NOŢIUNI DE VIRUSOLOGIE GENERALĂ Virus ur ile sunt definite ca forme acel ula re sau subce lulare de via ţă, metabolic inerte şi lipsite de capacitatea de creştere şi multiplicare înafara organismelor vii, fiindparazite obligatoriu intracelular. Virusologia - știinţa care se ocupă cu studiul virusurilor - constituie un domeniu particu lar al microbi ologiei prin specificitatea metodelor de cerceta re, care constau în cultivarea virusurilor pe ţesuturi vii, microscopie electronică, metode chimice şi imunologice proprii. 4.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILORVirusurile prezintă unele particularităţi care le diferenţiază de celelalte microorganisme, şi anume: 1.- dimensiunile foarte reduse, cuprinse între 1şi !nanometri "nm#, care le conferă următoarele p roprietăţi: - nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul electronic$ - traversează fitrele obişnuite, care reţin bacteriile$ -sedimentează numai prin ultracentrifugare "%1tura ții&minut#. 2.- sunt lipsite de metabolism propriu deoarece nu dispun de enzime metabolice şi prin urmare: -nu cresc și nu se divid singure ci sunt replicate de o celulă gazdă "animală, vegetală, fungică, bacterienă#$ - relația cu celulele gazdă este una de parazitismdeoarece virusul deviază metabolismul acestora în sensul sintezei de noi particule virale pe baza rezervelor nutritive și energetice ale celulei. 4.2.FORMELE DE EISTENŢĂ A VIRUSURILOR !N NATURĂ Virusurile pot e'ista în natură sub trei forme biologice, fiecare dintre ele reprezent(nd, în acelaşi timp, un stadiu al ciclului ontogenetic. Vi rusul "o#$l%& '(irio)ul* constituie forma matură, care posedă toate componenetele caracteristice virusului şi toate atributele speciei din care face parte. )l are capacitatea de a rezista un timp limitat înafara celulei sensibile şi
Virusurile sunt definite ca forme acelulare sau subcelulare de viaţă,metabolic inerte şi lipsite de capacitatea de creştere şi multiplicare înafaraorganismelor vii, fiind parazite obligatoriu intracelular .
Virusologia- ș tiinţa care se ocupă cu studiul virusurilor - constituie undomeniu particular al microbiologiei prin specificitatea metodelor de cercetare,care constau în cultivarea virusurilor pe ţesuturi vii, microscopie electronică,metode chimice şi imunologice proprii.
4.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR
Virusurile prezintă unele particularităţi care le diferenţiază de celelaltemicroorganisme, şi anume:
1.- dimensiunile foarte reduse, cuprinse între 1 şi ! nanometri "nm#,care le conferă următoarele proprietăţi:- nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul
electronic$- traversează fitrele obişnuite, care reţin bacteriile$-sedimentează numai prin ultracentrifugare "%1 turaț ii&minut#.
2.- sunt lipsite de metabolism propriu deoarece nu dispun de enzimemetabolice şi prin urmare:
-nu crescș i nu se divid singure ci sunt replicate de o celulă gazdă"animală, vegetală, fungică, bacterienă#$
- relaț ia cu celulele gazdă este una de parazitism deoarece virusuldeviază metabolismul acestora în sensul sintezei de noi particule virale pe baza rezervelor nutritiveș i energetice ale celulei.
4.2.FORMELE DE E ISTENŢĂ A VIRUSURILOR !N NATURĂ
Virusurile pot e'ista în natură sub trei forme biologice, fiecare dintre elereprezent(nd, în acelaşi timp, un stadiu al ciclului ontogenetic.
Virusul "o#$l%& '(irio)ul* constituie forma matură, care posedă toate
componenetele caracteristice virusului şi toate atributele speciei din care face parte. )l are capacitatea de a rezista un timp limitat înafara celulei sensibile şi
este dotat cu infecţiozitate "posibilitatea de a pătrunde într-o celulă gazdăreceptivă, capabilă să-l reproducă# şi patogenitate "capacitatea de a determinamodificări morfologice şi funcţionale echivalente cu starea de boală#.
Virusul (%g%&a&i( reprezintă o formă de e'istenţă intracelulară a
virusului, sub formă de elemente structurale dispersate în citoplasma celulei.*onform informaţiei genetice conţinute în acidul nucleic viral, celula cuaparatul ei enzimatic sintetizează componentele virale care, în urmaansamblării, formează noi virioni. )liberaţi din celula parazitată, aceştia vor pătrunde în alte celule receptive, relu(nd circuitul care asigură conservareavirusului în natură. +n faza de virus vegetativ, dependenţa virusului de celulăeste totală, el fiind incapabil de a supravieţui înafara acesteia.
Virusul i)&%gra& sau $ro(irusul este tot o formă de e'istenţăintracelulară total dependentă de celula gazdă, cu deosebirea că celula parazitată
nu sintetizează material viral. cidul nucleic viral se integrează în genomulcelulei receptive, unde răm(ne în stare ocultă un timp nelimitat, comport(ndu-seca un fragment de material genetic propriu celulei.
ceastă formă de e'istenţă este bine cunoscută la bacteriofagi "virusuricare parazitează bacteriile# şi la virusurile tumorale. Virusul integrat se poatetransforma în virus vegetativ, de obicei sub acţiunea unor factori stresanţi pentrucelulă, în care caz genomul viral se desprinde de cromozomul celulei şi începesă codifice sinteza de material viral, trec(nd în stadiul de virus vegetativ
4.+. MORFOLOGIA ,i STRUCTURA VIRUSURILOR
4.+.1. FORMA ,i DIMENSIUNILEin cauza dimensiunilor reduse ale virusurilor, morfologiaș i structura lor
pot fi e'aminate numai prin microscopia electronică a secț iunilor ultrafineș i prin difracț ia razelor . Virusurile se prezintă într-o gamă foarte variată deforme, în funcţie de specie: bastonaş drept, filament pliat, icosaedru, corpusculsferic, cărămidă cu colţurile rotun/ite, ghiulea, spermatozoid etc. "fig.0 #.
