+ All Categories
Home > Documents > Lp Bacterio

Lp Bacterio

Date post: 04-Aug-2015
Category:
Upload: ana-em
View: 164 times
Download: 7 times
Share this document with a friend
59
Disciplina: Microbiologie Specializarea: Medicina generala LP 1 Schema diagnosticului bacteriologic, virusologic, parazitologic Nr.crt. BACTERIOLOGIE VIRUSOLOGIE PARAZITOLOGIE METODE DIRECTE 1 Recoltarea produsului patologic Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat 2 Examenul direct al produsului patologic 1. examen macroscopic 2. examen microscopic microscopie optică o preparat nativ o coloraţie negativă o coloraţie simplă o coloraţii compuse 3. evidenţierea antigenelor bacteriene prin metode serologice 4. detectarea ADN-ului microbian (reacţii de hibridizare, amplificare genică – PCR) 1. examen macroscopic-nu 2. examen microscopic o evidenţierea incluziilor virale microscopie optică o microscopie electronică 3. reacţii antigen-anticorp (evidenţierea antigenului) 4. detectarea ADN-ului - reacţii de hibridizare, amplificare genică (PCR) Examen coproparazitologic: 1. examen macroscopic 2. examen microscopic o metode directe preparat nativ, în ser fiziologic preparat nativ în soluţie lugol frotiu colorat o metode de examinare în strat gros o metode de concentrare o metode larvoscopice o amprenta anală 3. detectarea ADN-ului - reacţii de hibridizare, amplificare genică
Transcript
Page 1: Lp Bacterio

Disciplina: Microbiologie

Specializarea: Medicina generala

LP

1

Schema diagnosticului bacteriologic, virusologic, parazitologic

Nr.crt. BACTERIOLOGIE VIRUSOLOGIE PARAZITOLOGIE

METODE

DIRECTE

1 Recoltarea

produsului

patologic

Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat

2 Examenul

direct al

produsului

patologic

1. examen macroscopic

2. examen microscopic –

microscopie optică

o preparat nativ

o coloraţie negativă

o coloraţie simplă

o coloraţii compuse

3. evidenţierea antigenelor

bacteriene prin metode serologice

4. detectarea ADN-ului

microbian (reacţii de hibridizare,

amplificare genică – PCR)

1. examen macroscopic-nu

2. examen microscopic

o evidenţierea incluziilor

virale – microscopie optică

o microscopie electronică

3. reacţii antigen-anticorp

(evidenţierea antigenului)

4. detectarea ADN-ului - reacţii de

hibridizare, amplificare genică

(PCR)

Examen coproparazitologic:

1. examen macroscopic

2. examen microscopic

o metode directe

preparat nativ, în ser

fiziologic

preparat nativ în soluţie lugol

frotiu colorat

o metode de examinare în strat

gros

o metode de concentrare

o metode larvoscopice

o amprenta anală

3. detectarea ADN-ului - reacţii

de

hibridizare, amplificare genică

Page 2: Lp Bacterio

Disciplina: Microbiologie

Specializarea: Medicina generala

LP

2

(PCR)

3 Cultivare Izolarea germenului în cultură

pură

însămânţarea si cultivarea

pe medii de cultură

inoculare la animale de

laborator

Cultivarea virusurilor

culturi celulare, linii

celulare

animale de laborator

oul de găină embrionat

Cultivarea paraziţilor

însămânţarea se face

pentru paraziţii unicelulari pe

medii

încălzite la 37°C, 1sau mai multe

zile

animale de laborator

4 Identificare Identificarea germenului izolat

din cultură pură

1. cercetarea caracterelor de

cultură si morfotinctoriale

2.cercetarea caracterelor

biochimice si de metabolism

3.determinarea structurii

antigenice prin:

reacţii de aglutinare

reacţii de precipitare

reacţii de umflare a capsulei

4. tehnici de detectare a ADN

microbian

5. Determinarea patogenităţii

germenului izolat prin:

o teste in vitro

Identificarea virusului izolat

1.prin examen microscopic

2. modificările caracteristice

apărute pe

culturile celulare,

OGE

animale de experienţă

3. reacţii antigen-anticorp

4. detectare a ADN–ului -reacţii de

hibridizare, amplificare genică

(PCR)

1.reacţii antigen-anticorp

2. tehnici de detectare a ADN

microbian

Page 3: Lp Bacterio

Disciplina: Microbiologie

Specializarea: Medicina generala

LP

3

o teste in vivo (boala

experimentală)

5 Antibiograma DA

METODE

INDIRECTE

6 1. detectarea anticorpilor din

serul bolnavilor (anticorpii se

urmăresc în dinamică)

1. detectarea anticorpilor din

serul bolnavilor

o Seroconversia: cresterea

titrului de anticorpi în probele de ser

recoltate la interval de 10-14 zile

o (demonstrarea unei infecţii

recente, actuale

1. Detectarea anticorpilor din

serul bolnavilor

o anticorpii se urmăresc în

dinamică

reacţii biologice

cutanate de diagnostic

(IDR) - rar

Page 4: Lp Bacterio

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul:

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus

Caracteristica generală a grupului cocilor piogeni

Familia Staphylococcaceae

Genuri-

- Staphylococcus;

- Gemella;

- Macrococcus;

- Salinicoccus;

Familia Streptococcaceae:

Genuri:

- Streptococcus;

- Lactococcus;

Familia Neisseriaceae:

Genul: Neisseria .

Caracter comun - capacitatea de a condiţiona procese supurative-distructive.

Morfologic reprezintă coci (sferici, lanceolaţi, riniformi), imobili, nesporogeni, unele

specii formează capsule.

