 la

şoarece, ChLA la cimpanzeu).

·       Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie

medulară şi politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi.

Aceasta stă la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A),

evidenţiat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Există o împărţire a

sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul

supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi receptor HLA identic sau diferit a dovedit că

sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu MHC uman.

·       Răspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a

răspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale

răspunsului imun. Doherty şi Zinkeragel au demonstrat în 1974 că răspunsul imun este

limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.

12. 2. Structură şi clasificareSistemul HLA cuprinde un ansamblu de gene localizate pe un segment al braţului scurt

al cromozomului 6 (Figura nr. 1).

Genele HLA posedă trei caracteristici importante:

1.      polimorfismul - fiecare genă este polialelică (cu excepţia HLA-DRA), fiind

evidenţiate peste 50 de alele în sistemulMHC uman; aceasta este principala caracteristică a

162

HLA ce face ca organismul uman să fie capabil de recunoașterea a miliarde de antigene din

natură prin arsenalul de MHC cu conformație specifică fiecărui antigen.

2.      codominanţa - la un subiect heterozigot, sunt exprimate două alele diferite;

3.      legătura strânsă -toate genele situate pe acelaşi cromozom se transmit în bloc

descendentului, sub formă de haplotip.

Moleculele HLA aparţin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de bază

fiind motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidică intramoleculară.

Sistemul HLA este împărțit în două grupe principale: HLA clasa I și HLA clasa II,

denumirea respectând cronologia descoperirii lor, și nu organizarea pe cromozom. Există și

HLA clasa III (nu este implicată în histocompatibilitate).

Moleculele HLA clasa I

Aceste molecule sunt heterodimeri formaţi prin legătură noncovalentă între un lanţ greu

polimorf a şi un lanţuşor nonpolimorf β2m (Figura nr. 2)

·         lanţul greu a (44 kDa) este o proteină transmembranară cu polimorfism alelic,

codată de o genă a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o porţiune

transmembranară şi o parte intracitoplasmatică scurtă;

·         lanţul β2m (11,5 kDa) este codat de o genă de pe cromozomul 15 şi cuprinde un

singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanţul a.

Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formând pe

suprafața acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt

adesea absente la nivelul globulelor roşii dar prezente în cantitate mare la nivelul

plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabilă, în funcţie de tipul

celular: pe limfocitele T sau B şi polimorfonucleare sunt exprimate 104-5

´105 molecule/celulă în timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase

şi spermatozoizi aproape lipsesc.

Pentru HLA-I există 3 gene ce codifică antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A,

HLA-B, HLA-C și 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G.

Moleculele HLA clasa a II-a

Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinzând un lanţ polipeptidic a şi un lanţ

polipeptidic β (Figura nr. 3)

·         lanţul greu a (33-34 kDa) cuprinde două domenii externe a1 şi a2, o porţiune

transmembranară şi o terminaţie carboxilică scurtă intracitoplasmatică;

·         lanţul uşor β (28 kDa) are o structură asemănătoare, cu două domenii externe

β1 şi β2.

Moleculele clasei a II-a au o distribuţie mult mai restrânsă în comparaţie

cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pecelulele prezentatoare de antigen (APC):

·         celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare şi

din timus, celule dendritice din epiteliul căilor respiratorii),

·         monocite / macrofage şi

·         limfocite B.

Limfocitele T nu exprimă astfel de molecule decât după activare.

163

Moleculele clasei a II-a au fost descoperite şi la nivelul endoteliului vascular şi al

celulelor epiteliale ale intestinului gros.

În cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor β din

insulele lui Langerhans în diabetul insulinodependent, al canalelor biliare în ciroza biliară

primitivă şi al celulelor tiroidiene în afecţiunile tiroidiene autoimune.

Expresia moleculelor este indusă de mediatori precum: IFN-g, TNF-a şi β, IL-4, IL-13 şi

GM-CSF cu rol esențial în răspunsul imun. Prostaglandina E2 inhibă sinteza lor pe monocite /

macrofage.

Regiunea HLA-II conține gene ce codifică HLA-DR, DQ, DP, DM, și pe lângă acestea,

câteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2.

Moleculele HLA-III nu sunt implicate în histocompatibilitate.

Sunt total diferite de cele de clasele I și II.

Nu se află atașate pe membranele celulare și nu intervin în recunoașterea peptidelor

antigenice.

12. 3. RoluriLimfocitele T protejează organismul uman de 2 mari categorii de agenţi patogeni:

virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infectează (devenind astfel antigene

endogene) și bacteriile care se replică autonom, majoritatea extracelular.

Cele 2 clase ale MHC sunt esenţiale în recunoaşterea şi răspunsul imun față de peptide

derivate din „agresori”. În ”lupta” dintr-o infecţie virală, virusul este eliminat de către LT

CD8+ care recunoaşte peptide virale endogene ataşate de MHC-I. În schimb, o bacterie e

eliminată prin fagocitare de către macrofage sau neutrofile.

LT CD4+ recunoaşte peptidele bacteriene legate de MHC-II şi direcţionează răspunsul

imun către activarea macrofagelor şi producţia de anticorpi care opsonizează bacteria.

Moleculele de histocompatibilitate au așadar un rol fundamental în prezentarea

peptidului antigenic către:

·         limfocitul T helper - HLA-II sau

·         limfocitul T citotoxic - HLA-I.

În această comunicare intercelulară intră în contact 3 molecule:

·         HLA

·         peptidul antigenic

·         TCR.

Rolul moleculelor HLA clasa I

Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I

prezintă un peptid endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un

parazit cu dezvoltare intracelulară sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor

celule self tumorale sau îmbătrânite către receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T

CD8+. Se va obţine astfel un răspuns imun celular prin activarea şi multiplicarea LTc având

ca rezultat liza celulelor ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4)

Rolul moleculelor HLA clasa a II-a

164

Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele

HLA II prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogenă, provenite din proteinele

endocitate şi degradate de APC. (Figura nr. 5)

Etape:

a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:

1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate

nespecific de monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmează

calea endocitozei;

2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii,

proteinele sunt degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;

3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic

sunt asociate, sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta

împiedică legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul

sintezei sale și permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după

terminarea sintezei;

4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la

suprafaţa APC. (Figura nr. 6)

b) Interacţiunea între APC şi limfocitul T helper:

Peptidele antigenice sunt recunoscute de către LTh prin TCR numai dacă sunt

prezentate de către APC pe MHC-II.

Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul său nu poate interacţiona cu o APC

decât dacă recunoaşte antigenele cuplate cu moleculele MHC ale

individului (restricţie allogenică).

Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacţionează cu domeniul β2constant al

HLA-II declanșând astfel primul semnal către limfocit pentru activarea sa. În urma unor

reacţii în cascadă LT va intra în mitoză, va secreta o serie de citokine şi va colabora cu LB

spre producţia de anticorpi având ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea

reacţiei este datorată asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic.

O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate în procesarea şi

încărcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 şi PSMB9 sunt subunităţi ale proteozomului

iar TAP1 şi TAP2 transportă peptidele endogene din citoplasmă în RE. BTNL2 este implicată

în susceptibilitatea la sarcoidoză

Moleculele HLA-III sunt împărţite în două categorii în funcţie de rol:

a.) cu rol în imunitate şi inflamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP

(proteina de şoc termic);

b.) cu rol enzimatic: CYP21

12. 4. Povestiri adevărate12.4.1. Polimorfismul HLA

165

Orice celulă care prezintă un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerată

non-self, un „invadator”, iar rezultatul este acela de rejecţie a ţesutului compus din

respectivele celule. Din cauza importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre

cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR faţă de oricare alte alele autozomale.

În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă,

rinichi, celule stem hematopoietice.

Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele

donoare să fie potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a

se aloca organe fără a se lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea,

în trecut, nu a fost posibilă analizarea corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu

organe compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe 8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre

din 24 state din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă cardiacă compatibilă HLA (A,

B sau DR) sau doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat supravieţuirea ţesutului pe

o durată de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut

succes: la compatibilitate maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2

nepotriviri. Aşadar, supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnificativ

influenţată de compatibilitatea HLA.

Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor

(detectabilă prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform

căreia incompatibilitatea alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea

antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată cu rejecţia de transplant cu celule stem

hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă cronică au primit transplant de

măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B,

C) şi s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o

incompatibilitate, la cele cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la

transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza şi, astfel,

riscul rejecţiei de transplant a fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate

antigenică HLA, faţă de cei cu o incompatibilitate alelică. Riscul a fost de asemenea crescut

la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi la primitorii homozigoţi HLA în locusul de

incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la donori cu o singură incompatibilitate a

alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot fi realizate cu succes. În schimb,

incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte riscul de respingere a

ţesutului.

12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli

Studii epidemiologice au demonstrat că peste 40 de boli se întâlnesc mai frecvent la

indivizi purtători ai anumitor alele HLA I sau II decât la populaţia generală. Importanţa

acestor efecte este extrem de mare, deşi nu vor fi probabil niciodată demonstrate ca

absolute. De exemplu, între 90% şi 95% din pacienţii caucazieni cu spondilită ankilozantă

posedă HLA-B27 (1), iar 30%-50% din pacienţii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-

DQ2/DQ8 heterozigoţi. Interesant este faptul că HLA-DQ6 pare a fi responsabilă de protecţia

împotriva diabetului zaharat de tip I.

166

Majoritatea bolilor care au legătură cu anumite gene HLA au un caracter autoimun.

Baza moleculară a acestei legături este necunoscută din cauza lipsei identificării

autoantigenului primar care reprezintă „trigger-ul”. (2) Cu toate că mecanismele prin care

genotipurile HLA controlează susceptibilitatea la aceste boli sunt încă incomplet definite, se

crede că participarea moleculelor MHC în stabilirea toleranţei imunologice şi în

recunoaşterea antigenelor stă la baza acestor fenomene.

Alelele HLA ce oferă protecţie pot media eliminarea în timus a LT potenţial patogene

responsabile de autoimunitate, în timp ce alelele HLA susceptibile pot eşua în eliminarea LT

patogene.

Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre

exemplu, subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial,

nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu

HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o incidenţă crescută de seronegativitate la

vaccinarea împotriva pojarului. (3)

Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifică faptul că

homozigoţii HLA-DR13-DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)

O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza

multiplă. (5-6)

12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC

Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc

antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de

LT foloseşte un receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe

molecule CD1. CD1 sunt asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un

situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel,

complexele CD1-glicolipide servesc drept ţintă pentru recunoaşterea de către LT ce au un

tip special de receptor: γδ TCR. Această prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule

CD1 pare să fie responsabilă de recunoaşterea independentă de MHC a mycobacteriilor. (3)

12. 7. Verificați-vă cunoştinţele1. Principala caracteristică a sistemului HLA este:

A. codominanţa

B. specificitatea

C. polimorfismul

D. histocompatibilitatea

E. imunogenicitatea.

 

2. Moleculele MHC-II se află pe:

A. majoritatea celulelor din organism

B. numai pe celulele nucleate

C. numai pe macrofage

D. toate APC

167

E. limfocite

 

3. Colaborare intercelulară există între:

A. HLA-II şi LTc

B. HLA-I şi LTc

C. APC şi HLA-I

D. HLA-I şi LTh

E. HLA-I şi HLA-II

 

4. Moleculele HLA-II prezintă către limfocite în situsul lor:

A. imunoglobuline

B. sfingolipide

C. peptide exogene

D. TCR

E. peptide endogene

13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi 

Interacţiunile între celulele imunitare se realizează prin două mecanisme

complementare:

·         contactul celular strâns, care necesită prezenţa moleculelor de adeziune (direct);

·         prezenţa factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele două celule

aflate în contact sau, uneori, de o celulă aflată la distanţă (indirect).

Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funcţiei celulare, ca urmare a transportului

informaţiei prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celulară

sau genele nucleare.

13. 1. Moleculele de adeziuneContactul între două celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este

complex şi nu se limitează la procesele imunologice.

Legăturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacţii chimice clasice specifice,

saturabile şi reversibile.

Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face în două moduri, structural şi

funcţional.

168

13. 1. 1. Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune

Clasificarea structurală a moleculelor de adeziune se bazează pe caracteristicile chimice

ale moleculei care permit legarea sa de o anumită superfamilie sau familie de

proteine. Expresia lor pe suprafaţa celulei poate fi constitutivă sau indusă în urma activării

celulare.

Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule)

Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-

calciu-dependent şi domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol în

adeziunea intercelulară; joacă un rol important în amorsarea procesului inflamator.

·         L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa leucocitelor, în timp ce

expresia E-selectinelor pe endoteliu este indusă de către TNF-a, IL-1 şi lipopolizaharidele

bacteriene iar a P- selectinelor de către C5b, histamină şi trombină.

·         L-selectinele joacă un rol important pentru LT imature şi APC (celule dendritice)

care sunt astfel direcţionate către situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii

limfatici sau GALT.

·         P-selectinele formează împreună cu factorul Willebrand granule denumite

corpusculii Weibel-Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind

stocate în vezicule.

IntegrineleFamilia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu

structură heterodimerică (a, β). Iniţial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanţul β comun

şi lanţul a diferit, pentru ca în prezent să se cunoască faptul că lanţul a se poate asocia cu

mai multe lanţuri β (β 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitară (cel puţin un membru al

acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puţin 13 astfel de

receptori. Celulele epiteliale exprimă la rândul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus,

în urma procesului inflamator.

Integrinele intervin în legarea intercelulară şi între celulă şi substrat, prin care

contribuie la organizarea tisulară şi migrarea celulară, alături de superfamilia

imunoglobulinelor; subfamilia β2-integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la

contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (β1 şi β2-integrinele stimulează

producţia de TNF-a şi β a celulei T; β2-integrinele stimulează producţia de IL-1β a

monocitelor, la contactul cu limfocitul T).

Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specificitate diferită faţă de

substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt influenţate de procese celulare interne de fosforilare ce

induc schimbări conformaţionale, ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de

integrare a cunoştinţelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin).

Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like)

169

Moleculele de adeziune din această clasă au o structură „imunoglobulin-like” prin

expresia extracelulară a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate în

trei subfamilii:

·         ICAM (intercellular adhesion molecule),

·         VCAM (vascular cell adhesion molecule) şi

·         PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule).

Moleculele de adeziune din această clasă intervin în legarea intercelulară, mai ales în

interacţiunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecţie (integrine) intervin

în legarea leucocitară şi prin aceasta în controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor

pe suprafaţa celulară este constitutivă sau indusă de citokine.

Caderinele

Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv

pe suprafaţa celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe

celulele adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură

integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate în patru subfamilii:

·         E-caderine (pe epitelii),

·         V-caderine (pe endoteliu),

·         P-caderine (placentare),

·         N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi).

adresine vasculare

Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor endoteliale şi intervin în „homing-

ul” limfocitar, respectiv în direcţionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici şi ţesuturile

extraganglionare.

Carbohidraţii

Reprezintă liganzii specifici pentru selectine şi nu constituie o clasă distinctă de

molecule de adeziune.

13. 1. 2. Clasificarea funcţională a moleculelor de adeziune

13. 1. 2. 1. Moleculele accesorii asociate cu TCR

·       molecula CD4

Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 2/3 din LT mature circulante, definind

subsetul de LT CD4+. Molecula CD4 este prezentă şi pe suprafaţa celulelor dendritice

cutanate şi pe monocitele/macrofagele activate. Este o moleculă de 55-67 kDa, cu o parte

extracelulară compusă din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoaşte o parte constantă

situată la nivelul domeniului β2 a moleculei HLA II.

·       molecula CD8

Această moleculă este exprimată pe suprafaţa a 1/3 din LT mature circulante. Defineşte

subsetul de LT cu activitate citotoxică şi unele celule NK (în proporţie mai mică) (Figura nr.

2). Molecula CD8 este homodimerică (CD8a/CD8a) sau heterodimerică (CD8a/CD8b). Rolul

său primordial este să asigure interacţiunea cu o parte monomorfă a moleculei HLA I, 170

pentru recunoaşterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca şi molecula CD4,

este asociată cu tirozinkinaza.

NB. Pentru mai multe informații despre apoptoză, vezi capitolul Toleranţă Imunologică.

 

13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele

prezentatoare de antigen şi limfocitele T

În permanenţă, între APC şi LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelulară. Este

nevoie de prezenţa APC dar şi de o „colaborare bidirecţională” („crosstalk”) între APC şi LT

(trebuie să existe o dublă activare a celor două tipuri de celule, în sens anterograd şi

retrograd), întrucât în lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil să capteze şi cu atât mai

mult, să prelucreze Ag native T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc

un efect de „fermoar” între membrana APC şi LT, legătura având loc înainte ca TCR să vină

în contact cu epitopul (cuplul se formează chiar dacă APC prezintă un epitop pentru care LT

nu are receptori specifici).

Se descriu trei cupluri:

Cuplul B7-CD28·       Molecula B7 se exprimă pe suprafaţa majorităţii APC (celule dendritice în repaus,

macrofage activate şi LB activate). Deşi este absentă pe macrofagele şi LB în repaus, în

urma costimulării acestora, molecula B7 se exprimă pe suprafaţa lor, pentru a asigura o

cooperare celulară pozitivă.

·       Molecula CD28, care recunoaşte receptorul B7, este prezentă pe toate LT, cu

excepţia LT supresoare şi permite costimularea între APC şi LT.

·       Rezultatul este transcripţia unor factori antiapoptotici precum Bcl-x şi IL-2.

Cuplul B7-CTLA-4 (CD80)Molecula CTLA-4 nu este exprimată decât de LT CD4+ sau T CD8+, într-o proporţie mai

mică decât molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7.

Interacţiunea cu APC poate induce inhibiţie şi chiar apoptoză .

 

NB. CTLA-4 competiţionează cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimată pe

membrana APC. Datorită efectelor discrepante – activatoare/inhibitoare – se pune problema

înţelegerii modului în care LT va traduce semnalul primit.

1). Dacă APC este activat de prezenţa în mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL–2),

va prezenta un număr mai mare de molecule B7, favorizând legarea CD28, iar semnalul

transmis va fi activator (Figura nr. 4).

2). În cazul în care APC este puţin activat, va exprima pe membrana sa puţine molecule

B7. Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aşa încât

majoritatea moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va

fi inhibitor (Figura nr. 5).

Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este

modulat de factorii de mediu şi decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul

„Toleranţă Imunologică” pentru mai multe detalii).

 

171

Cuplul CD40 şi CD40L·       Molecula CD40 se exprimă pe toate celulele prezentatoare de antigen în repaus -

celule dendritice, LB şi monocite/macrofage dar şi pe progenitorii hematopoietici şi celulele

epiteliale.

·       Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprimă decât pe LT activate CD4+ sau

CD8+ şi nu pe cele în repaus. Este de asemenea prezentă pe bazofile şi mastocite.

Sindromul hiper-IgM, X-linkat se caracterizează prin absenţa moleculei CD40L funcţionale.

·       Mecanismul prin care interacţiunea CD40-CD40L stimulează răspunsul LT pare a fi

reprezentat de intensificarea secreţiei de IL-12 şi creşterea numărului de molecule B7 de pe

membrana APC („APC licensing”), ducând la recrutarea mai multor celule prezentatoare de

antigen şi potenţarea semnalului costimulator transmis de aceste celule.

13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele

prezentatoare de antigen şi limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice şi

ţintă.

Aceşti liganzi cuprind următoarele două cupluri:

Cuplul LFA2 (CD2) şi LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated antigen)

·       Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) între LT

umane şi eritrocitele de oaie. Fenomenul se datorează prezenţei LFA3 pe eritrocitele de

oaie.

·       Molecula LFA3 (CD58) are o distribuţie largă, care cuprinde celulele endoteliale

vasculare, fibroblaştii, limfocitele şi macrofagele.

Cuplul LFA1 şi ICAM 1, 2 şi 3·       Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/β2 (CD11a/CD18). Prezenţa sa este relativ

difuză la nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB şi LT de memorie).

·       ICAM1 (CD54), ICAM2 şi ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice şi

permit activarea lor. ICAM1 se găseşte pe neutrofile în repaus, celule endoteliale,

monocito/macrofage şi LB activate.

Aceste două cupluri de adeziune permit recunoaşterea şi interacţiunea între LT CD4+ şi

APC sau între LT CD8+ şi celula ţintă, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea

constituită între LT CD4+ şi APC a fost numită „sinapsă imunologică”, subliniind transferul

informaţional implicat în recunoaşterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de către

TCR 

13. 2. Citokinele (Interleukinele)Citokinele sunt substanţe proteice, solubile, cu greutate moleculară mică, 8-70 kDa. cel

mai frecvent sunt sintetizate de către celule după activare prealabilă, acţionând ca

mediatori asupra altor celule sau asupra lor însăşi, în cantităţi foarte mici, de ordinul pico

sau nanogramelor. În momentul de faţă au fost identificate peste 100 de molecule diferite

172

de citokine. O parte dintre citokine au în special efecte „chemotactice” şi din acest motiv au

fost numite chemokine.

Termenii de limfokine (substanţe sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind

din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gamă mult mai

largă de celule. Termenul de interleukine, care indică o acţiune între două leucocite, a

persistat şi continuă să persiste în denumirea prescurtată, de la IL-1 la IL-35.

Termenul de citokine pare să fie cel mai adecvat. În unele cazuri, denumirea provine de

la una din activităţile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor),

IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF

(granulocyte-CSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). În afara

sistemului imun şi hematopoietic au fost descoperiţi şi alţi factori de creştere: NGF (nerve

growth factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc.

Citokinele acţionează datorită prezenţei receptorilor specifici, desemnaţi prin denumirea

lor engleză: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezenţi uneori pe aceeaşi celulă care a

sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare

atotcuprinzătoare a citokinelor este foarte dificilă, din punct de vedere funcţional, pentru

motivele prezentate (şi care reprezintă un „punct” din „cutia Pandorei” la care se face

uneori referire, atunci când sunt luate în discuţie aceste structuri). Din punct de vedere

didactic (şi funcţional), vom încerca să prezentăm în continuare o grupare a celor mai

cunoscute dintre citokine.

13. 2. 1. Citokine pro-inflamatoriiÎn cadrul procesului infecţios, diferitele microorganisme care au sau dobândesc prin

variabilitate un efect de agresiune faţă de organismul gazdă, antrenează un răspuns la

nivelul endoteliului vascular; una dintre primele reacţii este reprezentată de mobilizarea

leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). În această etapă intervin şi o serie de

citokine.

·       TNF-α şi TNF-β

TNF-α este produs de monocite / macrofage dar şi de diverse alte celule (limfocite T,

limfocite B, celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacţie la

contactul cu diferite bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi.

Sursa cea mai importantă pentru TNF-α rămâne însă sistemul monocito-macrofagic. TNF-α

favorizează expresia moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular şi al

monocitelor; atrage către sediul procesului infecţios alte monocite şi leucocitele PMN. Are o

activitate anti-virală, anti-parazitară şi anti-tumorală. Stimulează lipoliza, glicoliza

musculară şi reabsorbţia osoasă prin care poate antrena apariţia caşexiei (TNF a fost numit

iniţial caşexină). Induce formarea altor mediatori ai inflamaţiei (leucotriene, PAF). Formarea

sa este la rândul său indusă de IFN, IL-1, factori de creştere sintetizaţi de monocit,

endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri, bacterii, unele componente ale

sistemului complement, leucotriene şi prostaglandine. Eliberarea TNF-α este inhibată de

glucocorticoizi, α2-macroglobuline, α2-antitripsină etc. TNF-β este sintetizat de LT activate

173

şi celule NK şi are acţiuni identice cu TNF-α, acţionând pe acelaşi tip de receptori. În

momentul de faţă este clasificat între limfotoxine (LT-α).

·       IL-1 şi IL-6

Sunt două citokine cu rol asemănător. Sunt produse de numeroase celule: monocite,

macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite şi celule

gliale (din creier) etc.

IL-1 se găseşte sub două forme: IL-1a fixată la membrană şi IL-1β secretată.

Experimental a fost demonstrat că stimularea cu orice structură microbiană a celulelor care

în mod potenţial sintetizează IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a şi IL-1β). Ele

sunt codificate de gene diferite dar recunosc aceeaşi receptori: primul receptor IL-1R1

induce transducţia informaţiei la nivel celular, în timp ce IL-1R2 nu induce un semnal

celular. IL-1α are funcţie imunologică, activând la nivel superior LTh, care se vor divide

mitotic şi se vor diferenţia în diverse clase. IL-1β, eliberată în spaţiul extracelular şi în

sânge, exercită o puternică acţiune proinflamatorie.

Celulele care sintetizează IL-1 produc câteva ore mai târziu un antagonist al

receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca acţiunea IL-1 să fie tranzitorie. IL-1 induce

creşterea expresiei moleculelor de adeziune; activează limfocitele T şi B; creşte sinteza

proteinelor de fază acută la nivel hepatic; creşte catabolismul celulelor musculare şi al

osteoclastelor (rezorbţie osoasă); activează sistemul nervos central cu febră, anorexie şi

insomnie. Fiind şi prima interleukină numită ca atare, IL-1 a fost considerată iniţial drept o

moleculă piretogenă. Inocularea de IL-1 la subiecţi umani conduce la apariţia febrei şi

frisonului. Concentraţia de IL-1 din plasmă poate să crească şi în condiţii fiziologice (ex. în

stres nepatologic, exces de vitamină A, în timpul menstruaţiei).

IL-6 are o acţiune atât asupra sistemului imun cât şi asupra unor celule care nu aparţin

acestuia, asemănătoare cu aceea a Il-1, cu o singură diferenţă: ea acţionează mai ales pe

maturaţia terminală a LB în plasmocite şi pe diferenţierea LT citotoxice. Ca şi IL-1, produce

proteoliză endogenă, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen,

haptoglobină, α1-antitripsină, proteină C reactivă etc) şi activează sistemul nervos central

conducând la apariţia febrei, anorexiei, somnolenţei etc. IL-6 induce sinteza de

imunoglobuline; are şi rol în maturarea celulelor pe linia megakariocitară. Sinteza IL-6 este

stimulată de IL-1.

·         Limfotoxinele

Limfotoxina (LTx) a fost identificată în urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele

activate, ulterior a fost sintetizată şi caracterizată, dar s-a dovedit că nu există un singur

factor de acest tip, ci o serie de substanţe care ar putea fi grupate într-o „superfamilie”.

Iniţial LT-α, o limfotoxină solubilă, a fost definită drept factor de necroză tumorală (TNF-β).

Dintre numeroşii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menţionăm LT-α şi LT-β, sintetizate

în special de LT şi LB activate, dar şi de către celulele NK sau celule LAK (lymphokine

activated killer cells). Au rol în etapele de iniţiere a inflamaţiei şi se pare că au un rol în

realizarea unei protecţii faţă de agresiunea microbiană.

·         IFN-g

174

Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN-γ amintim activarea macrofagelor (acest

interferon este probabil cea mai importantă substanţă care produce „trecerea”

macrofagelor de la o stare „în aşteptare” la starea activă, bactericidă) şi astfel intervine în

fazele iniţiale ale inflamaţiei dar şi în diferenţierea clonelor de limfocite care reacţionează

faţă de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate în

următoarele subpuncte.

·         IL-10

Acţionează atât asupra celulelor hematopoietice cât şi asupra altor celule. Dacă iniţial s-

a considerat că are efecte pro-inflamatorii, în momentul de faţă se cunoaşte faptul că, prin

efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o

interleukină cu efect anti-inflamator. A fost numită şi „factor de inhibare al macrofagelor”.

·         IL-11

Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor,

keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11

stimulează sinteza unor reactanţi de fază acută, la fel ca şi IL-6. Totuşi, efectul esenţial al

IL-11 se adresează creşterii trombocitare. Are şi efecte anti-inflamatorii la nivelul

adipocitelor şi osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizată utilizarea IL-11 în tratamentul

asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariţia unei trombocitopenii severe la

pacienţii care primesc medicaţie citotoxică, anti-tumorală.

·         IL-12

Cunoscută drept o substanţă care induce sinteza de IFN-γ, IL-12 are şi alte efecte de

stimulare a răspunsului inflamator al gazdei, în urma unui proces infecţios. Sursa cea mai

importantă de IL-12 este reprezentată de celulele dendritice.

·         IL-16

Iniţial a fost considerată o chemokină pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita

astfel de activităţi şi faţă de alte celule implicate în procesul infecţios şi în inflamaţie. Sursa

principală de IL-16 este reprezentată de LT CD8+.

·         IL-17 (A, B, C, F)

Au efecte proinflamatorii şi de stimulare a hematopoiezei.

·         IL-18

A fost considerată drept o moleculă care induce sinteza de IFN-γ. Ulterior s-a dovedit că

singură, nu duce la o stimulare eficientă, dar în asociere cu IL-12, efectul de stimulare al

sintezei de IFN-γ demonstrează sinergism. IL-18 este sintetizată în special de macrofagele

activate şi de către celulele dendritice, dar există şi alte celule producătoare de IL-18

(monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte

în procesul infecţios declanşat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), paraziţi

(ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale şi

intervine în patogenia unor boli în care există inflamaţie cronică sau în boli autoimune.

·         IL-22

Este o citokină înrudită cu IL-10, dar cu puternice proprietăţi pro-inflamatorii. Într-un

studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un răspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de

la debutul infecţiei cu Klebsiella pneumoniae. Răspunsul indus în celule cultivate în

175

prezența aceastei citokine, este de exprimare a moleculelor defensive în celulele epiteliale

traheale. Unul din efectele induse de această citokină este exprimarea moleculei lipocalin-

2, cu rol în sechestrarea fierului. Într-un model de infecţie colonică s-a demonstrat că lipsa

IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale şi diseminare bacteriană.

·         IL-23

Are efecte asemănătoare cu IL-12, exercitate în combinaţie cu IL-12. Este sintetizată

mai ales de celulele dendritice.

·         HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1)

Iniţial a fost caracterizată ca o proteină non-histonică cu rol în arhitectura cromozomilor.

S-a demonstrat că această citokină cu totul particulară are rol pro-inflamator, fiind eliberată

din celulele necrotice (şi doar în mică măsură de cele apoptotice), jucând rol de DAMP

(Damage Associated Molecular Pattern) dar şi secretată activ de macrofage stimulate.

Receptorul membranar specific, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-

products) mediază efectele sale.

Această proteină are un rol patogenic important în sepsis şi medierea efectelor de fază

târzie  ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, că mortalitatea în

sepsis a fost redusă prin administrarea pasivă de anticorpi anti-HMGB1.

13. 2. 2. Citokine cu acţiune anti-virală şi anti-proliferativă

În această categorie sunt cuprinse mai multe interleukine.

·         Spre exemplu interferonul a şi β. IFN-a este produs de monocite şi celulele

hematopoietice iar IFN-β este produs de alte celule de tipul fibroblaştilor şi al celulelor

endoteliale. Cele două citokine prezintă acţiune anti-virală şi anti-proliferativă; stimulează

celulele NK; cresc expresia moleculelor MHC I; activează producţia de IL-2 de către

monocite/macrofage şi celule dendritice; induc sinteza de IFN-g, cu acţiune anti-virală şi

anti-proliferativă.

·         IL-2, cu efect autocrin şi paracrin, a fost prima interleukină utilizată în terapia

cancerului (administrarea pe cale intravenoasă a fost asociată, din nefericire, cu efecte

toxice severe; datorită acestor efecte, dar şi descoperirii unor efecte similare prin

administrarea altor molecule în alte situaţii clinice, în momentul de faţă a intrat între

noţiunile medicale clasice şi definirea „sindromului de toxicitate al citokinelor”). Mai recent,

se încearcă administrarea IL-2 la pacienţii cu infecţie HIV / SIDA, în speranţa că efectele

proliferative asupra LT CD4+ vor îmbunătăţi istoria naturală a bolii. O analiză recentă a

datelor din două mari studii clinice a arătat un efect neutru al terapiei. (1)

·         Prin potenţarea activităţii citotoxice a LT şi a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea

utilitate clinică în inhibarea procesului infecţios determinat de virusuri dar şi în diferite

forme de neoplazii.

·         IL-18 are sau induce efecte împotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal,

virusului herpes simplex etc dar are şi efecte anti-tumorale.

176

13. 2. 3. Citokine activatoare ale răspunsului imun celular

Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de provenienţă limfocitele Th1. În

această categorie sunt incluse următoarele citokine.

·         IL-2 este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 şi Th1 (cu rol în RIP de tip

celular) activate şi într-o mai mică măsură de celulele NK şi de celulele dendritice. Şi LT Th2

(cu rol în RIP de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acţionează asupra diferitelor celule cu rol

în imunitate [asupra limfocitelor T acţionează printr-un mecanism autocrin, antrenând

proliferarea şi activarea spre subsetul Th1 dar şi Th2; transformă celulele Nk în celule LAK

(lymphokine activated killer cells); antrenează proliferarea limfocitelor B]. Acţionează

sinergic cu IL-12 şi IFN-γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a fost prima

dintre interleukine care a fost caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu

133 aminoacizi, o greutate moleculară de 15,5 kDa; gena care codifică sinteza de IL-2 se

găseşte pe cromozomul 4.

·         IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină

este reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu

producerea speciilor reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra

microorganismelor intracelulare. Prin acţiunea sa anti-Th2, reduce răspunsul imun umoral.

IFN-γ controlează funcţii imune implicate în apărarea antibacteriană, antivirală şi

antiparazitară.

13. 2. 4. Citokine activatoare ale răspunsului imun umoral

Aceste citokine sintetizate de ex. de către limfocitele Th2 şi unele mastocite, orientează

răspunsul imun umoral spre diferitele clase şi subclase de imunoglobuline.

·         IL-4 acţionează în etapa iniţială a răspunsului imun umoral, permiţând trecerea

LB din stadiul G0 la stadiul G1. Stimulează producerea şi maturarea intramedulară a LB.

Acţiunea sa este întărită de IL-1. De asemenea, stimulează producerea de IgG, specifică RIU

secundar şi blochează producerea de IgM, specifică RIU primar. Mecanismul are loc la nivel

de genom şi se numeşte izotipic switch (comutare izotipică) (Figura nr. 8). Citokina este

totodată un factor de creştere pentru bazofile şi mastocite. Are de asemenea rol în

hematopoieză. Acţionează sinergic cu IL-3 în cursul diferenţierii mastocitelor şi limfocitelor.

Dacă există o sinteză crescută peste normal a IL-4 de către LT Th2, se înregistrează o

creştere semnificativă a sintezei de IgE iar din punct de vedere clinic apariţia manifestărilor

hipersensibilităţi de tip umoral (tip I).

·         IL-5 stimulează RIU la nivelul mucoaselor. Intră în acţiune mai târziu, alături de

IL-2, permiţând multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de creştere pentru leucocitele

polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare şi asupra bazofilelor. La fel ca şi IL-

4 şi IL-5, are rol hematopoietic. Stimulează sinteza de Ig A de către limfocitele B. Datorită

177

efectelor menţionate, un tratament novator al afecţiunilor datorate hipersensibilităţii de tip

I ar putea să se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- „alergice” care să aibă drept ţintă

molecula IL-5).

·         Printre numeroasele sale activităţi, IL-6 este o citokină proinflamatorie, cu

acţiune tardivă în procesul de maturaţie a imunoblastelor în plasmocite.

·         IL-10 induce diferenţierea iniţială a liniei de celule B. IL-10 inhibă citokinele

proinflamatorii şi sinteza de IFN-g, comportându-se ca o citokină reglatorie negativă pe

subsetul Th1. Are de asemenea şi rol stimulator, în cazul maturării mastocitelor, în cazul

apărării antivirale şi antitumorale, precum şi rol chemoatractant pentru limfocitele T

(CD8+).

·         IL-13 este produsă de LT Th2 activate (dar există şi clone de LT Th1, Th0 sau LT

CD8+ care pot sintetiza această moleculă). IL-13 inhibă sinteza citokinelor proinflamatorii

şi, ca şi IL-4, stimulează sinteza IgE.

13. 2. 5. ChemokineAceste molecule de adeziune cuprind  aproximativ 50 de  membri divizaţi în mai multe

familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost

standardizată în raport cu structura chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de

cisteină. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte

pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaugă litera R şi un număr, în timp ce

liganzii conţin litera L şi un număr. Ele prezintă o activitate chemotactică faţă de limfocite,

monocite, eozinofile etc.

Neutrofilele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinofilele,

bazofilele şi monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri

există în permanenţă pe suprafaţa celulelor normale circulante şi pot fi detectate prin

metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul

circulator, în timp ce unii liganzi (CX3CL1, CXCL16) conţin o porţiune transmembranară,

permiţând ancorarea celulelor de endoteliul vascular în condiţii de flux fiziologic. Prin

intermediul acestor receptori, celulele menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la

celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este

reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că

studiile arată tot mai des rolul chemokinele în procese patologice, precum ateroscleroză,

scleroza multiplă etc.

13. 2. 6. HematopoietineHematopoieza este controlată de către un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se

menţine un compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate

liniile sanguine. Sistemul necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui

spaţiu hematopoietic medular graţie echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul

de proliferare şi diferenţiere a celulelor stem intervin numeroase citokine:

178

·       SCF (stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei

osoase. SCF este produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana

citoplasmatică.

·       IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu

greutatea moleculară 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate

în urma stimulării antigenice dar şi al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codifică

pentru sinteza IL-3 se află pe cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi

diferenţierea celulelor stem spre diferitele linii.

·       IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 şi IL-15:

- IL-4 stimulează diferenţierea şi creşterea bazofilelor şi mastocitelor;- IL-5 are acelaşi rol faţă de eozinofile;- IL-7 este un factor de creştere produs de celulele stromale medulare şi timice care induce proliferarea L pre T şi pre B;- IL-10 favorizează dezvoltarea megacariocitelor;- IL-11 este un factor de creştere pentru linia trombocitară, dar are şi efect pro-inflamator;- Il-15 permite diferenţierea celulelor stem spre NK.

Factorii de creştere ai liniilor hematopoietice: factorii de creştere stimulează

celulele hematopoietice deja diferenţiate, respectiv progenitorii, permiţând creşterea şi

evoluţia lor spre stadiile ulterioare, până la maturizare. Se cunosc GM-CSF (granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor) pentru linia monoblastică şi mieloblastică, G-CSF

(granulocyte CSF) pentru linia mieloblastică, M-CSF (macrophage GSF) pentru linia

monoblastică, alături de interleukinele menţionate anterior, în special IL-3.

13. 3. Mesagerii secunziStimularea celulară debutează prin interacţiunea unui număr mare de receptori

membranari celulari. Alături de moleculele de adeziune şi receptorii de citokine, mai trebuie

amintiţi receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) şi receptorii pentru

complement (CR). Aceştia au o importanţă sporită în recunoaşterea patogenilor şi

reprezintă startul procesului de procesare antigenică în cadrul răspunsului imun înăscut.

Transducţia semnalului primit necesită intervenţia mesagerilor secunzi, care transmit

informaţia printr-o reacţie în cascadă, până la nivelul membranei celulare, al organitelor

intracitoplasmatice sau al nucleului. În acest ultim caz, este vorba de o acţiune asupra unor

gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificări

transcripţionale).

Întregul mecanism este complex şi necesită interacţiunea între partea

intracitoplasmatică a receptorilor membranari şi mesagerii secunzi. În unele cazuri,

molecula receptor membranar care primeşte semnalul extracelular comunică direct cu

mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). În alte

cazuri, molecula receptor cu o parte intracelulară limitată la câţiva aminoacizi, este

asociată la alte molecule, fomând adevărate domenii de amplificare a semnalului

(molecular scaffolds). Partea intracelulară astfel dezvoltată poartă motivul de interacţiune

cu mesagerul secund. În acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR,

179

moleculele Iga şi Igβ ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru

interleukine. (Figurile nr. 9-10)

Recrutarea leucocitelor circulante – Molecule de adeziune şi Citokine

Primii mediatori ai inflamaţiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar

ca rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal – epinefrină, activarea mastocitelor rezidente

– histamină, sau ca urmare a activării cascadei coagulării – trombină). Aceşti  mediatori

sunt responsabili de modificările reologice specifice inflamaţiei şi de recrutarea leucocitară

prin activarea celulelor endotelialiale adiacente.

Consecinţele sunt permeabilizarea patului vascular şi expunerea pe versantul circulator

a moleculelor de adeziune. P- şi E-selectinele sunt primele expuse, având rol în

marginalizarea leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe

leucocite joacă rol de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele două selectine, ducând la contactul

celulelor cu endoteliul, cu rol în încetinirea leucocitelor – rolling leucocitar (adeziunea este

insuficient de puternică pentru a constitui o legătură fermă).

Citokinele (IL–1 şi TNF–a) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor

immunoglobin–like (ICAM-1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaţa

leucocitelor (LFA-1 şi Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leagă

receptori specifici de pe membrana leucocitară (IL-8R). Ca urmare a semnalizării

intracelulare determinată de citokine, se induc schimbări conformaţionale în structura

integrinelor (semnalizare „inside-out”). Integrinele trec astfel de la stadiul conformaţional

cu afinitate redusă la cel cu afinitate crescută pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de

a stabili o adeziunea fermă a leucocitelor la endoteliu. Urmează reorganizarea scheletului

celular şi diapedeza leucocitară mediată tot de integrine (semnalizare „outside-in”).

Integrinele mediază şi ataşarea leucocitară la componentele matricei extracelulare,

conducând la exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite înaintarea

leucocitelor spre focarul de inflamaţie. Procesul de dirijare a migrării leucocitare se bazează

pe emiterea de prelungiri membranare în direcţia dictată de gradientul de concentraţie a

mediatorilor chemotactici.

13. 4. Povestire adevăratăPovestirea adevărată este preluată din literaură şi subliniază mai multe principii care

merită însuşite încă din anul al 2-lea de studenție. Introducerea în practica medicală

curentă a unui nou medicament reprezintă concomitent un maraton (întrucât durează în jur

de 15 ani) cât şi un concurs (între companii farmaceutice, echipe de cercetare). Există însă

un proces riguros de testare ce trebuie urmat cu strictețe. Studiile sunt coordonate astfel

180

încât se efectuează studii de siguranţă şi de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale

de laborator, iar abia în final pe oameni (voluntari). De multe ori însă, rezultatele foarte

promiţătoare ale studiilor preclinice sunt ”dărâmate” de ineficienţa noilor substanţe în

clinică. Aceste date conflictuale trebuie foarte bine investigate şi trebuie efectuat un bilanţ

riguros care să aibă drept scop binele pacienţilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine

documentate şi supervizate.

Prima etapă a studiilor clinice, o reprezintă validarea siguranţei de administrare la tineri

voluntari sănătoşi.

Asemănător terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor

T, investigaţiile preclinice au arătat un potenţial beneficiu în folosirea anticorpilor

direcţionaţi anti-CD28, cu acţiune de superagonişti şi rol de a activa şi expansiona numărul

de limfocite T in vivo, independent de stimularea receptorului TCR. În modelul murin, s-a

demonstrat că un anticorp cu aceeaşi specificitate a expansionat preferenţial sectorul

CD4+CD25+, de limfocite reglatoare, având un profil bun de siguranţă.

Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sănătoşi. În

decursul a 90 de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce

au fost atribuite unei descărcări masive de citokine (furtună citokinică/ ”cytokine storm”).

Fenomene asemănătoare au fost identificate într-un număr impresionant de patologii,

existând în continuare destul de multe necunoscute. Toţi pacienţii au prezentat răspuns

inflamator sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scădere a tensiunii sistolice cu cel

puţin 20 mmHg şi tahicardie compensatorie. Majoritatea pacienţi au dezvoltat o suferinţă

pulmonară  însoțită de permeabilizare vasculară şi infiltrare a spaţiilor alveolare cu lichid,

ducând la suferinţă severă. Toţi pacienţii au necesitat tratament suportiv cu intubaţie,

tratament de stabilizare hemodinamică şi dializă, iar tratamentul „specific”,

imunomodulator, a constat în administrarea de anticorpi anti-IL2 şi corticoterapie.

Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele şi citokinele circulante. S-a

constatat o creștere dramatică a TNF-α la o oră de la infuzia anticorpului cât şi a IL-2, IL-4,

IL-10 şi IFN-γ în decurs de 4 ore. Pacienţii cu evoluţia cea mai gravă au avut nivele ridicate

de citokine circulante pentru o durată mai lungă de timp.

 Toţi voluntarii au supravieţuit sindromului de răspuns inflamator sistemic (Systemic

Inflammatory Response Syndrome -SIRS). Analiza acestor reacții precum şi publicarea

rezultatelor a contribuit la o mai buna înţelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai

mult, urmărirea acestor fenomene, ca evoluţie naturală şi sub tratament a contribuit la

înţelegerea tratamentului. Merită admirat faptul că o poveste „de eşec” pentru o moleculă

candidat a fost publicată şi a contribuit, în felul acesta, la „viitorul succes” în domeniu.

13. 5. Verificaţi-vă cunoştinţeleLa întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.

1.      Rolling-ul leucocitar este mediat de interacțiunea:

  a.       Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine

  b.      Selectine – Antigen Lewis X

181

  c.       Integrine – Receptori de integrine

  d.      Integrine – Fibrină

2.      Inducerea comutării izotipice IgM – IgG este realizată de:

  a.       TNF alfa

  b.      IL-1

  c.       IL-4

  d.      HMGB-1

3.      Descrieţi cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice.

4.      Enumerati rolurile Interferonului Gamma.

5.      Au efect imunoinhibitor (răspuns multiplu):

  a.       TLR

  b.      IL-4

  c.       IL-10

  d.      CTLA-4

  e.       IL-13

14. Imunoglobulinele Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în

plasmă, lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina

specific cu antigenul inductor al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu

aceeaşi structură dar fără activitate de anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în

macroglobulinemia Waldenström's a fost identificată proteina patologică Bence-Jones

(poate fi identificată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză anormală de lanţuri

uşoare; a fost descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) îl

înlocuieşte pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi

anticorpii migrează electroforetic în regiunea „gama”.

Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au şi alte

roluri.

Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor”

bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri

(inclusiv împotriva structurilor proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor,

pot exista anticorpi diferiţi faţă de structuri diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă

de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae).

Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:

- recunosc şi reacţionează specific cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;

- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor

avea rolul de antigene pentru respectivul individ;

- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;

182

- pot activa sistemul complement etc.

S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr-o parte de

moleculă umană şi alta animală; fiind de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri

antigenice şi nu vor mai fi „respinşi”.

14. 1. Structura generalăStructura de bază a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde două lanţuri grele identice şi

două lanţuri uşoare identice, legate între ele prin punţi disulfurice: două punţi între cele

două lanţuri grele (în cazul IgG1) şi o singură punte între fiecare lanţ greu şi uşor.

Această schemă structurală a fost identificată în urma mai multor experimente

(reducere şi alchilare, acţiunea papainei, acţiunea pepsinei). Pepsina poate de ex. să

degradeze enzimatic o moleculă de imunoglobulină, acţionând la nivelul aminoacidului

Leucină din structura lanţurilor grele. Duce astfel la apariţia unui fragment cu greutate

moleculară destul de mare format la rândul său din 2 fragmente Fab unite [acest fragment

poartă numele de F(ab)2].

Fragmentele unei Ig sunt următoarele:

- Fab: prima jumătate a lanţului greu şi întregul lanţ uşor, legate între ele printr-o punte

disulfurică, obţinute sub acţiunea papainei, prin scindarea înaintea regiunii balama, cu un

singur situs de legare;

- F(ab’) 2: cele două fragmente Fab şi regiunea balama, care rezultă după acţiunea

pepsinei, constituie un fragment superior celor două fragmente Fab şi conţine două situsuri

de legare;

- Fc: jumătăţile terminale ale celor două lanţuri grele unite prin punţi disulfurice la

nivelul regiunii balama;

- pFc’: cuprinde fragmentele peptidice rezultate după acţiunea pepsinei, cu întregul

domeniu CH3 situat după aminoacidul 333 al lanţului greu;

- Fd: corespunde primei părţi a lanţului greu după acţiunea papainei, cu formarea

fragmentului Fab, şi după reacţia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanţul uşor;

- Fv: corespunde părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor (VH+VL).

Pentru Ig, noţiunea de domeniu se regăseşte la lanţurile grele în 4 exemplare (IgG, IgA,

IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) şi la lanţurile uşoare în 2 exemplare. Terminologia utilizată

este următoarea:

·       Lanţurile grele:

- VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comună tuturor claselor şi

subclaselor cu aceeaşi specificitate.

- CH 1, CH 2, CH 3 şi CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care

conţine diferenţele pentru fiecare clasă şi subclasă; de exemplu pentru IgG1 există

fragmentele Cg11 , Cg12 şi Cg13 şi pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4.

·       Lanţurile uşoare:

- VL pentru fragmentul uşor variabil (variable light), diferit pentru lanţurile kappa şi

lambda: Vk şi Vl.

183

- CL pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru

Cl funcţionale.

Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu

determinantul antigenic (epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ)

vine în contact direct cu epitopul şi se numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului

combinativ se numeşte idiotip.

14. 2. Structura particulară a fiecărei clase sau subclase de Ig

IgG

IgG (prototipul de Ac) reprezintă circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser şi are o

distribuţie aproximativ egală în vase şi ţesuturi. Există patru subclase de IgG (molecule cu

termorezistenţă mai mare), cu structură asemănătoare, o masă moleculară de 146.000

(excepţie făcând IgG3 cu o masă de 170.000), 3 domenii constante pentru lanţul greu şi un

procentaj de hidraţi de carbon de 2-3 %. Concentraţia sanguină a IgG este de ordinul 11 g/l,

din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% şi IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul

complement. Poate trece prin bariera hemato-placentară (după a 20-a săptămână de viaţă

intra uterină). Apare în RI secundar.

IgM

Sunt anticorpi aglutinanţi şi reprezintă cei mai eficace activatori ai complementului. Ac

IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producţia lor fiind stimulată de către IL-4, care nu

activează mecanismul de switch izotipic.

IgM membranară (IgMm) este exprimată pe suprafaţa LB. Are structură monomerică

şi se termină prin aminoacizii 556-597, cuprinzând în mod particular o parte

intramembranară hidrofobă şi 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare moleculă de IgMm

este asociată cu 2 lanţuri Iga şi 2 lanţuri Igβ. Ansamblul formează BCR (B cell receptor),

comparabil cu TCR-ul limfocitului T.

IgM serică (IgMs) cuprinde un lanţ greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii

constante Cm1 - Cm4 şi un procent ridicat de hidraţi de carbon (12 %). Molecula însăşi este

un pentamer cu un prim inel al punţii disulfurice la sfârşitul lui Cm3, un al doilea la

terminarea lui Cm4 şi un lanţ J (joining chain). Masa moleculară este foarte mare (circa

970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraţia serică este de 1,2 g / l.

Reprezintă circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative

dintre care numai 5 sunt funcţionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu

poate trece prin bariera hemato-placentară. Apare în RI primar.

IgA

IgA serică. Sub forma IgA1 (80%) şi IgA2 (20%), ea se găseşte ca monomer (GM

160.000, 7 S) sau ca dimer sau trimer, ultimele două forme cu lanţul J de joncţiune. IgA2

are o structură originală. Lanţurile uşoare unite între ele printr-o punte disulfurică nu sunt

legate printr-o legătură covalentă cu lanţurile grele. Concentraţia sanguină a IgA este de

2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-184

placentară. Nu participă la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are

activitate bactericidă mai mare decât IgG şi decât IgM.

IgA exocrină sau secretorie cuprinde două subclase IgA1 şi IgA2. Masa moleculară

este de 400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde două unităţi de

IgA reunite printr-un lanţ J. Acest ansamblu este înconjurat de unitatea secretorie

sintetizată de celulele epiteliale ale tubului digestiv.

Au rol important în apărarea la nivelul mucoaselor (digestivă, respiratorie etc) şi în

reglarea ”compoziţiei” florei microbiene de la suprafaţa acestora. Este important ca nou-

născutul să primească de la mamă colostrul şi apoi să fie alimentat pe cale naturală pentru

a primi IgA (sinteza proprie începe după circa 1 lună de la naştere).

IgD

Are un nivel seric scăzut iar rolul său încă nu este pe deplin cunoscut. IgD se află, mai

ales, la suprafaţa limfocitului B în asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor

activ de diferenţiere celulară şi memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu

poate traversa bariera hemato-placentară. Concentraţia de IgD creşte în ser de la naştere şi

până la vârsta de 15 ani. Creşte în serul femeilor însărcinate.

IgE

Deşi concentraţia lor serică este infimă (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile şi mastocite le

conferă un rol important în inflamaţie şi hipersensibilitatea de tip imediat. posedă, ca şi

IgM, un al patrulea domeniu constant, care îi conferă o masă moleculară de 190.000 D şi un

coeficient de sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixează pe receptor prin intermediul

domeniilorCe2 şi Ce3,într-o poziţie aproape orizontală.

Lanţurile uşoare

Acestea sunt în proporţie de 2/3 lanţuri kappa şi 1/3 lanţuri lambda, excepţie făcând IgD

la care lanţurile lambda sunt majoritare.

14. 3. Determinanţii antigenici ai imunoglobulinelor

Imunoglobulinele inoculate la o specie diferită vor avea rol de antigene şi în această

„calitate” prezintă 3 tipuri diferite de determinanţi sau markeri antigenici.

Izotipia

Determinanţii izotipici sunt prezenţi la toţi indivizii aceleiaşi specii. Ei iau naştere în

cursul diferenţierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obţinuţi prin injectarea Ig umane

policlonale sau monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la

subiecţii cu deficit de IgA după transfuzia de sânge şi stau la originea şocului cu

hipotensiune arterială. Ei pot fi consideraţi anticorpi anti-izotip.

Allotipia

Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumită specie, bazate pe

deosebirea a 1-3 aminoacizi, corespund variaţiei apărute în cadrul respectivei specii. În

mod natural (în lipsa unei injectări prealabile de sânge sau plasmă), se pot găsi anticorpi

185

anti-allotipici la subiecţii care nu au allotipurile corespunzătoare, la 1% din subiecţii normali

şi la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrită reumatoidă.

Diferitele sisteme cunoscute se notează folosind litera clasei de Ig şi litera K pentru

kappa, urmate eventual de numărul subclasei şi în final litera m pentru marker (ex.

sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km).

IdiotipiaÎn definiţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care

a produs anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o

primă etapă a imunizat un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de

anticorpi numiţi Ab1 împotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu

acest imunoser şi s-au obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau

anti-idiotip Ab1. Aceşti anticorpi nu recunosc decât serul primului animal imunizat şi nu

serul dinaintea imunizării sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeaşi Salmonella. Un

anticorp Ab2 poate recunoaşte mai mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând anticorpii

cu aceeaşi specificitate anti-Salmonella.

Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti-

idiotip Ab2, aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă

reacţia antigen-Ab1 şi Ab2-β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt

numiţi „imagine internă“ a epitopului de plecare E1, ceea ce înseamnă ce au o structură

imunologică asemănătoare, recunoscută de Ab1. Determinanţii antigenici idiotipici se

găsesc la nivelul părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi uneori sunt constituiţi

din cele două lanţuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor

imunoglobulinelor.

14. 4. Proprietăţi fizico-chimice14. 4. 1. Ig policlonale

Termenul de clonă a fost împrumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele

care derivă dintr-o bacterie sunt identice între ele şi cu prima bacterie. În imunologie,

aceasta desemnează toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate

imunologică).

Un răspuns imun „obişnuit” corespunde unui răspuns policlonal cu imunoglobuline:

·         de diferite clase şi subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.;

·         cu două allotipuri, dacă subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3);

·         cu lanţuri uşoare kappa şi lambda;

·         cu diferite specificităţi faţă de antigen, în recunoaşterea diverşilor determinanţi

antigenici iar pentru fiecare determinant antigenic, prezenţa unor epitopi diferiţi;

·         cu diferite afinităţi.

Ansamblul sintezei determină o hipergamaglobulinemie difuză datorată heterogenităţii

Ig prezente, corespunzătoare numărului de clone limfocitare diferite, şi se traduce prin

molecule cu încărcătură electrică diferită.

14. 4. 2. Ig monoclonale au următoarele caracteristici:

186

·         o singură şi subclasă de Ig, de exemplu IgA2;

·         un singur lanţ uşor, de exemplu lambda;

·         un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2;

·         o specificitate unică, ce recunoaşte un anumit epitop;

·         afinitate unică.

Acest aspect poate rezulta din proliferarea benignă (imunoglobulină monoclonală

benignă) sau malignă (mielom multiplu, boală Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig

secretate de clonă au o structură chimică identică, cu mobilitate electroforetică unică,

astfel încât electroforetic proteinele prezintă un vârf cu bază îngustă, iar

imunoelectroforetic se caracterizează prin apariţia celei de-a doua curburi a arcului normal,

având următoarele 3 caracteristici: linie groasă, curbă foarte marcată, poziţie mai apropiată

de imunoserul revelator.

14. 5. Ontogenia imunoglobulinelor

Fătul este capabil să sintetizeze, din a zecea săptămână, cantităţi foarte mici de IgM şi

cantităţi importante din a 12-a săptămână. IgG materne nu traversează bariera placentară

decât după a 20-a săptămână.

în absenţa unei infecţii congenitale (toxoplasmoză, sifilis etc), în sângele nou născutului

se găseşte o cantitate de IgM fetală care nu depăşeşte 10% din valoarea adultului. Nivelul

IgG la nou-născut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ,

de la mamă la făt.

După scăderea nivelului IgG materne (care pot persista până în lunile 3-6 de viaţă şi

chiar până la 18 luni) se observă o sinteză activă a diferitelor clase: IgM are nivel normal la

1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA şi IgE au un nivel normal la 14 ani.

14. 6. FuncţiiProprietăţile fragmentului Fab

Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu

intervenţia egală a domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor.

Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fiecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura

primară, dar apropiaţi în structura cuaternară, contribuie la formarea acestuia.

Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile.

Proprietăţile fragmentului Fc

Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fixat antigenul sau a fost

alterat de căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea

complementului şi recunoaşterea factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea

reactivităţii este următoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4.

Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig.

IgG (cu excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile.

187

Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai

uşor. Aşa cum am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de

cea maternă, ceea ce indică prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu

traversează placenta, Ig din aceste clase găsite la nou-născut fiind de origine fetală.

Cunoaşterea acestor aspecte este foarte utilă pentru evidenţierea unei afectări intrauterine

sau a unui simplu transfer de Ig materne. În caz de suspiciune de toxoplasmoză

congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti-toxoplasma în serul nou-născutului (au

existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a sarcinii în cazul în care la mamă au fost

identificaţi anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG).

Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un

receptor ascuns în stare nativă pentru C1q, care va fi activat în timpul fixării anticorpului pe

antigen. Acest receptor se află în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o

singură moleculă de IgM pentamerică este suficientă pentru activarea complementului,

datorită celor două situsuri apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin eficace

decât IgM, pentru activarea complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate

una de cealaltă. Calea alternă poate fi activată de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b.

Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule

membranare specifice pentru fiecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor

purtătoare. Se disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixează un monomer de Ig şi

sunt activaţi când antigenul se leagă de anticorp formând o punte între doi receptori cu

slabă afinitate Fc R II şi Fc R III, care nu pot fixa decât complexe antigen-anticorp

multivalente, formate în prealabil.

Celulele purtătoare de receptori pentru Ig sunt:

·         macrofagele, monocitele şi neutrofilele au următorii receptori: Fc g RI, Fc g RII,

Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor

acoperite cu anticorpi IgG;

·         celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxicităţi faţă de

celula ţintă sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependentă (ADCC) (antibody

dependent cellular cytotoxicity). În acest mod celulele NK se pot fixa pe celula ţintă şi o pot

liza;

·         bazofilele circulante şi mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI şi Fc e RII),

inductoare ale hipersensibilităţii imediate;

·         eozinofilele şi plachetele au receptori de slabă afinitate Fc e RII. Plachetele au şi

receptori Fc g care le conferă o activitate antiparazitară;

·         limfocitele au diverşi receptori de slabă afinitate.

Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimerică

sintetizată pe plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează

citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale

glandelor exocrine.

14. 7. Povestiri adevărate188

Apariţia unor infecţii respiratorii severe la persoane cu deficit de IgA

Cele 2 cazuri prezentate demonstrează importanţa existenţei unor valori normale a

imunoglobulinelor, discutându-se ca şi exemplu concret situaţia IgA. În ambele cazuri,

deficitul imun congenital a fost diagnosticat tardiv, la 2 ani şi jumătate şi respectiv la 5 ani,

cu ocazia unor infecţii respiratorii joase. În nici unul dintre cazuri nu a fost posibilă stabilirea

etiologiei, pentru că s-au administrat antibiotice şi chimioterapice înainte de a se recolta

produse patologice pentru începerea diagnosticului bacteriologic, direct.

Primul caz

Un copil de sex masculin, în vârstă de 5 ani, se internează într-o clinică de pediatrie,

datorită faptului că în cursul internării într-un spital de nivel inferior nu s-a obţinut

vindecarea pneumoniei de care suferea.

Motivele internării au fost: stare generală alterată, lipsa evoluţiei favorabile în cursul

internării precedente.

Istoricul bolii a arătat că este vorba de un copil care a făcut în fiecare an mai multe

infecţii respiratorii joase (3-5 / an, în fiecare an) şi mult mai numeroase infecţii acute ale

căilor respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat în finalul anului precedent, cu

simptome respiratorii pentru care părinţii au administrat paracetamol şi picături cu un

decongestiv nazal. După 2 săptămâni, datorită intensificării semnelor respiratorii, medicul

de familie recomandă internarea în cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind

pneumonie cu pleurezie. În spital s-a administrat o asociere de ceftriaxonă cu gentamicină,

dar semnele respiratorii s-au menţinut, apărând în plus semne de insuficienţă respiratorie;

în aceste condiţii copilul se transferă în clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de

gardă relevă o stare generală foarte alterată, dificultăţi în respiraţie, respiraţii frecvente,

tiraj intercostal, lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stâng, submatitate la

percuţie şi raluri crepitante însoţite de frecătură pleurală la auscultaţie în treimea medie a

hemitoracelui stâng. În clinica de pediatrie s-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi lichid

pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au

fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativă. Valorile celorlalte analize de

laborator au fost următoarele: VSH = 85 mm/oră, număr de leucocite = 28.000/mm3 (dintre

care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactivă=9,8 mg/dL. Dozarea

imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de 242

mg/dL pentru Ig M, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3 a

complementului a fost dozabilă, în cantitate de circa 10 ori mai mare decât valorile

normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari.

Diagnosticul de pneumonie stângă cu pleurezie, probabil de etiologie bacteriană, în

condiţiile unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de

medicamente antibacteriene (ceftriaxonă, amikacină şi teicoplanină) alături de

dezobstruante, menţinerea permeabilităţii căilor respiratorii şi administrare de oxigen. S-au

administrat de asemenea imunoglobuline pe care intravenoasă.

Datorită faptului că în ciuda unei evoluţii favorabile din punct de vedere clinic, semnele

fizice de la nivel pulmonar s-au menţinut iar temperatura nu a coborât sub 38,1ºC, s-a

administrat suplimentar un medicament antifungic evoluţia fiind favorabilă. Tratamentul a

189

fost continuat timp de 3 săptămâni, după care copilul a fost externat cu recomandarea de a

reveni la control clinic, radiologic şi bio-umoral. La controlul efectuat s-a constatat că

deficitul de IgA nu a fost corectat şi s-a menţinut şi după vindecarea pacientului, fiind

probabil o cauză a patologiei şi nu un rezultat al acesteia.

Al doilea caz

Un copil de sex feminin, se internează la vârsta de 2 ani şi 6 luni într-o clinică de

pediatrie, prin transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorită evoluţiei nefavorabile a unei

pneumonii. S-a născut prematur, după 8 luni de gestaţie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7.

A fost îngrijită în maternitate până la vârsta de 2 luni şi jumătate. Până la vârsta de 2 ani şi

jumătate a făcut repetate infecţii acute ale căilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4

episoade / an).

Motivele internării au fost: febră, tuse şi dispnee.

Din discuţia cu părinţii s-a aflat că tusea şi febra au apărut cu 10 zile anterior internării;

ulterior copilul a început să respire din ce în ce mai dificil. A primit în ambulatoriu ampicilină

(pe cale orală), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru că evoluţia a fost nefavorabilă, mama a

fost sfătuită să se prezinte pentru internare, la spital.

S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evidenţiat: febră (38,3°C),

paloare, număr ridicat de respiraţii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale în

timpul inspirului) şi sindrom de matitate în treimea inferioară a hemitoracelui drept (la

inspecţie, auscultator şi la percuţie). La examenul radiologic s-a văzut opacifierea

neomogenă a jumătăţii inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte

investigaţii se amintesc: VSH= 120 mm/oră, leucocitoză (12.400 / mm3) cu neutrofilie

(75%), hipoxemie (cu scăderea presiunii de oxigen). Imediat după internare s-a administrat

ceftriaxonă, apoi amoxicilină-acid clavulanic în asociere cu ciprofloxacină, fără ca evoluţia

să fie pozitivă. În aceste condiţii, s-a recomandat transferul într-o clinică de pediatrie, de

nivel superior.

Diagnosticul la internare în clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreaptă, sepsis

bacterian.

Examenul clinic la internare a revelat o stare generală profund alterată, prezenţa unui

facies suferind, foarte palid, hipertermie (39ºC), deficit al stării de nutriţie (greutate = 10,7

kg), cianoză peri-oro-nazală accentuată la plâns şi alte eforturi, polipnee (80 respiraţii /

minut), bătăi ale aripioarelor nazale, matitate cu absenţa murmurului vezicular în două

treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat

la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonară efectuată la

internare a evidenţiat opacifierea omogenă a hemitoracelui drept.

Celelalte investigaţii de laborator au avut următoarele valori: VSH = 75 mm/h,

hemoglobină = 8,2 g/dL, leucocitoză (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600

neutrofile/mm3, 63%), modificări ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie

dreaptă importantă, insuficienţă respiratorie acută, insuficienţă cardiacă, anemie, hipotrofie

ponderală. S-a realizat puncţia pleurală (atât pentru a elimina această cauză de presiune

mecanică asupra arborelui cardiovascular cât şi pentru punerea diagnosticului etiologic şi

stabilirea sensibilităţii la antibiotice a agentului sau agenţilor etiologici). S-a recoltat şi

190

sânge pentru hemoculturi, înainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau

chimioterapice. Lichidul pleural era „sub presiune”; s-au extras cu uşurinţă peste 375

mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost trimise imediat către laboratorul de

bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus în evidenţă rare PMN (2-5 / câmp) şi rari coci

Gram-pozitivi, aşezaţi unul câte unul sau în diplo. Coloraţia Ziehl-Nielsen nu a pus în

evidenţă bacili acid-alcoolo rezistenţi. Atât culturile din lichidul pleural cât şi cele

hemoculturi au rămas sterile. Prin reacţii antigen-anticorp s-a încercat punerea în evidenţă

a prezenţei antigenelor capsulare în lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae,

meningococ), dar reacţiile au fost negative.

Dozarea imunoglobulinelor serice a arătat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o

valoare de 160 mg/dL pentru IgM, în timp ce IgA a fost nedozabilă (0 mg/dl). Fracţiunea C3

a complementului a fost dozabilă, în cantitate mai mare decât valorile normale.

În condiţiile obţinerii acestor date clinice, paraclinice şi de laborator, s-au administrat

antibiotice în asociere [iniţial o combinaţie între un glicopeptid şi o cefalosporină de

generaţia a III-a (pentru 2 săptămâni), apoi o combinaţie între vancomicină şi amikacină

(pentru încă 2 săptămâni)], în afară de drenajul lichidului pleural (sub control clinic şi

paraclinic), administrare de oxigen, administrare de lichide, electroliţi şi substanţe nutritive

intravenos. Avându-se în vedere rezultatul dozării imunoglobulinelor, s-au administrat şi

imunoglobuline intravenos. Lent, evoluţia din punct de vedere clinic a fost favorabilă. Pe

partea dreaptă, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost

spitalizat pentru o lună, iar înainte de externare valorile bio-umorale au fost următoarele:

VSH =12 mm/oră, număr de leucocite= 6.500/ mm3 (fără neutrofilie), hemoglobină =

10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL.

Discuţii

Cu excepţia vârstei, au existat o serie de asemănări între cele două cazuri. Ambii copii

au avut în antecedente episoade de IACRS şi IACRI, mai multe / an, în fiecare an, fără

diagnostic etiologic, pentru care au primit tratament la domiciliu, de regulă incluzând

antibiotice sau chimioterapice. Episodul infecţios discutat, datorită evoluţiei grave, a

condus la recomandarea de internare şi în fiecare dintre cele două cazuri internarea a fost

realizată, succesiv, la două nivele spitaliceşti. În ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior,

copii au primit tratament antibiotic înainte de recoltarea produselor pentru punerea unui

diagnostic etiologic. În aceste condiţii nu a fost posibilă nici stabilirea sensibilităţii

microorganismelor implicate şi tratamentul anti-infecţios a fost condus „empiric”, ceea ce

ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului.

În primul caz nu s-a putut emite nici o ipoteză privind etiologia (alta decât „bacteriană”)

iar în al doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis

suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococică.

Tratamentele conduse în ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de părinţi (în baza

„amintirii” unor recomandări medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care să ridice

suspiciunea privind o „cauză de bază” care să explice un număr de infecţii respiratorii,

repetate, mai numeroase decât în mod obişnuit, ne fac să realizăm motivele pentru care

191

deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate că în ambele cazuri a existat un

deficit absolut în sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar).

Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei

funcţionări a sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor

deficienţe, iar pe de altă parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui

realizat numai după diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice, singura variantă corectă, care poate veni în sprijinul pacienţilor pe care

trebuie să îi îngrijim.

15. Sistemul complementComplementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente,

reprezintă unul dintre principalii constituenţi ai apărării naturale, ai imunităţii umorale şi

respectiv un element important al reacţiei imune survenite ca urmare a formării

complexelor antigen-anticorp (are rol esenţial în răspunsul inflamator). Sistemul

complement (C') reprezintă o componentă normală a serului.

Sistemul complement are o serie de funcţii importante: apărarea nespecifică împotriva

infecţiei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor străine, favorizarea prin opsonizare a

fagocitozei, chemotactism pentru PMN şi sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune şi

a celulelor apoptotice; reglarea fiziologică a RI, dar participă şi la creşterea permeabilităţii

capilarelor, stimularea contractilităţii musculaturii netede etc. În cele mai multe împrejurări,

sistemul complement are efecte benefice; totuşi sunt de menţionat şi unele efecte negative

(ex. participă la reacţiile anafilactice, este implicat în hipersensibilitatea citolitică-citotoxică

etc).

Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice.

Componentele sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale

etc. Substanţele activatoare reprezintă 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l);

componenta C3 este componenta care se găseşte în cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l).

(Tabelul nr. 1)

Sistemul C' se poate activa pe trei căi, respectiv calea clasică, calea lectinică şi calea

alternă.

Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de formarea complexelor

imune (Ag-Ac), dar şi de apariţia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C

reactivă cuplată cu anumiţi liganzi (Figura nr. 1).

Calea lectinică poate fi activată de lectina care leagă manoza de pe suprafaţa

bacteriilor (MBL, Mannan-Binding Lectin), dar şi de alte proteine asemănătoare.

·         Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imună şi prezintă cel

puţin două situsuri identice de legare specifică a unor structuri glucidice;

192

·         MBL este o proteină din clasa colectinelor, având domenii lectinice prin care se

ataşază glucidelor şi un domeniu colagen-like. MBL se găseşte în cantitate mică în serul

indivizilor sănătoşi, însă în cazul infecţiilor acute, concentraţia acesteia creşte semnificativ.

S-a constatat că persoanele care au deficit de MBL dezvoltă în copilărie mult mai multe

infecţii decât copiii normali, lucru ce atestă importanţa apărării organismului prin activarea

complementului pe calea lectinică la vârste la care sistemul imun nu s-a constituit în

totalitate din punct de vedere funcţional.

Interacţiunea acestora formează un complex asemănător celui format în primele

subetape ale căii clasice (C1qrs) şi activează calea clasică fără a necesita prezenţa

complexelor antigen-anticorp.

·         Pe lângă MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri

antigenice, să declanşeze activarea complementului pe calea lectinică. Aceste proteine

sunt ficolina-1, ficolina-2 şi ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compuşi acetilaţi prezenţi pe

suprafaţa microorganismelor. Dintre MBL şi ficoline, cea mai abundentă în plasmă şi cea

care intervine cel mai adesea în declanşarea căii lectinice, este ficolina-3, numită şi

antigenul Hakata sau β-2 macroglicoproteina termolabilă. (1)

Calea alternă poate fi activată de bacterii, fungi, virusuri, paraziţi, venin de viperă,

produşi de coagulare, celule tumorale etc.

Calea clasică şi calea alternă (alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale

efectoare comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr.

3). În fiecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum

şi receptorii pentru complement. Aceste elemente se găsesc fie în plasmă fie la nivelul

peretelui celulelor autologe sau omologe.

În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare

componentă studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră,

de la C1 la C9, care este eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită

subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 există C1q, C1r şi respectiv C1s).

Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt

fragmentate, aceste fragmente fiind desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale

(exemplu C3a şi C3b). În general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a,

fragment înglobat într-un complex proteolitic şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi

se fixează la nivelul structurii ţintă, în timp ce componenta a este mai mică, este solubilă şi

posedă o activitate anafilactoidă sau chimiotactică.

Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate în cursul cascadei de activare a

complementului, care prezintă receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile,

trombocite şi au efect proinflamator. Cea mai puternică dintre anafilatoxine este C5a.

Acţiunile anafilatoxinelor sunt de tipul:

·         contracţie a musculaturii netede,

·         creştere a permeabilităţii vasculare,

·         degranulare bazofilică şi mastocitară,

·         chemotactismul şi activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea

enzimelor litice şi a radicalilor liberi.

193

Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c şi C3d).

Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele

sistemului complement sunt prezentate în tabelul nr. 1.

15. 1. Calea clasicăActivarea sistemului complement

Componentele C' se găsesc în ser, în stare inactivă. Pentru a declanşa activarea lor este

necesar un stimul. Pentru calea clasică, punctul de pornire este reprezentat de către

complexele antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4)

sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunzând subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3.

Complementul poate fi activat de o singură moleculă de IgM sau de către două molecule de

IgG apropiate una de alta. Activarea este posibilă şi în cazul unor molecule de IgG agregate.

În mod asemănător, calea clasică poate fi activată şi de către unele microorganisme

sau diferite substanţe chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria

spp.), retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparină-protamină etc.

În cursul activării intervin următoarele proteine:

C1. În sângele circulant există un complex plurimolecular ce conţine o moleculă de C1q

(moleculă ce aparţine familiei colectinelor, precum MBL), două molecule de C1r şi două

molecule de C1s, situate în jurul ionilor de calciu şi asociate inhibitorului C1, denumit C1inh.

La persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activează cronic în mod

spontan, provocând episoade severe şi recurente de edem – edem angioneurotic.

Compusul C1q, cu o greutate moleculară de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet

de 6 lalele. Fiecare „floare” este la rândul său compusă din 3 lanţuri de proteine alipite şi

terminate în mod globular. Fixarea C1q prin mai puţin de două părţi globulare periferice pe

fragmentele Fc ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din

complexul plurimolecular. Acest fenomen antrenează pe de altă parte autoactivarea

moleculelor C1r şi C1s. Componenta C1s are o activitate serinesterazică, prin care poate să

cliveze următoarele 2 componente: C4 şi C2.

C4 este fragmentat în C4a, moleculă mică, cu activitate anafilactoidă şi respectiv C4b,

de dimensiuni mai mari, care se leagă printr-o legătură covalentă fie de fragmentul Fab al

anticorpului fie la nivelul peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (străine, proprii

modificate, infectate etc). Ansamblul formează complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b.

C2. Aceeaşi esterază (C1s) împreună cu fragmentul C4b, clivează o moleculă de C2 în

C2b (o moleculă mică, cu activitate de tip kinină) şi în C2a (molecula de dimensiune mai

mare, care se leagă de structura ţintă). Ansamblul necesită prezenţa Mg2+şi formează C3

convertaza căii clasice sau C4b2a. În acest moment, anticorpii şi respectiv componenta C1

pot să se detaşeze de structura ţintă, iar procesul poate continua.

C3 este clivată în C3a şi C3b de către C4b2a. C3a este o moleculă mai mică şi are, în

mod primordial, o activitate anafilactoidă şi chimiotactică, în timp ce subcomponenta C3b

se fixează pe structura ţintă datorită unei punţi realizate între un radical tioester şi o

grupare (-OH) sau (-NH2) de pe suprafaţa celulară acceptoare. Pe de altă parte, C3b poate fi

inactivat de factorul I (rezultând C3bi), iar apoi clivat într-o moleculă mare C3c (liberă) şi o

194

moleculă C3dg restantă pe structura ţintă, care poate apoi să se transforme în C3d. C3b

format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasică. (Figura nr. 1)

Calea clasică de activare a complementului poate fi amplificată foarte mult. Fiecare

complex antigen-anticorp leagă o moleculă de C1, iar C1s în stare activă clivează până la

100 molecule de C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataşază complexelor

antigen-anticorp. C3 convertaza căii clasice clivează mii de molecule de C3. Aceste lucru

dovedeşte imensa capacitate de amplificare a acestui lanţ de reacţii biochimice.

15. 2. Calea alternă şi calea de amplificare

Calea alternă constituie una dintre primele linii de apărare a organismului față de un

agent patogen, înaintea constituirii răspunsului imun.

Această cale poate fi activată de către diferite microorganisme, de componente ale

acestora, de numeroase substanţe neimune, spre exemplu:

·         bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative,

virusuri (dar şi celule infectate sau transformate de către virusuri), fungi (ex. Candida

albicans), paraziţi (ex. Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi),

·         endotoxine bacteriene,

·         alte substanţe (insulină, hemoglobină, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri,

unele substanțe de contrast utilizate în radiologie, venin de viperă sau veninul altor şerpi

etc.).

Calea alternă poate fi activată de complexele imune care cuprind IgG sau IgA.

Printre componentele căii alterne se numără:

C3. În plasmă, prin proteoliza spontană a C3, sunt formate în permanenţă mici cantităţi

de C3b. Moleculele de C3b se fixează de suprafeţele acceptoare, în particular de peretele

microorganismelor sau de celulele infectate şi alterate. Câteva bacterii, a căror structură

este bogată în acid sialic, pot evita acţiunea sistemului complement. La rândul său, C3b

acţionează asupra factorului B.

Factorul B. Element al căii de amplificare, factorul B este clivat în Ba şi Bb. Complexul

C3bBb, format în prezenţa ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativă, care

clivează noile molecule de C3 în C3b. Acest clivaj accelerat de C3, dă naştere C5-

convertazei (C3bBb)n.

Factorul D, factor prezent sub formă activă în ser înainte de activarea C’, clivează

factorul B, ceea ce facilitează formarea complexului C3bBb.

Ansamblul factorilor activatori ai căii clasice şi alternative realizează o buclă de

amplificare, care permite transformarea numeroaselor molecule de C3 în C3b astfel încât

C3b să acopere (opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)

15. 3. Calea finală comună

195

Calea finală comună mai este numită şi calea efectoare sau calea litică. Activarea

începe de la C5-convertaza căii clasice (C4b2a-C3b)n şi respectiv de la (C3bBb)n în cadrul

căii alternative.

Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al

membranei (Membrane Attack Complex), MAC):

C5. Convertazele-C5 pentru calea clasică şi respectiv pentru calea alternă clivează C5

în C5a, molecula mică, liberă şi C5b, molecula mare care se fixează pe structura ţintă. Atât

C5a, cât şi molecula care rezultă în urma transformării sale în C5-dezarginină, acţionează la

nivelul receptorului C5a-R al mastocitelor şi bazofilelor.

C6, C7, C8. C5b antrenează legătura dintre C6 şi C7, formând un complex C5b67 notat

prescurtat C5b7. Complexele C5b7 se leagă de o moleculă de C8 care se implantează în

membrană apoi mai multe molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m.

C9. Această proteină are două proprietăţi: 1. de a se insera la nivel membranar, graţie

unei feţe hidrofobe; 2. de a polimeriza, formând astfel peretele unei soluţii de continuitate

de circa 10 nm în diametru la nivelul membranelor celulelor ţintă (limfocitul T utilizează o

substanţă numită perforină, cu efect asemănător cu cel produs de C9). Formarea sau

fixarea complexului C5b9 în cantităţi sublitice la suprafaţa celulelor antrenează sinteza şi

eliberarea mediatorilor inflamaţiei (leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3)

Există o serie de mecanisme de reglare a activităţii sistemului complement, acestea

fiind mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat în cursul cascadei de

activare, având capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2)

În general, aceste proteine inhibă formarea C3 convertazei sau promovează disocierea

ei (când aceasta deja s-a format).Decay Accelerating Factor (DAF) – „Factorul de accelerare

a disocierii C3 convertazei” este o proteină care poate dezactiva C3 convertaza căii clasice,

dar are şi rolul de a inhiba formarea ei, nepermiţând elementelor C2a şi C4b să

interacţioneze. Împreună cu CR1 (complement receptor 1), DAF competiţionează cu factorul

B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei căii alterne. Acest

complex DAF-CR1 poate să disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza căii

alterne.

Factorul H are acţiune similară.

Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte şi Factorul I, o protează din plasmă

care clivează C3b în mai multe situsuri, inactivându-l. Iniţial rezultă C3bi, apoi C3c şi C3dg

(fragment ce rămâne ataşat membranei celulare).

Properdina (factorul P), în contrast cu toţi compuşii enumeraţi anterior, intervine în

reglarea sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei căii alterne. Deficienţele

de properdină au fost asociate cu creşterea susceptibilităţii faţă de infecţiile provocate

de Neisseria spp.

15. 4. Receptorii pentru complement (CR)

Cei mai importanţi receptori recunosc C3b sau derivaţii săi C3bi şi C3d.196

CR1 (CD35) sau receptorul pentru C3b

CR1 sau receptorul pentru C3b şi C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile,

eozinofile, monocite şi macrofage, limfocite B şi T4 precum şi la nivelul podocitelor

glomerulare. Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul

globulelor roşii spre macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de altă parte, fenomenul

de aderenţă imună realizat prin intermediul macrofagelor de particulele încărcate cu C3b,

permite fagocitoza complexelor şi eliminarea lor. Dacă sunt prezenţi şi anticorpii, această

acţiune este decuplată, graţie acţiunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menţionat

că CR1, prezent pe celulele dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului

situat în cadrul complexului imun acoperit de componente ale complementului.

CR1 acţionează drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin

în reglarea acţiunii complementului. (2)

Variaţiile expresiei genetice a CR1 se corelează direct cu apariţia lupsului eritematos şi

formelor severe de malarie. În prezent este speculat scopul terapeutic pe care îl are CR1

solubil. (3)

CR2 (CD21) sau receptorul pentru C3d

Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare

dendritice şi pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antrenează stimularea şi proliferarea

limfocitelor B prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite

prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel

faringian şi respectiv infectarea ulterioară a limfocitelor de către virusul Epstein-Barr se

realizează prin intermediul acestui receptor.

CR2 este implicat direct în inducerea răspunsului imun umoral primar.

CR3 (CD11b/CD18) sau receptorul pentru C3bi

CR3 sau receptorul C3bi se găseşte pe monocite, macrofage, neutrofile şi pe celulele

foliculare dendritice. El permite fenomenele de aderenţă imună precum şi fagocitoza

particulelor acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody

dependent cell-mediated cytotoxicity).

CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice.

Are un rol important în stabilirea adeziunii dintre leucocite şi endoteliu, fiind presuspus

faptul că CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula

endotelială. (4)

CR3aR, C4a, C5a, C1q, HR

Există, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) şi C5a

(C5aR) la nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor şi trombocitelor.

Aceşti receptori activaţi antrenează fenomene inflamatorii, activând aceste celule şi

permiţând eliberarea substanţelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul

pentru C1q (C1qR) precum şi receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza

particulelor opsonizate.

197

15. 5. Rolul biologic al sistemului complement

Sistemul complement prezintă numeroase activităţi biologice:

15. 5. 1. În inflamaţie sunt implicaţi diferiţi compuşi solubili de talie mică. C3a şi C4a

au o masă moleculară apropiată de 10.000 Da şi sunt numite anafilatoxine. Ele pot să se

fixeze pe bazofile şi pe mastocite atrăgând eliberarea de histamină precum şi vasodilataţie,

unul dintre primele elemente ale răspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabilă să

crească permeabilitatea vasculară. C5a posedă o activitate chimiotactică pozitivă faţă de

neutrofile şi conduce la agregarea polinuclearelor, în urma activării complementului.

Complexul C5b7 fixat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea acţiune

chimiotactică pentru polinucleare.

15. 5. 2. În apărarea anti-infecţioasă. Agenţii infecţioşi extracelulari pot fi acoperiţi de

componente ale sistemului complement fie în urma activării directe (calea alternativă

activând direct C3), fie prin intermediul anticorpilor care fixează complementul. În final,

complexele de atac ale membranei (componentele C5-C9) lizează diferite microorganisme:

bacterii, virusuri sau paraziţi. Aceasta reprezintă o activitate citolitică directă a

complementului cu sau fără prezenţa anticorpilor.

Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot fi acoperiţi de C3b sau C3bi care

sunt recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare

esenţiale: neutrofile şi macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele.

Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului:

ex. prezenţa unei capsule care împiedică activarea căii alternative (S. pneumoniae,

Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substanţe care fixează C3b sau antrenează o

rezistenţă la inserţia complexului de atac al membranei.

15. 5. 3. În metabolismul complexelor imune. Curăţarea (clearance-ul) complexelor

imune este facilitată în mare măsură de către sistemul complement. Simpla fixare a

complementului inhibă formarea complexelor imune de talie mare (calea clasică) şi le

solubilizează. Totuşi complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi

pot fi transportate până la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are

proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Această proprietate stă la baza

diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante.

15. 5. 4. În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d

sau C3dg (CR2).

15. 5. 5. În inducerea secreţiei de citokine de către monocite şi macrofage prin

intermediul receptorilor C3. (5)

Sistemul C' poate acţiona în sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurcă,

cobai se poate folosi în reacţii de diagnostic în microbiologia medicală, sistemul indicator

provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) şi din această cauză a fost şi este încă

folosit în foarte multe situaţii. Trebuie însă reţinut faptul că sistemul C' se degradează rapid

198

la temperaturi mai mari de 56ºC şi din această cauză reactivii care conţin C' trebuie

menţinuţi la rece (0ºC) inclusiv pe timpul transportului.

15. 6. Povestiri adevărate15. 6. 1. Infecție gravă cu SGB în cazul deficitului de complement

Streptococii de grup B (Streptococcus agalactiae) reprezintă o cauză frecventă a

infecţiilor grave la nou-născuţi şi copiii mici. Prognosticul cel mai nefavorabil îl au sepsisul şi

infecţiile localizate la nivelul sistemului nervos central. În special în sepsis, dar şi în cazul

meningitelor, evoluţia poate fi către şoc şi insuficienţă multiplă de organ (eliberarea

sistemică a TNF-α, de către monocite şi macrofage este corelată cu gravitatea şi riscul

evoluţiei către deces). Gravitatea infecţiilor este însă dependentă şi de imaturitatea

mecanismelor de apărare la vârste mici. Se poate constata o insuficientă producţie de PMN

neutrofile, o activitate mai scăzută a sistemului complement, un procent mai însemnat de

limfocite T „naive”.

Deşi sinteza elementelor care formează sistemul complement începe relativ repede, în

perioada fetală (între săptămânile 6 - 14 de viaţă intrauterină), concentraţia acestora la

naştere nu depăşeşte jumătate din cea de la adult.

Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezintă o etapă

esenţială în cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement

reprezintă „punctul de convergenţă” între calea clasică şi calea alternativă (alternă). C3

favorizează fagocitoza prin structuri care se ataşează suprafeţei bacteriene şi sunt

recunoscute de anumiţi receptori. Pe suprafaţa neutrofilelor sunt expuşi receptorii CR1

(CD35) - care se leagă de componenta C3b. Neutrofilele prezintă şi receptori CR3.

Comparativ cu configuraţia receptorilor la adult, neutrofilele nou-născuţilor sunt deficitare

în exprimarea CR3.

Un studiu recent a demonstrat că blocarea (la adult) receptorilor CR3 împiedică buna

desfăşurare a proceselor de opsonizare şi fagocitoză. Acelaşi studiu a emis ipoteza că

depozitarea unor anumiţi compuşi de clivare ai C3 pe suprafaţa streptococului de grup B ar

fi un factor important în apărarea gazdei împotriva agravării infecţiei.

Alte experimente au arătat că la şoriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF-α indusă de

streptococ este semnificativ redusă. În concluzie, calea alternă a complementului şi factorul

C3 ar putea reprezenta cheia eliberării de TNF-α. Abilitatea streptococului de grup B de a

activa sistemul complement a fost demonstrată în vitro.

Deşi se ştie că nou-născuţii prezintă concentraţii relativ mici ale complementului, în

mod aparent calea alternă este suficient de activă încât să amplifice eliberarea de TNF-α în

cazul infecţiilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au

certificat creşterea marcată a eliberării TNF-α de către monocitele nou-născuţilor.

Având în vedere că eliberarea de TNF-α ca răspuns la infecţiile grave cu streptococ de

grup B pare să aibă o strânsă legătură cu fiziopatologia acestor infecţii, se consideră că

terapia adjuvantă imunomodulatoare administrată cu scopul de a reduce activitatea pro-

199

inflamatorie a streptococului ar putea fi eficientă. O astfel de terapie ar include şi

modularea căii alterne a complementului.

15. 6. 2. Consecințe ale deficitului de properdină

Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul

imunităţii nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu

deficienţe ale acestor compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de

hipersensibilitate.

Un subiect îndelung studiat îl reprezintă deficitul de properdină şi predispoziţia

persoanelor care posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria.

Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului,

singura care reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii

alterne. Concentraţia serică fiziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, fiind un amestec

de monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri în raport de 1:2:1.

În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în

asociere cu o infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această

problemă, s-a ajuns la concluzia că există 3 tipuri diferite de deficit de properdină

(observate clinic la indivizi diferiţi). Primul tip se caracterizează prin absenţa proteinei în

plasmă. Cel de-al doilea se manifestă printr-un titru foarte scăzut al properdinei, iar cel de-

al treile tip presupune o concentraţie serică normală, dar o variantă nefuncţională a

proteinei.

Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte dificil de făcut. Pe lângă

testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al

pacientului şi al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de

properdină este rar întâlnit, însă prezent în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în

cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o altă populaţie. Formele de deficit

de properdină sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoaşte deja, în toate trei

tipurile bolii, care sunt mutaţiile ce survin şi unde sunt acestea localizate.

Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în

toate tipurile deficitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii

sunt W-135 şi Y, mai puţin serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a

dezvoltat metode mai eficiente de apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu deficit

de properdină au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecţie meningocociă

decât restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală, şansele cele mai mari de a

face infecţie cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdină,

vârful riscului dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de

cazuri este de până la 75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt

ce atestă că probabil apărarea umorală devine mai eficientă la aceste persoane.

Pacienţii cu deficit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent

antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul

generând anticorpi anticapsulari ce devin eficienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea

bună este că nu la toţi pacienţii la care este detectat deficitul de properdină se dezvoltă

infecţii meningococice. Acest lucru a sugerat că există şi alţi factori adiţionali care

200

favorizează predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la o parte dintre

indivizii cu deficit de properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă

aminoacidică de pe lanţul g al moleculei de IgG2 specifică fiecărui individ). Se speculează

că această combinaţie: deficit de properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei

relevant care explică de ce indivizii afectaţi prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii

de infecţii meningococice.

15. 7. Verificați-vă cunoștințeleUrmatoarele întrebări au un singur răspuns corect.

1. C3 convertaza:

A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anafilactoidă

B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi

funcţie

C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b

D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack

Complex)

E. nici un răspuns nu este corect.

2. Afirmaţia adevărată este:

A. sistemul complement este una dintre componentele implicate în apărarea nespecifică

B. nu există nici o bacterie care să poată scăpa de acţiunea sistemului complement,

întrucât toate bacteriile reprezintă structuri non-self care generează un răspuns imun

C. calea clasică de activare a complementului presupune interacţiunea componentei C1q cu

paratopii (Fab) anticorpilor din complexele antigen-anticorp

D. componentele sistemului complement se găsesc permanent în ser în stare activă,

pregătite pentru a interveni ori de câte ori apare un agent patogen

E. răspunsurile de la punctele A și C sunt adevărate.

3. Receptorii pentru complement:

A. sunt proteine circulante în ser care se pot combina cu structurile complementului pentru

a fi transportate către splină

B. se găsesc pe toate celulele din organism

C. sunt proteine prezente în membrana celulelor imunitare care intervin în multiple roluri

ale sistemului complement (cum ar fi transportul eritrocitelor senescente către splină sau

ficat)

D. sunt doar de două tipuri şi prin intermediul lor, moleculele de C3b pot opsoniza celula

ţintă

E. nici un răspuns nu este corect.

201

4. Calea comună de activare a sistemului complement:

A. are ca rezultat formarea C3 convertazei

B. poate fi inhibată de către properdină

C. este amplificată sub acţiunea DAF (Decay Accelerating Factor)

D. debutează prin scindarea componentei C5 sub acţiunea C5 convertazei

E. toate răspunsurile sunt corecte.

5. Care dintre componente activează cel mai uşor calea clasică?

A. complexele antigen-anticorp

B. bacteriile care au un conţinut bogat în manoză la nivelul peretelui celular

C. bacteriile încapsulate

D. celulele tumorale

E. sunt corecte răspunsurile A și D.

16. AntigeneleAntigenul se defineşte drept o substanţă recunoscută specific de către sistemul imun.

Alţi autori consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun

(imunogenicitate) şi să fie recunoscută de către sistemul imun (specificitate). Răspunsul

imun (RI) tinde să neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat.

Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt definite drept substanţe imunogene.

Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot

declanşa activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene

numai dacă se combină cu macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen

incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic

rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o haptenă. Pot apărea reacţii de

hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură şi numai în

condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică

de codificare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel

RI.

Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat

activ, imediat.

Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt

imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva

microorganismelor sunt diferite dar pot fi deduse în funcţie de structura şi caracterele de

patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstrează

202

faptul că între capitole diferite există legături importante, iar noțiunile citite și

înțelese ”la timpul lor” pot fi foarte utile, ulterior.

Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip

micobacterian și spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate

fără invazivitate și invazivitate fără toxicitate). (Figura nr. 1)

Recunoaşterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun,

preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de

peptide antigenice diferite şi nu sunt specifice unui antigen în mod particular.

Moleculele simple precum apa, sărurile minerale şi ureea sau comune majorităţii

speciilor (ca acizii graşi, creatinina, mono- şi dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de

altă parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariţia

hipersensibilității, sau medicamentele, pot deveni antigene după ce se asociază cu diferite

macromolecule.

16. 1. Clasificarea antigenelor16. 1. 1. În relaţie cu subiectul în care are loc RI

Heteroantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat,

provenite de la o altă specie. Imunizarea este cu atât mai uşor de obţinut cu cât între specii

diferenţele sunt mai mari şi îndepărtarea filogenetică este mai importantă. Termenul izotip

indică un caracter comun tuturor indivizilor unei specii, şi, în acelaşi timp, corespunde

unuixenoantigen pentru celelalte specii.

Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt

obţinuţi prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip.

Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la

animalul imunizat sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune. În mod normal, un

individ nu declanşează un răspuns imun împotriva structurilor proprii. Un răspuns autoimun

se poate obţine prin imunizarea animalului cu substanţe proprii împreună cu adjuvanţi sau

prin injectarea unor substanţe self uşor alterate.

Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau

anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat.

16. 1. 2. În relaţie cu tipul de răspuns imun

Antigenele timodependente

Răspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal

timectomizat în timpul vieţii intrauterine sau la naştere, la şoarecele nud, timectomizat sau

203

la un subiect cu maladia di George, caracterizată prin absenţa congenitală a timusului.

Antigenele timodependente sunt în general de natură proteică dar pot fi şi de natură

glucidică. Ele induc un răspuns primar iniţial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un

răspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obţinerea sa, sunt necesare 3 celule

(o celulă prezentatoare de antigen, un limfocit T helper şi un limfocit B) sau 2 celule (atunci

când LB joacă şi rolul de APC).

Antigenele timoindependente

Producerea de anticorpi faţă de antigenele timoindependente nu necesită prezenţa LT.

Antigenele sunt în general glucide cu determinanţi antigenici repetitivi, cu o metabolizare şi

o rată de degradare lentă.Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care

au aceeaşi structură glucidică repetitivă dispusă de-a lungul peretelui celular. flagelina,

antigen proteic cu determinanţi antigenici repetitivi, face parte din antigenele

timoindependente.

16. 1. 3. În funcţie de repartiţia antigenelor în natură

Existenţa anticorpilor „naturali” şi a celor apăruţi în urma unui răspuns imun face

necesară divizarea antigenelor în două categorii:

Antigene ubicuitare: Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg răspândite în

natură. Prezenţa lor în bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare în primele luni de

viaţă. Răspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A şi anti-B sunt

din clasa IgM, uşor adsorbabili de substanţele A sau B salivare. Aceşti anticorpi, consideraţi

alloanticorpi în cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi.

Antigene restrânse: Unele antigene sunt limitate la o singură specie şi la un singur tip

celular (un exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii apăruţi în urma răspunsului

imun nu apar decât după contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, după o

transfuzie sau după pasajul hematiilor fetale în sângele femeii gravide.

16. 1. 4. În funcţie de natura chimică

Polizaharidele ca şi partea glucidică a glicoproteinelor sunt în general antigene.

Exemplele cele mai cunoscute sunt antigenele care definesc grupele sanguine (la acestea,

specificitatea este dată de diferitele zaharuri) şi antigenele clasice ale diferitelor

microorganisme.

Antigenele lipidice îşi datorează antigenicitatea cuplării cu părţi glucidice sau proteice,

aşa cum este cardiolipina, extrasă din mitocondrii, faţă de care apare reacţia imună în

sifilis.

204

Atunci când au o greutate moleculară mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau

proteinele devin antigene şi imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina

(greutate moleculară 1.000, cu doar 9 aminoacizi).

Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene şi imunogene.

Lipidele cuplate cu zaharuri formează lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de

ex. în peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio

spp., Brucella spp. etc).

Obţinerea de anticorpi anti-acizi nucleici după imunizarea unui animal este dificilă. În

unele afecţiuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observă diferite tipuri

de anticorpi anti-acizi nucleici.

Compuşii sintetici cu structura cea mai variată pot fi antigene dacă greutatea lor

moleculară este suficient de mare sau dacă sunt legaţi de proteine purtătoare („carrier”).

Compuşii sintetici au importanţă în determinarea imunogenicităţii şi specificităţii

antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de

reacţia „alergică” din patologia umană (ex. hipersensibilitatea de tip I faţă de beta-

lactamine).

Superantigenele sunt molecule care se leagă în exteriorul moleculelor MHC II şi de o

secvenţă peptidică din familia TCR; aceste molecule, fără a fi recunoscute specific,

acţionează pe numeroase clone celulare T cu structură comună. Această proprietate a fost

observată la enterotoxinele stafilococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consideră

că superantigenele pot avea un rol în inducerea bolilor autoimune.

16. 1. 5. În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac

În funcţie de potenţialul de a stimula RI şi de a reacţiona cu Ac formaţi în cadrul acestui

RI, antigenele pot fi:

- Ag complete (majoritatea) care pot declanşa RI şi pot reacţiona cu Ac apăruţi;

- Ag incomplete care nu pot declanşa RI dar pot reacţiona (in vitro) cu Ac; sunt de ex.

epitopi izolaţi, nelegaţi de grupări purtătoare (pot fi haptene).

16. 1. 6. În funcţie de specia microorganismului implicat

Antigenele bacteriene includ substanţe legate de corpul celular (proteina M a

streptococului beta-hemolitic de grup A, polizaharidul A de la stafilococul auriu, antigenul O

al bacteriilor Gram-negative, antigenul Vi de la Salmonella typhi, antigenele K şi de tip K de

la bacteriile capsulate, antigenele H ale bacteriilor ciliate) sau eliberate sub formă de

exotoxine sau enzime extracelulare (bacil difteric sau streptococ beta-hemolitic de grup A

205

dacă sunt lizogenizaţi, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella

shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi și capitolele 2 și 9)

Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din învelişul extern (ex.

hemaglutinine) sau constituie proteine şi glicoproteine structurale.

Antigenele parazitare au un caracter complex şi un aspect mozaicat, datorat de ex.

marii diversităţi a ciclurilor biologice parazitare. La o singură specie parazitară pot fi

evidenţiate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum).

Antigenele parazitare pot fi somatice şi metabolice.

16. 2. Proprietăţile antigenelor16. 2. 1. Specificitatea imunologică

Specificitatea unui antigen este proprietatea de a fi recunoscut prin RI pe care l-a

declanşat şi nu prin RI declanşat de alte antigene, diferite. Toate tehnicile imunologice se

bazează pe această proprietate fundamentală.

Reacţia încrucişată

Deşi specificitatea reacţiei imune este regula, există totuşi şi excepţii, reacţiile

încrucişate, atunci când 2 antigene de origine diferită reacţionează cu acelaşi anticorp

(datorită unei asemănări structurale).

Epitopul este o parte bine definită din structura antigenului, care intră în contact cu

situsul de combinare al anticorpului. Structura corespondentă sau receptorul de antigen al

imunoglobulinei se numeşte paratop.

Determinantul antigenic este un „punct cald” al antigenului, recunoscut în cadrul

diferitelor răspunsuri imune. El corespunde mai multor epitopi centraţi pe acelaşi loc. Într-

un Ag, determinanţii antigenici sunt situaţi frecvent la extremităţi sau în unghiurile

moleculei. Un Ag prezintă în general mai mulţi determinanţi antigenici, fie sub forma

aceleiaşi structuri glucidice repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite,

recunoscute de către sistemul imun.

Numărul determinanţilor antigenici care pot fi recunoscuţi de către sistemul imun

constituie repertoriul imun. Pe baza cunoştinţelor asupra structurii părţii variabile a

imunoglobulinelor, genomul uman codifică pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de

anticorpi diferiţi. În plus, mutaţiile frecvente în linia B aduc posibilităţi suplimentare, lărgind

repertoriul imun. Acelaşi Ac poate recunoaşte mai mulţi determinanţi antigenici diferiţi, cu

afinităţi variabile.

Pe de altă parte, o moleculă de antigen are mai mulţi epitopi (10-20), valenţa

antigenului fiind dată tocmai de numărul acestora (de ex. dacă există 16 epitopi, valenţa

este 16 şi ar putea fixa 8 molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu câte 2 situsuri

combinative). Fiecare epitop este recunoscut şi declanşează un RI şi sinteza de anticorpi

care îl recunosc doar pe el.

206

16. 2. 2. ImunogenicitateaImunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau

celular.

O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artificială), incapabilă să inducă singură

un răspuns imun dar care poate fi recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul

a fost introdus de Landsteiner în 1930. Haptena are specificitate dar nu are

imunogenicitate. Termenul de haptenă nu este sinonim cu cel de determinant antigenic:

haptena poate fi mai mică, egală sau mai mare ca epitopul.

Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare

cu haptena face ca aceasta să devină imunogenă.

16. 2. 3. AlergenicitateaUnele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să

provoace o reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene

cunoscute sunt polenul, veninul de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau

produse de origine animală.

16. 2. 4. Asocierea cu factorii adjuvanţi

Un adjuvant poate creşte intensitatea răspunsului imun faţă de un antigen la care

acesta este asociat. Adjuvanţii pot fi utili atunci când antigenele sunt eliminate rapid şi nu

există timpul necesar pentru stimularea RI. Pentru ca Ag să persiste cât mai mult, ele sunt

asociate cu aceste substanţe numite generic adjuvanţi (ex. hidroxid de aluminiu,

saponină, adjuvant Freund etc).

16. 2. 5. Răspunsul la mitogenePe lângă răspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie

globală, stimulând diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observă frecvent în cursul infecţiilor

sau inoculării de lipopolizaharide enterobacteriene.

16. 2. 6. Alte efecte ”datorate” antigenelor

Pot apărea şi alte modificări în organismul gazdă, care ţin de răspunsul imun.

Persistenţa activării macrofagelor într-un focar poate determina formarea granuloamelor.

Acestea sunt formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii și

antigene fagocitate sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite și ”celule

epitelioide” (formate din fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferică de celule T,

207

neutrofile și celule dendritice printre fibrele de colagen. Ȋn cazul tuberculozei (TB) centrul

granulomului este reprezentat de cazeum. În cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu

SIDA sau cu alte stări de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi

afectat, infecţia nu trece în stadiu latent ci rămâne activă. Un alt argument poate fi

reprezentat de următoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocanți ai TNF (de

exemplu, ca tratament simptomatic în artrita reumatoidă) reactivează rapid tuberculoza.

Răspunsul organismului la agresiunea bacteriană se poate solda și cu alte afectări și

chiar distrugeri la nivel tisular, şoc toxico-septic sau reacții de tip Schwartzman. Şocul

toxico septic este provocat de o producere excesivă de citokine în cursul sepsisului, în

special în infecțiile cu germeni Gram negativi și respectiv cu eliminare importantă de LPZ.

Apar febră înaltă, colaps circulator, CID (coagulare intravasculară diseminată), necroză

hemoragică și eventual afectare multiplă de organ (MOF -multiple organ failure). În mod

paradoxal, pacienţii care îşi revin după acest tip de şoc pot dezvolta ”paralizie imună”, fiind

susceptibili unei infecţii secundare.

Reacția Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate să apară experimental atunci

cȃnd, injectând subcutanat o doză mică de endotoxină, rezultă inflamaţie uşoară; ulterior,

la injectarea intravenoasă după 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamată devine

hemoragică în cȃteva ore. Această reacție poate apărea după infecții cu bacterii Gram

negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc.

O a doua injectare după încă 24 de ore de la prima injectare intravenoasă a

endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator şi necroză bilaterală a cortexului

renal. Mai pot apărea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului

digestiv, tromboze și CID. La nivel microscopic apar modificări endoteliale, depozite de

fibrină, acumulare de neutrofile și degranularea acestora. Titrul interferonului se corelează

cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se corelează cu manifestările sistemice. Aceasta

reacţie Schwartzman ar putea să se afle la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita

meningococică sau a şocului septico-toxic.

Organismul uman reușește, de obicei, să mențină o balanţă și nu apar agresiuni (auto-

agresiuni) evidente în cursul infecțiilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare

sunt IL-10 si TGFβ. Există și bacterii care profită tocmai de această balanţă a organismului.

Hemaglutinina şi adenilat ciclaza (factori de virulenţă ai B. pertussis) favorizează secreţia

de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistenţa bacteriene în organism prin inhibarea

TH1. O perturbare a acestei balanţe o poate determina omul prin tratament antibiotic

(auto-administrat sau nu) soldat cu distrugerea masivă a bacteriilor. Poate rezulta un

răspuns inflamator sever cu distrugeri tisulare.

16. 3. Factorii de care depinde imunogenitatea

1. Structura chimică trebuie să fie cât mai diferită (provenind de la o specie cât mai

îndepărtată) faţă de structurile proprii [noţiunea de „structură străină” este de fapt o

noţiune chimică; modificarea unui singur aminoacid din structura primară a unei molecule 208

proteice va fi „sesizată” ca atare şi va duce la un RI, ca şi cum ar fi vorba de o structură

„nouă” (diferită, străină, modificată)]; cu cât structura chimică antigenică provine de la o

specie mai îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai puternic;

2. Structura trebuie să aibă un grad de „rigiditate” (să se menţină ca atare);

3. Structura trebuie să persiste suficient de mult în organism (în cazul în care respectiva

structură este rapid epurată, nu va duce la apariţia unui RI); în acest sens pot fi date ca

exemplu anumite structuri antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor

îmbolnăviri (vaccinuri), dar care nu persistă suficient de mult în organismul gazdă, motiv

pentru care au fost asociate cu substanţe adjuvante (sărurile de aluminiu au fost folosite în

calitate de adjuvanţi pentru prima dată în 1950, în vaccinul Salk; diferite substanţe

adjuvante sunt utilizate în vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus

influenzae tip b etc);

4. Greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-5.000 Da);

antigenele cu moleculă mică pot stimula răspunsul imun după cuplarea cu o „proteină

carrier”;

5. Structura chimică trebuie să fie cât mai complexă (cele mai imunogene sunt

proteinele iar cele mai puţin imunogene sunt lipidele şi acizii nucleici);

6. Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrării antigenului etc. sunt

alţi factori de care depinde imunogenitatea.

Toţi aceşti factori sunt valabili „în contextul CMH al gazdei” care urmează să

reacţioneze faţă de respectivul antigen.

16. 4. Povestiri adevărate16.4.1. Antigene ... reacții ... apărare ...

Dar care ar fiutilitatea clasificării antigenelor? Diferite categorii de antigene vor ”dirija”

diferit răspunsul imun şi vor încearca să îl ”păcălească”, fiecare in stil propriu.

Prima linie de apărare a organismului este reprezentată de piele şi mucoase, de acizii

graşi secretaţi la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de mişcările cililor

traheali, de fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot

limita invazia bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine.

A doua linie de apărare este reprezentată de răspunsul imun înnăscut (innate), fără

intervenţia LT sau LB. Acțiunea este îndreptată împotriva aşa-ziselor Ag microbiene

comune, reunite sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) şi

cuprinde molecule ce în literatura anglo-saxonă sunt grupate sub denumirea de „patern

recognition molecules” (ex: colectine, ficoline, TLR-Toll like receptor, receptorul manozei,

proteinele NOD, proteina A din surfactantul pulmonar, complementul, PCR - proteina C

reactivă). Spre exemplu, LPZ-ul bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai

importanți reprezentanți ai PAMPs. LPZ se cuplează cu TLR4, activȃnd astfel raspunsul

imun, cu stimularea secreției de TNF alfa, Il-1, creşterea adezivităţii celulare, secreţia de

peptide şi amine vasoactive și scăderea consecutivă a tensiunii arteriale. Bacteriile Gram

pozitive posedă acid lipotechoic şi peptidoglicani (polizaharidele nu au suficient potenţial

209

imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. Ȋn recunoaşterea

lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor şi spirochetelor intervin LBP și TLR4. TLR4

se mai numește şi CD14. 

Cum se prezintă aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la

suprafaţa celulelor organismului (in special de la nivelul porţilor de intrare) și sunt

îndreptate împotriva patogenilor extracelulari. Dar există și molecule pentru patogenii care

au pătruns în celulă, care se află nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor

(TLR 9) sau solubili în citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori şi Salmonella

spp. generează PAMPs intracelulare. (Film nr. 1)

 

http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0

 

16.4.2. Răspuns imun nespecific ... specific ...

 Răspunsul nespecific presupune:

-activarea complementului pe calea alternativă (bacteriile Gram negative sunt

succeptibile la liza iniţiată de complexul C5b-9)

-eliberarea de citokine proinflamatorii, care cresc proprietăţiile adezive ale sistemului

endotelial (C5a, eliberat în cadrul formării complexului litic, funcţionează pe post de

chemoatractant pentru neutrofile şi mastocite), şi leucotriene care vor crește

permeabilitatea. Macrofagele eliberează TNF și Il-1, care împreună cu chemokinele CCL2,

CCL3 şi CXCL8 direcţionează recrutarea de populaţii leucocitare. TNF, IL-1 și IL-6 iniţiază

răspunsul inflamator acut și cresc producţia de componente ale complementului. PCR

opsonizează bacteriile favorizând fagocitoza acestora. IL-12 și IL-18 stimulează NK sa

produca IFN gama, care va activa macrofagele)

-generează semnale care influențează si răspunsul imun specific (Celulele dendritice

joacă un rol crucial în activarea LT. Activarea acestora în periferie induce migrarea lor la

nivelul nodulilor limfatici, unde creşte exprimarea MHC, a moleculelor co-stimulatoare:

CD40, CD80, CD86 şi a citokinelor ce induc diferenţierea LT. Contactul PAMPs-TLR creşte

producţia locală de IFN gama, IL-12 și IL-18 care vor stimula diferenţierea LT, în special a

TH1)

 

Răspunsul specific se bazează pe activitatea LB şi a LT. Are loc un proces complex de

interacţii celulare cu rol de amplificare a semnalizării iniţiale și de evitare a răspunsului

imun la un semnal fals. LB au în principal rolul de a secreta Ac și de a păstra o memorie a

agresiunilor infecţioase. Anticorpii pot fi suficienţi numai dacă patogenitatea este indusă de

o singură toxină sau moleculă de adeziune iar Ac produşi sunt directionaţi împotriva acestei

molecule cu rol patogen. Anticorpii opsonizanţi sunt importanţi pentru rezistenţa împotriva

bacteriilor extracelulare.

Bacterile patogene pot eluda răspunsul în anticorpi, aşa cum se petrece în

cazul Neisseria gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta în mod repetat cu acest

microorganism, însă în sȃngele său să nu se găsească dovezi ale imunităţii protective. (Film

nr. 2)

210

 

http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM

 

16.4.3. Dar alte modalități de eludare a răspunsului imun?

 Antigenul O, avȃnd un lanţ polizaharidic lung, poate fixa complementul la distanţă de

bistratul lipidic, astfel încât acesta nu işi poate exercita acțiunea litică. E. coli, Salmonella

spp. și Pseudomonas aeruginosa fixează complementul dar îl ”taie” rapid de pe suprafaţa

celulară. Alte microorganisme exploatează mecanismele fiziologice ale organismului gazdă

pentru a ”păcăli” sistemul imun.

Cȃnd C3b s-a ataşat de o membrană celulară poate interacţiona cu factorul B, care va

amplifica activarea complementului sau poate interacţiona cu factorii H şi I, care vor inhiba

complementul. Prezenţa acidului sialic favorizează interacţia complementului cu factorii H şi

I iar celulele organismului uman reprezintă un mediu bogat în acid sialic. Prin acest mod se

apără Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar şi streptococii beta hemolitici de grup B.

Proteina M a steptococcilor de grup A funcţionează ca un acceptor al factorului H (să nu

uităm că acești streptococi posedă şi o genă ce codifică sinteza unei C5a proteaze).

16.4.4. Leucocite ... macrofage ... fagocitoză ...

Totuşi, împotriva majorităţii bacteriilor este neapărat nevoie de intervenţia fagocitelor.

Fagocitele elimină cea mai mare parte a bacteriilor prin chemotaxie, adeziune, internalizare

şi apoptoză. Activarea optimă a macrofagelor este dependentă de TH1 (CD4+).

Macrofagul este principala celulă prezentatoare de antigen, dar are şi rolul de a secreta

citokine, enzime, molecule ale complementului, are efect procoagulant, produce specii

reactive de oxigen şi NO care sunt foarte toxice, şi endocitează bacterii şi fungi. Rolul său în

ansamblu este de a iniţia, propaga, preveni, supresa şi finaliza răspunsul imun. Macrofagele

se dezvoltă din monocitele circulante (ca şi celulele dendritice mieloide şi osteoclastele) şi

pot exista sub formă ciculantă sau sub formă tisulară. Citokinele eliberate de TH1

stimulează inflamaţia şi activitatea antimicrobiană a macrofagelor, în timp ce citokinele

eliberate de TH2 induc o prezentare antigenică eficientă către LB. TGF beta, corticosteroizii

şi IL-10 induc un fenotip antiinflamator. Macrofagele internalizează patogenii, utilizȃnd o

varietate de receptori (receptorul pentru LPZ, TLR, beta-glucanR, manoseR, receptorii

pentru complement CR1, CR3, CR4). (Film nr. 3)

http://www.youtube.com/watch?v=CHrk0ofcLDo

 Ataşarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin

intermediul TLR, manose receptor (MR),scavenger receptors și dectin-1b sau indirect, după

opsonizarea bacteriei cu Ac, fibronectină, vitronectină sau complement, prin intermediul

CR1, CR3, CR4, MBL, integrine, FcγRI, FcγRII, FcγRIII.

Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) oferă o oarecare protecţie, însă

necesită intervenţia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase în focarul

inflamator de componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de

chemokine şi citokine sintetizate de macrofagele din ţesutul respectiv și de unele celulele

epiteliale. Streptococcus pyogenesva determina leziuni acute şi atragerea la nivelul

focarului infecţios în special a neutrofilelor, în timp ce Mycobacterium

211

tuberculosis determină leziuni cronice şi va atrage macrofage, LT şi celule multinucleate

derivate din macrofage.

După cum știți, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru

microorganism, dar şi pentru celulele organismului gazdă). O specie reactivă de oxigen se

formează în principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substanţă are adăugat un

electron, care o va face instabilă şi care va determina un şir de reacţii în lanţ în organism.

Studii recente pe neutrofile au demonstrat că speciile reactive de oxigen sunt bactericide şi

indirect (prin inducerea unui flux de K în fagozomi)activează producerea de proteaze.

NO se formează din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate fi indusă de IFNγ și

TNFα, NO fiind tot o specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului

superoxid.

Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile,

de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor

se inseră între lipidele membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va

duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus

aureus,Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina

G şi azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important

pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele îngreunȃnd accesul

microorganismelor la acest element. Ȋnsă, organismul gazdă are nevoie crescută de fier de

vreme ce este co-enzimă pentru generarea NO şi pentru lanţul respirator. E foarte

important de reţinut că neutrofilul are o viaţă scurtă dar este foarte agresiv cu bacteriile, în

timp ce macrofagul are o viață mai lungă, însă neactivat, este un ... prieten al

bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFNγ, iar acesta este

produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+).

Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria

monocytogenes, Shigella spp. şiBurkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug

membrana fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului

fago-lizozom.

 M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele

epiteliale, care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C.

neoformans au un înveliş protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii.

Stafilococii posedă catalază, care scade stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un

glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în general, eliberează

lipoarabinoman, care scade eficienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei

infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi

exercită corespunzător funcţia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza

celulei gazdă.

După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC.

Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fie legat de o

moleculă MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate

pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la

nivelul APC prin fagocitoză sau endocitoză, aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe 212

MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP,

HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o moleculă asemănătoare MHC I care prezintă antigene lipidice

(M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4)

http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY

16.4.5. Intervenția LT ...

LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă.

S-a demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din

partea LTc şi consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cuM. tuberculosis.

Tendinţele actuale sunt de a găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-

a mai observat că pe lȃngă dependenţa activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi

o dependență de activitatea litică a fagozomilor.

TCR (fie ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ.

Aceste 2 tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2

specii de receptori vor avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi

a timocitelor, iar TCR γδ la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De

aceea s-a ridicat ipoteza conform căreia LT în care predomină TCR γδ să nu aibă neaparat

nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ recunosc fosfoliganzi derivaţi

din M. tuberculosis care le determină activarea).

 Superantigenele activează direct LT, fără a mai fi nevoie de prezentarea lor de către un

APC pe un MHC. Stafilococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol

adaptativ. S-ar putea ca motivul să fie o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea

producerii de anticorpi. Certa e însă toxicitatea determinată de eliberarea masivă de

citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparţinȃnd stafilococcilor este un exemplu

de superantigen. Și proteina M a Streptococcus pyogenes formeză un complex cu

fibrinogenul, complex care se leagă de integrinele de pe neutrofile, determinȃnd eliberarea

în cantităţi mari a mediatorilor inflamatori. Dacă un antigen convenţional activează 0,01-

0,1% LT, superantigenele activează 5-30% din populaţia LT.

16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ...

Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în

2010 relevă o incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care

8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul

de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi,

precum fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1)

HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si

bacteriilor şi au fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei

acestora în condiţii de temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces

infecţios). HSP au rol în asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în

transportul altor molecule. Ȋn timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi

împotriva HSP, atȃt a celor autohtone, cȃt şi a celor bacteriene. HSP activează sistemul

imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 şi anumiţi TLR. Datorită asemănării structurale

între cele 2 tipuri de HSP se presupune că aceste proteine ar avea un rol important în

generarea bolilor autoimune.

213

Tot timpul ne aflăm sub influenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc

procese fiziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie

ne protejează de germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale.

Dar există şi ”teoria igieniei”, neconfirmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor

microorganismelor, conform căreia şi infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii

patogene este de folos. ”Alergiile” (stările de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale

intestinului subțire şi bolile autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de

igienă, vaccinuri și antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modalități clasice de

apărare împotriva infecțiilor, ci de a afla cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fiecare ”armă” şi

de a cunoaște cȃt mai bine adversarul împotriva căruia o folosim.

16.4.7. Şoc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ?

Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat

şi o durere surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui.

Ȋn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit

amoxicilină. S-a prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i

s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu

amoxicilină şi s-a recomandat prednison.

Este corectă atitudinea dermatologului?

Argumentaţi.

La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate,

dezorientare și durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să fi avut sȃngerări (melenă,

hemoptizie, hemoroizi). Examen și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min,

T:39,7°C, SO2=93%.

La examenul fizic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar,

fără exsudate sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufluri

supraadăugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În

tabel sunt listate determinările biochimice şi hematologice anormale (comparativ, valorile

normale). (Tabelul nr. 1)

Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu

explorările paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult

respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3)

La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică;

febra se menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei

datorită insuficienţei respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină,

exsudat faringian şi se face o puncție lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază

tratament cu clindamicină, vancomicină și meropenem iar pacienta este transferată în

serviciul de ATI.

Comentarii explicative

Ȋn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune

stabilirea diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii:

1)      Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge,

fluid cerebro-spinal, pleural, peritoneal)

214

2)      Hipotensiune

3)      2 sau mai multe dintre următoarele:

·         Insuficienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod

normal la pacienţii cu boală renală)

·         Coagulopatie

·         Enzime hepatice crescute

·         ARDS (adult respiratory distress syndrome)

·         Rash maculo-eritematos

·         Necroză de ţesut moale.

Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la

2% 1995-2001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că

favorizează TSS. Un articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS

folosiseră anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic.

Diferenţierea între TSS stafilococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție

stafilococică pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insuficienţa

conjunctivală, mialgie severă. Pacienţii cu infecție streptococă pot prezenta necroză de

ţesut moale (celulită, fasciită, abces, miozită), simptomatologie influenza-like, varicelă în

antecedente în cazul celor nevaccinaţi.

Ȋn cazul TSS stafilococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri.

Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt

responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea

determinării Ac anti TSST-1 este de 90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M

nu există teste fiabile. Se poate folosi în schimb titrarea ASLO în dinamică.

Ȋn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi:

·         cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea

TA şi a PVC

·         antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-

lactamine pentru streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru stafilococ;

clindamicina s-a introdus pentru că are un efect mai îndelungat după administrare,

facilitează fagocitoza bacteriei, inhibă liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutivă

suplimentară de citokine în circulaţie).

·         terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate

intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF.

Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul

Ac anti TSST-1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe

antibiotice orale, funcţia renală şi WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografii

toracice zilnice, care au confirmat şi rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externată după 14

zile de spitalizare.

Diagnosticul final: Şoc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.

16. 5. Verificați-vă cunoștințele215

La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.

1. Care dintre următoarele microorganisme au toxicitate dar nu şi invazivitate?

a) Klebsiella pneumoniae şi Vibrio cholerae

b) Corynebacterium diphteriae şi Vibrio cholerae

c) Escherichia coli şi Salmonella typhi

d) Corynebacterium diphteriae şi Mycobacterium tuberculosis

 

2. Care este răspunsul corect?

a) Administrarea îndelungată de antibiotice nu afectează flora intestinală.

b) Administrarea de antibiotice fără realizarea şi respectarea antibiogramei, fără a ţine

cont de CMI şi CMB nu determină fenomenul de rezistenţă la antibiotice.

c) Cȃnd flora normală este distrusă pot apărea infecţii cu Candida spp. sau Clostridium

difficile.

d) Este mai corect să administrăm probiotice (de exemplu lactobacilii) şi o doză foarte

mare de antibiotic în cazul unei infecţii localizate, decȃt să drenăm chirurgical respectivul

abces sau flegmon.

 

3. Ce este un granulom?

a) o marcă a RIC împotriva bacteriilor intracelulare

b) un tip de modificare anatomo-patologică acută

c) o marcă a RIU împotriva bacteriilor extracelulare

d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare.

 

4. Găsiţi afirmaţia greşită

a)Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot

declanşa activarea limfocitelor

b) Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat

activ, imediat.

c) Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T

sau anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat

d) Autoantigenele sunt substanţe diferite de antigenele proprii animalului imunizat,

provenite de la o altă specie.

 

5.Iată 3 afirmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai

îndepărtată filogenetic, cu atât RI va fi mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fie cât

mai simplă” și (3) „greutatea moleculară trebuie să fie cât mai mare (de regulă peste 4-

5.000 Da)”. Alegeţi varianta corectă dintre urmatoarele:

a) (1) și (3) sunt false

b) (1) și (2) sunt adevărate

c)   doar (3) este adevărată

d) doar (2) este falsă

216

17. Răspunsul imun umoral şi celular17. 1. Definiţia şi caracteristicile răspunsului imun

Răspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc după introducerea

unui Ag, și anume:

·         activarea limfocitelor,

·         eliberarea a diverse molecule,

·         multiplicarea celulelor specifice,

·         producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili să se fixeze pe Ag şi

să participe la

·         eliminarea acestuia (direct sau indirect).

După acest prim contact (ca şi în cursul imunizării consecutive), sistemul imun produce

limfocitele T şi B de memorie, capabile să reacţioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia

unei reintroduceri ulterioare a aceluiaşi antigen.

Aşa cum a fost menţionat anterior, principala caracteristică a imunităţii

este specificitatea. Pentru a sugera cât de specific este răspunsul imun, o modalitate este

de a discuta despre „potrivirea dintre cheie şi broască”, între structurile Ag şi Ac. Acest

exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet în comparaţie cu realitatea. O

altă modalitate de a sugera specificitatea răspunsului imun ar fi „potrivirea dintre mâna

aşezată în faţa oglinzii şi imaginea din oglindă”.

Probabil, o modalitate şi mai sugestivă ar fi cea discutată la cursurile de imunologie din

INCDMI ”Cantacuzino”: răspunsul imun este atât de specific, încât dacă ne-am închipui că

Ag este reprezentat de o pagină dintr-un manual, dacă am schimba nu o frază, un rând,

un cuvânt ci chiar o singură literă într-un cuvânt de pe o anumită pagină, această

schimbare ar fi sesizată de sistemul imun iar Ac produşi se vor „potrivi” cu această pagină

în care a fost schimbată o singură literă. Totuşi, aşa cum am menţionat la punctul 16. 2. 1.,

există şi reacţii încrucişate.

O altă caracteristică foarte importantă a RI, în condiţii fiziologice, este capacitatea de a

discerne între self şi non-self şi de a reacţiona numai faţă de moleculele care îndeplinesc

definiţia de antigen (vezi şi MHC/CMH).

Răspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat

de către celule. În cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se

dezvoltă un răspuns imun celular specific prin LT citotoxice şi unul umoral specific prin

anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri

217

de răspuns. În cazul antigenelor timoindependente, răspunsul imun este umoral. În

continuare vor fi prezentate în mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun umoral şi

celular.

17. 2. Răspunsul imun de tip umoral

Răspunsul imun umoral (RIU) constă în producerea de Ac specifici şi este transferabil

pentru o perioadă de timp (3-6 săptămâni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umorală

intervine în distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea

toxinelor.

Natura antigenelor faţă de care se dezvoltă un răspuns imun umoral include poliozide,

proteine, substanţe sintetice, rareori lipide şi acizi nucleici sau anticorpi (în cazul proceselor

autoimune). Unele antigene („alergenii”) determină un RI cu anticorpi de tip IgE.

Introducerea antigenului pe cale subcutană, intramuscular sau intravenos determină un

RIU cu producerea de IgM și/sau IgG iar administrarea pe cale orală determină un răspuns

preferenţial cu IgA.

După o primă administrare intravenoasă, la un subiect care nu a mai venit în contact

cu respectivul antigen, Ag molecular parcurge următoarele etape succesive:

1. descreşterea cantitativă rapidă, datorată difuziei în spaţiile extravasculare;

2. dispariţia lentă, datorată catabolismului propriu al antigenului;

3. descreşterea rapidă după 8-10 zile, ca urmare a eliminării formaţiunilor imune

(complexele imune) rapid fagocitate.

În cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub formă

de agregate, eliminarea este mult mai rapidă, prin procesul de fagocitoză (care antrenează

o imunizare mai precoce).

În cazul utilizării căii subcutanate, antigenul rămâne, în parte, la locul de inoculare.

Adăugarea unui adjuvant menţine antigenul în acest loc şi favorizează o stimulare

imunologică de durată (eventual şi formarea unui granulom inflamator). În următoarele ore,

antigenul migrează în sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunzători anatomic,

apoi în zona medulară şi în final (24 de ore) ajunge în regiunea corticală, la periferia

foliculilor primari. În interiorul organelor limfoide, antigenul se regăseşte în celulele

fagocitare. În prezenţa anticorpilor preformaţi şi a sistemului C', unele antigene se

localizează la suprafaţa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul

cu antigenul antrenează importante modificări histologice ale organelor limfoide: centri

germinativi se dezvoltă în foliculi şi persistă mai multe săptămâni; în paralel apar atât

imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de memorie; după 3-4 zile se pot detecta

limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi serici.17. 2. 1. Răspunsul imun primar (RIP)

218

Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de

acesta. Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag.

După primul contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:

·       Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor

Ag către LB (în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului,

calea de administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;

·       Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3

zile; în timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de

stagnare (câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;

·       Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.

De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac după 5-14 zile de la

stimulul antigenic primar.

Natura anticorpilor:

·         examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt

de tip IgM (cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce

nivelul IgM scade);

·         în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;

·         în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.17. 2. 2. Răspunsul imun secundar (RIS)Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după

contacte ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:

·         poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;

·         latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere

logaritmică;

·         anticorpii sunt de tip IgG;

·         titrul Ac produşi este mult mai înalt;

·         persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat,

luni de zile).

Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu

memorie. După eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie,

reacţia imună la al doilea contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria

imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifică.

Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:

·         face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi

·         permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).

Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem

şi motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.17. 2. 3. Succesiunea de evenimente în producerea anticorpilorDupă pătrunderea antigenului şi recunoaşterea acestuia ca non-self urmează

fagocitarea şi prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt

reprezentate în principal de celulele dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B.

219

APC, prin IgM şi IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoaşterea

epitopilor antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de

limfocite B, estimat la 107 posibilităţi; mutaţia somatică conduce la posibilităţi mult mai

mari de diversificare).

Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea şi etapele

următoare ale RIU necesită prezenţa limfocitelor Th CD4+ (cu intervenţia TCR, APC cu

expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 şi moleculele de aderenţă).

După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive),

care  ulterior vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp

se vor diferenția în LTh0 și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de

citokinele produse (vezi și 11.3.1.).

Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-

5 şi IL-6, care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB.

Acest „switch” se realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural,

dar cu aceeași specificitate pentru antigen.

Limfocitele B pot fi activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de origine

polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între

receptorii de suprafaţă şi determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În

lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără

„comutarea” spre IgG.

Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre

stadiul G1 (celula sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de

contactul cu antigenul.

IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 şi G1 şi

creşte expresia moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23,

CD34 şi CD40.

Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din

stadiul G1 în fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5.

Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite;

secreţia de IL-6 ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea

izotipică spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline.

Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu

ajutorul unor molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați

mesageri (”hormoni”) ai imunității.17. 2. 4. Teoria selecţiei clonaleTeoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet.

Această teorie afirmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de

clone de limfocite, fiecare dintre aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri

antigenice (unui anume epitop); în cadrul aceleaşi teorii, Burnet a făcut estimarea că în

lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiţi. Clona, aşa cum se

cunoaşte, este o populaţie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale

unei singure celule „mamă”.

220

Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură

imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice

(pentru fiecare antigen diferit există un receptor diferit).

Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie”

pe acelea care au receptori complementari (configuraţie spaţială etc) şi astfel determină

proliferarea şi diferenţierea lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au

aceeaşi specificitate pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat.

Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”)

sunt reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la

maturitate. În lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.

17. 3. Răspunsul imun de tip celular

Imunitatea celulară presupune în special dezvoltarea unui răspuns imun faţă de celulele

infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelulară

(mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), paraziţi intracelulari, allogrefe, celule

tumorale.

Un microorganism cu dezvoltare intracelulară penetrează în diverse celule şi în

particular în macrofage (aflate în stare de repaus şi neactivate) şi se poate divide fără ca

acest proces să inducă o reacţie imună celulară naturală şi specifică. Macrofagul care a fost

infectat cu un microorganism secretă o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a şi

TNF-β) care la rândul lor vor acţiona după cum urmează (Figura nr. 2):

·         TNF-a va activa macrofagul infectat;

·         TNF-a, TNF-β vor activa macrofagele neinfectate încă;

·         TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK.

Această primă fază va pune în mişcare celulele imunităţii celulare specifice şi astfel

limfocitele Th0 vor fi activate şi se vor diferenţia în Th1, datorită IL-12, secretată de

macrofage şi a IFN-g, secretat de celulele NK activate.

Antigenele proteice sunt transformate de către APC în peptide de 12-20 aminoacizi.

Acest tip de antigene induce o dublă imunizare celulară şi umorală. Nu a fost încă

demonstrat, complet, RIC faţă de antigenele ne-proteice.17. 3. 1. Etapele răspunsului imun celularImunitatea celulară intervine în mai multe etape succesive.

Răspunsul celular presupune ca antigenul prezentat limfocitelor să fie degradat în

peptide şi asociat cu molecule MHC II. Dintre APC menţionăm celulele dendritice (cele mai

bune prezentatoare de antigen), celulele Langherhans, macrofagele şi limfocitele B

(eficiente numai după stimulare).

Recunoaşterea peptidelor antigenice de către LT helper şi activarea

lor necesită contactul direct între APC şi limfocitele Th, interacţiunea fiind trimoleculară:

TCR, peptide antigenice şi MHC clasa II. moleculele CD4 şi moleculele de adeziune

consolidează această interacţiune. Toate aceste contacte duc la activarea şi multiplicarea 221

limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizează IL-2 şi lanţul a cu rol de

receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o acţiune autocrină şi exocrină; multiplicarea

limfocitelor T antigen-specifice duce la formarea de clone celulare specifice antigenului.

Generarea limfocitelor T citotoxice

LT CD8+ sunt selecţionate după specificitatea lor faţă de antigen şi activate de

diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil.

Recrutarea altor celule pentru cooperare

Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule

care nu sunt specifice antigenului:

¨             IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de

către CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT

CD8+ şi a celulelor NK;

¨             IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de

celulele NK, activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK

şi le activează funcţia citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu

virusuri (acţiune antivirală).

17. 4. Povestire adevărată17.4.1. Tratamentul în imunosupresie

În stabilirea şi aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodată

uitat rolul răspunsului imun (nici în plus şi nici în minus). De exemplu, pacientului

imunodeprimat trebuie să-i administrezi antibiotice bactericide și nu bacteriostatice.

Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse

motive se restaurează imunitatea, poate face reacţii cu impact fatal asupra evoluţiei. O

infecţie cronică cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor în diverse situaţii, nu

ridică probleme deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creşterea răspunsului imun,

„găseşte” pacientul într-o situaţie în care viremia este „înaltă”. Reacţia imună, recent

restaurată, poate induce leziuni hepatice severe, hepatită fibrozantă colestatică cu

mortalitate uneori până la 90%. Un alt exemplu ar fi pacientul cu infecţie HIV, aflat la

debutul unui tratament antiretroviral. Acesta, datorită aceluiaşi proces de restaurare imună,

poate să dezvolte afecţiuni nemanifeste până atunci, numite sindrom

de reconstrucţie imună, cu mortalitate foarte mare. Aşadar, este necesară o atenţie

deosebită atât în ceea ce priveşte imunodepresia cât şi în cazul revenirii imunităţii.

17.4.2. Stresul și răspunsul imun

Stresul este cunoscut ca având efect inhibitor al răspunsului imun, crescând astfel

susceptibilitatea la infecții și cancer.

Paradoxal, stresul este învinuit pentru exacerbarea astmului și a bolilor inflamatorii și

autoimune, deși astfel de boli ar trebui să fie ameliorate de un anumit grad de

imunosupresie. Mai mult, răspunsul de tip „fight-or-flight” este unul dintre mecanismele

naturale de apărare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal

promovează supraviețuirea, și de aceea este puțin probabil ca acest răspuns la stres să

222

suprime funcția imună, în momentul în care este esențială pentru supraviețuire. Fără acest

răspuns un tigru nu poate prinde o căprioară, în timp ce căprioara nu ar avea nici o șansă

de supraviețuire. Aceste observații sugerează că stresul poate suprima funcția imună în

anumite condiții și o poate întări în altele. Așadar, efectele stresului pot fi atât benefice cât

și dăunătoare.

Studiile au demonstrat că o serie de factori influențează direcția efectelor stresului:

1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat în timpul activării

imune stimulează atât imunitatatea înnăscută cât și pe cea adaptativa; stresul cronic

suprimă răspunsul imun scăzând numărul celulelor și/sau potențând mecanismele

imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI și prin

promovarea răspunsului proinflamator.

2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în

timpul stresului acut determină imunostimulare;

3. concentrația fiziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura

endogenă vs. sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fiziologică au

efect imunostimulant, în timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și

hormonii sintetici au efect imunosupresor.

4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a

răspunsului imun: imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii

incipiente ale activării imune, iar imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI.

Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în

organism, funcția imună fiind semnificativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în

timpul stresului acut.

Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul

plasmatic al cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură.

Rezultatele arată o creștere semnificativă în numărul celulelor imune înainte de săritură,

urmată de o scădere dramatică la 1 oră după, modificări concomitente cu creșterea

catecolaminelor, respectiv creșterea cortizolului plasmatic. (2)

Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate

ușoară, sau efort fizic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee

(splină, plămâni) și intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul

induce trecerea leucocitelor din sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract

gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici).

Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fiziopatologic persistența RI după

încetarea acțiunii agentului stresor sau activarea repetată.

Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres

pregătind sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție).

17.4.3. Interacțiunea somn – răspuns imun

Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea

consecințelor a fost dificilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifice acesteia, lipsesc.

S-a constatat însă că peste 64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe

223

cognitive marcate, dar numai câteva semne fiziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile

de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie.

Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu

este foarte clară. Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru

cronic energetic, deteriorarea graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun,

accelerarea catabolismului,  malnutriție putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza

morții șobolanilor deprivați de somn (3 săptămâni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ

anaerobe, prin multiplicare excesivă (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Corynebacterium

jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul

unei stări hipermetabolice și inflamatorie sistemice având ca rezultat sepsisul fără a se

putea pune în evidență un focar septic.

Semnele care certifică prezența unui status de imunosupresie includ absența abceselor

în ciuda colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de

microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.

17. 5. Tipuri de imunitateImunitatea poate fi moştenită (trăsătură de specie, se transmite ereditar) şi dobândită.

Imunitatea poate fi dobândită activ, după contactul cu un anumit antigen (ex.

bacterian). Evenimentul imunologic poate apărea după o infecţie (natural) sau după

administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunităţii dobândite activ este faptul că,

de regulă, protecţia este de durată. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul că

instalarea răspunsului imun are loc lent, mai ales în cazul RIP.

Imunitatea poate fi dobândită şi pasiv, preluând anticorpi produşi de către o altă gazdă.

Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxină difterică / tetanică / botulinică

(artificial) pune la dispoziţia gazdei infectate, imediat, o cantitate importantă de antitoxină,

în vederea neutralizării cât mai rapid a toxinei implicate patogenic. În mod natural, fătul şi

nou născutul beneficiază de protecţie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA

prin colostru, lapte) proveniţi de la mamă. Avantajul imunităţii dobândite pasiv este

rapiditatea, în timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru

care este oferită protecţia iar pe de altă parte, de riscurile unei hipersensibilizări, atunci

când sunt utilizaţi anticorpi provenind de la o altă specie (ex. în cazul administrării de ser

recoltat de la cal hiperimunizat).

Există şi posibilitatea dobândirii unei imunităţi activ - pasiv, atunci când se

administrează concomitent (dar în locuri diferite) ser imun şi un vaccin (ex. în suspiciunea

infecţiei cu Clostridium tetani).

Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent,

imunitatea înnăscută oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar

imunitatea dobândită intervenind mai târziu, pentru a elimina infecția. Însă,interacțiunea

dintre cele 2 tipuri de imunitate este evidentă: imunitatea adaptativă profită de

224

abilitatea imunității înnăscute de a distinge între agenții patogeni, microbii benefici și

factorii de mediu.

Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în strânsă colaborare (un adevărat

exemplu pentru studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar).

Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente,

celulele NK au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în

plus, au fost identificate celule NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative:

timus și ganglionii limfatici. (4)

17. 6. Definiţia vaccinurilorPornind de la observaţiile şi experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a

fundamentat ştiinţific vaccinurile alcătuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la

punct metodele de neutralizare a toxinelor şi a identificat utilizarea lor ca „anatoxine”.

Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau

inactivate sau 2. cuprinde fracţiuni din microorganisme (subunităţi), în vederea stimulării

mecanismelor de răspuns imun, de regulă pentru prevenirea apariţiei unor infecţii.

Vaccinarea este definită drept o metodă profilactică, care urmăreşte creşterea

rezistenţei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activă, cu stimularea răspunsului

umoral sau celular, după caz. De fapt, vaccinările incluse în programele naţionale de

vaccinare (conform recomandărilor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, OMS) reprezintă

metodele profilactice cu cel mai bun raport între cost şi eficienţă, în comparație cu orice

altă metodă cunoscută.

Strategiile de vaccinare au în vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al

gazdei respective (imunocompetentă sau imunodeprimată).

Unele vaccinuri se pot administra şi în timpul unei izbucniri epidemice („outbreak”) sau

a unei epidemii, pentru prevenirea apariţiei de cazuri noi şi scurtarea duratei epidemiei.

Există şi posibilitatea administrării unor vaccinuri în scop curativ, gazda fiind deja

infectată în momentul inoculării (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatită cronică, cu HBV).

17. 7. Clasificarea vaccinurilorÎn funcţie de infecţia care se doreşte a fi prevenită, vaccinurile pot fi bacteriene sau

virale.

În funcţie de modul de preparare există:

·           Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluzând, după caz, corpi vii

atenuaţi sau distruşi (inactivaţi) prin acţiunea unor factori fizici (ex. căldură) sau chimici

(ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conţine bacterii vii atenuate, stimulează RIC şi se

administrează pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A

includ virusuri omorâte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conţin virusuri

vii, atenuate şi stimulează RIU şi răspunsul imun la poarta de intrare.

·           Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetică, au un grad superior

de siguranţă (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular).

225

·           Vaccinurile care conţin anatoxine bacteriene, purificate şi adsorbite pe

suport mineral (DTP conţine anatoxină tetanică şi difterică plus corpi de Bordetella

pertussis omorâţi, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA).

În funcţie de numărul componentelor antigenice există:

·         Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B,

pertussis acelular, BCG etc),

·         Vaccinuri asociate, care conţin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-

rubeolos etc).

      Date privind schema de vaccinare aflată în uz în ţara noastră la acest moment,

precum şi câteva informaţii privind substanţele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt

prezentate în anexa nr. 4.

17. 8. Povestire adevăratăIanuarie 1993 ... un articol semnalează faptul că difteria, o boală practic eliminată în

Europa de Vest, capătă proporţiile unei epidemii, în Rusia.

Situaţia a fost de asemenea periculoasă în Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri

au fost raportate în primele zece luni ale anului 1992. Ameninţarea extinderii în alte state,

foste membre URSS, a fost reală. Eforturile uriaşe de a vaccina atât copiii cât şi adulţii au

făcut, până la urmă, posibil controlul epidemiei. Totuşi, în perioada 1990-1998, peste

150.000 de cazuri de difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS,

înregistrându-se şi un foarte mare număr de decese.

Dar care a fost motivul şi de ce a apărut o epidemie de difterie după 1990 ?

Incidenţa difteriei în Rusia era foarte mare în prima jumătate a secolului 20; peste

750.000 de cazuri au fost raportate doar în Rusia în anii ’50 (imunizarea împotriva difteriei

a început în anumite zone ale Uniunii Sovietice în 1920, însă abia în 1958 a fost statuată

imunizarea universală a copiilor, în toată Uniunea Sovietică). Este adevărat că în 1977, au

început să fie din nou raportate cazuri de difterie, în URSS, atingând o valoare maximă în

1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dată, majoritatea cazurilor au apărut la adulţi.

Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea adversă faţă de imunizare.

Multe dintre bolile prevenite de vaccin aveau o incidenţă scăzută şi în acest context a

apărut o „mişcare anti-imunizare” în presă, în contextul unei perioade (1985-1990) de

profundă neîncredere în guvern. După 1990, părinţii nu mai erau de acord să permită

imunizarea copiilor cu vaccinuri produse în Rusia fiind făcuţi să creadă că acestea le fac rău

şi îi îmbolnăvesc. Chiar şi membri ai comunităţii medicale au avut „ieşiri în presă” în care

au exprimat părerea că aceste vaccinuri dăunează.

În plus, o parte din părinţi considerau că amânarea (nerespectarea schemelor de

vaccinare, neprezentarea la medic atunci când erau invitaţi să o facă) sau evitarea

vaccinării copiilor sunt o nou-descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată

cu dizolvarea URSS.

Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în

legătură cu vaccinul produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au

226

demonstrat că vaccinul era eficient [este totuşi posibil ca vaccinul să fi fost transportat în

condiţii improprii şi astfel să fi avut, în mod real, o eficacitate mai mică (presupunere care

nu a fost demonstrată)].

Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele

modificări, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen,

creşterea intervalului între vaccinări, renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală)

iar preocuparea pentru sănătatea publică a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la

copii a scăzut în anii ’80, la mai puţin de 70% (mult sub recomandările OMS).

Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai

multor copii dar şi a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost

aprobată abia în 1993. S-au făcut vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu

pentru vaccinarea şomerilor. Pentru a creşte rata imunizării la copii s-a diminuat lista

contraindicaţiilor şi a început să se folosească schema completă de vaccinare. În octombrie

1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea în clasa I. În 1995 - 1996, epidemia a

început să fie controlată. Dar care au fost pierderile umane şi materiale, reale, probabil că

nu vom cunoaşte, vreodată.

În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale

intervenţiei negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei

de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate

publică în secolul 20.

18. Reacţiile de hipersensibilitate18. 1. Definiţie, clasificare

Reacţia imună este un răspuns normal fiziologic faţă de microorganisme sau celule

tumorale.

Totuşi, RI poate îmbrăca şi aspecte patologice, de tipul hipersensibilităţii (HS) sau

al autoimunităţii. Primele observaţii privitoare la reacţiile de hipersensibilitate au fost

făcute de Charles Richet în urmă cu un secol, observaţii care vor acoperi tipul I din

clasificarea Gell şi Coombs de mai tȃrziu.  Pornind de la diferite tipuri de reacţii observate,

Gell şi Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de hipersensibilitate de tip I-

IV. În 1974, Roitt adaugă hipersensibilitatea de tip V, stimulantă (pornind de la anticorpii

stimulanţi ai funcţiei tiroidei, prezenţi în hipertiroidia primitivă, boala Basedow).

În mod clasic, HS reprezintă o stare de reactivitate crescută a organismului, pe baza

unui mecanism imunologic, indusă de expunerea (repetată) la anumite structuri

antigenice (sau haptene).  Cuvȃntul alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet;

desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate.

HS este specifică şi include

·         un contact sensibilizant,

·         o perioadă de latenţă şi

227

·         un nou contact, contactul declanşator, cu acelaşi antigen care a fost implicat în

contactul sensibilizant.

HS se poate clasifica în funcţie de tipul de răspuns imun în:

·         HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB şi anticorpii)

            -HS de tip I (anafilactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului

anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic,

urticariei, eczemei atopice etc;

            -HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi,

complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement

independentă (mecanisme ce pot fi implicate de ex. în patogenia reumatismului articular

acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, reacţii

posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);

            -HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în

reacţia Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita

extramembranară, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita

şi periarterita poststreptococică etc.

·         HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT şi

citokinele), spre exemplu în

-HS tuberculinică sau

-HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină,

tricofitină etc şi

-HS în multe dintre infecţiile virale.

18. 2. Hipersensibilitatea de tip I (anafilactică)

Reacţia imună anafilactică se poate instala rapid (în mai puţin de 15-30 minute) după

un nou contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. În această reacţie

intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite de „reagine” (în principal IgE), care

eliberează mediatori chimici (histamina fiind cel mai important şi cel mai cunoscut dintre

aceştia).

Anafilaxia este un fenomen general, obţinut ca răspuns la antigene variate: toxine,

proteine, medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina şi

substanţele de contrast folosite în imagistică pot determina şoc anafilactoid, cu aceleaşi

manifestări ca în şocul anafilactic, însă fără participarea IgE.

Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixează prin fragmentul lor Fc pe

receptorii specifici exprimaţi la suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor.

Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimulează producerea IgE (sunt

implicate IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhibă producerea IgE (fiind implicate IFNγ și IL-12).

Th2 (Figura nr. 1) are o acţiune autocrină, secretă IL-4 cu acțiune atât asupra LB  cât şi

asupra celulei secretoare.

228

Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează

de aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate

foarte apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4

devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea

juca Il-10.

Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datorează structurii

diferite. IgE prezintă faţă de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zonă balama diferită

şi zone de recunoaştere pentru ambele tipuri de receptori: FcεRI (afinitate înaltă) şi FcεRII

(afinitate joasă).

 

IgE au un timp de viaţă mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar

concentraţia acestora este foarte scăzută în serul individului normal.

Ataşarea IgE de mastocite şi bazofile (ca dimeri cuplaţi cu alergenul) duce la creşterea

duratei de viaţă a IgE de la mai puțin de 2 zile la 10 zile.

IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că placenta nu conține FcεR. Ȋn

sângele fetal se pot găsi IgE în cantităţi sub 1UI/ml prin ataşare de FcγRI de pe macrofagele

fetale. FcγRI pot semnaliza pentru degranulare şi după cuplarea cu alte molecule (ex.

lectine, Ac anti lanțt α FcγRI).

Bazofilele şi mastocitele se caracterizează prin prezenţa unor granule

metacromatice, roşii după coloraţia cu albastru alcyan, datorită histaminei şi heparinei.

Mediatorii mastocitari sunt reprezentaţi de histamină, leucotriene, prostaglandine,

factorul activator plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) şi

neutrofile (NCF) şi o serie de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-

a, TGF-β1, IFN-g). La suprafaţa bazofilelor şi mastocitelor sunt exprimaţi diverşi receptori,

dintre care cei mai importanţi sunt FceRI, FceRII (CD23) şi C3aR şi C5aR (CD88).

Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniţializează semnalizarea spre interiorul

celulei, ducând la activarea celulară.

Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun şi

necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare

constă dintr-o serie de reacţii biochimice în trepte, cu participarea fosfolipidelor

membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducând la creşterea influxului de

Ca2+ extracelular alături de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a

iniţia eliberarea mediatorilor preformaţi şi sinteza de novoa mediatorilor lipidici.

Exemplificăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:

·         bronhoconstricţie prin acţiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede

traheo-bronşice,

·         vasodilataţie arterio-capilară prin contracţia fibrelor musculare netede din

peretele venulelor postcapilare,

·         creşterea permeabilităţii capilare,

·         creşterea motilităţii intestinale şi

·         reacţie urticariană la nivel cutanat.

 

229

Mastocitele eliberează histamină şi LTD4, care vor determina edem, hipersecreţie de

mucus şi bronhoconstricţie, cu scăderea FEV1, însă eliberează şi IL-5, TNFα, care vor atrage

eozinofile, limfocite, neutrofile şi macrofage.

Aceste celule inflamatorii vor determina modificări cronice la nivelul plămȃnului:

hiperplazie a celulelor secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei

bazale şi hiperplazie musculară netedă. Aceste modificări vor determina o hiperreactivitate

bronşică, dar de data aceasta, nespecifică (hiperreactivitate bronşică la aer rece, efort).

Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se corelează cu valoarea NO

expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un număr crescut de eozinofile şi cu

valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) în sputa indusă. Aceste teste nu au valoare

diagnostică, însa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severităţii astmului.

Faptul că mastocitele intervin în ambele faze, imediată şi tardivă, o demonstrează

efectul benefic pe care îl are cromoglicatul (stabilizator de membrană, se opune

degranulării) în tratamentul astmului bronșic. Corticosteroizii acţionează numai pe

răspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea între implicarea mastocitelor şi LT în

inflamaţia cronică datorită faptului că inhibă ambele celule.

 

Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I,

sunt de reţinut:

- şocul anafilactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm;

în lipsa tratamentului poate evolua către deces. Principalele antigene care pot declanşa

şocul anafilactic sunt înţepăturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor

medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) şi

- edemul Quincke care cuprinde faţa, gura şi uneori faringele şi laringele, ducând la

asfixie şi deces.

Dintre manifestările clinice localizate ar fi de amintit:

- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept

principali agenţi declanşatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci

(conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv febra de fân, traheita spasmodică şi astmul

alergic);

- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) şi

- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă,

peşte, fructe, ţelină etc).

18. 3. Povestiri adevărate 18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever?

 18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreția IgG4/IgE?

 18. 3. 3. Testarea HS de tip I

18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever?

230

O tânără de 19 ani ajunge la camera de urgenţă din cauza unui atac acut de dispnee, respiraţii şuierătoare (wheezing), înroşire (erupţie eritematoasă) generalizată la nivelul tegumentelor şi vărsături. Era cunoscută ca suferindă de astm bronşic, ţinut sub control cu tratament medicamentos. Din antecedentele din copilărie, avea notat în carnetul de sănătate o reacţie „alergică” (dermatită atopică şi urticarie) după ingerarea de unt de arahide.

După spusele colegilor care au însoţit-o la spital, înainte de a-i apărea simptomele, a mâncat o ciocolată de la un tonomat din cămin. Pe ambalaj nu apăreau notate alunele ca ingredient.

Totuşi ...

Iată câteva elemente privind „alergiile” la diferite alimente

Reacţiile de hipersensibilitate apărute după ingestia anumitor alimente afectează aproximativ 6-8% dintre copiii mai mici de 4 ani şi aproape 2% din populaţia SUA cu vârsta mai mare de 10 ani. „Alergia” la produsele alimentare reprezintă una dintre cele mai importante cauze pentru reacţiile anafilactice tratate în departamentele de urgenţă din SUA şi din multe state occidentale. În fiecare an sunt raportate circa 30.000 reacţii anafilactice, 2.000 de spitalizări şi 200 de decese din cauza reacţiilor de sensibilitate la diferite produse alimentare. Reacţiile în urma consumului de arahide şi alune de pădure conduc la un procent important de reacţii anafilactice fatale sau foarte grave. În SUA, de unde putem obţine date statistice privind această situaţie, 3 milioane de oameni suferă astfel de „alergii”. Deşi există numeroase programe de informare (tot în SUA) cu privire la „alergiile alimentare”, majoritatea pacienţilor nu ştiu cum să acţioneze şi cum să se salveze în cazul unei reacţii anafilactice.

Cum s-ar putea pune diagnosticul?

La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de astm, trebuie să ridice întotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indusă de produse alimentare poate fi confundată de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza şi examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului.

Tratamentul alergiei la alune

În primul rând şi cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită şi măsurile includ educarea pacienţilor şi a familiilor acestora cu privire la modul în care să evite ingestia accidentală de alune, cum să recunoască primele semne şi simptome ale unei reacţii „alergice” şi cum să reacţioneze în primele stadii ale unei reacţii anafilactice.

Spre deosebire de imunoterapia tradiţională (pentru reacţiile de HS la înţepături de insecte etc) în cazul HS la alune sunt investigate metode de tratament „neconvenţionale” precum injectarea lunară de anticorpi anti-IgE (care, prin scăderea nivelelor de IgE, pot preveni activarea răspunsului la alergenul proteic din alune) sau obţinerea prin inginerie genetică a unor proteine de

231

alune recombinante (prin substituirea unor aminoacizi „critici” se poate preveni activarea reacţiilor mediate de IgE).

Tratamentul reacţiei anafilactice

Pacienţii care au HS de tip I la alune trebuie să primească urgent adrenalină (injectată intramuscular), antagonişti ai receptorilor histaminici H1 şi H2 (administraţi oral, intramuscular sau intravenos), oxigen, albuterol (pe cale inhalatorie) şi corticosteroizi (injectabil). Datorită faptului că pot apărea reacţii bifazice (definite ca o agravare simptomelor, ce necesită o nouă terapie după tratarea iniţială a reacţiei anafilactice) şi deoarece circa90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la reacţia anafilactică iniţială, pacienţii trebuie ţinuţi sub observaţie cel puţin 4 ore înainte de a fi externaţi din camera de  urgenţă.

Se recomandă continuarea tratamentului timp de 3 zile (prednison şi antihistaminice), cu toate că nu a fost demonstrat că această recomandare ar reduce riscul simptomelor recurente.

18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreția IgG4/IgE?

Pentru a bloca interacţiunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a încercat terapeutic, cu rezultate bune in vitro (administrare inhalatorie), dar nu și  in vivo (probabil datorită contracarării acțiunii acestora prin intervenția altor citokine implicate în sinteza de IgE).

Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.

Copii care trăiesc în casă cu o pisică e posibil să nu dezvolte hipersensibilitate la alergenii aceasteia, prin modificarea raspunsului Th2

        

va crește sinteza de IgG4 şi

        

va scădea sinteza de IgE.

Cercetătorii încearcă să găsească un mod de a induce Th2 să sintetizeze numai a IgG4, cu blocarea producției de IgE, cu scopul de a induce toleranţa la venin de insecte, proteine diferite, alergeni alimentari, păr de animale etc. Merită menționat faptul că imunizările antitetanos şi antidifterie nu induc producerea de IgE, în timp ce imunizările repetate antipertussis cu adjuvant

232

Freund incomplet induc o sinteză crescută de IgE (e foarte interesant faptul că există variaţii mari în funcţie de tulpina utilizată pentru fabricarea vaccinului).

Câteva exemple de alergeni

O descriere orientativă a alergenilor implicați în HS de tip I ar fi cea de proteine hidrosolubile cu greutate moleculară între 10 şi 40kDa, chiar dacă structura, provenienţa şi calea pe care o urmează aceste proteine poate fi extrem de diferită. Cloning a descoperit o anumită secvență de aminoacizi omoloagă pentru o parte din alergeni și diferite enzime. Pentru polen sau părul de pisică nu există nici omologia structurală cu enzimele şi nici capacitatea enzimatică, deci nu aceştia sunt factorii esenţiali. Pentru acarieni, în schimb, s-a dovedit o strȃnsă corelaţie între activitatea proteazică şi imunogenitate (Der p 1 taie CD23 sau CD25 de pe limfocite, intensificȃnd răspunsul imun; de asemenea, distruge joncţiunile dintre celulele epiteliale, ceea ce le facilitează acarienilor pătrunderea în organism).

18. 3. 3. Testarea HS de tip I

Testele cutanate, prick-test, reprezintă metoda cel mai des utilizată în diagnosticul HS de tip I.

Se introduc cȃte 0,1μl din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testează 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), şi unul negativ (soluție salină fiziologică). Modificările cutanate apar în 5-15 min şi durează 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de răspuns:

        

maculă, determinată de descărcarea de histamină, cu prurit şi edem şi

        

papulă, cu aspect eritematos şi dimensiuni mai mari şi care are ca mecanism reflexul

de axon.

(Figurile nr. 5 și 6)

 

Altă tehnică ar include dozarea IgE, însă testul este mai puţin sensibil decȃt testele cutanate.

Un test cutanat pozitiv nu inseamnă neapărat că persoana prezintă HS de tip I, ci că există o mare probabilitate să fie aşa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru) este urmat şi de un răspuns tardiv, caracterizat prin eritem şi induratie. Răspunsul tardiv apare la 2-3 ore după injectarea intradermica a antigenului, ţine pȃnă la 24 ore şi este sugestiv pentru inflamaţie cronică la nivelul foselor nazale, plămȃnului, pielii, datorându-se:

233

        

efectelor directe ale prostaglandinelor, leucotrienelor şi citokinelor eliberate de

mastocite,  

        

infiltrării cu limfocite, eozinofile, bazofile şi neutrofile şi

        

produşilor de secreţie ai acestor 4 tipuri de celule.

Răspunsul tardiv se întȃlneşte în cazul administrării de tuberculină, candidină şi tricofitină.

 

Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din zona respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-test: injecţii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua probe repetate fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare.

(Figurile nr. 7 și 8)

 Un test patch pozitiv înseamnă prezenţa eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de vezicule pline cu lichid între cheratinocite) la nivel macroscopic şi prezenţa unui infiltrat celular dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate în MBP-major basic protein, bazofile, limfocite). S-a reuşit clonarea de LT specifice împotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczemă (produsă în mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil şi din pielea persoanelor alergice dar care nu dezvoltă eczemă, ceea ce sugerează nu doar rolul de helper, ci chiar pe cel de celulă efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare că rolul LT ca efector în HSI nu se limitează doar la nivel cutanat, dar şi la nivelul mucoasei nazale şi conjunctivei în rinita alergică şi a epiteliului bronşic în astm.

(Figura nr. 9)

Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu răspuns rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4-8 ore, constȃnd în eliberare de mediatori de novo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate pune în evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot identifica toate modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere de colagen, subţierea peretelui bronşiolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronşică. Pentru demonstrarea hiperreactivităţii bronşice nespecifice se fac teste de provocare cu histamină,

234

metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci epitelilul, ori stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din celulele locale (histamină din mastocite).

Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic, titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid. Examenul CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime din astmatici.

Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la cel de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament.

Imunoterapia sau hiposensibilizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de cȃteva luni, a fost încercată în 1911 de Noon şi Freeman. Acum se foloseşte împotriva reacțiilor față de veninul de albine, viespi şi pentru tratamentul rinitei alergice. Doza iniţială este de 1-10ng şi creşte progresiv cu cȃte 10μg alergen/doză.

O formă mai nouă de imunoterapie e cea folosind, nu structura naturală a alergenilor, ci un fragment conținȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a alergenului. De asemenea, se pot sintetiza forme recombinate genetic, cu o capacitate de legare de IgE scăzută.  Însă şi acestea ar putea provoca şoc anafilactic aşa că administrarea lor se va face după luarea tuturor precauţilor necesare. 

Sunt în studiu şi vaccinuri ADN, cu introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vectorîin celulele gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia. Experimente s-au facut pe şoareci, unde expresia tisulară de CpG a facut să crească activitatea TH1 şi să scadă cea  a TH2.

Anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi se ataşează de Fab a IgE circulanţi, şi astfel îi îndepărtează din circulaţie. Ȋnsă, pot şi scădea producţia de IgE prin ataşarea de receptorii situaţi pe LB, care nu vor mai semnaliza pentru producerea de reagine (Ac anti-IgE). Şi-au dovedit eficacitatea în cazul astmului alergic şi al rinitei alergice, şi urmează să se stabilească dacă au efect benefic în cazul alergiei alimentare, dermatitei atopice sau alergiei la medicamente.

 

18. 4. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

Întrebarea 1

1). Anafilaxia apare după un contact nou cu un antigen la care organismul nu era

sensibilizat.

2). Ȋn HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai

numesc şi reagine.

235

3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de

novo.

Dintre cele 3 afirmaţii de mai sus, care este adevărată/care sunt adevărate?

A) 2

B) toate

C) nici una

D) (1) si (3)

 

Ȋntrebarea 2

Alegeți afirmațiile care sunt amândouă corecte și se află în relație de cauză-efect.

a). Activarea bazofilelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun

pentru că necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc).

b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe

receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice

c). Şocul anafilactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm

pentru că în lipsa tratamentului poate evolua către deces

d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la

nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun.

 

Intrebarea 3

Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I

a). prick-test

b). dozarea IgE

c). patch test

d). dozarea IgG

 

Intrebarea 4

Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I

a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de

cȃteva luni

b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a

alergenului caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE

c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele

gazdei, cu modificarea răspunsului imun al acesteia

d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi

 

Intrebarea 5

Pentru a găsi afirmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată

a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne

recente de astm, nu ar trebui să ridice niciodată suspiciunea anafilaxiei.

b). Cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie prevenită

236

c). Ȋn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii  receptorilor histaminici H1 şi H2,

oxigenul, albuterolul şi corticosteroizii

d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la

reacţia anafilactică iniţială, pacienţii pot fi externaţi din camera de urgenţă înainte de

atingerea a 4 ore de la prezentare.

18. 5. Hipersensibilitatea de tip II (citotoxică)

Reacţia imună citotoxică reprezintă unul dintre mecanismele importante de apărare a

organismului gazdă faţă de microorganisme. Rolul acestei reacţii este multiplu: distrugerea

bacteriilor extracelulare şi intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar şi

distrugerea unor paraziţi sau fungi. Pentru îndeplinirea acestor funcţii sunt utilizate

mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea

specifică completează imunitatea naturală, adăugând aderenţa celulelor fagocitare şi a

celulelor NK la antigene prin intermediul anticorpilor şi complementului. Un rol aparte în

imunitatea specifică îl deţin limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.

HS de tip citotoxic apare după cuplarea anticorpilor cu antigene fixate pe membrana

celulară. Spre deosebire de hipersensibilitatea de tip I, Ac implicaţi în acest tip de răspuns

imun sunt IgG sau IgM. Ei sunt ataşaţi celulelor gazdei sau se găsesc în matricea

extracelulară (în HS III, Ac sunt în ser, cu formarea de complexe circulante care se vor

depune nespecific în ţesuturi). (Figura nr. 10)

Se cunoaște faptul că un neutrofil recunoaşte și fagocitează fagocita bacteria

opsonizată cu Ac, formează fagolizozomi urmând distrugerea produsului

fagocitat.Receptorii pentru complement sunt necesari pentru că bacteria poate fi

opsonizată şi de fragmente ale sistemului complement. A fost demonstrat experimental (pe

șoareci) că rolul esenţial nu revine C3R, ci FcR. Ȋn loturile cu deficit de sinteză a lanţului γ al

FcR, HS de tip II nu apare, în timp ce la şoarecii cu deficit al componentelor sistemului

complement, nu s-a constatat nici o diferenţă faţă de lotul de control. Ȋn cazul HS de tip

II, în locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoză a enzimelor lizozomale asupra

celulei/matricei tapetate cu Ac.

După formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se

generează complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odată cu liza

celulei gazdă are loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor şi

leucotrienelor.

Alături de neutrofile participăşi macrofagele, trombocitele, celulele K, eozinofilele

datorită prezenţei FcR pe membrana lor. Macrofagele, eozinofilele şi neutrofilele au un

răspuns mai puternic datorită prezenţei şi a C3R pe membrana celulară. Amplitudinea

fenomenelor la nivel celular depind de cantitatea de Ac dar şi de rezistenţa celulelor ţintă la

liză. De exemplu, în cazul eritrocitelor este suficient un singur MAC, în timp ce pentru

celulele nucleate există o capacitate mai mare de a se reechilibra ionic precum şi

mecanisme de apărare anti-complement.237

Liza mediată de C' este implicată în anemiile hemolitice, reacţiile postransfuzionale

în incompatibilitatea ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de

atragerea fagocitelor şi eliberarea locală a enzimelor litice.

 Organismul uman posedă în mod normal în sȃnge anticorpi față de Ag sistemului ABO

pe care nu le deține. În aceste condiții, Ac nu se vor întȃlni niciodată cu fără o intervenţie

din afară. Ȋn cazul unei transfuzii cu sȃnge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de

febră, hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior și posterior), datorită

hemolizei intravasculare.

Este de menționat că o femeie însărcinată poate păstra sarcina în cazul unui făt cu o

altă grupă de sȃngepentru că Ac formaţi împotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM

(pentameri) care nu vor trece bariera fetoplacentară.

 Sistemul Rh, însă, poate provoca sindromul hemolitic al nou-născutului. Mama,

sensibilizată împotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece

bariera feto-placentară. Manifestările sindromului hemolitic al nou-născutului constau în

hepatosplenomegalie, icter şi peteșii apărute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh

incompatibil cu mama sa, nu va suferi, însă, următorii, da. Situaţia caracteristică este:

mama, Rh- iar fătul, Rh+. Ac anti Rh+ rămân ”in amonte” de placentă. Pornind de la aceste

constatări s-a imaginat un tratament care şi-a dovedit eficienţa. Se administrează mamei

imediat post- partum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne.

Alte sisteme sangvine implicate în reacţiile posttransfuzionale, în afară de sistemele

ABO şi Rh, sunt MN, Duffy şi Kell. Formarea de IgG vor induce o reacţie hemolitică mai puţin

accentuată. Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului şi

splinei, şi nu vor da o hemoliză intravasculară sistemică. Ȋnsă poate apărea şi în acest caz

necroza acută tubulară datorită eliberării masive a componentelor eritocitare.

 Pot apărea reacţii postransfuzionale îndreptate şi împotriva altor componente celulare

sangvine, însă consecinţele nu sunt la fel de pregnante ca în cazul eritrocitelor.

Reacţiile de respingere de grefă se manifestă la nivelul ţesuturilor vascularizate direct

(un exemplu de țesut care nu suferă reacţii de respingere este corneea). Cele mai severe

manifestări se datorează tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor,

recrutare de neutrofile şi trombocite. Ȋnsă frecvente sunt şi manifestările datorate

incompatibilităţii MHC.

 Alte exemple:

- anemia hemolitică după ataşarea de proteinele de suprafaţă a hematiilor a unor

medicamente (penicilină, fenacetină, chinidină etc) şi iniţierea producerii şi cuplării unor

anticorpi de tip IgG.  HS de tip II la medicamente se poate produce în 3 modalități diferite:

·         prin ataşarea medicamentului la membranna celulară cu producerea ulterioară

de Ac (cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor),

·         prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se

ataşează pe membrana celulară şi

·         prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11)

238

- trombocitopenia şi tendinţa la hemoragie după administrarea de chinină, care se

ataşează de trombocite şi stimulează producerea de autoanticorpi;

- apariţia unui sindrom asemănător lupusului eritematos după administrarea de

hidralazină care stimulează producerea de autoanticorpi anti-ADN;

- anemia hemolitică după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, datorită stimulării

producerii de anticorpi care se fixează pe hematii;

- cardita reumatismală din reumatismul articular acut (anticorpii faţă de streptococul

beta-hemolitic de grup A reacţionând încrucişat cu ţesutul cardiac);

- sindromul Goodpasture (după apariţia de Ac care se fixează pe membrana

glomerulară renală sau la nivel pulmonar, se activează C', rezultând leziuni grave ale

membranelor celulare).

Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginării unor

tratamente ce folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor

receptor 2) în terapia cancerului de sȃn; Infliximab (Ac anti-TNF) în boala Crohn; Rituximab

(Ac anti-CD20) în limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimună, artrită reumatoidă

şi lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) în leucemii şi pentru inducerea

imunosupresiei la pacienţii ce suferă un transplant de celule stem.

18. 6. Povestire adevărată (Cardita reumatismală, entitate a hipersensibilităţii tip II ce nu trebuie subestimată)

În urmă cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatică) reprezenta

un subiect foarte frecvent dezbătut în publicaţiile ştiinţifice, mai mult chiar decât infarctul

miocardic acut, de ex. Atunci existau atât de mulţi copii cu această boală, încât spitale

întregi erau dedicate tratamentului RAA.

În prezent, majoritatea medicilor din ţările dezvoltate nu au mai văzut cazuri de RAA

(profilaxia primară şi secundară a atacului reumatismal realizându-se în mod

corespunzător); experienţa în ţările occidentale este astăzi limitată la constatarea prezenţei

leziunile de valvă mitrală la pacienţi care au fost afectaţi de RAA în tinereţe.

În ţările dezvoltate, populaţia cumulată este mai mică de 20% din populaţia globului;

pentru restul populaţiei (peste 80%), RAA şi cardita reumatismală continuă să reprezinte o

problemă importantă. Se estimează că la nivel mondial există 15,6 milioane de persoane cu

RAA, în fiecare an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt

provocate fie de RAA fie de diferitele complicaţii ale RAA. Este posibil ca numărul real de

cazuri să fie mai mare.

239

O consecinţă negativă a scăderii interesului faţă de RAA în ţările dezvoltate este

reducerea cercetării în acest domeniu şi singurele progrese din ultima jumătate de secol au

fost realizate în domeniul tratamentului medical şi chirurgical al RAA.

Principala modalitate de control al RAA rămâne tratamentul corect al faringitelor cu

streptococ β-hemolitic de grup A şi administrarea de injecţii cu penicilină retard (varianta

„depozit” cu intervalul cel mai lung între 2 administrări poate fi administrată la 3-4

săptămâni), de-a lungul unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA

pentru a preveni episoadele recurente (profilaxie secundară). Ambele strategii au fost

publicate încă din anii 50, în SUA. În prezent se încearcă şi obţinerea unui vaccin, pentru

profilaxie primară (se estimează că în 10-20 ani va putea fi obţinut un vaccin sigur şi

eficient).

În lipsa unor cercetări realizate în ţările dezvoltate, se încearcă obţinerea unor date în

statele în care RAA are o frecvenţă crescută. Spre exemplu, studii realizate în Mozambic,

Cambodgia, Franţa şi Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei în detectarea

pacienţilor cu boală cardiacă reumatică (copii cu vârstă şcolară), detectându-se astfel cu

90% mai multe cazuri decât prin metoda clasică, de diagnostic clinic. S-a descoperit că 2-

3% dintre copii cu vârstă şcolară din Cambodgia şi Mozambic sufereau de boală cardiacă

reumatică, majoritatea nefiind diagnosticaţi în cursul acestui studiu. Aceste date confirmă

faptul că RAA şi cardita reumatismală au o suficient de mare importanţă pentru a atrage

atenţia publicului internaţional şi a comunităţilor de cercetare.

18. 6. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

 

Ȋntrebarea 1

Printre rolurile hipersensibilităţii de tip II se numără:

a). distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare

b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri

c). distrugerea unor paraziţi sau fungi

d). toate cele de mai sus

 

Ȋntrebarea 2

Care dintre următoarele afirmaţii este incorectă?

a). Ȋn HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.

b). Ȋn HS de tip II sunt utilizate atȃt mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN,

macrofage, celule NK) cȃt și ale imunităţii specifice.

c). Imunitatea specifică presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma

ulterior complexe imune circulante.

d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavȃnd

posibilitatea de a se depune la nivelul ţesuturilor.

240

18. 7. Hipersensibilitatea de tip III (prin complexe imune circulante)

 Fenomene experimentale

 Patologia umană

HS de tip III se poate datora:

- unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită stafilococică);

- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită);

- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier,

antigene aviare în cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).

Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive

eliberate în cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are

ca efect creşterea permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi

expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor şi formarea de

microtrombi.

Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală

continuă să genereze C3a şi C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol

protectiv, determină ulterior creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare.

Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi exocitează conţinutul în loc să endociteze complexele

imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazală vasculară). Enzimele inhibitoare

serice împiedică enzimele lizozomale să acţioneze la nivel sistemic, însă nu şi local, de

aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru

C3b, importanţi pentru preluarea complexelor imune şi transportul lor către splina şi ficat,

unde vor fi fagocitate. Ȋn HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade eficienţa.

Complementul menţine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasică şi resolubilizează

complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul depleţiei de

componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) în patologia HS de tip

III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de

ficat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o perioadă mai lungă de

timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afinitate joasă, va favoriza

producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III.

Depunerea complexelor imune

 Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive)

reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare.

Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de

prezenţa turbulenţelor. Ȋn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare

decȃt în restul capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în 241

zonele de filtru vascular (plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau

altul poate fi dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a

Ac.

Fenomene experimentale

Reacţia Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus şi Nicholas Breton, după

injectarea subcutanată de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime

după aproximativ 6 ore. Boala serică acută, descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată

din nou în anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon).

Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depozitează în ţesuturi, apare conceptul de

antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul respectiv sau este fixat

secundar, se iniţiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente:

·         activarea complementului şi a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a şi C5a;

·         afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale şi

·         afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.

Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om.

Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de

la altă specie, asociat cu un adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru

obţinerea de anticorpi circulanţi IgG precipitanţi, reacţia Arthus poate fi obţinută prin

injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la

6 ore şi dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat, peteşii şi uneori purpură

necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la fixarea de igG

şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular.

Boala serului

a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecţioase erau tratate

prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicaţiile

acestei terapii sub termenul de boală serică (febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită

la unii bolnavi după 8-12 zile de la prima injecţie.

Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina

bovină (BSA), în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia

bolii serice acute (experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile.

BSA marcată radioactiv, scade, iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi

după 24 de ore, lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza complexelor imune

(corespunde prezenţei concomitente de BSA şi a anticorpilor anti-BSA); este boala serică cu

glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii

anti-BSA liberi nu sunt decelabili decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea complexelor

imune corespunde acestei perioade, ca şi scăderea complementului seric. Manifestările

patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-BSA liberi şi nici complexelor imune circulante.

Ca şi în reacţia Arthus, leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de

un aflux de neutrofile. La animalul fără complement apare o simplă albuminurie fără

glomerulonefrită); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau

conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescuţi; manifestările clinice, în special

glomerulonefrita, regresează rapid).

242

b) Boala serică cronică. Este dificil de reprodus la animal. Totuşi administrarea

repetată a antigenului (din 2 în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice

extramembranare proliferante.

Patologia umană

Principalele afecţiuni umane sunt:

·         bolile comparabile cu reacţia Arthus (în care antigenul induce o reacţie locală prin

difuziunea anticorpilor IgG precipitanţi); un exemplu este boala plămânului de fermier

[după contactul în timpul zilei cu fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la

începutul nopţii (după 6 ore) o stare de asfixie care dispare în următoarele ore];

·          manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaţiilor, pielii şi uneori a

creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative.

Afecţiunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă,

glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice etc. În 2/3 din cazurile de anemie

hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se formează anticorpi IgM anti-medicament. În

aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră, frison, mialgii cu dureri lombare şi

uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.

18. 8. Povestiri adevărateVasculită necrozantă aparută în cadrul

glomerulonefritei difuze postinfecţioasăVor fi prezentate două cazuri de glomerulonefrită şi evoluţia lor clinică şi

anatomopatologică. Biopsiile efectuate au evidenţiat aspectul de glomerulonefrită difuză

acută postinfecţioasă, asociată cu necroză fibrinoidă şi infiltrat inflamator leucocitar în

peretele arteriolelor şi arterelor interlobulare. Au fost observate proliferări celulare. În

ambele cazuri a apărut insuficienţa renală acută (IRA) severă (în cazul celui de al doilea,

evoluţia a fost nefastă, spre deces).

Primul caz

Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat în spitalul din oraşul de reşedinţă.

Motivele internării au fost reprezentate de inapetenţă, edem facial, diaree, vomă şi

hematurie macroscopică, constatate în ultimele 2 zile. La internare s-a constatat că

pacientul era febril (38°C) şi prezenta hipertensiune arterială (TA = 220/120 mmHg).

După o săptămână, în timpul internării, a apărut oligurie şi a fost trimis la un spital de

un nivel superior. A evoluat spre anurie şi a necesitat dializă peritoneală.

După 4 săptămâni de la internare, anuria a continuat să persiste, asociindu-se cu

episoade de vomă; TA a putut fi controlată medicamentos.

A fost transferat la spital de nivel superior.

Examenul clinic la internare a arătat o stare generală relativ bună, edem prezent în

pătrimea distală la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, înălţime = 157 cm, TA

= 100/70 mmHg, 26 respiraţii/minut, 76 bătăi cardiace/minut. A fost menţinut în dializă

peritoneală continuă.

243

Rezultatele analizelor de laborator la această internare au fost următoarele: hematocrit

28%, hemoglobină 9,2 g / dl, proteine totale 8,2 g%, albumină 2,9 g%, Na = 138 mEq/l, K =

4,3 mEq/l, Ca = 8,4 mg%, P = 8,6 mg%, Mg = 1,5 mg%, uree = 172 mg%, creatinină =

18,3 mg%; factor antinuclear negativ.

Ecografia renală a fost în limite normale pentru vârsta lui.

Datorită prezenţei vărsăturilor, s-a indicat efectuarea endoscopiei digestive (în a doua zi

de la ultima internare), evidenţiindu-se hernie hiatală şi duodenită (la examenul

microbiologic nu s-a identificat H. pylori). A primit tratament cu domperidonă şi omeprazol,

în urma căruia greaţa şi vărsăturile au dispărut.

În a 5-a zi de la internare s-a efectuat o biopsie renală, iar diagnosticul a fost:

glomerulonefrită proliferativă difuză endocapilar exsudativă, cu 17% proliferări celulare. La

examenul în imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în structura

capilarelor şi arteriolelor. Prin examenul cu ajutorul microscopului electronic s-au observat

depozite electronodense mezangiale, subendoteliale şi subepiteliale.

În ziua a 14-a de la internare s-a iniţiat tratament („puls-terapie” / doze mari

administrate pentru perioade scurte) cu metilprednisolon 1g i.v. şi prednison, pe cale orală,

40 mg/zi. După a 3-a zi de corticoterapie s-a continuat cu prednison 40 mg/zi.

În a 20-a zi de internare, datorită unei HTA acută, pacientul a primit propanolol şi

minoxidil.

Abia din a 26-a zi de internare, pacientul a prezentat diureză de 10 ml/zi, iar după încă

trei zile diureza a ajuns la 120 ml/zi (cu hematurie macroscopică).

Rezultatul analizelor de laborator în a 4-a săptămână de la ultima internare au fost:

uree = 80 mg%, creatinină = 3,5 mg% (o valoare încă foarte mare, dar de circa 5 ori mai

mică decât în momentul internării), clearance-ul creatininei = 13ml /min /1,73

m2 (suprafaţa corporală), ASLO = 974 UI/ml, C3 = 48,4 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%).

În a 29-a zi de la internare diureza a ajuns la de 900 ml iar TA era fost ţinută sub control.

În aceste condiţii, pacientul a fost externat, şi s-a recomandat să revină la control,

săptămânal.

După încă două săptămâni diureza s-a menţinut la de 900-1000 ml/zi, valoarea pentru

uree a fost de 50 mg% iar pentru creatinină de 2,1 mg%; nu a mai fost necesară dializa, dar

s-a menţinut tratamentul antihipertensiv.

Al doilea caz

O pacientă de sex feminin, în vârstă de 66 ani, a fost internată în spitalul Facultăţii de

Medicină din localitatea de reşedinţă.

Motivele internării au fost reprezentate de: anorexie, diureză scăzută şi hematurie

macroscopică. La internare s-a văzut că pacienta este apatică şi prezintă tuse cu

expectoraţie spumoasă.

Prin anamneză s-a aflat că în urmă cu circa o lună, pacienta a făcut o infecţie

orofaringiană, pentru care a primit tetraciclină.

Examenul clinic la internare a relevat o stare generală bună, absenţa temperaturii,

greutate = 63 kg, înălţime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bătăi cardiace / minut, 20

244

respiraţii / minut, jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat

palpabil la 5cm sub rebordul costal.

Au fost înregistrate următoarele valori pentru analizele de laborator efectuate:

hematocrit 40,2%, hemoglobină 13,5 g/dl, număr leucocite = 15.600/mm3. Examenul de

urină a arătat o densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fără glicozurie, hematurie =

3+, hemoglobinurie = 3+, leucocite, hematii şi cilindri numeroşi în sedimentul urinar iar

urocultura a fost negativă.

După 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au

avut următoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumină = 3,6 g%, globuline = 2,8 g

%, glicemie = 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid

uric = 10,6 mg%, uree = 174 mg%, creatinină = 1,84 mg%, proteina C reactivă = 100

mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-

500 µg/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a fost absent.

Examenul ecografic renal a fost în limite normale.

Funcţia renală s-a deteriorat progresiv, şi în aceste condiţii, la 20 de zile de la internare,

ureea a ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul

creatininei la 5,34 ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h.

S-a efectuat o biopsie renală care a evidenţiat o glomerulonefrită proliferativă difuză

endocapilar exsudativă, cu necroză tubulară acută (25% proliferări celulare). La

imunofluorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C3 în capilare şi mezangiul

arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale şi subepiteliale.

În acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrită acută post-infecţioasă.

Pacienta a primit un tratament în urma căruia funcţia renală s-a ameliorat progresiv, iar

la 6 zile ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% şi clearance-ul

creatininei = 14 ml/min, moment în care a fost externată (la cerere).

După aproximativ două săptămâni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea

diurezei era scăzută, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinină = 3,17

mg, clearance-ul creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneică şi

prezenta fatigabilitate intensă.

A doua biopsie a demonstrat înrăutăţirea tabloului anterior, cu 80% proliferări celulare

şi 42% scleroză glomerulară şi necroză fibrinoidă pe arterele mici, cu depozite de C1q, C3,

IgG şi fibrină.

Pacienta a evoluat foarte rapid către IRA. După 3 săptămâni s-a început dializa. După 9

săptămâni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept şi şoc septic, urmat de deces.

18. 9. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

 

Ȋntrebarea 1

Este corectă afirmaţia:

a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac „in situ”

245

b). Complexul imun se formează în ţesuturi sau este fixat secundar

c). Reacţia Arthus a fost descrisă după injectarea subcutanată de ser de iepure la un cal

hiperimunizat.

d). Boala serică se caracterizează prin febră, artralgii, vasculită cutanată survenită

imediat după injectarea de ser de cal hiperimunizat

 

Ȋntrebarea 2

Care dintre următoarele nu este fază a bolii serice acute?

a). faza leziunilor vasculare

b). faza anterioară imunizării

c). faza de restitutio ad integrum

d). faza complexelor imune

 

Ȋntrebarea 3

Următoarea afirmaţie „leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este

urmată de un aflux de neutrofile” este valabilă:

a). pentru reacţia Arthus

b). pentru boala serului

c). atȃt pentru reacţia Arthus cȃt şi pentru boala serului

d). pentru nici una dintre ele.

 

Ȋntrebarea 4

Printre principalele afecţiuni umane datorate HS de tip III nu se numără:

a). boala plămânului de fermier

b). lupusul eritematos diseminat

c). cardita reumatismală

d). glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice.

 

Ȋntrebarea 5

Depunerea complexelor imune este dependentă de:

a). permeabilitatea presională

b). regimul presional crescut

c). prezenţa turbulenţelor

d). nici una dintre mențiunile de mai sus

e). primele 3 afirmații sunt corecte.

18. 10. Hipersensibilitatea de tip IV (întârziată, mediată celular)

Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie (mai) întârziată, care apare la 48-72 de

ore după contactul cu antigenul şi se datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de

tip IV este un tip exagerat de răspuns imun celular.246

HS de tip IV poate fi considerată ca un martor al mecanismelor protective față de

germenii intracelulari dar şi de alte substanţe chimice care se leagă puternic de membrana

celulară. Totuşi, corelaţia protecţie-hipersensibiltate nu e perfectă, în sensul că se poate ca

un pacient cu HS de tip IV la un anumit germen să dezvolte infecţii progresive cu acel

patogen (ex. situația din infecțiile cu M. leprae).  

Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele

trei sunt importante în patologia umană.

- Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om);

- Hipersensibilitatea de contact

Este o reacţie epidermică, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de

contact. În experimentele pe animal se plasează pe piele diferite antigene, care penetrează

uşor în epiderm şi se leagă solid de celule. Cel mai frecvent se utilizează DNCB

(dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este

un exemplu de haptenă care sensibilizează aproape toţi contacţii, şi pe care o putem folosi

ca să stimulăm imunitatea mediată celular.

Un rol important în sensibilizare îl joacă keratinocitele şi celulele Langerhans.

Reacţia de hipersensibilitate de contact survine după ce animalul a fost sensibilizat în

prealabil. După o injecţie ulterioară intradermică sau după aplicarea antigenului pe

tegument,  urmează legarea haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o

celulă Langerhans care se va activa, matura şi îşi va începe migrarea spre zona

paracorticală a nodulilor limfactici sub acţiunea IL-1 şi TNF secretaţi de keratinocitele

agresate.

Corespunde unei  infiltrări dermice şi epidermice, edemului epidermic şi eritemului

apărut după 48-72 ore, care va persista câteva zile. Absenţa reacţiei se datorează unui

deficit imun celular. Sensibilizarea prealabilă cu DNCB (ex. la fotografii) poate declanşa un

şoc anafilactic la IgE.

Primele modificări apar începând cu a 6-a până la a 8-a oră după contactul cu alergenul;

LT activate şi cele cu memorie vor ajunge în circulatie şi ulterior în zona inflamată, alături

de monocite, unde vor îndepărta complexul haptenă-carrier. Ele înconjoară vasele

sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloşi şi infiltrează epidermul.

Infiltratul celular se accentuează progresiv şi ajunge maxim spre a 72-a oră.

Infiltratul conţine celule T CD4+ (în majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage

şi bazofile.

Aceleaşi keratinocite, dar şi macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al

reacţiei inflamatorii.

LTs intervin de asemenea în terminarea reacţiei de HS (la fel ca şi ultravioletele), prin

scăderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhibă direct şi celulele Langerhans.

Ȋn concluzie, fenomenele apar în următoarea succesiune: celulele Langherhans

activează LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g şi GM-CSF.

Celelalte celule sunt recrutate şi activează o reacţie inflamatorie în care predomină celulele

mononucleare.

- Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12)

247

Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania

tropica etc.) / sau care vin în contact cu substanţele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot

provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate.

În laborator, pentru sensibilizare se injectează la un animal Ag împreună cu adjuvantul

complet Freund (pregătirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamidă permite şi

utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Această fază de sensibilizare începe cu 2-3

săptămâni înainte de testarea HS.

După injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migrează în

jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreţia de interleukine care

recrutează alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm şi

atinge un maxim la 48-72 ore după injecţie. Celulele observateiniţial sunt LT [predomină T

CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)], ulterior încep să se acumuleze macrofagele (atingând un

maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare).

Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge şi epidermul; keratinocitele

exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore după apariţia infiltratului

limfocitar, fapt care va amplifica răspunsul imun al gazdei), circulaţia aferentă şi eferentă a

celulelor imunocompetente seamănă cu cea observată în hipersensibilitatea de contact; se

poate observa o infiltrare uşoară cu bazofile; în timp se poate dezvolta o reacţie

granulomatoasă.

La om se practică intradermoreacţia cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat,

un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea

rezultatului se face după 72 ore, asigurând o bună iluminare a zonei examinate (de preferat

lumina naturală). Se identifică existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee,

circumscriind urma înţepăturii dermice. Apoi se apreciază tactil (prin repetate mişcări într-

un sens şi altul deasupra zonei de reacţie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de

induraţie (percepută ca fiind reliefată) şi care corespunde histopatologic infiltraţiei dermice

(edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat.

Se măsoară şi se înregistrează „diametrul maxim” al zonei de infiltraţie (a se vedea

şi anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în

mod normal în 5-7 zile; persistenţa acestora face ca leziunea să se transforme dintr-una

tuberculinică într-una granulomatoasă.

- Hipersensibilitatea granulomatoasă

Este o formă mai gravă de hipersensibilitate (întârziată) de tip IV care survine atunci

când antigenul persistă şi nu poate fi eliminat. Se caracterizează printr-o acumulare şi o

proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile după

sensibilizare şi poate să persiste mai multe săptămâni. Hipersensibilitatea granulomatoasă

poate succeda diferite hipersensibilităţi întârziate precedente, în general după o perioadă

de 3 - 4 săptămâni.

Elementul distinctiv al hipersensibilităţii granulomatoase este formarea de celule

epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii

reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a întreţine inflamaţia prin secreţia continuă de

TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame, însă nici nu se apără eficient

248

împotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor

epiteloide rezultă celule gigante. Mai sunt denumite şi celule Langhans. Atenţie, sunt

diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai mulţi nuclei, însă periferici,

reticulul endoplasmic este puţin dezvoltat, iar mitocondriile şi lizozomii sunt în degradare.

Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa finală din diferenţierea

macrofagelor.

Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot fi observate în

trei grupe principale de afecţiuni:

1. Eczema de contact care poate apărea datorită bijuteriilor care conţin nichel,

produselor din piele de animal, produselor cu săruri de crom, cremelor „solare”, compuşilor

chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc;

2. Maladii infecţioase în care agenţii patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză,

lepră, leishmanioză, listerioză, micoze profunde etc);

Ȋn cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoasă conţine pe lȃngă macrofage, celule

epiteloide, celule gigante şi LT dispuse centrifug, şi o zonă de necroză centrală, un fel de

puroi numit cazeum. Ȋn jurul întregului ansamblu se află o zonă de fibroză şi o cantitate

crescută de colagen.

Ȋn cazul M. leprae, reacţia granulomatoasă se numeşte reacţia Mitsuda.

Apariţia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză

unei alte persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim. 

3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B şi C, SIDA,

infecţia HIV, poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

18. 11. Povestire adevăratăUn tuberculom, o tumoră malignă sau

sarcoidoză?Tuberculoza sistemului nervos central se poate prezenta ca meningită tuberculoasă,

sub formă de tuberculoame sau, rareori, sub formă de abcese. Examenul clinic este de

obicei nespecific, în faza acută putând sugera o tumoră malignă (25-85% dintre pacienţi

sunt asimptomatici). Localizările extracerebrale trebuie investigate sistematic.

Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, în vârstă de 53 de ani, internat

pentru slăbiciune musculară la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv.

Investigaţiile de laborator au fost în limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul

tomografic (CT) cranian a revelat o leziune masivă în lobul parietofrontal drept, cu zone

omogene perilezionale relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare

cerebrală; examenul RMN a confirmat existenţa şi dimensiunile leziunii.

Datorită simptomatologiei şi valorilor crescute ale reactanţilor de fază acută, s-a început

terapia cu corticosteroizi, pacientul prezentând o remisie a simptomelor. S-a efectuat

biopsie din zona afectată, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide

dar fără necroză. S-au realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen şi PAS; nu au fost

249

evidenţiate microorganisme iar decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre

laboratorul de bacteriologie.

Pentru a se elucida motivul apariţiei acestei leziuni, au fost realizate şi o serie de

investigaţii extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar şi bronhoscopie) fără

a se obţine date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv.

În aceste condiţii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoză localizată la nivelul

SNC iar pacientul a fost externat, continuând la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi,

conform scrisorii medicale eliberată în spital.

După 2 luni bărbatul a fost reinternat cu deficienţe motorii şi febră (38,2ºC). S-a indicat

din nou examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltându-se

produse din mai multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea

diagnosticului de tuberculoză diseminată.

S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a început tratamentul anti-tuberculos cu o

asociere de 4 medicamente (izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă şi etambutol).

După 4 luni simptomele au reapărut şi s-a luat decizia intervenţiei chirurgicale, pentru

excizia formaţiunii. Analiza anatomo-patologică a pus în evidenţă structura tipică pentru

granulomul tuberculos (ceea ce prin biopsia „oarbă” efectuată cu câteva luni înainte, nu s-a

reuşit). Tratamentul a continuat, dar a fost adăugată amikacina, penta-terapia anti-TB

realizându-se pentru o durată de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacţii adverse. După un

an, au fost scoase din asocierea medicamentoasă 3 medicamente iar pacientul a primit

pentru încă 6 luni (durata totală a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazidă

şi rifampicină.

Discuţii

Tuberculoza cerebrală are o rată de mortalitate care variază între 5 şi 60%. Tratamentul

de elecţie este cel medicamentos, cu o durată de circa 18 luni, până la dispariţia leziunilor

sau până la calcificarea acestora. O creştere paradoxală în dimensiuni a leziunii, sub

tratament, poate duce la recomandarea intervenţiei chirurgicale de excizie a

tuberculomului, aşa cum s-a întâmplat şi în această situaţie.

18. 12. Verificați-vă cunoștințeleAlegeți răspunsul corect.

Ȋntrebarea 1

Alegeţi răspunsul greşit:

a). HS de tip IV reprezintă o reacţie imediată;

b). HS de tip IV apare la 48-72 de ore după contactul cu antigenul;

c). HS de tip IVse datorează limfocitelor Th1 specifice antigenului;

d). HS tip Jones-Motenu are echivalent la om;

 

Ȋntrebarea 2

Alegeti dintre următoarele afirmaţii adevărate pe cea care nu se potriveşte în context

(ca sens de desfăşurare a reacţiilor imune):

250

a). Ultravioletele inhibă direct celulele Langerhans, care au un rol important în

sensibilizare

b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvoltă granuloame

c). Absenţa reacţiei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datorează unui

deficit imun celular

d). Keratinocitele exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore după

apariţia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica răspunsul imun al gazdei

 

Ȋntrebarea 3

Alegeţi varianta care se potriveşte pentru spaţiile libere din următoarea afirmaţie:

”Intradermoreacţia la .................... presupune apariţia unei eventuale arii

intens..................., circumscriind urma înţepăturii dermice, ...................... si reliefate, care

corespunde histopatologic infiltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN),

reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat”

a). tuberculină; eritemato-violacee, indurate

b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate

c). tuberculină; cianotice; retractile

d). bacil Koch; cianotice; indurate

 

Ȋntrebarea 4 (aveți de stabilit asocierea corectă)

1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermică de tuberculină se rezolvă în mod

normal în...........

2). Citirea rezultatului se face după...........

3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezintă o reacţie întârziată, care apare la...............

a). 5-7 zile

b). 48-72 ore

c). 72 ore

Care este asocierea corectă?

a). 1-a; 2-b; 3-c

b). 1-c; 2-b; 3-a

c). 1-a; 2-c; 3-b

d). 1-b; 2-a; 3-c

 

Ȋntrebarea 5

Care dintre următoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om?

a). Hipersensibilitatea tuberculinică

 b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote;

c). Hipersensibilitatea de contact

d). Hipersensibilitatea granulomatoasă

251

18. 14. Hipersensibilitatea de tip V

În cadrul acestui tip de reacţie fiziopatologică, anticorpii nu se ataşează de structurile

celulare de suprafaţă ci de receptori membranari, împiedică aderarea liganzilor specifici

acelor receptori („mimează” efectul ligandului). În aceste condiţii, semnalizarea celulară

este compromisă, iar funcţia celulei respective este alterată sau inhibată.

Acest tip de HS este întâlnit în boala Graves (Basedow) şi miastenia gravis.

Boala Graves, o afecţiune a glandei tiroide (guşă exoftalmică, tegument cu aspect de

„coajă de portocală”, hipertiroidism) a fost considerată o boală autoimună, în care

organismul produce autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) şi

autoanticorpi anti-tiroxină şi anti-tireoglobulină (mecanismul nu a fost elucidat complet).

Celulele foliculare tiroidiene (prezintă pe suprafaţă receptori pentru TSH), sunt

stimulate atât fiziologic de către hormonul hipozar, cât şi patologic, de către autoanticorpii

(de tip IgG) care „imită” structura şi funcţiile TSH. Această dublă stimulare conduce la o

hipersecreţie de hormoni tiroidieni (T3 şi T4), putând provoca tireotoxicoză. Simptomele din

hipertiroidism pot fi, parţial, explicate de către aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia

poate fi explicată prin faptul că atât glanda tiroidă şi muşchii externi ai globului ocular

prezintă un Ag comun care este recunoscut de către auto-Ac; rezultă un proces inflamator

retroocular şi protruzia globilor oculari. Aspectul de „coajă de portocală” al pielii se

datorează infiltrării de Ac subcutanat, determinând un proces inflamator la acest nivel.

Miastenia gravis este o boală neuromusculară caracterizată clinic prin hipotonie

musculară intermitentă (accentuată în efort, ameliorată în repaus) şi oboseală musculară.

Mecanismul de producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai

acetilcolinei de către auto-Ac circulanţi, care ajung la nivelul joncţiunii musculare post-

sinaptice.

19. Reacţii antigen - anticorp utilizate în microbiologie 19. 1. Mecanism general

Reacţia antigen-anticorp este o reacţie între un antigen (Ag) şi un anticorp (Ac) şi

constă în legarea grupării determinante de pe suprafaţa antigenului (epitop - o

„proeminenţă”) cu situsul de combinare de pe suprafaţa anticorpului (paratop - o

„adâncitură”). (Figura nr. 1)

Reacţia Ag-Ac are 2 proprietăţi principale, specificitatea şi reversibilitatea.

Specificitatea se referă la faptul că un antigen nu este recunoscut decât de anticorpii

care au fost produşi în urma inoculării respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc

252

decât antigenul faţă de care au apărut. Trebuie menţionat că specificitatea nu este

absolută, întrucât un Ag cu reactivitate încrucişată, poate reacţiona cu un Ac format faţă de

un alt antigen (reacţia încrucişată se explică prin aceea că anumite Ag posedă anumite

grupări determinante comune).

Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datorează faptului că legăturile necovalente

sunt reversibile la cald sau pH acid (<3).

Legarea antigenului cu anticorpul este determinată de complementaritatea reciprocă

dintre conturul suprafeţei epitopului şi paratopului, care apropie la câţiva Angstromi

grupările chimice care le alcătuiesc, permiţând stabilirea unor forţe intermoleculare între

epitop şi paratop (hidrofobe între grupările nepolare, de atracţie electrostatică între

grupările ionizate de semn contrar).

Iniţial are loc cuplarea între Ag şi Ac rezultând complexe Ag-Ac mici, solubile, care se

pot desface relativ uşor. În continuare, datorită existenţei mai multor situsuri de legare,

complexele Ag-Ac mici se reunesc formând structuri de dimensiuni mai mari, adevărate

reţele Ag-Ac, care pot fi evidenţiate fie direct, fie după utilizarea unor artificii tehnice (19.4.,

19.5).

19. 2. Bazele moleculare ale interacţiunii Ag-Ac

Reacţia dintre antigen (Ag) şi anticorp (Ac) necesită interacţiunea determinantului

antigenic (epitop) cu situsul de combinare al anticorpului (paratop).

Factorii care condiţionează interacţiunea Ag-Ac sunt:

- complementaritatea structurală dintre epitop şi paratop (reacţia este specifică);

complementaritatea presupune adaptarea conformaţională a celor două grupări, de tipul

„cheie în broască” (vezi şi 17. 1.); Fiecare anticorp posedă, în porţiunea Fab, o regiune

hipervariabilă care constă în 3 bucle de legătură între pliurile β adiacente ale domeniilor

variabile de la nivelul lanţului greu (VH) şi celui uşor asociat (VL). Aceste fragmente mai

poartă denumirea de CDR (complementarity-determining regions) sau fragmente ce

determină complementaritatea în reacţia cu antigenul. Însă într-o reacţie Ag-Ac, nu doar

aminoacizii din CDR interacţionează cu epitopul, ci şi alte porţiuni din regiunea variabilă,

uneori existând posibilitatea ca o porţiune CDR să nici nu fie implicată în reacţie.

- complementaritatea electrochimică a grupărilor care intră în reacţie este o consecinţă

a complementarităţii structurale; pentru stabilizarea legăturii intră în acţiune forţe

intermoleculare, care sunt legături necovalente, forţe nespecifice cu valoare mică, spre

exemplu

     legături de hidrogen / energie de legare 3-7 kcal / mol;

     forţe electrostatice (coulombiene sau ionice) / energie de legare 5 kcal / mol;

     legături van der Waals / energia de legare 1-2 kcal / mol

     legături hidrofobe.

253

Complementaritatea structurală sau forţele intermoleculare nu sunt suficiente, fiecare

în parte, pentru a forma legături stabile; este necesară îndeplinirea ambelor condiţii. Cu cât

energia de legare a reactanţilor este mai mare, cu atât complexele Ag-Ac sunt mai stabile.

Fiecare determinant antigenic poate avea o structură liniară – lucru posibil pentru orice

tip de moleculă: proteină, carbohidrat, lipid, acid nucleic – iar în cazul proteinelor, în plus

faţă de secvenţa liniară, un epitop poate fi determinat de conformaţia proteinei – structura

terţiară. Astfel se definesc două tipuri de epitopi: liniari şi conformaţionali.

Pe o proteină se pot găsi ambele tipuri de epitopi, crescând astfel şansele ca aceasta să

interacţioneze cu paratopul specific.

Pe de altă parte, secvenţele de aminoacizi cunoscute de anticorpi pot fi ”ascunse” în

cadrul proteinei, reacţia Ag-Ac neputând avea loc.

Aranjamentul spaţial al epitopilor pe o proteină poate influenţa modul de legare a Ac.

Astfel că atunci când determinanţii antigenici se situează la o distanţă netă unul faţă de

celălalt, anticorpii se pot lega fără să se suprapună. Când epitopii sunt foarte apropiaţi,

între anticorpii specifici apar restricţii de natură sterică, ajungând să se suprapună.

 Legarea unui anticorp de epitop poate conduce, în cazuri mai rare, la modificarea

conformaţională a unui alt epitop, cu consecinţe pozitive sau negative asupra reacţiei Ag-

Ac. Acest efect se numeşte efect alosteric, iar mecanismul este asemănător celui asociat

enzimelor alosterice la care centrul activ se poate modifica după ce enzima a interacţionat

cu un cofactor activator sau inhibitor.

Interacţiunea dintre epitop şi paratop este definită de 2 parametri (afinitatea şi

aviditatea anticorpilor). (Figura nr. 2)

·         Afinitatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop. Afinitatea este

rezultanta forţelor de atracţie şi de respingere care mediază interacţiunea celor doi

reactanţi. O interacţiune cu afinitate înaltă presupune structuri complementare perfecte, în

timp ce complementaritatea imperfectă a grupărilor reactante determină o afinitate

scăzută, deoarece forţele de atracţie sunt active numai pe distanţe foarte mici şi sunt

diminuate de forţele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate măsura prin dializă la

echilibru. Afinitatea reprezintă caracteristica unei singure perechi Ag-Ac şi este definită

printr-o constantă, (Kd), care relevă cât este de uşor să desparţi un complex Ag-Ac în

componentele sale. Când Kd este scăzut, afinitatea este crescută. În serul uman, anticorpii

au diferite afnităţi faţă de antigene, lucru determinat în principal de secvenţele din CDR.

·         Aviditatea este un parametru al interacţiunii Ag-Ac care rezultă din multivalenţa

Ag. Cele mai multe Ag posedă mai mult decât un epitop. De exemplu, bacteriile,

polizaharidele etc, au pe suprafaţă un număr mare de epitopi repetitivi (antigene

multivalente). Ag proteice au epitopi multipli, dar diferiţi. Antigenele multivalente leagă un

număr echivalent de molecule de anticorpi. Energia totală de legare a epitopilor multipli ai

unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioară în comparaţie cu energia separată a

fiecărei interacţiuni dintre epitop şi paratop. Aviditatea caracterizează energia medie de

legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici şi măsoară forţa rezultantă a afinităţii dintre

epitopii multipli ai unui Ag şi paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de

antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificilă, deoarece este necesară

254

ruperea tuturor legăturilor existente. O moleculă pentamerică de IgM care are afinitate

scăzută faţă de un antigen multivalent, poate să se lege ferm de Ag, reacţia având

aviditate crescută datorită însumării interacţiunilor de joasă afinitate dintre fiecare epitop şi

paratop.

Spre exemplu, luând în considerare ceea ce se întâmplă în cursul RIP şi RIS:

·         Anticorpii din clasa IgM, care apar în RIP au afinitate mare şi aviditate mică

pentru Ag (se cuplează uşor cu epitopul, dar legătura durează puţin);

Anticorpii din clasa IgG, care apar în RIS au afinitate mică, dar aviditate mare pentru Ag

(şi legăturile sunt mult mai stabile).

19. 3. Reacţii încrucişateÎn anumite cazuri pot avea loc reacţii încrucişate; un Ag reacţionează cu un Ac care a

fost sintetizat faţă de un alt Ag (aceste reacţii pot apărea de ex. datorită faptului că

anumite Ag posedă anumite grupări determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-

polizaharid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutinează eritrocitele umane de grup

A (cu specificitate antigenică conferită de N-acetil-galactozamină), iar serul imun anti-

Escherichia coli aglutinează eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenică

conferită de galactoză). Persoanele ”alergice” la diferite mâncăruri sau substanţe, pot

dezvolta foarte uşor alte stări de hipersensibilitate la structuri asemănătoare.. De exemplu

un individ ”alergic” la alune, poate să dezvolte ”alergie” şi faţă de soia, mazăre sau alte

seminţe.

19. 4. Stadiile reacţiilor antigen-anticorp

·         Interacţiunea primară se datorează legării efective a Ac de Ag şi depinde în

mod direct de cantitatea şi afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reacţiile Ag-Ac în

care reactanţii se află în interacţiune primară pot fi puse în evidenţă

prinnefelometrie (reacţie de precipitare în mediu lichid în care folosindu-se lumina laser,

se pun în evidenţă complexele Ag-Ac; razele laser sunt dispersate de complexele în soluţie

şi apoi focalizate cu ajutorul unei lentile spre un fotometru; aici se prelucrează semnalul

luminos şi pe baza lui se face o curbă de determinare a concentraţiei complexelor imune).

·         În cazul unora dintre tipurilor de reacţii care vor fi discutate în capitolele

următoare, interacţiunea primară nu devine vizibilă (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni

mici, solubile şi se pot desprinde uşor). In vivo aceste interacţiuni sunt spre exemplu

necesare şi suficiente în vederea neutralizării unor exotoxine circulante (difterică, botulinică

etc), pentru inhibarea activităţii unor bacterii sau virusuri, sau în declanşarea unor reacţii

de hipersensibilitate (ex. în reacţia de HS de tip I).

·         Interacţiunile secundare apar la circa 30 de minute după interacţiunile

primare. Datorită faptului că Ag poate avea mai mulţi epitopi iar Ac are minim 2 paratopi

255

(minim 2 pentru molecule de anticorpi izolate, precum IgE, IgD, IgG, dar în cazul IgM sunt

10 paratopi – molecula stabilă de IgM este pentamerică, iar în cazul IgA, 4 paratopi, IgA

secretorii fiind complexe dimerice) complexele primare mici, solubile, interacţionează între

ele formând complexe secundare, produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reţea

tridimensională, insolubil, mult mai stabil decât complexele primare. Din punct de vedere

diagnostic, reacţiile Ag-Ac în care reactanţii se află în interacţiune secundară pot fi puse în

evidenţă prin tehnici care vor fi enumerate în finalul acestui capitol şi discutate în capitolele

următoare. In vivo, manifestările interacţiunilor secundare sunt dependente de natura

reactanţilor şi de condiţiile de reacţie.

·         Interacţiunile terţiare definesc manifestările in vivo ale reacţiilor Ag-Ac şi

depind în special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interacţiunile terţiare

pot conduce la un rezultat pozitiv (protecţia gazdei) sau negativ (degradare tisulară).

19. 5. Tipuri de reacţii Ag-AcÎn funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmărit

există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, după cum urmează:

·         reacţii de precipitare

o   pot avea loc în gel (imunodifuzia radială simplă Mancini, dubla difuzie Ouchterlony

etc) sau

o   pot avea loc în mediu lichid (reacţia Ramon, Ascoli etc.)

·         reacţii de aglutinare

o   se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex. reacţia Huddleson) sau

o   se pot folosi în diagnosticul serologic (ex. reacţia Wright)

·         reacţia de fixare a complementului (RFC)

o   în diagnosticul serologic al sifilisului (RBV – Reacţia Bordet-Wasserman),

leptospirozei etc.

o   în diagnosticul serologic al infecţiilor virale etc.

·         reacţii de seroneutralizare

o   reacţia ASLO (în diagnosticul serologic al infecţiilor streptococice)

o   testul plăcilor semineutralizate

o   diferite intradermoreacţii cu mecanism imun umoral etc.

·         reacţii în care componentele sunt marcate

o   izotopic (radio immunoassay, RIA)

o   enzimatic (enyzme-linked immunoassay, ELISA)

o   fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)

o   chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

19. 6. Povestire adevărată 

256

Utilizarea ASLO în diagnosticul infecţiilor aparatului locomotor

 

Dintre patologiile infecţioase în ansamblu, infecţiile aparatului locomotor sunt printre

cele mai mortale şi mai greu de îngrijit. Un răspuns terapeutic satisfăcător depinde de

abordarea multidisciplinară a afecţiunii: chirurgia trebuie coroborată cu diagnosticul

microbiologic corect executat. În general există tendinţa de a se instaura un tratament

antibiotic empiric fără un diagnostic de laborator prealabil, iar dacă tratamentul nu se arată

eficient, se va aborda un altul, tot empiric, cu un spectru mai larg. Administrarea

antibioticului conform antibiogramei ar fi soluţia cea mai buna şi cea mai ieftină, dar

frecvent nu se recurge la ea.

Marea majoritate a infecţiilor aparatului locomotor sunt produse de stafilococi

(osteomielite, fasciite, miozite etc.), însa un procent de până la 7% au ca etiologie

streptococii. Într-un studiu retrospectiv la un spital din Geneva, a fost analizat un grup de

pacienţi cu infecţii musculo-scheletale dovedite clinic prin culturi şi cărora li s-a măsurat şi

titrul ASLO în dinamică în timpul internării. Doar 5 dintre cei 21 de pacienţi urmăriţi aveau

titrul ASLO crescut, iar agenţii patogeni identificaţi la aceşti pacienţi au fost: S. pyogenes si

streptococi β-hemolitici din grupurile C şi G. La restul de 16 pacienţi care aveau titrul ASLO

normal, germenii infectanţi au fost stafilococi, enterobacterii, streptococul β -hemolitic de

grup B şi bacilul piocianic. Din aceste date se constată că titrul ASLO a fost crescut doar în

infecţiile streptococice cu streptococi de grup A, C şi D şi nu în alte infecţii date de alţi

germeni.

        În literatura se cunoaşte că detectarea ASLO are drept scop identificarea aproape

exclusivă a infecţiilor provocate de S. pyogenes şi mai ales a sechelelor post-infecţioase

precum reumatismul articular acut, cardita reumatismală sau glomerulonefrita

poststreptococică. Se dovedeşte aşadar că titrul ASLO nu este o metodă specifică pentru

detectarea infecţiei exclusiv cu S.pyogenes.

        Streptolizina O este secretata de streptococii din grupurile A, C şi G şi

de Streptococcus canis. Măsurarea în dinamică a titrului ASLO este o metodă simplă şi

eficientă pentru a diagnostica infecţiile cu aceste tipuri de streptococi. Toţi dintre ei sunt

implicaţi în infecţii musculoscheletale şi toţi au rămas sensibili la penicilină. Aşadar la un

pacient cu semne de osteomielită sau fasciită la care nu se pot lua probe din produsul

patologic, este recomandat să se utlizeze măsurarea titrului ASLO şi dacă acesta este

foarte mare, balanţa se înclină către o infecţie streptococică, uşor de tratat cu penicilină.

Această abordare ar fi ideală pentru a reduce administrarea abuzivă de antibiotice cu

spectru larg, fiind nevoie doar de un test de laborator simplu şi sensibil.

19. 7. Verificați-vă cunoștințeleÎntrebările au un singur răspuns corect.

257

1. Ce presupune o reacţie antigen-anticorp?

A. activarea sistemului complement

B. interacţiunea dintre determinantul antigenic (epitop) şi fragmentul corespunzător din

molecula anticorpului (paratop)

C. pH şi temperaturi extreme

D. neapărat prezenţa unei bacterii în sânge

E. opsonizarea particulei patogene

2. Specificitatea recţiei antigen-anticorp:

A. este absolută

B. este o măsură a compatibilităţii structurale şi electrochimice între antigen şi anticorp

C. descrie ce forţă este necesară pentru a separa un complex imun în componentele sale

D. reprezintă o caracteristică prin care un antigen este recunoscut de un anumit anticorp

compatibil, iar anticorpul recunoaşte doar antigenul respectiv

E. nu permite apariţia reacţiilor încrucişate

3. Care este afirmaţia falsă?

A. între epitop şi paratop nu se stabilesc legături covalente, ci forţe intermoleculare

B. un determinant antigenic liniar nu este recunoscut de anticorpul specific

C. o reacţie antigen-anticorp este reversibilă deoarece între cei doi reactanţi nu se stabilesc

legăuturi greu de scindat

D. un anticorp specific unui antigen poate să lege un alt antigen înrudit datorită

fenomenului de „reacţie încrucişată”

E. epitopii conformaţionali sunt determinaţi de structura terţiară a proteinelor

4. Despre afinitate şi aviditate este adevărat că:

A. sunt caracteristice doar moleculelor IgG

B. sunt sinonime

C. sunt parametri ai interacţiunii antigen-anticorp şi au semnificaţie diferită

D. nu se pot defini în cazul unei reacţii încrucişate

E. aviditatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop

5.  În cursul unei reacţii antigen-anticorp:

A. există 3 stadii de desfăşurare

B. este un stadiu al interacţiunilor primare care se pot pune în evidenţă prin reacţii de

precipitare, aglutinare, fixare a complementului etc.

C. nu se formează complexe imune care pot să precipite

D. toţi anticorpii au aceeaşi afinitate şi aviditate faţă de antigenele implicate

E. in vitro, în oricare stadiu al reacţiei, complexele imune sunt vizibile cu ochiul liber

258

20. Reacţii de precipitare şi reacţii de aglutinare 20. 1. Reacţia de precipitare

Reacţia de precipitare între Ag şi Ac poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în

unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultând complexe antigen-anticorp, care nu devin

insolubile şi stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale între antigen şi

anticorp, conform teoriei reţelei care presupune: un antigen cel puţin trivalent pentru

amplasarea anticorpilor, anticorp bivalent şi condiţii fizice favorabile precipitării (ex. Ac

puţin glicozilaţi / de tip IgG cu 3% glucide superiori celor IgM cu 10% glucide).

Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifică în evidenţierea prezenţei Ag (pentru

realizarea reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o anumită „cantitate” de Ag şi

Ac, care să se găsească într-un anumit raport / proporţie, iar Ag care participă la formarea

agregatelor sunt într-o cantitate proporţional mai mică, în raport cu Ac). În cadrul cursului

se discută diferitele situaţii legate de prezonă (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de

echivalenţă (Ag şi Ac se găsesc „în totalitate” în precipitat), exces relativ de Ag şi respectiv

postzonă (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definită şi noţiunea de

proporţie optimă.

20. 2. Clasificarea reacţiilor de precipitare

Reacţiile de precipitare se pot clasifica după cum urmează.

A. Reacţii de precipitare în mediu lichid

·         Reacţii de precipitare în amestec, reacţii de floculare

o titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc.,

o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin),

o RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, în diagnosticul serologic al sifilisului

·         Reacţii de precipitare în inel

o   reacţia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc.

·         Reacţii de precipitare în tub capilar

o   determinarea prezenţei proteinei C reactive,

o   determinarea prezenţei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc.

·         Dozajul nefelometric etc.

B. Reacţii de precipitare în mediu gelifiat

·         Imunodifuzia radială simplă (ex. metoda Mancini)

·         Difuzia dublă

o   metoda Elek,

o   difuzia dublă radială (Ouchterlony)

259

C. Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cu migrarea în câmp

electric

·         Imunoelectroforeza

·         Contraimunoelectroforeza

·         Electroforeza urmată de imunofixare

·         Electroimunodifuzia.20. 2. 1. Reacţii de precipitare în mediu lichidAu la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor

precipita atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii.