+n general:- forma rotun/ită "corpusculară# este specifică virusurilor patogene pentru
animale " zoovirusuri #$- forma alungită, virusurilor patogene pentru plante " fitovirusuri # şi
insecte$- forma spermatozoidică, virusurilor patogene pentru bacterii
"bacteriofagi #.imensiunile virusurilor diferă de la o specie la alta, fiind cuprinse între
1 -0 nanometri la virusurile mici "e'. virusul febrei aftoase# şi ! -!nanometri la virusurile mari "e'. virusurile variolice#.
Fig. 2- R%$r% %)&ar%a s"/%#a&i"0 a or#%lor ,i i#%)siu)ilor"o#$ara&i(% al% $ri)"i$al%lor gru$%ș i a#ilii % (irusuri.
4.+.2. STRUCTURA VIRUSURILOR
Virusurile complete "virionii# sunt formate dintr-un singur acid nucleic 2 ADN sau ARN -,care constituie genomul viral şi un înveliş proteic în contactdirect cu acidul nucleic numitcapsidă , form(nd împreunănucleocapsida.
3a unele virusuri, nucleocapsida este încon/utată de un învelişsuplimentar numit
pericapsidă (anvelopă, peplos#, prevăzut cu o serie de
Fig.23 S&ru"&ura g%)%ral0 a (irusurilor "555.anisn.it&omodeo&omodeo&virus.htm#.
4.+.2.1 G%)o#ul (iral
6enomul viral este reprezenrat de acidul nucleic viral. +n funcţie denatura acestuia, virusurile se împart înribovirusuri "virusuri cu 78# şidezoxiribovirusuri "virusuri cu 8#. 3a virusurile fitopatogene "patogene pentru plante# acidul nucleic este întotdeauna 78, în timp ce la virusurilezoopatogene şi bacteriofage, poate fi 8 sau 78.
*onfiguraț ia acizilor nucleici virali poate filineară sau circulară iar structura, în funcţie de numărul lanţurilor dincare este constituită molecula,monocatenară sau dublu "a&%)ar0. e regulă, dezo'iribovirusurile au omoleculă unică de 8 dublu catenar circular iar ribovirusurile, 78
monocatenar linear divizat în segmente separate "9 ; *ș i col., 0 !#.6enomul viral conţine între ! şi 0 de gene şi este componenta esenţialăa virusului, deoarece poartă informaţia genetică necesară pentru propria sareplicare ș i pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul sintezeicelorlalț i constituienț i ai particulei virale.
Ribovirusurile constituie un unicat în biologie, în ce priveşte posibilitatea păstrării informaţiei genetice de către ARN.
<asa moleculară a genomului reprezintă -! = din masa totală avirionuluiș i este constantă pentru fiecare specie, constituind unul din criteriileta'onomice aplicate în clasificarea virusurilor.
CA SIDA+nvelişul e'tern, prezent la toate virusurile, se numeştecapsidă "gr.
>apsa?cutie# şi este format din mai multe subunităţi de natură proteică identice,numitecapsomere"gr. >apsa@meros?părţi ale cutiei#.
*apsomerele sunt riguros aran/ate, conform unei arhitecturicristalografice, numărul şi simetria lor fiind bine definite pentru fiecare virus în parte.
Ae cunosc trei tipuri principale de simetrie a capsidei virale.
. !apsida cu simetrie icosaedrică sau cubică dispusă în /urul genomului"acidului nucleic viral# pliat sub formă de ghem. ;cosaedrul, prin cele 0 de fețeîn formă de triunghiuri echilaterale, 10 v(rfuriș i ! de muchii reprezintă formaideală de dispunere a capsomerelor deoarece asigură minimum de material pentru ma'imum de volum.
)l are trei tipuri de a'e de simetrie rotaț ională 2 a'e în /urul cărora, prinrotaț ie completă, va avea 0, !, respectiv poziț ii identice "fig. 0B# :
- a'e de tip 0 care unesc două laturi opuse e'act la /umătatea acestora$- a'e de tip ! care trec prin punctele centrale a două fețe triunghiulare
opuse$- a'e de tip care traversează fiecare două unghiuri opuse.
ispunerea capsomerelor în structura capsidei icosaedrice este
următoarea: fețele ș i laturile sunt formate din"exone sau "examere"capsomere formate din C monomere sau molecule proteice, încon/urate de C
3a unele virusuri, e'terior capsidei se găseşte un înveliş suplimentar,nimit pericapsidă, anvelopă, sau peplos "fig.0#. Eericapsida derivă dinmembrana celulei gazdă$ în cursul maturării, virionii ,,înmugurescF prinmembrana celulară pregătită în prealabil prin inser ț ia de glicoproteine viruscodificate. ceste proteine vor proemina sub formă de spiculi pe suprafațaanvelopei av(nd, după caz, funcț ie de liganzi "e'. hemaglutininele#, mai rar deenzime "e'. neuraminidaza# sau factori de fuziune a membranelor citoplasmatice. Virusurile lipsite de pericapsidă se numesc(irusuri )u %.
*apsida împreună cu pericapsida prote/ează genomul viral de acţiuneafactorilor de mediu şi asigură fi'area virionului de receptorii celulei gazdă
4.4 MULTI LICAREA VIRUSURILOR <OO ATOGENE
Virusurile sunt cele mai mici structuri biologice care dispun de toatăinformaț ia genetică necesară pentru propria lor reproducere.
Eentru virusuri, termenul demultiplicare nu reflectă întocmai realitateafenomenelor care au loc în celula gazdă. +n interiorul acesteiavirusurile nu semultiplică ci sunt sintetizate de celulă prin activitatea metabolică a acesteiaredirecț ionată, în urma substituirii informaţiei genetice a celulei cu cea avirusului, către necesităț ile replicative ale acestuia. cidul nucleic viral deț ineinformaț ia necesară pentru a diri/a propria sa replicare, sinteza proteinelor
virale ș i inhibarea biosintezelor celulare normale "uneori - în infecț iileendosimbionte produse de leucovirusuri, virusul sarcomului lui 7ous - se
stabileș te un echilibru virus&gazdă astfel înc(t, at(t genomul viral c(tș i cel alcelulei codifică simultan sinteza de proteine#.
