Editori Mihaela Alua Simion Simon

Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nano-sistemelor

1

2

Editori Mihaela Alua Simion Simon

METODE EXPERIMENTALE AVANSATEPENTRU STUDIUL I ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR

Casa Crii de tiin Cluj-Napoca, 2012 3

Coperta: Patricia Puca

Editur acreditat CNCSIS (24)

Universitatea Babe-Bolyai, 2012

Material editat n cadrul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, ID 36154

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nanosistemelor / ed.: Mihaela Alua, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Crii de tiin, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5 I. Alua, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.) 53

4

Prefan calitate de director al proiectului cu titlul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc s mulumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza i profesionalismul lor la realizarea acestui volum i, implicit, la dezvoltarea programului doctoral. Mulumirile mele se ndreapt de asemenea ctre echipa de management a proiectului, n urmtoarea componen: Prof. dr. Simion Simon, coordonator tiinific program doctoral Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator tiinific relaii internaionale Cristina Dominic, asistent manager Andra Ghira, responsabil logistic i asistent manager Jr. Alexandru Braoveanu, consilier juridic Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar Ing. Carmen Ciplea, expert IT Ec. Istvn Psk, expert contabil Am convingerea c informaia cuprins n aceast lucrare va sprijini generaiile prezente i viitoare de conductori de doctorat n activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor n lumea minunat a tiinei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercettor o vocaie. Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013. C.S.III. dr. Mihaela ALUA 5

6

Cuvnt nainteInstitutul de Cercetri Interdisciplinare a fost nfiinat prin Hotrrea Senatului Universitii Babe-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare i transfer tehnologic, avnd ca obiectiv de activitate att realizarea de studii i cercetri interdisciplinare n domeniile biologie molecular, biomateriale i sisteme biologice, materiale avansate i mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural i artificial, ct i transferul rezultatelor obinute ctre beneficiari locali, naionali sau internaionali. Institutul beneficiaz de o cldire proprie, cu o suprafa desfurat de peste 3000 mp, modernizat la nivelul standardelor internaionale din punct de vedere al dotrilor conexe i avnd laboratoare de cercetare structurate n acord cu nevoile cercetrilor interdisciplinare menionate. ntre timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis s-i dedice energia i cunotinele cercetrilor la interfaa Bio-NanoSistemelor, a devenit Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nanotiine (ICI-BNS). n cadrul acestuia i desfoar activitatea n prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conductori de doctorat), 25 alte cadre didactice i cercettori i peste 40 de doctoranzi cu frecven. Acetia aparin domeniilor Fizic, Chimie, Biologie, Informatic, tiina mediului i Psihologie. Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar a oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercettori valoroi, cu experien deosebit n tehnicile experimentale frecvent utilizate n cercetrile interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-tiinelor. Marea majoritate a experilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoctorale n prestigioase laboratoare din lume unde au dobndit o bogat experien n utilizarea echipamentelor de nalt performan de care dispune Institutul nostru. Studenii doctoranzi, dar i specialiti din domenii ca: fizic, chimie, biologie, geologie sau tiina mediului interesai n studii experimentale interdisciplinare vor gsi n materialele incluse n prezentul volum date teoretice dar mai ales practice, despre tehnici experimentale avansate prezentate ntr-o form accesibil, cu exemple semnificative, menite a facilita nelegerea fenomenelor studiate i a contribui la creterea aportului fiecrui cercettor la dezvoltarea domeniului n care i va desfura activitatea tiinific. Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS

7

8

CUPRINSI. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13 Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine.......................................................................................................................... 13 Asist. univ. dr. Iulia Lupan Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ........... 36 Asist. univ. dr. Iulia Lupan II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64 Culturi celulare ........................................................................................................... 64 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Culturi celulare partea a II-a .................................................................................... 82 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101 Microspectroscopia Raman....................................................................................... 101 Conf. dr. Monica Maria Baia Microspectroscopia Raman partea a II-a................................................................ 121 Conf. dr. Monica Maria Baia IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134 Spectroscopia de absorbie n infrarou .................................................................. 134 Lect. dr. Nicolae Leopold Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR ............................................. 147 Lect. dr. Nicolae Leopold V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160 Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160 Conf. dr. Dana Maniu Spectrofluorimetria - aplicaii ................................................................................... 172 Conf. dr. Dana Maniu VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR ......... 191 Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) .................. 191 C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Alua Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organice n faza solid .......................................................................................................... 216 C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Alua

9

Rezonana magnetic nuclear pe sisteme lichide ................................................ 246 Lect. dr. Mihai Vasilescu VII. MSURTORI TERMICE .................................................................................. 266 Analiz termic diferenial. Analiz calorimetric diferenial......................... 266 Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termic diferenial si analiz calorimetric diferenial. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC........................................................................................................................... 275 Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286 Difracie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Determinarea structurii cristaline prin difracie de raze X................................... 305 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ I DE TRANSMISIE ........... 327 Microscopia electronic ............................................................................................. 327 ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Microscopia electronic - partea a II-a .................................................................... 347 ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran X. MICROSCOPUL DE FOR ATOMIC ............................................................ 365 Microscopia de for atomic ................................................................................... 365 Conf. dr. Ioan Burda Microscopia de for atomic partea a II-a ........................................................... 378 Conf. dr. Ioan Burda XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X I ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394 Spectroscopia fotoelectronic ................................................................................... 394 C.S.III. dr. Maria Teodora Radu Studiul prin spectroscopie fotoelectronic de raze X a suprafeelor diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424 C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga XII. SPECTROMETRUL DE REZONAN ELECTRONIC DE SPIN .......... 437 Spectroscopia de rezonan electronic de spin ................................................... 437 C.S. dr. Milica Todea Spectroscopia de rezonan electronic de spin partea a II- a ............................ 452 C.S. dr. Milica Todea