În funcţie de caracterele tinctoriale se disting:

1. Coci gram pozitivi (Staphylococcaceae, Streptococcaceae)

2. Coci gram negativi (Neisseriaceae)

Cocii piogeni se deosebesc prin:

Caractere de cultură: exigenţe nutritive, tipul de respiraţie;

Infecţii nespecifice;

Infecţii specifice (gonoreea, scarlatina).

Familia Staphylococcaceae

Genul Staphylococcus

Se disting 2 grupuri (varietăţi):

1. stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP - foarte virulenţi (S. aureus, S.

intermedius);

2. stafilococi coagulazo-negativi - SCN - potenţial-patogeni (aproximativ 30

specii: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis).

Habitat: 20-70% din populaţie sunt purtători:

S. aureus - cavitatea nazală, intestine;

S. epidermidis – tegument;

S. saprophyticus - mucoasa uro-genitală, tegument;

Staphylococcus aureus

Caractere morfobiologice:

Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, în frotiu se aranjează în grămezi neregulate

(ciorchine) în perechi sau izolat. Sunt imobili, nesporogeni, necapsulaţi (uneori

microcapsule)

Page 5: Lp Bacterio

Caractere de cultură: facultativ anaerobi, nepretenţioşi la cultivare, cresc pe medii

uzuale, pH-7,0–7,5. Cultura apare peste 24 h de incubare la 37°C.

Medii selective cu caracter diferenţial-diagnostic:

- geloză salină (3 % NaCl) cu gălbenuş de ou (GGO);

- mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol);

- geloză - sânge .

Colonii S, 2-3 mm, opace, bombate, pigmentate (galben-auriu, galben-citric, alb), pe

geloză - sânge cauzează hemoliză. Pe GGO coloniile sunt înconjurate cu un halou opac

(acţiunea lecitinazei). Pe mediul Chapman coloniile sunt înconjurate de un halou galben

(fermentarea manitolului).

Caractere biochimice: catalazo - pozitivi, fermentează glucoza şi manitolul.

Factori de patogenitate

I. Factori structurali:

- peptidoglicanul (induce secreţia citokinelor de către celulele limfocitare,

responsabile de starea de şoc);

- acizii lipoteichoici (induc o stare de hipersensibilitate tardivă);

- proteina A (asigură fixarea Fc al IgG, împiedică opsonizarea şi fagocitoza);

- microcapsula, rol antifagocitar;

- adezine, proteine care asigură fixarea S. aureus pe diverse molecule plasmatice

ale gazdei, ulterior adeziunea la ţesuturi:

a. proteine fixatoare de fibronectină şi laminină. Fibronectina este prezentă pe

suprafeţe epiteliale şi endoteliale, precum şi în cheaguri sanguine.

b. “Clumping factor”, proteina fixatoare de fibrinogen. Asigură aderarea la

cheaguri şi ţesuturi lezate, protejează stafilococii de fagocitoză.

c. proteina fixatoare de colagen. Tulpinile ce posedă astfel de adezine cauzează

osteomielite şi artrite septice.

II. Toxine:

- α-toxina (alfa-hemolizina). Deteriorează membranele celulelor gazdei

(trombocite, monocite, hematii) prin integrare şi formarea porilor;

- ß-toxina (sfingomielinaza). Prezentă la tulpinile izolate de la bovine cu mastită.

- γ şi δ-toxine. Efect leuco - şi hemolitic;

- leucocidina, efect litic faţă de leucocite şi macrofage, factor important în procese

dermonecrotice;

Page 6: Lp Bacterio

- exfoliatine (epidermolizine) A şi B. Manifestă tropism cutanat.

Mecanism: se fixează de unele proteine cutanate (profilagrină şi filagrină), inducând

desprinderea intra-epidermică dintre stratum granulosum şi stratum spinosum, cu

formarea leziunilor buloase (pemphigus neonatorum, impetigo bulos, dermatită

exfoliantă/sindromul pielii opărite).

III. Coagulaze:

- coagulaza liberă - proteină extracelulară care se leagă de protrombina gazdei cu

formarea unui complex. Astfel activată, trombina determină conversia fibrinogenului în

fibrină şi coagularea plasmei. Reprezintă cauza tromboflebitelor septice şi protejează

cocii de fagocitoză;

- coagulaza legată (Clumping factor) este un determinant superficial al S. aureus

fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoacă fenomenul de aglutinare a stafilococilor în

prezenţa fibrinogenului.

IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) - activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi

lizogeni). Complexul stafilokinază-plasminogen manifestă activitate proteolitică, cauzând

dizolvarea trombilor (responsabilă de localizări septice secundare).

V. Enzime de patogenitate:

- hialuronidaza – facilitează diseminarea bacteriilor

- alte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze.

Rol în diseminarea infecţiei şi producerea leziunilor.

Se disting multiple serotipuri de S. aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit

clasificarea în lizotipuri (fago-variante).

Epidemiologia infecţiilor stafilococice

Sursa de infecţie:

- omul bolnav sau purtători sănătoşi de germeni. Rareori - bovinele bolnave de

mastită;

- contact direct sau diseminare manuportată;

- contact indirect (alimente, praf, îmbrăcăminte).

Factori favorizanţi: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plăgi,

Formele clinice ale infecţiilor cu S. aureus:

- infecţii cutanate şi subcutanate: foliculite, furuncule, cărbuncule, abcese,

hidrosadenite, mastită, panariţiu, infecţie de plagă (frecvent de origine nosocomială);

- exfoliatina determină epidermoliza buloasă (dermatita exfoliativă, sindromul

pielii opărite, sindromul Lyel) la copii, pemphigus neonatorum la nou-născuţi (boala

Ritter) şi impetigo bulos la mature;

- infecţii ale mucoaselor: mastoidite, sinuzite, otite, angine;

- infecţii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonită, meningită;

- infecţii osoase: osteomielită, spondilodiscită, infecţie de proteză;

- infecţii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite.