*omponentele particulei virale se constituie pe seama rezervelor energetice şi nutritive "aminoacizi, nucleotide# ale celulei parazitate.
<ultiplicarea virusurilor implică următoarele etape succesive:adsorbț ia ș i penetrarea virionilor în celulă,decapsidarea cu eliberarea intracelulară agenomului viral,replicarea propriu%zisă, morfogeneza noilor virioni ș ieliberarea acestora din celula gazdă "fig.!!#..
Fig. ++ E&a$%l% r%$li"0rii (irusurilor a)i#al%
1. A sor6=ia sau i>ar%a (irio)ilor $% "%lul0upă o serie de ciocniri înt(mplătoare ale virusurilor cu celulele animale
ș i după o fază de adsorbț ie nespecifică reversibilă, urmează faza deadsorbț ieireversibilă la nivelul unor receptori celulari specifici. ceș tia suntreprezentaț i de grupările chimice ale membranei celulare, complementare subaspect stereo, electrostatic şi geometric cu capsida sau pericapsida virionului.Apecificitatea de receptor e'plică tropismul celular, tisularș i de organ al unor virusuri: virusul rabic se fi'ează pe receptorii pentru acetilcolină, virusurilegripale pe glicoproteinele care conț in acid sialicș i care sunt complementareneuraminidazei "enzima din pericapsida acestor virusuri#, virusul poliomielitei, pe receptorii de pe enterociteș i neuronii sistemului nervos central etc.
dsorbț ia poate fi oprită prin blocarea receptorilor în urma acț iunii unor factori fizici, chimici sau biologici. Virionul rămas e'tracelular este repededistrus de factorii de apărare ai organismului.
2. 0&ru) %r%a (irio)ului ?) "%lul0.
upă fi'are, pătrunderea virusurile nude prin membrana celulară serealizează printr-un proces activ de încorporare din partea celulei, numitviropexie. <embrana celulară se invaginează şi se ad(nceşte progresiv îndreptul virionului p(nă c(nd acesta este complet înglobat în celulă. Virusul pătruns în celulă se află inclus într-o vacuolă delimitată de membrana celularăinvaginată "endozom#, care se dezintegrează treptat.
3a virusurile cu anvelopă, de regulă, are loc fuziunea acesteia cumembrana citoplasmaticăș i eliberarea nucleocapsidei direct în citoplasmă.
Apre deosebire de virusurile zoopatogene şi fitopatogene, care pătrund în
întregime în celula sensibilă, la bacteriofagi capsida răm(ne înafara celulei, încare este introdus numai genomul după o prealabilă decapsidare.+. D%"a$si ar%a
upă pătrunderea în celulă are loc mai înt(i decapsidarea virusurilor subacţiunea unor enzime produse de celula gazdă sub determinismul genomuluiviral.
in momentul decapsidării p(nă în momentul apariț iei noilor virioni,virusul se află în stare vegetativă "subunităţi dispersate în citoplasmă# fiindcomplet dependent de celula gazdăș i lipsit de infecț iozitate. cest interval dinreplicarea virusurilor poartă denumirea de perioadă de eclipsă deoarecevirusurile, lipsite de identitate morfologică, nu sunt evidenț iabile prin mi/loaceelectronooptice.
Erimele trei etape ale replicării virale sunt relativ ineficiente deoarece:- rata fi'ării "eficiența coliziunilor# este redusă "!- ' 1-D#,raportată la
multitudinea de particule virale care pătrund în organism$- nucleocapsidele nu sunt eliberate uneori din endozomi$- genomurile virale sunt atacate de endonucleazele celulei gazdă.+n acest conte't, raportul dintre numărul virionilor adsorbiț i ș i al celor
efectiv replicaț i de celulele receptive este subunitar.4. R%$li"ar%a $ro$riu@ is0"Ainteza componentelor virale#.Virusurile 78 sunt replicate în citoplasmă, cu e'cepț ia virusurilor
gripale la care unele faze ale procesului replicativ se desfăș oară in nucleu.Virusurile 8 sunt replicate în nucleu, cu e'cepț ia po'virusurilor al căror genom este replicat în citoplasmă.
3a scurt timp după pătrunderea în celulă, acidul nucleic viral antrenat lalocul replicării îşi preia atributele de material genetic autonom, program(nd şidiri/(nd sinteza componentelor virale care include:replicarea genomului viral ,sinteza ARN m viral ș i sintezele proteice.
R%$li"ar%a g%)o#ului este controlată de polimeraze "enzime ale celuleigazdă sau incluse în nucleocapsida virală#ș i are loc în mod diferit în funcţie de
structura mono- sau dublu catenară a acidului nucleic: de regulă, replicaresemiconservativă la 8ș i 78 dublu catenar ș i replicare mai înt(icomplementarăș i apoi semiconservativă c(nd acizii nucleici sunt monocatenari.
Si)&% a $ro&%i)%lor (iral%
Erin mecanisme incomplet elucidate, genomul viral scoate din funcţie8 celular astfel înc(t în celulă este prezent numai 78m transcris de pegenomul viral, care va transmite la nivelul ribozomilor un mesa/ genetic nou,oblig(nd celula să sintetizeze proteine virale în locul enzimelor şi al celorlalte proteine proprii.
Ainteza proteinelor virale are loc la cele mai multe virusuri "în principal,virusurile 8# în două faze: precoceș i tardivă.
& 'aza precoce debutează imediat după infectarea celulei. Eroteineletimpurii au rolul de enzime, fiind implicate în sinteza 8 sau 78 viralș i a
unor precursori ai proteinelor virale structurale precumș i în inhibarea sintezelor proprii celulei gazdă.#& 'aza tardivăcorespunde sintezei proteinelor virale structurale. )a se
declanș ează în momentul c(nd, în urma replicării 8 s-a a/uns la un anumitnumăr de genomuri virale, genele precoce fiind, de regulă, inhibate.