10

XIII. METODE ELECTROCHIMICE ......................................................................... 467 Elaborarea, testarea i verificarea protocoalelor de practic experimental pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice ........................ 467 Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Electrochimia unei substane cu potenial biologic activ. Studiu de caz ............ 490 Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean XIV. SISTEME DE ANALIZ A SUPRAFEEI SPECIFICE I A DIMENSIUNII PARTICULELOR .......................................................................... 509 Sisteme de analiz a suprafeei specifice i a dimensiunii particulelor ............. 509 Lect. dr. ing. Rka Barabs

11

12

I. ANALIZE GENETICE Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteineAsist. univ. dr. Iulia Lupan

Cuprins1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ................................................................................................................. 13 2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare ..................................................................................................... 31 3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular ................... 33 4. Bibliografie ............................................................................................................. 34

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariotADN n sine are doar 2 funcii importante i anume pstrarea informaiei genetice i furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Pstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN i mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de descifrarea informaiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN, care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraz. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc n ribozomi. Practic ARN este cruul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc sinteza proteinelor. Dogma central a biologiei presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1). Informaia genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exist cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine. 13

Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii const din urmtoarele etape: amplificarea genei de interes introducerea genei de interes ntr-un vector de clonare introducerea moleculelor recombinate n celule gazd selecia celulelor transformate (purttoare ale moleculei recombinate) Figura 1. Dogma central a biologiei. verificarea moleculelor recombinate Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment de ADN care se transcrie ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN rezultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: ARN funcional ARN informaional ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (sintez a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist 2 modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic. A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des 14

utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesit cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie obligatorie pentru o amplificare reuit este cunoaterea secvenei int, n special la capetele acesteia. Dac secvena este necunoscut, atunci se vor analiza cel puin secvene ADN omoloage de la alte specii sau secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen. Principiul tehnicii PCR este o imitaie a procesului de replicare a ADN care are loc n celule. Dac n celule pentru replicare se folosete o ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape: denaturarea ADN alinierea amorselor sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraz Dup fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dubleaz, iar dup 35-40 de cicluri se obin milioane de copii ale fragmentului int pornind de la o singur copie. Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C. Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec. Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite i oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremitile secvenei int i formeaz cu acestea poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la 40-60C timp de cteva zeci de secunde. Aceast etap este numit de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabilete la cteva grade (2-5C) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai simpl formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este: Tm = 4 (G + C) + 2(A + T) 15

Unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece ntre acestea exist 3 legturi de hidrogen, n consecin moleculele bogate n G i C au o temperatur mai mare de topire. Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume: numrul de nucleotide este de 15-35 temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 i 70C coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55% la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoarece ofer o stabilitate mai mare amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern, n caz contrar amorsa poate forma secvene interne dublu catenare care au aspect de stem sau bucl cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare ntre ele, altfel se vor forma poriuni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte rmase monocatenare. De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri i amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia 5'3' (Figura 2). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea fragmentului amplificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz, care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'. Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolat de la bacteria Escherichia coli, care are activitatea optim de sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat de la o bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei), care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activitate este nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de 16

aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sintezei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide 2minute.Etapa iniial de denaturare

5'

3'

ADN genomic cu fragmentul int3' 5'

5'

3' 3 5'

Alinierea amorselor la capetele fragmentului int3'

5'

3 '

5'

Ciclu I

5'

3'

Etapa de elongare sau sintez a catenei complementare de ctre ADN polimeraz

3'

5'

5'

3'

Sfritul primului ciclu3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5'

3'

5'

3'

3'

3'

5'

Ciclu II

5'

3'

5'

3'

3'

3'

5'

17

5' 3' 5'

3' 3'

5'

3' 5'

5' 3'

3'

5' 3'

3' Ciclu III

5' 3'

3' 5' 3'

5'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3'

Taq polimeraza

amors amors ce indic direcia de sintez

Figura 2. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere invers. Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz deoarece sintetizeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la virusurile care au material genetic ARN i n momentul intrrii n celul necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se utilizeaz pentru obinerea copiilor de gene eucariote care nu conin introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la ARNm (ARN informaional care codific proteine). Enzime de restricie Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN. Restrictazele recunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri specifice de recunoatere, se fixeaz de acestea i taie legturile fosfoesterice ntre nucleotide. Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). n mo18

mentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost descrise 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i utilizeaz ioni de Mg2+ ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este identic. Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea bacteriei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13.A EcoRI B SmaI

5 GAATTC CTTAAG 3

3 5

5 GGGCCC CCCGGG 3

3 5

5 G CTTAA 3

AATTC G

3 5

5 GGG CCC 3

CCC GGG

3 5

Figura 3. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de tiere sunt indicate cu sgei.

Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz capete drepte sau netede (Figura 3). Cu ajutorul unor programe speciale se pot alctui hri de restricie care reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite restrictaze ntr-o secven (Figura 4).

19

B am H I (533) H inf I (7 5) E co RV (5 8) H inf I (32) H inf I (461) E co RI (605) H inf I (616) E co RI (633) B am H I (7 7 3) NcoI (7 7 7 ) H inf I (942

Y LR3 7 7 C1047 bp

Figura 4. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricie.

Ligarea fragmentelor de ADN Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit ADN ligaz. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 5). Funcia ligazei n celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i dup repararea ADN. Cea mai des utilizat este ADN ligaza T4 izolat de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizeaz ATP ca i cofactor.

Figura 5. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au capete netede.