S. aureus poate coloniza corpuri străine (catetere, proteze, etc). După implantare ele sunt

acoperite cu proteine matriciale ale organismului (fibronectină, fibrinogen, laminină).

Stafilococii prin adezinele sale se leagă specific de aceste proteine matriciale, se

Page 7: Lp Bacterio

multiplică şi secretă exopolizaharide, constituind un biofilm. El protejează bacteriile de

AB, anticorpi, celule imunitare şi constituie un focar de diseminare a infecţiei.

Septicemii şi endocardite. Cauzate şi întreţinute de un focar infecţios primar (infecţie

cutanată, pneumonie) complicat de tromboflebită.

În mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare

cardiace, articulare, stimulatoare cardiace).

Risc major de metastaze septice (endocard, oase, articulaţii)

Sindromul şocului toxic stafilococic: febră, hipotensiune arterială, erupţie scarlatiniformă

în special pe palme şi plante, urmată de descuamare, stare de şoc, leziuni viscerale

(cerebrale, renale, hepatice, musculare). Mortalitate 3-5%.

Descris în 1978 în SUA la femei care utilizau tampoane periodice şi sufereau de vaginită

cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni

stafilococice.

Intoxicaţii alimentare (doza toxică - 1μg la 100 g aliment). Incubaţie scurtă (1-6 ore).

Vome, diaree, deshidratare, absenţa febrei

Enterita fulminantă - gravitate extremă şi mortalitate înaltă. Consecinţa unei

antibioterapii, urmare a multiplicării tulpinii de stafilococ producător de enterotoxină în

intestin.

Infecţii cauzate de SCN

S. epidermidis produce un polizaharid de adeziune (glicocalix), care-i permite fixarea pe

implante din polimeri sintetici, metalici, din ceramică (formarea unui biofilm).

S. epidermidis determină infecţii asociate cu un corp străin (proteze, catetere, sonde de

intubare, stimulatori cardiaci) frecvent de origine nosocomială (endocardite, endoftalmii,

peritonite la pacienţi cu dializă peritoneală, bacteriemii, infecţie de plagă).

S. saprophyticus este responsabil de 10-20% din infecţiile acute ale tractului urinar, în

special cistită la femei tinere. La bărbaţi rareori - uretrită.

S. lugdunensis - infecţii de plagă, endocardite.

Imunitatea antistafilococică este mixtă: celulară şi umorală.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Staphylococcus

Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, etapele fiind următoarele.

Recoltarea şi transportul produsului patologic:

- se face cât mai repede, la debutul bolii, înainte ca pacientului să primească

antibiotice/chimioterapice, corect, asepsie;

- se recoltează: secreţii purulente (în abcese, celulite, infecţii ale plăgilor şi

arsurilor), lichide (prin puncţie sinusală, articulară, pleurală); exsudat nazal sau exsudat

faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie vaginală, lichid de vărsătură, materii fecale.

Diagnostic direct:

Examinarea microscopică a p.p. (Gram, RIF) cu realizarea a minim 2 frotiuri pe care le

colorăm cu A.M. şi Gram:

- se examinează la microscop şi se notează prezenţa celulelor (unele fiind

modificate), prezenţa celulelor inflamatorii (leucocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitivi,

Page 8: Lp Bacterio

cu diametrul de 0,5-1,5 μ, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi

neregulate, intra sau extraleucocitar.

Cultivarea pe medii de cultură a p.p. se face pentru a obţine colonii izolate (cultură pură),

necesară în etapele următoare. Se folosesc medii de cultură obişnuite. Coloniile sunt de tip

S, de 1-3 mm, pigmentate (auriu). Stafilococii se pot multiplica pe medii hiper clorurate,

tolerând o concentraţie de NaCl (mediul Chapman, pentru p.p. contaminate).

Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza:

• caracterelor morfo-tinctoriale: coci gram-pozitivi, 0,5-1,5 μ., dispuşi în lanţuri

scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate;

• caracterelor de cultură: colonii de tip Sv pigmentate auriu;

• caracterelor biochimice: fermentează zaharuri cu producere de acid (S. aureus

este manito-pozitiv); sunt catalazo - pozitivi;

• caracterelor antigenice;

• caracterelor de patogenitate: se recomandă îndeosebi efectuarea testul

coagulazei;

• sensibilităţii la bacteriofagi (în centrele de referinţă).

• altor caractere (în centre de referinţă: studiul acizilor graşi celulari, hibridarea

moleculară, ribotipie, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea prin

biologie moleculară a rezistenţei la antibiotice etc.).

Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Diagnostic indirect (serologic)

Se examinează seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru>

2 UI/ml) - în caz de infecţii profunde sau cronice sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) - n

caz de endocardite sau focare inaccesibile.

Familia Streptococcaceae:

Genuri:

- Streptococcus: fragili şi exigenţi la cultivare;

- Lactococcus: anterior streptococi din grupul N.

Genul Streptococcus

Reuneşte specii facultativ anaerobe/anaerobe - aerotolerante caracterizate prin morfologie

tipică (coci Gram+ în lanţuri, imobili, nesporogeni, capsulaţi), metabolism fermentativ şi

lipsa catalazei.