20. 2. 1. 1. Reacţii de precipitare în amestec

Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a

demonstra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative

de Ag şi Ac. Spre exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (metodaRamon) se pun în

contact, în amestec în tuburi, cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina

difterică, Ag) cu cantităţi variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maximă de

precipitat se găseşte în tubul unde există raportul de echivalenţă. Pentru sistemul toxină

difterică - anticorpi anti-toxină difterică (ca şi în cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi

anti-toxină tetanică), raportul de echivalenţă se „suprapune” peste proporţia optimă, astfel

încât se poate observa relativ uşor tubul în care apare cantitatea cea mai importantă de

precipitat. Cunoscând titrul anticorpilor, se află imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes

floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antitoxină = 1 UA = 1

unitate antitoxică). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în care titrul

anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.

În mod asemănător, prin metoda Dean şi Web se poate determina titrul

anticorpilor anti-toxici, cunoscând titrul toxinei.

20. 2. 1. 2. Reacţii de precipitare în inel

Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu

se amestece; reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel

de precipitare albicios. Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia

Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază

de carne (în industria alimentară).

Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli)

se poate utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de

la Bacillus anthracis). Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex.

splină) recoltate de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost

produs de o infecţie generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojarează

în soluţie de clorură de sodiu sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic,

apoi se menţinea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. După decantarea şi

alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea şi rezulta soluţia antigenică. Din punct de vedere

tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacţie şi 2 tuburi martor. În primul tub martor vom

pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml soluţie salină fiziologică iar în al doilea tub martor

vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de antigen. În ceea ce priveşte tubul

260

de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluţia de

antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, eventual prin „scurgere picătură

cu picătură” pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu se amestece.

În cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică), după circa 5 minute,

la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel” de precipitare.

20. 2. 1. 3. Reacţia de precipitare în tub capilar a fost utilizată pentru evidenţierea

prezenţei proteinei C reactive (CRP).

20. 2. 1. 4. Dozajul nefelometric: în prezenţa unei cantităţi constante de Ag sau Ac, se

formează complexe Ag-Ac care modifică intensitatea şi dispersia luminii direct proporţional

cu concentraţia de Ag sau Ac (principiul de măsurare este proporţionalitatea dintre

cantitatea de complex antigen-anticorp formată şi lumina „împrăştiată”). Cu ajutorul unui

nefelometru, care utilizează fascicule luminoase monocromatice intense şi a unei măsurări

a precipitatului în mediu lichid prin difracţie de raze luminoase, este posibilă dozarea

uşoară, reproductibilă a antigenului sau a anticorpilor, folosind o curbă de etalonare.

Nefelometria se utilizează curent şi determină cantitativ proteine specifice din ser şi urină

(IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobină, orosomucoid, fibrinogen, C3, C4, prealbumină, alfa1-

antitripsină etc).20. 2. 2. Reacţii de precipitare în mediu gelifiatUtilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită

concentraţie de agar în soluţie de tampon veronal, în aşa fel încât porii gelului să permită

migrarea), va duce la vizualizarea reacţiei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.

20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini)

Imunodifuzia radială simplă (Mancini) se bazează pe difuzia spontană şi radială a Ag din

proba de cercetat, într-un gel care conţine o cantitate constantă de anticorpi, determinând

apariţia unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia

de antigen din probă. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilă,

concentraţia Ac înglobaţi în gel trebuie să fie aleasă în funcţie de titrul acestora şi de

concentraţia Ag care urmează a fi testat. Metoda permite determinareacantitativă a

imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei,

siderofilinei etc.

Sunt necesare plăcuţe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel care

include Ac faţă de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. Există un cod al

culorilor şi spre exemplu, plăcuţele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraţiei

de IgG au culoare roşie, pentru IgA culoarea este albastră, pentru siderofilină culoarea este

portocalie etc. În gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de

cercetat şi un ser de referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre

ex. câte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). Înainte de pipetarea

serurilor în godeuri se realizează diluarea acestora, diluţia fiind ¼ pentru IgG, IgA şi

siderofilină şi respectiv ½ pentru IgM, complement C3 şi alfa1-antitripsină. Diluţia serului de

referinţă se face în funcţie de proteina care urmează a fi determinată. Cantitatea de ser

introdusă în fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru

serurile de cercetat).

261

După 10 minute de menţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la

37°C, cu stratul de gel poziţionat în sus, timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv 24 de

ore pentru celelalte componente. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din

plastic, o riglă specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se

va măsura iniţial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se află serul de

referinţă iar rezultatul obţinut trebuie să corespundă aşteptărilor (de ex. 6 mm pentru IgG

care a fost diluat ¼ şi astfel are concentraţia de 25 UI / ml). În cazul că rezultatul este cel

aşteptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de

cercetat; în caz contrar este necesară o „corecţie” (dacă spre exemplu diametrul este 6,5

mm în loc de 6 mm, din valoarea obţinută pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm).

După citirea diametrelor, se compară rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele iar cifra

obţinută se înmulţeşte cu diluţia probei (spre ex. dacă obţinem o valoare de 50 UI / ml

pentru IgG, vom înmulţi cu 4 pentru a obţine rezultatul real).

20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)

Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într-un gel.

Deoarece mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului,

iar distanţa parcursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul

concentraţiei sale şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară, migrarea reactanţilor

unul spre celălalt determină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. În

gelul transparent vor apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului sistemelor

Ag-Ac studiate.

Metoda certifică prezenţa sau absenţa proteinei cercetate. Se pot evidenţia alfa-

fetoproteina, proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa şi

lambda, produşi de degradare ai fibrinogenului (PDF) etc. În micologie, prin imunodifuzie se

poate identifica prezenţa exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces

dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenţa Ac faţă de Ag fungice, spre exemplu în

diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Această metodă este încă frecvent

utilizată pentru determinarea specificităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în

patologia umană.

Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%, lama putând fi

folosită pe parcursul unei zile (dacă acest lucru nu se poate îndeplini, lama trebuie păstrată

în cameră umedă, la temperatura frigiderului, pentru maxim o săptămână). În gelul de pe

lamă se perforează 3 grupe de godeuri, câte 7 godeuri în fiecare grup (1 godeu central şi 6

godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dacă spre exemplu dorim să determinăm

prezenţa proteinei C reactivă (CRP) în seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-

CRP, seruri de cercetat şi un ser de referinţă care conţine CRP. Numerotând godeurile

periferice, pipetăm Ac anti-CRP în godeul central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi

4. În celelalte godeuri pipetăm serurile de cercetat. Incubăm la 37°C, timp de 24 de ore, în

cameră umedă (într-o cutie Petri putem pune o bucată de vată îmbibată în soluţie salină

fiziologică, alături de lama respectivă). Liniile de precipitare pot deveni vizibile după 2-4 ore

dar sunt mult mai clare după 24 de ore.

262

Pentru citire pot fi necesare o lupă şi o sursă de lumină. Între godeul central şi godeurile

1 şi 4 (martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. În cazul în care de ex. în

godeul 2 există CRP, va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul nr. 2.

Este certificată prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul

central şi godeurile 1 şi 2) sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit”).

20. 2. 2. 3. Dubla difuzie Elek

Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini

de Corynebacterium diphteriae. În cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în

mediu iar după unirea cu Ac anti-toxină, complexele Ag-Ac vor da naştere unor linii de

precipitare.

Într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit, decupăm un şanţ pe

unul din diametre. În şanţul respectiv pipetăm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conţine Ac

anti-toxină difterică în concentraţie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în

mediu. După circa 2 ore însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină, de fiecare

parte a şanţului, o tulpină de Corynebacterium diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o

tulpină de Corynebacterium diphteriae ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat,

câte un striu (de fiecare parte a şanţului) pentru fiecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru 48

ore, dar urmărim zilnic apariţia culturii şi precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul

liniilor de însămânţare apare cultură bacteriană. Din cultura

de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzează în mediu. Unirea dintre Ag şi

Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar în mediu vor apărea linii de

precipitare în unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti-toxină. În cazul în care apar linii

de precipitare în unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti-toxină,

respectiva tulpină este toxigenă. Reacţia va fi negativă pentru martorul negativ şi pentru

tulpinile de cercetat ne-toxigene.20. 2. 3. Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este

combinată cu migrarea în câmp electric20. 2. 3. 1. Electroforeza proteică în gel

Electroforeza proteică în gel este folosită în laboratorul de imunochimie pentru

decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor într-un strat de gel care este

supus acţiunii unui câmp electric se va realiza diferenţiat, pentru fiecare structură proteică

în parte, în funcţie de greutatea moleculară şi încărcătura electrică a proteinelor. Pentru

vizualizare este necesară fixarea, uscarea şi colorarea liniilor de precipitare care corespund

fracţiunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o

componentă monoclonală).

20. 2. 3. 2. Imunoelectroforeza

Se asociază electroforeza în gel cu imunodifuzia dublă (realizându-se separarea prin

electroforeză a proteinelor în mediu gelozat, urmată de o imunodifuzie dublă utilizând un

antiser corespunzător). Reacţia Ag-Ac se va vizualiza prin apariţia unor arcuri de

precipitare. Este o metodă foarte utilă în studierea purităţii unui Ag (sau Ac), însă în mod

curent are indicaţii didactice. Datorită faptului că în boala pneumococică prin urină se

263

elimină cantităţi destul de importante de Ag K, prezenţa acestuia poate fi evidenţiată de ex.

prin imunoelectroforeză.

20. 2. 3. 3. Contraimunoelectroforeza

Contraimunoelectroforeza reprezintă o dublă difuzie în care deplasarea unul faţă de

celălalt a Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric. Pe o lamă de microscop se toarnă un

gel de agar 1% şi se perforează 3 grupe de perechi de godeuri, faţă în faţă. Metoda poate fi

utilizată pentru acele structuri antigenice care în câmp electric migrează către anod. Luând

în discuţie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, în godeurile

care vor fi poziţionate spre catod (polul negativ) pipetăm Ag iar în godeurile care vor fi

poziţionate spre anod (polul pozitiv) pipetăm Ac cunoscuţi, specifici Ag pe care dorim să-l

identificăm. Reacţia este mai rapidă şi mai sensibilă decât dubla difuzie deoarece migrarea

celor doi reactanţi unul către celălalt este amplificată de câmpul electric. Reacţia (apariţia

unei linii de precipitare între godeuri, în cazul în care în godeul catodic se găseşte Ag

presupus) poate fi citită după numai 30-90 minute în loc de 24 de ore aşa cum se întâmplă

în dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizată din punct de vedere istoric pentru

identificarea prezenţei Ag HBs. Se poate utiliza pentru identificarea antigenelor capsulare în

lichidul cefalorahidian la pacienţi cu meningită acută (Haemophilus influenzae, Neisseria

meningitidis, Streptococcus pneumoniae).

20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia

Electroimunodifuzia are la bază electroforeza probelor care conţin proteina-antigen,

într-un strat de gel, care conţine o cantitate constantă de anticorpi monospecifici (anti-

proteină antigen), rezultând zone de precipitare în formă de rachetă sau conuri, a căror arie

este direct proporţională cu concentraţia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare

decât IDRS.

20. 3. Reacţia de aglutinareÎn reacţia de aglutinare antigenele sunt de natură corpusculară. Reacţia de aglutinare

constă în reacţia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaţa unor particule (bacterii,

hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinând aglutinarea acestora prin scăderea

forţelor electrostatice de repulsie dintre particule şi formarea unor punţi de legătură.

Aglutinareaeste mai sensibilă decât precipitarea, Ag fiind o particulă şi nu o moleculă

solubilă. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanţi decât Ac de tip IgG (pentru că au mai

multe valenţe). Există şi Ac neaglutinanţi (incompleţi / blocanţi) sau care aglutinează numai

la rece.

20. 4. Câteva tipuri de aglutinareExistă mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta în

continuare, pe scurt, aglutinarea directă, aglutinarea indirectă, inhibarea aglutinării,

aglutinarea în coloană şi aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom

discuta reacţiile de aglutinare utilizate în bacteriologie şi micologie.

20. 4. 1. Aglutinarea directă

264

Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii,

celule) de către Ac specifici. Se poate utiliza în a. diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru

identificarea enterobacteriilor (Shigella, Salmonella, E. coli etc) sau a altor germeni Gram-

negativi (Vibrio cholerae) etc., pe baza structurii antigenice, în b. diagnosticul serologic al

unor boli infecţioase (febră tifoidă, bruceloză etc), c. pentru determinarea grupelor

sanguine (ABO) etc.

20. 4. 2. Aglutinarea indirectă sau pasivă

Este o reacţie în care particule artificiale (globule roşii formolate, particule de latex,

cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt „încărcate” in vitro cu Ag sau Ac şi sunt

aglutinate de către Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizează în

principal pentru decelarea factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului

streptococic etc.

20. 4. 3. Inhibarea aglutinării

Reacţia constă în inhibarea aglutinării particulelor „încărcate” cu Ag, după ce în

prealabil Ac reacţionează cu Ag corespondent. Se utilizează de ex. pentru decelarea

mioglobinei sau în diagnosticul imunologic al sarcinii.

20. 4. 4. Aglutinarea în coloană

Metoda permite o mai bună vizualizare a reacţiei. Dispozitivul utilizat are 2

compartimente, partea în care se introduc reactivii (situată superior) şi o coloană situată

inferior, plină cu microparticule de sticlă. După introducerea hematiilor şi a serului de

cercetat şi „incubarea” acestora, dispozitivul este centrifugat. În cazul unei reacţii pozitive

complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, în timp ce în cazul unei reacţii

negative, hematiile se depun în porţiunea inferioară a coloanei.

20. 4. 5. Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline

Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate” cu Ac şi vor duce la apariţia unor

aglutinate (prin apariţia complexului imun). Se utilizează spre exemplu în decelarea

factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).

20. 5. Utilizarea reacţiei de aglutinare în microbiologie

Vom prezenta atât exemple de utilizare a reacţiei de aglutinare în diagnosticul direct

cât şi în diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul că în cadrul diagnosticului de

laborator serologic se va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) Ac necunoscuţi, în

serul pacientului respectiv, utilizând Ag cunoscute. În diagnosticul serologic, de regulă,

trebuie să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale: există anticorpi în serul

pacientului investigat? care este titrul anticorpilor? cum evoluează în dinamică (în timp)

acest titru? În acest scop vom realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10

zile (pentru majoritatea infecţiilor care pot fi diagnosticate astfel). În acest capitol vom

discuta atât exemple de reacţii serologice calitative cât şi exemple de reacţii serologice

cantitative.

265

20. 5. 1. Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul de laborator microbiologic direct

Tehnica de aglutinare se execută în a patra etapă a diagnosticului de laborator,

respectiv în etapa de identificare, pe baza caracterelor antigenice. În momentul aplicării

acestei reacţii avem o serie de date pornind de la informaţiile clinice, paraclinice,

epidemiologice, s-a prelevat un anumit p.p., care s-a examinat din punct de vedere

microscopic şi a fost cultivat. Aşa cum am menţionat anterior, în vederea identificării este

necesar să avem colonii izolate, cultură pură.

20. 5. 1. 1. Aglutinarea pe lamă

Spre exemplu, în cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella

spp., Salmonella spp., E. coli etc), după cultivarea p.p. pe medii selectivo-diferenţiale se

obţin colonii izolate şi din porţiunea superioară (bombată) a coloniilor izolate facem treceri

pe medii multitest (ex. TSI, MIU). În ziua următoare, avem deja mai multe elemente pentru

încadrarea tulpinii izolate într-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacteriană

dezvoltată pe mediul TSI, putem face reacţia de aglutinare. În nici un caz nu se vor utiliza

pentru identificarea pe bază de caractere antigenice tulpini mai „vechi” de 18-24 ore.

Pentru realizarea reacţiei de aglutinare sunt necesare următoarele: cultura de

identificat (colonii de tip S, de 18-24 ore), soluţie salină fiziologică, Ac cunoscuţi faţă de Ag

pe care dorim să le identificăm (Ac polivalenţi, Ac monovalenţi de grup, Ac monovalenţi de

tip, după caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc.

Iniţial, pe o lamă de microscop curată şi degresată punem la una dintre extremităţile

lamei o picătură de soluţie salină fiziologică, în care suspendăm un fragment din colonia de

identificat în aşa fel încât să obţinem o suspensie omogenă, opalescentă. În cazul în care

suspensia rămâne omogenă, putem trece la etapele următoare; în cazul în care picătura

„se limpezeşte” şi apar grunji, tulpina este ne-tipabilă prin această metodă (apare

„aglutinarea nespecifică”), ar putea fi vorba de o tulpină care provine dintr-o colonie de tip

R. În următoarea etapă, la cealaltă extremitate a lamei, punem o picătură de ser cu Ac

cunoscuţi, de ex. polivalenţi şi realizăm o suspensie omogenă, opalescentă, a coloniei de

identificat. Înclinăm lama de câteva ori, uşor, în toate direcţiile, pentru a favoriza contactul

dintre cei 2 reactanţi şi unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru a forma reţele de

complexe Ag-Ac. În cazul reacţiei pozitive (corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care

dorim să îl identificăm) picătura „se limpezeşte” şi apar grunji de aglutinare. Este indicat să

citim reacţia pe fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber însă în cazul

unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi necesar să folosim o lupă, un microscop

sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme există scheme care

orientează etapele de urmat (tabelele şi schemele respective se livrează de către

producători împreună cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care se fac reacţiile de

aglutinare, după terminarea reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant.

266

În cadrul lucrărilor practice vor fi discutate aglutinările pentru identificarea E.

coli, Salmonella spp. până la nivel de specie (conform clasificării Kauffmann-White) şi

respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin aglutinare directă se mai pot identifica

tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini

de E. coli entero-patogen, iar în cazul leptospirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării

trebuie verificată cu ajutorul microscopului.

Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de

grup A sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip

capsular b, pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru

detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a

unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifica exotoxine în filtratul

de cultură, streptococii de grup A-D, E. coliO:157, Legionella pneumophila, Listeria

monocytogenes etc.

20. 5. 1. 2. Aglutinarea în tuburi

Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv

la aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este suficient

de clar. Vom avea la dispoziţie cultura pură de identificat care se va prepara diferenţiat în

funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm. Spre exemplu, dacă încercăm să

identificăm Ag de tip O iar bacteria ar putea să prezinte şi Ag H sau Ag K (care ar putea

inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menţine 1-2 ore la 100°C pentru inactivarea Ag de

înveliş, după care se va trece la realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare

poate fi necesară şi în cazul tehnicii de aglutinare pe lamă). Vom utiliza un şir de eprubete

în care vom introduce Ac cunoscuţi, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluţie salină

fiziologică. În tuburile respective vom adăuga o cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre

ex., la 0,5 ml Ac vom adăuga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face diferenţiat, în

funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm (ex. 20 ore la 52°C pentru identificarea

Ag O).

Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase - în cazul prezenţei Ag O,

floconoase - în cazul prezenţei Ag H etc). Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi

verificarea titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.

20. 5. 2. Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic

În diagnosticul serologic, în mod obişnuit, reacţiile utilizate permit detectarea prezenţei

Ac în serul de cercetat dar şi stabilirea titrului. Totuşi există şi câteva exemple de reacţii de

aglutinare calitative.

20. 5. 2. 1. Aglutinarea pe lamă

Reacţiile de aglutinare pe lamă Huddleson (în diagnosticul brucelozei) şi respectiv

Kudicks-Steuer (în diagnosticul tifosului exantematic) au intrat în istoria medicinii. Prima

dintre reacţii o utilizăm demonstrativ în cadrul lucrărilor practice, apariţia aglutinatelor fiind

clară iar tehnica de lucru foarte simplă. Sunt necesare următoarele materiale: lame de 267

microscop curate, Ag brucelos inactivat (colorat în violet), ser de cercetat. Pe o lamă de

microscop depunem o picătură din soluţia de Ag brucelos şi în imediata vecinătate a

acesteia, o picătură de ser de cercetat. Cu colţul unei alte lame amestecăm şi omogenizăm

cei 2 reactanţi. Prin mişcări de înclinare a lamei în toate direcţiile facilităm formarea

complexelor Ag-Ac, în cazul în care în serul de pacient sunt prezenţi Ac anti-Brucella spp.

Reacţia este pozitivă în cazul în care se remarcă prezenţa aglutinatelor. Chiar şi în perioada

în care această se utiliza în diagnostic, o reacţie pozitivă pe lamă trebuia să fie confirmată

prin aglutinare în tuburi.

Tehnica de aglutinare indirectă poate fi utilizată în diagnosticul serologic al infecţiilor

produse de Helicobacter pylori,Treponema pallidum (hemaglutinare pasivă) etc.

20. 5. 2. 2. Aglutinarea în tuburi

Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi în diagnosticul serologic al brucelozei

(reacţia Wright), diagnosticul serologic al infecţiilor produse de Cryptococcus neoformans,

diagnosticul serologic al febrei tifoide etc. Denumirea de reacţie Widal pentru diagnosticul

serologic al febrei tifoide a intrat în istoria medicinii.

Luând în discuţie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoidă, sunt

necesare următoarele: seruri recoltate (în dinamică) de la pacienţii la care se suspicionează

acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de apă cu temperatură reglabilă, Ag cunoscute

(Ag O şi Ag H). Se va lucra cu 2 rânduri de eprubete, un rând pentru detectarea prezenţei şi

titrului Ac anti-O, al doilea pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-H (pentru

persoanele în convalescenţă sau în cazul suspicionării stării de purtător vom încerca să

identificăm în serul de cercetat Ac şi titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasivă).

Serul de cercetat, pentru fiecare rând de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, în

diluţii binare. Dacă amestecul de ser de cercetat şi diluant va fi în cantitate de 0,5 ml, vom

adăuga o cantitate similară de Ag, câte 0,5 ml Ag O în primul rând de tuburi şi respectiv

câte 0,5 ml Ag H în al doilea rând de tuburi. Vom proceda în aşa fel încât să obţinem în

primul tub o diluţie de 1/20, în al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conţine doar un amestec de

tampon fosfat salin şi soluţie Ag (tub martor). După ce omogenizăm conţinutul tuburilor,

vom incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore la 52°C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp

de 2 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura camerei.

Citirea se va realiza după incubare, comparând rezultatul din fiecare tub cu martorul

pentru Ag. Pentru evidenţierea reacţiei vom agita uşor tuburile. Aglutinarea H diferă de

aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, în timp ce aglutinatul H este mai

floconos şi uşor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezintă aglutinare vizibilă

permite stabilirea titrului reacţiei. În capitolul 38 vom relua acest tip de diagnostic şi vom

discuta modalităţile de interpretare.

268

21. Reacţii care utilizează sistemul complement21. 1. Reacţia de fixare a complementului (RFC)

Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic,

în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar

acest sistem indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie

este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format

nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules

Bordet şi s-a perfecţionat destul de mult de-a lungul timpului. Această reacţie este utilizată

în peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări,

inclusiv introducerea micrometodelor RFC.

Se utilizează de ex. Ag cunoscute, puse în contact cu serul testat (în care căutăm Ac)

care este decomplementat (prin încălzire la 56°C timp de 30 minute) şi cu o cantitate

de C' de cobai (alexină); dacă în serul cercetat există Ac, ei se vor cupla cu Ag formându-se

complexe Ag-Ac, pe care se ataşează C', care se va consuma şi nu va mai acţiona în timpul

doi (nu va mai produce hemoliza). Într-un al doilea timp este adăugat un sistem hemolitic

(substrat indicator) compus din globule roşii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de iepure).

Dacă globulele roşii nu sunt hemolizate, înseamnă că a fost utilizat C' în cursul primului

timp şi reacţia este pozitivă (Ac prezenţi în serul de cercetat); dacă globulele roşii sunt

hemolizate, înseamnă că nu s-a utilizatC' care a rămas disponibil pentru a se ataşa de

sistemul hemolitic, reacţia este negativă (nu sunt prezenţi Ac în serul de cercetat).

Reacţia de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât şi în

diagnosticul serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom

enumera doar câteva dintre exemple, RFC permiţând identificarea unor Ag rickettsiene,

chlamydiene, virale etc. În diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă

RFC Bordet-Wasserman, utilizată încă în diagnosticul serologic al sifilisului.

Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar

fiind executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate şi specificitate. Este de

asemenea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.

Principiul RFC:

RFC se bazează pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac.

În prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac

specifici faţă de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va

activa pe calea clasică şi nu va mai fi „disponibil” pentru a se fixa pe sistemul hemolitic

indicator (hematii + Ac-antihematie). În cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac

specifici faţă de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a

RFC.

269

După introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac-

antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' „liber” se va fixa pe acesta.

După fixare va urma activarea C' şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând fi examinată

cu ochiul liber.

Materiale şi reactivi necesari:

- serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obţinute „în

dinamică”;

- seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ);

- Ag cunoscut (suspensie corpusculară sau soluţie coloidală, după caz);

- sistemul C' obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat de la cobai;

- sistemul hemolitic indicator format din

o   hematii de berbec, soluţie 4%, valabil timp de o săptămână la 4°C şi

o   ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii de

oaie la iepurele de laborator, spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat la 4°C;

- baie de apă cu temperatură reglabilă;

- plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete diferite etc.

Tehnica de lucru:

Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în

totalitate, în cele ce urmează.

Serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru

inactivarea C' propriu.

      Aşa cum am menţionat anterior, principial, RFC are loc în 2 etape (Figura nr. 1):

o   în prima etapă se pun în reacţie C', serul de cercetat şi Ag cunoscut; există 2

posibilităţi: a. în serul de cercetat există Ac specifici, rezultând un complex Ag-Ac pe care

se va fixa C'; b. în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se formează complex Ag-

Ac, C' rămâne liber;

o   în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac

anti-hematie); există 2 posibilităţi: a. C'nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixează

pe sistemul hemolitic, lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei.

      Toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza:

o   omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonare prin spectrofotometrie;

o   titrarea serului hemolitic;

o   titrarea C' în prezenţa Ag;

o   titrarea „bidimensională” a Ag şi a serului de referinţă.

      În RFC „finală” se va proceda astfel:

o   se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul

hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referinţă, C');

o   se repartizează în godeurile corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi C';

o   pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor

pentru C', martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ);

o   plăcile se introduc până a doua zi la 4°C;

o   a doua zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;

270

o   se adaugă în toate godeurile sistem hemolitic;

o   plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;

o   se pun plăcile la 4°C, până la sedimentarea hematiilor.

Există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile sunt

aceleaşi.

În RFC Bordet-Wasserman (RBW), metodă calitativă, reacţia se realizează în eprubete, 2

pentru reacţia propriu-zisă (una cu ser diluat 1/8, cealaltă cu ser diluat 1/16), 2 pentru

martori sigur pozitiv şi sigur negativ şi câte una pentru fiecare din ceilalţi martori, respectiv

martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C', martor pentru serul

hemolitic). (Figura nr. 2)

Interpretare:

Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă

cantitativă sau calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul

de cercetat trebuie să fie hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag,C' şi ser sigur

negativ. În tuburile martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să

fie hemoliză.

În tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac iar

testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu, limpede).

Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză,

hematiile se depun formând un „buton” în partea inferioară a tubului (în serul de

cercetat există Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RBW să fie

confirmată prin reacţii specifice (vezi capitolul dedicat genului Treponema).

Control de calitate:

Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fiecare

reacţie.

În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciunea

de diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţiilor

produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp.,Treponema

pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.

În scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o

anumită temperatură „de incubare” (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac

fixatori de C' apar precoce în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate

semnifica o infecţie acută sau recentă.

22. Reacţia de seroneutralizare La fel ca şi în cazul RFC, în reacţia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu

tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor. În cazul RSN, Ag are o anumită

proprietate biologică (toxică, enzimatică) care poate fi blocată (neutralizată) prin cuplarea

cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar în cazul în

271

care determinantul pentru toxicitate sau pentru  activitatea enzimatică respectivă este

acelaşi cu determinantul antigenic (epitop).

Reacţiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu

în:

·         diagnosticul microbiologic direct

o   identificarea Clostridium perfringens prin metoda plăcilor semineutralizate (vezi

anexa nr. 2 şi capitolul 51);

o   testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de

seroprotecţie, vezi anexa nr. 2);

o   toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridium

botulinum (vezi anexa nr. 2 şi capitolul 50);

·         diagnosticul serologic

o   reacţia ASLO (vezi şi capitolul 28);

·         prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea eficacităţii

vaccinale

o   vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi şi anexa nr. 4);

o   titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc);

o   testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală

infecţioasă care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine.

Intradermoreacţiile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate faţă

de o infecţie difterică sau scarlatinoasă au intrat în istoria medicinii.

·         tratamentul / profilaxia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline

specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

22. 1. Reacţia ASLOAceastă reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv al unei infecţii

streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună cu

criteriile minore şi majore de diagnostic). Reacţia ASLO determină titrul Ac anti streptolizină

O (SLO).

Principiu:

Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor

de iepure sau de berbec. În cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO, acţiunea

hemolitică a SLO este neutralizată. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate

constantă de SLO vom putea determina titrul ASLO.

Materiale şi reactivi necesari:

- ser de cercetat (sau seruri „pereche”, recoltate la interval de 2 săptămâni);

- SLO liofilizată (standardizată de către producător);

- sânge defibrinat de iepure / berbec;

- soluţie salină izotonă, soluţie de rivanol 0,3%;

- eprubete, pipete gradate foarte curate;

- baie de apă, centrifugă etc

Tehnica de lucru:

272

Trebuie urmate toate indicaţiile din protocolul de lucru, respectiv

- se omogenizează suspensia de hematii;

- se îndepărtează inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizăm soluţie de rivanol şi

suspensie de cărbune activ, realizăm o diluţie de 1/10 a serului care se va menţine 30

minute la 56°C);

- se realizează diluţiile de ser şi se repartizează în tuburile de reacţie (ser în diluţii

succesive) împreună cu SLO (în cantitate constantă, câte 0,5 ml / tub); combinarea serului

de cercetat cu SLO reprezintă prima etapă a reacţiei;

- se agită tuburile pentru omogenizare şi se menţin timp de 15 minute la 37°C;

- urmează a doua etapă a reacţiei ASLO, respectiv adăugarea suspensie de hematii

(5%), câte 0,5 ml în fiecare tub;

- se agită pentru omogenizare şi se incubează timp de 45 minute la 37°C;

- se centrifughează tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaţii / minut) şi se menţin până a

doua zi la 4°C (temperatura frigiderului).

Interpretare:

Pornind de la o diluţie iniţială a serului de 1/10, după adăugarea tuturor reactivilor titrul

(numărul de unităţi ASLO) va fi 12, 50 în tubul următor, 100, 125, 166, 250, 333 etc în

tuburile următoare. Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care

lipseşte complet hemoliza. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de

200 (maxim 250) unităţi ASLO. Există teste serologice şi pentru evidenţierea prezenţei şi

titrului anticorpilor faţă de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornază,

hialuronidază, streptokinază).

Control de calitate:

Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, în care se verifică

rezistenţa hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia

de hematii.

Există şi posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO, reacţia efectuându-se în plăci

de material plastic cu godeuri.

22. 2. Utilizarea RSN în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase

22. 2. 1. Vaccinarea în scopul obţinerii unei protecţii prin seroneutralizare

Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza I, combinată cu

anatoxina difterică şi tetanică. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului,

administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru menţinerea imunităţii

se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practică

la 36 de luni de viaţă a copilului respectiv. Datorită posibilelor reacţii adverse (faţă de

componenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuţii cu probleme ale

273

sistemului nervos, la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă

semnificativă la o administrare anterioară a DTP-ului. Se studiază posibilitatea utilizării pe

scară largă a unui vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată şi care să

permită obţinerea unui RI eficient şi de durată. Vaccinul DTPa este deja utilizat în SUA şi în

ţări din UE.

22. 2. 2. Evaluarea eficacităţii vaccinurilor

• Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare, conform normativelor

elaborate de autorităţile de sănătate publică; metodele au la bază titrarea Ac anti-toxină

(difterică, tetanică etc) în seruri prelevate de la copii vaccinaţi, prin diferite tehnici. Spre

exemplu se consideră că un copil este protejat (prezintă rezistenţă specifică în cazul unei

infecţii difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică este mai mare de 0,03 UAI / ml (UAI =

unitate anti-toxică internaţională). În mod asemănător se consideră că există protecţie faţă

de tetanos dacă titrul Ac-anti toxină tetanică este mai mare de 0,01 UAI / ml.

• Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dacă persoana investigată

este sau nu protejată faţă de o eventuală infecţie. În acest scop se practică IDR. În istoria

medicinii au intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilităţii faţă de scarlatină (toxina

este elaborată de către streptococul de grup A lizogenizat) şi respectiv IDR Schick, care

permite testarea susceptibilităţii faţă de difterie (toxina este elaborată de către bacilul

difteric lizogenizat).

o Ambele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic;

o Spre ex. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebraţului, strict

intradermic o cantitate de 0,1 ml toxină difterică diluată corespunzător. În cazul în care în

sângele persoanei testate se găseşte o cantitate de Ac anti-toxină mai mare de 0,03 UAI /

ml, toxina inoculată va fi neutralizată şi nu va apărea nici o modificare la locul inoculării

(lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este susceptibilă să facă difterie,

în cazul în care se infectează cu un bacil difteric toxigen). În cazul în care persoana

respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică, Ag inoculat va conduce la apariţia unui

eritem la locul de inoculare.

22. 2. 3. Terapia sau profilaxia specifică (imunoterapie pasivă)

• Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obţinute de la persoane imunizate

(natural sau artificial) faţă de o anumită maladie infecţioasă, de ex. în imunoterapia

infecţiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI.

• Administrarea de seruri imune heterologe, obţinute prin hiperimunizarea cailor, în

tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc.

Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai

rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulaţie. Pe

de altă parte, administrarea de ser heterolog trebuie realizată numai în caz de necesitate

(datorită stării de hipersensibilitate care ar putea fi indusă şi care ar duce la reacţii

adverse).

274

23. Reacţii Ag-Ac cu reactivi marcaţi 

Reamintim că, în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare,

scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, şi anume:

·         reacţii de precipitare

·         reacţii de aglutinare

·         reacţia de fixare a complementului (RFC)

·         reacţii de seroneutralizare.

Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul

liber, cu ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme

indicator”. În continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este

necesară marcarea reactanţilor, ceea ce se poate face:

- izotopic (radio immunoassay, RIA);

- enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);

- fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA);

- chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.

În prezent aceste metode sunt extrem de folosite având avantajul unei mari

sensibilităţi, sunt automatizate şi adaptabile la testări utile în toate disciplinele bio-

medicale.

24. Inflamaţia şi procesul infecţios24. 1. Inflamaţia

24. 1. 1. Inflamaţia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene

alterative, fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative şi proliferative (este vorba despre o

reacţie tisulară nespecifică, cu caracter de apărare locală) şi fenomene reparatorii.

Inflamaţia are drept principal scop limitarea acţiunii şi eventual neutralizarea „agentului

agresor” (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutăm despre fenomenul

inflamator şi în cadrul unor „agresiuni” microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale,

prionice), dar inflamaţia reprezintă un concept mult mai complex (apare în mult mai multe

circumstanţe, decât în cele infecţioase). (Figura nr. 1)

Inflamaţia poate interesa ţesuturi, organe, sisteme sau chiar întregul organism şi are drept

semne / simptome clasice, următoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, înroşire

locală), calor(temperatură crescută în zona în care evoluează fenomenul

inflamator), dolor(durere), însoţite sau nu de „functio laesa” (tulburări funcţionale mai

275

ample sau mai puţin ample, mergând până la impotenţă funcţională, de ex. imposibilitatea

deplasării membrului inferior datorită unei inflamaţii la articulaţia genunchiului, în cadrul

unei infecţii diseminate cu Neisseria gonorrhoeae).

24. 1. 2. Există o mare diversitate de „agenţi determinanţi” ai unui proces inflamator,

printre aceştia putând fi enumeraţi:

- diferiţii agenţi fizici (radiaţii, frig, căldură, curent electric, traumatisme etc.);

- microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, paraziţi);

- agenţii chimici exogeni, unii încă necunoscuţi până în acest moment, dar exemplificarea

încearcă să dea în primul rând sensul diversităţii şi să explice faptul că fenomenul

inflamator poate fi determinat de foarte multe substanţe dintre care vor fi enumerate doar

câteva, exogene (ex. ulei de croton, terebentină, caolin, dextran etc) şi / sau endogene

(uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminării lor din organism pe

alte căi decât cele fiziologice (de exemplu în situaţia apariţiei unui reflux bilio-gastric).

Indiferent de „agentul determinant”, în urma acţiunii acestuia va putea apărea o afectare a

vaselor mici, a ţesutului colagen (noţiune foarte importantă pe care o vom reîntâlni în

cadrul discutării diferitelor maladii, cu sau fără o determinare precizată), a proteinelor

interstiţiale etc., rezultând astfel eliberarea şi de cele mai multe ori activarea unor

mediatori şi a unor enzime. Acestea din urmă pot fi considerate mecanismelele de

declanşare sau „trigger” pentru procesul inflamator.

În rezumat, inflamaţia reprezintă reactivitatea diferitelor structuri ale organismului,

structuri care aparţin diferitelor reţele informaţionale (de exemplu reţeaua imună ce

include organe ale sistemului imun, celule ale sistemului imun, substanţe sintetizate şi

eliberate în cursul reacţiilor imune, inter-relaţii mediate celular sau umoral etc) ce

declanşează diferite tipuri de răspunsuri care urmăresc, cel puţin în stadiile iniţiale, să

realizeze o reechilibrare şi „aducere la normal”, la situaţia anterioară intrării în contact cu

„agentul agresor”. Dintre variantele de posibile reacţii putem să amintim:

modificări la nivelul microcirculaţiei, cu creşterea calibrului vascular,

creşterea permeabilităţii vaselor mici şi scăderea vitezei de circulaţie (stază);

modificări ale hemostazei şi respectiv marginaţia, diapedeza, migrarea leucocitelor.

 Rezultatul acestei reactivităţi este reprezentat de ex. de apariţia exsudatului inflamator

(care poate fi examinat prin metode de laborator).

Aşa cum am menţionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanşate pentru

neutralizarea activităţii „agentului determinant” (al inflamaţiei). Fenomenele vasculo-

exsudative, la fel ca şi exsudatul inflamator, încearcă să limiteze efectele produse de

agentul pro-inflamator şi să împiedice extinderea procesului inflamator spre zonele

învecinate sau la nivelul întregului organism. În cazul în care aceste activităţi au succes,

alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, în

ansamblu, pot determina:

- vindecarea anatomică în totalitate (restitutio ad integrum),

- vindecarea însoţită de cicatrizare sau

276

- cronicizarea inflamaţiei.

Aşa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent

există tendinţa către vindecarea ţesuturilor lezate. Inflamaţia devine un fenomen patologic

în cazul în care sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci când procesul inflamator

se cronicizează.

Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte,

indiferent de „agentul determinant”. Chiar dacă acesta este reprezentat de un traumatism

prin compresiune, o înţepătură sau o tăietură (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsură

(indiferent de procentul de tegument afectat), de bacterii, virusuri, paraziţi, sau este vorba

de o necroză (mortificare) tisulară care apare în cursul dezvoltării unui neoplasm (cancer)

sau în urma apariţiei metastazelor tumorii primare, în cursul procesului inflamator va

rezulta sinteza şi eliberarea reactanţilor de fază acută (RFA).

Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar

putea explica (parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de

către acelaşi agent etiologic. Spre exemplu, Salmonella

enteritidisserotipul typhimurium produce inflamaţii proliferative la nivelul sistemului limfatic

şi respectiv inflamaţii exsudative în parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis,

agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaţii alterative (la nivel pulmonar), inflamaţii

exsudative (la nivel pleural) sau inflamaţii proliferative (la nivel dermic).

24. 1. 3. Din punct de vedere didactic, etapele inflamaţiei sunt următoarele:

1.Etapa de declanşare, în care „agentul determinant” produce modificări la nivelul

ţesutului interstiţial şi în celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de

laborator este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze.

Factorii eliberaţi conduc la apariţia răspunsului inflamator acut, respectiv:

- vasodilataţie capilară (eritem, înroşire),

- exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) şi

- acumulare de leucocite PMN.

Principalele proteine care apar în această etapă sunt componentele sistemului

complement, dar şi diferite citokine. Elementele celulare importante în realizarea procesului

inflamator sunt reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear

fagocitar), colagenul vascular şi celulele endoteliale. Este de menţionat şi subliniat rolul

important al ficatului.

Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se află „agentul determinant” este

esenţială în declanşarea inflamaţiei. Dorim să menţionăm că examinarea prin metode de

laborator a prezenţei acestor celule (de ex. într-o inflamaţie de natură infecţioasă apărută

la nivel faringian, realizăm un frotiu colorat şi în primul rând căutăm să

identifică prezenţa leucocitelor PMN, astfel având o informaţie care susţine ipoteza unei

infecţii bacteriene) poate fi foarte utilă. PMN şi macrofagele sunt atrase de moleculele

chemotactice şi migrează direcţionat de aceste molecule prin procesul de diapedeză, iar la

locul inflamaţiei fagocitează, endocitează, secretă enzime lizozomale şi generează anioni

superoxid. Pe de altă parte, leucocitele PMN şi macrofagele prezintă receptori specifici de

277

suprafaţă pentru componenta C5a a sistemului complement, pentru CCF (crystal-induced

chemotactic factor) şi LTB4 (leucotriena B4), precum şi pentru peptidele din factorii

chemotactici. Aceste peptide servesc cuplării PMN-factor chemotactic şi astfel fagocitele se

îndreaptă spre locul unde acesta a fost produs. Ajungând la nivelul respectiv, PMN sau

macrofagele îşi pierd configuraţia rotundă, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre

factorul chemotactic. Pentru ca modificarea de formă să fie posibilă, are loc o rearanjare a

elementelor din citoschelet, microtubulii generează o polarizare „faţă-spate”, filamentele

de actină se acumulează în faţa şi în spatele celulei. Se asigură astfel forţele necesare

deplasării (motilitatea celulară depinde de polimerizarea monomerilor de actină în

filamente de actină). (Figura nr. 2)

Fagocitarea „agentului determinant” al procesului inflamator (de ex. o structură bacteriană)

este favorizată de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor

(atunci când acest lucru este posibil) şi / sau transformat în superantigen cu rol în

declanşarea unor cascade de reacţii imune. Până în acest moment, sistemul complement a

reprezentat elementul esenţial, fie că a fost activat pe cale directă sau pe cale alternă.

Fragmentele rezultate în cascada complementului participă la stimularea secreţiei

macrofagice (mediatori ai răspunsului inflamator acut).

Activitatea leucocitelor PMN este facilitată şi de prezenţa unei întregi game de proteine

active de tipul moleculelor de adeziune celulară (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular

adhesion molecule), ELAM-1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140,

adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell adhesion molecule), ISCOM

(immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex), MACIF (MAC

inhibitory factor), precum şi o serie de proteine sintetizate şi eliberate de ficat drept

reactanţi de fază acută (RFA). Dintre RFA am putea menţiona: proteina C reactivă (PCR

este secretată în mod predominant de ficat şi ţesuturile adipoase ca răspuns la stresul

inflamator şi este reglat, în mare parte, de interleukina-6. Valoarea semnificativă pentru

prezenţa inflamaţiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de încredere şi uşor de dozat, este

foarte utilizată în practica medicală ca metodă de screening şi monitorizare a inflamaţiei,

însă nu trebuie să uităm ca PCR poate fi crescută şi în sarcină sau în arsuri etc). (1)

Alți RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul,

haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 şi amiloidul P seric. Am

subliniat cu caractere speciale RFA care se testează mai frecvent în practică, în ţara

noastră.

 Aceste proteine de fază acută mediază procesul inflamator, în cursul căruia se şi consumă.

Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantităţi sunt sintetizate şi de către

macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoaşte, totuşi, că o serie de RFA

sunt implicaţi atât în procesele de necrobioză cât şi în cele de remaniere tisulară.

Informaţii cu privire la existenţa unui proces inflamator putem obţine şi verificând

valoarea VSH. 

 

În continuare, evoluţia procesului inflamator este determinată de tipul agentului agresor,

278

agresivitatea acestuia şi momentul declanşării „conflictului imun”. Acesta din urmă

corespunde de regulă apariţiei semnelor clinice (de ex. febră).

În completare la răspunsul celular, citokinele sintetizate de către diferitele celule

stimulate specific, antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influenţa / stimula şi activitatea

celulelor producătoare de citokine, rezultând sinteza şi eliberarea de noi tipuri de citokine.

Se constituie „anse de tip feed-back” endocrine şi autocrine, care sporesc sinteza de

citokine de către o singură celulă, în timp ce o singură citokină poate acţiona asupra mai

multor celule. (Figura nr. 6)

Spre exemplu, IFN-g(sintetizat şi eliberat de limfocitul T) are cel puţin trei acţiuni

importante şi anume: deviază sinteza la nivelul măduvei osoase hematopoietice spre linia

monocito-macrofagică, activează exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei

macrofagelor şi creşte puterea de fagocitoză a sistemului MM în vederea fagocitării atât a

actualelor antigene, cât şi a viitoarelor complexe imune ce se vor constitui în cursul

procesului inflamator.

Aproape simultan, celulele endoteliale reacţionează eliberând diferiţi produşi de secreţie,

precum endotelinele (ET) şi EDRF (endothelium-derived relaxing factor). „Jocul” dintre cele

două proteine vasoactive condiţionează pentru un timp aportul local de oxigen şi nivelul

acidozei. Iniţial se eliberează local factorii vasodilatatori (EDRF) şi NO, care au drept scop

creşterea fluxului sanguin local, cu creşterea atracţiei de celule ale răspunsului imun la

locul impactului cu ”agentul determinant” al procesului inflamator. EDRF este rapid

inactivată de hemoglobină şi de substanţe antioxidante (care apar în urma stimulării

activităţii PMN dar şi datorită prezenţei eritrocitelor).

Pe măsură ce debitul sanguin local creşte (determinat de sistemul kinină / bradikină),

creşte şi sinteza de EDRF (EDRF are însă o „viaţă” de numai 6-10 secunde). Vasodilataţia

locală se dezvoltă până în momentul în care celulele endoteliale, fiind comprimate de

edemul perilezional, încep să sintetizeze şi să elibereze local endoteline (ET), în special ET1.

Această endotelină (care are de asemenea o „viaţă” foarte scurtă) induce vasoconstricţie

brutală şi foarte intensă, tocmai pentru scăderea debitului sanguin şi limitarea amplitudinii

răspunsului inflamator local (endotelina este considerată cel mai puternic vasoconstrictor

din organism). Rezultatul etapei de declanşare este reprezentat de răspunsul inflamator

acut, manifestat prin vasodilataţie capilară (eritem, înroşire), exsudarea proteinelor

plasmatice (edem) şi acumulare de leucocite PMN.

2.Etapa efectoare, care la rândul ei se subîmparte în trei subetape:

A) Subetapa moleculară, în care se activează:

- cascada complementului;

- sistemul de coagulare-fibrinoliză;

- diferitele căi de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian

în urma scindării date de fosfolipază), respectiv: a) calea ciclooxigenazei prin care rezultă

prostaciclină (PGI) care determină vasodilataţie, inhibă agregarea trombocitelor şi aderarea

PMN, prostaglandină (ex. PGE2) şi tromboxan (TxA2) care determină agregare plachetară,

are efect vasoconstrictor şi de creştere a permeabilităţii capilare); b) calea lipooxigenazei,

279

care duce la apariţia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determină

bronhoconstricţie, vasoconstricţie sistemică, vasodilataţie la nivelul microcirculaţiei)

şic)calea epooxigenazei;

(Figura nr. 7, Căile ciclooxigenazei si liopooxigenazei)

- sistemul kinină-bradikinină;

- familia citokinelor;

- superfamilia interferonilor;

- sistemul extracelular „gunoier” al actinei. Actina este o proteină care se găseşte în

cantităţi mari şi este responsabilă pentru motilitatea celulară, schimbarea formei şi mărimii

celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). După apoptoză,

actina eliberată are tendinţa de a polimeriza, ducând la apariţia de filamente de actină în

vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu în şocul septic, necroza hepatică etc). Există

însă şi un mecanism homeostatic ce are la bază două proteine plasmatice, gelsolina şi

proteina Gc (care sunt depăşite însă din punct de vedere funcţional în distrugerile masive).

B) Subetapa vasculară, în care au loc modificări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de

circulaţie a sângelui, ale permeabilităţii vaselor mici din aria tisulară lezată. Iniţial se

produce vasoconstricţie, în decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule

sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub acţiunea unor mediatori

solubili eliberaţi din zona tisulară afectată, care produc două categorii de efecte:

a) vasculare (dilataţie arteriolocapilară cu creşterea numărului de capilare active,

hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de

adeziune intercelulară astfel încât celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul

vascular prin cuplaj receptorial şi în final o fază de stază vasculară pasivă, cu hipoxie şi

creşterea permeabilităţii vaselor mici) şi

b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase către ţesutul lezionat şi activate

metabolic)..

C) Subetapa exsudativă, în care se formează exsudatul inflamator (plasma exsudată,

bogată în proteine şi LDH) la care se adaugă elementele figurate extravazate, elementele

celulare mobilizate local şi produşi rezultaţi din diferite modificări locale. Prin constituenţii

săi celulari şi moleculari, exsudatul asanează focarul inflamator şi tinde să blocheze

procesul infecţios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitară.

24. 1. 4.Consecinţele activării mecanismelor implicate în procesul inflamator

În funcţie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaţie. Putem lua în

discuţie diferitele forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum şi formele

anatomoclinice.

24. 1. 4. 1.Evoluţia spre cronicizare se datorează agenţilor inflamatori care au proprietatea

de a stimula în special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenţei

stimulului inflamator.

Inflamaţia cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecinţă a unui risc

infecţios continuu, dar şi ca o parte integrantă a multor boli neinfecţioase, cum ar fi

disfuncţiile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc.

Astfel, nu este surprinzător că unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renină-

280

angiotensină (SRA), care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a

dovedit a fi factorul major de reglare a răspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8)

24. 1. 4. 2.Evoluţia spre vindecare presupune:

- asanarea focarului inflamator (începe concomitent cu constituirea barierei fibrino-

leucocitare şi cu îndepărtarea resturilor celulare şi a eventualelor microorganisme care sunt

„agenţi determinanţi”); devine maximă după acumularea de leucocite PMN şi macrofage.

- vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului inflamator; vindecarea

începe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască

pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menţionate anterior.

 Varianta cea mai favorabilă este reprezentată de vindecarea completă, anatomică (numită

şi „restitutio ad integrum”). Cealaltă posibilitate este reprezentată de evoluţia spre apariţia

unei cicatrici (cicatrizarea). Cicatrizarea apare în cazul unor inflamaţii însoţite de fenomene

lezionale întinse, pierderi de ţesut şi eventual de infecţii şi cronicizarea infecţiei.

24. 1. 4. 3.Aspecte anatomo-clinice:

- inflamaţii alterative în care predomină procesele distrofice şi necrobiotice (de exemplu în

miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp.);

- inflamaţii exsudative în care predomină procesele exsudative şi care se pot subîmpărţi în

inflamaţii:

a) seroase (3-5% proteine, număr scăzut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu în

pleurezia sau meningita produse deMycobacterium tuberculosis;

b) fibroase, destul de frecvent rezultate în urma unui proces infecţios, cu acumulare de

fibrinogen care determină apariţia fibrinei şi formarea de depozite care se organizează şi

duc la apariţia „aderenţelor”, care se organizează (de ex. în pneumonia cu Streptococcus

pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică etc.);

      c) purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus

pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de

abcese;

d) hemoragice, de exemplu în ciumă (produsă de Yersinia pestis) sau în pneumonia

hemoragică produsă de Bacillus anthracis(extrem de gravă, însoţită de hemoptizie şi

asociată frecvent cu pleurezie hemoragică şi adenopatie mediastinală importantă).

- inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular (de

ex. apărute după infecţii cuMycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii

de Brucella sau datorate prezenţei unui corp străin). (Video nr. 1, Inflamaţia acută

http://www.youtube.com/watch?v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Răspunsul

inflamatorhttp://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)

 

Febra Febra  (pyrexia) este un semn şi simptom medical caracterizat de creşterea

temperaturii corpului o anumită valoare (ex. peste 37,8°C; însă este important de cunoscut

281

valoarea temperaturii bazale, pentru fiecare subiect) datorită stabilirii unui alt punct de

echilibru la nivelul centrului reglator din hipotalamus. Se acompaniază de creşterea

tonusului muscular,  tremurat (frison) şi paradoxal, de senzaţia de frig. Senzaţia de cald

apare odată ce noua temperatură de echilibru este atinsă. Etimologia termenului este

dublă: din grecescul pyretos (foc)şi din latinesculfevris (febră).

Febra este o dovadăa funcţionării sistemului imun, deoarece prin această modificare de

temperatură, organismul încearcă “să distrugă” bacteriile şi virusurile. Dar infecţiile nu sunt

singurul mecanism declanșator al febrei.

De obicei nu este nevoie de tratament antipiretic. Acesta se administrează doar în cazurile

în care temperatura crește foate mult sau pentru confortul pacientului.

Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depăşirea

capacităţii de termoreglare (ex. o zi în soare înnăbuşitor fără consum adecvat de lichide)

sau supraîncălzirea (ex. după un efort fizic foarte intens).

Temperatura se măsoară clasic la nivel anal, la nivel axilar, în cavitatea bucală, sau la nivel

auricular. Vorbim despre febră dacă temperatura intrarectală depăşeşte 37,5-38,3°C și/sau

cea din cavitatea bucalădepășește 37,7 °C (”în mare” vorbim de subfebră între 37-38°C şi

de febrăpeste 38°C).

Persoanele maiîn vȃrsta au o abilitate scăzută de a genera caldură, astfel că și o

temperatură  nu foarte crescută  poate fi expresia unei afecțiuni grave.

Cauze posibile de febră ar fi: hemoragia intracraniană,  administrarea anumitor

medicamente, boli ale țesutului colagen, distrucţii tisulare de diverse cauze (traumatisme,

intervenţii chirurgicale, iradieri, arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacţii

”alergice”, conflicte de ordin psihologic, probleme neurologice, endocrine, metabolice sau

pot fi de cauză iatrogenă (de cauză medicală). 

Infecţia este ce mai comună cauză de febră.

Febra infecţioasăse instalează în: infecţii generalizate acute şi cronice fără semne de

localizare (în viroze, bacteriemii, rikettsioze, spirochetoze etc.); infecții generale cu

semne de localizare (tuberculoza pulmonară ganglionară, endocardita septică

etc.);infecţii localizate superficiale (celulite, plăgi infectate) sau profunde (flegmon,

abces subfrenic, abces apendicular, salpingite, pielonefrite, colecistite) etc.

Un trigger al febrei se numeşte pirogen. Pirogenul determină secreţia de PGE2, care

acționează la nivelul hipotalamusului (aria preoptică), determină un răspuns sistemic

(simpatic) de creştere a temperaturii (prin vasoconstricție, secuse ale muşchilor, catabolism

crescut şi creşterea activităţii diferitelor organe endocrine. Aceste modificări duc şi la

creşterea TA. Ȋn cazul nou-născuţilor, se mai obţine căldură în principal prin consumarea

grăsimii brune perirenale. Reversul presupune vasodilataţie şi transpiraţie. PGE2 provine

din acidul arahidonic, sub acţiunea PLA2, COX-2 şi PGE2-sintetaza.

Pirogenii pot fi endogeni sau exogeni. LPZ-ul din peretele bacteriilor Gram -

(precum şi alte superantigene) reprezintă exemplul clasic de antipiretic exogen.

Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-αsunt pirogeni majori. Alţi pirogeni: Il-8,

macrophage inflammatory protein-α, IFN α, βsi γ.

Febra evoluează în 3 stadii:

282

a) stadium incrementi:  stadiul de creştere a temperaturii, de la cȃteva minute la cȃteva

ore, zile sau săptămȃni.

b) stadium fastigium: stadiul de temperatura maximă reprezintă perioada de apogeu a

temperaturii.

c) stadium decrementi stadiul de scădere a temperaturii, de declin sau defervescenţă se

caracterizează prin creşterea termolizei.

Iată tipurile de febră, fiecare patologie caracterizȃndu-se prin una din urmatoarele:

Febra prelungită. Orice stare febrilă care persistă mai mult de trei săptămȃni reprezintă o

febră prelungită.

Febra continuăeste o febră ridicată în care diferenţa dintre temperatura matinală şi cea

vesperală timp de mai multe zile nu depăşeşte 1 grad C. Ea este întȃlnită în pneumonia

francă lobară, febra tifoidă (în perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielită

etc.

Febra remitentăeste febra ce se caracterizează prin aceea că diferenţa dintre

temperatura matinală şi cea vesperală depăşeşte 1 grad C. Ea apare în septicemii, supuraţii

pulmonare, tuberculoza pulmonara gravă, în perioada a doua a febrei tifoide.

Febra intermitentăse caracterizează printr-o alternanţă în timp de 24 de ore a

temperaturii normale cu febră mult ridicată. Cȃnd oscilaţiile devin foarte mari (ex. 3-5

grade C pe parcursul a 24 de ore) febra foarte ridicată oscilȃnd cu temperatura normală

sau chiar subnormală vorbim de febră hectică. Ea apare în supuraţiile pulmonare, infecţii

urinare şi unele septicemii etc.

Febra recurentăevoluează cu febră ridicată şi continuă timp de 5-8 zile alternȃnd cu

perioade afebrile. Ea apare în limfogranulomatoza malignă, tuberculoza pulmonară, infecţii

urinare sau biliare, leptospiroze etc.

Febra recidivantăeste o variantă de febră recurentă caracterizată prin faptul că

ascensiunile termice survin la intervale foarte variate şi îmbracă caracter de puseuri (o

întȃlnim în colangite, pielite, carcinom şi unele forme de tuberculoză etc.).

Febra ondulantăeste caracterizată prin ascensiuni termice ce se repetă periodic.

Ridicarea temperaturii este progresivă, iar defervescenţa este lentă pȃnă la afebrilitate sau

subfebrilitate urmată de cicluri repetate.

Febra de tip inverseste febra în care temperatura matinală este mai ridicată decȃt cea

vesperală. Apare în tuberculoza pulmonară gravă, supuraţii profunde şi inflamaţii cavitare

etc.

Febra neregulatăse referă la febra care nu poate fi încadrată în nici unul din tipurile

descrise şi care nu poate fi descrisă așa cum s-a menționat mai sus. (3)

Febra de origine necunoscutăeste luată în considerație atunci când, după 1 săptămână

de încercări în a pune diagnosticul și a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode

de laborator), nu am reușit să identifică o cauză pentru creșterea temperaturii.

VSH-ul

283

VSH reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge cu

anticoagulant, într-o oră. Ȋn mod normal hematiile dintr-o probă de sȃnge sedimentează

lent datorită încărcăturii de suprafaţă negative a acestora, care face ca celulele adiacente

să se respingă cȃnd distanţa intercelulară scade sub un nivel minim. Ȋn anumite afecţiuni

care determină creşterea proteinelor de fază acută (alfa-globuline, fibrinogen) sau

creșterea valorii imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataşează pe suprafaţa

hematiilor şi reduc potenţialul de suprafaţă determinȃnd agregarea hematiilor şi creşterea

sedimentării acestora.

Care sunt recomandările efectuării acestui test?

VSH poate fi folosit ca test screening în suspiciunea unor reacţii inflamatorii, infecţii, boli

autoimune, discrazii plasmocitare, dar şi pentru monitorizarea evoluţiei şi tratamentului în

anumite boli (ex. arterită temporală, polimialgie reumatică, artrita reumatoidă, reumatism

articular acut, lupus eritematos sistemic, boală Hodgkin, tuberculoză, endocardită

bacteriană). De reţinut: VSH nu este un test diagnostic pentru o anumită boală şi nu

trebuie utilizat pentru screening-ul pacienților asimptomatici.

Sȃngele se recoltează a jeun (pe nemȃncate) sau postprandial (după masă) pe

anticoagulant (vacutainer cu dop negru cu citrat de sodiu 3,8 % tamponat). După prinderea

venei se desface garoul pentru a nu liza hematiile. Să nu uităm că o masă lipidică poate

determina alterări plasmatice şi modifică şi VSH-ul. Se va recolta cȃt permite vacuumul;

raportul sȃnge/anticoagulant trebuie să fie 4/1.

Pentru citire se folosesc 2 metode:

1. metoda Westergren: se aşează tubul în poziţie verticală într-un suport gradat milimetric

şi se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor în mm după 1 oră; în unele teste este citit

rezultatul şi după un interval de 2 ore, dar aceasta nu furnizează informaţii suplimentare.

(Figura nr. 3)

2. Metoda automată (cititor automat de VSH)

Proba este stabilă timp de 2 orela temperatura camerei (18-26o C): testul ar trebui efectuat

la cel mult 2 ore după recoltare. Dacă este ratată citirea la 1 oră, sȃngele nu poate fi

remixat şi refolosit pentru VSH. Testul trebuie efectuat la temperatura camerei.

La 2-8o C îşi menţine stabilitatea 12 ore; dacă sȃngele a fost refrigerat, trebuie reechilibrat

la temperatura camerei înaintea efectuării testului.

1. Variații fiziologice:

a. În menstruație: VSH creşte în timpul ciclului menstrual, atingȃnd nivelul maxim în faza

premenstruală şi scăzȃnd în timpul menstruaţiei.

b. În sarcină: VSH-ul creşte continuu începȃnd cu a 4-a săptămȃnă de sarcină pȃnă în a 3-a

săptămȃnă postpartum şi atinge un nivel maxim de pȃnă la 45 mm/h în prima săptămȃnă

postpartum.

c. la nou-născuţi: VSH-ul este scăzut datorită hematocritului crescut şi nivelului scăzut de

fibrinogen.

d. la femei vȃrstnice (70-89 ani) aparent sănătoase VSH poate atinge valori de pȃnă la 60

284

mm/h.

2. Factori care determină creșterea VSH:

a. Refrigerarea sângelui;

b. Anemia: datorita numărului scăzut de eritrocite; în anemia feriprivă creşterea VSH nu

corespunde numărului de eritrocite deoarece microcitoza concomitentă încetineşte

sedimentarea hematiilor;

c. Macrocitoza.;

d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorită absorbţiei pe suprafaţa

eritrocitelor), anticonvulsivante, carbamazepină, cefalotină, ciclosporină A, dexametazonă,

etretinat, fluvastatin, hidralazină, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofloxacină,

lomefloxacină, metisergid, misoprostol, procainamidă, propafenonă, quinină, zolpidem etc.

3. Factori care determină scăderea VSH:

a. Temperaturi >20-24o C;

b. Hiperglicemia;

c. Hiperlipoproteinemia (în special chilomicronii);

d. Hipofibrinogenemia;

e. Policitemia;

f. Leucocitoza;

g. Prezenţa de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite,

stomatocite, acantocite, sferocite (prin scăderea suprafeţei necesare pentru agregarea

hematiilor);

h. Caşexia;

i. Medicamentele: aspirină, aur, corticotropină, ciclofosfamidă, glucocorticoizi,

hidroxiclorochină, metotrexat, antiinflamatorii nesteroidiene, penicilamină, sulfasalazină,

tamoxifen, trimetoprim etc.

Concomitent, macrofagele dezvoltă o serie de activităţi şi anume: pregătesc

superantigenul, eliberează în circulaţie monokine şi îşi expun (la suprafaţa membranei) Ag

HLA de clasa a II-a (vezi și capitolul 11). (Figurile nr. 4 și 5)

24. 2. Procesul infecţios 

Infecţia reprezintă un tip particular de relaţie între microorganismele condiţionat

patogene şi patogene pe de o parte şi organismul gazdă pe de altă parte. Pentru ca să se

declanşeze un proces infecţios şi să apară infecţia, microorganismele trebuie să pătrundă în

organismul gazdă, să depăşească barierele şi mecanismele de apărare, să-l colonizeze, să

se multiplice şi eventual să intre într-un lanţ de transmitere prin intermediul căruia poate

contamina o nouă gazdă.

Procesul infecţios defineşte ansamblul relaţiilor stabilite între microorganism şi gazdă,

apărute după infecţie.

285

Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modificările apărute să fie exteriorizate şi

constatabile de către medicul clinician) se datoreşte interacţiunii dintre microorganism

(bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazdă şi este urmată de apariţia unor simptome (de

ex. temperatură peste 39ºC, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) şi de reacţii

funcţionale din partea gazdei (de ex. stare generală modificată, senzaţie de febră, frisoane,

creşterea numărului de respiraţii pe minut, creşterea numărului de bătăi cardiace pe minut

etc). Infecţia nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând fi inaparentă, subclinică

sau latentă. Poate apărea şi starea de purtător şi / sau eliminator de germeni.

Datorită infecţiei pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcţie de:                

- agentul infecţios (factori de patogenitate, gradul de virulenţă);

- organismul gazdă (rezistenţa specifică şi nespecifică);

- mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc).

Manifestări subclinice

a) Infecţia inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome şi ar putea fi decelată numai

prin examene de laborator. Spre deosebire de infecţia latentă, infecţia inaparentă este

limitată în timp şi poate contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecţia

cu Neisseria meningitidis, infecţii cu Haemophilus influenzae etc).

b) Boala subclinică se deosebeşte de infecţia inaparentă prin apariţia unor tulburări

funcţionale (febră, transpiraţii, dureri etc) şi chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără

o simptomatologie distinctă / specifică, dar există şi situaţii în care nu este decelat nici un

simptom, de exemplu în formele subclinice de hepatită virală acută).

c) Infecţia latentă este asimptomatică, agenţii patogeni putând persista timp îndelungat în

ţesuturile gazdei. După un timp variabil, infecţia latentă poate deveni evidentă clinic, de

obicei în urma acţiunii unor factori favorizanţi externi sau interni, proprii organismului (de

exemplu infecţia cu Mycobacterium tuberculosis care este un microorganism condiţionat

patogen, infectează circa o treime din populaţia globului dar produce tuberculoză la circa 8

milioane de persoane, pe an).

d) Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecţioasă, la persoana

aflată în convalescenţă, înainte de „eradicarea” infecţiei suferite dar şi la persoanele

aparent sănătoase care adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la

nivelul veziculei biliare, microorganismul putându-se „cantona” la acest nivel după o febră

tifoidă). Starea de purtător reprezintă atingerea unui echilibru relativ între cele două verigi,

de multe ori fiind însoţită de eliminarea în mediu a germenilor care au produs infecţia şi se

află în diferite focare latente (precum în exemplul de mai sus, situaţie în care starea de

purtător se elimină doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, în ţara noastră apar

din când în când izbucniri epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundaţii, dacă în

zona respectivă există un purtător de S. typhi, iar condiţiile igienico-sanitare pentru

prevenirea transmiterii pe calea fecal-orală nu sunt respectate. În cursul stării de purtător

există teste biologice şi imunologice care pot certifica prezenţa microorganismelor (direct,

de ex. după cultivare sau amplificare genică şi / sau indirect).

Manifestări clinice

a) Infecţia locală, în care agenţii patogeni rămân cantonaţi la poarta de intrare şi în

286

vecinătatea acesteia, unde se multiplică (de exemplu în furunculul stafilococic, infecţia

amigdaliană produsă de streptococul piogen).

b) Infecţia de focar este o formă particulară a infecţiei locale. Evoluează cronic, cu

manifestări locale minime (acestea putând chiar lipsi), adesea însă cu tulburări la distanţă

(subfebrilitate, mialgii, artralgii etc.) a căror apariţie încă nu a fost complet explicată.

c) Infecţia regională cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porţii de intrare, prin

afectarea vaselor limfatice şi a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecţia

tuberculoasă, cu producerea de manifestări anatomo-clinice şi paraclinice relativ

caracteristice).

d) Boala infecţioasă cu manifestări clinice la nivelul întregului organism (sistemice), în care

germenii patogeni diseminează pe cale circulatorie (bacteriemie) în diferite ţesuturi şi

organe, la distanţă de poarta de intrare sau de focarul infecţios primar. Se descriu două

forme:

- boala infecţioasă ciclică, cu evoluţie regulată, în mai multe etape care se succed într-un

timp limitat, de exemplu febra tifoidă produsă de S. typhi.

- septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluţie clinică neregulată, de obicei

foarte gravă, fiind definită prin existenţa unei porţi de intrare, a unui focar septic (detectat

sau suspectat), bacteriemiei şi a unor „metastaze” septice care pot deveni focare

secundare; din focarele secundare au loc descărcări secundate de germeni în circulaţie.

Drept bacteriemie definim prezenţa pasageră de germeni viabili în sânge. Bacteriemia nu

duce, de regulă, la apariţia de metastaze septice şi nici la apariţia unui tablou clinic

manifest. Bacteriemii pot apare de ex. după extracţii dentare sau intervenţii chirurgicale pe

focare septice, ca şi în multe dintre bolile infecţioase (exemplu în pneumonia cu

pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explică astfel utilitatea recoltării de sânge

pentru hemocultură, cu toate că produsul patologic „principal” este reprezentat de spută în

primul caz şi lichid cefalorahidian în al doilea caz).

În momentul de faţă, s-a decis utilizarea noţiunii de sepsis, entitate care reuneşte

existenţa unui proces infecţios şi respectiv existenţa răspunsului inflamator sistemic. Starea

de sepsis include prin definiţie două sau mai multe din următoarele elemente:

febră (peste 38°C) şi frisoane, sau hipotermie (sub 36°C);

tahicardie (bătăi cardiace peste 90/minut);

polipnee (peste 20 respiraţii / minut) cu hiperventilaţie sau Pa CO2sub 32 mmHg;

leucocitoză peste 12.000 / mm3sau leucopenie sub 4.000 / mm3, cu forme tinere în

circulaţia periferică (peste 10%), respectiv deplasarea la stânga a formulei leucocitare.

Sindromul septic reuneşte sepsisul şi modificările circulatorii şi funcţionale la nivelul

diferitelor organe şi sisteme, care conduc la hipoxemie, oligurie, alterări psihice etc.

Şocul septic evoluează cu hipotensiune (presiunea sistolică scade cu peste 40 mmHg

faţă de nivelul bazal) şi sepsis sever.

287

Sindromul de disfuncţie multiorganică (MODS, Multiorgan Dysfunction Syndrome)

reprezintă ultimul şi cel mai grav stadiu evolutiv, cu letalitate mai mare de 80%; este un

sindrom clinic, cu apariţia insuficienţei la 2 sau mai multe organe sau sisteme. Agresiunea

microbiană declanşează un răspuns inflamator sistemic, care aşa cum a fost prezentat

anterior, din mecanism de apărare poate deveni un fenomen de autodistrugere.

După aspectul evolutiv, bolile infecţioase pot fi:

- acute şi

- cronice (persistente), atunci când agentul patogen persistă şi acţionează vreme

îndelungată în ţesuturile gazdei, de exemplu în bruceloză.

Poarta de intrare

Pentru a produce infecţia (după parcurgerea etapelor menţionate anterior privind

„definiţia” infecţiei) şi a invada organismul gazdă după multiplicare sau prin intermediul

unor produse toxice specifice (ex. exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizează una

sau mai multe căi de pătrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) pătrunde

pe cale digestivă (ex. consum de apă contaminată), se multiplică şi produce manifestările

caracteristice la nivel intestinal (rolul esenţial revenind toxinei holerice) etc.

Difuzarea în organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizează în

diferite moduri şi pe mai multe căi:

- extindere locală în suprafaţă, ex. în cazul erizipelului produs de streptococul beta-

hemolitic de grup A;

- extindere în profunzime, ex. în miozita produsă de Clostridium spp. (C. septicum,

sporogenes, histolyticum etc.);

- extindere regională;

- diseminare sanguină, de exemplu în febra tifoidă (produsă de Salmonella typhi);

- diseminare pe cale nervoasă, de exemplu în infecţia cu virusul rabic.

Perioadele bolii infecţioase:

- Incubaţia reprezintă intervalul de timp din momentul infectării până la apariţia primelor

semne şi simptome ale bolii; durata incubaţiei variază în limite relativ stabile (ex. 1-5 zile în

dizenterie, circa 14 zile în febra tifoidă);

- Invazia este de obicei concomitentă cu debutul bolii, care poate fi brusc (în plină stare de

sănătate) sau lent progresiv; în momentul invaziei este posibil să „surprindem” prezenţa

bacteriemiei (recoltăm sânge pentru hemocultură);

- Perioada de stare se caracterizează prin manifestările esenţiale şi deseori caracteristice

ale bolii;

- Încheierea evoluţiei bolii, care se poate face prin:

1. convalescenţă, în care boala clinică a încetat şi organismul îşi recapătă treptat

capacitatea de apărare şi revine la starea anterioară bolii infecţioase respective;

2. vindecare, urmată de stabilirea unui grad de imunitate; în unele cazuri imunitatea este

de durată, chiar şi pentru tot restul vieţii; instalarea răspunsului imun, precum şi statusul

imun în relaţie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste

de laborator (reacţii antigen-anticorp); pentru unele entităţi este stabilit nivelul de protecţie

(de ex. prezenţa anticorpilor în valoare de 0.01 UAI/mLasigură protecţie faţă de apariţia

288

tetanosului);

3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism şi gazdă; în alte situaţii

cronicizarea poate crea probleme importante) sau

4. exitus, fie datorită agresivităţii (virulenţei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie

datorită incapacităţii organismului de a reacţiona în mod eficient.