Ae pare că la virusurile 78 sinteza proteinelor enzimaticeș i a celor structurale se desfăș oară simultan.
-. Mor og%)% a (irio)ilor $rog%)i"nou formaț i#3a sf(rşitul fazei de biosinteză, c(nd în celulă s-au acumulat cantităţi mari
de acid nucleic şi proteine virale, are loc asamblarea virionilor progeni. 3avirusurile mici, aşezarea capsomerelor în /urul genomurilor virale"încapsidarea#, se petrece spontan printr-un proces de autoasamblare. 3a celemai multe virusuri, asamblarea implică însă intervenţia unor enzime. +ntresinteza proteinelor capsidale şi apariţia lor în structura virionilor nou formaţie'istă un interval de apro'imativ 0 de minute.
<orfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru virusurile 78 încitoplasmă, iar pentru virusurile 8, intranuclear, după migrarea materialuluiviral din citoplasmă în nucleul celulei gazdă.
*omponentele virale acumulate în e'ces pot genera incluzii celularevirale "9uiuc ., 0 !#.
8. Eli6%rar%a (irio)ilor i) "%lul0Virionii nou formaţi pot fi eliberaţi din celulă prin mai multe mecanisme.
& nmugurirea sau bur)eonarea este modalitatea de eliberare avirusurilor cu anvelopă.
+ntr-o primă fază, virionii nou asamblaţi sunt incluşi în nişte vezicule"cisterne# care se ataşează de faţa internă a membranei celulare pe care o bombează, proemin(nd asemănător unor muguri. lterior, virusurile sedetaşează de celulă prin mici aperturi care apar în membrană.
#& *iza celulei gazdă sub acţiunea unor enzime sintetizate de celulă înultima fază a morfogenezei virionilor. cest mecanism, caracteristic
% virusuri epiteliotrope (dermatotrope#, care au afinitate pentru piele şimucoase "e'. virusurile variolice , virusul febrei aftoase, virusurile herpetice#$
% virusuri neurotrope, cu afinitate pentru ţesutul nervos "e'. virusul rabic,virusul poliomielitei#$
% virusuri organotrope (viscerotrope&, cu afinitate pentru anumite organeinterne, care, la r(ndul lor, pot fi clasificate în: pneumotrope "e'. virusurilegripale, virusul /igodiei#, enterotrope "e'. virusul diareei virale 2 boliimucoaselor#$ hepatotrope "virusurile hepatitelor#$
% virusuri pantrope (mezenc"imotrope&, cu afinitate pentru toatețesuturile şi organele bogate în celule mezenchimale."e'. virusurile pestelor ladiferite specii animale#.
!itotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite celule dincadrul aceluiaşi ţesut. Virusul rabic, de e'emplu se multiplică de preferinţă în
neuronii piramidali din cornul lui mon, iar virusul poliomielitei, în neuroniimotori din coarnele anterioare ale măduvei spinării.4.-.2. TI URI DE INFECŢIE VIRALĂ
Virusurile pătrunse în organism determină din partea gazdei reacț ii derăspuns numite genericinfecț ii virale sau viroze, care pot evolua diferit din punct de vedere clinic.
./nfecţiile virale acute (manifeste clinic& apar atunci c(nd multiplicareavirusului în organism determină modificări morfologiceș i funcț ionale care semanifestată prin semne clinice evidente, corespunzătoare stării de boală.
6ravitatea bolii virale clinice este condiţionată de o serie de factori ca:numărul de virioni infectanţi, rezistenţa generală a organismului, v(rsta, se'ul,alimentaţia, igiena, etc.
n aspect particular al patogenezei infecț iei virale îl constituie asociereasinergică virus-bacterie. ceastă asociere este frecvent înt(lnită în virozelerespiratorii, în care leziunile produse de virus constituie por ț i de intrare pentru bacteriile oportuniste prezente în mod normal pe mucoasele căilor respiratoriianterioare.
#. /nfecţiile virale persistente, inaparente clinic+n unele infecț ii virale, după un episod acut sau chiar în lipsa acestuia,
virusurile pot răm(ne în organismul animal, perioade lungi de timp, chiar toatăviața, duc(nd la instalarea infecț iilor persistente. cestea se caracterizează prinlipsa semnelor cliniceș i pot fil%)&%, "ro)i"%sau la&%)&%.
/nfecț iile lente se caracterizează printr-o perioadă lungă de incubaț ie "anide zile# ca urmare a stabilirii unui echilibru între virusș i organismul gazdă.
cest tip de infecţie se înt(lneşte în anemia infecţioasă a calului, leucozeleaviare şi mamifere, sindromul imunodeficienței umane "A; #ș .a. nii factoride mediu "radiaţiile, temperatura, umezeala etc.#, sau factori interni "infecţiiintercurente, stimuli endocrini# pot determina ruperea acestui echilibru, careeste urmată de replicarea virusuluiș i instalarea bolii clinice.
n infecț iile cronice, după un episod acut, virusul infectează organismulîn mod cronic, adică pentru o lungă perioadă de timp în care simptomele lipsescsau sunt slab e'primate deș i infecț ia evoluează. )'emplul tipic de infecț iecronică evolutivă îl constituie hepatitele umane cu virus 9ș i * .
n infecț iile latente,cum sunt cele produse de virusurile herpetice"virusul Herpes simplex , virusul varicela-zoster #, genomul viral se inseră îngenomul anumitor celule unde răm(ne în stare ocultă o perioadă nelimitată. +nacest timp, virusul nu este multiplicat iar prezența lui în organism este lipsită dee'presie clinică. Hcazional, în situaț ii stresante care induc imunosupresie darș iîn condiț ii necunoscute, aceste infecț ii se pot activa.