Page 9: Lp Bacterio

Clasificarea streptococilor:

1. După aspectul hemolizei pe geloză - sânge:

- streptococi alfa-hemolitici (hemoliză incompletă, zonă verzuie în jurul

coloniilor);

- streptococi beta-hemolitici (hemoliză completă, zonă clară în jurul coloniilor);

- streptococi nehemolitici (gamma-hemoliză):

2. Clasificarea imunologică Lancefield:

După antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A - H,

K - W). Streptococii care nu posedă acest Ag nu se încadrează în clasificarea Lancefield

(S. pneumoniae). Ei se identifică după caractere de cultură şi biochimice.

3. După habitat şi patogenitate:

- streptococi piogeni, virulenţi, beta-hemolitici (aparţin grupurilor A, B, C, G);

- streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili după

Lancefield;

- streptococi fecali, specii comensale sau condiţionat patogene ale tractului

digestiv uman şi animal;

- streptococi lactici, reprezintă flora laptelui şi produselor lactate:

Diferenţierea streptococilor patogeni de cei saprofiţi se efectuează în baza criteriilor

Sherman:

- creşterea în BP la 10 şi 45°C;

- creşterea în bulion cu 6,5% NaCl;

- creşterea în mediu cu pH 9,6;

- hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bilă;

- liza culturii în bulion biliat;

- sensibilitatea la bacitracină şi optochină;

- hidroliza hipuratului de sodiu.

Streptococcus pyogenes (gr. A)

Bacterie strict umană, posibil portaj oro- şi nasofaringean (20%).

Caractere morfologice: lanţuri scurte sau perechi de coci sferici Gram+, imobili,

capsulaţi, nesporogeni.

Caractere de cultură: facultativ-anaerobi, cultivă pe medii elective. Pe geloză - sânge,

după 18-24 ore incubare la 37° C - colonii S mici (0,5 - 1mm), bombate, transparente sau

translucide, cu zonă de β-hemoliză.

În bulion glucozat, bullion - ser formează depozit la fundul şi pe pereţii tubului.

S. pyogenes este sensibil la bacitracină.

Structura antigenică a S.pyogenes (Lancefield-Griffith):

- polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (după Lancefield).

Poate fi identificat în RP, latexaglutinare, co-aglutinare;

- proteinele de suprafaţă: M (fimbriale), R şi T (uneori asociate cu acizii lipo-

teicoici), care permit diferenţierea S.pyogenes în 90 serotipuri (după Griffith).

Proteina M manifestă reactivitate imunologică încrucişată (mimicrie antigenică) cu

constituenţi normali ai organismului (miozină, sarcolemă, sinoviale), determinând

Page 10: Lp Bacterio

procese imunopatologice (manifestări post-streptococice). Ag proteice de tip se identifică

în RP (Ag M) şi RA (Ag T);

în MCP a S. pyogenes există Ag comun cu membrana bazală a glomerulilor

renali.

Factori de patogenitate

1.Factori de structură

- capsula din acid hialuronic. Efect antifagocitar;

- proteina M, adeziune, antifagocitarã;

- acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale;

- proteina F, receptor de fibronectină:

2. Toxine:

- streptolizinele O (oxigen-labilă) şi S (oxigen-stabilă). Sunt toxine citolitice. SLO

manifestă efect cardiotoxic, hemolitic. Inhibă chimiotaxisul PMN şi reduce activitatea

celulelor imunocompetente. Induce formarea Ac neutralizanţi - antistreptolizine O

(ASLO). SLS nu este imunogenă. Manifestă activitate citolitică şi leucotoxică;

- toxinele eritrogene (pirogene) A, B şi C sunt codificate de profagi. Responsabile

de scarlatină. Au activitate de superantigen, producând inflamaţie asociată cu stare de

şoc.

3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza,

streptokinaza (fibrinolizina). Facilitează diseminarea rapidă în ţesuturi.

Epidemiologia infecţiilor provocate de S. pyogenes

Sursa de infecţie: bolnavii şi purtătorii sănătoşi (faringe şi amigdale, mai rar – intestin,

tegument, vagin).

Mecanismele şi căile de transmitere:

- aerogen (picături Pflugge);

- contact direct (leziuni cutanate):

Patogeneza şi formele clinice ale infecţiilor provocate de S. pyogenes:

- infecţii ale mucoaselor;

- sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular

acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite;

- infecţii cutanate şi subcutanate: erizipel (leziune cutanată eritematoasă, edem,

febră), impetigo (leziuni cutanate superficiale: papulă-pustulă-crustă), celulită, fasciită

necrozantă (leziuni necrotice subcutanate, durere, eritem, gangrenă, febră, şoc,

mortalitate 30% - 48 h), mionecroză (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecţii ale

plăgilor şi arsurilor;

- scarlatină (angină streptococică însoţită de erupţie cutanată şi descuamare în

convalescenţă, enantem, febră, adenopatie);

- sindromul şocului toxic streptococic, determinat de tulpini producătoare de

toxină eritrogenă (febră, hipotensiune, erupţie generalizată, descuamare în convalescenţă,

afectarea organelor). Letalitate 30%;

- septicemii ;

- alte infecţii: endometrite, pneumonii;

- infecţii post-streptococice;

Page 11: Lp Bacterio

- RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vârstă şcolară. Apare

după infecţii faringiene repetate şi este determinată de acţiunea directă a streptolizinei,

depozite de complexe imune (RHS III), precum şi prin interacţiunea autoAc şi al Ac anti

- streptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice şi sinoviale (RHS II);

- glomerulonefrita acută (GNA). Maladie a copilului de vârstă preşcolară. Survine

după 10-20 zile de la o infecţie cutanată, mai rar faringeană. Se caracterizează prin

perturbarea funcţiei renale, edem şi hipertensiune arterială;

- patogenie: efect toxic direct, reacţii autoimune, bazate pe asemănarea unor Ag

streptococice din MCP şi membrana bazală glomerulară (RHS II şi III), persistenţa

formelor L;

- coreea (infecţie a SNC prin RHS II).