24. 3. Povestiri adevărate24. 3. 1. Artrita gonococică

O pacientă în vârstă de 21 ani se prezintă la camera de gardă cu durere la nivelul

articulaţiei mâinii drepte evoluând de circa 36 de ore. Anamneza nu a identificat existenţa

unor traumatisme sau a unui efort fizic deosebit, care să justifice prezenţa acestor dureri.

Medicul de gardă a indicat efectuarea unei radiografii a articulaţiei mâinii. Rezultatul

radiografic nu a pus în evidenţă aspecte patologice. Concluzia medicului examinator a fost

că este vorba de o entorsă (chiar şi în lipsa datelor anamnestice), a aplicat o faşă gipsată şi

a indicat tinerei să ia un medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale orală (2 × 50 mg /

zi, timp de 5 zile) şi să revină, la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul

durerii în articulaţia mâinii drepte, pacienta a decis să revină la camera de gardă pentru că

prezenta lipsa poftei de mâncare, ameţeli şi senzaţie de febră. Termometrizarea a arătat că

pacienta are, într-adevăr, febră (38,3°C).

Discuţia cu pacienta şi examenul clinic au permis înregistrarea următoarelor date: pacienta

nu a avut greţuri, vărsături, tulburări de tranzit intestinal şi nici semne care să poată fi

încadrate într-un sindrom meningean; erau prezente edem (umflătură) de culoare uşor

eritematoasă (roşiatică) al articulaţiei mâinii drepte, căldură la nivelul acestei articulaţii (în

comparaţie cu articulaţia simetrică), dificultate în utilizarea mâinii; la nivel palmar, bilateral,

a fost pusă în evidenţă o erupţie cu mai multe elemente de culoare violacee, dureroase

spontan şi la palpare.

De această dată, medicul clinician a luat în considerare mai multe variante de diagnostic.

Totuşi, o parte dintre supoziţii au putut fi eliminate relativ uşor (reumatism articular acut,

lupus eritematos diseminat) în timp ce datele obţinute în cadrul unei anamneze mai riguros

realizate (dar şi în contextul în care pacienta, îngrijorată de condiţia fizică personală, a fost

de acord să ofere date suplimentare) au permis restrângerea ipotezelor la o reacţie în

cadrul unei infecţii care a fost transmisă pe cale sexuală.

Examenul ginecologic a evidenţiat congestie şi eritem la nivelul colului uterin şi leucoree

(secreţie abundentă la nivel vaginal, cu aspect purulent).

S-a recoltat secreţia vaginală dar s-a realizat şi o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul

endocolului (tamponul a fost introdus în endocol pe o distanţă de circa 1,5-2 cm).

S-a administrat „tratamentul minut” recomandat în unele dintre infecţiile cu transmitere

sexuală, respectiv ceftriaxonă (o doză, 250 mg, injectabil, intramuscular).

Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN în secreţia genitală şi un număr

mai mic de PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului.

289

Pacientei i s-a recomandat o internare de scurtă durată, ceea ce a acceptat.

După 36 ore, medicul de gardă din laboratorul de microbiologie clinică, examinând cultura

din secreţia vaginală a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei şi testul superoxol şi a

început testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.

Diagnosticul microbiologic a fost infecţie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul final a

fost cel de artrită gonococică.

Rezultatul testării sensibilităţii la antibiotice (antibiograma difuzimetrică standardizată) a

demonstrat o tulpină cu sensibilitate la majoritate antibioticelor şi chimioterapicelor testate,

inclusiv la penicilină. Pentru mai multă siguranţă, deşi în literatură a fost descris faptul că

„tratamentul minut” este eficient, s-a prescris penicilină G, 1 doză la 12 ore, timp de 10

zile. În a treia zi de la internare, starea generală a pacientei era bună, durerea articulară

diminuase semnificativ, edemul şi erupţia erau abia perceptibile, curba febrilă a înregistrat

valori normale iar pofta de mâncare a revenit.

Comentarii cu privire la caz

Există statistici în literatura de specialitate internaţională care consideră că artrita

gonococică reprezintă una dintre cele mai frecvente cauze de artrită inflamatorie localizată

la o singură articulaţie, la tineri. Nu există date statistice relevante la nivel naţional. În

aceste condiţii, trebuie să luăm în seamă datele puse la dispoziţie cu generozitate de CDC

(Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se discută că 3% dintre

cazurile de infecţie gonococică sunt însoţite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai frecvent la

femei decât la bărbaţi. Infecţia gonococică se poate însoţi de diseminare, indiferent de

calea de pătrundere. Ca şi în cazul meningitei produsă de meningococ, un factor de risc

este reprezentat de deficienţe ale sistemului complement. Sindromul infecţiei gonococice

diseminate include în mod clasic: dermatită, sinovită, artrită migratorie („prinzând”

eventual mai multe articulaţii).

În funcţie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva după cultivarea unor

produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de sânge.

O problemă care poate apărea este legată de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice

şi chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat în această situaţie.

24. 3. 2. Antibioterapia în unele afecţiuni fără etiologie microbiană - o eroare

discutabilă?

În anumite circumstanţe, abilitatea de a institui antibioterapia în scop profilactic poate fi

considerată salutară. Un astfel de exemplu îl constituie administrarea de antibiotice locale

în afecţiunile oculare acute de natură neprecizată (infecţioasă sau inflamatorie) care

necesită intervenire de urgenţă, acest tratament salvând, de multe ori, vederea pacientului.

Totuşi, de cele mai multe ori, antibioticele locale (topice) sunt folosite în scop preventiv sau

profilactic în terapia oculară primară, fără ca acest lucru să fie necesar.

Este demonstrat statistic faptul că aproape toate keratoconjunctivitele la adulţi sunt de

origine inflamatorie şi nu infecţioasă. Prin urmare, tratamentul local cu corticosteroizi

reprezintă alegerea adecvată. În comunitatea medicală există tendinţa de a limita

prescrierea antibioticelor topice, în speranţa încetinirii apariţiei fenomenului de rezistenţă la

290

medicamentele antimicrobiene. În prezent, cea mai frecventă indicaţie pentru prescrierea

unui antibiotic într-o afecţiune oculară acută este reprezentată de către secreţia

mucopurulentă la acest nivel, cu recomandarea recoltării secreţiei respective şi realizarea

diagnosticului microbiologic direct, înainte de administrarea oricărui alt medicament.

Trebuie menţionat faptul că marea majoritate a presupuselor ulceraţii corneene nu sunt

altceva decât infiltrate leucocitare sterile, care în nici un caz nu justifică administrarea de

medicamente antimicrobiene. Este uimitor însă faptul că „tratamentul” cel mai frecvent al

acestora se face cu antibiotice locale!

24. 3. 3. Urmări ale unei inflamaţii în legătură cu sepsisul bacterian

Este luată în discuţie situaţia unei paciente cu endocardită infecţioasă în antecedente, la

care, în urma unei intervenţii stomatologice (moment în care a primit profilaxie cu

antibiotice) a apărut o osteită la nivel mandibular. Această descriere are relevanţă pentru

mai multe aspecte care pot fi luate în discuţie, pornind de la sepsisul cu germeni Gram-

negativi şi continuând cu utilizarea corectă a antibioticelor şi chimioterapicelor, inclusiv

situaţia în care gestul chirurgical reprezintă alegerea optimă. De asemenea, este

exemplificată o urmare a fenomenului inflamator.

O pacientă în vârstă de 59 de ani s-a aflat în supravegherea unei clinici cu specific de boli

infecţioase datorită unei afecţiuni valvulare pe care s-a grefat în urmă cu câţiva ani un

proces infecţios. Într-o perioadă de câţiva ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau

intervenţii stomatologice şi în câteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorită

faptului că intervenţiile au fost „sângerânde”. Cu toate acestea, în urma uneia dintre aceste

intervenţii (timp în care a primit o cefalosporină cu spectru lărgit), la câteva zile de la

intervenţie pacienta a început să prezinte febră (38,8ºC), transpiraţii, oboseală şi dureri la

nivelul toracelui. Numai după încă o săptămână a decis să se adreseze spitalului (necăjită

datorită prea multelor spitalizări din ultimii ani), iar la camera de gardă i s-a propus

internarea, ceea ce pacienta a acceptat.

Atitudinea a fost corectă şi susţinută de datele anamnestice, pentru că în urmă cu circa 3

ani pacienta mai fusese internată în spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dată a fost cel

de sepsis cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracţii dentare (şi de acea dată pacienta

a primit antibiotice, dar tulpina izolată s-a dovedit a fi rezistentă la toate medicamentele

beta-lactamice care au fost testate prin antibiogramă difuzimetrică standardizată, inclusiv

la medicamentele administrate profilactic).

La internare, tensiunea arterială era în limite normale, dar auscultator medicul de gardă a

detectat suflu sistolic atât în focarul mitral cât şi în focarul tricuspidian, iar după câteva ore

de la internare, la contravizită, au putut să fie auscultate frecături pericardice. Datele de

laborator obţinute în regim de urgenţă au relevat leucocitoză (15.850/μl) cu neutrofilie

(10.900 PMN/μl), valori crescute ale reactanţilor de fază acută (proteină C reactivă 6mg/l,

VSH 112 mm/oră, fibrinogen 526 mg/dl) şi anemie (nr. hematii 3,1×106/μl). A fost recoltat

sânge pentru trei hemoculturi incubate atât în aerobioză cât şi în anaerobioză. Prima

hemocultură a fost recoltată imediat după internare. În două dintre cele trei hemoculturi a

fost izolat Enterobacterspp., tulpină care s-a dovedit sensibilă la ampicilină, gentamicină,

291

amikacină, ciprofloxacină, carbenicilină şi asocierea piperacilină-tazobactam. S-a decis

instituirea unui tratament cu ampicilină plus gentamicină, pentru o durată de 3 săptămâni.

Nu a fost utilizată ampicilina în monoterapie, fiind cunoscut faptul că într-o astfel de

eventualitate ar fi fost posibilă dezvoltarea rezistenţei nu numai faţă de acest antibiotic dar

şi faţă de alte antibiotice (ex. piperacilină).

Temperatura a rămas ridicată, iar pacienta a menţionat că simptomele nu se ameliorează,

în cursul primelor două săptămâni de terapie. Reactanţii de fază acută au diminuat ca

valoare, menţinându-se însă peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de

către medicul stomatolog al unităţii nu a revelat o afecţiune care să pară a fi în legătură cu

evoluţia insuficient de favorabilă, sub tratament. Totuşi, după ce mandibula a fost

examinată radiologic, cu foarte multă atenţie, a fost remarcată o situaţie patologică şi s-a

presupus existenţa unui granulom care nu era cunoscut anterior.

Luând în calcul aceste noi informaţii şi solicitând un examen de specialitate la o clinică

universitară cu profil stomatologic, s-a decis extracţia dintelui situat în vecinătatea

granulomului respectiv, chiuretarea zonei şi asanarea presupusului focar de infecţie.

Intervenţia stomatologică a avut rezultate foarte bune, după 14 ore de la aceasta

constatându-se diminuarea temperaturii. În următoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat

semnificativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic în aşa fel încât durata totală să

fie de 4 săptămâni. După a treia săptămână de tratament probele biologice au revenit la

valori normale, starea generală a fost considerată ca fiind bună iar după patru săptămâni

de tratament pacienta a fost externată, vindecată.

24. 3. 4. Răspunsul tegumentului la injurii

Când pielea este rănită, un Ag necunoscut îşi găseşte expresia în keratinocitele deteriorate.

Celulele gamma-delta T învecinate se grupează şi contribuie la vindecarea rănii prin

producerea, pe plan local, de factori epiteliali de creştere şi citokine inflamatoare. Ȋn

absenţa celulelor gamma-delta T ale pielii, vindecarea rănilor este împiedicată (5). În mod

tradiţional, keratinocitele au fost considerate drept constituenţi inerţi ai epidermului cu mai

multe straturi. Conceptul actual s-a modificat în mod fundamental.

Keratinocitul este recunoscut azi ca un ”jucător activ” în reînnoirea epidermului şi având

funcţii cheie în apărarea imună a pielii. În condiţii homeostatice, se presupune că celulele

generatoare de keratinocite se divizează în mod simetric sau asimetric, ceea ce înseamnă

că ele continuă să prolifereze sau continuă să se diferenţieze în formă definitivă constituind

epiderma de suprafaţă. Procesul fin de reînnoire a epidermului se bazează pe o reţea

extraordinară de cascade semnalizatoare care sunt guvernate de interacţiunile receptorului

keratinocitului cu mediul înconjurător prin circuitele paracrine si autocrine. Opuse acestui

proces homeostatic coordonat sunt  semnalele de rănire şi inflamare. Ele modifică soarta

keratinocitului şi răspunsul său la mediul înconjurător prin alterarea moleculelor de

adeziune şi receptorii de suprafaţă, prin completarea declanşării unui răspuns inflamator

imediat al keratinocitului, prin secreţia de citokine, chemokine şi peptide antimicrobiene.

Dacă nu sunt controlate, modificările fundamentale impuse de rănire şi inflamare asupra

programului homeostatic, pot conduce la leziuni severe ale pielii inclusiv disfuncţii

292

inflamatorii cronice (6).  De asemenea Factorul de creştere a hepatocitului (HGFA) este

cunoscut a avea importanţă majoră în morfogeneza ţesuturilor, în regenerare şi în

progresul tumorilor, prin receptorii săi, MET. În vivo, HGFA activează, de asemenea,

proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii săi RON, are roluri în recrutarea

macrofagelor, declanşarea procesului infecţios, supravieţuirea celulelor şi vindecarea

rănilor. Prin urmare, activitatea pericelulară a HGFA poate constitui un factor important de

reglare a activităţilor citokinelor multifunctionale în vivo. (7)

24. 3. 7. Posibile terapii în şocul septic

Șocul septic determină imunosupresie. De aici usurința unor suprainfecții cu germeni

condiționat patogeni sau cu tulpini multirezistente, precum: Stenotrophomonas

spp., Acinetobacter spp., Candida spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp,

citomegalovirusuri etc. Mecanismele prin care conduc la imunosupresie sunt variate: induc

depleția celulelor sistemului imun prin apoptoza acestora, suprimă exprimarea MHC II,

induc supraexpresia citokinelor antiiinflamatorii și a moleculelor co-stimulatoare negative,

cresc numărul de LTs. Privind din acest unghi, prevenția imunosupresiei induse de sepis

devine o prioritate în tratamentul acestei entitati. Vom parcurge acum câteva terapii

propuse de oamenii de știință.

PD-1 (programed death 1) este o proteină de origine macrofagică, co-stimulatoare

negativă, a cărei sinteză creste în infecția HIV, concomitent cu a ligandului său, PDL-1. PD-1

scade capacitatea de apărare a organismului prin inducerea apoptozei, prin creșterea

sintezei de IL-10 (antiinflamatoare), prin impiedicarea proliferării LT, pe care le face

neresponsive. S-a încercat blocarea PD-1 cu rezultate promițătoare în cazul infecțiilor

fungice și a sepsisului bacterian (în experimentele pe șoareci).

Și-au dovedit eficiența și imunostimulatoarele, precum: IFN (interferon), GM-CSF

(granulocyte–macrophage colony-stimulating factor)și G-CSF(granulocyte colony-

stimulating factor). Au fost rezerve în legătura cu posibilitatea inducerii unei boli autoimune

sau a hiperinflamației. Acest lucru se pare că nu se produce pentru că rezervele

organismului sunt mult prea scăzute.

Il-7 și Il-15 sunt citokine antiiapoptotice și imunostimulatoare care și-au demonstrat

eficiența pe animale de laborator. Il-7 restaurează funcția limfocitelor și îmbunătățește

migrarea limfocitară prin creșterea activității integrinelor. Folosirea IL-7 ca medicament

este deja în fază de ”trialuri clinice” pentru cancer și infecție cu VHC și HIV.

S-ar putea folosi flow-citometria pentru cuantificarea moleculelor co-stimulatoare sau proba

de stimulare totală a secreției citokinice (rapid whole-blood stimulation assays of cytokine

secretion). (8)

24. 3. 6. Farmacogenomică?

 Aţi mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetică?

Credeţi că există vreo diferenţă? Si dacă da, ce legătură au ele cu inflamaţia?

Să vedem.

S-a estimat că genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonală cu

293

privire la răspunsul la medicamente. Primele investigaţii pe această latură au fost făcute în

1950, constituind baza farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt

parţial sinonimi. Farmagenomica studiază efectul unui medicament în relaţie cu întregul

genom, în timp ce farmacogenetica, în relaţie cu o singură genă sau cu un anume set de

gene.

Principala ocupaţie actuală a farmacogenomicii şi a farmacogeneticii este detecţia unui

„profil de risc”, ce va permite probabil, 2 eventualități:

identificarea precoce a indivizilor susceptibili la o boală, cu aplicaţii în prevenţie şi

tratament

dezvoltarea unor metode care să amelioreze progresia bolii.

Să luăm un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar ”Alzheimer-ul acesta” nu

e o boală neurologică? Da, foarte bine. Ȋnsă, ca și în situația multor altor boli, astăzi i se

recunoaşte şi o componentă inflamatorie.

Iată cȃteva argumente pentru a susţine componenta de inflamaţie cronică a bolii

degenerative Alzheimer:

Unii se bazează pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul că AINS ameliorează evoluţia (în

special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac)

Alţii se bazează pe markeri biologici, arătând că PCR este crescută, cu valori în cele 3

quartile superioare ale valorilor, cu 25 ani înaintea diagnosticului bolii.

Sunt luate în discuție și teste genetice, spre exemplu mutaţia genei M694 pentru gena

Pyrin, care reprezintă un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaţia

reprezentativă >65 ani din Italia. Şi se pare că este factor de risc şi pentru alte boli, cum ar

fi infarctul miocardic.

Iată şi cȃteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii în cadrul bolii

Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustivă).

 Asocierea dintre genotipul ApoE şi boala Alzheimer reprezintă una din întrebările ştiintifice

ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai „profil de risc”, ci şi

indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare că încetineşte progresia

bolii pentru cei care nu sunt homozigoţi pentru ApoE4. Pe de altă parte, există şi studii cu

rezultate negative privind valoarea predictivă a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu

relevant este cel al  promotorului sintezei 5-LO. Ȋn urmă cu câţiva ani s-a observat că

inhibitorii căii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacienţi, variabilitate în strȃnsă

legatură cu polimorfismul 5-LO. S-a tras concluzia că putem stabili un tratament diferenţial,

în funcţie de genotipul pacientului, concluzie extrapolată de la astm la boala Alzheimer.

Un alt exemplu se referă la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare că este implicat in

fiziopatologia bolii Alzheimer şi care ar putea fi folosit pentru înţelegerea rolului profilaxiei

cu antibiotice în acest caz. (9)

 

294

24. 4. Verificaţi-vă cunoştinţeleAlegeți A dacă 1, 2, 3 sunt adevărate; B dacă 1, 3 sunt adevărate; C dacă 2, 4 sunt

adevărate; D dacă 4 este adevărat, E dacă toate sunt adevărate (mențiunea este

valabilă pentru primele 2 întrebări)

 

Ȋntrebarea 1:

Următoarele evenimente au loc în cazul declanşării unui răspuns inflamator:

1).Modificări la nivelul microcirculaţiei, cu creşterea calibrului vascular.

2).Creşterea permeabilităţii vaselor mici şi scăderea vitezei de circulaţie (stază).

3).Modificări ale hemostazei şi respectiv marginaţia, diapedeza, migrarea leucocitelor.

4).Creşterea vitezei de circulaţie şi scăderea riscului trombotic.

 

Ȋntrebarea 2:

Sunt false următoarele afirmaţii:

1).Febra este o dovadă a alterării sistemului imun.

2).Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar

putea explica (parţial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de

către acelaşi agent etiologic.

3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator  al etapei de vindecare este eliberarea

unor factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze.

4).Modificările fiziopatologice apar independent de cauza inflamaţiei sau, cu alte cuvinte,

indiferent de „agentul determinant”.

 

Alegeţi doar un răspuns corect:

Ȋntrebarea 3:

A).Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci

depăşirea capacităţii de termoreglare.

B).Persoanele mai în vȃrstă au o abilitate scăzutăde a genera caldură, astfel că o

temperatură  nu foarte crescutăne pune în situaţia de a sta liniştiţi, vȃrstnicul respectiv nu

are sigur nici un proces inflamator în derulare în organism.

C).Ȋn mare, vorbim de febră între 37-38°C şi de subfebră peste 38°C.

D).Cel mai fidel loc de preluare a temperaturii corporale este axila.

E).Infecţiile generalizate superficiale nu pot genera febră.

 

Ȋntrebarea 4:

A).Fibrinogenul va fi mereu normal într-o inflamaţie de orice etiologie.

B).PCR este secretată de către adipocite și ficat în mod fiziologic, însă valori mai mari de

1mg/dL indică existenţa unui proces inflamator.

C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecţie localizată sau generalizată.

D).VSH-ul reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge coagulat,

295

într-o oră.

E).Ceruloplasmina şi amiloidul P seric nu sunt RFA (reactanţi de faza acută).

 

Ȋntrebarea 5:

A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria

meningitidis nu pot provoca  inflamaţii exsudative purulente.

B).Inflamaţiile  fibroase, care reprezintă acumularea de fibrinogen, cu apariţia fibrinei şi

formarea de depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”, nu apar în

pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică.

C).Vindecarea propriu-zisă începe tardiv în cursul procesului inflamator.

D).Inflamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular,  apar

în infecţia cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecția cu diferite specii

de Brucella sau datorate prezenţei unui corp străin.

E).Ȋn miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp predomină procesele

distrofice şi necrobiotice, care corespund inflamației seroase.

25. Toleranța imună25. 1. Introducere

Definiţie: Toleranţa imună reprezintă lipsa răspunsului imunologic indusă de

prezentarea unui antigen la celulele imunologic competente.

Toleranţa imunologică reprezintă un proces complex, încă incomplet studiat, ce este intricat

cu procesul de maturare a celulelor imunităţii adaptative.

Pentru a menţine homeostazia imunologică, indivizii trebuie să fie aresponsivi faţă de

antigenele proprii (numite self). Limfocitele activate de auto-antigene se distrug

(inducţia apoptozei - proces cunoscut şi sub numele de "moarte celulară programată"), sunt

inactivate (inducţia anergiei) sau îşi schimbă specificitatea (Figura 1.)

296

Figura 1. Schemă generală reprezentând posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor

autoreactive, la nivelul organelor limfocitare centrale cât şi în periferie. Celulele sistemului limfocitar

provin dintr-o populaţie suşă (stem), comună limfocitelor T şi B, ce îşi are sediul în măduva

297

hematogenă. Limfocitele T migrează în timus pentru a continua dezvoltarea. Ambele seturi

limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule prezintă receptori.

Acestea au potenţial auto-reactiv, astfel încât, fără mecanisme de reglare, ar putea duce la apariţia

unor boli autoimune. Mecanismele implicate în reglarea răspunsului limfocitar sunt: apoptoza,

anergia, editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii şi supresia de către acestea a

răspunsului imunitar.

Toţi indivizii moştenesc, în mare, aceleaşi gene care codifică receptorii antigenici.

Rearanjarea acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite

organismului să răspundă faţă de o paletă foarte largă de antigene. Pentru a ajunge la

acest nivel de variabilitate, rearanjarea genelor codante are loc la întâmplare. (NB: Doar

genele codante pentru receptorii antigenici suferă procesul de rearanjare, nu întreg

genomul limfocitar.)

Invariabil, unii din receptorii generaţi vor recunoaşte auto-antigene. Celulele

ce poartă aceşti receptori trebuie eliminate, sau organismul riscă să iniţieze un răspuns

împotriva propriilor ţesuturi. 

Rreactivitate faţă de auto-antigene se numeşte autoimunitate.

Imunogenitatea antigenului este dictată de caracteristicile fizico-chimice ale antigenului cât

şi de condiţiile în care acesta este prezentat sistemului imun. Deducem de aici că nu toate

antigenele sunt capabile să inducă un răspuns imun. 

După acest criteriu, putem clasifica antigenele ca fiind:

Antigene imunogene - antigene capabile să inducă un răspuns imun.

Antigene tolerogene - antigene capabile să inducă toleranţă imunologică.

Calităţile antigenice care dictează statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate în

Tabelul 1:

FactorFavorizează stimularea răspunsului imun

Favorizează toleranţa imunologică

CantitateCantitatea optimă diferă în funcţie de

antigenDoze înalte

Persistenţă De scurtă durată Prelungită

Modul de pătrundere

Subcutan, intradermic; Absenţa în organele limfoide primare*

Intravenos, oral; Prezenţa în organele limfoide primare*

Prezenţa adjuvanţilor

Adjuvanţii stimulează celulele THÎn lipsa adjuvanţilor, antigenele sunt non-

imunogene sau tolerogene

Proprietăţile APC Nivel ridicat de costimulareNivel scăzut de costimulare sau citokine în

focar

TH: T Helper. APC: Celulă Prezentatoare de Antigen (Antigen Presenting Cell)

298

25. 2. Mecanisme generale ale toleranţei

Toleranţa rezultă din recunoaşterea antigenelor de către subseturi limfocitare

specifice. Aceste limfocite, prezente şi la indivizii sănătoşi, recunosc antigene proprii de pe

APC, dar reacţionează într-o manieră care induce toleranţa şi nu un răspuns imun.

Toleranţa poate fi indusă în limfocite imature în organe limfoide centrale (toleranţă

centrală), sau în limfocite mature în organe periferice (toleranţă periferică).

Toleranţa centrală reprezintă un proces intricat cu maturarea limfocitară. În cadrul

acestuia, limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa răspundă la

auto-antigene prezentate. Aceasta se referă la:

- antigene exprimate ubicuitar 

- antigene circulante

prin expunerea acestora pe celule specializate în timus (antigenele poartă numele de timo-

dependente) sau captate direct de LB în măduva hematogenă (antigene timo-

independente). Toleranţa centrală nu este un mecanism perfect şi necesită consolidare prin

mecanismele toleranţei periferice (unele antigene sunt exprimate numai în ţesuturile

periferice).

Caracteristicele limfocitelor sine-tolerante sunt rezumate în Tabelul 2:

Caracteristică Limfocite T Limfocite B

Locul principal al inducerii de toleranţă

Timus (cortex); Periferie Măduva hematogenă; Periferie

Faza de maturare sensibilă la toleranţă

Limfocite T CD4+CD8+ (dublu pozitiv) Limfocite B imature (IgM+IgD-)

Stimuli ce induc toleranţa

Central: aviditate ridicată a recunoaşterii antigenelor în timus

Periferic: prezentarea antigenică de către APC ce nu prezintă molecule

costimulatoare

Central: recunoaşterea antgenelor multivalente în măduva hematogenăPeriferic: recunoaştere antigenică în

absenţa semnalelor de la LT sau costimulării

Mecanismele pricipale ale toleranţei

Toleranţă centrală: deleţia (apoptoză), dezvoltarea limfocitelor T reglatorii

Toleranţă periferică: anergie, apoptoză, supresie

Toleranţă centrală: deleţia (apoptoză), editarea receptorilor

Toleranţă periferică: anergie, excludere foliculară, apoptoză

25. 3. Toleranţa Limfocite TProcesul de distrugere a limfocitelor T imature reactive la auto-antigene este încă

incomplet elucidat. Informaţiile disponibile momentan sunt în principal bazate pe dovezi in

vitro.

299

25. 3. 1. Toleranţa LT CentralăPe parcursul maturării în timus, limfocitele T trebuie să posede două caracteristici

esenţiale, care stau la baza funcţionării sistemului imun. Astfel, reamintim conceptul

de dublă selecţie necesar pentru maturarea LT şi migrarea lor din timus:

- selecţie pozitivă – trebuie să recunoască receptorul MHC II, prezentat pe timocite

- selecţie negativă – nu trebuie să recunoască antigene expuse în timus

În timpul dezvoltării, toate limfocitele ce se dezvoltă în organele limfoide centrale trec

printr-o fază în care sunt expuse doar la auto-antigene. Astfel că, în timus, limfocitele T

care recunosc cu afinitate crescută un astfel de auto-antigen sunt distruse.

Pentru a asigura o selecţie cât mai bună a limfocitelor, este necesar ca în această etapă

limfocitele să întâlnească cât mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat,

timocitele exprimă antigene "periferice" după inducţia factorului de

transcripţie AIRE – AutoImmune REgulator. Trebuie reţinut că (aproape) toate celulele din

organism conţin molecule identice de ADN. Astfel, sub acţiunea promoterilor corecţi,

celulele pot exprima orice antigen prezent în organism. 

În cazul în care limfocitele CD8+ nu satisfac condiţiile de selecţie, se induce

fie apoptoza, fie anergia. Aceste mecanisme vor fi detaliate în cadrul secţiunii următoare,

ele fiind comune toleranţei centrale şi periferice.

Ca o consecinţă a recunoaşterii de antigene self, limfocitele CD4+ sunt transformate

în limfocite reglatoare. Acestea îşi schimbă fenotipul imunologic (markerii de suprafaţă)

şi funcţional (devin supresoare). În periferie, limfocitele reglatoare vor interacţiona cu

limfocitele T, contribuind la supresia răpunsului imunologic prin secreţia citokine anti-

inflamatorii (ex: IL-10).

25. 3. 2. Toleranţa LT PerifericăToleranţa LT Periferică reprezintă procesul prin care limfocitele mature, în organe

limfoide periferice devin incapabile să răspundă la auto-antigene.

Importanţa  clară este reprezentată de toleranţa faţă de antigenele specifice ţesuturilor

periferice ce nu sunt abundent exprimate în timus. Consolidează toleranţa indusă central.

Am menţionat în alte capitole ale acestei cărţi, rolul critic al semnalelor

costimulatoare pentru declanşarea răspunsului imun. (vezi capitolul 13. Molecule de

adeziune; Citokine; Mesageri secunzi.)

 

Expunerea LT CD4+ la antigene, în absenţa costimulării APC, poate induce anergie.

Astfel este posibil ca antigene periferice prezentate subseturilor LT autoreactive, în lipsa

reacţiei imunităţii native (inflamaţiei) să inducă toleranţa.

Experimentele au arătat ca în lipsa co-stimulării de către cuplul molecular B7-CD28,

300

semnalul transmis de TCR nu este suficient pentru a induce răspunsul imun şi induce

toleranţa prin anergie sau apoptoză (Figura 2).

Figura 2. Răspunsul în urma interacţiunii celulelor sistemului imun aflate în diferite

stadii de activare. În lipsa unor semnale de activare date de inflamaţie, macrofagele şi

limfocitele imature imunologic vor conduce la toleranţă.Celulele APC mature sunt

caracterizate de prezenţa pe membrana lor a ligandului costimulator numit B7. Celulele LT

mature prezintă pe membrană receptorul CD28, iar din interaţiunea lor, se transmit

semnale stimulatoare, rezultând în activarea şi proliferarea LT. În absenţa uneia dintre cele

două molecule, se induce anergia. LT imature prezintă, în loc de CD28, o moleculă

inhibitoare, numită CTLA4. Funcţia moleculei CTLA4 este de fosfatază, cu rolul fiziologic de

a contra-regla răspunsul imun.

301

Anergia reprezintă o stare caracterizată de incapacitatea limfocitelor de a nu răspunde

la stimuli. Aceasta este indusă în urma interacţiunii cu un auto-antigen şi inducerea

toleranţei. S-au descris o serie de factori epigenetici şi morfologici (markeri de suprafaţă)

caracteristici limfocitelor anergice, dar ne vom opri asupra caracterelor funcţionale:

- scăderea expresiei de molecule TCR, creşterea turn over-ului acestor molecule

- recrutarea tirozin fosfatazelor cu rolul de a diminua semnalizarea TCR

- semnale inhibitorii de la molecule de tip CTLA4 care competiţionează cu CD28 pentru

legarea moleculelor stimulatoare B7.

Este posibil ca celulele dendritice rezidente în organe limfoide sau organe periferice să se

afle într-un stadiu imatur, exprimând puţine molecule B7. În lipsa semnalului costimulator,

LT devin anergice.

 

LT Reglatoare (LTR) au fost extensiv caracterizate fenotipic (CD4+, CD25+, foxP3+) şi

totuşi incomplet funcţional. Sunt formate prin recunoaşterea antigenelor self in timus.

Acţiunea lor este periferică, unde au rolul de a completa toleranţa centrală.

Acţionează prinsecreţia de IL-10 si TGF-β, cu rol anti-inflamator.

- secreţia acestor molecule blochează activarea şi functia celulelor LT efector şi a

macrofagelor.

- unele experimente demonstrează inhibarea APC prin contact direct a LTR

Deşi acest subset este cel mai bine studiat, s-au descris mai multe fenotipuri reglatoare.

Se caută defecte de dezvoltare a LTR in boli autoimune precum DZ1 (Diabet Zaharat tip I) şi

SM (Scleroză Multiplă).

 

Apoptoza reprezintă, într-o definiţie simplistă, „moartea celulară programată”. Acest

proces este rezultatul activării unor pachete enzimatice complexe care duc la fragmentarea

ADN-ului şi digestia proteinelor celulare, cu menţiunea importantă cămembrana

citoplasmatică rămâne intactă.

Limfocitele T care recunosc molecule antigene proprii sau sunt expuse pentru lung timp la

un anumit antigen mor prin apoptoză.

Căile biochimice care induc apoptoza sunt:

- Calea Mitocondrială (Bim)

Limfocitele T care recunosc antigene fără costimulare sau în absenţa inflamaţiei activează

un răspuns pro-apoptotic, prin proteina Bim (membră a familiei Bcl-2).

Molecule aflate in membrana mitocondrială, reglează stabilitatea acesteia. Aceste molecule

au diverse roluri, fiind pro- si anti-apoptotice, cât şi molecule senzor pentru diverşi stresori.

Citocromul C este sechestrat în mod normal în interiorul mitocondriei, iar eliberarea sa în

citoplasmă este mediată de canale sensibile la moleculele pro-apoptotice de tip Bax/Bak.

Citocromul C joacă un rol important, ca marker al destabilizării membranei mitocondriale şi

activator al caspazelor. Molecule precum Bcl şi Bcl-XL au rolul de a stabiliza canalele

mitocondriale, având astfel rol anti-apoptotic.

302

- Calea Receptorilor Morţii (Fas-FasL)

Stimularea repetată a LT conduce la co-expresia unor receptori care, activaţi, induc

apoptoza.

În LT CD4+, receptorul implicat în inducerea apoptozei este numit Fas (CD95). Acesta este

membru a familiei TNF şi conţine, în porţiunea intracelulară domenii specializate care

traduc semnale pro-apoptotice. De menţionat că FasL este o moleculă cvasi-ubicuitar

exprimată, contribuind la menţinerea toleranţei – interacţiunea LT CD8+ cu MHC I de pe

ţesuturi, în lipsa citokinelor de la LT CD4+ duce la dominanţa relativă a semnalelor

transmise de Fas. Trimerizarea Fas duce la inducerea programului pro-apoptotic prin

activarea unor serin-proteaze numite caspaze. Acestea induc degradarea proteinelor

intracelulare şi fragmentarea ADN.

Deşi caspazele pot induce apoptoza separat, cele doua mecanisme se autopotenţează.

Caspaza 8 activează molecula Bid care activează şi calea mitocondrială de apoptoză.

(Figura 3)

Figura 3. Schema reprezintă cascadele intracitoplasmatice care conduc la activarea

programului apoptotic şi punctul de intersecţie reprezetat de Caspaza 8 şi Bid.

25. 4. Toleranţa Limfocitelor B25. 4. 1. Toleranţa LB Centrală

Asemănător LT, toleranţa centrală a LB este indusă atunci când limfocitele imature,

recunosc cu afinitate mare un antigen. Diferenţa constă în faptul că aceste antigene sunt

de obicei circulante în sânge şi se leagă direct de BCR (B Cell Receptor). 

303

Editarea BCR reprezintă un mecanism specific de toleranţă a limfocitelor B.

Mecanismul implică reactivarea unor enzime (RAG1 şi RAG2) ducând la

rearanjarea genelor VJD şi formarea imunoglobuline cu o nouă specificitate. Acest proces

este cu atât mai intens cu cât semnalul este mai puternic (legare multivalentă). Procesul de

editare BCR este un important mecanism de prevenire a apariţiei de clone LB auto-reactive.

Dacă editarea dă greş şi LB continuă să recunoasca un antigen propriu, se

induce apoptoza.

Un semnal mai putin putenic duce la instalarea anergiei. 

Figura 4. Schemă a mecanismelor implicate în toleranţa limfocitelor B, centrală şi periferică.

Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a

cauza distrugeri ţesuturilor organismului.

25. 4. 2. Toleranţa LB PerifericăMecanismele implicate sunt asemănătoare, fiind reprezentate de:

- Anergie

- Apoptoză – interacţiunea Fas - FasL de pe LTh antigen-specifice

- Excluzie foliculară – un alt mecanism LB-specific. Limfocitele B care recunosc un antigen

propriu au puţine molecule CXCR5, care în mod normal ghidează limfocitele B în zona

304

foliculară a nodulului limfatic. În mediu extrafolicular, LB nu primesc suficiente semnale de

supravieţuire.

Scopul unui răspuns imun bine-reglementat este să apere gazda de patogeni, fără a cauza

distrugeri ţesuturilor organismului.

25. 5. Toleranţa imunologică în sarcină

O condiţie specială o reprezintă inducerea toleranţei în cadrul perioadei gestaţionale. S-

a demonstrat că, în trimestrul second, 20-25% din LT din splină au un fenotip TLR, iar

nivelul de TGF-β este crescut. Aceste populaţii Treg revin la normal la scurt timp după

încheierea sarcinii. Controlul acestui status imun pare sistemic, întrucât pierderea sarcinii

duce la revenirea la statusul imun normal [1]. Incubarea culturilor splenice cu alo-antigeni,

a dus la o activare slabă [2]. În timpul sarcinii, timusul produce cantităţi mari de

limfopoietină, ce face ca celulele dendritice placentare să transforme LT CD4+ în fenotip

CD25+ foxP3+, capabile de secreţia IL-10 [3].

25. 6. Oprirea răspunsului imunPână acum am discutat despre mecanismele prin care sistemul imun devine

neresponsiv faţă de auto-antigenele expuse de ţesuturile proprii. Menţinerea relativ

constantă a numărului de limfocite în faţa numeroaselor stimulări antigenice întâmpinate

de individ este o componentă vitală pentru menţinerea homeostaziei. (Figura 5)

305

Figura 5. Schemă a fazelor răspunsului imun, cu expansiunea clonală şi contracţia

limfocitară.

Răspunsul imun este auto-limitat, scăzând în intensitate pe măsură ce antigenele

implicate în declanşarea sa sunt eliminate. Astfel, se revine la un status de bază al

sistemlui imun, care devine pregătit de o nouă încercare antigenică. Apoptoza şi inactivarea

limfocitelor sunt mecanismele principale implicate în homeostazia răspunsului imun, astfel

încât organismul poate să faţă la generarea expansiunea clonală din cadrul stimulării

răspunsului imun. Proliferările anarhice ale limfocitelor sunt întâlnite în cadrul limfoamelor,

cu consecinţe grave.

În urma eliminării antigenelor, limfocitele suferă o fază de contracţie, în care majoritatea

celulelor care răspund la stimulul antigenic sunt pierdute. Faza de contracţie este în

principal datorată morţii programate a limfocitelor, care, în lipsa semnalelor de

supravieţuire din mediu, activează un program apoptotic. Antigenele, semnalele

costimulatoarea şi citokinele dezvoltate în focarul inflamator au ca funcţie blocarea

semnalelor pro-apoptotice şi permit supravieţuirea limfocitelor atâta timp cât provocarea

antigenică există.

Se consideră că majoritatea clonelor generate în faza de expansiune sunt sortite a

deveni limfocite-efector, cu viaţă scurtă. Spre deosebire de limfocitele-efector, în cadrul

răspunsului imun se generează şi limfocitele-memorie. Acestea sunt silenţioase din punct

306

de vedere funcţional şi au o viaţă lungă, fiind capabile să răspundă repede în cazul întâlnirii

antigenului faţă de care sunt sensibile.

CLTA-4 începe să fie exprimată în cantităţi mari după 3-4 zile de la activarea limfocitară.

Astfel, este posibil ca CTLA-4 să joace rolul unui stimul fiziologic de oprire a sistemului

imun. Această moleculă competiţionză direct cu CD28 pentru a se lega de B7 de pe APC

(blocarea semnalului costimulator). Un alt mecanism de acţiune îl reprezintă recrutarea de

fosfataze, care defosforilează regiunile ITAM ale CD3 şi ζ, blocând semnalul TCR. Alte

molecule de inhibare a răspunsului imun au fost descrise, dintre cele mai studiate fiind PD-

1. (Figura 6)

Figura 6. Inhibiţia semnalelor B7 şi TCR prin exprimarea în număr mare a CTLA4 la

câteva zile de la activarea limfocitară.

Antibody feedback

Anticorpii IgG inhibă activarea limfocitelor B prin formarea de complexe antigen-anticorp

(CAA) cu antigene polivalente.  CAA se cuplează, prin porţiunea Fc a anticorpilor cu

receptorul specific de pe limfocite B, FcγRIIB (sau CD32). Aceşti receptori conţin secvenţe

care, odată fosforilate, recrutează fasfataze (SHIP).  Prin legarea simultană

307

 

Figura 7. Inhibiţia semnalelor activatoare prin complexele antigen-anticorp formate de

interacţiunea anticorpilor cu antigene polivalente şi receptori Fc speciali.

Una din consecinţele inflamaţiei este fibroza tisulară. În lipsa unei controlări judicioase a

semnalelor ce întreţin inflamaţia şi răspunsul imun, organismul ar suferi leziuni induse de

aceste mecanisme de apărare. Ca urmare a citokinelor secretate în focarul inflamator,

fibroblastele devin active metabolic, ducând la producţia şi secreţia de colagen. În cazul

inflamaţiei moderate, ca cea întâlnită într-o stimulare normale a sistemului imun de către

un agent patogen comun, fibroza este minimă iar citoarhitechtura şi fiziologia tisulară

rămâne fără consecinţe – un astfel de grad de fibroză este fiziologică; în cazul inflamaţiei

severe sau cronice, fibroza este importantă şi duce la disfuncţii organice profunde. Unul din

mecanismele care rămân încă mult investigate sunt translaţia epitelio-mezenchimală prin

care, tot sub influenţa produşilor inflamatorii, celulele epiteliale trec în fibroblaşti sau

miofibroblaşti care sunt responsabile de fibroză [4]. Este lesne de înţeles că aceste

modificări sunt cu atât mai importante în organele parenchimatoase ca plămânul, rinichiul

şi ficatul în care epiteliile înalt-specializate au rol foarte important. Pierderea masei

epiteliale induce disfuncţii severe ale funcţiei acestor organe.

25. 7. Povestire adevărată308

Deşi nu reprezintă o metodă terapeutică utilizată în tratamentul bolilor infecţioase,

trebuie recunoscută importanţa terapiei .Reţelele imunoreglatoare dezvoltate în decursul

ontogenezei organismului sunt rezultatul unei istorii complexe, marcată de repetate

interacţiuni cu factori microbiali, rezultând în comensalism de scurtă/lungă durată, sau

infecţie acută/cronică/latentă.

Această istorie a fost numită “biografia” sistemului imun, jucând un rol în sănătate şi boală.

microclimatul tumoral are efect de supresie asupra sistemului imun. Totodată, tumorile

care declanşează un răspuns limfocitic pronunţat au un fenotip mai blând şi un prognostic

mai bun. Interacţiunile celulelor neoplazice cu sistemul imun sunt extensive. Trebuie readus

în discuţie efectul carcinogen pe care îl poate avea inflamaţia cronică dar şi anergia pe care

o prezintă pacienţii cu neoplasm activ.

Căile reglatoare care inhibă răspunsul imunologic în cancer sunt caracterizate din ce în ce

mai bine, iar studiul lor a dus la descoperirea unor noi ţinte terapeutice. Ipilimumab este un

anticorp IgG1 monoclonal uman, care, datorită inhibării CTLA-4, are rol în activarea

imunităţii anti-tumorale.

Studii de faza 2 au fost deja efectuate, folosind Ipilimumab atât în monoterapie cât şi

împreună cu alţi agenţi (inclusiv alte vaccinuri anticanceroase). Un studiu multicentric,

randomizat publicat de curând, a implicat trei braţe de tratament – Ipilimumab+Gp100 /

Gp100 monoterapie / Ipilimumab monoterapie. Gp100 este o proteină menlanosomală, ce

şi-a dovedit eficacitatea prin îmbunătăţirea răspunsul în pacienţii trataţi cu doze mari de

interleukină-2. S-a demonstrat astfel, pentru prima oară într-un studiu randomizat, că

Ipilimumab, singur sau în combinaţie cu Gp100, a îmbunătăţit supravieţuirea pacienţilor cu

melanom malign metastatic, comparând cu cei ce au primit monoterapie cu Gp100.

Este pentru prima oară când o terapie îmbunătăţeşte supravieţuirea pacienţilor cu

melanom metastazat. Datorită efectelor de derepresare a sistemului imun, această terapie

poate părea relativ nespecifică. Efectele adverse serioase (inclusiv necroza hepatică

fulminantă), deşi pot fi tratate cu doze mari de corticosteroizi, pun probleme. Succesul

înregistrat de Ipilimumab dezvoltă un cadru conceptual pentru continuarea studiilor folosind

imunomodulatoare (de orice formă) în boala neoplazică. Vaccinarea cu celule neoplazice

întregi, sau antigene specifice, cu DC-uri încărcate cu antigene specifice sau autotransfuzia

cu limfocite T anti-melanom activate şi expansionate in vitro, toate au potenţial de a fi

folosite în arsenalul împotriva melanomului malign.

26. Diagnosticul în bolile infecţioase – prima parte 

309

26. 1. Introducere. Relevanţa diagnosticului în bolile infecţioase

în bolile infecţioase (numite de către unii autori şi boli transmisibile; transmisibile sunt

însă şi maladiile genetice, fără a fi în acelaşi timp şi infecţioase) diagnosticul are o

importanţă considerabilă (uneori decisivă, influenţând în mod direct prognosticul).

De stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului pot depinde

atât salvarea/vindecarea/îmbunătățirea stării de sănătate a bolnavului,

cât şi succesul măsurilor de prevenire/profilaxie care trebuie iniţiate cât mai rapid

posibil, pentru a preîntâmpina dezvoltarea unui eventual focar epidemic (izbucnire

epidemică, „outbreak”) sau chiar a unei epidemii. De exemplu, ignorarea primului caz al

unei boli infecţioase grave (holeră, febră tifoidă, difterie, meningită meningococică etc.)

poate avea consecinţe clinice şi epidemiologice foarte importante.

În prima parte a manualului am prezentat datele de bază, necesare oricărui diagnostic

microbiologic (direct sau indirect).

Având la bază aceste cunoştinţe, în partea specială vom aborda fiecare gen în parte,

urmărind o serie de noţiuni pe o schemă asemănătoare (de menționat că acest stil poate fi

util indiferent de etiologia bacteriană, fungică, parazitară sau virală, cu anumite

particularități).

Dorim să subliniem că în ”viața reală”, pe măsura acumulării cunoștințelor și experienței în

practica de zi cu zi, fiecare va putea să ajungă la o modalitate de abordare optimă.

În fiecare capitol vom exemplifica modul în care se poate face diagnosticul de laborator,

folosind o schemă generală de diagnostic (prezentată în capitolul 27) pentru infecţiile

produse de principalele microorganisme studiate.

Considerăm că utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a

cunoştinţelor precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea unor principii utile,

indiferent de specialitatea care a fost / va fi aleasă ulterior.

Microbiologia este, după părerea noastră, o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate

practică. Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru toţi cei

implicaţi în sistemul sanitar; cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie

de anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase (aşa cum s-a întâmplat spre exemplu

într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de

spital/nosocomiale).

 

310

26. 2. Contextul actualDacă în urmă cu circa 40 de ani, la nivel internaţional a început să se considere (în mod

absolut eronat) că problemele legate de bolile infecţioase sunt din ce în ce mai puţin

importante (eroare carea creat şiîncă mai creează probleme în sănătatea publică la

nivel naţional şi internaţional), în ultimii 13-14 ani (în special începând cu anul 1998) s-a

dovedit, concret, că bolilor infecțioase trebuie să li se re-acorde importanţa cuvenită.

În opinia noastră, referința în domeniu este reprezentată de către DECIZIA

2119/98/CE A PARLAMENTULUI EUROPEAN ȘI A CONSILIULUI din 24 septembrie 1998, de

creare a unei rețele de supraveghere epidemiologică și control al bolilor

infecțioase/transmisibile în Comunitate, a cărei traducere în limba română poate fi

examinată la http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?

uri=CONSLEG:1998D2119:20071228:RO:PDF

Pornind de la această DECIZIE au fost elaborate numeroase acte normative în domeniu iar

fondurile alocate au sporit substanţial, încercând să se „vindece” situaţia la care se

ajunsese datorită erorilor făcute anterior.

Şi în ţara noastră, preocuparea faţă de sănătatea publică în general şi faţă de

microbiologia în sănătatea publică în mod particular a crescut începând cu anul 1997, chiar

înainte ca primele decizii și directive ale UE să apară şi să fie publicate în documentele

oficiale.

Astfel, activitatea desfăşurată în domeniul reformelor pentru sănătatea publică în România

a fost în acea perioadă, din acest punct de vedere, destul de aproape de reforma care a

avut loc în restul UE.

Diferitele proiecte şi programe iniţiate în special în perioada 1997-2000 (iniţial în colaborare

cu CDC, Atlanta, GA şi OMS, Copenhaga sau OMS, Geneva) și-au găsit concretizarea în

aplicarea unor măsuri cu mare importanţă la nivel naţional:

reabilitarea centrelor de referinţă pentru microbiologie,

reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei,

adaptarea la standarde internaţionale a sistemului de diagnostic, prevenire şi control

pentru bolile cu transmitere sexuală,

menţinerea la un nivel corespunzător a imunizărilor pentru a preveni bolile

prevenibile prin vaccinare,

includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor

infecțioase la nivel european etc.

Totuşi, dorim să subliniem faptul că prima încercare (reuşită) pentru reforma sistemului

de supraveghere a bolilor infecţioase a fost înregistrată în perioada 1990-1991. Echipa

formată atunci, echipă care a început adevărata supraveghere pentru sănătatea

311

publică, a fost din păcate distrusă în anul 1992, arătând încă o dată influenţa negativă a

politicului în sănătate.

Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere

a bolilor transmisibile în Balcani. În anul 2000, a fost organizată una dintre cele mai

importante întâlniri cu scopul armonizării supravegherii bolilor infecţioase în Europa

(Consensus Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile

2000). Prezentarea pe care unul dintre coordonatorii prezentului volum a făcut-o cu acest

prilej, discuţiile care au urmat în „ateliere de lucru”, întâlnirile cu factori de decizie ai

Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii, iniţiativa organizării unei reţele de supraveghere a bolilor

infecțioase/transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe care am

organizat-o în decembrie 2000, la Bucureşti, prima şi singura de acest nivel în perioada

1990-2007, neegalată până în prezent) au dus la construirea unui proiect de reformă în

domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin european (Phare) pe care l-am gândit

în perioada mai-octombrie 2000, l-am scris în perioada octombrie-noiembrie 2000 (ajutat

pentru finalizare de colegii de la Direcţia de Integrare Europeană şi Programe de Sănătate

din Ministerul Sănătăţii) şi care a fost aprobat la „data istorică” de 14 noiembrie 2000.

Finanţarea a fost de circa 5 milioane EUR (circa 4 milioane EUR fonduri nerambursabile,

Phare). Implementarea fondurilor pe care le-am câştigat în anul 2000 a avut loc în perioada

2003-2004, după opinia noastră mai târziu decât a fost cazul şi cu o performanţă mai

scăzută în comparaţie cu cea care ar fi fost atinsă de echipa condusă (în perioada 1999-

2000) de unul dintre coordonatorii prezentului manual, în acelaşi timp autorul proiectului.

Chiar dacă reprezintă măsuri pentru prevenirea unor maladii virale (şi nu bacteriene

sau fungice), vom mai aminti, dintre măsurile luate în ultimii ani, îmbunătăţirea

programului de vaccinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B, în anul 1999.

Vaccinarea nou-născuţilor avea deja o „vechime” de 4 ani, dar în 1999, prin politica dusă în

domeniul sănătăţii publice, a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea

tuturor elevilor din anul I de la şcolile sanitare postliceale şi respectiv a studenţilor din anul

I din facultăţile de medicină şi stomatologie. Ulterior, cohortele de copii vaccinaţi

„apropiindu-se”, a început vaccinarea tinerilor aflaţi în clasa a XII-a şi astfel, nu numai

viitorii medici sau asistenţi medicali au beneficiat şi beneficiază de această metodă

profilactică. Politica de vaccinare a permis ca în numai câţiva ani, un mare număr de

generaţii de copii şi tineri să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise endemică la

nivelul anilor ’90.

Dacă până în anii 2000 au existat foarte bune relații de colaborare cu OMS și CDC,

Atlanta, acum principala colaborare are loc cu ECDC, Stockholm. Bazele relaţiilor cu ECDC

au fost puse în perioada 2005-2007, atât în misiuni comune [investigarea izbucnirilor

epidemice de gripă aviară, evaluarea epidemiei de rujeolă (datorată acumulării de

persoane susceptibile în perioada 2001-2004), evaluarea sistemului de supraveghere al

bolilor infecţioase în general şi al infecţiilor cu transmitere sexuală în particular etc.], cât şi

312

prin participarea experţilor români la întruniri internaţionale pe teme microbiologice sau

epidemiologice.

Odată cu integrarea României în UE a devenit posibilă şi pregătirea specialiştilor români,

prin includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor infecțioase

la nivel european, participarea (începând cu anul 2007) ca membru cu depline drepturi în

reţelele europene privind supravegherea bolilor infecţioase, în reţelele care discută viitorul

microbiologiei sau epidemiologiei la nivel european etc. Începând cu anul 2007, cetăţenii

români pot participa şi participă la modulul complet de pregătire în domeniul

epidemiologiei, la nivel european (European Programme for Intervention Epidemiology

Training, EPIET).

Fiecare dintre aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia, cât şi

cu sănătatea publică şi merită a fi cunoscute atât de către medicii cât şi de viitorii medici

care activează în sistemul sanitar românesc sau la nivel european.

27. Diagnosticul în bolile infecţioase – partea a 2-a 27. 1. Recomandări cu privire la diagnosticul integrat, în bolile infecţioase

Cu toate că în primii ani de studiu este abordată în mod special partea microbiologică

(bacteriologică, virusologică, parazitologică, micologică) a diagnosticului, este strict necesar

să menţionăm că examenul clinic îşi păstrează valoarea în totalitate.

Orice investigaţie de laborator este precedată de studierea elementelor clinice, ulterior

discuţiei cu pacientul sau aparţinătorii acestuia (anamneză). Fără un examen clinic

aprofundat şi fără evaluarea zilnică a evoluţiei din punct de vedere clinic şi paraclinic a

bolii, nici laboratorul de microbiologie modern nu poate fi utilizat la nivelul posibilităţilor

actuale. Dorim să subliniem faptul că în scopul diagnosticării bolilor infecţioase au fost puse

la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise şi obiective, dar

utilitatea lor este maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi

epidemiologic.

Aşa cum am mai menţionat şi anterior, colaborarea şi stabilirea unei echipe

interdisciplinare reprezintă un deziderat esenţial, ţinta finală fiind reprezentată de

vindecarea pacientului şi prevenirea apariţiei unor cazuri secundare.

Investigarea şi documentarea bolilor infecţioase ilustrează prin excelenţă principiul

313

„trepiedului diagnostic”, datele de anamneză servind la orientarea examenului clinic

obiectiv, care la rândul său direcţionează investigaţiile paraclinice de laborator, imagistice

ş.a. astfel încât  tabloul unitar necesar demersului diagnostic poate fi realizat prin

coroborarea datelor extrase prin toate cele trei metode.

În diagnosticul bolilor infecţioase trebuie respectate următoarele reguli:

1. Culegerea datelor reprezintă de multe ori o urgenţă; trebuie realizată cât mai curând

posibil. Toate datele necesare diagnosticării unei boli infecţioase (clinice, paraclinice şi de

laborator) trebuie obţinute cât mai rapid, chiar în prima oră după luarea în evidenţă a

bolnavului. Anamneza şi „istoricul bolii” trebuie să fie realizate riguros, de fiecare dată

(chiar şi atunci, sau mai ales atunci când situaţia pare să fie asemănătoare cu o situaţie

„cunoscută” - interpretarea datelor sub formă de „şablon” reprezintă un mare

risc!).

Spre exemplu, succesul sau insuccesul terapeutic în meningitele sau în endocarditele

bacteriene depinde de fiecare oră, câştigată sau pierdută. În cazul apariţiei unui caz de

holeră, lipsa obţinerii informaţiilor necesare (anamnestice), lipsa orientării către ipoteza

diagnostică, lipsa recoltării, examinării coprocitogramei (element esenţial = lipsa

leucocitelor) şi însămânţării produsului patologic pe apă peptonată alcalină vor putea crea

probleme atât pentru pacientul respectiv (evoluţia putând fi severă în lipsa instituirii rapide

a măsurilor de re-echilibrare hidro-electrolitică) cât şi din punct de vedere al diseminării

infecţiei (1) (de ex. în cazul în care această situaţie ar apărea în Delta Dunării, în condiţii

igienico-sanitare precare).

2. Datele obţinute în vederea diagnosticului trebuie privite ca un tot unitar;

diagnosticul de boală infecţioasă trebuie să rezulte din totalitatea datelor clinice şi a celor

de laborator considerate şi interpretate unitar. Nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice

şi nici cele ale laboratorului. Metodele de laborator, luate separat, nu permit punerea

diagnosticului, dar executarea corectă a manoperelor de laborator reprezintă o

condiţie sine qua non pentru un diagnostic corect şi util.

Este deosebit de important ca, în momentul în care luăm în calcul un diagnostic din sfera

bolilor infecţioase, să nu excludem şi alte etiologii posibile. De exemplu, o pacientă în

vârstă de 51 de ani se prezintă pentru apariţia recentă a unor leziuni eritematoase (Figura

nr. 1).

Date din anameză (tratament cu etoricoxib) corelate cu lipsa decelării altor leziuni similare

la examenul clinic obiectiv, au condus către diagnosticul de eritem fix – reacţie adversă

rară la administrarea de etoricoxib (2). Acest caz ilustrează ponderea datelor anamnestice

în formularea unei ipoteze diagnostice.

3. Este indispensabil să se stabilească diagnosticul etiologic în toate maladiile

infecţioase, însoţit de testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene pentru

tulpina izolată, având în vedere utilitatea şi importanţa tratamentului antimicrobian,

precum şi actualitatea problematicii referitoare la rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice

(3). Anamneza trebuie realizată cu rigurozitate; aprecierea statusului imunologic poate

avea o contribuţie esenţială; efectuarea unui examen clinic minuţios constituie o altă

314

condiţie a unui diagnostic complet. Pentru medic (dar şi pentru pacient) contează toate

datele obţinute prin examenul obiectiv; nici un element nu trebuie neglijat:

- faciesul bolnavului (facies = aspect caracteristic, corelat cu boala de care suferă o

anumită persoană), postura şi unele aspecte particulare;

- febra/curba termică (cu toate caracteristicile ei); trebuie folosită termometrizarea şi nu

„senzaţia de febră” (vezi și subcapitolul 24.1.);

- modificările apărute la nivelul mucoaselor şi la nivel tegumentar;

- semnele de insuficienţă respiratorie acută;

- semnele care relevă un dezechilibru hidro-electrolitic şi acido-bazic;

- modificările neurologice şi psihice etc.

În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm urmatoarele aspecte:

magnitudinea febrei,

frecvenţa şi durata episoadelor febrile,

recurenţa acestor episoade (cu/fără periodicitate),

relaţia dintre puls şi temperatură şi patternul de remisie a episoadelor febrile (4) etc.

Administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice poate altera aspectul curbei termice (5),

dar cu toate acestea, în cazurile tipice, este important de decelat prezenţa unor pattern-uri

febrile aşa-zise „clasice”. De exemplu, febra terţiară se suprapune peste ciclul de

reproducere asexuată al Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale pe când febra

cuaternară este înalt sugestivă pentru P. malariae(6). Totodată, febra continuă poate fi

întâlnită în patologiile de etiologie rickettsiană iar un pattern bifazic poate semnala febra

Dengue (5).

4. Folosirea corectă a datelor care pot fi oferite de către laborator constituie un alt

aspect foarte important. Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analize să

solicite, ce produse se recoltează de la bolnav, când şi cum să le recolteze, cum să le

expedieze / pregătească pentru expediere către laborator. Sunt de menţionat şi reţinut

următoarele reguli:

- produsele se recoltează înainte de administrarea tratamentului antimicrobian;

- se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru examinat;

- produsul trimis trebuie să fie reprezentativ pentru boala respectivă (de exemplu, spută şi

nu salivă în infecţiile respiratorii inferioare);

- produsul trebuie recoltat în perioada în care probabilitatea decelării agentului etiopatogen

este maximă (de exemplu, recoltarea pentru hemoculturi se face, pe cât posibil, în timpul

unui episod febril);

- produsul examinat nu trebuie contaminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al

transportului (recoltare şi transport în condiţii aseptice) (7);

- expedierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare produs

în parte (trebuie să existe recomandări specifice, în detaliu, la îndemâna medicilor);

- se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator;

- se urmăreşte, în timp, apariţia rezultatelor şi „se ţine legătura” cu colegii din laborator.

315

Însă, pentru ca datele de laborator să fie corecte este strict necesară respectarea unei

anumite conduite în laborator, utilizarea judicioasă a diferitelor aparate şi echipamente de

laborator şi implementarea controlului de calitate (intern şi extern) (a se vedea anexa nr.

5).

5. Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între clinician şi specialistul de

laborator. Este necesară o informare (care să includă aspecte rezultate în urma anamnezei

şi elemente clinice) a medicului de laborator făcută de către clinician (direct sau cel puţin

prin telefon) pentru orientarea cercetărilor în laborator şi pentru alegerea celor mai bune

metode de identificare a agentului etiologic. În acelaşi timp, laboratorul informează

clinicianul pe parcurs în legătură cu datele preliminare obţinute.

În cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul

microbiologic (bacteriologic şi / sau imunologic), care va fi prezentat în continuare. Pe scurt

vor mai fi notate câteva alte date referitoare (examene paraclinice, utile în diagnosticul

bolilor infecţioase).

Diagnosticul citologic: constă în punerea în evidenţă a unor aspecte celulare

caracteristice, utilizând un material prelevat de la bolnav (ex. din leziuni tegumentare sau

amprente de la nivelul mucoaselor). Spre exemplu, citodiagnosticul revărsatelor pleurale şi

al lichidului cefalorahidian poate aduce date preţioase pentru elucidarea etiologiei unei

pleurezii şi respectiv a unei meningite.

Diagnosticul histologic: prin biopsii (recoltate prin tehnică chirurgicală) sau prin puncţii-

biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plămân, ganglioni limfatici, fragmente vasculare,

mucoasă digestivă sau respiratorie) se pun în evidenţă modificări structurale caracteristice,

determinate de acţiunea agentului patogen.

Metodele de laborator nespecifice: în diagnosticul bolilor infecţioase sunt utile

informaţiile obţinute prin analiza valorii hemogramei, leucogramei (cu modificări destul de

caracteristice în anumite situaţii), vitezei de sedimentare a hematiilor, testelor de

disproteinemie, testelor enzimatice, proteinei C reactive (beta-globulină care nu se găseşte

în serul normal, apărând numai în afecţiuni inflamatorii, neoplasme şi în procese necrotice),

altor teste de inflamaţie (reactanţi de fază acută) etc.

Alte metode paraclinice: examenul radiologic poate furniza date de valoare pentru bolile

infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale, febră Q, pneumonie pneumococică

etc). Se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia,

diferite determinări biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia

computerizată, rezonanţa magnetică nucleară.

27. 2. Schema generală a diagnosticului microbiologic

Diagnosticul de laborator în microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau

micologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două 316

variante menţionate.

Aşa cum am menţionat, în continuare dorim să prezentăm etapele principale ale

diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structură pe care

urmează să discutăm, concret, diferite situaţii în cadrul capitolelor care urmează.

În celălalt volum, atunci când vom discuta recoltarea şi transportul produselor, vom

sintetiza pentru unele dintre aceste produse situaţiile posibile în momentul în care nu avem

„în faţă” un anumit gen sau o anumită specie ci produsul din care vom izola agentul

etiologic, iniţial presupus.

27. 2. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic

Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, şi anume:

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (cât mai aproape de debutul bolii,

înainte ca pacientului să i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, cât mai rapid şi

corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi

antisepsie, prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul

respectiv, de exemplu urină în cazul unei infecţii urinare, materii fecale în cazul dizenteriei,

spută în cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame în cazul unei micoze cutanate

superficiale etc) (vezi anexa nr. 6).

2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologic reprezintă de multe

ori o etapă esenţială, care poate orienta paşii următori.

Pentru examenul microscopic se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic

recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) /

Giemsa şi respectiv Gram. Este preferabil să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu (de

rezervă), în special în cazul în care produsul patologic este „preţios” (LCR, produs recoltat

prin puncţie-biopsie etc). în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară

realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la

microscopul optic, iniţial cu obiectivul 40× pentru o analiză mai generală, pentru stabilirea

câmpului microscopic sau a zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se notează

prezenţa diferitelor celule (eventual modificate faţă de normal, „burate” de

microorganisme), prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reactivităţii organismului, ex.

leucocite, surprinzând eventual fenomenul de fagocitoză), precum şi eventuala prezenţă a

microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretată cu

precauţie, în contextul dat. Chiar dacă examenul microscopic este de cele mai multe ori un

examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dată, cu rigurozitate, în anumite situaţii

putând fi foarte important şi foarte util.

317

Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de regulă

nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. Spre exemplu, în cazul materiilor fecale, se va

face o coprocitogramă, un preparat proaspăt (nativ) între lamă şi lamelă, căutându-se în

special prezenţa leucocitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu

privire la funcţionalitatea tractului digestiv). În cazul suspicionării unei infecţii urinare, se va

realiza un sediment urinar (după centrifugarea urinei), care se va examina între lamă şi

lamelă în vederea aprecierii numărului de leucocite pe câmp microscopic, în cazul în care

acestea există, în vederea aprecierii prezenţei unor cilindri leucocitari precum şi a altor

celule normale sau patologice, a prezenţei unor elemente fungice etc., date care pot fi

deosebit de utile în vederea unui diagnostic corect şi util pentru pacient.

În cazul suspicionării unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (ex.

preparatul montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraţii „negative” (tuş

de India, nigrozină), precum şi frotiurile colorate May-Grünwald-Giemsa sau Gram.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie

(mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe

care trebuie să-l izolăm; spre ex. în cazul în care infecţia este produsă de microorganisme

strict anaerobe, în lipsa condiţiilor anaerobe de cultivare este imposibilă izolarea agentului

etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite şi o temperatură mai mică decât

cea utilizată în cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine

colonii izolate (tehnica „însămânţării în poligon”) şi respectiv o cultură pură, care se va

identifica.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolată, frotiu care se va fixa şi

colora Gram sau Ziehl-Neelsen, după caz, şi se va examina microscopic. Prin examinarea

frotiurilor se vor evidenţia numai microorganisme cu formă şi tinctorialitate similară (în

cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte

morfologice diferite (8), de la aspecte cocobacilare până la forme filamentoase). În cazul

levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari.

b) Caractere de cultură: se vor examina coloniile izolate apărute pe mediile de cultură

solide şi care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiaţi inclusiv pentru levuri, de

tip R în cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosisşi Bacillus anthracis,

de tip M în cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae şi respectiv un

aspect pufos în cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt

prezentate în capitolele dedicate fiecărui gen în parte).

c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta şi pot

fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în practică a

„mediilor multi-test” permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU,

sistemele API etc). În cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.

d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazându-ne pe structura şi

318

antigenicitatea microorganismelor şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. Vom

utiliza anticorpi cunoscuţi pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre

exemplu, prin reacţii de aglutinare directă, pe lamă, se pot identifica antigenele şi respectiv

speciile şi tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacţii de aglutinare indirectă

se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru

detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus

neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc.

e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora

anumite substanţe cu rol în patogenitate (ex. coagulaza produsă de Staphylococcus aureus)

sau infecţia experimentală a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un

pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb; în cazul în care în spută

există pneumococi, animalul va muri în 24-48 de ore, iar din sângele lui se va izola o

„cultură pură” de Streptococcus pneumoniae).

f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie);

g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode

moderne) (vezi anexa nr. 7).

5. Antibiograma şi respectiv antifungigrama (testarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice antibacteriene şi antifungice, în vederea stabilirii tratamentului) se

realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave, antibiograma

difuzimetrică trebuie să fie completată de determinarea concentraţiei minime inhibitorii

(CMI) şi respectiv bactericide (CMB). În infecţii grave, cu potenţial fatal, poate fi necesară

determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de

eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă (NEB) (vezi şi capitolul 7).

 

27. 2. 2. Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic şi / sau imunobiologic.

27. 2. 2. 1. În cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezenţa (sau

se va dovedi absenţa) anticorpilor, în serul pacientului investigat, utilizând antigene

cunoscute. În diagnosticul serologic ne bazăm pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp şi

utilizând diferite tehnici trebuie să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale, şi

anume:

- există anticorpi în serul pacientului investigat?

- care este titrul anticorpilor?

- cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru; în acest sens se vor realiza minim două

determinări diferite la un interval de 7-10 zile; această analiză ne va permite să diferenţiem

situaţia unei afecţiuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, în 319

mod clasic de 4 ori), de situaţia în care pacientul este deja în convalescenţă (titrul

anticorpilor la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de situaţia unui pacient cu o

afecţiune cronică (titrul anticorpilor va fi asemănător sau foarte apropiat la cele două

determinări succesive). În vederea identificării unei infecţii acute, o variantă posibilă în

majoritatea situaţiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM.

27. 2. 2. 2. În cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu,

reactivitatea pacientului faţă de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacţia la

tuberculină (PPD, preparat proteic purificat) (9) sau la candidină (10) reprezintă exemple

clasice, în acest sens. Tehnica intradermoreacţiei este folosită în mai multe scopuri şi

trebuie să avem în vedere că în funcţie de scopul urmărit şi respectiv în funcţie de

antigenul inoculat (şi de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit

(vezi anexa nr. 3).

Considerăm că pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile

microbiologiei sunt foarte utile, merită să fie înţelese şi aplicate corespunzător.

Pentru cei care se dedică microbiologiei sau bolilor infecţioase, aceste noţiuni reprezintă o

bază obligatorie, care poate fi completată utilizând pe de o parte diferitele tratate medicale

în domeniu dar şi experienţa personală dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi

practic.

27. 3. Direcţii de cercetareImportanţa reală a promptitudinii şi a corectitudinii diagnosticului microbiologic este

confirmată prin cercetări extensive în domeniu. Astfel, evaluarea performanţei actualelor

metode de diagnostic şi elaborarea de noi tehnici de laborator constituie priorităţi în cadrul

cercetării în domeniul microbiologiei şi al bolilor infecţioase.

Supravegherea epidemiologică, un proces de o importanţă colosală, depinde direct de

efectuarea unui diagnostic microbiologic prompt şi corect. În acest domeniu, bacteriofagii

sunt din ce în ce mai utilizaţi în laboratoarele epidemiologice de referinţă, servind la aşa-

numitul „tipaj fagic” (11).

Un mecanism central al patogenezei endocarditei infecţioase este considerat a fi

reprezentat de legarea bacteriilor la trombocite. De exemplu, o variantă mutantă (SF100)

de Streptococcus mitis aderă la trombocite prin intermediul unei lizine codificate de SM1,

un bacteriofag lizogenic. Această lizină este o proteină multifuncţională ce aparţine unei

clase recent descoperite de proteine ce leagă fibrinogenul (12).

Precocitatea diagnosticului este unul dintre factorii de care depinde prognosticul unei

boli. Astfel, un domeniu prioritar pentru cercetarea medicală este reprezentat de punerea la

punct a unor noi teste diagnostice, care să poată fi utilizate cât mai precoce după

momentul pătrunderii agentului patogen la nivelul organismului uman.De exemplu, un

deziderat ar fi realizarea unui test urinar pentru identificarea antigenelor specifice bolii

320

Lyme (cauzate de Borrelia burgdorferi). Până de curând, acest lucru nu a fost posibil din

cauza concentraţiilor mici ale antigenelor la nivel urinar, sub limita de detecţie a testelor

clasice. Recent, Douglas şi colaboratorii au demarat un studiu asupra rolului unui nou

biomaterial (microparticule de tip hidrogel: N-izopropilacrilamida-acid acrilic) în capturarea

şi implicit concentrarea biomarkerului urinar pentru Borrelia burgdorferi. Rezultatele

preliminare au arătat că aceste microparticule au capacitatea de a concentra de 100 de ori

biomarkerul de la nivel urinar, crescând sensibilitatea testelor antigenice urinare (13).

