ANTIBIOGRAMA

LABORATORUL DE BACTERIOLOGIE

INITIEREA

TINTIREA

MONITORIZAREA

TERAPIEI ANTIMICROBIENE

TERAPIA ANTIMICROBIANA POSIBILA

Diferentierea infectiei bacteriene de infectia virala

Microorganismul infectant a fost stabilit prin rationament clinico-epidemiologic

Depistarea microorganismului infectant prin metode rapide

Izolarea in cultura pura; identificarea microorganismului infectant si testarea sensibilitatii la antibiotice

TERAPIA ANTIMICROBIANA POSIBILA

SPECTRUL REAL DE SENSIBILITATE

AL TULPINII

CU SEMNIFICATIE CLINICA

ANTIBIOGRAMA

DEFINITIE

Testarea sensibilităţii microorganismelor

“in vitro”

faţă de antibiotice

RELATIA MICROB-MEDICAMENT

IN VITRO:

- CMI (cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba cresterea bacteriana)

- CMB (cea mai mica concentratie de antibiotic care omoara 99.9% din populatia bacteriana)

IN VIVO: CONCENTRATIA DE MEDICAMENT ANTIMICROBIAN ACTIV IN FOCARUL DE INFECTIE (concentratia terapeutica)

Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate

SENSIBIL

CMI = 2-4 X< NIVELUL ATB. IN SER (UMORI)in conditiile unor doze

unice sau repetate normale

CMI/CT<1

EFECT TERAPEUTIC POSIBIL

Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate

REZISTENT

CMI > NIVELUL ATB. IN SER (UMORI)

CMI/CT>1

EFECT TERAPEUTIC NEVEROSIMIL

Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate

INTERMEDIAR

CMI apropiat NIVELUL ATB. IN SER (UMORI)

CMI/CT=1

EFECT TERAPEUTIC IMPREVIZIBIL(exceptii: doze f.mari, concentrare in focar, administrare locala)

Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate

PUNCTELE DE RUPTURA ALE CMI

FACTORI FARMACOLOGICI CONCENTRATIA MAX. A MEDICAMENTULUI IN FOCAR SI

TIMPUL DE INJUMATATIRE FRACTIUNEA ACTIVA ANTIMICROBIANA METABOLITI CU ACTIVITATE ANTIMICROBIANA RESTANTA CONCENTRATIA DE MEDICAMENT ACTIV VARIAZA

CONTINUU IN ORGANISMUL PACIENTULUI

Clasificarea microorganismelor in categorii de sensibilitate

PUNCTELE DE RUPTURA ALE CMI

FACTORI MICROBIENI CMI ESTE O VALOARE STATICA DISTRIBUTIA CMI VARIAZA:

- ZONE GEOGRAFICE

- COLECTIVITATI

- SPECII

TESTE DE EFICIENTA TERAPEUTICA

Cinetica proteinei C reactive (CRP)

Testarea activitatii antibacteriene a serului

Nivelul de Eficienta Bactericida (NEB)

cea mai mare dilutie a serului care omoara cel putin 99.9% din organismele inoculate

METODE DE TESTARE

Calitativemetoda difuzimetrică

Cantitativedeterminarea CMI

(concentraţia minimă inhibitorie)

STANDARDIZAREA TESTELOR DE SENSIBILITATE

MEDIUL DE CULTURA ORGANISME AEROBE: m. MUELLER-HINTON

30.0% beef infusion1.75% casein hydrolysate0.15% starch1.7% agarpH adjusted to neutral at 25 °C.

STANDARDIZAREA TESTELOR DE SENSIBILITATE

MEDIUL DE CULTURA ORGANISME ANAEROBE ISA supplemented with 5 % defibrinated horse blood and

20 mg/L NAD Fastidious Anaerobe agar m. WILKINS—CHALGREN

MEDIUL DE CULTURA Bazele purinice, pirimidinice, nucleozidele (din peptone) antagonizeaza

sulfamidele si trimetoprimul Mineralele (cationii de Mg si Ca) interfera:

- activitatea tetraciclinelelor (stafilococ)

- aminoglicozidelor (pseudomonade)

pH-ul mediului (7,2-7,4):

- acid: scade activitatea macrolidelor si aminoglicozidelor

creste activitatea tetraciclinelor, nitrofuranului

- alcalin: invers

Suplimentele nutritive:

- glucoza: creste zonele de inhibitie la penicilina,ampicilina; nu modifica CMI

- sange: reduce zonele de inhibitie la aminoglicozide, sulfamide, trimetoprim, rifampicina

Grosimea, uniformitatea

STANDARDIZAREA TESTELOR DE SENSIBILITATE

INOCULUL

ATESTAREA SEMNIFICATIEI CLINICE

DENSITATE

- METODA DIFUZIMETRICA = 108 UFC/ml (std.turbidimetric 0.5 MacFarland)

- METODA DILUTIILOR= 105 UFC/ml

VARSTA (culturii): FAZA LOGARITMICA

INOCULUL

Prepararea inoculului: - se suspensionează 2-3 colonii izolate, în ser fiziologic Etalonarea - turbiditatea suspensiei se controlează nefelometric sau comparând cu tuburi etalon (conţin suspensii de particule latex/sulfat de Ba cu turbiditate determinată)- se ajustează la 0.5 McFarland- timp: max.15min.