Imunitatea antistreptococică este specifică de tip, asigurată de Ac anti-proteina M. Ac

anti - eritrotoxină protejează de eritemul scarlatinos.

Streptococcus agalactiae (gr. B):

Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional găzduit de om în

rinofaringe, vagin şi intestin.

Rol în patologie:

- la gravide: infecţie urogenitală, infecţie de plagă, amniotite, endometrite, avort

sau naştere prematură;

- la nou-născut: infecţie precoce (septicemie, pneumopatie în primele 10 zile de

viaţă) sau tardivă (meningită);

- la adult: infecţie de plagă, osteo-artrite, infecţii urogenitale, septicemii,

endocardite, meningite.

Streptococi din grupul C (S. equisimilis, S. equi) şi din grupul G:

Beta-hemolitici cu rezervor animal şi uman (tegument, mucoase).

Responsabili de infecţii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infecţii osteo -

articulare, meningite, pneumopatii, endocardite. Rareori urmate de GNA. Excepţional pot

cauza scarlatină.

Streptococii din grupul D: S. bovis, S. equinus

Fac parte din flora comensală a tubului digestiv al omului şi animalelor.

Rol în patologia umană: endocardite, septicemii neonatale, cholecistite, peritonite,

infecţii urinare, meningite, osteomielite vertebrale, artrite, abces cerebral.

Streptococii negrupabili (lipsiţi de antigene polizaharidice de perete): S. mitis, S.

mutans, S. oralis, S. sanguis

Prezenţi în cavitatea bucală, joacă rol în geneza cariei dentare, în infecţii materno-fetale,

bacteriemii şi endocardite.

Streptococcus pneumoniae:

- habitat natural: mucoasa tractului respirator superior. 5-10% adulţi şi 20-40% copii

- purtători sănătoşi de germeni;

- caractere morfo - tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolaţi, Gram+, imobili,

nesporogeni, capsulaţi.

Page 12: Lp Bacterio

- caractere de cultură: se cultivă pe medii elective (geloză - sânge, geloză - ser, bulion -

ser), pH optimal 7,8. Pe geloză - sânge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37°C în

atmosferă cu 5-10% CO2, formează colonii S mici (0,5-1,5 mm), opace, bombate, cu o

zonă de hemoliză alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se

deprimă. Tulpinile necapsulate formează colonii R.

Structura antigenică:

- antigene capsulare, de origine polizaharidică. Permit clasificarea pneumococilor în

90 serotipur;

- antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare;

- antigenul proteic M.

Factori de patogenitate:

- capsula (rol antifagocitar);

- adezine;

- sIgA - protează;

- acidul lipoteichoic (implicat în reacţii inflamatoare cu semne generale şi leziuni

tisulare, posibil şoc);

- autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol în virulenţă);

- pneumolizina (hemolizina). Efect citolitic şi citotoxic asupra celulelor epiteliale

şi endoteliale. Reduce activitatea bactericidă a PMN;

- hialuronidaza;

- neuraminidaza:

S.pneumoniae se diferenţiază de alţi streptococi prin:

- sensibilitatea la optochină

- liza culturii de pneumococi în prezenţa sărurilor biliare (activarea autolizinelor)

– testul de solubilitate în bilă;

- patogenitatea pneumococilor pentru şoarece;

- prezenţa capsulei;

- hidroliza inulinei.

Epidemiologia infecţiilor cu pneumococi:

- sursa de infecţie - purtătorii sănătoşi (naso-faringe) sau bolnavii.

- calea de transmitere - aerogenă.

Infecţiile cauzate de S.pneumoniae:

- infecţii respiratorii: pneumonia francă lobară acută, broncho-pneumonii,

bronşite, otite, sinusite, mastoidite;

- meningite (în special la copii);

- bacteriemii cu artrite, peritonită, pericardită, endocardită.

Imunitatea antipneumococică este specifică de tip, prin Ac anti-capsulari.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor streptococice Prelevate: în funcţie de forma clinică (tampon faringean sau cutanat, puncţie a ţesutului

sub - cutanat, LCR, puroi, sânge, etc)

Metodele de diagnostic:

Page 13: Lp Bacterio

1. Diagnosticul direct:

- examenul microscopic (frotiu Gram – orientativ, RIF);

- examenul bacteriologic (de bază);

- detectarea serologică a Ag specifice (Ag capsulare pot fi identificate în reacţii

de latexaglutinare, “reacţia de umflare a capsulei” cu Ac specifici);

- identificarea ADN prin tehnici de biologie moleculară.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Streptococcus: în faringita

streptococică

Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.

Recoltarea şi transportul p.p:

- produs patologic: secreţia purulentă de la nivelul faringelui;

- se recoltează dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi rar după ce s-a spălat pe dinţi,

fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii;

- dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore;

- produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, nu trebuie să treacă mai mult

de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore), în caz contrar este necesar un

mediu de transport.

Examinarea microscopică a p.p.:

- se notează prezenţa celulelor, celulelor inflamatorii (leucocite) şi a cocilor Gram-

pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri.

Cultivarea:

- se face pe agar – sânge;

- cultura apare în 18-48 ore;

- coloniile au aspect de tip S, sunt mici şi înconjurate de o zonă de fi-hemoliză (clară, cu

diametrul mai mare decât diametrul coloniei).