$. /nfecț iile transformantesunt determinate de virusurile oncogene"citochinetice#ș i se caracterizată printr-o multiplicare anarhică a celulelor infectate, cu apariț ia de formaț iuni tumorale.
;poteza originii virale a unor tumori este veche "<ecini>ov şi 9orrel,1D !# iar capacitatea unor virusuri de a produce tumori în condiţii naturale şie'perimentale a fost evidenţiată în anul 1D B de )llerman şi 9ang , care audemonstrat că leucozele aviare pot fi transmise în serie prin filtrate acelulare.
intre virusurile identificate p(nă în prezent la animale, apro'imativ I prezintă potenţialul oncogen.
<ecanismul oncogenezei virale nu este complet elucidat$ se pare căintegrarea unor gene virale în genomul celulei gazdă determină transformăricare duc la pierderea controlului reglator asupra multiplicării celulare şi implicitapariţia de tumori benigne sau maligne.
4.8. CULTIVAREA VIRUSURILOR !N LABORATOR iagnosticul de certitudine în viroze se bazează pe cultivarea, izolareaș i
identificarea virusurilor. in cauza lipsei echipamentului enzimatic, deci a unuimetabolism propriu, virusurile nu pot fi cultivate pe medii artificiale ci numai pe gazde vii: culturi de celule, embrioni de găină, animale de laborator. Eentrureuș ita izolării se vaț ine seama de tropismul virusului a cărui izolare seurmăreș te, adică de prezența celulelor receptive capabile să-l replice.
.0. !ultivarea virusurilor pe cul&uri "%lular%7elaț iile virus-gazdă în infecț ia naturală sau e'perimentală au putut fi
e'plicate în mare parte prin studiul relaț iilor virus-celulă gazdă ,,in vitro" "înculturi de celule#.
*ulturile celulare se obț in din țesuturi sau organe proaspăt prelevate""ul&uril% $ri#ar%#, dințesuturi embrionare "li)iil% % "%lul% i$loi %#ș i dintumori canceroase "li)iil% "%lular% $%r#a)%)&%#.
*ultivarea virusurilor pe linii celulare permanente "denumire atribuitădatorită faptului că pot fi subcultivate indefinit# are avanta/ul că sensibilitateacelulelor respective față de un anumit virus este stabilăș ; cunoscută, iar rezultatele obț inute în diferite laboratoare sunt comparabile. ouă dintre cele
mai utilizate linii celulare permanente sunt linia 1e*a obț inută dintr-uncarcinom de col uterinș i linia 23 din carcinom rinofaringian.
Țesuturile sau organele din care se prepară culturile celulare sunt maiînt(i fragmentate în piese mici, apoi sunt disociate cu tripsină în celule
individuale. cestea se introduc în recipiente de sticlă sau plastic cu mediinutritive speciale "fig.!J#. *elulele aderă la pereț ii interni ai recipientuluiș i semultiplică form(nd un film continuu de cultură "monostrat de celule#- fig.! .*ultura confluentă este inoculată cu suspensia virală obț inută din prelevatele patologice prin omogenizare "pentru eliberarea virusurilor din celule#,centrifugare "pentru îndepărtarea resturilor celulareș i a eventualelor celule bacteriene#ș i tratare cu antibiotice "pentru a preveni creș terea bacteriilorș i afungilor contaminanț i#.
upă o perioadă de incubaț ie, necesară replicării virusului, culturilecelulare sunt e'aminate pentru detectarea prezenței acestuia pe baza efectelor produse asupra celulelor parazitate.
.+fectul citopatic constă într-o serie de modificări morfologice alecelulelor infectate cu virusuri:
- ratatinarea celulelor 2 devierea de la forma normală - "arbovirusuri#$- formarea de sinciț ii "celule gigante cu numeroș i nuclei# prin fuzionarea
celulelor din monostrat "parami'ovirusuri# 2fig.!C$- vacuolizarea citoplasmei "virusurile vacuolizante#$
#. +fectul citoliticeste o formă particulară a efectului citopatic,caracterizat prin liza celulelorș i desprinderea lor de pe suport. Monele de liză,care se pot observa cu ochiul liber fiind distincte de restul filmului celular normal, poartă denumirea de ,,pla)e4.
$. 1emadsorbț ia constă în adsorbț ia hematiilor sau eritrocitelor pesuprafața celuleor din monostrat, care au replicat virusuri prevăzute cuhemaglutinine "virusurile gripale, paragripale#. Nemadsorbț ia poate fi mai precoce dec(t efectul citopaticș i poate să se producă chiar în absența lui.
. 1emaglutinarea este produsă de supernatantulș i omogenatulculturilor celulare infectate cu virusuri posesoare de hemaglutinine, fiindconsecința adsorbț iei virionilor pe suprafața globulelor roș ii, la nivelul cărora produc modificări de natură electrostatică.
;dentificarea acestor virusuri se poate face prin reacț ii serologice deinhibare a hemadsorbț iei sau a hemaglutinării folosind seruri antiviralespecifice. <etoda se bazează pe pierderea capacităț ii de hemadsorbț ie,respectiv, hemaglutinare a virusului izolat, după neutralizarea acestuia cuanticorpi specifici.
5. /nterferenț a virală. nele virusuri "e'., virusul rubeolei#, fără a
produce efect citopatic determină un efect de interferență, astfel înc(t replicarealor în culturi celulare se depistează în mod indirect prin incapacitatea culturilor de a replica un virus cunoscut ca fiind citopatogen.
0. -ransformarea neoplazică"transformarea celulelor normale în celulecanceroase# este efectul multiplicării virusurilor oncogene "e'., virusulsarcomului 7ous#. *elulele transformate au tendința de rotun/ire, metabolismmodificat, se divid anarhic într-un ritm acceleratș i se aglomează în straturisupraeta/ate form(nd tumori miniaturale ca urmare a pierderii inhibiț iei decontact.