PROCEDURA

Temperarea placilor cu m.Mueller-Hinton

Insamantarea cu inoculul etalonat Adsorbtia inoculului 3-5min. Aplicarea discurilor/benzilor Etest

STANDARDIZAREA TESTELOR DE SENSIBILITATE

INCUBATIA

TIMPUL

16 - 18ore

TEMPERATURA

35C - 37C (functie de specie)

ATMOSFERA

(functie de specie)

STANDARDIZAREA TESTELOR DE SENSIBILITATE

SELECTAREA SUBSTANTELOR ANTIMICROBIENE

CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute)

EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility)

SELECTAREA SUBSTANTELOR ANTIMICROBIENE

Grupele de antibiotice testate/raportate Grup A: antibiotice testate şi raportate de rutină (de primă intenţie) Grup B: antibiotice importante clinic, care se testează de rutină dar rezultatele se raportează selectiv; dacă: - o tulpina este rezistentă faţă de aceeaşi clasă de antibiotic din grup A - izolatul provine din produs patologic special (de ex. sensibilitatea faţă de

cefalosporine de generaţia a III-a a izolatelor din LCR) - infecţia este polimicrobiană - infecţia se extinde la mai multe situsuri - alergie la antibiotice - eşec terapeutic la tratament cu antibiotic grup A - raportare către SPCIN, scop epidemiologic Grup C: antibiotice suplimentare sau alternative: - tulpini nosocomiale - alergii - scop epidemiologic Grup U: antibiotice testate în infecţii urinare Grup O (other): antibiotice utilizabile în terapie dar care nu se testează de rutină

CONTROLUL DE CALITATEAmerican Type Culture Collection

TESTE CALITATIVE

A. ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA PE SUBCULTURA STANDARDIZATA (Metoda Kirby-Bauer)

O cantitate de substanta antimicrobiana este depusa pe suprafata mediului agarizat preinsamantat cu bacteria testata

Se produc: difuzia antibioticului si cresterea bacteriei In locul unde antibioticul realizeaza concentratii>CMI, bacteria nu creste;

circumferinta zonei de inhibitie: locul geometric al punctelor in care antibioticul a atins CMI in momentul critic al culturii (faza de lag + primele 2-4 generatii)

Diametrul zonei de inhibitie variaza invers proportional cu CMI Nu permite cuantificarea nivelului de rezistenţă, rezultatele fiind exprimate

în sensibil, intermediar sau rezistent

B. ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA PE CULTURA PRIMARA

ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA PE SUBCULTURA STANDARDIZATA

(Metoda Kirby-Bauer)

ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA PE SUBCULTURA STANDARDIZATA (Metoda Kirby-Bauer)

ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA PE SUBCULTURA STANDARDIZATA (Metoda Kirby-Bauer)

Citire Cultură bacteriană confluentă în jurul microcomprimatelor (R) Zone de inhibiţie (lipsa creşterii bacteriene) (S/I)- se masoara diametrele zonelor de inhibiţie - se compară diametrele citite cu diametrele din standard

Interpretare CLSI

Sinergism

Rezistenta inductibila

ESBL

TESTE CANTITATIVE

Determina concentraţia minima inhibitorie (CMI) a unui antibiotic (CMI: cantitatea cea mai mică de antibiotic care inhibă complet

multiplicarea unei bacterii) Se recomandată în următoarele situaţii: - cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite) - rezultate incerte la metoda difuzimetrică / sensibilitate

nedeterminată - situaţii speciale (ex. testarea sensibilităţii pneumococului la

penicilină când diametrul zonei de inhibiţie la oxacilină este <20 mm)

CMI obţinut se raportează la punctele de ruptură superior şi inferior date de CLSI

TEHNICI

METODA DILUTIILOR IN AGAR

Se efectueaza diluţii succesive din antibioticul testat în geloză Mueller-Hinton

Se însămânţează cultura bacteriană în spoturiIncubare Citire CMI

TEHNICI

METODA DILUTIILOR IN BULIONSe efectueaza diluţii succesive din antibioticul de testat în

mediu de cultură lichid

Se adaugă cantităţi fixe din cultura bacteriană cercetată

Incubare 18 ore 35°C

Se urmăreşte apariţia culturii în mediul lichid

Citire CMI

TEHNICA MACRODILUTIILORIN BULION

TEHNICA MACRODILUTIILORIN BULION

TEHNICA MICRODILUTIILOR IN BULION

VITEK 2C

TESTUL E

Inoculul standardizat este insamantat intr-un gradient discontinuu de concentratii ale antibioticului

E-teste: bandelete din plastic impregnate cu antibiotic în gradient exponential (la un capăt concentraţia minimă, la celălalt maximă)

PROCEDURA Se insamanteaza inoculul

standardizat Se aplica benzile Etest

Incubare Citire CMI: zone de inhibiţie de formă elipsoidală (în dreptul intersectării cu banda de plastic)