Identificarea se face pe baza caracterelor:

• morfotinctoriale (coci Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri;

• de cultură (colonii de tip S, 0,5-1 mm, înconjurate de P-hemoliză);

• biochimice (hemoliză de tip beta, multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de

bacitracină şi sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol);

• antigenice (determinarea polizaharidului specific de grup, determinarea tipurilor M).

Antibiograma nu este necesară decât la pacienţii alergici la beta-lactamine sau în cazuri

speciale. Sunt sensibili la penicilină.

Dacă se doreşte confirmarea (retrospectiv) unei infecţie invazivă sau trebuie să se confirme

bolile poststreptococice, se apelează la reacţia ASLO.

Diagnosticul de laborator serologic

Diagnosticul serologic este util pentru:

- certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA);

- identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate;

- diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice;

- evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.

Diagnosticul serologic se realizează de obicei prin reacţia ASLO, care identifică titruri

ale anticorpilor anti-streptolizină O. Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la

Page 14: Lp Bacterio

interval de 7-10 zile. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200

(maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de

calitate. Există şi alte teste care se folosesc mai rar în ţara noastră.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Streptococcus pneumoniae

Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, dispuşi în diplo, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili.

Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză - sânge determină α-hemoliză.

Creşterea este favorizată de 5% CO2. Streptococcus pneumoniae este condiţionat

patogen. Poate produce infecţii ale tractului respirator superior şi inferior, urechii medii,

sinusurilor, dar şi meningită, endocardită.

Diagnosticul microbiologic în pneumonia pneumococică

Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic şi bacteriologic (direct).

Recoltarea şi transportul p.p.: spută cu respectă regulilor impuse pentru recoltarea şi

transportul produselor patologice.

Examinarea microscopică a p.p.:

- se notează prezenţa celulelor (macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN)

şi cocilor Gram-pozitivi, în diplo, cu o capsulă comună.

Cultivarea:

- se face pe geloză - sânge, cu incubare în atmosferă de 5% CO2 la temperatura de

35-37°C,

- apar colonii de tip S sau de tip M, cu α-hemoliză.

Identificarea se realizează pe baza:

• caracterelor morfo - tinctoriale: coci gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, în diplo,

capsulaţi;

• caracterelor de cultură: colonii de tip S sau M, înconjurate de o zonă de a-

hemoliză;

• caracterelor biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerată de săruri

biliare (testul bilolizei), sensibilitate la optochin (etil-hidrocupreină);

• caracterelor antigenice: folosim seruri specifice anti-K polivalente şi

monovalente, în reacţia de umflare a capsulei.

• caracterelor de patogenitate: inoculare la şoarecele alb.

Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Pentru

verificarea sensibilităţii la penicilină se utilizează microcomprimate cu oxacilină.

Genul Enterococcus

Definiţie. Încadrare

Germenii din genul Enterococcus sunt coci Gram-pozitivi, ovali sau coco-bacili, dispuşi

izolat, în perechi sau lanţuri scurte. Sunt aerobi facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi,

catalazo-negativi, oxidazo-negativi. Enterococii au fost iniţial incluşi în grupa D

Lancefield a genului Streptococcus. În 1984, pe baza diferenţelor genetice, prin

hibridarea ADN-ADN, genul Enterococcus a fost separat din genul Streptococcus. În

prezent genul Enterococcus cuprinde 19 specii dintre care 3 sunt mai frecvent implicate

în patologia umană: E. faecalis, E. faecium şi E. durans (tabel I).

Caractere generale

Page 15: Lp Bacterio

Habitat: sunt componenţi ai florei comensale a tractului digestiv şi genito-urinar, al

omului şi animalelor de unde jung în mediul extern. Pot fi prezenţi, de asemenea în

tractul biliar ceea ce atestă capacitatea lor de a supravieţui la concentraţii mari de bilă.

Supravieţuiesc în apă, sol, alimente, insecte.

Caractere morfo - tinctoriale: sunt coci sferici, ovalari sau coco-bacilari, Gram pozitivi,

dispuşi în diplo, lanţuri scurte sau izolat. Sunt imobili, necapsulaţi, nesporulaţi.

Caractere de cultură

Cresc pe medii suplimentate cu 5% sânge de berbec, incubate aerob la 37ºC, cu limite ale

temperaturii de creştere între 10ºC şi 45ºC. Pentru izolarea enterococilor din produse

patologice contaminate se folosesc medii de cultură selective: agar - bilă - esculină - azid

sau agar Columbia cu supliment de colistin şi acid nalidixic. Pe mediile solide formează

colonii de tip S, α-, β- sau nehemolitice. Pe agar cu bilă - esculină - azid formează colonii

alb-cenuşii cu halou negru iar pe mediile selective cu antibiotic coloniile sunt mai mici.

Caractere biochimice

Sunt bacterii catalază şi oxidază negative. Cresc în bulion îmbogăţit cu 6,5% NaCl,

hidrolizează esculina în prezenţa a 40% bilă sau săruri biliare, produc pirolidonil-

arilamidază, leucinaminopeptidază.