27. 4. Povestiri adevărate27. 4. 1. Despre diagnostic şi tratament în infecţiile urinare

Problema luată în discuţie este a unei colege mai tinere, studentă într-un „an mare” la

medicină, dar de fapt, ca şi următoarea, poate fi considerată o problemă care poate fi a

unui sistem şi nu a unui „caz particular”.

În urmă cu mai mult de un an, colega noastră primeşte diagnosticul de litiază renală şi

recomandarea de eliminare a calculilor prin litotripsie [manevră care constă în mărunţirea

calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate în mod natural prin urină; accesul la

calculi se face pe cale endoscopică şi sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate

să fie realizată cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanică), cu ajutorul ultrasunetelor

(litotripsie ultrasonică), prin unde de şoc repetate (litotripsie electrohidraulică) sau cu

ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executată, cu succes (conform

protocolului operator).

După 5 luni, în anul următor, semnele clinice şi analizele de laborator (în special urocultura

însoţită de testarea sensibilităţii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecţie

urinară (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul medic primeşte norfloxacină, timp de 10 zile.

Pentru că la 3 săptămâni de la primul diagnostic simptomatologia persistă, primeşte un nou

tratament, de această dată cu amoxicilină + acid clavulanic. La încheierea celui de al doilea

tratament, simptomatologia persistă şi colega ni se adresează solicitând un sfat,

menţionând şi că medicul urolog i-a recomandat să înceapă un tratament cu cefuroximă

(cefalosporină de generaţia a II-a) şi Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi să refacă analizele.

Tulpina de E. coli identificată la ultimul examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid

nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicină, gentamicină, rezistenţă la:

amoxicilină şi la amoxicilină + acid clavulanic şi era „intermediară” la norfloxacin (cu alte

cuvinte, putem remarca „evoluţia sub tratament” a tulpinii, iniţial sensibilă la norfloxacin şi

amoxicilină + acid clavulanic, rezistenţă „câştigată în trepte”).

La recomandarea noastră, colega se prezintă din nou la un control ecografic, conform

căruia se pun în evidenţă „elemente litiazice”. Este cunoscut faptul că litiaza renală

reprezintă unul dintre factorii de risc pentru apariţia şi persistenţa ITU.

Opinia noastră a fost ca, în acest caz, analizele de laborator să se realizeze în INCDMI

„Cantacuzino” şi pentru că era încă vacanţă iar reşedinţa nu era în capitală, colega noastră

a respectat recomandarea în a doua jumătate a lunii septembrie. Din discuţiile pe cale

321

„electronică” am aflat că medicul urolog a afirmat „că este vorba de o boală de tub renal”

şi că în aceste condiţii trebuie să evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastră

era deja îngrijorată datorită rezistenţei la tratament a infecţiei cu E. coli.

După administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizată la Bucureşti în luna septembrie a

fost „sterilă”, situaţie conformă cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor).

Totuşi, după circa 2-3 săptămâni, semnele şi simptomele revin şi colega ni se adresează din

nou, pentru un sfat, menţionând şi rezultatele obţinute la testarea sensibilităţii la

antibiotice pentru tulpina de E. coli (menţionate mai sus) şi cerând să îi recomandăm unul

dintre antibioticele din listă pentru a începe un nou tratament.

Aşa cum nici diagnosticul şi prescrierea tratamentului la telefon nu reprezintă un bun

exemplu în medicină, nici utilizarea „căii electronice” nu poate să substituie examenul clinic

şi analizele de laborator. Având în minte aceste recomandări pe care le-am învăţat, la

rândul nostru, în vremea studenţiei sau în timpul rezidenţiatului, singurul sfat pe care l-am

putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI „Cantacuzino”.

Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a

contrariat-o pe colega noastră (totuşi, rezultatul nu a fost surprinzător).

Pentru că toată această discuţie se purta, din nou, pe „cale electronică” (colega noastră se

întorsese în localitatea de reşedinţă) şi pentru că nu ştiam unde fusese realizat ultimul

examen de laborator, în primul rând am solicitat această informaţie. Aflând atât laboratorul

cât şi medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru noi o certitudine că

ultimul diagnostic este şi el corect şi, în context, existau două posibilităţi „de primă

intenţie”:

infecţie cu un alt germen din flora proprie, în condiţiile litiazei renale;

infecţie dublă, atât la nivel urinar cât şi în alt sediu, care trebuie tratată simultan,

urmând ca situaţia litiazei renale să fie rezolvată ulterior.

Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelând la unul

dintre cei mai experimentaţi colegi, unul dintre puţinii şi adevăraţii profesori din catedra de

microbiologie, în final a fost dovedită o dublă infecţie, ITU şi la nivel genital, cu Klebsiella

pneumoniae. Tratamentul infecţiei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infecţiei,

dispariţia semnelor şi simptomelor şi primirea mulţumirilor de rigoare, „prin email”.

27. 4. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic şi urmările acestei

„lipse”

Un alt coleg mai tânăr, de această dată în primii ani de studiu, a relatat după momentul în

care am discutat şi rezolvat o situaţie particulară, medicală, că în vremea copilăriei a primit

de foarte multe ori antibiotice, de regulă în cadrul unei „auto-medicaţii” stabilită în familie.

Cele mai frecvente „probleme”, ca şi la mulţi alţi copii (dacă nu chiar la toţi) erau legate de

nas-gât-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au „repetat” anual şi de

mai multe ori pe an până spre vârsta de 13-14 ani.

Se pare că un moment important a fost legat de o infecţie de acelaşi tip, cu manifestări

322

ceva mai serioase, care au determinat familia să se prezinte împreună cu tânărul nostru la

medicul de familie; acesta, analizând „auto-medicaţia” propusă a concluzionat că

respectivul medicament în cantitatea propusă reprezenta un risc pentru pacient şi în acest

context, pacientul a înţeles că nu trebuie să mai accepte medicaţia „ca atare” (chiar dacă

era minor, la acea dată). Totuşi, colegul nostru a concluzionat: „oricum a fost suficient de

mult timp să iau pastile aiurea”.

Însă, toate aceste probleme s-au arătat a fi minore, faţă de ceea ce a urmat.

Într-o toamnă, la început de liceu, într-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave

se pot petrece vinerea, în week-end, noaptea, „la sfârşit de program” etc), tânărul coleg a

revenit acasă cu dureri foarte mari în zona articulaţiei coxo-femurale, după o lovitură

aparent minoră, în cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul că

prima reacţie acasă a fost o „baie fierbinte” (dar realmente fierbinte).

După 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult şi copilul (avea totuşi numai 15 ani)

nu s-a mai putut deplasa fără ajutorul unuia dintre părinţi sau a unui cadru metalic.

Au început peripluri prin unităţi sanitare, iniţial la un spital cu profil de „urgenţe copii”,

ulterior la un spital de urgenţă „pentru adulţi”, la o secţie de ortopedie (imaginile

radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat

medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni,

pentru noi analize.

În timpul weekend-ului durerile s-au intensificat şi a fost înregistrată febra (peste 38,5ºC);

copilul nu mai putea pune „pe pământ” membrul inferior drept.

La recomandarea unor cunoştinţe, familia s-a îndreptat iniţial către cel de al treilea spital

(cu profil „de copii”). La acest spital, în tot cursul dimineţii respective, nimeni nu a găsit

timpul necesar pentru a îl consulta pe copil care menţionează, din amintiri: „nimeni nu s-a

uitat la mine, eu mă ţineam de pereţi şi mama alerga...”, motiv pentru care au plecat de la

al treilea spital şi s-au îndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil „de adulţi”. Analizele

efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaţiei (tradusă prin valorile înalte ale

reactanţilor de fază acută) şi sugerarea unei infecţii. Medicul a luat legătura cu un coleg de

la un al patrulea spital (cu profil „de copii”), suspicionând, se pare, un proces tumoral

localizat osteo-articular.

Din amintirile de copil am putea remarca «între timp trecuseră cam 5 zile, poate chiar o

săptămână, urlam de durere când încercam să merg, abia mai puteam să mă dau jos din

pat şi daca eram ajutat urlam de durere pentru că nu mai suportam să fiu atins; devenise

un chin să merg la baie pentru că oricum dura mult şi acolo nu prea mai puteam să stau ...

mi s-au făcut analize, radiografii; analizele indicau o „infecţie care creştea" în comparaţie

cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic».

Medicii, după un timp, au indicat tratament cu oxacilină, 12g/zi, iar între diagnosticele

diferenţiale luate în discuţie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoză

osoasă, reumatism şi ... în cel mai bun caz, o infecţie (copilul, actualul nostru coleg, îşi

aminteşte că după mult timp a aflat de la părinţi că a existat şi suspiciunea de cancer, dar

părinţii au ştiut acest lucru de la început; şi îşi mai aminteşte şi alte aspecte, pe care nu le

putem discuta în materialul de faţă).

323

După circa 1 săptămână de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15

metri în 30 de minute, ca să ajungă la baie („noroc cu nişte băieţi care stăteau cu mine în

salon şi mă ajutau”). A primit în continuare oxacilină 12 g/zi, a fost examinat repetat,

radiologic (se pare că s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la început şi până în

timpul acestei internări), semnele de laborator (reactanţii de fază acută) au început să

stagneze sau să evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel şi impotenţa funcţională.

La sfaturile unor prieteni, părinţii au decis să transfere pacientul în al cincilea spital, cu

profil „de adulţi”, transfer care nu a fost realizat cu foarte multă uşurinţă, dar se pare că

acest ultim transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poartă şi astăzi un deosebit respect

celor care s-au ocupat de el în clinica de ortopedie a spitalului, atât şefului de clinică dar şi

unui coleg, care la acea vreme era mai tânăr şi pe care avem plăcerea să îl cunoaştem şi

noi. Datorită suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizată

şi o scintigrafie osoasă (din fericire infirmând respectiva suspiciune); tratamentul anti-

infecţios a fost continuat iniţial cu oxacilină 2g/zi în asociere cu gentamicină 2mg/kg/corp

(de 2 ori pe zi) timp de 2 săptămâni, urmat de tratament cu oxacilină 2g/zi.

Tânărul nostru coleg îşi mai aminteşte că, înainte de transferul la al cincilea spital

tratamentul a fost administrat intra-venos „când am plecat de la ... deja arătam ca un

drogat; aveam pe mâini foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ...” iar în momentul

în care a auzit pentru prima dată că a existat suspiciunea de cancer osos a slăbit circa 4 kg

în 2 zile.

În final, pacientul a fost externat, vindecat, după o lungă perioadă de suferinţă.

Din discuţia cu tânărul nostru coleg şi din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo

încercare de diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care să fie

transmis spre analiză (înainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo

recoltare de sânge pentru hemoculturi.

Nu putem menţiona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tânărul coleg le-a acumulat

pe parcursul acestei experienţe de viaţă. Totuşi, amintim o dorinţă exprimată de acesta „de

fiecare dată când trebuie să merg la spital, mă rog să dau de un OM”.

27. 4. 3. Despre unele „teoreme” din timpul facultăţii sau rezidenţiatului

Foarte mult timp, la cursuri în timpul studenţiei sau în timpul rezidenţiatului am fost învăţaţi

că IDR cu PPD (vezi şi anexa nr. 3) „nu are nici o valoare, în România, pentru că toţi copiii

sunt vaccinaţi la naştere, pentru că tuberculoza este endemică etc.; în aceste condiţii toţi

cetăţenii români au IDR pozitiv şi o nouă testare nu va aduce nicio informaţie utilă.” Am

suspicionat de mult timp că această „teoremă” nu are acoperire reală.

În ultimii patru ani, prin colaborare cu o serie de studenţi entuziaşti (sigur, studiile trebuie

continuate şi este necesară realizarea unor observaţii pe un lot semnificativ statistic), am

început infirmarea acestor supoziţii, transmise, din păcate, multor generaţii de studenţi,

rezidenţi etc. Din cei peste 60 de studenţi care au dorit să participe la studiu, în 40,9%

dintre cazuri valoarea citirii la 48 şi 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri în timp ce în 19,7%

valoarea induraţiei a fost de peste 10 şi până la 22 milimetri. Într-un caz, consultul cu

medicul de specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrării de hidrazidă a

324

acidului izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost

salutar pentru respectivul, mai tânăr, coleg.

27. 5. Verificați-vă cunoștințeleLa următoarele întrebări se pot alege unul sau mai multe răspunsuri corecte (după caz):

1. Care dintre următoarele afirmaţii sunt corecte:

A. anamneza este cea mai importantă componentă a demersului diagnostic

B. anamneza, examenul clinic obiectiv şi investigaţiile paraclinice compun “trepiedul

diagnostic”

C. anamneza poate orienta examenul clinic obiectiv

D. examenul clinic obiectiv poate suplini anamneza în cazul pacienţilor conştienţi şi

cooperanţi

E. testele paraclinice se rezumă la tehnici de investigaţie imagistică

 

2. Următoarele afirmaţii sunt false, CU EXCEPŢIA:

A. în bolile infecţioase, diagnosticul etiologic este doar un deziderat, necontribuind

semnificativ la demersul terapeutic

B. antibiograma nu mai este de actualitate în demersul diagnostic şi terapeutic în bolile

infecţioase, cazurile de rezistenţă la antibiotice şi chimoterapice fiind din ce în ce mai rare

C.recoltarea produselor patologice trebuie efectuată înainte de administrarea tratamentului

antimicrobian

D. saliva poate înlocui cu succes sputa ca şi produs patologic recoltat în infecţiile

respiratorii inferioare

E.în cadrul examenelor de laborator, diagnosticul microbiologic are doar semnificaţie

istorică

  

3. În interpretarea curbei termice, este important să evaluăm următoarele aspecte:

A.periodicitatea episoadelor febrile

B.relaţia dintre puls şi temperatură

C.administrarea de antibiotice şi/sau antipiretice

D.pattern-ul de remisie a episoadelor febrile

E.frecvenţa şi durata episoadelor febrile

  

4. În recoltarea produselor patologice trebuie ţinut cont de următoarele elemente:

A.recoltarea pentru hemoculturi se face în timpul unui episod febril

B.se solicită examinarea produselor transmise către laborator în termen de 7-10 zile de la

recoltare

C. este importantă alegerea momentului ideal pentru recoltare

D.diagnosticul microbiologic ocupă un loc prioritar în cadrul examenelor de laborator

E. în cursul recoltării, evitarea contaminării cu alţi germeni are doar caracter de

325

recomandare, nefiind criteriu indispensabil

 

5. Următoarele afirmaţii legate de examinarea microscopică a produsului patologic sunt

adevărate, CU EXCEPŢIA:

A. se vor realiza minim două frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru

de metilen (AM) / Giemsa şi respectiv Gram

B. în cazul suspicionării unei infecţii urinare, sedimentul urinar se va examina între lamă şi

lamelă

C. prezenţa celulelor inflamatorii este un element frecvent decelat şi ca atare poate fi

trecut cu vederea

D. în cazul suspicionării unei infecţii mycobacteriene este necesară realizarea unui frotiu

colorat Ziehl-Neelsen

E.atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge, urină sau materii fecale, de

regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate

 

28. Prezentare generală a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei 

Lumea microbiană este alcătuită dintr-un mare număr de ordine, familii, genuri, specii,

subspecii, tipuri, subtipuri şi tulpini microbiene a căror prezentare face subiectul unor

importante tratate în domeniu. În lucrarea de faţă vor fi incluse informaţiile considerate

esenţiale şi care sunt organizate utilizând un stil, pe care îl considerăm folositor.

O prezentare exhaustivă, a tuturor amănuntelor, ar putea conduce la neglijarea

aspectelor care chiar nu trebuie să fie uitate, indiferent de specialitatea în care ne

desfăşurăm activitatea. Considerăm că materialul redactat este util nu numai în scopul

pregătirii unui examen (care nu ar trebui în nici un caz să fie considerat un scop în

sine) ci este (ar trebui să fie) util reţinerii unor noţiuni şi principii microbiologice care pot

permite ulterior (indiferent de specialitatea aleasă) o abordare corectă, ştiinţifică a

procesului infecţios.

Microbiologia medicală reprezintă o specialitate care poate asigura (în condiţiile în

care colaborarea între clinică şi laborator funcţionează) date foarte precise, oferind

326

suportul stabilirii unor atitudini, uneori decisive pentru evoluţia ulterioară a pacientului.

În acest sens se pot da numeroase exemple, dar ne vom opri asupra a trei dintre acestea.

În cazul în care un pacient se prezintă la medic şi afirmă că are o infecţie urinară,

medicul va putea, prin efectuarea în mod corect a anamnezei (ex. discuţia cu pacientul

respectiv) şi a examenului clinic, să realizeze un prim pas către diagnostic şi stabilirea

tratamenului. Însă certitudinea diagnosticului şi stabilirea tratamentului corect vor rezulta

numai prin examenul de laborator.

Într-o suspiciune de infecţie urinară, urocultura cantitativă trebuie precedată de examenul

microscopic al sedimentului urinar care necesită o dotare minimă (eprubete, centrifugă fără

pretenţii, lame, lamele, microscop optic nesofisticat şi mai ales,dorinţa medicului de a face

cât mai mult şi cât mai bine pentru pacienţii săi). Urina recoltată corect (adică aşa cum se

cunoaşte încă din facultate) trebuie examinată macroscopic, centrifugată iar sedimentul

urinar trebuie examinat microscopic. În circa 20 de minute (sau mai puţin) se va putea

observa eventuala prezenţă a leucocitelor în sediment, amănunt care va permite (în

contextul clinic respectiv) aprecierea corespunzătoare a situaţiei şi adoptarea atitudinii

celei mai potrivite. Utilizarea corectă a datelor de laborator va permite nu numai o

diminuare a risipei de medii de cultură şi reactivi (nu în ultimul rând a timpului celui / celor

care procesează probele) ci şi o posibilă direcţionare spre un alt diagnostic decât cel al unei

eventuale infecţii urinare, interpretată în mod mecanic sau la indicaţia / solicitarea

pacientului. Un studiu pe care nu l-am publicat a arătat că într-unul dintre spitalele din

Bucureşti, din peste 10.000 de uroculturi efectuate, s-au pozitivat mai puţin de 20%;

examinarea sedimentului urinar ar fi putut contribui la selectarea situaţiilor în care

urocultura „merita” să fie făcută.

În cazul prezenţei unor dureri de cap intense (cefalee), a apariţiei fotofobiei, vărsăturilor

fără efort, poziţiei caracteristice (antalgice) se ridică ipoteza unei meningite a cărei etiologii

nu se poate preciza fără diagnosticul de laborator. Acest diagnostic va permite

diferenţierea unor meningite în funcţie de cauză [există meningite neinfecţioase şi

meningite infecţioase (virale, bacteriene, parazitare sau fungice), iar examenul biochimic la

LCR împreună cu diagnosticul de laborator microbiologic vor putea arăta care este

etiologia]. Acest lucru este de maximă importanţă atât pentru evoluţia ulterioară, cât şi

pentru prognosticul pacientului implicat deoarece este bine cunoscut faptul că în cazul

meningitei există şi posibilitatea unei evoluţii nefavorabile, cu persistenţa unor sechele sau

chiar apariţia decesului. În cazul unei meningite (inclusiv a unei meningite meningococice),

recoltarea şi transportul lichidului cefalo-rahidian este esenţială. Este de preferat ca

medicul să ştie care sunt manevrele necesare pentru a procesa produsul patologic "la patul

bolnavului". Realizarea şi examinarea corectă a frotiurilor va permite nu numai ca în maxim

20 minute să se pună diagnosticul de meningită meningococică (prezenţa leucocitelor şi a

cocilor Gram-negativi intra şi extra-leucocitari) dar şi să se instituie tratamentul (de ex. cu

penicilină).

327

În cazul în care pacientul prezintă febră, tuse şi expectoraţie nu este recomandată

administrarea unor antibiotice doar pe baza existenţei acestor semne. Administrarea unui

antibiotic cu spectru larg (ex. tetraciclină) ar putea crea probleme suplimentare. Dacă

dorim să procedăm corect, după anamneză trebuie să urmeze examenul clinic complet,

revenind cu minuţiozitate asupra examinării semnelor şi simptomelor în relaţie cu aparatul

respirator. Dintre examenele paraclinice se realizează de obicei radiografia cardio-toraco-

pulmonară. Alte examene de laborator (aşa cum am menţionat în capitolul precedent) sunt

necesare şi trebuie efectuate. Din punct de vedere microbiologic, recoltarea corectă şi

transportul sputei reprezintă elementul esenţial. În laborator sputa va fi prelucrată, vom

realiza cel puţin trei frotiuri pe care le fixăm şi colorăm cu AM / Giemsa, Gram şi Ziehl-

Neelsen. Din momentul recoltării produsului patologic şi până la obţinerea primelor

informaţii prin examinarea frotiurilor, pot trece nu mai mult de 20-30 minute. În cazul în

care nu parcurgem aceste etape şi de ex. administrăm direct tetraciclină, evoluţia

pacientului ar putea fi nefavorabilă, chiar şi către deces, iar frotiurile realizate şi examinate

post-mortem (pe produse recoltate anatomo-patologic) ar putea demonstra prezenţa de

hife şi levuri, semnificând o infecţie fungică. Continuând cu etapa de identificare am putea

stabili, de ex., că a fost vorba de o pneumonie provocată de Candida albicans. Decesul a

fost precipitat de utilizarea iraţională a tetraciclinei, medicament care distrugând flora de

asociaţie a permis multiplicarea „în voie” a fungului respectiv. Dacă am fi examinat sputa

recoltată de la bolnav am fi putut detecta prezenţa elementelor fungice şi am fi ales

medicaţia corespunzătoare.

Bacteriile studiate pot fi grupate după mai multe criterii, dar o variantă utilă este cea în

care avem în vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de

diferiţi coloranţi.

Un prim grup important este cel care include cocii cu importanţă medicală, Gram-

pozitivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) şi respectiv Gram-negativi (meningococi,

gonococi etc).

Între bacteriile Gram-negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate drept

coci sau bacili se află parvobacteriile,cocobacilii Gram-negativi (H. influenzae, B. pertussis,

Brucella spp. etc).

Bacilii Gram-pozitivi care vor fi incluşi în prezentările din acest manual se pot grupa în

bacili nesporulaţi (Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) şi respectiv bacili Gram-

pozitivi sporulaţi (Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Totuşi, nu trebuie să uităm că există

şi alţi bacili Gram-pozitivi.

Bacilii Gram-negativi studiaţi fie aparţin familiei foarte numeroase a enterobacteriilor (E.

coli, Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp.

etc), fie sunt incluşi în genuri separate precum V. cholerae din genul Vibriosau Ps.

aeruginosa din genul Pseudomonas.

Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu destul de mare dificultate;

uneori nu se colorează şi apar sub aspectul unor zone necolorate, „fantome” bacteriene)

prin metoda Gram, dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. O

328

adaptare a tehnicii Ziehl-Neelsen este medoda de colorare Kinyoun. Specia principală

studiată este M. tuberculosis. Există şi alte specii de mycobacterii dar şi bacterii aparţinând

altor specii şi genuri, care se pot colora prin aceste tehnici.

O serie de bacterii spiralate (Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se

colorează prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate

microscopic fie în preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând

coloraţii particulare (ex. impregnarea argentică).

Până în urmă cu o perioadă de timp microorganismele aparţinând

genurilor Rickettsia, Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor. Totuşi,

proprietăţile lor fundamentale fac să le studiem astăzi între bacterii.

În obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici

aparte. Noţiunile legate de micologie sunt reluate în cadrul dermatologiei iar diagnosticul

micologic este prezentat mai pe larg în diferite tratate de specialitate.

Pentru fiecare microorganism studiat am abordat aspecte legate de încadrarea într-un

anumit gen, caracterele generale mai importante (habitat, caractere morfo-tinctoriale,

caractere de cultură, caractere biochimice, rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici,

structura antigenică şi răspunsul imun realizat în organismul gazdă, precum şi caracterele

de patogenitate).

Legat de caracterele distinctive ale microorganismului studiat am prezentat, în general

foarte succint, date cu privire la patogenia principalei afecţiuni clinice produse (cu

enumerarea mai multor entităţi clinice, de la caz la caz).

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele avute în vedere este

axat pe datele microbiologice (diagnostic bacteriologic şi respectiv diagnostic imunologic)

urmând schema care a fost deja prezentată. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare

permite o mai bună fixare a cunoştinţelor precum şi atingerea obiectivului stabilit: reţinerea

unor principii de către mai tinerii colegi, indiferent de specialitatea care va fi aleasă ulterior,

sau de către medici. Microbiologia este, după opinia noastră, o ştiinţă cu foarte mare

aplicabilitate practică. Elementele de bază ale microbiologiei sunt necesare şi utile pentru

toţi partenerii implicaţi în sistemul sanitar. Cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea

preveni o serie de anomalii şi erori care uneori pot avea consecinţe dezastruoase (aşa cum

s-a întâmplat de ex. într-o maternitate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită

unor infecţii nosocomiale contractate după naştere, în anul 2004).

În final vom oferi, pe scurt, unele noţiuni legate de tratament, modalităţile de transmitere şi

respectiv de prevenire a transmiterii germenului discutat. În privinţa datelor

epidemiologice, pentru unele dintre microorganisme / boli vor fi prezentate date concrete

(în cazul acelor maladii pentru care există un sistem de supraveghere şi datele sunt

disponibile). Exemplele vor fi redactate comparativ, pentru sistemul de sănătate american

şi cel românesc. Motivaţia alegerii datelor din USA este reprezentată de faptul că sistemul

329

american de sănătate publică şi supraveghere epidemiologică pentru sănătatea publică

poate fi privit ca un model, iar aceste date sunt publicate în mod periodic, fiind puse la

dispoziţia autorităţilor sanitare, unităţilor sanitare, medicilor şi oricărei persoane care

doreşte să obţină aceste informaţii (http://www.cdc.gov). Recomandăm, de asemenea,

consultarea site-ului http://ecdc.eu.int, site al Centrului European de Prevenire şi Control al

Bolilor Infecţioase („communicable diseases”), mai recent înfiinţat, dar cu o evoluţie rapidă

şi pozitivă.

În ceea ce priveşte tratamentul, este util să reţinem că pentru majoritatea situaţiilor este

necesară izolarea microorganismului implicat, identificarea acestuia şi testarea sensibilităţii

la antibiotice şi chimioterapice (de ex. utilizând cel puţin antibiograma difuzimetrică).

29. Genul Staphylococcus29. 1. Definiţie. Încadrare

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi,

catalază-pozitivi.

Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical

(unele dintre aceste grupuri incluzând mai multe specii).

S. aureus este şi specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884), în timp ce una

dintre speciile recunoscute mai recent,S. succinus, se estimează că ar avea o „existenţă”

de mai multe milioane de ani. Numărul speciilor din acest gen a ajuns la 35, însă numărul

este şi mai mare dacă luăm în consideraţie şi subspeciile (de ex. S.

aureus subspecia aureus şi S. aureussubspecia anaerobius).

Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de:

- S. aureus;

- S. epidermidis (produce un pigment alb);

- S. saprophyticus (produce un pigment citrin).

S. aureus reprezintă specia cel mai frecvent implicată în clinică, în timp ce celelalte două

specii sunt de obicei nepatogene. În funcţie de capacitatea de a elabora coagulază, toţi

stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupaţi ca S. aureus.

 

29. 2. Caractere generale29. 2. 1. Habitat

S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor şi mucoaselor (în special în zonele

piloase şi la nivelul vestibulului nazal).

330

Există o serie de factori care determină şi/sau influenţează starea de purtător pentru S.

aureus. O parte dintre aceşti factori sunt legaţi de apărarea la nivel de gazdă, o parte sunt

corelaţi cu anumite proprietăţi ale bacteriei. Dintre acestea, menţionăm formarea de biofilm

(caracteristică tulpinilor care se pretează portajului nazal, dar nu şi celor care nu determină

stare de portaj) (1), care pare să faciliteze nu numai creşterea supravieţuirii bacteriilor în

contextul tratamentului antibiotic, dar şi evitarea mecanismelor de apărare specifice

gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum: lizozimul, lactoferina, SLPI

(secretory leukoprotease inhibitor), catelicidine, alfa şi beta defensine (2), inclusiv beta

defensina umană 3 (HBD-3), cea mai eficientă dintre beta defensine în ceea priveşte rolul în

infecţiile cu S. aureus (3).

Deoarece unele studii arată că circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare

în mod permanent de S. aureus iar în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia

portajului temporar, s-a intuit că există un anumit grad de influenţă genetică privind starea

de purtător de S. aureus. Într-un studiu transversal recent la care au participat în mod

voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5%

dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi/sau faringian. Un studiu

similar, transversal, efectuat în 2010 în Brazilia, pe un lot comparabil de voluntari

(incluzând studenţi aflaţi în finalul anilor 1 şi 2 de facultate în domeniile: farmacie, medicină

dentară şi medicină generală), a decelat un procent de portaj nazal de 40,8% (102/250), un

CMI (50) la meticilină de 0,5 µg/mL şi un CMI (90) de 1 µg/mL. Datele obţinute de noi în

România sunt comparabile cu cele obţinute în Brazilia, cu atât mai mult cu cât există

similitudini şi la nivelul loturilor de voluntari incluse în studiu.

Stafilococii coaguloază-negativi (SCN) formează microcolonii la nivelul foliculilor piloşi (4) şi

la nivelul glandelor sebacee. Habitatul principal pentru S. epidermidis este reprezentat de

vestibulul nazal.

Deoarece au un tropism special pentru derm, stafilococii pot fi implicaţi în infecţii la

nivelul tegumentelor şi anexelor pielii (infecţii însoţite de puroi), dar pot fi implicaţi şi în

infecţii localizate la nivelul oricărui alt ţesut sau organ.

29. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm. Pe frotiul realizat din

cultura pe medii solide se poate remarca o dispoziţie în grămezi neregulate. În frotiurile

realizate din culturi pe medii lichide sau din produse patogene, se pot dispune în lanţuri

scurte, perechi sau coci izolaţi. În culturile cu o vechime mai mare de 2 zile, stafilococii pot

apărea ca şi Gram-variabil sau chiar şi Gram-negativi „la limită”.

331

29. 2. 3. Caractere de culturăSe dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C. Coloniile

au aspect de tip S, au diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de

specia izolată. Pigmentarea devine mai pronunţată după menţinerea plăcii cu mediul de

cultură încă 24-48 ore la temperatura camerei.

Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară (β-

hemoliză), dar S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine.

Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl

(exemplu mediul Chapman).

29. 2. 4. Caractere biochimiceStafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ. Fermentează

glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.

Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere

între S. aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). Stafilococii sunt catalază-pozitivi.

29. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Stafilococii sunt relativ rezistenţi faţă de agenţii din mediul extern. În culturi (bulion,

geloză), rezistă la temperatura frigiderului câteva luni; în puroi uscat pot supravieţui 2-3

luni.

Sunt relativ rezistenţi la anumite antiseptice şi dezinfectante (de exemplu, rezistă peste 30

minute la alcool 70°şi peste 10 minute în fenol 2%). Sunt distruşi în 60 minute la o

temperatură de 60°C.

29. 2. 6. Structură antigenică29. 2. 6. 1.Structuri antigenice legate de corpul celular

a). Capsula este prezentă la un număr mic de tulpini de S. aureus; este alcătuită din acid

glucozaminuronic. „In vivo“ pare a fi mai frecventă decât s-ar crede (examinând la

microscop tulpinile cultivate). Tulpina încapsulată prototip de S. aureus (tulpina Smith) dă

naştere spontan la variante necapsulate.

b). Polizaharidul A a fost identificat la S. aureus, în timp ce la S. epidermidis s-a pus în

evidenţă un polizaharid B. Ambii sunt acizi teichoici. Astăzi se cunoaşte structura ambilor

acizi teichoici, precum şi a grupărilor răspunzătoare de specificitatea antigenică a fiecăruia.

332

c). Proteina A apare ca o componentă de suprafaţă la toate tulpinile de S. aureus (proteina

Cowan). Are o greutate moleculară de 42 kDa şi poate induce apariţia de anticorpi specifici

(este imunogenă). Este de menţionat faptul că proteina A interacţionează nespecific cu

porţiunea Fc a imunoglobulinelor de la practic toate speciile de mamifere. Ca urmare a

interacţiunii dintre proteina A şi fragmentul Fc, apar o serie de efecte biologice precum:

anafilaxie locală şi sistemică la animale, reacţii urticariene la om, activarea complementului

pe calea clasică şi alternativă urmată de generarea de factori chemotactici, inhibarea

activităţii opsonizante a anticorpilor (prin competiţie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite),

proliferarea limfocitelor B umane etc. Proteina de suprafaţă A este unul dintre factorii

determinanţi ai virulenţei şi ai formării de biofilm (5), iar un studiu recent (2) a sugerat şi o

asociere a statusului de purtător nazal de S. aureus cu un nivel crescut al expresiei acestei

proteine.

d). Majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus aglutinează atunci când sunt

suspensionate în plasmă sau în soluţii de fibrinogen. Factorul răspunzător de această

reacție este o coagulază legată („clumping factor”; factor de aglutinare/agregare) la nivelul

suprafeţei celulei bacteriene. Acest factor poate fi prezent şi la circa 10% dintre tulpinile

de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană,

rezultatul poate fi pozitiv şi pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi(subspecia schleiferi).

e). Adezinele sunt proteine de suprafaţă specifice, prin care stafilococii se fixează pe

proteinele matriciale de la suprafaţa celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină,

colagen, proteina A etc). Par a fi implicate în colonizarea matricei intercelulare, în invazia

ţesuturilor şi în rezistenţa la fagocitoză.

29. 2. 6. 2.Structuri antigenice extracelulare produse de stafilococi

a). Stafilococii, mai ales S. aureus, produc o mare varietate de exoproteine imunogene.

Majoritatea sunt proteine accesorii care, în condiţii de creştere optime, sunt sintetizate la

sfârşitul perioadei de creştere exponenţială sau la începutul fazei staţionare. În condiţii

suboptime (de exemplu deficit de Mg2+), condiţii care se pot întâlni şi în ţesuturile infectate,

aceste proteine pot fi sintetizate în tot cursul fazei exponenţiale.

b). Filtratele culturilor de S. aureus coagulează plasma recoltată de la o serie de specii

animale sub acţiunea coagulazei, care este cel mai important marker pentru S. aureus. S-au

descris mai multe coagulaze antigenic distincte. Există totuşi şi tulpini de stafilococ

implicate patogenic care sunt coagulază-negative. Unele tulpini coagulază-negative produc

o metaloproteinază care are o activitate asemănătoare cu cea a coagulazei, ceea ce poate

crea probleme în identificare.

Coagularea necesită prezenţa unui factor coagulazo-reactant (FCR), care este probabil un

derivat de protrombină. Complexul coagulazei realizat cu FCR converteşte fibrinogenul în

fibrină. Procesul diferă de coagularea normală prin faptul că nu sunt necesari o serie de

factori (ex. Ca2+) iar cheagul care se formează este mai friabil şi nu se retractă. Studii

recente demonstrează că TFPI (inhibitorul căii factorului tisular), prin secvenţa sa C-

terminală, joacă un rol antimicrobian împotriva S. aureus şi împotriva altor bacterii Gram-

pozitive (Bacillus subtilis), Gram-negative (Escherichia coli şi Pseudomonas aeruginosa) şi

333

chiar împotriva fungilor Candida albicans şi Candida parapsilosis (6).

c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:

- stafilokinaza, care determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină)

sub controlul unui material genetic fagic;

- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN,

generând 3'-nucleotide;

- diferite lipaze evidenţiabile prin opacifierea agarului cu gălbenuş de ou sau prin scindarea

substanţei numită Tween; contribuie la supravieţuirea stafilococului la nivel dermic;

- hialuronidaza;

- ureaza;

- diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează).

d). În momentul se faţă se cunosc patru hemolizine produse de stafilococi. O tulpină anume

poate produce mai multe hemolizine. Unele dintre hemolizine distrug şi alte celule, ducând

la o necroză locală şi pot avea efecte letale asupra animalelor de experienţă. Principalele

caractere ale hemolizinelor sunt următoarele:

1. a-hemolizina (a-toxina) este principala hemolizină produsă de S. aureus. Are

activitate maximă asupra hematiilor de iepure; hematiile de om nu sunt susceptibile.

Afectează trombocitele şi celulele umane în cultură. Are efect dermonecrotic asupra

animalul de experienţă (injectată local) şi efect letal (injectată intravenos). Efectul ei

principal este reprezentat de producerea de spasme ale muşchilor netezi vasculari. S-a

identificat receptorul de pe suprafaţa membranei eritrocitului, o sialoglicoproteină. Este

secretată sub forma unui monomer hidrosolubil de 34.000 Da, care se rearanjează în

contact cu un receptor de membrană, formând un hexamer cilindric care străpunge

membrana celulei şi proemină la suprafaţa ei, generând un por cu un diametru de 23 nm

(există asemănări cu complexul litic C5b-C9 al C').

2.   β-hemolizina este produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar

numai de 10-20% dintre stafilococii umani. Produce o hemoliză de tip „cald-rece“. Este de

fapt o sfingomielinază C, activată de Mg2+, nu însă şi de Ca2+. Efectul (în ordine

descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de oaie, om, cobai (ceea ce corespunde cu

concentraţia de sfingomielină a hematiilor). Este citotoxică pentru diferite culturi de celule.

În doze mari, este toxică pentru animalele de experienţă.

3. g-hemolizina este un complex de două proteine bazice care acţionează în cooperare.

Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie, nu şi cele de cal sau pasăre. Efectul ei

este inhibat de agar şi de diferiţi polimeri sulfataţi. Nu are efect atunci când se utilizează

plăci cu agar-sânge. Acţiunea este inhibată de colesterol şi de alte lipide.

4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus. Constă din

agregate heterogene de subunităţi de circa 5.000 Da. Acţionează pe diferite celule

(hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) şi nu are specificitate de specie.

e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene, un grup de toxine cu mai

multe activităţi patogene, spre exemplu cu efecte imunosupresoare, cu un efect mitogen

334

mai pronunţat la nivelul limfocitelor T supresoare (au capacitatea de a activa policlonal

toate celule T); cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor Gram-negativi (blochează funcţia

de clearance a sistemului reticuloendotelial); produc eritrodermie prin mecanisme de

hipersensibilitate de tip întârziat. Efectul piretogen se realizează cel puţin în parte prin

stimularea producerii de IL-1. Din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi B,

enterotoxinele stafilococice (cu cinci tipuri serologice) şi respectiv TSST-1, cauza

sindromului de şoc toxic stafilococic. Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una

sau mai multe enterotoxine. Aproximativ 15% produc TSST-1. Mai rare sunt tulpinile care

produc exotoxine piretogene A şi B.

f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus şi acţionează numai

asupra polinuclearelor şi macrofagelor de om şi iepure. Are două componente, F şi S.

Componenta S se fixează pe gangliozidul GM1 (receptor pentru toxina holerică) şi activează

o fosfolipază endogenă, legată de membrană. Produşii acesteia se fixează apoi pe

componenta F, inducând apoi un canal ionic pentru K+şi conducând astfel la citoliză.

g). Exfoliatina (toxina epidermolitică) produce o varietate de leziuni dermatologice. Este o

proteină termolabilă şi acid-labilă, cu greutatea moleculară de 24.000 Da, produsă de circa

5% din tulpinile de S. aureus. S-au descris două variante antigenice, ETB (codificată de un

plasmid) şi respectiv ETA (codificată cromozomial). Multe tulpini produc ambele exfoliatine.

Toxina acţionează prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea

desmosomilor care unesc celulele acestui strat.

29. 2. 6. 3.Bacteriocine

S. epidermidisproduce epidermina (stafilococina 1580) şi Pep5, care sunt lantibiotice. S.

gallinarum produce galidermina. Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor

Gram-pozitive, chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie decât cea

producătoare.

29. 2. 7. Răspuns imunImunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de produşii extracelulari (toxine, enzime)

şi faţă de antigenele legate de corpii bacterieni. Titrul anticorpilor antistafilococici este

scăzut (creşte, eventual, în cursul unor infecţii generalizate, dar nu influenţează evoluţia

spre vindecare) şi nu are utilitate practică în diagnostic. Există un însemnat potenţial de

producere a unui vaccin stafilococic care să poată fi acceptat în Uniunea Europeană

(deocamdată nici un astfel de produs nu are licenţă la nivelul UE).

S. aureus are posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV

(small colony variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie

cronică. Un studiu pe modele celulare a arătat că printre tehnicile de persistenţă se află

modificarea expresiei factorilor de virulenţă, auxotrofismul (inabilitatea unui microorganism

de a sintetiza un compus organic necesar procesului de creştere) dar şi această diversitate

fenotipică, care s-a dovedit a fi un proces extrem de dinamic, fenotipurile SCV 335

transformându-se rapid înapoi în fenotipurile sălbatice complet virulente în momentul

părăsirii localizării intracelulare (7).

29. 2. 8. Caractere de patogenitate

Atât S. aureus cât şi o parte dintre SCN sunt incluşi în categoria microorganismelor

condiţionat patogene.

S. aureus apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul

tegumentelor şi mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare.

Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special

datorită prezenţei acidului lipoteichoic, proteinei A şi altor adezine. După aderare şi

multiplicare, în cursul infecţiilor pot fi produse o serie de substanţe cu rol în patogenitate

(enzimele şi toxinele elaborate au fost prezentate la punctul 29. 2. 6).

De menţionat şi faptul că stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru

care s-a descris fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice. Rezistenţa la penicilină

(mediată de o β-lactamază) a fost evidenţiată încă din anul 1947. Ulterior, pe măsura

utilizării în infecţiile stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a „penicilinelor

penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la meticilină, oxacilină, tetraciclină,

cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.

Un studiu recent a evaluat prevalenţa portajului de MSSA şi de MRSA în departamentele

de urgenţă din SUA, la pacienţi în principal fără manifestări sugestive pentru infecţia

stafilococică. Prevalenţa portajului MSSA a fost estimată la 39% iar prevalenţa colonizării cu

MRSA a fost de 5%. Dintre pacienţii colonizaţi MRSA, 80% au prezentat şi cel puţin o

colonizare extranazală, pe când 45% au prezentat colonizare exclusiv extranazală (8).

Până în anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S.

aureus rezistent la alte antibiotice şi chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice

intermediare sau rezistente la vancomicină. În privinţa sensibilităţii/rezistenţei la

vancomicină au fost descrise trei variante de S. aureus, respectiv:

S. aureus cu un nivel intermediar de rezistenţă la vancomicină (VISA),

S. aureus cu hetero-rezistenţă la vancomicină (hVISA) şi

S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA).

În mod clasic era considerat că o tulpină de S. aureus intră în categoria VISA în cazul în

care CMI este ≥ 6 μg/ml (determinare prin „E test”) şi în categoria VRSA în cazul în care CMI

este ≥ 32 μg/ml. Conform EUCAST (2010), o tulpină de stafilococ este rezistentă la

vancomicină în cazul în care CMI este > 2 μg/ml.

336

Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate. O clasă de antimicrobiene care

poate fi utilizată în tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine

(quinupristin/dalfopristin, pristinamicina, virginiamicina, NXL 103, etamycin).

Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi

posibilitatea tratării S. aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa

acestui fenotip fiind însă redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a

tulpinilor rezistente constitutiv la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10).

29. 3. Patologie specifică şi principalele afecţiuni produse

Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare şi

invazivitate, fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi îmbinarea acestor

mecanisme).

Determinanţii patogenităţii stafilococului includ produsele toxice şi enzimatice, care au

fost prezentate la punctul 29. 2. 6. Spre exemplu, a-toxina are rol în generalizarea infecţiilor

şi respectiv apariţia sepsisului; d-hemolizina şi leucocidina explică de ce S. aureus este mai

dificil de distrus prin fagocitoză în comparaţie cu SCN; lipaza este importantă în

mecanismul de producere a furunculelor; coagulaza contribuie la localizarea şi persistenţa

infecţiei; hialuronidaza contribuie la invazivitate etc. Ar fi de menţionat că tulpinile izolate

de la nivelul unor furuncule sunt mai bogate în lipază şi mai sărace în hialuronidază faţă de

cele izolate din impetigo bulos. Tulpinile capsulate sunt mai virulente (împiedică

fagocitoza); frecvenţa lor pare a fi mai mare „in vivo”, deci rolul capsulei pare a fi mai

important decât se credea anterior. Datorită faptului că nici unul din caracterele enumerate

nu pare a fi decisiv în virulenţa stafilococilor, tulpinile de S. aureus nu pot fi clasificate net

în patogene şi nepatogene, aşa cum se poate face de ex. în cazul tulpinilor

de Corynebacterium diphteriae, tox+sau tox-.

S. aureus este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu

puroi), începând cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu

panariţii, furuncule, abcese profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără

generalizarea infecţiei. Pe de altă parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special

toxinelor elaborate) şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza toxică a epidermului,

sindromul de şoc toxic etc.

Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în

care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de

greţuri, crampe abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia

alimentelor contaminate. Se vindecă în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt

contaminate în general de către cei care le manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un

panariţiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza, îngheţata, carnea şi

337

produsele din carne (acestea pot constitui adevărate medii de cultură pentru bacterii).

Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune

păstrarea alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare.

Dermatitele exfoliative includ dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter) care poate

apărea la nou născut; epidermonecroza toxică (întâlnită la copii şi eventual la adulţi);

impetigo bulos şi „scarlatina stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu

afectează limba şi palatul). Leziunile apărute sunt extinse, de multe ori impresionante, dar

este posibilă vindecarea fără cicatrici deoarece sediul leziunilor este în stratul granular al

pielii (sub ele rămânând un strat suficient de gros pentru evitarea unor pierderi masive de

lichid şi pentru a proteja straturile profunde de infecţii supraadăugate). În mod frecvent,

stafilococii care au produs toxinele implicare patogenic nu sunt izolaţi de la nivelul leziunii.

Sindromul de şoc toxic cuprinde un complex de simptome provocat ca urmare a unor

infecţii locale cu S. aureus producător de TSST-1 (toxina 1 a şocului toxic). Principalele

semne şi simptome sunt reprezentate de apariţia stării de şoc, febră mare, greţuri,

vărsături, diaree, trombocitopenie, insuficienţă renală şi hepatică acută, rash (erupţie)

scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor şi plantelor). Mortalitatea în

cazurile necomplicate este de circa 2%. În formele complicate, mortalitatea poate ajunge la

50%. Un procent important (circa 80%) dintre cazuri apar la femei. Unele mărci de

tampoane destinate igienei intime feminine s-au dovedit a stimula producţia de TSST-1 de

către tulpini „proprii“ de stafilococ. Deoarece s-a demonstrat că TSST-1 creşte toxicitatea

endotoxinei germenilor Gram-negativi, cazurile cele mai grave au apărut atunci când

infecţia stafilococică locală s-a asociat cu o infecţie cu germeni Gram-negativi.

Stafilococii coagulază-negativi sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-

chirurgicale care penetrează bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme, implante, protezări

intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infecţiile tractului urinar şi genital cuS.

saprophyticus (la femeile tinere).

O infecţie gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai

ales a prematurului, situaţie în care administrarea necontrolată / abuzivă a antibioticelor

poate produce disbacteriemii cu consecinţe grave). În etiologia enterocolitei postantibiotice

sunt recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupând primul loc.

29. 4. Diagnostic de laboratorDiagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi este doar bacteriologic

(direct) şi respectă etapele clasice ale acestui tip de diagnostic, începând cu recoltarea şi

transportul produsului patologic, de obicei reprezentat de puroi (fie dintr-o leziune deschisă,

superficială, fie din leziuni închise, profunde). Cultivarea în vederea obţinerii de colonii

izolate se continuă cu identificarea în care pe lângă caracterele morfologice, de cultură şi

biochimice se face testul coagulazei pe lamă şi/sau în tub. Antibiograma completează în

mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecţii stafilococice.

338

Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi vom alege

drept reprezentative infecţiile purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom

referi numai la Staphylococcus aureus.

Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie

de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât

mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de

asepsie şi antisepsie etc). În funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele

produse patologice: secreţii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecţii ale

plăgilor şi arsurilor), lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală,

pleurală, pericardică), exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută, urină,

secreţie vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente, prelevate de

pe suprafaţa cateterelor şi a inserţiilor iv. ale acestora. În continuare vom discuta cazul în

care p.p. este reprezentat de puroi (vezi anexa nr. 6; A. 6. 1.).

De menţionat că din anul 2002 a fost pusă la punct o tehnică PCR pentru identificarea S.

aureus rezistent la meticilină, direct în produsul patologic (vezi „Direcţii de cercetare”).

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri

din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru

de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie

şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de

normal), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-

pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în

grămezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are în vedere locul de

unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dacă se recoltează de ex. prin

puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil contaminat cu

floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială).

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru

a diminua riscul modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) şi în aşa fel încât

să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi

anexa nr. 2). Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore,

la 35-37°C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt

pigmentate în funcţie de specia izolată (ex. pigment auriu). Pe mediul geloză-sânge, în jurul

coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară. Stafilococii se pot multiplica pe medii

hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). În cazul în

care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conţine mai

multe specii de microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor hiperclorurate.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5

mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate.

339

Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge

pot produce hemoliză.

Caractere biochimice: stafilococii au un metabolism glucidic atât respirator cât şi

fermentativ. Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere

de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de

diferenţiere între S. aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). S. aureus este

catalază-pozitiv (vezi anexa nr. 2) (la fel ca și ceilalți stafilococi). De importanță egală

taxonomică și recomandat drept al doilea test de confirmare a apartenenței la specia S.

aureus este testul dezoxiribonucleazei termostabile. Se poate face şi testul fosfatazei

(poate fi pozitiv și la unele specii coagulază-negative). Există sisteme multitest care se pot

procura comercial (API, Micro Scan, Minitek, Vitek etc).

Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste

comerciale care includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A

(tehnici de aglutinare indirectă). Se pot utiliza şi truse cu anticorpi monoclonali faţă de

endo-β-N-acetil-glucozaminidazei stafilococice.

Caractere de patogenitate:

o Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi anexa nr. 2); factorul care produce

coagularea pe lamă poate fi prezent la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius. În

cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi

pozitiv pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi (subspecia schleiferi).

o  Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau

aglutinarea pasivă inversată (vezi şi capitolele 20 şi 23).

Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea litică a bacteriofagilor a

fost sistematizată pentru tulpinile de S. aureus într-un sistem care se poate utiliza la

nivelul centrelor de referinţă. Există un set de bază de bacteriofagi, care permit

încadrarea S. aureus în unul din grupele I, II, III sau V. Lizotipia este actualmente evaluată

comparativ cu capacitatea „discriminatorie” a testelor care au ca mecanism biologia

moleculară (ex. ribotiparea).

Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă)

teste care se bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al

unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricţie ale

materialului genetic, hibridarea moleculară, ribotiparea etc.). S-au dezvoltat tehnici rapide

utilizând truse de identificare şi instrumenteautomatizate pentru evidenţierea unor

elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată), a enzimelor elaborate în

aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru termonuclează) şi a toxinelor

(enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Există metode care utilizează markeri moleculari pentru

evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex. amplificarea genică,

PCR pentru gena mecA, dar şi pentru genele femA, femB) şi/sau pentru diferenţierea

intraspecifică la S. aureus şi SCN.

340

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea

stabilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode

difuzimetrice. În cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi

capitolul 7). Pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilină (MRSA) se poate detecta

prezenţa genei mecA (după amplificare genică, prin PCR).

 

29. 5. TratamentMulte persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian.

Chiar dacă stafilococii ar fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea

s-ar produce foarte rapid (4).

Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi

infectaţi cu HIV sau la personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea

de eliminare a stării de purtător are justificare. Se poate utiliza tratamentul local cu

mupirocină. Este încă în studiu utilizarea lizostafinei în acest scop (lizostafina este o enzimă

litică produsă de o tulpină de S. simulans; atacă puntea pentaglicinică de la nivelul

lanţurilor de peptidoglican ai S. aureus; au fost făcute experimente pe animale de laborator

obţinându-se rezultate promiţătoare) (11).

Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va

face conform antibiogramei.

Principial, dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit

rezistente prin producerea de beta-lactamază, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui

să includă acest antibiotic. Din experiența centrului de referință din INCDMI ”Cantacuzino”,

procentul tulpinilor sensibile la penicilină este de circa 5%. Datorită rezistenței la penicilină

au fost produse peniciline rezistente la acțiunea beta-lactamazelor (penicilinele M – de la

”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și derivații acestora.

Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.

Ca şi principiu de tratament, MRSA răspunde potențial la tratamentul cu vancomicină.

VRSA poate răspunde la streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost

identificată rezistenţă şi la streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea tratării S.

aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide, prevalenţa acestui fenotip fiind însă

redusă, de 60,3%, spre deosebire de prevalenţa de 92,8% a tulpinilor rezistente constitutiv

la macrolide, lincosamide şi streptogramina B (10).

În cazul colecţiilor purulente reamintim şi considerăm că este de reţinut ca fiind de

primă importanţă utilizarea inciziei şi drenajului, fără de care antibioterapia nu are nici un

sens. De multe ori, incizia şi drenajul sunt suficiente.

341

29. 6. EpidemiologieStafilococii sunt ubicuitari. Sursa de infecţie cea mai comună este reprezentată de

leziunile stafilococice de la nivelul tegumentului. De menţionat posibilitatea răspândirii

infecţiei cu stafilococi rezistenţi la antibiotice (de spital), atunci când persoanele purtătoare

sunt reprezentate chiar de personalul medical şi auxiliar.

Referitor la sindromul de şoc toxic stafilococic (SSTS), în SUA s-au raportat 157 de

cazuri în 1997, 138 de cazuri în 1998 şi 113 cazuri în 1999, cu o incidenţă anuală de

0,050/0000. În anul 2005 au fost raportate numai 90 de cazuri (incidenţa fiind 0,040/0000). Tot

în anul 2005 s-au raportat 2 cazuri de infecţie cu S. aureus cu sensibilitate intermediară la

vancomicină (VISA) şi 3 cazuri de infecţie cu S. aureusrezistent la vancomicină (VRSA).

În România nu sunt disponibile (la nivel naţional) date privind SSTS sau rezistenţa la

vancomicină a tulpinilor de S. aureus. Din datele laboratorului de referință pentru stafilococ

din INCDMI ”Cantacuzino”, inclusiv cele provenite din supravegherea microorganismelor

izolate din infectii invazive pe baza protocoalelor EARSS (2002-2009), respectiv EARS.Net

(din 2010), în România nu au fost semnalate tulpini de S. aureus rezistente la vancomicină.

Laboratorul de referință pentru stafilococ din INCDMI ”Cantacuzino” poate detecta prin

metode moleculare prezenţa genelor pentru enterotoxine, leucocidina Panton

Valentine, TSST1, în culturi de S. aureus.

29. 7. ProfilaxiePrevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În

spital, secţiile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi

saloanele unde se află pacienţi cu cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de

imunodepresie. În aceste situaţii, personalul medical trebuie investigat prin metode de

laborator şi este de preferat ca persoanele purtătoare de stafilococi coagulază-pozitivi să nu

aibă acces în aceste incinte şi să nu aibă contact direct cu pacienţii în cauză. Ca alternativă

trebuie să se pună accentul pe proceduri adecvate, care să evite contaminarea pacienților.

Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a

portajului nazal (ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile. (11)

Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de

ex. la pacienţi care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel

internaţional (EU) nu există un vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare. În

ţara noastră vaccinul stafilococic produs de INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de

utilizare până în anul 2010.

29. 8. Direcţii de cercetare

342

29.8.1 Tratamentul infecţiei cu S. aureus

Antibioticele convenţionale acţionează în general pe bacteriile aflate în cursul ciclului de

multiplicare (12). În cursul evoluţiei clinice a unei infecţii, acestea coexistă cu cele aflate în

afara ciclului de multiplicare, motiv pentru care este aproape imposibil ca întreaga

populaţie bacteriană să fie distrusă simultan. Astfel, rămân viabile o serie de bacterii care

au fost deja expuse antibioticului şi care au avut timpul necesar pentru dezvoltarea

mutaţiilor de rezistenţă.

Terapia ţintită pe bacteriile non-multiplicative este un concept nou, existând o serie de

astfel de antibiotice în curs de dezvoltare şi cercetare. Unul dintre acestea este HT61, un

derivat quinolonic, a cărui eficacitate a fost demonstrată (pe culturi celulare şi pe modele

murine de colonizare cutanată) împotriva MSSA, MRSA şi chiar şi MRSA rezistent la

mupirocină. Acest medicament acţionează prin depolarizarea membranei celulare şi prin

distrucţia peretelui bacterian, în decurs de 2 ore. Pe parcursul unui an de studiu, în cadrul a

50 de culturi seriate, nu a fost decelat niciun fenotip de rezistenţă la HT61. Acest tip de

terapie reprezintă promisiunea unui tratament de durată mai scurtă, eficienţă mai ridicată

şi cu un risc scăzut de instalare a rezistenţei.

 

Un antibiotic cunoscut din clasa streptograminelor B, etamycin, şi-a demonstrat recent

eficienţa asupra MRSA (atât tulpinile comunitare cât şi cele spitaliceşti) pe modele murine

cu infecţie sistemică letală MRSA (13). Etamycin a fost izolat de la actinomicete marine

descoperite recent (CNS-575), ceea ce a atras atenţia asupra mediului marin – privit ca

potenţială sursă pentru identificarea altor antibiotice eficiente asupra tulpinilor rezistente

ale diverselor specii bacteriene. Etamycin a demonstrat de asemenea o eficienţă

experimentală asupra mai multor patogeni Gram-pozitivi sau Gram-negativi, fiind ne-

citotoxic la concentraţii de 20 de ori mai mari decât CMI-ul (care a fost de 1-2 mg/L pentru

MRSA comunitar sau spitalicesc).

29.8.2 Detecţia directă a rezistenţei la meticilină

Printre metodele de detecţie directă a rezistenţei la meticilină a S. aureus se numără şi

testele de latex aglutinare. Un tip particular de astfel de test a fost descris în 2010, de Qian

et al. (14) în Journal of Clinical Microbiology. Ei propun efectuarea acestui test de latex

aglutinare (pe mediu de tip geloză-sânge) prin utilizarea unei proteine de legare a

penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a).

Acest test (PBP-LA) şi-a demonstrat o sensibilitate de 94,1% şi o specificitate de 97,5%,

valori doar cu puţin mai scăzute faţă de sensibilitatea şi specificitatea efectuării tehnicii

PCR. Dintre avantajele utilizării acestei metode menţionăm: obţinerea de rezultate rapide,

tehnică uşor de utilizat, preţuri scăzute ale reactivilor utilizaţi. În vederea creşterii

sensibilităţii testului, acesta poate fi utilizat în combinaţie cu alte teste de identificare

rapidă, precum: DNA-aza termostabilă, API Rapidec, şi FISH (peptide nucleic acid-

fluorescence in situ hybridization).

343

29. 9. Povestire adevărată„Super-bug” ... Acesta este numele dat de „U.S. Department of Health” S.

aureus meticilino rezistent (MRSA). Această „denumire” a fost preluată de reprezentanţii

mass-media şi în momentul de faţă acest nume a devenit de notorietate în Statele Unite şi

nu numai.

Având în vedere faptul că numai pe o perioadă de un an s-au raportat în SUA circa 20.000

de pacienţi care au fost internaţi cu acest diagnostic, „definiţia” şi numele par a fi potrivite

şi este strict necesar ca sistemul de raportare să se ocupe cu atenţie de această situaţie.

Din păcate, şi în acest caz, trebuie să ne bazăm în special pe datele din literatura de

specialitate internaţională, datele publicate în România fiind fie puţine, fie irelevante.

Din evenimentele care au avut loc recent (octombrie 2007) în legătură cu acest subiect,

amintim decizia luată de Guvernatorul Statului Virginia, care a promulgat în regim de

urgenţă o lege, prin care toate unităţile sanitare erau obligate să raporteze cazurile

suspecte şi confirmate de infecţie cu Staphylococcus aureus meticilino rezistent (MRSA),

contribuind la stabilirea unui sistem activ de raportare, pentru a se putea astfel demonstra

care este evoluţia infecţiilor cu MRSA în contextul unei campanii speciale de control a

acestor infecţii.

Toate aceste reacţii, inclusiv măsura fără precedent de închidere a peste 20 de unităţi de

învăţământ pentru „dezinfecţie şi sterilizare” au fost instituite în contextul în care un tânăr

de 17 ani a decedat prin sepsis stafilococic. Decesul lui O.R. a condus la o campanie în care

au participat în colaborare unităţile de învăţământ, elevii din aceste unităţi, sistemul

medical (inclusiv centrul de prevenire şi control al bolilor, mass-media, reprezentanţii

autorităţilor locale şi o serie de politicieni).

După cum am discutat în prezentul capitol, dar şi în alte capitole ale acestui manual,

stafilococii sunt prezenţi în mod normal pe tegumente şi mucoase. Totuşi, stafilococii pot fi

implicaţi şi în patologie. Pot fi vizate persoane imuno-competente, copii, adolescenţi, tineri.

De suficient de multe ori, cei care consideră că nu sunt vulnerabili sau cred că au un risc

foarte scăzut de îmbolnăvire, de ex. sportivii (mai ales cei care practică sporturile mai dure,

însoţite de contact direct şi care se consideră „indestructibili”) pot fi printre cei mai expuşi

la infecţie şi chiar la o evoluţie gravă a acesteia. La universitatea din Virginia, întreg lotul de

lupte greco-romane s-a infectat venind în contact cu o saltea de luptă contaminată de un

coleg care s-a rănit în timpul antrenamentului.

De multe ori, simpla respectare a unor reguli de igienă generală şi personală pot contribui

semnificativ la prevenirea apariţiei infecţiilor stafilococice. Pentru restul cazurilor studiul

individual, cercetarea bazelor de date şi experienţa câştigată cu fiecare caz consultat,

investigat, analizat şi discutat ne ajută să ajungem la cea mai bună ipoteză diagnostică, la

cel mai bun diagnostic diferenţial, la cel mai potrivit tratament în vederea celui mai bun

prognostic pentru pacientul sau pacienţii pe care îi vom examina de-a lungul întregii cariere

medicale sau medico-chirurgicale.

344

30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes 30. 1. Definiţie. Încadrare

Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formează perechi sau lanţuri în cursul

diviziunii celulare. Sunt larg răspândiţi în natură. Unii fac parte din flora umană normală;

alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante datorate parţial infecţiei streptococice şi

parţial răspunsului imun al gazdei.

Nu există încă un sistem perfect pentru clasificarea tuturor speciilor de streptococi. Totuşi,

pentru a contura o imagine legată de numărul acestora, NCBI a creat un browser taxonomic

unde putem găsi speciile cunoscute până în acest moment. (1)

Dintre numeroasele specii, unele au importanţă medicală (în patologia umană) şi dintre

acestea amintim Streptococcus pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care

aparţine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc.

Streptococii sunt imobili, nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă.

În anul 1906 a fost descris Streptococcus faecalis iar în 1919, Streptococcus faecium.

Împreună cu o a treia specie, S. durans(foarte asemănătoare cu S. faecium), în 1937 a fost

definit grupul enterococilor, incluşi în grupul D al genului Streptococcus. Din 1984, pe baza

studiilor de hibridizare moleculară s-a decis că aceste specii fac parte dintr-un gen separat,

genul Enterococcus(vezi 30. 9). Enterococii pot fi izolaţi din flora enterică normală. Sunt

nonhemolitici (ocazional alfa-hemolitici); dau o reacţie pozitivă la bilă-esculină. Tolerează

NaCl în concentraţie de 6,5%. Sunt rezistenţi la multe antibiotice şi chimioterapice.

Tratamentul infecţiilor cu enterococi poate reprezenta o problemă foarte serioasă.

30. 1. 1. Sisteme de clasificareO perioadă de timp, clasificarea streptococilor s-a bazat pe o serie de observaţii privind:

a). Morfologia coloniilor şi hemoliza produsă pe agar sânge;

b). Specificitatea antigenică a substanţelor specifice de grup (clasificarea Lancefield) şi de

tip;

c). Reacţiile biochimice;

d). Rezistenţa la factori fizici şi chimici;

e). Diferite caracteristici ecologice.

După 1980 s-au introdus teste biochimice adiţionale precum şi studiile de genetică

moleculară.

În funcţie de hemoliza produsă pe agar sânge, streptococii se împart în trei grupe: cei care

produc α hemoliză, β hemoliză şi streptococii γ hemolitici.  (Figura nr. 1, Fotografia nr. 1)

345

Clasificarea Lancefield împarte streptococii în grupe serologice (A-H şi K-U), în funcţie de

polizaharidele din compoziţia peretelui, în timp ce proteina M subîmparte streptococii din

grupul A în tipuri serologice. (Tabelul nr. 1) Specificitatea antigenică a polizaharidelor

capsulare este folosită pentru a clasifica S. pneumoniae în peste 90 de tipuri şi pentru

tipizarea streptococilor de grup B (S. agalactiae).

30. 1. 2. Streptococi de interes medical 30. 1. 2. 1.S. pyogenes. Cei mai mulţi dintre streptococii care conţin antigenul de

grup A sunt streptococi piogeni. Ei sunt beta-hemolitici (produc în mod caracteristic zone

largi de hemoliză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici, punctiforme). S.

pyogenes este principalul microb asociat cu invazia locală sau sistemică şi cu tulburări

imunologice poststreptococice. De regulă streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină.

Structura de tip capsular pe care unele tulpini o prezintă este chimic similară cu ţesutul

conjunctiv al organismului gazdă (acid hialuronic), fiind ca atare neantigenică. Membrana

sa citoplasmatică are antigene similare cu miocardul, muşchii scheletici şi muşchiul neted,

fibroblaştii valvelor cardiace şi ţesutul nervos.

30. 1. 2. 2.S. agalactiae. Face parte din flora normală a tractului genital feminin şi

poate reprezenta o importantă cauză de sepsis şi meningită neonatală. Sunt beta-

hemolitici şi produc zone de hemoliză care sunt doar puţin mai extinse decât coloniile (1-2

mm în diametru). Streptococii de grup B hidrolizează hipuratul de sodiu şi dau o reacţie

pozitivă în testul CAMP (folosind discuri impregnate cu toxină β stafilococică) (2).

30. 1. 2. 3.Grupele C şi G. Aceşti streptococi sunt izolaţi uneori din nazofaringe şi

pot cauza sinuzită, bacteriemii sau endocardită. Deseori formează colonii asemănătoare

cu cele ale streptococilor piogeni şi sunt beta-hemolitici. Sunt identificaţi prin reacţii cu

antiser specific pentru grupele C sau G.

30. 1. 2. 4.S bovis. Face parte din streptococii de grup D. Aparţine florei normale.

Ocazional produce endocardită sau bacteriemie la pacienţii cu carcinom de colon. Nu

produce hemoliză şi dă o reacţie pozitivă la bilă-esculină.

30. 1. 2. 5.S. pneumoniae.Pneumococii sunt alfa-hemolitici, creşterea lor este

inhibată de optochin iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare (vezi capitolul 31). În

continuare reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin pneumonie

comunitară).

30. 1. 2. 6.S. viridans. Fac parte din flora normală la nivelul tractului respirator

superior. În mod caracteristic sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici. Creşterea lor nu

este inhibată de optochin. Pot ajunge în torentul sanguin ca urmare a unei traume şi

reprezintă o cauză importantă a endocarditei care survine la pacienţi cu valve cardiace

patologice. Unii streptococi viridans (exempluS. mutans) sintetizează polizaharide care

contribuie la geneza cariilor dentare.

346

30. 1. 2. 7.Peptostreptococii. Cresc numai în condiţii anaerobe sau microaerofile şi

produc în mod variabil hemolizine. Fac parte din flora bucală normală, flora tractului

respirator superior, intestinal şi genital feminin. Participă, adesea în asociere cu alte specii

bacteriene, în infecţiile anaerobe polimicrobiene abdominale, pelviene, pulmonare sau

cerebrale.

30. 2. Caractere generale‹ 30. 1. 2. Streptococi de interes medical sus 30. 3. Patogenie şi patologie specifică.

Principalele afecţiuni produse ›

30. 2. 1.Submitted by Mircea Ioan Popa on Mar, 2012-03-27 18:36.

30. 2. 1. Habitat

Streptococii piogeni se pot găsi la nivelul tractului respirator superior uman. Condiţiile în

care ar trebui eliminaţi se stabilesc de la caz la caz. O parte dintre speciile de streptococi

colonizează exclusiv suprafaţa dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară.

Pentru alte specii de streptococi, datele referitoare la habitat au fost prezentate mai sus.

30. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili, nesporulaţi.

Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50

elemente bacteriene). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu.

Unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică.

Cele mai multe din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic. Capsulele

sunt mai evidente în culturile tinere şi împiedică fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperiţi

de acid lipoteichoic şi au rol în aderenţă.

30. 2. 3. Caractere de cultură

Cei mai mulţi streptococi cresc pe medii solide şi formează colonii discoide, de tip S, cu

diametrul de 1-2 mm. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formează colonii

punctiforme. Speciile care produc material capsular adeseori dau naştere unor colonii

mucoide (de tip M). Cei mai mulţi streptococi sunt aerobi, facultativ anaerobi.

Peptostreptococii sunt strict anaerobi.

Necesităţile nutritive variază mult în funcţie de specie. Streptococii implicaţi în patologia

347

umană sunt în general germeni pretenţioşi, necesitând o varietate de factori de creştere.

Un mediu de cultură util (atât ca mediu îmbogăţit cât şi ca mediu diferenţial) este mediul

geloză-sânge. Pe acest mediu streptococii se pot diferenţia în funcţie de capacitatea de a

produce hemoliză. Distrugerea completă a eritrocitelor cu eliberarea de hemoglobină

poartă numele de beta-hemoliză şi reprezintă un caracter util în identificarea streptococilor

piogeni (colonii mici, de tip S, înconjurate de o zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult

mai mare decât diametrul coloniei). Liza incompletă a eritrocitelor cu formarea de pigment

verde se numeşte alfa-hemoliză (sau hemoliză viridans). Hemoliza incompletă fără o nuanţă

verzuie poartă numele de hemoliză alfa prim. În cazul în care streptococii nu produc

hemoliză sunt clasificaţi drept streptococi gama.

În funcţie de producerea hemolizei, mai frecvent implicaţi în patologia umană sunt

streptococii beta-hemolitici, iar dintre aceştia în mod special streptococii beta-hemolitici din

grupul A. Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A elaborează două hemolizine: 1)

streptolizina O, o proteină antigenică având greutatea moleculară de 60.000 Da, hemolitic

activă în stare redusă (grupări –SH disponibile), dar inactivată rapid în prezenţa oxigenului

şi 2) streptolizina S care nu este imunogenă.

30. 2. 4. Caractere biochimice

Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea

hemolizei. Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare

adăugarea în mediul de cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin

utilizarea ca mediu de cultură a gelozei-sânge sau a bulionului nutritiv. Streptococii

degradează glucoza pe calea glicolitică. O mare parte dintre specii pot fermenta şi alte

tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate doar

în prezenţa carbohidratului respectiv şi în absenţa glucozei). În mod uzual streptococii

piogeni sunt sensibili la bacitracină. Sunt catalază negativi.

30. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii

uscate, la temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni. Deoarece nu este

sensibil la acţiunea coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate fi utilizat în

mediile de cultură selective.

30. 2. 6. Structură antigenică

Streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate

cu literele mari ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura

peretelui multor streptococi (grupele Lancefield). Specificitatea serologică a carbohidratului

specific de grup este determinată de un zahar aminat, care pentru streptococii de grup A

este ramnoză-N-acetil-glucozamină, pentru grupul B ramnoză-glucozamină-polizaharid etc.

348

Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F şi G (includ streptococi β-hemolitici).

Streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai

important factor de patogenitate pentru acest grup streptococic. Anticorpii faţă de proteina

M conferă imunitate specifică de tip. Deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină

M (dar nu toate au şi proprietăţi de prevenire a fagocitozei), o persoană poate face infecţii

repetate cu S. pyogenes de grup A, de diferite tipuri. Proteina M a fost identificată şi la

streptococi din grupul G.

Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:

- proteina asociată proteinei M (MAP);

- substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu

antiser specific;

- peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement);

- proteina R, care este un antigen de suprafaţă;

- proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina;

- nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul

streptococic;

- diferite toxine şi enzime:

1. streptokinaza (fibrinolizina) care transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în

tratamentul administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi

în infarctul miocardic acut; este o structură antigenică;

2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice,

în special după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază;

3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei

fundamentale din ţesutul conjunctiv;

4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la originea rash-ului

(erupţiei caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de

streptococii lizogenizaţi; există un singur tip de toxină eritrogenă;

5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii

streptococi;

6. hemolizinele (streptolizinele); Semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară.