Vectori de clonare Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule 20

gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este originea de replicare. Nicio molecul de ADN nu poate fi replicat fr o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de anumite proteine care iniiaz replicarea. O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN sunt tiate cu aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie care nu se conin n alt regiune a vectorului. O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conine att celule cu, ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supravieui doar celulele care conin plasmidul. Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile re21

zultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional i vor supraveui. Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristic important pentru plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5 ml de cultur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur. Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc i n genom i fac parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus n situsul multiplu de clonare, n caz contrar acesta se poate introduce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus i el de obicei n situsul de clonare. n unele cazuri acesta este prezent dup regiuni care codific anumite aa-zise etichete. Etichetele faciliteaz purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la 22

captul ei C-terminal sau N-terminal dac secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate fa de anumite rini cromatografice.AEco RI (4360) Sca I (3847) Pvu I (3737) Cla I (25) HindIII (30) Eco RV (188) Bam HI (376) Sph I (567) Sal I (652)

B

LacZEco RI Sac I (6

AP rPst I (3612)

bla(AmR)

Kpn I (6

TC r

pTZ57R2886 bp

Xba I (6 Bam HI

pBR3224361 bp

MCSApa I (6 Sal I (6 Pst I (6 Hin dI

ORIBst Z17I (2247)

T7 pT7 terminator

Cf1 origin

His tagXhoI (159) Not I (167) HindIII (174) Sal I (180) Sac I (191)

Ori

M CSEco RI (193)

bla (Ap)

Bam HI (199 Nde I (239

pET-21a5443 bp

T7 promBgl II (34

lacI

ColE1 pBR322 origin

Figura 6. Hrile unor vectori plasmidici. A harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezisten la antibiotice: Apr confer rezisten la ampicilin, iar TCr rezisten la tetraciclin, situsul multiplu de clonare l poate constitui oricare dintre cele dou gene de rezisten, n dependen de gena selectat pentru inserare, rezistena la antibioticul respectiv se va pierde . B harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezisten la ampicilin, iar situsul multiplu de clonare se afl n gena lacZ' care ofer selecia alb-albastr a clonelor pozitive. C harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care confer rezisten la ampicilin, situsul multiplu de clonare care conine un codon START i un codon STOP dup eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

23

Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se numete transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau transfecie dac sunt celule eucariote. n continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular: transformarea chimic transformare sub influena cmpului electric. Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de transformare natural. Aceast competen n cazul transformrii chimice este indus cu CaCl2. n acest scop se realizeaz o cultur de E. coli i prin tratarea celulelor cu clorur de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bacteriene (Figura 7 A). Celulele sunt ocate termic foarte scurt, timp de maxim 2 minute, la 42C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele bacteriene. Transformarea n cmp electric este mai eficient dect transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar creterea lor pn n faza logaritmic (D=600nm = 0,6-0,8) i nlturarea prin splri repetate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de electroporare, ai crei perei laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura 7 B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice. Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate, adic fr plasmid. Eficiena de transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile rezultate. Numrul de colonii va corespunde numrului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia natere dintr-o singur celul. Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoarea la 1000). O eficien bun de transformare este 106, ceea ce nseamn ca la transformarea unui g de plasmid s-ar obine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie 24

sau de cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din aceast cauz este recomandat o eficien ct mai mare a celulelor competente. Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri. Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar mai ieftin deoarece nu necesit aparatur i cuve costisitoare.ACaCl2 2 min 42C

B

Celule de E.coli

Celule transformate de E.coli

nsmnarea celulelor transformate pe mediu selectiv

Splarea celulelor bacteriene

1800 V 5 msec

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A transformarea chimic cu CaCl2; B electroporarea celulelor bacteriene.

Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr-un cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza proteinelor n condiii denaturante n gel de poliacrilamid (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice i pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici. Aceast matrice este folosit mai rar n laboratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz. Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl. Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de ADN i ARN 25

ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi n dependen de masa lor molecular. Pentru estimarea aproximativ a mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de molecule se numete marker molecular ADN. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon specific. Concentraia agarozei n gel poate fi ntre 1 i 3% n dependen de scopul urmrit. Cu ct concentraia agarozei este mai mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n concluzie concentraii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru fragmente mici. Gelurile de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt plasate ntre cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA). Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utilizarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de ADN. Lungimea de und a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm.A B

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz. A imaginea gelului la expunerea n UV; B fotografia aceluiai gel.

Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN 26

(ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificri. Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-18 ore de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat. Secvenializarea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescut. n cadrul Centrului de Biologie Molecular exist 2 secveniatoare: Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secveniere. Matria ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea 27

unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar i di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi captat i prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electroforegramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale.

Figura 9. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.

Exprimarea genelor n sistem procariot Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate. 28

Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se va pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl sub controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac (Figura 10).

Figura 10. Inhibiia exprimrii genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 i a genei int n celulele gazd de E. coli n lipsa inductorului.

29

Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de proteine este necesar purificarea n cel puin 2 etape prin metode cromatografice diferite. Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur purificarea proteinelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul necesar i asigur randamente de purificare mai mari (Figura 11). Dac eticheta deranjeaz n analiza ulterioar a proteinei, atunci se poate recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conine situsul pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n cazul plasmidului pET28.A B C

Figura 11. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate. A ncrcarea amestecului total de proteine pe coloana cu rin; B splarea coloanei cu tampon i fixarea proteinei int de rin; C eluarea proteinei int de pe coloan.

30

2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinareClonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Una dintre aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele n care aceasta se exprim n mod firesc natural prezint mai multe dificulti: cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o cantitate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purificrilor n cteva etape pot fi sub 100 mg de protein; obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem s le cultivm n condiii de laborator; obinerea materialului pentru purificare implic probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de proteine din celule umane ar fi imposibil; purificarea se face n mai multe etape care necesit timp, consumabile i are randamente mai mici. Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic sunt eliminate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse mai multe tipuri de mutaii: mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul; deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi nlturate; inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena codificatoare i respectiv n proteina recombinat; fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit; proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate 31

cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor. Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este tehnica la care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai puin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i cuaternar. Exprimarea genelor i sinteza proteinelor n celulele procariote asigur doar structura primar exact a polipeptidului sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale i alte proteine care contribuie la adoptarea conformaiei proteinei active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o structur secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplasm formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii denaturante. Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai important aspect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a proteinei i nu structura ei secundar sau teriar. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza apartenenei genei sau pe baza analizei structurii primare. O alt problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacteriene. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri conformaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri, glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar, atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor post-traducere este un avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete s se cunoasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest fel proteina recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul acestor grupri n activitatea proteinei. 32