Pe baza fermentării manitolului, sorbozei, sorbitolului şi a capacităţii de hidroliză a

argininei, enterococii sunt clasificaţi în 5 grupe în cadrul cărora speciile se diferenţiază în

funcţie de fermentarea arabinozei, rafinozei şi zaharozei(tabel I). Grupa I, cuprinde 5

specii diferenţiate pe baza fermentării arabinozei, rafinozei şi a utilizării piruvatului;

Grupa II cu 5 specii identificate pe baza producerii de pigment, a mobilităţii şi a

capacităţii de a tolera teluritul; Grupa III cu 3 specii şi 2 variante recunoscute pe baza

utilizării piruvatului şi a fermentării arabinozei, rafinozei şi zaharozei; Grupa IV cuprinde

2 specii diferenţiate pe baza producerii de pigment şi a fermentării sorbitolului; Grupa V

cu 1 specie şi 3 variante cuprinde tulpini care nu descompun arginina.

Structură antigenică

Toate speciile din genul Enterococcus posedă un antigen de suprafaţă care corespunde

serogrupului D în clasificarea Lancefield a streptococilor.

Caractere de patogenitate

Patogeneza infecţiilor cauzate de enterococi este puţin cunoscută. În patogenitatea

tulpinilor de enterococ sunt implicaţi următorii factori de virulenţă:

- hemolizina/bacteriocina - o proteină codificată plasmidic cu acţiune litică pe

hematiile umane. Acţionează ca bacteriocină asupra altor coci Gram pozitivi.

- factorul de agregare - o proteină de suprafaţă, codificată plasmidic, care

determină agregarea enterococilor. Poate media aderenţa enterococilor la celulele

epiteliului urinar conferind tulpinilor capacitatea de a cauza infecţii urinare. Poate iniţia

aderenţa la ţesutul endocardic tulpinile care posedă acest factor fiind cauzatoare de

endocardită;

- gelatinaza - o peptidază extracelulară similară elastazei produsă de

Pseudomonas aeruginosa. A fost identificată la un număr mare de tulpini de enterococ

izolate de la pacienţi cu endocardită şi de la pacienţi spitalizaţi;

- acidul lipoteichoic. Tulpinile de enterococ ce posedă acidul lipoteichoic

determină un răspuns inflamator exagerat din partea gazdei. E. faecium poate avea un

înveliş subţire de carbohidrat care conferă tulpinii rezistenţă la fagocitoză.

Page 16: Lp Bacterio

Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Germenii din genul Enterococcus au o capacitate deosebită de a supravieţui în variate

condiţii adverse. Sunt foarte rezistenţi la antibiotice ceea ce pune probleme deosebite în

mediul de spital transformându-i în importanţi agenţi etiologici ai infecţiilor nosocomiale.

Prezintă două feluri de rezistenţă:

1. rezistenţă intrinsecă, de nivel scăzut, mediată de gene cromozomale,

netransferabilă altor bacterii;

2. rezistenţă dobândită, de nivel înalt, mediată de plasmide şi transpozoni,

transferabilă altor bacterii.

Enterococii sunt în mod natural rezistenţi la cefalosporine, sulfamide, lincosamide,

aztreonam, clindamicină, trimetoprim-sulfametoxazol şi faţă de dozele uzuale de

aminoglicozide. Au o mare capacitate de a dobândi rezistenţă faţă de unele antibiotice:

- rezistenţă de nivel înalt faţă de aminoglicozide, penicilină şi vancomicină;

- au toleranţă faţă de antibioticele cu acţiune pe peretele celular (penicilină,

vancomicină) care doar le inhibă nu le distrug;

- faţă de penicilină au dezvoltat 2 mecanisme de rezistenţă prin:

- beta-lactamază;

- modificarea afinităţii proteinei de legare a penicilinei (PLP5). Penicilinele

de semisinteză au efect bacteriostatic asupra enterococilor.

Rezistenţa dobândită faţă de vancomicină are implicaţii serioase asupra tratamentului şi

controlului infecţiilor cauzate de tulpini de enterococ vancomicino-rezistent (VRE). Se

cunosc 5 fenotipuri de rezistenţă la vancomicină codificate genetic: VanA, VanB, VanC,

VanD, VanE cele maifrecvente fiind primele două.

Fenotipul VanA manifestă rezistenţă de nivel înalt faţă de vancomicină şi teicoplanină,

este mediat de transpozonul Tn 1546. Acesta conţine 7 gene şi este prezent mai ales la E.

faecium.

Fenotipul VanB este rezistent la vancomicină şi sensibil la teicoplanină. Este mediat de

transpozonul Tn1547 prezent la E. faecium şi E. faecalis.

Fenotipul VanC prezintă rezistenţă de nivel scăzut faţă de vancomicină, este sensibil la

teicoplanină. Este mediat de 2 gene cromozomale: vanC 1prezentă constitutiv la E.

gallinarum şi vanC2 prezentă constitutiv la E. casseliflavus. Aceste gene sunt

netransferabile.

Fenotipurile VanD şi VanE sunt descrise la un număr mic de tulpini de enterococ.

Posibilitatea transferării genelor de rezistenţă de la Enterococcus la Staphylococcus

aureus (posibilă in vitro dar nesemnalată în clinică) creşte importanţa acţiunilor de

limitare a circulaţiei tulpinilor de enterococ vancomicino-rezistent.

Patogenie. Boala la om

Enterococii sunt bacterii condiţionat patogene care pot fi implicate etiologic în:

- infecţii ale tractului urinar, nosocomiale (15%) sau comunitare, la pacienţi cu

uropatii obstructive, mai frecvent la bărbaţi vârstnici;

- ocupă locul al III-lea în etiologia endocarditei subacute;

- bacteriemie la vârstnici sau la pacienţi cu imunitatea deprimată;

- infecţii mixte (asocieri cu enterobacterii sau bacterii anaerobe) ale plăgilor

chirurgicale sau ale ulcerelor de decubit, peritonite, infecţii biliare, abcese intra

abdominale. Specia mai frecvent implicată în patologia umană este E. faecalis (90%)

Page 17: Lp Bacterio

urmată de E. faecium (8%). Ocazional au fost izolaţi din infecţii umane tulpini de E.

raffinosus, E. durans, E. casseliflavus, E. avium.