Se ştie că administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva

secunde prin acţiunea sa directă la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că  streptolizina S ar fi

produsă și in vivo. (2)

În momentul de faţă se studiază modul în care SGB activează sistemul imun pe o altă cale,

cale descoperită în ultimii ani şi încă insuficient studiată, inflamazomul NLRP3. S-a

descoperit, prin studii efectuate pe şoricei, că celulele dendritice răspund la SGB prin

secreţia de IL-1β şi IL-18. IL-1β necesită pentru a se forma pro- IL-1β şi clivaj proteolitic

dependent de caspaza 1. Aici intervine inflamazomul. Acesta, la rândul lui, pentru a fi

activat are nevoie de secreţia de β-hemolizină de către SGB. S-a determinat şi faptul că

atunci când inflamazomul cu toate compomentele sale lipseşte, şoriceii sunt mai

susceptibili la infecţie. (Figura nr. 2) (3)

349

30. 2. 7. Răspuns imun

Rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip. Imunitatea faţă de

infecţia cu streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici anti-proteină

M. Pentru că există mai mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii

repetate cu S. pyogenes de grup A, de tipuri diferite. Structura şi funcţia proteinei M au fost

mult studiate. Molecula are o structură de tijă încolăcită care separă domeniile funcţionale,

permiţând astfel schimbarea unui număr mare de secvenţe în timp ce funcţia este

menţinută. Au fost identificate două clase majore (I şi II) de proteină M. Anticorpii anti-

proteină M pot fi identificaţi serologic.

Deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care

duce la scarlatină imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi

pentru toată viaţa.

În cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi

prin teste serologice (ex. reacţia ASLO). Titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea

bolilor streptococice şi poststreptococice.

30. 2. 8. Caractere de patogenitate

Proteina F are rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi are un rol în

invazivitate.

Proteina M reprezintă cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru

streptococul beta-hemolitic din grupul A. Proteina M apare ca o excrescenţă la nivelul

peretelui celular. Proteina M formează structuri fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara

celulei bacteriene, fiind ancorate cu cealaltă extremitate în membrana citoplasmatică

(există un grad de omologie cu proteina A stafilococică). S-a dovedit experimental că atunci

când proteina M este prezentă, streptococii sunt virulenţi. În absenţa anticorpilor specifici

de tip anti-proteină M, streptococii sunt capabili să reziste fagocitării de către leucocitele

polimorfonucleare. Proteina M este implicată şi în aderarea la celulele epiteliale ale gazdei.

Streptococii de grup A lipsiţi de proteina M sunt avirulenţi.

Se pare că proteina M şi probabil şi alte antigene streptococice au un rol important în

patogeneza „febrei reumatice” (reumatismului articular acut). Domeniile antigenice

conservate din proteinele de clasă M (în special clasa I) reacţionează încrucişat cu structuri

ale muşchiului cardiac uman. Alte tipuri M au similarităţi cu miozina, keratina sau α-

tropomiozina.

Unele tulpini de S. pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi

produc colonii mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate

avea rol în virulenţa anumitor tulpini.

Hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante.

Difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;

această substanţă permite microorganismului să distrugă leucocitele.

Toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază, o serin-protează care scindează

350

componenta C5a (rezultată în cascada sistemului C’). C5a este unul dintre principalii factori

care atrag PMN la sediul procesului infecţios.

Toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A

lizogenizaţi, este implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică.

30. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse30. 3. 1. Boli invazive datorate streptococilor piogeni

Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. În fiecare caz poate apărea o

extindere rapidă şi difuză a infecţiei de-a lungul căilor limfatice, însoţită de o supuraţie

minimă. Infecţia se poate extinde la nivel circulator. În această categorie se pot include

Erizipelul- apare atunci când poarta de intrare este reprezentată de tegument

(formă particulară de celulită); este caracterizat prin leziuni „lucioase”, eritemtoase,

indurate, sub forma unei plăci cu margini distincte; adesea este cauzat de streptococii de

grup A şi mai rar de grupurile C sau G. (Fotografia nr. 2)

Febra puerperalăse dezvoltă în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.

Sepsisul streptococic - în 1992, American College of Chest Physicians şi Society of

Critical Care Medicine (ACCP/SCCM) au elaborat câteva criterii care pot orienta medicul

spre a pune diagnosticul de sepsis, criterii care au fost revizuite în 2001. (Tabelul nr. 2) (4)

Infecţiile osoase şi articulare;

Fasciita necrotizantă- inocularea poate fi de la nivelul pielii sau de la nivel

intestinal. Prevalenţă este mai ridicată la persoanele ce folosesc droguri pe cale

intravenoasă. Este cunoscută și drept gangrena streptococică, streptococul primind (în

mass-media) numele de „bacteria mâncătoare de carte”. Această entitate clinică poate

avea determinare polimicrobiană, cu floră aerobă şi anaerobă, incluzând şi Clostridium

perfringens, Bacteroides spp. Când infecţia se localizează la nivelul perineului se numeşte

gangrena Fournier. Tabloul clinic include: febră, durere foarte intensă, eritem, tromboză la

nivelul microvascularizației care conduce la necroză, gangrenă, şoc si insuficienţă renală.

În multe dintre cazuri evoluția este nefastă, spre exitus. (Fotografia nr. 3)

Meningita etc.

30. 3. 2. Boli localizate351

În acest grup sunt incluse:

Faringita streptococică care este cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor

beta-hemolitici. Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul

acidului lipoteichoic. Fibronectina glicoproteică de la nivelul celulelor epiteliale serveşte

probabil ca ligand pentru acidul lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual la

nivelul altor structuri poartă numele de angină streptococică. Boala se manifestă cu

durere în gât, rinofaringită, amigdalită „roşie” şi purulentă (pultacee), ganglioni limfatici

cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-40°C). Poate avea loc (în special la copiii mici)

extinderea infecţiei către urechea mijlocie, mastoidă şi meninge. De menţionat că circa

10-20% din infecţii pot fi asimptomatice. (Figura nr. 4)

Impetigo streptococic reprezintă o infecţie localizată la nivelul straturilor

superficiale ale pielii, în special la copii. La majoritatea pacienţilor nu se găseşte o leziune

predispozantă. Totuşi, amintim ca factori de risc generali mediul umed şi igiena deficitară.

Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup şi formează o crustă gălbuie,

durere uşoara sau disconfort şi prurit. (Figura nr. 5)

Celulita streptococică (aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută

a pielii şi ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde

rapid, edem, febră, limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S.

pyogenes (infecţie difuză, rapid progresivă datorată enzimelor secretate) dar la pacienţii

diabetici este întâlnit şi S. agalactiae. Infecţia apare mai des la nivelul membrelor

inferioare, tipic unilateral. Peteşiile sunt adesea întâlnite, se pot dezvolta vezicule şi bule

ce se pot rupe. (Figura nr. 6)

Pneumonia poate fi rapid progresivă şi severă; de obicei apare ca o complicaţie, în

urma unei infecţii virale (de exemplu gripă, pojar etc.; infecţia cu virusul sinciţial respirator

la copilul mic poate fi urmată de asemenea de o pneumonie streptococică).

Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în

cursul bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate anterior.

Distrugerea rapidă a valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi uneori a

protezării valvulare, evoluează frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau săptămâni.

Endocardita subacută implică mai frecvent valvele anormale (malformaţii congenitale,

leziuni reumatice sau aterosclerotice).

 30. 3. 3. Boli datorate producerii de toxine Sindromul de şoc toxic streptococic, foarte asemănător celui produs de către S.

aureus, apărut datorită eliberării de toxine. Mortalitatea este mai ridicată ca în cazul

sindromului stafilococic. În majoritatea cazurilor duce la sindrom de detresă respiratorie

acută şi mai rar la o reacţie cutanată cum este cazul S. aureus. Are un debut brusc, febră

39°-40,5°C, hipotensiune, eritem difuz macular, coagulopatie, leziuni hepatice.

352

Atunci când streptococii sunt lizogenizaţi (infectaţi cu un bacteriofag specific), produc

toxină eritrogenă. Dacă pacientul nu are imunitate antitoxică apar erupţia caracteristică şi

scarlatina. Antitoxinele faţă de toxina eritrogenă previn apariţia rash-ului (dispare la

presiune, apare mai ales pe abdomen şi torace lateral, iniţial ca papule mici apoi ca linii ce

durează 2-5 zile), dar nu interferă cu infecţia streptococică.

30. 3. 4. Bolile poststreptocociceBolile poststreptococice includ reumatismul articular acut (RAA), cardita reumatismală

şi glomerulonefrita acută poststreptococică (GNA).

După o infecţie acută cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmează o perioadă de

latenţă (circa 1-4 săptămâni), după care se pot dezvolta bolile poststreptococice.

Perioada de latenţă sugerează faptul că boala poststreptococică nu se datorează efectului

direct al diseminării bacteriene, ci reprezintă un răspuns în cadrul unei stări de

hipersensibilitate care urmează unor infecţii repetate, netratate sau tratate

necorespunzător, cu streptococi piogeni, beta-hemolitici, din grupul A.

30. 3. 4. 1.Glomerulonefrita acută poate apărea la circa 3 săptămâni după infecţia

streptococică (adesea tegumentară), în special dată de tipurile 12, 4, 2, 49, 59-61.

Glomerulonefrita se datorează unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin

producerea în exces de complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la nivelul

membranei bazale glomerulare. Toţi glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltraţi cu PMN,

monocite şi eozinofile. În nefrita acută apar hematurie microscopică şi macroscopică,

proteinurie pâna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex. periorbitale), hipertensiune

arterială, retenţie de uree, oligurie şi anurie, ascită, congestie sistemică (dispnee, tuse,

stază în jugulare, cardiomegalie, galop, edeme); nivelul complementului seric este scăzut.

30. 3. 4. 2.Reumatismul articular acut (RAA) reprezintă cea mai serioasă sechelă a

infecţiei streptococice (tegumentară dar mai ales respiratorie - la care par să fie predispuşi

cei cu grupa de sânge A II), deoarece duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac.

Anumite tipuri de streptococi de grup A conţin antigene care reacţionează încrucişat cu

structuri din ţesutul cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor bazali.

RAA este precedat de o infecţie streptococică.

În patogenia RAA sunt incluse toate tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II

(citotoxică) şi de tip IV (mecanism celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele

şi simptomele specifice din RAA includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de

inflamaţia la nivel cardiac (cardita reumatismală). (Tabelul nr. 3)

Nu dorim să intrăm în toate detaliile care vor fi studiate în cadrul modulului de cardiologie,

dar dorim să punctăm câteva aspecte. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă,

nesupurativă. Apare în comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară,

alimentaţie defectuoasă, tulburări de imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la

353

grupele de vârstă 5-15 ani. Nu există predispoziţie de sex dar leziunile cardiace sunt

diferite în funcţie de sex.

30. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Streptococcus pyogenes

Diagnosticul de laborator este în mod uzual bacteriologic (direct) şi include în mod

necesar recoltarea şi transportul (în maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea

microscopică a acestuia, cultivarea de obicei pe geloză-sânge şi identificarea pe baza

caracterelor morfologice, de cultură, biochimice şi antigenice a microorganismelor din

coloniile izolate. Antibiograma nu este, în general, necesară deoarece streptococii piogeni

îşi menţin sensibilitatea la penicilină. Deşi cultivarea rămâne metoda standard în

diagnostic, datorită faptului că rezultatul este obţinut abia după circa 18 ore, au fost puse la

punct teste rapide, care pot identifica antigenele streptococice în circa 10 minute (extracţie

enzimatică urmată de latex aglutinare în prezenţa anticorpilor specifici pentru grupul A).

Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni

alegem faringita streptococică. 

În vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta reacţia ASLO (vezi şi

capitolul 22).

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic

30. 4. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, în faringita

streptococică.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic, secreţia purulentă de la nivelul

faringelui, trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul

bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de

vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea

se face preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat pe dinţi,

fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă aceste condiţii nu au fost

respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore etc.) (vezi şi anexa nr. 6).

Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să

treacă mai mult de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore). În cazul în

care se estimează depăşirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport,

354

ex. mediul Stuart (vezi şi anexa nr. 2). Chiar şi în această situaţie, nu ar trebui să treacă

mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p.p.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a două frotiuri din

produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de

metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi

se notează prezenţa celulelor de la nivel faringian, prezenţa celulelor inflamatorii (ex.

leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în

lanţuri, dar şi a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol

orientativ.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să

se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi

anexa nr. 2). Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care nu se dezvoltă pe medii

de cultură obişnuite. Mediul cel mai frecvent folosit este agar-sânge, pe care cultura apare

în 18-48 ore, la 35-37°C. În cazul în care nu remarcăm apariţia de colonii caracteristice

după 24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi.

Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-

hemoliză (zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul

coloniei). În cursul însămânţării, pe cel puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie

să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel încât inoculul să ajungă mai în profunzime.

Această manevră (există şi alte variante tehnice) este necesară pentru a permite

activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivată în prezenţa oxigenului). Speciile care

produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de

tip M). Se pot folosi pentru cultivare şi medii selective (de ex. agar-sânge plus trimetoprim-

sulfametoxazol).

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul

de circa 1µm. Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune în

lanţuri (de până la 50 elemente). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de

factori de mediu.

Caractere de cultură: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm,

înconjurate de o zonă de β-hemoliză sau colonii de tip M.

Caractere biochimice:

- Streptococii piogeni produc hemoliză de tip beta.

- Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi teste

comerciale, rapide, pentru testul PYR).

- Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic produs

355

de Bacillus licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai

puţin de 1% sunt rezistente la bacitracină (vezi anexa nr. 2).

- Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol.

Caractere antigenice:

o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului

specific de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimatică

(ex. cu pronază). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex-aglutinare),

coaglutinarea sau ELISA.

o Prin reacţii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lamă, sau

precipitare se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.

o S. pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste

100 de serotipuri) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28 serotipuri)

prin reacţia de aglutinare pe lamă. Aceste testări se fac în centre de referinţă.

Alte teste utilizate în identificare:

o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor

de grup A în exsudatul faringian.

o După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care

codifică pentru diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite peste 120

de secvenţe genetice diferite, această metodă fiind mai discriminativă în comparaţie cu

metoda clasică, de tipizare a S. pyogenesşi tinde să completeze şi eventual să înlocuiască

această metodă.

o Relativ recent a fost propusă tehnica MLST (multilocus sequence typing),

accesibilă unorcentre de referinţă.

5. Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost

identificate în ultima perioadă tulpini „tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de

către penicilină, 2003).

Pentru pacienţii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru

tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament

antimicrobian şi în acest caz antibiograma devine necesară. În general antibiograma se

realizează în scop epidemiologic, pentru supraveghere şi cercetare.

30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic

30. 4. 2. Diagnosticul de laborator serologic

Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii β-hemolitici din grupul A ar

putea consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi titrul anticorpilor,

356

în cadrul diagnosticului serologic), fie a răspunsului imun de tip celular.

În continuare nu vom discuta decât diagnosticul serologic, care are importanţă practică.

Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice

(RAA, GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul

retrospectiv al unei infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii

tratamentului.

Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt

mai complexe, dar includ dovedireaprin metode de laborator a unei infecţii

streptococice în antecedente.

Diagnosticul serologic se realizează de obicei, în România, prin reacţia ASLO, care identifică

titruri ale anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 22). Testarea se face în dinamică,

pe seruri recoltate la interval de 7-10 zile.

Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi

ASLO.

Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de calitate.

Tot strict necesară este evaluarea rezultatelor în contextul clinic.

Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte

structuri antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-

streptodornază este crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă

se suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute. Se pot determina şi anticorpii

anticarbohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).

31. Streptococcus pneumoniae31. 1. Definiţie. Încadrare

Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci Gram-pozitivi, alungiţi,

lanceolaţi, dispuşi în general în diplo pe axul longitudinal, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili.

Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge determină a-hemoliză, la fel

ca Streptococcus viridans. Creşterea îi este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o

temperatură de 37°C.Streptococcus pneumoniae este unul dintre principalele

microorganisme implicate în etiologia otitei medii şi în alte infecţii respiratorii, incluzând

pneumonia. Meningita pneumococică reprezintă însă o entitate nosologică redutabilă.

Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la

antibiotice o reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte medicamente

antimicrobiene. Gravitatea acestei situaţii rezultă din incidenţa crescută a pneumoniilor

pneumococice (40 - 50% din etiologia pneumoniilor comunitare) şi din valorile extrem de

alarmante ale incidenţei tulpinilor de pneumococi penicilino - rezistenţi (20-40% din

357

tulpinile izolate în Europa Occidentală sau în America de Nord), uneori cu multirezistenţă la

antibiotice.

31. 2. Caractere generale31. 2. 1. Habitat

Pneumococii se pot izola de la persoane sănătoase, făcând parte din flora normală a

tractului respirator superior (în special bucală, nazală şi faringiană). Cu toate că frecvenţa

portajului orofaringian este estimată la 30-70%, în recentul studiu la care au participat în

mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), nu

am identificat nici un purtător de Streptococcus pneumoniae.31. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o

capsulă comună), imobili, nesporulaţi. În coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca

un halou în jurul pneumococilor. Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o

identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu spută), prin reacţia de

umflare a capsulei.31. 2. 3. Caractere de cultură

            Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple,

aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M,

înconjurate de o zonă de a-hemoliză (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este

favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C. Glucoza reprezintă principala

sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează enzime zaharolitice, proteolitice şi

lipolitice.

            În mediile de cultură lichide pneumococii tulbură omogen mediul.31. 2. 4. Caractere biochimice

Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează

enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice. Fermentarea inulinei reprezintă un caracter

biochimic important, util în diferenţierea pneumococilor de S. VIRIDANS(ambele tipuri de

streptococi producând pe geloză-sânge o hemoliză de tip viridans).

Produc enzime autolitice. Autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri biliare, acizi

biliari; testul este util în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld).

Sunt sensibili la optochin (etil-hidro-cupreină), sensibilitatea la această substanţă fiind

de asemenea utilă în identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans.31. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Pneumococii pot supravieţui câteva luni în spută uscată, la întuneric. În mediul extern

rezistenţa lor este scăzută. În timp, microorganismele devin Gram-negative şi tind să se

lizeze spontan.Autoliza pneumococilor este intensificată de agenţii tensioactivi de

suprafaţă.31. 2. 6. Structură antigenică

358

La nivelul peretelui există un polizaharid specific de grup, comun tuturor

pneumococilor. Polizaharidul C include acidul teichoic (legat de peptidoglican).

Cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică

(antigenul K), ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea.

Structura polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte. Până în prezent au

fost identificate peste 90 de serotipuri capsulare diferite, a căror structură a fost

determinată pentru majoritatea serotipurilor. Există două sisteme diferite folosite pentru

clasificarea tipurilor capsulare. Sistemul american a numerotat tipurile capsulare în ordinea

descoperirii acestora. Sistemul danez grupează mai multe tipuri antigenic înrudite. Spre

exemplu, grupul 19 din clasificarea Statens Serum Institute grupează tipurile 19A-C şi 19F,

care în sistemul american de clasificare erau numerotate cu 19, 57, 58 şi respectiv 59. Au

fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente şi monovalente, utile în identificarea

pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei.

Este descris şi acidul lipoteichoic numit şi antigen F (Forsman); anticorpii faţă de

antigenul F reacţionează încrucişat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni.

Fosfocolina (FC) se găseşte atât în acidul lipoteichoic, cât şi în acidul teichoic parietal.

Prezenţa reziduurilor de FC este necesară atât în diviziune, în fenomenul de autoliză, cât şi

în fenomenul genetic de transformare. FC are şi rol de adezină (se leagă de „choline-

binding proteins” de pe suprafaţa celulelor gazdei).

Toţi pneumococii secretă IgA1 protează (una dintre Zn-proteinazele produse de S.

pneumoniae).31. 2. 7. Răspuns imun

Imunitatea faţă de infecţia pneumococică are specificitate de tip şi depinde atât de

anticorpii care apar împotriva polizaharidului capsular, cât şi de funcţia fagocitelor.

Vaccinarea induce producerea de anticorpi faţă de polizaharidul capsular.31. 2. 8. Caractere de patogenitate

S. pneumoniae este un microb condiţionat patogen care, atunci când este implicat în

patologia umană, se manifestă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa pneumococilor

depinde de capsulă, care conferă rezistenţa la fagocitoză. Un ser care conţine anticorpi

împotriva polizaharidelor specifice de tip protejează împotriva infecţiei. Dacă un astfel de

ser este absorbit cu polizaharide specifice de tip îşi pierde puterea protectoare.

Alţi factori de patogenitate ar fi reprezentaţi de:

- IgA1 protează;

- hemolizina intracelulară (pneumolizina), eliberată prin autoliză (inhibă chemotactismul

pentru PMN, inhibă proliferarea limfocitelor şi sinteza de anticorpi);

- proteinele de suprafaţă (PspA) care au unele asemănări cu proteina M de la S.

pyogenes;

- neuraminidazele (NanA şi NanB) şi hialuronidaza.

Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi,

mucoasa respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste

microorganisme. Printre factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat:

359

- anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii

locale, obstrucţii bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante

etc.);

- intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de

tuse;

- consumul de tutun (fumatul);

- malnutriţia, debilitatea generală, hiposplenismul sau deficienţele sistemului

complement.

31. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

În majoritatea infecţiilor pneumococice există o fază iniţială bacteriemică, perioadă în

care microorganismul ar putea fi izolat prin hemocultură. Pneumococul este patogen prin

multiplicare şi invazivitate, conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator

superior şi inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar şi alte infecţii produse prin

diseminare hematogenă (ex. meningită, endocardită, care pot fi foarte grave).

Pneumonia pneumococică se însoţeşte de prezenţa edemului alveolar şi a unui exsudat

fibrinos, urmat de apariţia de hematii şi leucocite. În exsudat se identifică prezenţa a

numeroşi pneumococi. Debutul pneumoniei este adesea brusc, cu febră mare, frison, junghi

toracic. Sputa caracteristică este ruginie (semn patognomonic). Aspectul radiologic este

caracteristic atunci când este prins un singur lob şi constă într-o opacitate cu aspect

triunghiular, cu baza la periferie şi vârful către mediastin (pneumonie francă lobară).

32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae 32. 1. Definiţie. Încadrare

Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre

exemplu Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella.

În genul Neisseria, speciile importante pentru patologia umană sunt N.

meningitidis (meningococul) şi N. gonorrhoeae(gonococul), dar se pot aminti şi N.

360

lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis etc. Există şi o specie (N. elongata)

în care tulpinile au aspect cocobacilar şi sunt oxidază-negative (1).

Pe baza studiilor filogenetice, speciile Neisseria au fost clasificate în cinci grupe şi

anume: N. meningitidis, N. flavescens, N. cinerea, N. pharyngis şi N. elongata (12 specii în

total).

Anterior, Moraxella (Branhamella) catarrhalis aparţinea genului Neisseria; studii de

genetică moleculară au demonstrat că există diferenţe între aceste microorganisme.

32. 2. Caractere generale32. 2. 1. Habitat. Caractere fiziologice

N. lactamica a fost evidenţiată la nivel nazal sau faringian în cazul a 3-40% din

purtătorii sănătoşi. Studii epidemiologice arată că prezența acestei bacterii poate avea

efecte favorabile (înregistrându-se activitate bactericidă serică îndreptată împotriva N.

meningitidis; studiul s-a efectuat iniţial pe şoricei, ulterior pe oameni). Cu toate că este

improbabilă realizarea unui vaccin cu tulpini vii de N. lactamica, înţelegerea mecanismului

inducerii unei imunitaţi încrucişate şi a activitaţii serice bactericide ar putea utilă pentru

studiile legate de vaccin. (2, 3)

Marea majoritate a speciilor din genul Neisseria sunt coci Gram negativi. În urmă cu

caţiva ani se considera că N. elongataeste singura specie de origine umană cu aspect

bacilar. Totuşi, un studiu publicat de Journal of Clinical Microbiology în 2006 raportează

izolarea şi caracterizarea a 8 tulpini bacilare de Neisseria de la pacienţi cu infecţii localizate

fie la nivelul cavităţii orale, fie la nivelul tractului respirator. Două dintre ele au fost izolate

din sânge. Din punct de vedere genetic asemănarea era de <96% cu celelalte specii din

gen. Analiza acizilor graşi celulari a arătat o similaritate mare. Microorganismele sunt Gram

negativ si măsurau 0.6μm /1.3-3.0μm. Cresc pe geloză-chocolate. Sunt oxidază pozitivi,

indol negativi şi nu produc acid la fermentarea cu dextrozei, lactozei, maltozei şi sucrozei.

Aceste teste au dus la concluzia că se poate descrie o specie nouă, denumităNeisseria

bacilliformis. (4)

Moraxella catarrhalis a fost identificată în flora normală a tractului respirator superior, la

40-50% din copiii de vârstă şcolară sănătoşi şi la circa 5% dintre adulţi, dar poate fi

implicată şi într-o serie de infecţii (bronşite, traheobronşite, pneumonii, sinuzite, otite,

conjunctivite), în special la gazde cu deficienţe ale capacităţii de apărare. Există studii care

estimează că un procent de circa 15% din otitele medii ar fi produse de Moraxella

catarrhalis. Speciile de Moraxella sunt de regulă Gram-negative (totuşi, există elemente

care rezistă decolorării cu alcool-acetonă). M. catarrhalis a aparţinut iniţial

genului Neisseria, ulterior genuluiBranhamella, astăzi făcând parte din genul Moraxella.

Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, dar pot forma şi lanţuri scurte. Se pot dezvolta

atât la 35-37ºC cât şi la 28-30ºC. Pot forma colonii pe medii care conţin colistin. Dacă în

urmă cu 35 de ani prezenta sensibilitate la penicilină, actualmente se cunoaşte faptul că

361

produce β-lactamază (3 tipuri enzimatice diferite); prezintă, de regulă, rezistenţă la

penicilină, ampicilină, meticilină, clindamicină şi vancomicină. Este unul dintre micro-

organismele care, alături de S. pneumoniae şi tulpinile ne-tipabile de H. influenzae, este

studiat în vederea producerii unui vaccin care să prevină apariţia otitei medii.

N. gonorrhoeaese poate găsi la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate

(indiferent dacă infecţia este sau nu simptomatică). A fost remarcată pentru prima dată de

Albert Neisser (1879): coci intra-leucocitari la examenul secreţiei purulente din uretra

masculină, la pacienţi cu gonoree. Cultivarea a fost realizată cu 3 ani mai târziu. Cea mai

recent definită subspecie de N. gonorrhoeae a fost identificată în secreţii conjunctivale (N.

gonorrhoeae subspecia kochii).

Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant în microbiota vaginală, au fost

evidenţiate în strânsă legătură cu un risc scăzut de infectare în urma expunerii la N.

gonorrhoeae. Lactobacillus  scade aderenţa N. gonorrhoeae cu până la 50% şi inhibă

invazia celulelor epiteliale cu până la 60%. Mai mult decât atât, lactobacilii au posibilitatea

să disloce gonococii aderaţi ceea ce ne poate conduce cu la ideea că ar putea ajuta la

profilaxia postexpunere. (5)

N. meningitidis a fost izolată la persoane sănătoase de la nivel nazal sau faringian. La

pacienţii cu meningită meningococică, germenul se multiplică în lichidul cefalorahidian

(LCR). A fost izolată pentru prima dată în anul 1887 din LCR de la un pacient cu meningită

acută.

În prima decadă a secolului 20 meningita meningococică netratatată avea o rată a

mortalitaţii de 75-80%. În 1913, Simon Flexner a fost primul care a gândit o formă de

terapie folosind serul antimeningococic cabalin intratecal. Mortalitatea a fost redusă la 31%

pe un lot de 1.300 pacienţi. În perioada 1928-1936 169 de copii au fost trataţi în acest fel la

spitalul Bellevue din New York iar mortalitatea a scăzut la 20%. În 1930 odată cu

introducerea sulfonamidelor mortalitatea a scăzut la 5-15%. Totuşi, odata cu ”era

antibioticelor” a început şi ”era rezistenţei la antibiotice”. (6)

Atât adulţii cât şi copiii pot fi colonizaţi de mai multe specii de Neisserii, în acelaşi timp

(de ex. Neisseria spp. nepatogene şiN. meningitidis). Neiseriile saprofite / comensale au fost

descrise pentru prima dată în 1906, purtând iniţial alte denumiri. Ceea ce este relativ

interesant, N. flavescens (1930) şi N. lactamica (1969) au fost izolate din LCR, motiv pentru

care se presupune că pot determina meningită. Ultima specie de Neisseria a fost definită în

1993, drept N. weaweri (numele iniţial fiind grupul CDC M-5; de origine canină şi rar izolată

din rănile pacienţilor muşcaţi de câini).

În continuare vor fi prezentate doar două dintre speciile enumerate, respectiv N.

gonorrhoeae şi N. meningitidis, microorganisme cu necesităţi nutritive complexe şi care se

pot dezvolta doar la 35-37ºC.32. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Atât meningococul cât şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili,

înconjuraţi de o structură capsulară comună, cu o structură de polifosfat sau polizaharid-

polifosfat (în cazul meningococului), situaţie în care capsula este mai evidentă. (Figura nr. 1

și Figura nr. 2) În funcţie de structura capsulei există mai multe serogrupuri.

362

32. 2. 3. Caractere de cultură

Ambele microorganisme au nevoie în vederea izolării de utilizarea unor medii de cultură

îmbogăţite, necesităţile nutritive fiind mult mai mari în cazul gonococului (există tulpini de

meningococ care se pot dezvolta pe medii simple, cu săruri minerale, lactat şi aminoacizi).

Principial se pot multiplica în cazul folosirii mediului Mueller-Hinton (amintit şi la

antibiograma difuzimetrică), la o temperatură de incubare de 35-37ºC şi în condiţiile unei

atmosfere de 3-10% CO2. (Figura nr. 3, exsicatorul) Gonococul nu se multiplică în lipsa unor

surse energetice (glucoză, piruvat, lactat). Coloniile apar în 24-48 de ore, mai rapid în cazul

meningococului.

Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M,

nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot

apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este

eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii după 72 de ore.

Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm. Tulpinile

încapsulate (A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.32. 2. 4. Caractere biochimice

Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre

exemplu, gonococul poate metaboliza glucoza (nu şi maltoza), în timp ce meningococul

metabolizează ambele zaharuri menţionate. (Figura nr. 4)

Produc citocrom-oxidază, ceea ce reprezintă un test cheie în identificare; se utilizează

de exemplu benzi de hârtie de filtru îmbibată cu reactiv, respectiv tetrametil-p-

fenilendiamină. Reacţia pozitivă apare în circa 10 secunde (vezi şi anexa nr. 2). (Figura nr.

5)32. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Neisseriile implicate în patologia umană sunt foarte sensibile la uscăciune, lumină

solară şi la variaţii de temperatură, precum şi la majoritatea antisepticelor şi

dezinfectantelor. Produc enzime autolitice.32. 2. 6. Structură antigenică

În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte

lipopolizaharidul (endotoxina). Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura

enterobacteriilor, care conţine multiple unităţi repetitive, neisseriile au lanţuri zaharidice

scurte, motiv pentru care denumirea corectă ar fi cea de lipooligozaharid (LOZ). În funcţie

de structura lipooligozaharidului există mai multe serotipuri, 6 în cazul gonococului şi 12

în cazul meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic

diferite.

Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit şi endotoxină, deoarece este

eliberat din perete după distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmentează în

lipidul A (responsabil pentru toxicitate) şi respectiv în polizaharidul (oligozaharidul) O.

Neisseria gonorrhoeae

363

În cazul gonococului heterogenitatea antigenică este remarcabilă. Acest microorganism

este capabil să îşi modifice structurile de suprafaţă „in vitro” (probabil şi „in vivo”), evitând

mecanismele de apărare ale gazdei. Ar fi de menţionat şi următoarele structuri antigenice:

- pilii, cu rol în ataşarea de celulele gazdei, care protejează gonococul faţă de fagocitoză

şi au o structură proteică. Capătul C-terminal are o structură variabilă. Pilinele diferă de la o

tulpină la alta şi chiar în cazul aceleaşi tulpini (există sute de tipuri de piline posibile). Există

şi pili cu rol în procesul de conjugare genetică;

- mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formează pori la

suprafaţa celulei bacteriene. Fiecare tulpină prezintă un tip de porină, dar porinele diferă de

la o tulpină la alta. Această structură este utilă pentru serotiparea gonococilor. Proteina II

(OPA) este identificată la tulpinile care produc colonii opace şi este utilă pentru aderarea

gonococului.

- proteina care leagă fierul (iron binding protein) este similară ca greutate cu porinele;

se exprimă atunci când aportul de Fe este insuficient;

-  adezina cu greutate moleculară 36 kDa;

- proteina Rmp, o proteină localizată la suprafaţa membranei externe; are secvenţe

care prezintă omologie parţială cu proteine identificate la Shigella dysenteriae sau E. coli;

anticorpii anti-Rmp pot fi puşi în evidenţă la pacienţi sau convalescenţi cu gonoree, la nivel

sanguin sau în secreţiile genitale;

- IgA1 proteaza;

- pseudo-capsula din polifosfat;

- proteine de stres asemănătoare proteinelor de şoc termic Hsp60.

Variaţia antigenică este importantă, cu o valoare de circa 10-3 (pentru OPA, LOZ, piline)

şi este utilă pentru eludarea mecanismelor de apărare ale gazdei. De menţionat prezenţa

anumitor plasmide implicate în rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.

Gonoreea apare adesea în cadrul coinfecţiei cu HIV. LOZ induce imunitatea

înnăscută legându-se de TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite

de Neisseria gonorrhoeae  asupra infecţiei HIV şi a provirusului din macrofage. Macrofagele

care conţineau LOZ au devenit rezistente la infecţia HIV şi la provirus. (7)

Neisseria meningitidis

În cazul meningococului, pe lângă LOZ mai este important de menţionat structura

capsulară, care permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre aceste grupuri

serologice (notate cu litere), mai importante datorită implicării în patologie sunt grupele:

29E, A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z şi W-135. Vaccinurile conţin numai o parte dintre aceste

antigene.

Atât pilii, cât şi tipurile de proteine menţionate mai sus sunt prezente şi în cazul

meningococului (piline de clasa I şi II, porine de clasa 1, 2 şi 3, proteina Rmp, proteina OPA

de clasă 5 etc), însă fără fenomenele de variaţie antigenică (genetică) menţionate.32. 2. 7. Răspuns imun

În infecţiile cu gonococ apare un răspuns imun, dar datorită fenomenelor prezentate

mai sus, practic nu există imunitate postinfecţioasă; aceeaşi persoană poate face infecţii

repetate.

364

În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-

capsulari, anti-lipooligozaharid şi anti-membrană externă, care apar după infecţii subclinice.

Nou-născuţii sunt în general protejaţi datorită anticorpilor de tip IgG proveniţi de la mamă.

Infecţiile meningococice reprezintă o problemă în special pentru persoanele care au un

deficit al sistemului complement (mai ales componentele C6-C9).

LCR conţine molecule implicate în imunitatea înnăscută (ex. sistemul complement),

molecule esenţiale în controlul infecţiei şi în activarea infiltrării cu fagocite (neutrofile,

monocite). Totuşi, celulele epiteliale ale stratului ependimal care intră în structura tubului

neural sau ale plexului coroid ar putea fi foarte vulnerabile la atacul citotoxic şi citolitic al

componentelor complementului. Un studiu publicat în 2006 (8) a arătat capacitatea

celulelor epiteliale cerebrale de a exprima la nivelul membranei receptori pentru reglarea

activității complementare (CD35, CD46, CD55, CD59). Prin studii de dublă

imunofluorescenţă pentru markeri ai celulelor ependimale (GFAp, S100, ZO-I) şi ai

receptorilor pentru reglarea complementului s-a ajuns la concluzia că aceste celule au o

cantitate mare de CD55 şi CD59 şi mai mică de CD46 şi CD35. La nivel tisular s-a observat

că CD55 era slab exprimat la nivelul plexurilor coroide şi celulelor ependimale de control

dar exprimarea era crescută în meningită. Anti-CD59 era prezent la nivelul ambelor epitelii

în timp ce CD59 a fost identificat doar la nivelul plexurilor coroide inflamate. CD46 şi CD35

nu au fost identificate în ţesuturile de control. Pe de altă parte, în meningită aceste

molecule erau puternic exprimate. Acest studiu arată posibilitatea structurilor cerebrale de

a raspunde şi susţine imunitatea înnăscută mediată de complement. (8)

Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o creştere a incidenței

infecţiilor cu Neisseria meningitidis.S-au făcut teste în acest sens şi s-a recoltat sâange şi

ser de la pacienţi adulţi care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienţii aveau de

asemenea deficit de mannose-binding lectin (MBL). Proliferarea meningococilor introduşi în

sânge a fost evaluată prin numărul de CFU (colony-forming unit) şi prin Real-time PCR. S-a

investigat activitatea bactericidă serică şi cea opsono-fagocitică a granulocitelor incluzând

ser inactivat termic postvaccinare pentru a evalua influenţa anticorpilor antimeningococici.

Proliferarea meningococică a fost de 2log10 pentru CFU şi 4 sau 5log10 copii ADN.

Proliferarea a scăzut moderat după corectarea deficitului de C2, dar după corectarea

deficitului de C5 toţi meningococii au fost distruși (remarcându-se și un titru mare de

anticorpi). Activitatea opsono-fagocitică a fost strict dependentă de C2, a apărut în serul

normal şi a crescut în serul postvaccinare. Activitatea bactericidă serică a depins doar de

C2, C5 şi titrul anticorpilor. MBL nu a influenţat în nici un fel aceşti parametri. (9)

Imunitatea adaptativă este pilonul cel mai important. Ţesutul limfoid asociat

nazofaringelui (NALT) este locul principal al răspunsului imun. LTCD4+ interacţionează în

cele din urmă cu LB şi duc la secreţie de IgA şi IgG. IgA facilitează clearance-ul microciliar,

aglutinarea patogenilor şi împiedicarea adeziunii epiteliale precum şi neutralizarea toxinelor

secretate. (10)32. 2. 8. Caractere de patogenitate

În cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datorează existenţei factorilor care

permit ataşarea de celulele gazdei, multiplicării la poarta de intrare şi respectiv capacităţii

365

de invazivitate. Prezenţa capsulei şi a lipooligozaharidului contribuie în mod diferenţiat (mai

important în cazul meningococului) în patogenia bolilor produse.

Pentru câteva detalii, luăm în discuție Neisseria meningitidis unde aderarea are loc la

nivelul nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Aceştia se pare că se leagă de o

proteină reglatoare a complementului de pe membrana celulară, CD46. Pilii duc la

modificări post-transcripţionale în cele din urmă glicozilarea acestora poate accelera

detaşarea bacteriană de pe suprafaţa celulei unde deja s-au format colonii. Prin alterearea

acestui mecanism, de adeziune, bacteriile scapă din agregate şi pot disemina şi forma noi

agregate în noi locuri. (11)

Pentru a particulariza doar o parte din fenomenele desfășurate în cursul procesului

infecțios, vom lua drept exemplu infecția cu N. meningitidis. În timpul invaziei,

meningococul se localizează preferenţial în capilarele cerebrale unde viteza de curgere a

sângelui este redusă, la fel ca în capilarele din nazofaringe, viteza căreia trebuie sa îi

reziste în timpul colonizării. De asemenea, el trebuie să reziste şi forţelor mecanice,

mucusului, răspunsului inflamator şi tusei. Prin intermediul anumitor structuri pe care le

deține, meningococul duce la polimerizarea actinei şi auto-protecţie (formarea unor

structuri de protecție). În plus, meningococii formează la suprafaţa celulei biofilme alcătuite

din lipide şi polizaharide (evitând astfel contactul cu sistemul imun).  Procesul poate

continua pe 2 căi: transcelulară sau paracelulară.

Nu doar LOZ este util în aderare, dar şi de proteinele Opa şi Opc. Opc se leagă de

proteinele matrixului extracelular, precum vibronectina. Opa se leagă de moleculele de

adeziune celulară a antigenului carcinoembrionar, de heparan sulfat şi integrine.

O altă moleculă cu o importanţă foarte mare este TspA (T-cell stimulating protein A)

care duce la proliferarea LT și LB.  Nu este cunoscut bine mecanismul de acțiune.

Luând în discuție capsula, portajul este favorizat de pierderea capsulei (aceasta inhibă

aderenţa şi formarea biofilmului), în schimb, în cursul procesului infecțios prezența capsulei

este necesară (11).

32. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

Neisseria gonorrhoeae

Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică

inclusiv în ţările cu o economie dezvoltată (vezi şi 30.3.6). Acest fapt se datorează şi

apariţiei / răspândirii tulpinilor de gonococ rezistente la antibiotice/chimioterapice şi

existenţei unui număr important de infecţii asimptomatice (în special la femei).

După pătrunderea în organismul receptiv, în funcţie de calea de transmitere, gonococul

se ataşează de mucoase (genito-urinară, oculară, rectală, faringiană etc.) şi produce, local,

o supuraţie acută. În timp poate apărea invazia tisulară şi în consecinţă, instalarea unor

fenomene inflamatorii cronice şi apariţia fibrozei (în special în cazurile netratate).366

La bărbaţi apare, de regulă, uretrita gonococică (manifestată prin secreţie galben-

verzuie, cremoasă, însoţită de usturimi şi dureri la micţiune); în lipsa tratamentului, aceasta

poate afecta prin invazie epididimul şi prin fibroză poate determina apariţia stricturilor

uretrale.

În cazul sexului feminin, gonoreea se localizează endocervical, dar se poate extinde la

nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (în ultimul caz, cu

posibilitatea apariţiei unor fibroze şi obstrucţii care conduc la sterilitate). Dacă mama are

gonoree şi nou-născutul se naşte pe cale naturală, va apărea oftalmia

gonococică (prevenită de ex. prin instilaţii cu soluţie de nitrat de Ag 1% în sacul

conjunctival).

Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguină (bacteriemie), cu apariţia unor

leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.

Neisseria meningitidis

Meningococul poate produce şi alte infecţii, dar este important de menţionat că

reprezintă una din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături

de Haemophilus influenzae şi Streptococcus pneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar

se estimează că meningita meningococică apare la 1/1.000 din persoanele contaminate.

În producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii

(portaj = o relaţie de comensalitate între bacterie şi gazdă, fără ca gazda să prezinte vreun

semn sau simptom care să ne ducă cu gândul la patologie), invazia locală, bacteriemia

(favorizată de prezenţa capsulei), invazia meningeală, alterarea barierei hemato-encefalice,

inflamaţia în spaţiul subarahnoidian şi creşterea presiunii intracraniene. Apariţia vasculitei

cerebrale şi scăderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezintă factori de agravare.

Activarea mai multor cascade inflamatorii (în special datorită eliberării unor cantităţi

importante de endotoxină) pot conduce la instalarea unui sindrom de coagulare

intravasculară diseminată şi la o evoluţie nefastă spre deces.

32. 4. Diagnostic de laboratorDiagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) atât în gonoree cât şi în meningita

meningococică, dar trebuie să fie orientat de examenul clinic. În cazul meningitei, de mare

importanţă este utilizarea unor examene paraclinice complementare.

32. 4. 1. În gonoree, recoltarea produsului patologic se realizează diferenţiat (într-o

oarecare măsură) în funcţie de vârstă, sex şi de practicile sexuale ale individului infectat. În

cazul gonoreei la femei, recoltarea se va face de la nivelului colului uterin. La bărbaţi,

recoltarea se va face de la nivelul uretrei, eventual utilizând un tampon steril uretral,

introdus cu blândeţe circa 2 cm în uretra anterioară. Transportul trebuie realizat foarte

rapid (şi în condiţii care să permită supravieţuirea microorganismului) sau pe medii speciale

de transport, dar ar fi de preferat inocularea imediată pe mediul de cultură.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând

regulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit

367

antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând

toate normele de asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se prelevează secreţia

uretrală (eventual „picătura matinală”), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă

ginecologică de la nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi anexa nr. 2, A. 6.

1.). Secreţiile au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe

medii de cultură potrivite şi în atmosferă de CO2. În cazul în care p.p. urmează a fi

transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură

apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul utilizării mediilor de transport (ex. mediul Amies

plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar

putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea

urinei etc. În cazul în care nu există nici o secreţie, se poate utiliza urina care trebuie

centrifugată şi însămânţată imediat pe medii de cultură.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu

albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic

cu imersie şi se notează prezenţa celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi

prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o

structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. Aspectul microscopic este

acelaşi ca şi în urmă cu aproape 130 de ani.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să

se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi

anexa nr. 2). Gonococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt

aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include

vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloză-sânge

sau geloză-chocolate cu diferite suplimente nutritive; se recomandă utilizarea pulberii de

hemoglobină şi nu a sângelui proaspăt). Este preferată cultivarea „în dublu”, pe medii

selective şi neselective; în cazul în care p.p. este reprezentat de secreţie de la nivelul

rectului sau de secreţie faringiană se vor folosi numai medii selective. Este necesară o

atmosferă de 3-10% CO2, la o temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore.

Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M,

nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot

apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este

eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii, după 72 de ore.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

·         Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,

imobili, eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi. Se poate utiliza

şi „coloraţia” fluorescentă.

·         Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3).

·         Caractere biochimice:

Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Gonococul

metabolizează glucoza dar nu şi maltoza.368

Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2).

Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv.

Auxotipia evaluează necesităţile nutriţionale ale gonococului.

Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor

(ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc).

Utilizând galeriaAPI NH(manuală) putem identifica specii

de Neisseria, Haemophilus şi Branhamella catarrhalis, în circa 4 ore.

·         Caractere antigenice:

În funcţie de structura lipooligozaharidului există 6 serotipuri. Gonococii pot exprima

simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creează probleme tehnice. Aceste

testări se realizează în centre de referinţă.

Prezenţa gonococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin coaglutinare

(suspensie de S. aureus tip Cowan I stabilizată şi sensibilizată cu Ac monoclonali

antiproteină I din membrana externă a gonococilor) sau printr-o tehnică imunoenzimatică,

ELISA (cu Ac policlonali).

Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscuţi, pentru identificare gonococului prin tehnica

imunofluorescenţei directe.

·         Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:

Există diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie moleculară) care sunt practicate

numai în centrele de referinţă.

·         Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte

bună; se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p.

- Sondele nucleotidice (ADN) pot hibridiza cu ARNr extras din celulele microbiene.

PCR

LCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină sau de la

secreţii vaginale dar are un dezavantaj - costul.

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii

tratamentului) este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice

(mediul utilizat este GC suplimentat nutritiv dar fără pulbere de hemoglobină). Au fost

identificate tulpini rezistente la penicilină (fie datorită unui plasmid care codifică o β-

lactamază de tipul TEM, fie datorită unor mutaţii cromozomiale). Este necesară testarea

producerii de β-lactamază (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate

realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7).

32. 4. 2. În meningita meningococică diagnosticul este urgent (risc de deces şi

evoluţie cu sechele), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către

laborator. Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului”, chiar dacă

pentru concentrarea germenilor este necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi

biochimică a LCR este utilă în stabilirea etiologiei.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând

regulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit

antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând

369

toate normele de asepsie şi antisepsie etc). Aşa cum am menţionat, recoltarea LCR prin

puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de

ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar

pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei

cantităţi de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). LCR poate fi

purulent. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie

realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Meningococul ar putea fi izolat

şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Prezenţa

meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex aglutinare,

coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti - A, C, Y, W-135

şi respectiv seruri monovalente anti - B (care pot fi utile şi în identificarea „încrucişată” a

antigenului K1 al E. coli).

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu

albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent, frotiurile se pot

executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se

examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor

inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,

imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar.

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să

se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi

anexa nr. 2). Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple,

sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include

vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-

sânge sau geloză-chocolate) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o

atmosferă de 3-5% CO2, la o temperatură de 37°C.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

·         Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,

imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi.

·         Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de

circa 1-2 mm. Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de

tip M.

·         Caractere biochimice:

Metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în identificare. Spre exemplu

meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza.

Produc citocrom-oxidază, un test cheie în identificare (vezi anexa nr. 2)

Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatică a Neisseriilor (ex.

Quad Ferm+, RIM, Minitek etc).

·         Caractere antigenice: În funcţie de structura lipooligozaharidului există 12

serotipuri. Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura

370

capsulară permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante

sunt grupele: A, B, C, Y şi W-135.

Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex

aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti -A, C,

Y, W-135 şi respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml).

De notat posibilitatea unei reactivităţi încrucişate faţă de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de

la E. coli.

Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate în cultură.

·         Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Există diferite tehnici

(imunologice, electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre

de referinţă. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la

pacienţii pentru care s-a iniţiat deja antibioticoterapia.

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii

tratamentului) este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Majoritatea tulpinilor de meningococ au rămas sensibile la penicilină. Totuşi, realizarea

antibiogramei poate fi utilă, orientând continuarea tratamentului. În cazul unor infecţii

grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14).

32. 5. TratamentPentru tulpinile de gonococ sensibile se putea utiliza penicilina, având ca alternativă

spectinomicina sau ceftriaxona. În momentul actual unica atitudine corectă este izolarea

tulpinii și tratamentul conform antibiogramei. Ca o regulă generală este de reţinut că este

strict necesar ca tratamentul să fie aplicat tuturor partenerilor sexuali.

În meningita cu meningococ pot fi utile penicilina G, ceftriaxona sau cloramfenicolul,

dar nu trebuie neglijată utilitatea antibiogramei. Foarte recent (2007-2008), au fost

identificate în SUA tulpini de meningococ rezistente la ciprofloxacină. În meningită

tratamentul este mai complex, avându-se în vedere posibilele complicaţii.

33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa)

33. 1. Definiţie. Încadrare

Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii de

microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Această familie reprezintă

probabil cea mai larg reprezentată grupare taxonomică, intens studiată, atât din punct de

vedere al microbiologiei fundamentale cât şi datorită implicaţiilor practice, clinice.

371

Numele acestei familii a fost propus în anul 1937, dar Serratia marcescens a fost

descrisă şi a primit acest nume în 1823. Este adevărat că tulpinile de S. marcescens,

producătoare de pigment caracteristic de culoare roşie, sunt uşor de identificat şi în acelaşi

sens se estimează că prezenţa lor a fost luată în discuţie cu circa 3 secole înainte de

Hristos. Salmonella typhi a fost descrisă în 1884, iar Yersinia pestis, după încă 10 ani.

Dacă în 1974, familia includea 12 genuri şi 36 de specii, iar în 1994, 30 de genuri şi 107

specii, în momentul de faţă familiaEnterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de

microorganisme semnificative din punct de vedere medical şi peste 150 de specii (în cazul

în care nu luăm în considerare clasificarea genului Salmonella în peste 2.390 de specii)

(vezi şi A.6.5.1. şi capitolele 37-42).33. 2. Caractere generale33. 2. 1. Habitat

Enterobacteriile se pot găsi în apă, pe sol, pe plante sau pot coloniza în mod normal

intestinul omului şi animalelor. Totuşi trebuie reţinut că peste 90% din flora intestinală

normală umană este formată de germeni anaerobi.

Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru om,

în timp ce altele (Escherichia,Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc) cuprind specii saprofite

sau condiţionat patogene (cu excepţia anumitor tulpini, patogene) şi se găsesc în flora

normală gastrointestinală, sau de ex. în flora tractului respirator superior.

Când se utilizează termenul de „bacterii enterice”, unii autori includ şi alte genuri

precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia Enterobacteriaceae.33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii având o dimensiune de aproximativ 2-3 /

0,6μm), cu capete rotunjite, care nu se pot diferenţia prin microscopie optică, mobili

cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp, Proteus spp.), sau imobili (ex.Shigella spp., Yersinia

pestis, Klebsiella spp.), nesporulaţi; unele specii pot prezenta capsulă (ex. Klebsiella

pneumoniae).33. 2. 3. Caractere biochimice şi caractere de cultură

Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ

anaerobi, utilizează fermentativ glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidază-

negativi, catalază-pozitivi, reduc nitraţii la nitriţi, se pot cultiva pe medii obişnuite formând

colonii de tip S, R („vechi”) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia

coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza (ex. Salmonella spp., Shigella spp.). De altfel,

caracterele biochimice sunt foarte importante în identificarea enterobacteriilor. În Tratatul

de Microbiologie şi Infecţii Microbiene (Topley and Wilson’s, 2005), nu mai puţin de 11

pagini de tabele (1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale enterobacteriilor

(de menţionat că această prezentare reprezintă o simplificare şi prescurtare privind acest

subiect).33. 2. 4. Structura antigenică

33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este

format din:

372

- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxică, format din unităţi dizaharidice de

glucozamină fosforilată de care se ataşează acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (ex.

acidul β-hidroximiristic cu 14 atomi de carbon), care este prezent la toate enterobacteriile

şi care se găseşte în natură numai în această structură particulară, lipidul A. De lipidul A se

ataşează:

- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative şi o

serie de unităţi terminale repetitive care diferă de la specie la specie (antigenul O).

Antigenul O este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacţii de aglutinare

cu antiseruri specifice. Antigenul O este asimilat cu termenul de endotoxină. Formele „R”

sintetizează un LPZ care nu conţine elementele repetitive ale polizaharidului O,

caracteristice culturilor „S”.

Faţă de antigenul O apar în special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde

antigene O specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de

exemplu:

- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;

- pot exista reacţii încrucişate între E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;

- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacţionează încrucişat cu structuri

antigenice izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte

antigene de suprafaţă de la celulele animale.

33. 2. 4. 2. Antigenul H este de natură proteică; denaturat de alcool (50°) şi de

temperatură (70°C). Este localizat la nivelul flagelilor (nu există la speciile imobile). Are

antigenicitate mai mare decât antigenul O (dominant); de aceea, pentru a putea apărea

combinaţia cu antigenul O, în anumite situaţii, antigenul H trebuie denaturat în prealabil.

Antigenul H poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice (în special cu

anticorpi din clasa IgG).

Anticorpii anti-H imobilizează bacteria, atenuând virulenţa microorganismelor mobile,

fiind probabil cauza apariţiei variaţiei de fază la Salmonella. Variaţia de fază este

proprietatea bacteriei de a altera exprimarea unui anumit tip de antigen flagelar.

33. 2. 4. 3. Antigenul K se situează extern faţă de antigenul O, la bacteriile capsulate.

Este un antigen polizaharidic, parţial stabil la temperatură. Dacă este organizată o structură

capsulară, aglutinarea cu antigenul O va fi inhibată. Au fost identificate şi structuri

asemănătoare antigenului tipic capsular; spre ex. la E. coli există antigenul K1. Antigenul K

este implicat şi în patogenitate, favorizând rezistenţa la fagocitoză a bacteriei şi contribuind

la invazivitate.

33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi există în mod suplimentar antigenul Vi (de virulenţă)

care face parte din antigenele „de înveliş” ale acestei bacterii, are structură polizaharidică

şi este implicat în scăderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare

intramacrofagică. Poate „masca” antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica

prin reacţii de aglutinare cu antiseruri specifice.

373

Clasificarea antigenică a enterobacteriilor indică adesea prezenţa fiecărui antigen

specific, de exemplu E. coli O55:K5:H21 etc.

33. 2. 4. 5. Unele enterobacterii elaborează şi exotoxine, spre exemplu toxina SHIGA

PRODUSĂ DE SHIGELLA DYSENTERIAETIPUL 1, VEROTOXINA PRODUSĂ DE E. COLI O157:H7

ETC.

33. 2. 4. 6. Majoritatea enterobacteriilor prezintă fimbrii, de natură proteică (există 6

tipuri de fimbrii); unele enterobacterii prezintă şi proteine filamentoase (ex. E. coli) care par

să aibă rol în patogenitate.33. 2. 5. Caractere de patogenitate

Adezinele

Practic toate bacteriile Gram-negative prezintă fimbrii (pili), indispensabili pentru

aderarea de mucoase, acesta fiind primul pas în vederea colonizării şi multiplicării iniţiale.

Toxinele

a). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella şi la unele

tulpini de E. coli), toxina LT (termic labilă) la E. coli (asemănătoare cu exotoxina vibrionului

holeric) etc. Ar mai fi de menţionat existenţa unor citotoxine produse deE. coli care sunt

alfa-hemolizine (exotoxine); beta-hemolizinele rămân legate de celulă şi inhibă fagocitoza şi

chemotaxia leucocitelor.

b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse în peretele tuturor germenilor Gram-negativi,

putând determina în cazul unei eliberări masive (distrugerea brutală a unui număr mare de

bacterii) şocul endotoxic. Administrarea experimentală a lipopolizaharidului la animal

determină febră, leucopenie, trombocitopenie, CID (coagulare intravasculară diseminată),

activarea sistemului complement şi eliberarea de substanţe vasoactive proinflamatorii.

Achiziţia de fier

O serie de enterobacterii sintetizează o componentă care are capacitatea de a chela

fierul (siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de către bacterie (de exemplu,

aerobactina de la E. coli).

Structurile capsulare

Antigenele de tip K ale E. coli au structură proteică şi sunt importante în colonizare;

diminuă opsonizarea şi fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-

neuraminic. Este similar cu structuri proprii gazdei şi este slab imunogen.

Klebsiella prezintă un antigen K (şi respectiv o capsulă) bine reprezentat.

Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoperă (maschează) antigenul O şi are importanţă

în invazivitate.

Plasmidele

Sunt importante pentru faptul că transmit atât informaţii genetice legate de rezistenţa

la antibiotice (factor R) cât şi pentru virulenţă.33. 3. Povestire adevărată

374

Un pacient de sex masculin, în vârstă de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de

leucemie acută promielocitară de circa 1,5 ani; se internează pentru administrarea

tratamentului chimioterapic şi pentru realizarea unui transplant de celule stem.

La circa 3 ore de la administrarea profilactică de imunoglobuline pe cale i.v., pe un

cateter fixat anterior, pacientul devine febril (temperatură 39,5ºC).

S-a recoltat sânge pentru hemoculturi şi după aceasta s-a administrat o asociere între o

cefalosporină de generaţia a 3-a şi gentamicină. Sângele a fost însămânţat în bulion sânge,

cu trecere „oarbă” după 18 ore, pe geloză-sânge şi pe un mediu care conţinea eozină şi

albastru de metilen. După încă 24 ore, apar culturi (de tip „S/M”) pe ambele medii, se

apreciază că este vorba de colonii lactoză-pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor

izolate relevă prezenţa unor bacili Gram-negativi.

Se realizează teste biochimice pe „medii multi test”, microorganismul fiind glucoză-

pozitiv şi lactoză-pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil, indol-negativ,

urează-negativ. Analiza preliminară orientează spre o enterobacterie, dar, se face testul

oxidazei care este pozitiv. Efectuând şi alte testări, diagnosticul final a fost: infecţie

cu Agrobacterium radiobacterla un pacient cu imunodepresie. Testarea sensibilităţii la

antibiotice şi chimioterapice a recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.

Evoluţia a fost favorabilă, iar la 3 săptămâni de la episodul acut s-a putut realiza

tratamentul chimioterapic şi pacientul a fost pregătit pentru transplantul cu celule stem.

Discuţie

Nu orice bacil Gram-negativ, glucoză-pozitiv şi lactoză-pozitiv este o enterobacterie.

Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a revelat o tulpină rezistentă la

majoritatea medicamentelor testate, prezentând sensibilitate numai la ticarcilină, imipenem

şi ciprofloxacină. Având în vedere faptul că a fost vorba de o infecţie la o gazdă

imunodeprimată, diagnosticul bacteriologic şi testarea sensibilităţii le medicamentele

antibacteriene sunt strict necesare.

34. Genul Escherichia. Escherichia coli34. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde

germeni comensali care se găsesc ubicvitar (în apă, pe sol, etc). La nivelul intestinului

uman au rol în sinteza unor vitamine (simbioză). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau

imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactoză pozitivi.

375

Sunt grupați în şase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris și E.

albertii. Cu excepţia speciei E. blattae, izolată de la insecte, toate celelalte specii

de Escherichia au fost izolate din prelevate umane.

Specia tip, reprezentată de Escherichia coli, şi-a căpătat numele în 1919, în memoria lui

Theodor Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o din materii fecale

denumind-o Bacterium coli commune.

 

34. 2. Caractere generale34. 2. 1. Habitat

E. coli se găsește în intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind

considerată componentă a florei intestinale normale. Acest rezervor primar a făcut ca E.

coli să fie selectată de Organizaţia Mondială a Sănătaţii ca indicator de poluare fecală (1).

Studii întreprinse în ultimii ani indică însă o mult mai mare complexitate a populaţiei

genului Escherichia, ai cărui membri pot circula şi persista autonom, în afara tractului

gastrointestinal, fiind prezenţi în rezervoare secundare din mediul ambiant (2).34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-negativi drepţi sau uşor incurbaţi, cu capete rotunjite şi dimensiuni

cuprinse între 2-5µm / 0,5-1µm (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista şi forme

cocobacilare). În majoritate sunt mobili, prin prezența flagelilor (în preparatele native).

Unele tulpini prezintă capsulă (antigene capsulare de tip K).34. 2. 3. Caractere de cultură

Se dezvoltă bine pe medii simple de cultură; pe geloză se pot dezvolta colonii de tip S,

lactoză pozitive, convexe, umede, cu suprafaţă lucioasă, margini netede, uşor

emulsionabile în soluţie salină fiziologică sau colonii de tip R, uscate, cu marginile

crenelate, care se emulsionează greu şi neuniform în soluţie salină fiziologică; există forme

intermediare între coloniile S şi R, după cum există şi colonii mucoide de tip M.34. 2. 4. Caractere biochimice

Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvoltă în limite largi de temperatură şi

pH. Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalază pozitivă, oxidază

negativă şi fermentează glucoza. Capacitatea majorităţii tulpinilor deE. coli de a fermenta

lactoza este utilă în diferenţierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic,

tulpinile de E. colitestate pe medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu

produc H2S, produc indol şi lizindecarboxilază, dar nu urează si fenilalanindezaminază. În

plus, E. coli nu poate creşte pe un mediu care are ca unică sursă de carbon citratul

(caracter metabolic important pentru diferenţierea de alte enterobacterii).

Tulpinile EHEC/VTEC, de regulă, nu fermentează sorbitolul.34. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

376

Germenii supravieţuiesc în mediul extern (sol, apă) luni de zile. E. coli este distrus prin

expunere la 60ºC în 30 minute. Este sensibil la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor

uzuale.34. 2. 6. Structură antigenică

Ca şi în cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafața

tulpinilor de E. coli servesc aşa numitei serotipizări, metodă utilă în epidemiologia infecţiilor

cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacţii

serologice antigen-anticorp (ex. reacţia de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic),

antigenul H (flagelar) și antigenul K (capsular). Antigenul O (LPZ) a fost descris la

caracterele generale ale enterobacteriilor şi defineşte serogrupul (numerotarea grupului

antigenic este de utilitate epidemiologică; ex. serotipurile O55 şi O111 sunt implicate în

izbucniri epidemice de meningită neonatală). Există peste 170 de variante de Ag O.

În cadrul unui serogrup O, pe baza diversităţii antigenelor H (prezente numai la tulpinile

mobile, care posedă flageli) şi K (prezente la tulpinile care posedă capsulă) se definesc

serotipuri. Serogrupurile şi serotipurile se noteazţ printr-o combinaţie de litere şi cifre (ex.

O55:K59:H6). Structurile de suprafaţă pot masca prezenţa antigenului somatic O.

În majoritatea cazurilor, tipizarea serologică a tulpinilor de E. coli se rezumă la

identificarea antigenelor O şi H (ex. O157:H7).

Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie

menţionat că nu antigenele de suprafaţă conferă virulenţă bacteriei. Cu toate acestea,

definirea serotipului poate fi sugestivă pentru identificarea unor clone virulente (ex.

serotipul E. coli O157:H7, marker pentru subgrupul EHEC din patotipul VTEC).

Datorită faptului că au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de

tipuri de antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K şi o serie de tipuri antigenice

fimbriale (antigene F), prin combinaţiile acestora rezultă peste 1.000 de tipuri antigenice

de Escherichia coli.

Unele dintre tulpinile de  E. coli elaborează exotoxine (vezi 37.2.8 şi 37.3). Acestea pot

fi, la rândul lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacţii antigen-anticorp.34. 2. 7. Răspuns imun

Apare un răspuns imun umoral care nu are semnificaţie nici în ceea ce priveşte

protecţia faţă de boală şi cel mai adesea nici în diagnostic. De reţinut însă că, un titru înalt

al anticorpilor anti O157, detectat la pacienţii cu sindrom hemolitico-uremic (SHU), poate fi

util pentru diagnosticul indirect (imunologic) al infecţiei cu E. coli O157:H7 (3).34. 2. 8. Caractere de patogenitate

Tulpinile de E. coli domină microflora facultativ anaerobă a colonului la individul

sănătos, marea majoritate întreţinând cu aceasta relaţii de simbioză benefice ambilor. Ele

pot produce infecţii în condiţiile în care gazda este imunodeprimată sau când depăşesc

bariera intestinală şi ajung în zone normal sterile.

377

Există însă şi tulpini de E. coli care au o virulenţa intrinsecă, putând declanşa variate

procese infecţioase la indivizii imunocompetenţi. Tulpinile patogene de E. coli sunt

clasificate în aşa numite patotipuri. Ele generează simptomatologii similare prin

mecanisme de patogenitate comune.

În prezent sunt descrise şase patotipuri de E. coli implicate în sindromul diareic

(patotipuri intestinale) (4) şi un patotip implicat în infecţii extraintestinale (ex. infecţiile

tractului urinar, meningite, septicemii, etc.) şi denumit E. coli cu patogenitate

extraintestinală (ExPEC) (5). Patotipurile intestinale sunt: E. coli enteropatogen (EPEC), E.

coli enterotoxigen (ETEC), E. colienteroinvaziv (EIEC), E. coli producător de verotoxine

(VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) și E. coli cu aderenţă difuză (DAEC). În cadrul

patotipului VTEC se distinge, pentru a se sublinia în principal asocierea cu manifestări

clinice severe (ex. colita hemoragică), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic

(EHEC), care are ca prototip serotipul O157:H7.

Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulenţă, care afecteaza variatele

procese desfăşurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcţia

citoscheletului, diviziunea celulară, secreţia de ioni, funcţia mitocondriilor, apoptoza etc.).

Aceşti factori de virulenţă sunt codificaţi de structuri genetice localizate în cromozom sau

pe plasmide şi intervin în mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a

învinge sistemele de apărare ale gazdei.

 Adezinele sunt structuri de aderenţă aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile

de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la

suprafaţa membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC)

bacteriene. Ele reprezintă factori de virulenţa importanţi, care permit bacteriei să

colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subţire, tract urinar, vagin), in care nu

rezidă în mod normal.

Toxinele sunt o altă categorie de factori de virulenţă. Endotoxinele fac parte din

structura membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) şi sunt invariabil prezente la

toate bacteriile Gram negative, nu numai la E. coli, indiferent de potenţialul lor de

patogenitate. Eliberate în urma distrucţiei peretelui bacterian îşi manifestă efectele toxice,

fiind implicate în apariţia febrei şi şocului toxic din septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate

şi secretate în cursul metabolismului bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci

diverselor patotipuri de E. coli. În prezent se cunosc structura si funcţiile a numeroase

toxine responsabile de patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabilă şi

termostabilă produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 şi 2 sintetizate de tulpinile VTEC,

enterotoxina termostabilă enteroagregativă 1 a tulpinilor EAEC, etc.).

Multe dintre tulpinile ExPEC implicate în producerea meningitei neonatale sau a

infecţiilor urinare prezintă capsulă, o altă componentă importantă pentru patogenitatea

speciei. Rolul principal al capsulei este de a inhiba acţiunea complementului seric şi 378

fagocitoza, conferind astfel rezistenţă bacteriei. Antigenul polizaharidic capsular K1 este

prezent în 80% din tulpinile de E. coli izolate din cazuri de meningită neonatală (6).  

35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. 35. 1. Definiţie. Încadrare

Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate,

caracterizate printr-o intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi

hidrolizează cu producerea de acizi şi uneori de gaz. Glucoza este degradată cu producere

de gaz.

Specia tip a fost descrisă în 1885 sub numele de Bakterium lactis aerogenes. Numele actual

datează din 1954 fiind atribuit în onoarea microbiologului german Edwin Klebs. Klebsiella

pneumoniae este cunoscută şi sub numele de Bacillus Friedländer.

Există mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis şiK.

oxytoca, aceste tulpini fiind şi cele mai des implicate în patologia umană. În ultima perioadă

se consideră K. ozaenae şi K. rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae.

Recent, câţiva membri ai genului Klebsiella au fost reclasificaţi pentru a forma un nou

gen, Raoultella, pe baza informaţiilor din studii genetice. Membrii acestui nou gen pot fi

implicaţi şi în patologia umană, iar denumirea a fost adoptată la nivelul comunităţii

ştiinţifice internaţionale [1].

35. 2. Caractere generale35. 2. 1. Habitat

Klebsiella pneumoniae este larg răspândită în natură (sol, apă), dar şi în intestinul

omului şi animalelor; în mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot

coloniza tractul urinar sau respirator la adult sau tractul intestinal la copil, mai ales după

terapia prelungită cu antibiotice cu spectru larg.

Mai multe studii au urmărit „pattern-ul” de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniaea

indivizilor, cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecţii. S-a demonstrat astfel că

aproximativ o treime din persoanele testate prezintă portaj de Klebsiellaîn fecale.

Spitalizarea şi folosirea de antibiotice a crescut numărul celor colonizaţi de bacterii din

genul Klebsiella, cât şi numărul acestor bacterii per gram de fecale. Personalul medical

prezintă Klebsiella pe mâini după ce îngrijesc pacienţi (într-un studiu, 17% din asistentele

379

unei secţii de terapie intensivă; rate şi mai mari au fost înregistrate în cursul unui focar

epidemiologic activ – 30 % [2]).35. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulaţi (capsula are dimensiuni

de 2-3 ori mai mari decât diametrul bacteriei), imobili, nesporulaţi. Se pot dispune în diplo,

în special în organismul uman.35. 2. 3. Caractere de cultură

Se cultivă cu uşurinţă pe medii uzuale fără cerinţe nutritive speciale. Pe medii gelozate

s-au descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M): colonii mari,

opalescente, uneori cenuşii, cu suprafaţa umedă care după o incubare prelungită prezintă

tendinţă la confluare şi „curgere” pe suprafaţa mediului. Pe medii lactozate sunt lactoză-

pozitive.Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial

inhibată pe cele moderat selective. S-a raportat apariţia unor tulpini ce dezvolta colonii

hipermucoide, aceste tulpini având şi o virulenţă crescută [3].35. 2. 4. Caractere biochimice

Pe mediile multitest germenii au următorul comportament enzimatic: pe mediul TSI

sunt glucoză-pozitivi şi uneori fermentează glucoza cu producere de gaz, sunt lactoză-

pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-negativi şi urează-

pozitivi; pot creşte pe medii având citratul drept unică sursă de carbon. Sunt germeni

catalază pozitivi, oxidază negativi.35. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Sunt puţin rezistenţi la căldură (distruşi în 5-7 minute la 100°C); pe sol, în alimente

rezistă un mare număr de zile. Dezinfectantele obişnuite îi distrug în intervale de timp

cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.35. 2. 6. Structură antigenică

Particularităţile morfologice ale klebsiellelor se reflectă în structura antigenică. Au fost

descrise antigene somatice O (LPZ) specifice de grup şi antigene capsulare polizaharidice K,

specifice de tip. Există peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin reacţia de

umflare a capsulei şi (prin analize serologice sau de microbiologie moleculară).35. 2. 7. Caractere de patogenitate

Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiţionat patogen, care poate fi

implicat în patologia umană prin multiplicare şi invazivitate.

Factorii de patogenitate sunt reprezentaţi de capsula (antigenul K) care îi conferă

rezistenţă faţă de fagocitoză şi de endotoxina (antigenul O) eliberată după distrugerea

bacteriei.

Sideroforii membranari sechestrează Fe2+ în focarul infecţios, pentru a asigura un nivel

adecvat creşterii bacteriene. Deşi nu reprezintă un rol central în patogenitate, într-un model

murin de peritonită, s-a demonstrat creşterea virulenţei tulpinilor deKlebsiella prin

introducerea genei care codifică sideroforul aerobactin.

Biofilmul reprezintă o matrice extrem de bine organizata ce înconjoară bacteriile. Ele

favorizează aderarea bacteriană pe suprafaţa cateterelor.

380

Adezinele cele mai întâlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul

1 şi 3. Există o interrelaţie între adezinele exprimate şi cantitatea de biofilm produs [4].

35. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

Considerată iniţial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit că numai 1-3 %

din pneumonii sunt produse deKlebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem

de grave (pneumonii necrotice şi hemoragice), în special la pacienţi cu un sistem de

apărare deficitar.

Klebsiella pneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de boli precum

toxiinfecţii alimentare de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii

urinare etc. Din ce în ce mai frecvent acest microorganism apare în infecţii nosocomiale (de

spital), la fel ca şi Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a fost izolată din mucoasa nazală a

pacienţilor cu ozenă (atrofie progresivă a mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella

rhinoscleromatis s-a izolat de la pacienţi cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului şi

faringelui).

Tulpini aparţinând serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic,

cerebral. Dintre acestea o tulpină de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulentă a fost

izolată în special în ţările asiatice, această tulpină produce majoritatea abceselor hepatice

primare bacteriene [5-7]. Într-un model murin, secvenţa de evenimente ce a condus la

constituirea unui abces bacterian primar după inoculare orală a fost:

·         colonizare intestinală (la 12 ore),

·         diseminare extraintestinală (între 12 şi 24 ore),

·         replicare hepatică (la 36 ore),

·         metastazare septică (după 48 ore).