3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie MolecularDenumire echipament Instalaie de preluare i prelucrare a imaginilor Ced Limited, Marea Britanie Instalaie de ap ultrapur, Elga-Lab Water, Marea Britanie Centrifug cu rcire Sigma 3K18 (4 rotoare), Sigma, Germania Centrifug de mas Sigma 1-13, Sigma, Germania Thermocycler, Eppendorf, Germania Thermocycler, Corbett Research, Australia Electroporator Eppendorf, Germania Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301, CamSpec, Marea Britanie Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu termostatare, Jasco, Japonia Patru instalaii electroforez proteine, Consort, Belgia ase instalaii electroforeza acizi nucleici, Consort, Belgia pH-metru P901 (dou buci), Consort, Belgia Congelator temperaturi foarte sczute, 70 litri, Sanyo, Japonia Congelator temperaturi foarte sczute, 100 litri, Snijders Scientific, Olanda Dou balane analitice, Scaltec, Germania Dou incubatoare bacteriologice, Memmert, Germania Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Caracteristici Achiziia i interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamid sau geluri de agaroz Purificarea apei pn la o rezistivitate de 18,2 M/cm (apa MilliQ) Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg, rcire de la temperatura camerei la 0C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml i rotor 4x250ml Fr rcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg) Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml, 0,5ml i placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur n tub Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml i plci ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur Transformarea celulelor electrocompetente bacterii i drojdii Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm, cu termostatare, pentru cinetic enzimatic Electroforez vertical n gel de poliacrilamid, max. 32 probe Electroforeza orizontal n gel de agaroz, max. 48 probe Masurarea pH-ului, electrod combinat prevzut cu senzor de temperatur Congelare probe biologice la -82C Congelare probe biologice la -82C Domeniul de msurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfa pentru calculator i imprimant Incubarea culturilor bacteriene i a probelor moleculare de la temperatura camerei la 70C Incubarea probelor biologice pana la 100C, (3%)

33

Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA laser cu detecie pentru 5 fluorocromi Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System laser cu detecie pentru 4 fluorocromi Instalaie Real Time PCR, Corbett Research, Australia

Secvenierea fragmentelor de ADN, identificare uman i determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilar la 15kV; soft-uri speciale pentru secveniere i genotipare;

Amplificarea ADN-ului n timp real; detecia simultan a 4 fluorocromi Separarea probelor prin cromatografie de nalt perforInstalaie HPLC, Jasco, Japonia man; gradient binar de nalt presiune i gradient cuaternar de joas presiune Microscop inversat NIKON Studiul preparatelor celulare i tisulare n lumina normaEclipse TE2000S, Nikon, Japol, contrast de faz i fluorescen nia Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umed sau uscat a mediilor de cultur, mateAutoclav AE-75-DRY Raypa, rialelor i instrumentelor Spania Ultrasonicator cu patru sonde, Dezintegrarea celulelor bacteriene, esuturilor animale i Sonics & Materials vegetale n volume de la 1ml pn la 1 litru Hota PCR cu flux laminar Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, iluminasteril, Telstar, Spania re, preparare probe PCR (4% Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 Hota flux laminar biohazard m 99,97%), prefiltru reciclabil (3-30 m); flux de aer 100, Coreea de Sud reglabil n 9 trepte (0,35-0,5 m/s);

4.Bibliografie1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science. Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York: W. H. Freeman Company. Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition, Wiley-Blackwell Publishing. Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant DNA, 2nd Edition, Academic Press. Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press. Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press. Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic Analysis, New York: W. H. Freeman Company. Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company.

34

10. McPherson M.J., and. Mller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, Springer-Verlag Telos. 11. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis. 12. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Editura Tehnic, Bucureti. 13. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes - A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.

35

Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinareAsist. univ. dr. Iulia Lupan

Cuprins1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai.................................................... 36 2. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor ............................................... 57 3. Bibliografie ............................................................................................................. 60

1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminaiUn numr mare de aminoacizi se pot obine prin sintez enzimatic, care nu se aplic la scar industrial la fel ca n fermentarea direct, din cauza costurilor prea mari a substratelor. Aceast metod capt o amploare mai mare pe an ce trece datorit cererii mari de aminoacizi, care nu se gsesc n natur, i de derivai ai acizilor aminai. Totui metoda enzimatic prezint unele avantaje fa de alte metode, deoarece: izomerii optici ai aminoacizilor se pot obine direct din substratele corespunztoare; se pot sintetiza D-izomeri, care nu se pot obine prin fermentare direct sau prin extracie; se pot obine derivai ai aminoacizilor sau aminoacizi rari; sintezele sunt uor de manipulat; cantitile produse i concentraiile sunt mai mari; necesit condiii blnde de temperatur, pH, presiune. La nceput, pentru producerea acizilor aminai pe cale enzimatic, se foloseau enzime nerecombinate produse de microorganisme, fiind stimulat sinteza lor prin diverse metode. Pentru a reduce costul sintezelor, enzimele nu se purificau i se folosea lizatul celular ce coninea enzime specifice. Imobilizarea enzimelor n sintezele enzimatice prezint dou avantaje importante i anume reutilizarea multipl a enzimelor costisitoare i recuperarea substratelor rmase, folosite n exces. Sinteza enzimatic continu prin imobilizarea enzimelor a fost aplicat n producerea L-tirozinei cu -tirozinaz i a triptofanului cu triptofanaz, pornind de la indol, piruvat i sruri de amoniu. O surs de triptofanaz 36