+n celulele în care se multiplică un virus apar frecvent structuricorpusculare "acumulări de virioni sau componente virale# de dimensiunivariabile, numite incluzii virale. )le au fost descrise cu mult înainte dedescoperirea virusurilor şi poartă numele celor care le-au observat şi descris
pentru prima dată: incluziile 9abeş-8egri în turbare$ incluziile 9ollinger, învariola aviară$ incluziile 6uarnieri, în infecţiile cu virus vaccinal etc.)videnţierea incluziilor prin coloraţii speciale în preparate histologice,
prin imunofluorescență în amprente de organeș i prin alte tehnici reprezintă ometodă frecvent utilizată în diagnosticul virozelor. Apecificitatea incluziilor pentru un anumit virus este dată de prezenţa lor în ţesutul pentru care virusulmanifestă tropism şi de poziţia lor: în citoplasmă sau în nucleu. 3a noi în ţară, lanivelul laboratoarelor veterinare /udeţene, evidenţierea incluziilor 9abeş-8egriîn neuronii piramidali din cornul lui mmon "fig.!4 ș i 9#, constituie o
metodă curentă în diagnosticul turbării.
9
Fig. +3 I)"lu ii Ba6%,@N%gri 'gra)ul%l% % "uloar% ro * ?) "i&o$las#a)%uro)ilor $ira#i ali i) "or)ul lui A##o) " - 1 '$ 9 2 J '#. *oloaț iahemato'ilină-eozină. "555.pathguO.com&lectures&rabies./pg#
.0.# !ultivarea virusurilor pe embrioni de găinăHul embrionat constituie un mediu optim pentru cultivarea virusurilor
deoarece este constituit dințesuturi în dezvoltare, cu multiplicare activă, estesteril ș i lipsit de mi/loacele de apărare antiinfecț ioasă e'istente la animaleleadulte ";vanof .ș i col. 1DB0#.
+nainte de inoculare ouăle incubate se verifică la ovoscop, în camerăobscură, pentru a le elimina pe cele neembrionate sau cu embrioni mor ț i.Auspensia virală preparată din prelevatele patologice se inoculeazăț in(nd
cont de v(rsta optimă a embrionului "C-1 zile#ș i de calea optimă de inoculare pentru diverse virusuri: pe membrana corioalantoidiană "virusurile herpetice, po'virusurile#, în cavitatea amniotică sau alantoidiană "ortomO'o-ș i paramO'ovirusurile#, în sacul vitelinș i mai rar intavenos sau intracerebral "fig.!B#.
upă J-4 zile de incubare la ! -!4P*, multiplicarea virusului poate
determina moartea embrionului, apariț ia de pustule " pocks # pe membranacorioalantoidă sau acumulare de hemaglutinine în lichidul amniotic saualantoidian
#.0.$ !ultivarea virusurilor pe animale de laborator 3a ora actuală, cultivarea virusurilor pe animalele de laborator este o
metodă la care se apelează numai în cazul unor virusuri care nu se pot izola înalte sisteme celulare "e'., arbovirusurile se izolează peș oricelul nou-născut prininoculare intracerebrală, deoarece culturile celulare sunt mai puț in sensibile#.
Ee l(ngă problema protecț iei animalelor, e'perimentarea pe animale delaborator "ș oareci albi,ș obolani, hamsteri, iepuri etc.# prezintă o serie deinconveniente de ordin practic, cum ar fi specificitatea de gazdă a unor virusuriș i reactivarea unor infecț ii virale latente ale animalelor în cursule'perimentului. ltimul inconvenient poate fi evitat prin utilizarea animalelor g%r# r%%"sterile din punct de vedere microbiologic#.
7eplicarea virusului pe animalele inoculate este atestată de: apariț iasimptomelor caracteristiceș i eventual, moartea acestora$ prezența virusului înorganele sau țesuturile ț intă, evidenț iată prin e'amene histopatologice,activitatea hemaglutinantă a omogenatelor sau prin infecț iozitatea acestora"capacitatea de a transmite boala prin reinoculare#.
*a regulă generală, modificările apărute la gazdele inoculate pentrudetectarea virusurilor "culturi celulare, ouă embrionate, animale de e'periență#dau indicaț ii asupra grupului de virusuri "familie, gen# căruia apar ț ine virusulinoculat, identificarea speciei făc(ndu-se prin reacț ii antigen-anticorp.
4.3 ACŢIUNEA UNOR AGENŢI FI<ICI ,i C IMICI ASU RAVIRUSURILOR
*unoaşterea comportamentului virusurilor faţă de factorii fizici şi chimiciare implicaţii practice at(t pentru identificarea unui virus, c(t şi pentru măsurilede profila'ie nespecifică a bolilor virale.
T%#$%ra&ura+n general, virusurile sunt sensibile la căldură, unele inactiv(ndu-se în
mediul e'tern la temperatura de 0 -00Q*, în decurs de c(teva ore. ;nactivareavirusurilor are loc în ma/oritatea cazurilor la CQ* în ! minute, iar la 1 Q* înc(teva secunde.
Remperatura optimă pentru multiplicarea virusurilor coincide, în mareama/oritate a cazurilor, cu temperatura optimă pentru celula gazdă. e aceeareacţia febrilă a organismului în cursul infecţiei trebuie privită ca un mi/loc deapărare antivirală, av(ndu-se în vedere că temperatura corporală realizată prinhipertermie este de cele mai multe ori nefavorabilă multiplicării virusului, fără afi nocivă pentru celula gazdă.
Remperaturile scăzute au proprietăţi conservante, metoda folosită pentru păstrarea virusurilor în colecţii, luni sau chiar ani de zile, fiind congelarea la 2 J p(nă la 2 1DCQ* .
Varia=iil% % $3imitele de pN în care virusurile îşi menţin viabilitatea se situează între
-D, cu unele e'cepţii cum ar fi enterovirusurile care îşi păstrează infecţiozitateaşi la pN 0,0 "după 9u'ton şi col. citaţi de *arp-*ărare <., 0 1#.
E)%rgia ra ia)&07adiaţiile cele mai active faţă de virusuri sunt ultravioletele în doze mari.