S-a tentat identificarea unor gene care favorizează producerea abcesului hepatic [8-10].

În ultima vreme tulpini de Klebsiella producătoare de β-lactamaze sunt tot mai des

responsabile de infecţii nosocomiale mai ales la pacienţi iimunocompromişi. De o

importanţă particulară sunt enzimele cu activitate β-lactamazică cu spectru extins

(Extended Spectrum Beta Lactamaze, ESBL); tulpinile de Klebsiella producătoare de ESBL

sunt recunoscute în patologia umană datorită dificultăţii tratamentului curativ.

Tratamentul de primă linie pentru tulpinile de K. pneumoniae producătoare de ESBL a

fost reprezentat de carbapeneme. În 1996 s-a identificat pentru prima oară în SUA o tulpină

producătoare de carbapenemaze (Klebsiella pneumoniaeCarbapenemase - KPC).

35. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Klebsiella

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).

381

Cu toate că nu este cea mai reprezentativă entitate clinică pentru acest gen, vom

discuta în continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae.

Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice (ex. examenul radiologic) şi de

laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util în stabilirea etiologiei şi tratamentului

antibiotic corespunzător.

Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o

serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientul să fi primit antibiotice,

cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele

de asepsie şi antisepsie, etc.). În infecţiile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta

materii fecale, urină, sânge, puroi, etc. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este

reprezentat de spută (vezi şi anexa nr. 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate

avea un aspect mucoid, de culoare roşu închis, „în jeleu de coacăze”.

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două

frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu

albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic

cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare),

prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa bacililor Gram-negativi, de

dimensiuni relativ mari, încapsulaţi (înconjuraţi de o capsulă voluminoasă). Examinarea

microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o

identificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi anexa nr. 6). În coloraţia cu

albastru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. Utilizând anticorpi anti-

capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic,

prin reacţia de umflare a capsulei (vezi şi anexa nr. 2).

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să

se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi

anexa nr. 2). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-

24 ore, la 35-37°C. Se preferă utilizarea unor medii de cultură slab selective (ex.

MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial

inhibată pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formează

colonii lactoză-pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, în „picătură de miere”, care

dau aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă de confluare. Se

poate realiza şi inocularea la animale de laborator sensibile, şoarecele alb (vezi şi anexa nr.

2).

Există medii de cultură selective/diferenţiale care pot ajuta în diagnosticul rapid al

infecţiilor cu Klebsiella sau aducând informaţii epidemiologice de valoare (izolarea de tulpini

producătoare de ESBL, datorită rezistenţei la o doză de antibiotic inclusă în mediu). Valorile

de sensibitilitate şi specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie să fie

folosite cu prudenţă, pentru a nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni

posibili implicaţi în procesul patogenic. [11]

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:

382

·         Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari,

capsulaţi, capsula fiind voluminoasă, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi. În mediul

de cultură pot pierde capsula.

·         Caractere de cultură: produc colonii lactoză-pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la

24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în „picătură de miere”,

care dau aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare.

Pe mediul MacConkey coloniile apar roşii (fermentează lactoza, cu producerea de gaz).

·         Caractere biochimice:

·         Klebsiella este un microorganism lactoză-pozitiv, ceea ce se poate evidenţia încă

din etapa de izolare pe mediul MacConkey (virează culoarea mediului în roşu);

·         alte caractere biochimice se studiază după repicarea unor colonii pe medii multi-

test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau în sisteme multi-test comerciale de tip API;

·         Klebsiella pneumoniae este glucoză-pozitivă (cu producere de gaz), lactoză-

pozitivă, nu produce H2S, imobilă, urează-pozitivă, indol-negativă, care se dezvoltă folosind

citratul ca unică sursă de carbon; K. oxytoca e indol-pozitivă acesta fiind un caracter ce

poate fi folosit în schema de diagnostic de laborator diferenţial.

·         produce acetoină din glucoză, caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proskauer

(adăugarea de hidroxid de potasiu duce la virarea în roşu a unei  culturi bacteriene în care

se află acetoină, în prezenţa unui indicator de pH precum alfa-naftol).

·         Caractere antigenice: se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru

identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA [12],

Western Blot sau latex aglutinare. Există peste 80 de tipuri de antigen K laKlebsiella

pneumoniae. Aceste reacţii se practică în laboratoare de referinţă.

·         Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la şoarecele alb (vezi şi

anexa nr. 2).

·         Alte caractere / teste utilizate în identificare care se pot utiliza (în centre de

referinţă):

·         testarea sensibilităţii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite în

Institutul Cantacuzino);

·         gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice;

·         bacteriocinotipie;

·         caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului

plasmidic, cu identificarea plasmidelor implicate în virulenţă etc.).

5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea

stabilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 7). Klebsiella

pneumoniae reprezintă unul dintre microorganismele cu o rezistenţă remarcabilă faţă de

antibiotice şi chimioterapice. Când sunt detectate, tulpinile producătoare de β-lactamaze şi

carbapenemaze necesită teste moleculare pentru a determina cu exactitate substratul

rezistenţei.

383

36. Genul Proteus36. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi, care nu

fermentează lactoza, produc urează, sunt nesporulaţi, necapsulaţi. Există 2 specii

principale, Proteus mirabilis şi Proteus vulgaris (P. morganii a devenitMorganella morganii,

iar P. rettgeri a devenit Providencia rettgeri); celelalte 3 specii sunt P. myxofaciens, P.

penneri şi P. hauseri.

Majoritatea tulpinilor din genurile înrudite (Proteus, Morganella, Providencia) au anumite

caractere comune (ex. mobilitatea, rezistenţa la KCN, producerea de indol).

36. 2. Caractere generale36. 2. 1. Habitat

Germenii din genul Proteus sunt răspândiţi în natură ubicvitar, se pot identifica în

materiile organice în putrefacţie, în alimente. Fac parte din flora intestinală umană.36. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde şi numele, derivat din

mitologia antică), pe frotiu putându-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de

până la 50-80 µm. Prezintă un mare număr de cili peritrichi care le conferă mobilitatea

caracteristică (dar există şi tulpini aciliate). Sunt necapsulaţi şi nesporulaţi.36. 2. 3. Caractere de cultură

Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui miros

caracteristic de putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Pe mediile

diferenţiale (cu lactoză) nu se pot obţine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie

(migrare). Cultura se întinde pe toată suprafaţa plăcii (sau tubului) în strat continuu sub

forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea în

mediu de săruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicină, cărbune

activat etc.

Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, acestea

se vor dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea

o linie de demarcaţie între cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaţie).

Cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată

incubat în poziţie verticală, va conduce (în cazul în care în produsul patologic există o

tulpină de Proteus spp.) la obţinerea în 24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorită

mobilităţii acestor microorganisme (fenomenul de „căţărare”).36. 2. 4. Caractere biochimice

Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab şi moderat selective pe care fenomenul de

migrare a fost inhibat, speciile deProteus dezvoltă colonii de tip S, lactoză-negative (vezi

36. 4.). Microorganismele din genul Proteus sunt glucoză-pozitive, lactoză-negative, produc

384

H2S, sunt urează-pozitive, indol-pozitive (exceptând P. mirabilis şi P. myxofaciens) iar pe

mediul MIU se poate constata mobilitatea.36. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Are o rezistenţă relativ crescută în mediu, în alimente etc şi poate rezista în soluţii

antiseptice sau în detergenţi, ceea ce poate crea probleme deosebite în mediul de spital.

Rezistă mai multe luni la temperaturi joase, inclusiv în alimentele congelate. Rezistenţa la

antibiotice şi chimioterapice este considerabilă.36. 2. 6. Structură antigenică

Prezintă antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. După constatarea că serul

bolnavilor de tifos exantematic aglutinează cu o tulpină de proteus s-a demonstrat că genul

include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au înrudiri antigenice cu microorganisme

aparţinând genului Rickettsia.

Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.36. 2. 7. Răspuns imun

Postinfecţios apare un răspuns imun umoral care însă nu are utilitate practică.36. 2. 8. Caractere de patogenitate

Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate, în condiţii speciale

(părăsirea habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficienţe ale sistemului imunitar).

La fel ca şi ceilalţi germeni Gram-negativi, eliberează de la nivel parietal, după

distrugere, endotoxina (antigenul O, LPZ).

Mobilitatea deosebită îi permite invadarea tractului urinar.

Producerea de urează alcalinizează urina şi favorizează formarea de calculi (de ex. de

struvită). Existenţa calculilor favorizează apariţia altor infecţii urinare sau cronicizarea

acestora.

Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este remarcabilă.

36. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce

apar în afara tractului digestiv. Există totuşi şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care

aceşti germeni au reprezentat agenţii cauzali.

În mod frecvent se discută despre infecţiile cu proteus la nivelul tractului urinar, dar

sunt posibile mai rar şi alte infecţii (genitale, pleurezii, alte localizări în cursul unei

bacteriemii) de regulă la pacienţi cu status imun deficitar sau în spital (infecţii

nosocomiale).

39. Genul Salmonella385

39. 1. Definiţie. ÎncadrareImportanţa clinică a microorganismelor din genul Salmonella a fost cunoscută cu mult

înainte de studiile omologiei ADN sau de realizarea secvenţelor ARNr 16S. Pe baza unei

omologii ADN-ADN de aproximativ 90%, Salmonella şi E. coli ar fi să facă parte din acelaşi

gen, dar protestul microbiologilor şi clinicienilor obişnuiţi cu vechile denumiri a împiedicat

acest lucru.

Una dintre clasificările acceptate la ora actuală grupează genul în 3 specii (Ewing):

- S. typhi patogenă numai pentru om;

- S. choleraesuis, patogenă la porc şi ocazional la om (numită ulterior S. enterica), cu

1.416 serotipuri;

- S. enteritidis, cauză de diaree la om şi la animal.

Serotipurile nu se scriu cu litere italice. De ex. S. typhimurium ar putea fi scrisă

actual Salmonella ser. Typhimurium, sauSalmonella Typhimurium sau pe scurt

Typhimurium.

Sunt autori care consideră că serotipul corespunde speciei şi în acest caz, în

genul Salmonella ar putea fi luate în considerare peste 2.390 specii.

Salmonella, ca şi E. coli, a reprezentat un subiect de studiu, servind ca model pentru

metabolismul bacterian, genetica bacteriană sau studii de virulenţă. Este de asemenea un

indicator al gradului de siguranţă al conductelor de apă, dar relativ de curând a apărut

„rolul” ei în a onora o persoană publică cum ar fi S. mjordan (cu referire la baschetbalistul

american).

39. 2. Caractere generale39. 2. 1. Habitat

Salmonelele sunt foarte larg răspândite în natură şi prezente la toate speciile de

animale, păsări, peşti, şerpi, insecte. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor. Veriga

alimentară este esenţială în infectarea umană.39. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili

peritrichi (cu excepţia S. galinarum pullorum), necapsulaţi, nesporulaţi.39. 2. 3. Caractere de cultură

Se multiplică pe medii de cultură simple şi formează colonii de tip S sau R (prin

„îmbătrânire”). Salmonella ser. Paratyphi B poate produce colonii de tip M.

Pe mediile selective cu lactoză dau naştere unor colonii lactoză-negative. Pe geloza

Wilson-Blair formează colonii caracteristice, opace, cu suprafaţa rugoasă şi margini

neregulate, prezentând un halou negru şi luciu metalic.39. 2. 4. Caractere biochimice

Fermentează glucoza cu formare de gaz (nu şi S. typhi), nu fermentează lactoza,

formează hidrogen sulfurat (există şi excepţii), nu formează indol, nu produc urează, cresc

386

pe mediul cu citrat ca unică sursă de carbon (Simmons pozitiv), sunt aerobi, facultativ

anaerobi.39. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Se pot multiplica într-un interval larg de temperatură (7-48ºC) şi la un pH între 4 şi 8.

Sunt puţin rezistente la căldură (spre exemplu sunt distruse în 5-7 minute la 100°); pe sol

(păşuni) rezistă circa 200 de zile, în alimente rezistă 10-180 de zile (rezistă 4 ani în

pulberea de ouă, a cărei utilizare în alimentaţie este contraindicată). Dezinfectantele

obişnuite le distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.39. 2. 6. Structură antigenică

Modul în care o tulpină este definită din punct de vedere antigenic cuprinde 3 părţi

(antigenul O, faza 1 de la antigenul H şi faza 2 de la antigenul H).

Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Există peste 60 de

structuri antigenice O diferite care definesc 46 de serogrupuri O; unul sau mai mulţi factori

asociaţi determină formula antigenică a unei anumite grupe serologice care este notată cu

literele mari ale alfabetului sau doar cu cifrele respective (A…Z, O51…O67) (1 ... 51 ... 67). A

fost descris fenomenul de variaţie genetică în legătură cu antigenul O.

Antigenele de înveliş includ de exemplu antigenul Vi la S. typhi şi Salmonella ser.

Paratyphi C; structurile antigenice Vi reprezintă substratul de fixare a bacteriofagilor,

acoperă antigenul O şi nu permit reacţia de aglutinare; se asociază virulenţei şi invazivităţii

(determină leucopenie, nu permit legarea componentei C3b şi în acest mod inhibă

fagocitoza şi determină capacitatea de multiplicare intrafagocitară).

Antigenul H este de natură proteică, se găseşte la nivelul cililor peritrichi, este

determinant de tip, cu posibilitatea unei variaţii de fază. Majoritatea serotipurilor

de Salmonella pot exprima alternativ două tipuri de flageli cu specificităţi antigenice

diferite. Din 1986 s-a văzut că unele tulpini de Salmonella pot exprima trei sau mai multe

tipuri de flageli cu antigenicitate distinctă.

Variaţia antigenică se poate realiza de ex. prin transducţie existând mai multe

posibilităţi: pot pierde antigenul H şi devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se

„transformă” în colonii R; pot pierde parţial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N

acetil-galactosaminuronic).

Există antigene şi la nivelul fimbriilor. Apariţia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la

pacienţi cu febră tifoidă sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariţia unor

reacţii fals-pozitive în cadrul analizei serice cantitative (reacţia de aglutinare în tuburi).

Schema de clasificare Ewing a fost prezentată anterior. Schema de identificare

serologică Kaufmann-White subîmparte genul Salmonella în foarte multe grupe şi „specii”,

spre ex. în grupul A, S. paratyphi A; în grupul B, S. paratyphi B, S. typhimurium; în grupul

C, S. paratyphi C; în grupul D, S. typhi, S. enteritidis etc. Conform schemei Kaufman-White

există S. dublin, care în schema Ewing poartă numele de S. enteritidis serotipul dublin.

Există şi alte scheme de clasificare.39. 2. 7. Răspuns imun

387

Apare răspuns imun umoral detectabil în special după infecţiile extraintestinale. Este

certă apariţia răspunsului imun după infecţii produse de S. typhi şi paratyphi (Paratyphi), cu

punerea în evidenţă a anticorpilor circulanţi anti O, anti H şi anti Vi. Anticorpii anti O şi anti

Vi au rol protector. Apariţia anticorpilor din clasa IgA secretorii pot împiedica ataşarea la

nivelul epiteliului intestinal.39. 2. 8. Caractere de patogenitate

Salmonella spp., devine patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Primul pas,

obligatoriu, este reprezentat de colonizare, realizată cu ajutorul unor structuri de aderare,

adezinele şi fimbriile, care induc modificări la nivelul membranei celulare. Studii de

fiziopatologie fundamentală au reprezentat prima dovadă a existenţei unui receptor

hormonal afectat prin ataşare şi invazie bacteriană.

De menţionat faptul că la genul Salmonella a fost pus în evidenţă un grup de gene

(genele de invazivitate), unele din ele fiind asemănătoare cu gene identificate la

genul Yersinia.

Salmonella spp., supravieţuieşte intrafagocitar datorită prezenţei unor structuri de

suprafaţă precum şi prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca

răspuns la fagocitare. Antigenul Vi contribuie (pentru S. typhi şi SalmonellaParatyphi C la

rezistenţa la fagocitoză şi rezistenţa după fagocitoză).

Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat după distrugerea germenilor, are un rol

important în patogenitate.

Tulpinile care produc toxiinfecţii alimentare secretă „enterotoxine” cu proprietăţi

antigenice şi biologice asemănătoare toxinei holerice.

39. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

Principial infecţiile produse de salmonele se pot împărţi în salmoneloze minore

(enterocolite) şi salmoneloze majore (febra tifoidă).

Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios, salmoneloza) apare

după ingestia a 105-108 salmonele. După ingestie are loc ataşarea şi adsorbţia la nivelul

celulelor epiteliale în porţiunea terminală a intestinului subţire, apoi penetrarea prin celule

şi migrarea în lamina propria, în regiunea ileocecală. La acest nivel are loc multiplicarea în

foliculii limfoizi determinând hipertrofia şi hiperplazia SRE (sistemului reticulo-endotelial).

Acumularea de PMN determină o reacţie inflamatorie cu eliberare de prostaglandine care

duc la stimularea secreţiei intestinale, urmată de diaree (nesanguinolentă), greaţă,

vărsături; mai pot apărea febră, dureri abdominale, mialgii, dureri de cap (cefalee).

Persoana infectată poate fi contagioasă timp de circa 3 luni. Simptomele sunt mai severe la

copiii mai mici de 10 ani şi la bolnavii imunocompromişi (ex. infectaţi cu HIV / SIDA).

Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 103 salmonele. După

ingestie are loc ataşarea şi trecerea S. typhi prin şi printre celulele epiteliale de la nivelul

ansei ileocecale, urmată de multiplicarea activă în submucoasă şi de fagocitarea de către

388

macrofage. Aici bacilii rămân vii şi se multiplică (în macrofagele din formaţiunile limfoide

intestinale), apoi trec în ganglionii mezenterici, apoi în canalul toracic, producând

bacteriemia iniţială (care reprezintă debutul clinic al bolii), urmată de invadarea altor

organe şi formaţiuni limfatice.

Multiplicarea crescută mai ales în organele SRE (ficat, splină) este urmată de o a doua

bacteriemie masivă şi de eliminarea prin bilă şi / sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de

boală, salmonella se elimină din foliculii intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia

prelungindu-se mult timp în convalescenţă. Pot apărea angiocolită, colecistită; bolnavul

poate deveni purtător (portaj de Salmonella) după vindecare.

Simptomatologia generală (afectarea stării generale, febră, stare de şoc) este

determinată în special de endotoxină care activează diferite cascade inflamatorii şi

producerea de citokine, iar simptomatologia digestivă (anorexie, dureri, constipaţie sau

diaree) este consecinţa agresiunii intestinale, hepatice şi asupra vezicii biliare.

40. Genul Shigella40. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Shigella include bacili Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, oxidază-

negativi, lactoză negativi. Shigella spp.nu aparţine florei normale intestinale.

Genul Shigella ar trebui să facă parte, conform studiilor de biologie moleculară, dintr-un

gen care să includă şi Escherichia spp., genul Escherichia-Shigella. Cu toate acestea, este în

continuare acceptată tratarea separată a celor două genuri înrudite. Există mai multe

specii. Pe baza structurii antigenice au fost diferenţiate patru subgrupe (A-D)

respectiv Shigella dysenteriae (serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza în

sub-serotipuri), S. boydii (18 serotipuri) şi S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante,

respectiv R şi S).

40. 2. Caractere generale40. 2. 1. Habitat

Germenii se pot găsi în intestinul şi scaunul omului bolnav. În funcţie de anumite

condiţii, shigellele se pot izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin

intermediul muştelor.40. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 µm / 0,5-0,8 µm, necapsulaţi,

nesporulaţi.40. 2. 3. Caractere de cultură

Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoză (ex. ADCL, AABTL)

formează colonii de tip S, lactoză-negative. Pentru izolare din materiile fecale sunt utilizate

389

medii diferenţiale (cu lactoză şi indicator de pH) şi / sau medii selective (mediul Shigella-

Salmonella cu săruri biliare etc).40. 2. 4. Caractere biochimice

Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoză-pozitivi fără producere de gaz, lactoză-

negativi, nu produc H2S, urează-negativi, indol-negativi, imobili. Subgrupele A-D se pot

diferenţia pe baza fermentării manitei (subgrupul A este manită-negativ).40. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Shigellele sunt inactivate în 10 minute la 50-60ºC. ÎN PRAF USCAT REZISTĂ CIRCA 10

ZILE, PE LENJERIE POT SUPRAVIEŢUI PESTE 2 SĂPTĂMÂNI. ÎN APE, LA O TEMPERATURĂ DE 7-

10ºC POT SUPRAVIEŢUI CIRCA 9 ZILE, ÎN ALIMENTE CIRCA 1-2 SĂPTĂMÂNI, IAR ÎN GHEAŢĂ

PÂNĂ LA 2 LUNI.40. 2. 6. Structură antigenică

Subgrupele sunt divizate pe baza structurii antigenului O (LPZ). Subgrupul A (Sh.

dysenteriae) include 10 serotipuri dintre care cel mai patogen este tipul 1, Shigella shiga.

Subgrupul B (Sh. flexneri) include mai multe tipuri şi subtipuri serologice. Subgrupul C (Sh.

boydii) cuprinde 15 serotipuri iar subgrupul D (Sh. sonnei) cuprinde o singură specie în 2

faze distincte antigenic (S şi R).

Există tulpini care prezintă la suprafaţă structuri antigenice de tip K.

Sh. shiga elaborează şi o exotoxină termolabilă, cu structură proteică.40. 2. 7. Răspuns imun

Infecţia cu Shigella spp. duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu apariţia de

anticorpi care însă nu conferă protecţie. Apariţia de anticorpi locali de tip IgA (eventual

după administrarea de vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate în prevenirea

infecţiei.40. 2. 8. Caractere de patogenitate

Shigella este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. În cazul serotipului 1 din

subgrupul A (Sh. shiga) este implicată şi toxigeneza.

La fel ca toate microorganismele Gram-negative, shigellele elaborează lipopolizaharidul

parietal, care se eliberează ca endotoxină, după distrugerea bacteriei. Endotoxina

(antigenul O) este implicată în patogenia dizenteriei, având o acţiune iritativă la nivel

intestinal.

Exotoxina shiga afectează atât intestinul (fiind implicată în mecanismul de producere al

diareei), cât şi sistemul nervos central (putând conduce la apariţia unor fenomene de

meningism sau chiar pierderea stării de conştienţă, comă). Faţă de animalele de experienţă

are efect letal.

40. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

Infecţiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria

poate apărea după ingestia a numai 100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi 390

invadează epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la

nivelul ileonului terminal, abcese care evoluează spre ulceraţie, necroză, hemoragie).

După o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc

febră, diaree apoasă, dureri abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte

numeroase (20-40 / zi), nefecaloide, cu mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale

şi tenesme rectale. Starea generală se înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse

de Sh. shiga) şi problema principală este reprezentată la fel ca şi în cazul altor diarei, de

pierderile hidro-electrolitice şi instalarea unui sindrom de deshidratare acută. În lipsa

tratamentului corespunzător (în special în lipsa reechilibrării hidro-electrolitice) evoluţia

poate fi fatală.

În afară de dizenterie, shigelele pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.

41. Genul Yersinia41. 1. Definiţie. Încadrare

Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili Gram-

negativi, care prezintă coloraţie bipolară. Nu formează spori, pot prezenta structuri de tip

capsular. Sunt aerobi facultativ anaerobi, catalază-pozitivi, oxidază-negativi. Majoritatea au

drept gazdă naturală animalele şi pot produce boli (uneori foarte grave) umane.

Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Yersinia

pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica. Numele Yersinia a fost dat

în onoarea lui Alexander Yersin, care a izolat bacilul pestei, în Hong-Kong, în anul 1894.

41. 2. Caractere generale41. 2. 1. Habitat

Microorganismul poate fi identificat numai la animale (ex. rozătoare - şobolani) sau la

omul bolnav. Se poate transmite prin plăgi muşcate, de la o rozătoare la alta sau ocazional

la om prin intermediul purecilor. Rezultă infecţii grave, posibil mortale. În USA, ultimul caz

de transmitere interumană a fost raportat în 1924.41. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Y. pestis este un bacil Gram-negativ, imobil, care prezintă o coloraţie bipolară. Pe

frotiuri bacilii pot apare atât izolaţi cât şi dispuşi în lanţuri scurte şi sunt nesporulaţi. Există

şi forme cocobacilare. În organismele vii şi în culturile tinere, prezintă un înveliş

pseudocapsular.41. 2. 3. Caractere de cultură

391

Aerob facultativ anaerob, se dezvoltă mai rapid pe medii ce conţin sânge sau fluide

organice şi la 30°C dar se poate multiplica şi pe medii simple. În culturi pe geloză-sânge la

37°C coloniile pot fi foarte mici şi apar după circa 24 ore. O inoculare a unor

microorganisme virulente recoltate direct din ţesutul infectat conduce la apariţia unor

colonii de tip S, sau cu aspect mucoid, vâscoase şi colorate alb-gri. După realizarea unor

pasaje în laborator, coloniile devin neregulate şi aspre (de tip R); capsula dispare.41. 2. 4. Caractere biochimice

Yersinia pestis are o activitate biochimică relativ scăzută şi cu un grad de variabilitate.

Este un germen aerob, facultativ anaerob, fermentează glucoza şi în mod variabil

fermentează lactoza. Y. pestis şi Y. pseudotuberculosis au caractere biochimice similare.41. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Sunt germeni puţin rezistenţi faţă de agenţii fizici şi chimici, dar în mediul extern pot

supravieţui până la circa 2 săptămâni în puroi sau în spută şi câteva luni în cadavre.41. 2. 6. Structură antigenică

Yersiniile, la fel ca toate microorganismele Gram-negative, prezintă la nivelul peretelui

antigenul O (LPZ, endotoxina).

Y. pestis produce mai multe antigene şi toxine care acţionează ca factori de virulenţă.

Anvelopa conţine o proteină (fracţiunea I, F-1) care este produsă în principal la 37°C,

conferă proprietăţi antifagocitare şi activează complementul. Tipul virulent sălbatic de Y.

pestis elaborează antigenele proteice V şi W care sunt codificate cromozomial sau

plasmidic. Dintre toxinele produse, una este letală pentru animalele de laborator. Toxina

(exotoxină) are structură proteică.

Y. pestis produce şi o bacteriocină (pesticină).

Câteva dintre antigenele Y. pestis reacţionează încrucişat cu antigene ale altor yersinii.41. 2. 7. Răspuns imun

Există imunitate postinfecţioasă. Se pot utiliza vaccinuri pentru prevenirea îmbolnăvirii

(protecţia nu este absolută).41. 2. 8. Caractere de patogenitate

Yersinia pestis este un microorganism patogen în special prin multiplicare şi prin

invazivitate, rolul patogenic al diferitelor structuri sintetizate în cursul metabolismului

nefiind complet elucidat. Doza infectantă este foarte redusă, 1-10 bacili sunt suficienţi

pentru producerea bolii.

Rolul esenţial pare a reveni structurilor care conferă proprietăţile de rezistenţă la

fagocitoză, spre ex. fracţiunea I, proteică, de la nivelul suprafeţei celulare, şi respectiv

structurii pseudocapsulare (virulenţa scade în lipsa pseudocapsulei).

Structurile cu rol în virulenţă (rol dovedit in vitro şi pe animalele de experienţă) sunt

codificate plasmidic sau cromozomial. S-a dovedit implicarea esenţială a unor astfel de

structuri genetice, care nu au fost identificate în cazul tulpinilor avirulente. Aceste tulpini

pot fi utile în producerea unor vaccinuri.

Dintre toxinele menţionate mai sus, una este letală pentru animalele de laborator (doză

de numai 1 mg în cazul şoarecelui). Această proteină cu GM de 74.000Da, produce

392

blocade β-adrenergice şi este cardiotoxică la animale. Rolul său în infecţiile umane nu a fost

elucidat.

41. 3. Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

În cursul „prânzului”, vectorul se hrăneşte dintr-o rozătoare infectată cu Y. pestis,

microorganismul ajunge în intestinul puricelui şi prin intermediul unei coagulaze blochează

peristaltismul la nivel gastric. Bacteriile se multiplică. Masa bacteriană şi structura

fibrinoasă blochează tranzitul intestinal, puricele înfometat muşcă din nou şi regurgitează

microorganismele în animalul muşcat. Datorită blocajului intestinal, cu toate că aspiră

sânge, puricele nu se poate hrăni, devine şi mai înfometat şi pierde selectivitatea naturală

pentru rozătoarele respective; astfel ajunge să muşte gazda umană. Microorganismul

inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica atât intra cât şi extracelular. În scurt

timp ajunge la nivel limfatic şi apare o inflamaţie hemoragică la nivelul ganglionilor care se

hipertrofiază, suferi o necroză şi devin fluctuenţi. În cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge în

torentul sanguin şi infecţia se poate generaliza. Se dezvoltă leziuni hemoragice şi necrotice

în toate organele (ex. meningite, pneumonii şi pleuropericardite serosangvinolente).

Aceasta este forma de pestă bubonică, în care letalitatea în lipsa tratamentului este de

peste 50%.

Pesta pneumonică primară (forma pulmonară) poate apare prin inhalarea de nuclei de

picătură (de obicei de la un pacient care tuşeşte) sau prin embolizări septice la nivel

pulmonar; se manifestă prin pneumonie hemoragică, septicemie şi deces în peste 90% din

cazuri.

42. Genul Acinetobacter42. 1. Definiţie. Încadrare

Genul Acinetobacter a fost descris pentru prima dată la începutul secolului XX.

În 1911, Martinus Willem Beigerinck, microbiolog olandez, descoperă o bacterie aerobă,

gram negativă, nonfermentativă, care face parte astăzi din genul Acinetobacter. În anii ’70,

Acinetobacter începe să fie recunoscut ca un microorganism implicat în infecţii „de spital”;

totuşi în acea perioadă, putea fi distrusă de către medicamentele antimicrobiene uzuale.

În 1986, Bouvet și Grimont au definit (folosind tehnicile de hibridizare moleculară) 12

grupuri în cadrul genuluiAcinetobacter. Ei au propus includerea a 4 specii noi, printre care

și A. baumannii, (recunoscut astăzi şi datorită dezvoltării rezistenței la antibiotice şi

chimioterapice). Acinetobacter baumannii și speciile numerotate 3 și 13TU formează

“Complexul A. baumannii”. Cele 3 specii au cea mai mare importanță clinică, fiind

responsabile de majoritatea infecțiilor; nu pot fi diferențiate prin teste de rutină (ale

393

microbiologiei clasice). În anul 2004, CDC a raportat că 80% din infecțiile

cu Acinetobacter sunt produse de A. baumannii.

Alte genomospecii implicate în patologia umană sunt: A. lwoffii, A. haemolyticus  și A.

johnsonii. Diferențierea speciilor se realizează prin biotipare, serotipare, bacteriocino-tipare.

43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa 43. 1. Definiţie. Încadrare

Familia Pseudomonodaceae are patru genuri, dintre care numai

genul Pseudomonas include specii importante din punct de vedere medical.

Genul Pseudomonas cuprinde pe baza omologiei ARNr cinci grupuri, o parte din speciile

incluse anterior în acest gen aparţinând actualmente genului Burkholderia (B. mallei, B.

pseudomallei etc). Pseudomonas maltophilia a fost redenumităXanthomonas maltophilia şi

a devenit actualmente Stenotrophomonas maltophilia. Cea mai importantă specie a genului

estePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, „bacilul puroiului albastru”), specie

implicată relativ frecvent în infecţii la persoane cu reactivitate scăzută, precum şi în infecţii

nosocomiale (infecţii „de spital”). Pseudomonas aeruginosa reprezintă una din principalele

bacterii oportuniste.

În anul 1981 se considera că există circa 800 de specii de Pseudomonas, contaminând

în special plantele.

Genul cuprinde bacili aerobi, facultativ anaerobi, nesporulaţi, Gram-negativi, cu

dimensiuni de 1-5 / 0,5-1mm, mobili datorită prezenţei unuia sau mai multor flageli (polari).

43. 2. Caractere generale43. 2. 1. Habitat

Microorganism foarte răspândit în natură (agent de putrefacţie a materiei organice

animale şi vegetale), poate fi pus în evidenţă la circa 15% dintre persoanele sănătoase, la

nivel intestinal, axilar, perineal etc, preferând zonele cu un grad de umiditate. Poate

contamina obiectele din grupurile sanitare, camera de baie, chiuvetele (în special sifonul de

scurgere) etc. Elaborează o piocină (bacteriocină), cu efect inhibitor asupra unor tulpini din

aceeaşi specie.43. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

Este un bacil Gram-negativ subţire, cu dimensiuni între 1-5mm / 0,5-1mm, mobil, cu 1-3

cili polari (există şi tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezintă capsulă.43. 2. 3. Caractere de cultură

Din punct de vedere nutriţional sunt germeni puţin pretenţioşi. Se pot cultiva uşor pe

medii simple în condiţii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot multiplica la

394

4°C, dar cele mai multe au temperatura optimă de multiplicare cuprinsă între 30 şi 37°C

(Pseudomonas aeruginosa se poate multiplica şi la 42°C). Posibilitatea cultivării la 42°C

permite diferenţierea de celelalte specii.

Pe medii solide formează colonii care se pigmentează în mod specific, însoţindu-se de

pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde). De menţionat că pot apărea colonii (de

tip S) cu aspecte diferite, dând impresia prezenţei concomitente de bacterii diferite. Cultura

poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Tulpinile

de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la pacienţi cu fibroză chistică formează colonii

mucoide.

În bulion tulbură mediul, formând şi o peliculă la suprafaţă, sub care se evidenţiază

pigmentul.43. 2. 4. Caractere biochimice

Produce diferiţi pigmenţi, dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi

pioverdina (galben-verzui fluorescent). Este un germen catalază-pozitiv, degradează

oxidativ glucoza, nu fermentează lactoza şi este oxidază-pozitiv.43. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori chimici şi fizici

Este sensibil la căldură, fenol, alcool de 80°, dar rezistent la acţiunea compuşilor

cuaternari de amoniu.

În spital se selectează tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini

care pot fi implicate în infecţii de spital.43. 2. 6. Structură antigenică

Pseudomonas aeruginosa posedă antigenul flagelar H (proteic) şi antigenul somatic O

(lipopolizaharidic). Pe baza existenţei mai multor factori antigenici O şi H, s-au descris mai

multe serotipuri în cadrul speciei, utile în special în investigaţii epidemiologice.43. 2. 7. Răspuns imun

Există un răspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi (opsonine,

aglutinine), însă cu titruri nesemnificative şi fără eficacitate protectivă.43. 2. 8. Caractere de patogenitate

Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (întâlnite în apă, pe sol, pe plante etc,

sau fac parte din flora microbiană umană). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat în

diferite soluţii apoase, inclusiv soluţii dezinfectante sau chiar soluţii de antibiotice, având o

deosebită capacitate de a supravieţui în medii umede. Pseudomonas aeruginosa este un

microorganism oportunist, condiţionat patogen.

Dintre factorii de virulenţă ai bacilului piocianic am putea aminti prezenţa pililor (care

mediază ataşarea bacteriană la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte

histotoxice), a unei lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa

20.000 de ori mai toxică decât endotoxina), precum şi existenţa endotoxinei

(lipopolizaharidul din structura peretelui).

Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacienţi cu fibroză chistică deţin un

glicocalix foarte dezvoltat care mediază aderenţa la nivelul mucoaselor respiratorii şi

împiedică opsonizarea. În infecţiile cronice, la aceşti pacienţi, a fost demonstrată trecerea

395

tulpinilor din forme S în forme de tip M, datorită unor mutaţii care au fost identificate recent

(2008).

43. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

Datorită capacităţii de adaptare şi supravieţuire în diferite medii, precum şi datorită

factorilor de virulenţă enumeraţi,Pseudomonas aeruginosa poate produce infecţii foarte

variate, de la infecţii tegumentare superficiale până la septicemii fulminante. La persoanele

cu reactivitate normală, infecţiile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecţii oculare

etc), urmând contaminării cu diferite soluţii apoase sau după înot în piscină. Prezenţa

piocianicului ar putea fi semnalată de culoarea albastră verzuie a pansamentelor. La nivel

dermic, procesul infecţios poate avea şi o evoluţie gravă, cu apariţia de vezicule care se

sparg şi se refac pe o bază necrotică. Procesul poate progresa în profunzime (ecthyma

gangrenosum), asemănător cu patologia întâlnită la pacienţii neutropenici la care infecţia

poate fi produsă şi de alte microorganisme.

La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuată şi supuse unor manevre medico-

chirurgicale invazive (intubaţii, cateterizări etc), precum şi la persoanele cu arsuri, P.

aeruginosa poate produce infecţii localizate, dar potenţialul diseminării şi apariţiei unor

complicaţii grave (bacteriemie, osteomielită, meningită, endocardită, septicemie) este

foarte important. În lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită rezistenţei la antibiotice),

evoluţia procesului infecţios poate fi gravă sau deosebit de gravă (80% din septicemiile cu

piocianic au evoluţie letală). Infecţia pulmonară cronică la pacienţii cu fibroză chistică

(mucoviscidoză) este produsă de un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.

44. Genul Vibrio44. 1. Definiţie. Încadrare

Speciile din genurile Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Campylobacter, Helicobacter sunt

larg răspândite în natură şi făceau iniţial parte din aceeaşi familie. Vibrionii se găsesc în

apele marine şi de suprafaţă. Aeromonas se găseşte predominant în apa proaspătă şi

ocazional contaminează animalele cu sânge rece. Plesiomonas se găseşte la animalele cu

sânge cald, dar şi la cele cu sânge rece. Aeromonas şi Plesiomonas au fost asociate cu boli

diareice la om. Helicobacter pylori se asociază cu gastrită şi ulcer gastroduodenal.

Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (1965), alături

de Aeromonas, Photobacterium şi Plesiomonas. Genul Vibrioinclude mai mult de 48 de

specii (12 dintre acestea fiind potenţial patogene pentru om). Vibrionul holerei produce o

396

enterotoxină care determină holera. Vibrionii sunt bacili Gram-negativi, drepţi sau uşor

încurbaţi, foarte mobili, necapsulaţi, nesporulaţi.

44. 2. Caractere generale44. 2. 1. Habitat

Habitatul natural al vibrionilor include sursele de apă dulce şi sărată, unde există liberi

sau în asociaţie cu diferite vietăţi acvatice. Vibrio cholerae se găseşte în intestinul şi în

materiile fecale ale omului bolnav de holeră. Prezenţa vibrionului holeric în mediul extern

este explicată prin contaminarea fecală şi supravieţuirea vibrionilor, existând şi

posibilitatea unui ciclu de viaţă extraintestinal.44. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

La izolarea primară, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de virgulă a

devenit mai mult o „reprezentare istorică”), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui flagel

polar.44. 2. 3. Caractere de cultură

Sunt germeni puţin pretenţioşi şi se pot dezvolta pe medii de cultură simple, inclusiv în

apa peptonată, ceea ce este util în izolarea primară (formează un văl la suprafaţa

mediului). V. cholerae se dezvoltă bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de pH

având rolul de medii de îmbogăţire.

V. cholerae produce pe mediile de cultură solide colonii convexe, rotunde, de tip S cu

un aspect opac. Se dezvoltă foarte bine la 37°C pe multe tipuri de medii, inclusiv pe medii

ce conţin săruri minerale şi asparagină ca surse de carbon şi azot. Creşte bine pe TCBS

(tiosulfat-citrat-bilă-sucroză-agar), pe care produce colonii galbene.44. 2. 4. Caractere biochimice

V. cholerae fermentează de obicei sucroza şi manoza. Fermentează glucoza. În funcţie

de fermentarea zaharurilor vibrionii se pot subîmpărţi în grupe. Au metabolism respirator şi

fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi.

Testul oxidazei (pozitiv în cazul vibrionului holeric) este un test cheie în identificarea

preliminară. Majoritateavibrionilor sunt halotoleranţi şi adesea prezenţa NaCl le stimulează

creşterea prin alcalinizarea mediului.

 44. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Vibrionii holerici sunt foarte sensibili la lumina solară şi la acţiunea căldurii (la 100° sunt

distruşi aproape instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. ÎN ALIMENTE TRĂIESC (CU UNELE

EXCEPŢII) PÂNĂ LA 7 ZILE. ÎN APĂ SUPRAVIEŢUIESC UN NUMĂR DE ZILE, ÎN FUNCŢIE DE

EFICACITATEA TRATAMENTULUI APLICAT APELOR UZATE. ÎN INTESTINUL BOLNAVILOR

NETRATAŢI SE POT MENŢINE CÂTEVA SĂPTĂMÂNI.44. 2. 6. Structură antigenică

Vibrionul holeric prezintă la nivel parietal antigenul O (lipopolizaharid). În funcţie de

structura antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au fost împărţiţi în 6 serogrupe;

397

vibrionul holeric clasic şi biotipul El Tor fac parte din grupul O:1, ceilalţi vibrioni fiind non-

O:1NAG (non-aglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste microorganisme nu pot fi distinse

biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordări taxonomice au demonstrat că Vibrio

cholerae O:1 şi non-O:1 reprezintă de fapt aceleaşi specii. Antigenul serogrupului O:1 are

determinanţi care fac posibilă diferenţierea serotipurilor. ÎMPĂRŢIREA VIBRIONULUI

HOLERIC ÎN SEROTIPURI ŞI BIOTIPURI ESTE UTILĂ ÎN STUDII EPIDEMIOLOGICE, DAR TESTELE

SE FAC NUMAI ÎN LABORATOARE SPECIALIZATE.

Există antigene la nivelul pililor.

Fiind mobil, vibrionul prezintă antigenul H la nivel ciliar.

Vibrionul holeric şi vibrionii înrudiţi produc o enterotoxină labilă faţă de căldură, cu

masa moleculară de 84.000 Da, alcătuită din două subunităţi A şi B (activă şi de legare).44. 2. 7. Răspuns imun

Aciditatea gastrică furnizează o oarecare protecţie în cazul ingerării unui număr mic de

vibrioni.

După holeră apare imunitate faţă de reinfecţie, dar durata şi gradul acesteia nu sunt

cunoscute. La animalele de experienţă apar anticorpi specifici de tip IgA în lumenul

intestinal. Anticorpii faţă de antigenul O protejează animalele de laborator faţă de infectare.

Anticorpi similari apar în serul uman după infecţie şi se consideră că sunt asociaţi (într-o

oarecare măsură) cu protecţia faţă de colonizarea cu vibrioni patogeni. Prezenţa

anticorpilor antitoxină nu se asociază cu protecţia.44. 2. 8. Caractere de patogenitate

Microbiologia medicală este interesată în cunoaşterea următorilor vibrioni patogeni sau

cu patogenitate condiţionată, potenţial periculoşi pentru sănătatea omului: Vibrio

cholerae O:1, cu biotipurile cholerae şi El Tor (fiecare din aceste biotipuri putând fi clasificat

în serotipurile Inaba, Ogawa, Hikojima); Vibrio cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio

parahemolyticus; V. damsela; V. furnissii; Vibrio vulnificus; V. fluvialis.

Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae constă în aderarea la

epiteliul celular (adezine/pili), urmează colonizarea şi apoi invadarea mucoasei, care permit

infiltrarea germenilor cu producerea unor variate substanţe biologic active, incluzând

enzime extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine, factori asociaţi cu virulenţa

bacteriană.

Capacitatea chemotactică faţă de epiteliile mucoase este mai evidentă la formele

monotriche, depinzând şi de cantitatea şi calitatea mucusului.

Majoritatea germenilor ce colonizează ţesutul uman posedă pe suprafaţă componente

proteice numite ²adezine² care se leagă stereochimic de structurile moleculare

complementare tisulare. Aceşti factori de adezivitate par a fi asociaţi cu fimbriile sau pilii.

Factorii de virulenţă implicaţi în colonizare sunt sintetizaţi în paralel cu producerea

enterotoxinei în cazul Vibrio cholerae(toxina holerică) şi sunt sub coordonarea aceleiaşi

gene. Se presupune că pilii (proprietate importantă asociată virulenţei germenilor din

mediu) se pierd o dată cu instituirea infecţiei.

398

Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existenţa unui

strat adiţional S extern faţă de peretele celular, care oferă protecţie faţă de agenţii litici

(bacteriofagi, proteine serice).

Enterotoxina holerică este principala cauză a diareei secretorii din holeră. De exemplu,

la voluntarii care au ingerat mai puţin de 10μg de toxină purificată, în 2 zile a apărut

diareea, cu un volum de peste 20 l, cu caracter „exploziv”.

Toxina holerică (la fel ca şi enterotoxina produsă de E. coli) este compusă dintr-o

subunitate A şi 5 subunităţi B, totalizând aproximativ 84.000 daltoni. Subunităţile B au o

mare afinitate pentru receptorii gangliozidici GM de pe suprafaţa celulelor ţintă. După

legare, subunităţile A intră în citoplasmă şi catalizează transferul ADP-ribozei la NAD, fiind

astfel activată o proteină reglatoare asociată membranei, numită Gs. Rezultatul este un

nivel crescut al AMPc în celulele mucoase ale intestinului subţire, urmat de hipersecreţia

clorurilor şi bicarbonatului care va determina un eflux important de apă.

Fiind germeni Gram-negativi, după distrugerea acestora din peretele celular se

eliberează endotoxina.

44. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

În condiţii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit că

pentru realizarea infecţiei şi bolii este necesară ingerarea a 108–1010 microorganisme.

Holera nu este o boală invazivă. Germenii nu ajung în torentul circulator, ci rămân

cantonaţi la nivelul tractului intestinal. Vibrionii colonizează marginea în perie a celulelor

epiteliale, apoi se multiplică şi eliberează toxina holerică (iar atunci când sunt distruşi

eliberează şi endotoxina).

După o perioadă de incubaţie de 1-4 zile apar brusc greaţă, vărsături, diaree abundentă

(20-30 litri / zi) şi crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme („apă de orez”) conţin

mucus, celule epiteliale şi un mare număr de vibrioni. Există o pierdere rapidă de fluide şi

electroliţi care duce la deshidratare, colaps circulator şi anurie. Rata mortalităţii în lipsa

tratamentului este 25-50%.

Infecţiile cu Vibrio cholerae grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterită şi cu

infecţii extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la

adulţi cu imunitate deficitară). Totuşi, a fost raportat un caz de sepsis cuVibrio

cholerae grup non O:1 plus gastroenterită la un copil de 8 ani, pacientul prezentând diaree

cu sânge, febră și deshidratare severă; vibrionii non O:1 au fost izolaţi din sânge și din

materiile fecale. (1)

399

45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter. Helicobacter pylori 45. 1. Definiţie. Încadrare

Microorganismele descrise în acest capitol erau anterior grupate împreună cu vibrionii şi

erau cunoscute ca patogeni ai unor variate specii animale la care produceau septicemii,

avorturi sau enterite (1963, vibrioni microaerofili). Ulterior s-a identificat

specia Campylobacter jejuni ca agent etiologic al diareei umane iar aceşti „vibrioni” au fost

încadraţi, având la bază secvenţierea ARNr 16S, precum și caracterele de cultură și

biochimice diferite în genurile Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter șiWolinella.

45. 2. Genul CampylobacterGenul Campylobacter conține 18 specii și subspecii, iar genul Arcobacter conține 4

45. 2. 1. Caractere generale45. 2. 1. 1. Habitat

Habitatul natural al microorganismelor din genul Campylobacter cuprinde păsările, atât

cele domestice, cât și cele sălbatice, acestea reprezentând principalele surse ale infecției

pentru oameni.45. 2. 1. 2. Caractere morfotinctoriale

Bacteriile din genul Campylobacter sunt bacili gram negativi curbați, mobili, iar

majoritatea speciilor au un singur flagel polar. După cultivarea prelungită sau după

expunerea la oxigen, microorganismele dobândesc o formă cocoidă (ceea ce ar putea preta

la confuzii de interpretare).45. 2. 1. 3. Caractere de cultură

Sunt bacterii microaerofile, spre anaerobe. Se dezvoltă cel mai bine într-o atmosferă

săracă în oxigen (5-10%) și îmbogațită cu CO2 (10%). În mod obișnuit, sunt utilizate medii

de cultură selective, de exemplu mediul Skirrow care conține vancomicină, polimixină B și

trimetoprim cu scopul de a inhiba creșterea altor bacterii. Temperatura optimă de

dezvoltare pentruC. jejuni, C. coli și C. lari este de 42°C (bacterii fiind cunoscute sub

numele de “grupul termofil”, deși nu sunt bacterii termofile în sensul strict al cuvântului, a

se vedea 3. 5). Coloniile sunt incolore sau gri și pot fi convexe și rotunde sau apoase cu

tendință la confluare.45. 2. 1. 4. Caractere biochimice

Sunt oxidază și catalază pozitive. Nu fermentează carbohidrații.45. 2. 1. 5. Rezistența față de factori fizici și chimici

400

Sunt mult mai sensibile în comparație cu majoritatea bacteriilor. Sunt distruse de

procedeele obișnuite de pasteurizare ale laptelui. C. jejuni supraviețuiește în apă la 4°C

timp de câteva săptămâni, dar acest timp este mult scurtat la temperaturi de peste 15°C.45. 2. 1. 6. Structura antigenică

Structura antigenică a bacteriilor din genul Campylobacter este similară cu cea a

tuturor microorganismelor Gram negative. Menționăm lipopolizaharidul (de fapt un

lipooligozaharid) cu activitate de endotoxină și porinele membranei externe. De asemenea,

există și antigenul flagelar.45. 2. 1. 7. Răspunsul imun

Anticorpii serici de tip IgG și IgM înregistrează un maxim la 2-4 săptămâni după infecție,

apoi scad rapid. Pacienții expuși frecvent la bacterii din genul Campylobacter au

concentrații crescute de IgA care sunt însoțite de imunitate. Pacienții care au infecție

cu Campylobacter pot avea un test fals pozitiv pentru anticorpi anti-Legionella.45. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate.

Caracterele de patogenitate specifice genului Campylobacter reprezintă subiectul unor

cercetări aflate încă în desfășurare. Pe scurt, cele mai importante sunt :

1.      Variabilitatea genetică caracterizează C. jejuni și este cauzată de mecanisme

intragenomice (variații de fază, duplicări și deleții de gene, mutații punctiforme) precum și

de schimbul genetic între tulpini (transfer orizontal de plasmide și de ADN

cromozomial). Acest transfer are loc atât in vitro cât și în timpul colonizării păsărilor.

2.      Lipooligozaharidul are rol în aderența la celula epitelială și în invazivitate. Unele

componente  ale sale, datorită asemănarii structurale cu părti ale mielinei, declanșează un

răspuns imun încrucișat cu acestea. A se vedea 45. 2. 2. pentru detalii.

3.      Flagelul: motilitatea este importantă pentru colonizarea gazdei de către bacterie. C.

jejuni prezintă chemotaxie pentru aminoacizii și alte componente ale mucusului tractului

intestinal.

4.      Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produsă și de alte bacterii (E.

coli, Haemophilus ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzează oprirea ciclului

celular în celulele-gazdă. Mecanismele precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului

sunt încă în studiu.

5.      Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF,

JlpA, Peb1.

45. 3. Genul HelicobacterGenul cuprinde 18 specii, cum ar fi:

·         Helicobacter pylori

401

·         Helicobacter heilmannii (a fost identificat la pisici, câini, unele primate; atunci când

afectează oamenii, cauzează doar o gastrită moderată, deși infectia cu H. heilmannii este

întâlnită deseori în asociere cu Limfomul de tip MALT(Suerbaum) (1)

·         Helicobacter fennelliae  (2)

·          Helicobacter cinaedi (2)

Ultimele 2 specii se comportă din punct de vedere clinic asemănător cu Campylobacter

jejuni.

45. 3. 1. Caractere generale45. 3. 1. 1. Habitat

Helicobacter pylori colonizează stomacul în 60-70% din dispepsiile fără ulcer şi mult mai

frecvent în ulcerul peptic. Este identificat la polul luminal al celulelor epiteliului gastric, sub

stratul de mucus sau în zonele profunde ale acestuia,  fără a invada mucoasa gastrică.

Ureea reprezintă un important element nutritiv, iar amoniacul produs de urează îi asigură

pH-ul optim necesar multiplicării.

ureeureazaH2O 2CO2+2NH3'>

Prima cultură de H. pylori a fost obţinută în anul 1982 (vezi 45.13.1). Germenii izolaţi de

la pacienţii cu gastrite şi ulcer duodenal au primit iniţial numele de Campylobacter like,

apoi Campylobacter pyloridis, Campylobacter pylori, iar din 1989 fac parte din noul gen,

genul Helicobacter cu specia tip H. pylori.45. 3. 1. 2. Caractere morfotinctoriale

Helicobacter pylori are aspect de vibrion Gram-negativ, cu o lungime de 2,5 µm şi o

grosime de 0,5 µm, cu unul sau mai mulţi flageli polari, mobil, cu mişcări caracteristice,

uneori cu formă de spiril, necapsulat, nesporulat. Poate prezenta şi cili laterali (Figura nr.

1). S-au descris și forme cocoide despre care se crede că reprezintă o formă de rezistență.45. 3. 1. 3. Caractere de cultură

Se dezvoltă în 2-7 zile pe medii de cultură neselective (agar-chocolate, medii cu infuzie

de creier şi inimă sau agar-Brucellasuplimentat cu 5-7% sânge de cal) sau pe medii

selective în care se adaugă de exemplu amfotericină B şi polymixină sau cefsulodină, în

condiţii de umiditate relativ ridicată şi un procent de 5-10% CO2.45. 3. 1. 4. Caractere biochimice

H. pylori nu reduce nitraţii, nu desface hipuratul de sodiu; unele tulpini produc H2S pe

mediul TSI, elaborează urează şi catalază. Pe abilitatea H. pylori de a produce urează se

bazează mai multe teste diagnostice (a se vedea 45. 3. 3).45. 3. 1. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

H. pylori este foarte susceptibil la deshidratare; rezistă relativ puţin în mediul extern.

Este dotat cu capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica la nivelul mucoasei gastrice.45. 3. 1. 6. Structură antigenică

Componentele morfologice ale H. pylori conturează şi structura antigenică, respectiv un

antigen somatic O (termorezistent), antigenul H flagelar (termolabil), un antigen de

402

colonizare (aderare) precum proteinele membranei externe. Porinele sunt printre cele mai

bine caracterizate familii de proteine ale membranei externe, incluzând mai multe canale

care permit difuzarea pasivă a nutrienților. O altă proteină, BabA este prezentată în detaliu

în Anexa nr. 1 la fel ca și diferitele caractere de patogenitate.45. 3. 1. 7. Răspuns imun

Pacienţii infectaţi cu H. pylori prezintă un răspuns imun ce constă în producerea de IgM

specifici. Sunt produşi de asemenea anticorpi de tip IgG şi IgA, aceştia persistând sistemic

şi la nivelul mucoasei gastrice, cu un titru mai ridicat în cazul infecţiilor cronice.

O dată colonizat stomacul unui individ, întrebarea care se impune este: cum este

realizată persistența acestei infecții? De ce sistemul imun al individului respectiv nu

reușește să combată infecția? Răspunsul este că de-a lungul timpului, H. pylori a reușit să

evite sistemul imun prin mai multe mecanisme care vor fi detaliate în continuare.

În primul rând, după cum am mai subliniat, H. pylori stă sub stratul de mucus, fără a

invada epiteliul gastric, dincolo de “locul de acțiune” al celulelor sistemului imun. Cu toate

acestea, răspunsul imun al gazdei este activat de atașarea bacteriei de celulele

epiteliale. H. pylori se poate atașa de MHC II (complexul major de histocompatibilitate) de

pe suprafața celulelor epiteliale, declanșând apoptoza acestora. O metodă importantă de

activare a sistemului imun este descrisă în documentul suplimentar (Anexa nr. 1) mai

precis stimularea secreției de IL8 de către acidul diaminopimelic.

Pentru a evita răspunsul imun înnăscut, este necesară “neutralizarea” receptorilor Toll-

like (prescurtați în continuare TLR). Aceștia recunosc PAMPs (pathogen associated

molecular patterns), adică recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de

agenți patogeni care sunt diferite din punct de vedere structural de moleculele

organismului gazdă. Astfel, receptorii TLR-5 recunosc flagelina caracteristică mai multor

specii bacteriene, însă nu și pe cea conținută de H. pylori. TLR-9 recunosc ADN nemetilat al

majorității bacteriilor, dar H. pylori are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a

suferit modificări, astfel încât este recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu însă și de

receptorii aflați pe celulele epiteliale gastrice. Unul din puținele mecanisme ale imunității

înnăscute care încă este activat de catre H. pylori este calea acid

diaminopimelic→NOD1→stimularea NFkB→secreție IL8→neutrofile (NOD like receptors sunt

un alt tip de pattern recognition receptors, receptori care recunosc PAMPs).

Pentru imunitatea dobândită sunt necesare prezentarea antigenelor și proliferarea LT,

evenimente inhibate de către vacA, după am prezentat în Anexa nr. 1.

În timpul răspunsului imun dobândit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenția fie în Th1

(care secretă IL2 și IFNγ), fie în Th2 (care secretă IL4, 5 și 10). Th2 stimulează LB care

produc anticorpi împotriva patogenilor extracelulari, în timp ce Th1 stimulează răspunsul

imun celular, caracteristic pentru infecțiile cu microbi intracelulari. În mod paradoxal H.

pylori generează un răspuns predominant Th1. Studiile pe șoareci au arătat ca acest

raspuns predominant Th1 este asociat cu apariția gastritei, în timp ce un răspuns Th2 este

protector față de inflamația gastrică (gastrita se pare că este cauzată de secreția de IFNγ, o

citokină caracteristică răspunsului imun tip Th1). Studiile epidemiologice la om au arătat o

polarizare mai puțin pronunțată a răspunsului imun. (Tabelul nr. 3 și Figura nr. 4)

403

45. 3. 1. 8. Caractere de patogenitate

H. pylori prezintă structuri cu rol în patogenitate, respectiv antigenul de suprafaţă (de

colonizare, aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxică care iniţiază

inflamaţia locală acţionând asupra celulelor din epiteliul gastric şi duodenal şi toxina care

inhibă secreţia acidului clorhidric la nivelul celulelor parietale gastrice (Anexa nr. 1)

Se pare că un rol destul de important în patogenitate îl au ureaza, ca şi prezenţa cililor.

45. 3. 2. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

Helicobacter pylori poate fi agent etiologic al gastritei, al ulcerului gastric și duodenal,

al cancerului gastric (este considerat carcinogen clasa I, adică în mod sigur cauzează

cancer) și al limfomului MALT (Mucosal associated lymphoid tissue). S-a demonstrat relația

de dublă cauzalitate între H. pylori și limfom, în sensul că atât infecția cu H. pylori crește

riscul de limfom, cât și eradicarea infecției cu H. pylori conduce la regresia limfomului MALT

în majoritatea cazurilor.

Pentru ințelegerea evoluției ulterioare a infecției cu H. pylori, este necesară explicarea

rolului bacteriei în homeostazia secreției acide. (Figura nr. 5) Astfel, H. pylori acționează

asupra celulelor de tip D cauzând scăderea nivelului de somatostatină, ceea ce duce la

creșterea cantității de gastrină.

În acest moment, devine importantă localizarea infecției cu H. pylori, și implicit  localizarea răspunsului inflamator. În cazul gastritei, răspunsul inflamator de la nivelul celulelor parietale inhibă funcția acestora cu suprimarea producției de acid, iar secreția gastrică este caracterizată de nivele crescute ale pH-ului. Hipoacidemia crește suplimentar gastrina care reprezintă un stimul proliferativ pentru epiteliile gastrice. Inflamația și proliferarea continuă duc la pierderea glandelor gastrice și instalarea gastritei atrofice. Atrofia gastrică reprezintă unul dintre cei mai importanți factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscută dintre acestea cuprinde secvența atrofie→metaplazie intestinală→displazie→adenocarcinom. (Figura nr. 6)

 

Gastrita predominant antrală se caracterizează prin hipergastrinemie care de această dată acționează prin stimularea celulelor parietale care vor crește secreția de acid, răspunsul final fiind reprezentat de ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu scăderea pH-ului secreției gastrice, în timp ce ulcerul gastric este asociat cu scăderea mijloacelor de apărare ale mucoasei stomacului. (Figura nr. 7)

404

45. 3. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Helicobacter pylori

Având în vedere particularitățile acestor infecții, abordarea acestui subcapitol va fi puțin

diferită și vom începe prin discutarea unor teste care par a nu avea legătură cu materia

studiată în anul 2, însă trebuie avute în vedere ca atare.

Este importantă o clasificare a metodelor de diagnostic pentru infecția cu H. pylori așa

cum sunt ele utilizate de medicul clinician, în colaborare cu medicul microbiolog și medicul

care efectuează testele paraclinice.

În diagnosticul infecțiilor produse de H. pylori, pornindu-se de la elementele clinice, se

vor realiza următoarele teste:45. 3. 3. 1. Teste non-endoscopice

A. Testarea serologică se referă la determinarea nivelurilor de anticorpi prin tehnici

de tip ELISA. Se utilizează antigene cunoscute ca fiind specifice H. pylori (fie celule întregi,

fie celule sonicate sau extracte antigenice purificate) pentru a determina dacă pacientul are

sau nu anticorpi-anti Helicobacter. Nivelele crescute de IgG se mențin pe perioade mari de

timp care variază de la o persoană la alta, din acest motiv acest tip de testare nu va fi

utilizat pentru evaluarea post-tratament, deși este un test care poate fi util în screeningul

inițial al infecției cu Helicobacter pylori.  

B. Testul respirator la uree: reprezintă standardul în testarea non-invazivă a infecției

cu H. pylori. Pacientul va bea un lichid care conține uree marcată cu C13 (izotop

nonradioactiv) sau cu C14 (utilizat mai rar din cauza radioactivității). Ureaza produsă de H.

pylori va descompune ureea în amoniac și CO2 marcat care va fi măsurat din aerul expirat

de pacient. Cantitatea de CO2 din aerul expirat este un indicator al cantității de uree aflata

în stomac. Testul respirator la uree poate fi folosit atât pentru diagnosticarea inițială, cât și

pentru monitorizarea răspunsului la tratament.

C. Testul antigenelor din materiile fecale: se utilizează tot un test de tip ELISA,

însă spre deosebire de cel de la punctul 1 suntem în situația inversă: în kit avem anticorpii,

ceea ce trebuie să determinăm este prezența sau absența antigenelor din fecale. Testul

antigenelor din fecale este unul care certifică infecția activă (daca nu mai sunt

microorganisme în stomac, acestea nu vor mai fi eliminate pe cale digestivă), deci

reprezintă un test eficace atât pentru screeningul inițial, cât și pentru evaluarea post-

terapie.45. 3. 3. 2. Teste endoscopice

Cu ajutorul endoscopiei se prelevează biopsii de țesut gastric care vor fi analizate prin

una din modalitățile următoare:

A. Metode bazate pe urează: țesutul biopsiat se plasează într-o soluție de uree și un

indicator de pH. Prezența ureazei va descompune ureea și va crește pH-ul ceea ce va

determina virarea culorii indicatorului de pH.

405

B. Teste care țin de diagnosticul de laborator microbiologic: fragmentele

bioptice obținute din corpul și antrul stomacului sunt strivite pe o lamă (amprentare), fixate

cu alcool metilic timp de 1 minut, uscate și apoi colorate timp de 20 de minute cu soluție

Giemsa1/10 preparată extemporaneu. Se poate utiliza și impregnarea argentică  Warthin-

Starry (aceasta a fost metoda orginală de evidențiere a Helicobacter de către Warren și

Marshall în 1983) Apare morfologia caracteristică de vibrioni sau spirili. (Figura nr 8)

Cultivarea, deși reprezintă o modalitate foarte specifică și prezintă în plus avantajul de

a putea permite testarea sensibilității la antibiotice nu se realizează în mod curent din

cauza unor dificultăți tehnice și a sensibilității reduse (un număr relativ mare de infecții

cu H. pylori nu au fost validate utilizând această modalitate de diagnostic). H. pylori este un

microorganism pretențios, cu creștere lentă, care are nevoie de condiții speciale pentru a

se dezvolta. Totuși, considerăm că ar fi necesare mai multe eforturi în acest sens.

46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulaţi. Genul Corynebacterium

46. 1. Definiţie. ÎncadrareGenul Corynebacterium cuprinde o serie de specii de bacili Gram-pozitivi (se pot colora

neuniform), uşor încurbaţi, măciucaţi, aşezaţi în V, L sau în „palisade”, nesporulaţi,

necapsulaţi, imobili, aerobi şi facultativ anaerobi, catalază-pozitivi. Speciile genului (62,

dintre care 38 cu relevanţă medicală) pot fi grupate în funcţie de habitat şi patogenitate.

Studii recente au delimitat în cadrul genului grupul „Corynebacterium

diphtheriaeӔn care sunt incluse

speciile C.diphtheriae, C. pseudotuberculosis şi C. ulcerans (ultimele două fiind urează-

pozitive). Cultivă mai bine pe medii îmbogăţite (de ex. cu adaos de ser sau sânge). Au

capacitatea (în cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxină. Specia cea mai

importantă este Corynebacterium diphtheriae (bacilul difteric). C. diphtheriae include patru

biotipuri: gravis, mitis, intermedius şi belfanti.

Difteria a fost descrisă încă din antichitate (Hipocrate). În 1821 difteria a fost

diferenţiată de alte infecţii ale tractului respirator, iar în 1883 în „falsele membrane” au fost

evidenţiaţi bacili Gram-pozitivi.

Bacteriile corineforme nu reprezintă o unitate distinctă din punct de vedere taxonomic,

însă au primit acest nume generic datorită faptului că se aseamănă din punct de vedere

morfologic, sunt bacili Gram-pozitivi, nu produc spori, au formă neregulată, unii prezintă

capete umflate şi este important să fie diferenţiate de agentul etiologic al difteriei (pot

exista confuzii de diagnostic).

406

46. 2. Caractere generale46. 2. 1. Habitat

C. diphtheriae poate fi identificat în tractul respirator superior uman (la 3-5% din

persoanele sănătoase), precum şi la nivel tegumentar (de regulă în leziuni dermice).46. 2. 2. Caractere morfotinctoriale

După cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi, măciucaţi

(Korynee înseamnă măciucă, ciomag), cu tinctorialitate inegală datorită prezenţei

granulelor de polifosfat (corpusculi Babeş-Ernst) şi cu o dispoziţie care ar putea fi

comparată cu literele V, L etc. sau cu nişte „litere chinezeşti”. Se poate afirma că bacilul

difteric, cu o compoziţie a peretelui celular care cuprinde mai puţină mureină (circa 50-

60%), este Gram-pozitiv la limită. Pe alte medii de cultură morfologia este mai puţin

caracteristică.

Bacilii difteroizi (de exemplu C. hoffmanni, C. xerosis etc) prezintă o colorare uniformă

şi sunt dispuşi în palisade.46. 2. 3. Caractere de cultură

Bacilul difteric este izolat în cultură pură pentru prima oară în anul 1884, când Loeffler

utilizează un mediu cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Deşi este inclus într-o singură

specie, bacilul difteric prezintă variabilitate în ceea ce priveşte caracterele de cultură şi de

metabolism, deosebindu-se mai multe tipuri. Coloniile au aspect de creştere de tip R

(rough). Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvoltă în 8-12-18 ore, iar aspectul

pe frotiu este cel caracteristic.

Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evidenţiază pe mediile cu

telurit (de exemplu Gundel-Tietz): tipulgravis produce colonii nehemolitice, mari, cu

suprafaţă granulară, gri-negre, în „margaretă”, cu margini crenelate; tipul mitisproduce

colonii hemolitice, convexe, cu margini circulare, de tip S; tipul intermedius produce colonii

nehemolitice, mici, cu margini circulare, cu suprafaţa granulară.

În cursul diagnosticului unei infecţii cu bacil difteric este necesară utilizarea mediului de

îmbogăţire OCST (ou-cisteină-ser-telurit), un mediu lichid.46. 2. 4. Caractere biochimice

Deşi se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o dezvoltare mai favorabilă

pe medii îmbogăţite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).

Capacitatea de fermentare a mono şi dizaharidelor permite identificarea speciei în

cadrul genului, iar fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) în cadrul

speciei.

Bacilul difteric produce cistinază (care descompune cistina, eliberând H2S), reduce

sărurile de telur şi elaborează bacteriocine.46. 2. 5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Poate rezista în fragmente din „falsele membrane”. Este distrus de căldura umedă (10

minute la 60º), alcool sau antiseptice uzuale, precum şi de antibiotice (eritromicină,

penicilină etc).

407

46. 2. 6. Structură antigenică

Există diferenţe serologice între diferitele tulpini de Corynebacterium diphtheriae, dar

nu s-a putut elabora o clasificare serologică satisfăcătoare. În diagnostic nu se folosesc

identificările serologice.

Cea mai importantă structură antigenică este reprezentată de toxina difterică, un

polipeptid termolabil cu greutatea moleculară de 62.000 Da, care conţine cel puţin patru

determinanţi antigenici diferiţi.46. 2. 7. Răspuns imun

Determină un răspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificaţi, dar nu

oferă protecţie (sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxină (care este identică la toţi bacilii

difterici toxigeni) oferă protecţie (neutralizează toxina). Titrul protector trebuie să fie mai

mare de 0,03 UA / ml.46. 2. 8. Caractere de patogenitate

Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) şi toxinogeneză

(tulpinile lizogenizate). Toxina (exotoxină) este aceeaşi pentru toate tulpinile toxigene.

Infectarea cu bacteriofagul temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece există

fagi tox+ şi fagi tox-, există tulpini lizogene care produc şi tulpini lizogene care nu produc

toxină difterică.

În cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul că prezenţa fierului este esenţială,

producţia optimă realizându-se la concentraţii care variază între 0,14-0,50 mg Fe / ml.

Toxina difterică este alcătuită din două fragmente legate prin punţi disulfidice.

Fragmentul B (greutate moleculară 38.000 Da), reprezintă fragmentul de legare pe

receptorii specifici ai celulelor susceptibile şi facilitează pătrunderea fragmentului A.

Fragmentul A este activ şi inhibă elongarea lanţurilor polipeptidice în curs de formare,

catalizând inactivarea translocazei ARNt(numit factor de elongare 2) prezentă numai în

celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este necesar pentru translocarea polipeptidil-

ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al ribozomului celulei eucariote; prin

inactivarea lui nu mai are loc interacţia ARNm-ARNt şi se stopează adăugarea a noi

aminoacizi lanţului polipeptidic în curs de formare.

În mod practic, toxina difterică (fragmentul A) catalizează o reacţie prin care se

eliberează nicotinamidă şi adenozin difosfat riboză, care cuplându-se cu factorul de

elongare 2 formează un complex inactiv (o toxină asemănătoare ca mod de acţiune poate fi

produsă de unele tulpini de P. aeruginosa). O moleculă de toxină opreşte sinteza proteică în

celulă pentru mai multe ore. Doza letală este de 0,1 mg / kg.

46. 3. Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse

408

Poarta de intrare a bacilului difteric poate fi reprezentată de tractul respirator (faringe,

nas), de leziuni tegumentare sau, mai rar, de mucoasa genitală. După multiplicare rezultă o

inflamaţie locală. În acelaşi timp, în cazul tulpinilor lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+)

începe sinteza toxinei. Toxina difterică poate afecta orice tip de celulă din organism, dar are

un „tropism” special pentru celulele de la nivel cardiac (miocardită), nervos (demielinizare),

renal (necroză tubulară), suprarenalian, muscular şi hepatic. Cel mai probabil oprirea

bruscă a sintezei proteice este responsabilă de efectele necrotice, neurotoxice etc.

În câteva zile de la debutul infecţiei (şi producerii de toxină), Corynebacterium

diphtheriae sintetizează o „structură” compusă din fibrină la care se adaugă leucocite,

eritrocite, celule epiteliale respiratorii distruse, bacterii, structură care a fost numită „falsa

membrană” de culoare gri-maronie (diphtera înseamnă membrană).

Încercarea de a îndepărta „falsa membrană” (foarte aderentă) duce la sângerări la

nivelul submucoasei prin ruperi de capilare. Această structură se poate forma local

(amigdalian, faringian, nazal, genital) sau se poate extinde, acoperind faringele,

obstrucţionând arborele traheobronşic (posibil cu asfixie mecanică, situaţie numită „crup

difteric”) etc. La adăpostul „falsei membrane”, bacilul îşi continuă multiplicarea şi sinteza

de toxină care difuzează pe cale sanguină şi conduce la apariţia unor tulburări la distanţă

(tulburări de ritm cardiac, miocardită, dificultăţi vizuale, de vorbire, de înghiţire etc).

Cu cât diagnosticul este mai tardiv, cu atât rata mortalităţii prin difterie creşte.

Au fost înregistrate forme de difterie invazivă, cu tulpini netoxigene, la persoane care

se droghează sau la alcoolici (artrită septică, osteomielită, endocardită difterică).

Datorită faptului că în ultimii aproape 22 ani nu au mai fost înregistrate cazuri de boală

în ţara noastră, există riscul nerecunoaşterii acestei patologii de către medicii care nu au

văzut niciodată un caz de difterie. Riscul apariţiei cazurilor există iar sistemul de sănătate

trebuie să fie în permanenţă pregătit pentru a reacţiona prompt, din toate punctele de

vedere (recunoaştere clinică, stabilire diagnostic, instituire tratament, intervenţie „în focar”

etc).

409