poate fi lizatul brut de E .coli, la care s-a indus sinteza acestei enzime. Sinteza continu a fost realizat prin ncorporarea enzimelor n gel de poliacrilamid. Imobilizarea asigur sinteza continu a aminoacizilor i reciclarea amoniului i piruvatului neutilizate, folosite n exces [Deconttignies-Le Marchal i colab., 1979; Fukui i colab., 1974]. Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate n sinteza acidului aspartic [Fusee i colab., 1981; Tosa i colab., 1973]. Aceeai metod de imobilizare a fost folosit i n sinteza alaninei cu celule de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat -carboxilazei [Fusee i Weber, 1984]. Utilizarea de cofactori (NADH, NADPH), costisitori n sintezele enzimatice, nu permite extinderea sintezelor la scar industrial. Acest impediment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate, n care se utilizeaz enzime pentru regenerarea cofactorilor. Astfel, 3-fluoroalanina s-a obinut din 3-fluoropiruvat, reacie catalizat de alanin dehidrogenaz ntr-un sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. Mediul de sintez mai conine formiat de amoniu, ionul de amoniu fiind necesar n reacia de sintez a aminoacidului, iar ionul formiat pentru reacia de regenerare a NADH [Oshima i colab., 1988]. Producerea continu de L-valin folosind valin dehidrogenaza i glucozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiat detailat [Monot i colab., 1988; Honorat-Pascal i colab., 1990]. Honorat i col. [1990] au sintetizat L-alanina i L-valina folosind sistemul cuplat de alanin dehidrogenaz, respectiv valin dehidrogenaz, cu glucozo dehidrogenaz pentru regenerarea NADH. n strategia de sintez s-au utilizat enzime provenite de la un singur microorganism i anume Bacillus megaterium. S-a testat eficiena sintezelor n cazul folosirii lizatelor i a enzimelor purificate. Numai n cazul sintezei alaninei s-a evideniat o cretere a randamentului sintezei de la 80%, n cazul folosirii lizatului brut pn la 92%, n cazul folosirii fraciunilor purificate. Sistemul multienzimatic a fost utilizat i n sinteza L-leucinei din -cetoisocaproat, utiliznd leucin dehidrogenaz de la Bacillus stearothermophilus [Oshima i colab., 1985] i formiat dehidrogenaza de la Candida boidinii, pentru regenerarea NADH [Schtte i colab., 1976]. Utilizarea enzimelor de la microorganismele termofile prezint avantajul c au o stabilitate mai mare. Producerea acidului aspartic la scar industrial s-a realizat enzimatic pornind de la fumarat i sruri de amoniu i utiliznd aspartaza ca i catalizator [Chibata i colab., 1976]. 37

Aminoacid dehidrogenaze Aminoacid dehidrogenazele (EC 1.4.1.X) sunt enzime care fac parte din familia oxidoreductazelor. Aceste enzime catalizeaz eliminarea gruprii amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunztori, n prezen de NAD(P)+. Aminoacid + NAD+ + H2O -cetoacid + NADH + H+ + NH3 Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru -aminoacizi, dar exist i cteva enzime care reacioneaz i cu aminoacizii . Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au importan industrial (fenilalanin-, leucin-, alanin-, valin- i glutamat dehidrogenaza). Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate n vederea utilizrii lor n diverse ramuri industriale. Ele au fost folosite la construirea biosenzorilor, care pot s monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma sanguin, caracteristic n unele patologii. Aceste enzime au ntrebuinare i n sinteza industrial de aminoacizi. Deoarece ele acioneaz stereospecific, enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri, aceast caracteristic fiind foarte important pentru industria farmaceutic. Alanin dehidrogenaza Aminarea reductiv a cetoacizilor la L-aminoacizi n procese NAD(P)H-dependente este catalizat de o suprafamilie de enzime omoloage de aminoacid dehidrogenaze, care include fenilalanin dehidrogenaza (PheDH), leucin dehidrogenaza (LeuDH), valin dehidrogenaza (ValDH) i glutamat dehidrogenaza (GluDH). Nu exist asemnri semnificative ntre secvenele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) i membrii acestei familii de aminoacid dehidrogenaze, cu excepia domeniului de legare a cofactorului, care este comun pentru toate aceste enzime. Dei realizeaz unul i acelai proces biologic, alanin dehidrogenazele i suprafamilia de aminoacid dehidrogenaze au evoluat separat [Baker i colab., 1998]. Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductaz NAD+ dependent, 1.4.1.1) catalizeaz reversibil reacia de dezaminare a L-alaninei cu formare de piruvat. L-alanina + NAD+ + H2O piruvat + NADH + H+ + NH3 Alanin dehidrogenaza a fost descris de ctre Wiame i Pirard n 1955 [Norbert i colab., 1994]. Aceast enzim a fost purificat i studiat n principal la mai multe specii din genul Bacillus. Enzima are un rol important n furnizarea energiei necesare germinrii sporilor. S-a demonstrat c n lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificulti [Siranosian i colab., 38

1993]. Alanin dehidrogenaza este o enzim oligomeric. Majoritatea enzimelor studiate sunt hexameri, cum ar fi cele de la B. subtilis, B. cereus, B. sphaericus, B. stearothermophilus, Mycobacterium, Thermus, Anabaena. Alanin dehidrogenaza este o enzim NAD+ dependent. Mecanismele cinetice ale AlaDH au fost studiate la mai multe specii. NAD+ se leag naintea piruvatului n reacia de dezaminare oxidativ, iar NADH n reacia de aminare. AlaDH poate utiliza ca substrate n reacia de aminare att piruvatul, ct i 3-hidroxipiruvatul, cu ultimul reacia fiind mult mai lent. Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus sp DSPM730 care reacioneaz n egal msur cu ambele substrate. Aceast enzim poate fi foarte util n sinteza de L-serin din 3-hidroxipiruvat [Nagata i colab., 1989]. Lizina din poziia 74 din secvena de aminoacizi a AlaDH de la B. subtilis este esenial n cataliz i este conservat i la alte alanin dehidrogenaze. Aminoacizii din vecintatea acestei lizine prezint o regiune conservat, dar care nu este specific altor aminoacid dehidrogenaze. [Delforge i colab., 1997]. Leucin dehidrogenaza Leucin dehidrogenaza (EC 1.4.1.9) (LeuDH) este o oxidoreductaz NAD+-dependent, care catalizeaz reversibil dezaminarea L-leucinei i a unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunztori. Leucina + NAD+ + H2O -cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+ Echilbrul reaciei este deplasat spre formarea aminoacidului. Ca i majoritatea aminoacid dehidrogenazelor, LeuDH intervine n catabolismul unor aminoacizi. Leucin dehidrogenazele studiate provin n mare parte de la genul Bacillus precum i de la Thermoactinomyces [Ohshima i colab., 1994], Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh i colab., 2003]. O mare atenie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la microorganisme mezotermofile, deoarece sunt mai stabile. Una din aceste enzime este cea de la B. stearothermophilus, a crei gen codificatoare a fost clonat, iar proteina exprimat n celule de E. coli. [Nagata i colab., 1988]. Diferenele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. coli i proteina recombinat de LeuDH permit purificarea acesteia ntr-o singur etap, prin denaturare termic. Enzima nu-i pierde activitatea dup incubare timp de 30 min la 70C [Oka i colab., 1989]. Enzimele termostabile nu prezint numai avantajul termostabilitii, fiind, n general, stabile i la ali factori care afecteaz proteinele, cum ar fi enzime proteolitice, solveni organici, detergeni, mediu acid sau alcalin. Aspartat amoniu-liaza L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4.3.1.1) catalizeaz reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat i NH4+. Aceast 39