)fectul acestora este însă diminuat proporţional cu protecţia pe care o e'ercităasupra virusurilor materia organică în care sunt incluse "secreţii, e'creţii,cadavre#.
Su6s&a)=%l% "/i#i"%iversele substanţe dezinfectante şi antiseptice ca formolul, soda
caustică, sublimatul de mercur, soluţiile de iod, soluţiile sărurilor de argint, etc.,distrug virusurile, viteza de acţiune fiind în funcţie de durata de contact şi deconcentraţia soluţiei.
1idroxidul de sodiu (soda caustică& e'ercită un puternic efect virulicidmai ales în soluţie ferbinte.'ormalde"ida este activă dar acţiunea ei antivirală este mai lentă. )a se
utilizează însă în mod curent la prepararea vaccinurilor inactivate "omor(te#,deoarece nu modifică structura antigenică a virusurilor.
+terul şi cloroformul au o acţiune electivă, în sensul că sunt inactivante pentru unele virusuri şi inofensive pentru altele, astfel înc(t sensibilitatea la celedouă substanţe reprezintă pentru virusuri, un criteriu ta'onomic.
7licerina în soluţie salină 589 constituie un bun conservant pentru
ma/oritatea virusurilor, asigur(ndu-le infecţiozitatea luni şi chiar ani de zile.
Antibioticele şi c"imioterapicele de uz curent în terapia antibacterianăș iantimicotică "penicilina, streptomicina, tetraciclinele, sulfamidele,cefalosporinele etc., respectiv, stamicina, nistatinul, nizoralulș .a.#, sunt inactivefaţă de virusuri.
tilizarea în practica medicală a compuș ilor chimici cu acț iune antiviralăeste limitată de to'icitatea neselectivă a acestora$ deoarece virusurile utilizeazămecanismele de biosinteză ale celulei gazdă, este dificil de selectat agenț ii caresă interfereze specific replicarea virală fără să altreze integritatea morfo-funcț ională a celulei parazitate.
genț ii antivirali folosiț i în terapie pot fi clasificaț i în două categorii:naturaliș i de sinteză.
genț ii antivirali naturali suntinterferonii (/'N& - proteine sintetizate încursul infecț iei virale de unele celule ale organismul gazdă. Ae cunosc trei tipuri
de interferon: ;G8 S, sintetizat, în principal, de leucocite, ;G8 T 2 produs defibroblaș ti ș i ;G8 ϒ 2 sintetizat numai de limfocitele R. )liberaț i din primelecelule parazitate de virus, interferonii recunosc receptori specifici pe suprafațacelulelor învecinate, de care se fi'ează, prote/(ndu-le. ;G8 nu e'ercită o acț iuneantivirală directă, ci prin intermediul unor proteineș i enzime a căror sintezăeste indusă de cuplarea ;G8 cu receptorii celulari. cestea blochează replicareavirală prin inhibarea traducerii 78m.în proteine virale, fără să afecteze sinteza proteinelor normale ale celulei gazdă.
;nterferonii au un spectru larg de acț iune, în sensul că inhibă replicarea a
numeroase alte virusuri , nu numai a virusului care a indus sinteza lor, dar au ostr(nsă specificitate de specie "e'., protecț ia omului este realizată numai de ;G8uman#.
eș i la ora actuală interferonii sunt produș i în cantităț i mari prininginerie genetică "gena umană care codifică sinteza ;G8 S este clonată în celule bacteriene#, din cauza efectelor secundareș i a prețului prohibitiv, ei suntutilizaț i doar în terapia unor viroze umane cronice, agresive cum sunt hepatitelevirale 9ș i *.
genț ii terapeutici antivirali de sinteză au ca mecanism de acț iuneinhibarea uneia din fazele replicării virale: blocarea penetrării în celulareceptivăș i a decapsidării "amantadinaș i rimantadina#, sinteza acidului nucleicviral "aciclovir, farmciclovir, zidovudinaș .a.#, sinteza proteinelor virale"indinavir, ritonavir#. ceste substanțe au o utilizare restr(nsă din cauzafenomenelor adverse multipleș i a capacităț ii virusurilor de a dezvoltarezistență prin selecț ia de mutanț i "9uiuc ., 0 !#.
4. BACTERIOFAGII
9acteriofagii sunt virusuri adaptate parazitării celulelor bacteriene. )i auo largă răsp(ndire în natură, fiind prezenț i în toate mediile naturale unde e'istă
bacterii, deoarece aproape toate speciile bacteriene pot fi gazde pentru unul saumai mulț i bacteriofagi.
9acteriofagii sau fagii sunt denumiț i după gazda naturalăș i poartă unsimbol "de e'emplu, R1, R0, R!LR 4, U, ' 14J 2 sunt bacteriofagi care
parazitează celulele speciei Escherichia coli #. <a/oritatea bacteriofagilor prezintă o specificitate de gazdă limitată la tulpinile unei specii bacteriene sauale unui gen. neori spectrul se e'tinde la genurile bacteriene înrudite "dee'.,e'istă bacteriofagi care infectează tulpini de Ahigellaș i )scherichia#, sau,dimpotrivă, se reduce la anumite tulpini din cadrul unei specii bacteriene saudoar la celulele bacteriene posesoare de pili se'uali 2 organite care constituiereceptorii specifici pentru anumiț i bacteriofagi "fagii de se'#.
Co#$o iț ia "/i#i"0 ș i s&ru"&ura9acteriofagii au o compoziț ia chimicăș i o arhitectură asemănătoare cu a
virusurilor animale, cu e'cepț ia unor fagi "de e'. bacteriofagii R0, RJ, RC ai bacteriei )scherichia coli# care prezintă ca particularitate, alcătuirea din două păr ț i distincte: capulș i coada "fig. !D#.
!apul este icosaedralș i conț ine 8 viral "genomul#, încon/urat de unînveliș proteic format din capsomere "capsida#.