enzim joac un rol important n metabolsimul azotului la bacterii. Majoritatea aspartazelor studiate au masa molecular n jur de 200 kDa i sunt alctuite din patru monomeri identici, de circa 50 kDa. Enzima este activat n prezen de ioni de Mg2+ la un pH alcalin; la pH mai mic ea nu necesit ioni de metal [Karsten i Viola, 1991]. Metode Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin metoda PCR utiliznd amorse specifice. n secvena amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricie necesare inserrii genei n vectorul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codific leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza i aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la inducere cu IPTG. Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu enzimele de restricie corespunztoare (Tabel 1). Vectorii de exprimare au fost digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii PCR i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.Tabelul 1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor.Enzima AlaDH Q08352 LeuDH P13154 ALL (P0AC38) Amorsele utilizate 5-GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3 5-GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3 5-GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3 5-TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3 5' GGTAGGATCCGATGTCAAACAACATTCGTATCG 3' 5' GCTACTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA 3' Escherichia coli Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus Organism surs Enzime de restricie BamHI XhoI BamHI XhoI NdeI BamHI NdeI BamHI NdeI BamHI Vector utilizat pET21b

pET21b

pET21b

5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3' GalM Escherichia coli (P0A9C3) 5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3' GlucDH P12310 5-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3 5-CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3 Bacillus subtilis

pET24a

pET24a

Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inserarea genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a 40

reface legturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate dup ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherchia coli DH5. Secvenele genelor clonate au fost verificate prin secvenializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utiliznd kitul de secvenializare BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherichia coli BL21(DE3). Pentru obinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0,5-1L). Dup ce densitatea optic (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil- D-tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM. Dup cteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate i pstrate la -80C pn la utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri i timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu att mai valoros cu ct implic mai puine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate n tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereii celulelor bacteriene au fost distruse prin sonicare. Dup sonicare extractul bacterian a fost centrifugat (20 min la 21 000 g la 4C), iar supernatantul cu proteinele solubile a fost utilizat pentru msurarea activitii enzimatice. Analiza exprimrii genelor i sintezei de proteine recombinate n celulele de E. coli a fost urmrit cu ajutorul electroforezei n gel de poliacrilamid n condiii denaturante n prezen de SDS (Figura 1).AlaDH1 2 394 67 43

LeuDH1 2 3

AAL1 94 67 43 54 2

42

94 67 43

42

30 20,1 14,4

30 20,1 14,4

30 20,1

Figura 1. Sinteza de proteine recombinate n celulele gazd de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum i masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportat la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene.

41

Msurarea activitii enzimatice a enzimelor Msurtorile de activitate enzimatic a dehidrogenazelor s-au efectuat la 30C cu un spectrofotometru Jasco V-530 urmrindu-se scderea absorbanei NADH (reacia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestuia (reacia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La aceast lungime de und NADH prezint maximul de absorban i are un coeficient molar de extincie de 6,22 103 M-1 cm-1. Activitatea enzimatic s-a calculat dup formula: A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min variaia densitii optice pe minut la 340 nm Vr volumul reaciei Vp volumul probei FD factorul de diluie O unitate enzimatic (1U) corespunde formrii unui mol de produs ntr-un minut. Mediile de reacie pentru enzime au fost urmtoarele: a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH 0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-leucin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-alanin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 d) GalM (galacto mutarotaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0 f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris HCl 50 mM pH8,5, MgCl2 6 mM Pentru msurarea activitii enzimatice a aspartzei s-a urmrit formarea acidului fumaric la 240 nm, care are un coeficient molar de extincie la aceas lungime de und egal cu 2,54 103 M-1 cm-1. Pentru msurarea activitii enzimatice s-au folosit civa l de enzim purificat sau extract brut bacterian, astfel nct valorile DO/min s fie cuprinse ntre 0,05 i 0,3. S-a ales poriunea dreptei cu activitatea cea mai mare. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Mediul de reacie pentru sintezele de aminoacizi marcai cu 15N a coninut: 42

cetoacid 100 mM 15NH4Cl 100 mM NADH 1 mM glucoz 670 mM Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia s-a declanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai au fost efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Aceast metod const n formarea unui compus de culoare, la interaciunea ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au preparat dup urmtoarea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori, 200 l de fenolnitroprusiat, 200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap. Developarea culorii s-a fcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100C. S-a msurat absorbana la 623 nm. nainte de declanarea sintezelor s-a preluat o prob care a servit la alctuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr clorur de amoniu (din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 2 este prezentat curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionin. Pe baza curbelor etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez. Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15 min la 85C.y = 0.068852 + 0.013334x R= 0.99935 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120

DO

623nm

NH Cl (% )4

Figura 2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionin.

Purificarea aminoacizilor sintetizai Aminoacizii sintetizai au fost purificai pe o coloan cu rin schimbtoare de ioni Dowex 50W x 8, n forma H+. Activarea umpluturii s-a fcut prin tratare cu HCl 2N, dup care s-a splat pn la un pH neutru. Amestecul de sintez filtrat s-a ncrcat pe coloan i apoi s-a splat cu ap (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH 1M. Controlul elurii s-a fcut cu ninhidrin pentru aminoacizi. Fraciunea cu aminoacid s-a concentrat pe 43

baia de ap, dup care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat peste noapte, iar precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, aminoacizii astfel obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i concentraiei izotopice. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a aminoacizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie. Derivatizarea, care trebuie facut la ambele funciuni polare ale moleculei de aminoacid, la carboxil i amin, s-a facut prin sililare, utiliznd metoda Das Neves i Vasconcelos, care introduce la fiecare funciune polar din molecul cte o grupare ter-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul c, datorit substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o singur grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut utiliznd ca reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) n calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un coninut de 1% ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator. Derivatizarea s-a fcut pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de prob, cu 150 l de acetonitril ca solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la 120C timp de 20 minute. Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form de TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur programat ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub form de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare parte sub form de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fiecrui aminoacid. Prin ruperea n diferite poziii din gruparea tert-butildimetilsilil se formeaz ioni cu masele M-43, M-57 i M-85, iar prin ruperea legturii dintre carboxil i atomul de carbon alfa, adiacent, ia natere un fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru de mas cuadrupolar HP 5985. Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor aminai cu izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste metode prezint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantiti mari de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape de sintez, obinerea racemicului. 44

Folosirea enzimelor n sinteze de aminoacizi marcai cu izotopi stabili prezint mai multe avantaje fa de metodele chimice, datorit faptului c decurg stereoselectiv i au randamente superioare. O metod relativ simpl i mai utilizat pentru obinerea de aminoacizi marcai cu 15N este sinteza enzimatic pornind de la cetoacizi i sruri de amoniu (15N). Reaciile de sintez sunt cuplate cu reacii de regenerare a cofactorilor costisitori. Majoritatea enzimelor utilizate n sinteza diverilor compui necesit coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preului mare a acestora utilizarea lor n cantiti stoichiometrice nu este eficient. Pentru a evita acest fenomen exist cteva ci de regenerare continu a coenzimelor pe parcursul sintezelor: regenerarea n vivo, cu utilizare de celule n cretere. Aceast metod prezint dezavantajul manipulrii laborioase a celulelor i caracterul enantioselectiv sczut al reaciei; regenerarea enzimatic n vitro, cele mai utilizate enzime pentru regenerarea coenzimelor n sinteze fiind alcool dehidrogenaza i formiat dehidrogenaza (Hummel i Kula, 1989); regenerarea electrochimic, care const n oxidarea unui mediator i transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al metodei l prezint specificitatea i viteza de regenerare reduse. Modalitatea cea mai eficient pentru regenerarea coenzimelor rmne metoda enzimatic. Sursele enzimelor utilizate n regenerarea coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizat n regenerarea att a NAD ct i a NADP pentru producerea de hidromorfon [Boonstra i colab., 2000]. Schema de sintez a aminocizilor marcai cu 15N utilizat n prezenta lucrare este reprezentat n Figura 3.15NH4Cl

Cetoacid

NADH AADH

Acid gluconic GDH GalM -glucoz -glucoz

L-(15N)aminoacid

NAD+

Figura 3. Schema de sintez a acizilor aminai cu 15N. AADH aminoacid dehidrogenz

Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl i cetoacizii corespunztori. Sinteza de aminoa45

cizi a fost cuplat cu reacia catalizat de glucozo-dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la regenerarea NADH, utiliznd ca substrat glucoza cu formare de acid gluconic. n unele sinteze s-a folosit galactozo-mutarotaza pentru transformarea -glucozei n -glucoz. Enzimele utilizate n sintezele de aminoacizi marcai nu au fost purificate. Enzimele recombinate, exprimate n celule de E. coli, reprezint aproximativ 50% din proteinele totale existente n lizatul bacterian. Purificarea acestora este o etap suplimentar care, n general, nu conduce la mrirea randamentului reaciei. Honorat i colab. [1990] au testat sinteza de L-alanin i L-valin cu enzime (alanin dehidrogenaz i valin dehidrogenaz) purificate i n lizat bacterian. Acest fapt nu a influenat randamentul sintezelor. Sinteza de [15N] L-Ala Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0. Reacia s-a declanat la adugarea enzimelor (115 U de leucin dehidrogenaz i 60 U de glucozo-dehidrogenaz). Pe tot parcursul sintezei alaninei s-a urmrit consumarea clorurii de amoniu prin metoda Berthelot (Figura 4 A) care este o metod colorimetric foarte sensibil de dozare a amoniacului. Dup purificarea aminoacidului randamentul sintezei a fost de 60%.

Figura 4. Sinteza de [15N]-alanin. (A) Consumul. 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-alanin. Sinteza de L-alanin marcat cu 15N s-a realizat pentru o cantitate de 8 mmol. Mediul de reacie utilizat a coninut: piruvat de Na 150 mM, 15NH4Cl 130 mM, NADH 1 mM, glucoz 670 mM. (B) Spectrul de mas al [15N]-Alaninei. DMTBS derivat, M = 318, cca 97 atom % 15N

NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Activitatea alanin dehidrogenazei din B. subtilis este inhibat de piruvat, constanta de inhibiie calculat de noi Ki=4,25 mM. Astfel, la concentraii mari de substrat activitatea enzimei este redus. O soluie n acest 46

caz ar fi declanarea reaciei de sintez cu cantiti mai mari de enzim. O alt soluie poate fi adugarea piruvatului n mai multe etape. n ambele cazuri este necesar o urmrire minuioas a consumului clorurii de amoniu. Masa molecular a alaninei fr marcare izotopic este 317. Masele fragmentelor ion ale alaninei cu coninut izotopic natural sunt m/z 274, 260, 232 i 158. Analiza spectrelor de mas a artat prezena fragmentelor ion cu o unitate mai mult dect cele menionate mai sus, ceea ce demonstreaz marcarea alaninei nu 15N (Figura 4 B). Sinteza de [15N]-L-Leu Leucin dehidrogenazele au specificitate pentru un numr mai mare de cetoacizi. Enzima are cea mai mare specificitate de substrat pentru acidul -cetoisovaleric. Specificitile de substrat ale leucin dehidrogenazei native din B. stearothermophilus sunt prezentate n Tabelul 2.Tabelul 2. Activitatea specific (U/mg de protein) a LeuDH din B. stearothermophilus n prezena diferiilor -cetoacizi -cetoacid Acid -cetoisovaleric Acid ceto--metilvaleric Acid -cetoizocaproic Acid -cetocaproic Acid -ceto--metiltiobutiric Acid -cetobutiric LeuDH429 168 (100) 46,5 (28) 36,8 (22) 17,4 (10) 7,8 (4,6) 4,7 (2,8)

Activitatea enzimatic a fost determinat la 30C n tampon Tris-HCl 50 mM, -cetoacid 10 mM, NH4Cl 1M i NADH 0,15 mM, pH 8,0. ntre paranteze este exprimat activitatea procentual considernd rezultatul obinut cu acid -cetoisovaleric ca 100%.

De aceste valori ale activitii enzimatice s-a inut cont n sintezele de aminoacizi marcai cu izotopul stabil al 15N. n sintezele de aminoacizi la care enzima are o specificitate mai mic pentru precursorul acestora, a fost necesar o cantitate mai mare de enzim. Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-leucin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 5 A). n cazul leucinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru leucin fr marcare izotopic la azot este M=359. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale leucinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 316, 302, 274, i respectiv 200. n cazul aminoacizilor mar47

cai cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas (Figura 5 B).

Figura 5. Sinteza de [15N]-leucin (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-leucin. (B) Spectrul de mas al [15N]-Leucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,2 mmol. Sinteza s-a declanat cu 205 U de leucin dehidrogenaz i 110 U de glucozo dehidrogenaz.

Sinteza de [15N]-L-Val Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-valin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).

Figura 6. Sinteza de [15N]-valin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-valin. (B) Spectrul de mas al [15N]-valinei. DMTBS derivat, M = 346, cca 97 atom % 15N

NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto isovaleric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,0 mmol. Sinteza s-a declanat cu 200 U de leucin dehidrogenaz i 125 U de glucozo-dehidrogenaz. S-au realizat cteva sinteze, raportul reactan48

ilor i randamentele sintezelor sunt prezentate n Tabelul 3. Cel mai mare randament s-a constatat n cazul sintezei de 12 mmol. Tabelul 3. Sinteze de [15N]-L-valinReactani (mmol) Acid cetoisovaleric 3,0 8,0 12,015NH 4Cl

3,0 8,0 12,0

Randamentul sintezei (%) 79 86 92

Viteza de reacie este, i deci i consumul de clorur de amoniu este foarte mare n primele minute de sintez. Astfel, dup 10 min s-a consumat 50% clorur de amoniu. n continuare viteza reaciei a sczut. Scderea vitezei de reacie se poate explica prin scderea concentraiei substratelor, viteza reaciei fiind direct proporional cu concentraia de substrat pn la anumite valori; acumularea de produi de sintez care pot inhiba activitatea enzimelor. n cazul valinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru valina fr marcare izotopic la azot este M=345 . Masele caracteristice ale ionilor fragment a valinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 302, 288, 260 i respective 186, iar n cazul valinei marcate cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Spectrul de mas al valinei marcate isotopic este prezentat n Figura 6 B. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena valinei marcate cu 15N n produsul reaciei enzimatice. Sinteza de [15N]-L-Met Mediul de reacie pentru sinteza de 15N-metionin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 7 A). Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul -ceto--metiltiobutiric este aproximativ 8 U/mg protein. Din aceast cauz a fost nevoie de o cantitate mai mare de protein. Viteza reaciei a sczut foarte mult dup primele 10 min cnd s-au consumat 50% din substrate (Figura 7 A). Viteza a sczut mult dup nc 10 min (n primele 20 min ale sintezei s-au consumat 80% clorur de amoniu). Pentru consumarea celorlalte 20% NH4Cl au fost necesare 100 min. Dup purificarea aminoacidului s-a constatat un randament al sintezei de 94%. Masa molecular a metioninei derivatizat cu dou grupri silil este de 377. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale metioninei fr marcare izotopic au valorile m/z 320, 292, i 218. n cazul metioninei marcate cu 15N, att masa molecular ct i 49

masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas. Spectrul de mas al metioninei marcate isotopic este prezentat n Figura 7 B. Datele spectrometrice de mas obinute confirm pe deplin prezena metioninei marcate cu 15N n produsul sintezei enzimatice.

Figura 7. Sinteza de [15N]-metionin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-metionin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto--metiltiobutiric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5,8 mmol. Sinteza s-a declanat cu 200 U de leucin dehidrogenaz i 125 U de glucozo dehidrogenaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-metioninei. DMTBS derivat, M = 378, cca 97 atom % 15N

Sinteza de [15N]-L-NorLeu Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-norleucin s-a realizat cu reactivii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode.100

A

100 90 80 70 60

73

201

B

80 NH Cl (%)

60

I, %

50 40 30 20 10 0

4

40

57

75

147 133

275 303

15

20

346 0 50 100 150 200 m/z 250 300 350 400

0 0 5 10 20 min 30 70 90 120

Figura 8. Sinteza de [15N]-norleucin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-norleucin. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto caproic:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 4,7 mmol. Sinteza s-a declanat cu 106 U de leucin dehidrogenaz i 86 U de glucozo dehidrogenaz i 39 U de galacto mutarotaz. (B) Spectrul de mas al [15N]-norleucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N

50

Activitatea specific relativ a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetocaproic este relativ mic (17,4 U/mg protein). Pe tot parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 8 A). Raportul reactanilor i randamentele sint