!oada este în e'clusivitate de natură proteicăș i este formată dinurmătoarele structuri:
a. la e'terior, teaca cozii - un manș on format din capsomeredispuse helicoidalș i care are proprietăț i contractile, put(ndu-ș i
reduce lungimea la /umătate din cea iniț ială$6. ti)a cozii (g:tul, cilindrul axial& 2 formaț iune străbătută decanal central$
". gulerul cozii,de formă he'agonală, situat în partea pro'imală atecii cozii$
. placa bazală, situată în partea distală a cozii, are formăasemănătoare cu gulerul, de colțurile ei fiind ataș atecroș etele.
cestea sunt subunităț i proteice care, împreună cu niș tefilamente numite fibrilele cozii , realizează fi'area fagului pesuprafața bacteriei.
Fig. +9. S&ru"&ura u)ui 6a"&%rio ag "u "a$ș i "oa 0 2 schemă.
R%laț ii 6a"&%rio ag 6a"&%ri% '#ul&i$li"ar%a agilor*)'istă două tipuri de relaț ie fag-bacterie infectată " ebeleac 3ucia, 0 !,
;vanof ;., 1DB0 #.
A.!iclul litic de multiplicare "ciclul productiv, infecț ia litică# duce laformarea de noi virioni, care sunt eliberaț i în mediu prin liza bacteriei.;nfecț ia litică se realizează în mai multe etape:
. Adsorbț ia bacteriofagului la receptorii de pe suprafața celulei bacteriene. <ai înt(i se fi'ează fibrele cozii apoi are loc o ancorare maifermă, prin intermediul croș etelor. cestea eliberează muramidază 2 enzimă care determină liza peretelui celular în zona de ataș are.
#. /n)ectarea genomului fagic prin contractarea tecii, străpungerea peretelui bacterian de către ti/a coziiș i trecerea acidului nucleic viral prin
canalul acesteia, din capul bacteriofagului în celula bacteriană. +nveliș ul proteic răm(ne la e'teriorș i poartă denumirea de ,,fag fantomă".$.;ultiplicarea bacteriofagului . ;mediat după pătrunderea 8-
ului fagic, apare o scurtă perioadă de eclipsă. poi, treptat, 8-ul bacteriei este blocat, fiind substituit funcț ional de 8-ul fagic care seva autoreplicaș i va induce sinteza de proteine virale pe seama rezervelor bacteriene. Gagul în multiplicare poartă numele de fag vegetativ .
. ;aturarea fagilor . 6enoamele fagiceș i proteinele structurale seansamblează form(nd bacteriofagii maturi virulenț i.
3. !iclul lizogen (reductiv&3izogenia constă în integrarea genomului fagic în cromozomul
bacteriei infectate.;ntegrarea este consecința acț iunii unei proteine bacteriene cu efect
represor care inhibă e'primarea funcț iilor vegetative ale fagului"replicarea acidului nucleic, sinteza proteinelor fagice, ansamblarea învirioni#ș i a unor gene fagiceș i bacteriene care asigură recombinareasitus-specifică "integrarea într-un locus unde e'istă omologie de bazeazotate între 8-ul fagicș i cel bacterian#. 9acteria se reproducenormal, transmiț (nd descendenț ilor gena reprezentată de fag, uneori,implicit un caracte nou codificat de aceasta. Eroducerea de to'inădifterică, de e'emplu, este consecința lizogenizării bacilului difteric cu bacteriofagul T-to'#. . Gagul integrat în genomul bacterian se mainumeș te profag, fag latent, fag endogen sau fag temperat.
Hdată instalată, starea de profag este stabilă. Rotuș i, într-o populaț ie bacteriană cu fag latent "lizogenă#, la un număr mic de celule"1 - -1 -J# acesta trece spontan în fag vegetativ, multiplic(ndu-se. +n
contact cu o populaţie bacteriană lipsită de profag(lizosensibilă# fagiieliberaţi de bacteriile lizogene vor produce liza acesteia.A$li"aț iil% 6a"&%rio agi%i+n medicină, aplicaț iile practice ale bacteriofagiei sunt lizotipiaș i
tratamentul infecț iilor. *izotipia.)'isten ța unei specificităț i restr(nse fag - bacterie a constituit premiza
utilizării fagilor în crearea de diviziuni ta'onomice în cadrul unor genuriș ispecii bacteriene numitelizotipuri . 3izotipia sau tipizarea fagică "operaț iuneade încadrare a unei tulpini bacteriene în lizotip cu a/utorul bacteriofagilor cunoscuț i# prezintă importanță practică înstabilirea filierei epidemiologice abolilor contagioaseș i în toxiinfecț iile alimentare.
Rratamentul prin bacteriofag are o utilitate restr(nsă deoarece efectul este
inconstantș i imprevizibil.
4.3. CLASIFICAREA VIRUSURILOR
Eroblema clasificării virusurilor este încă nerezolvată$ ea formeazăobiectul de studiu al unui comitet internaţional. Erincipalele criterii care stau la baza clasificării virusurilor sunt:
- natura chimică a acidului nucleic " 8 sau 78#$- simetria nucleocapsidei "cubică, helicoidală, binară#$- prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal$- numărul de capsomere pentru virusurile cu simetrie cubică sau
diametrul nucleocapsidei pentru virusurile cu simetrie helicoidală.Ee baza acestor criterii, virusurile au fost încadrate în phOlum<=/RA>
împărţit în două subphOla pe baza naturii chimice a genomului viral:% +?@ /=/RA,% R/3@=/RA+n funcţie de simetria capsidei 2 helicoidală sau cubică - , virusurile se
grupează în clase:- dezoxi"elica şi dezoxicubicaB % ribo"elica şi ribocubica.Hrdinele se bazează pe prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal, iar
familiile, în principal, pe numărul de capsomere şi diametrul nucleocapsidei.Ee baza unor criterii suplimentare, în cadrul familiilor au fost
individualizate subfamilii şi genuri virale, iar în cadrul fiecărui gen, una sau maimulte specii.
Virusurile au o nomenclatură latină cu terminaţiile:% viridae, pentru familii$