Diagnostic de laborator în infecţiile produse cu enterococ

Produse patologice: urina, materiile fecale, secreţii din plăgi.

Semnificaţia clinică a prezenţei enterococilor în prelevatele patologice trebuie stabilită

cu grijă dată fiind uşurinţa cu care contaminează prelevatele.

Examenul microscopic este util pentru prelevatele în mod curent sterile.

Izolarea bacteriei se face pe agar cu sânge de berbec sau pentru prelevatele contaminate

pe medii selective: agar bilă - sculină - azid sau medii cu supliment selectiv colistin +

acid nalidixic pe care sunt inhibate bacteriile Gram negative.

Identificarea se face pe baza caracterelor microscopice, biochimice.

Identificarea preliminară se face pe baza următoarelor reacţii pozitive:

- testul la bilă - esculină;

- toleranţa la 6,5% NaCl;

- producerea de pirolidonil-arilamidază, leucinaminopeptidază;

- sensiblitate la vancomicină.

Identificarea definitivă are la bază:

Caracterele fenotipice:

- fermentarea zaharurilor utilă în încadrarea în grupe şi pentru identificarea speciilor

în cadrul grupei;

- hidroliza argininei;

- testul toleranţei la telurit;

- testul mobilităţii;

- pigmentaţia;

- utilizarea piruvatului din mediul de cultură

Identificarea unor markeri epidemiologici care permit tiparea şi subtiparea tulpinilor de

enterococ:

- metode clasice: bacteriocinotipia, lizotipia,antibiotipia, serotipia;

- metode moleculare: determinarea profilului plasmidic, analiza endonucleazei de

restricţie a ADN-genomic, analiza profilului de macrorestricţie prin electroforeză în câmp

pulsat.

Antibiograma este obligatorie, după izolarea şi identificarea tulpinii de enterococ şi se

efectuează testând antibioticele: beta-lactamice, aminoglicozide, glicopeptide. Este

indicată determinarea CMI ş i a producerii de beta-lactamază în vederea conducerii unui

tratament eficient care să ducă la vindecarea pacientului şi totodată să evite selectarea de

tulpini rezistente.

Page 18: Lp Bacterio

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de enterobacterii:

Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Shigella, Salmonella

Familia Enterobacteriaceae cuprinde:

bacterii condiţionat patogene: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus;

bacterii patogene: Shigella, Salmonella.

Patogenie şi produse patologice

Escherichia coli spp. produc:

infecţii ale tractului intestinal (enterocolite). În aceste infecţii sunt implicate

tulpinile patogene de Escherichia coli: EPEC, EHEC, EIEC, EAEC, EAggEC.

Produsele patologice (p.p.) sunt reprezentate de: materii fecale, bilă, alimente, vărsături;

infecţii extraintestinale:

- infecţii urinare (UPEC) - pp: urină;

- infecţii intra-abdominale şi ale plăgilor - pp: puroi;

- meningită - p.p.: LCR;

- bacteriemie - p.p.: sânge.

Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis) produc:

pneumonii (K. pneumoniae) - p.p.: spută;

infecţii urinare (K. pneumoniae, K. oxytoca) - p.p.: urină;

infecţii din sfera ORL: ozena (K. ozaenae), rinoscleromul (K. rhinoscleromatis) -

p.p.: secreţii nazale;

infecţii ale ţesuturilor moi, ale urechii medii - p.p.: puroi;

infecţii digestive - p.p.: materii fecale, bilă, vărsături, alimente;

meningită, septicemie - p.p.: LCR, sânge.

Proteus spp. (P. mirabilis, P. vulgaris) sunt implicate în:

toxiinfecţii alimentare - p.p.: materii fecale, vărsături, alimente;

infecţii urinare - p.p.: urină;

meningită - pp: LCR;

abces cerebral (P. mirabilis) - p.p.: puroi;

pneumonii - p.p.: spută;

infecţii din sfera ORL: - p.p.: secreţii nazale;

septicemie - p.p.: sânge.

Shigella spp. (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei) produc:

dizenteria bacilară - p.p.: materii fecale emise spontan (recoltate pe sondă Nelaton de la

purtători), vărsături, alimente.

Salmonella spp. (S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis) produc:

salmoneloze: febre tifo-paratifoide;

salmoneloze digestive: toxi-infecţii alimentare, gastro-enterite;

manifestări extra-digestive:

- bacteriemii nontifoidice;

- infecţii pleuro-pulmonare;

Page 19: Lp Bacterio

- afecţiuni osteo-articulare: osteite, osteomielite, artrite septice, etc.;

- infecţii nozocomiale;

- infecţii cardio-vasculare: pericardite, arterite;

- infecţii urinare;

- infecţii abdominale: colecistite, abces al ficatului, splinei;

- infecţii ale SNC: meningite, abces al creierului, abces epidural, etc.

Produsele patologice se recoltează în cazul:

febrei tifoide (S. typhi). de la bolnavi:

în prima săptămână - sânge;

în a II-a săptămână. - materii fecale, bilă, suc duodenal;

în a III-a săptămână - materii fecale, sânge pentru serodiagnostic;

în a IV-a săptămâmă - sânge pentru serodiagnostic;

- de la purtător: materii fecale după administrarea unui purgativ, bilă;

gastroenterite (S. enteritidis) - p.p.: materii fecale, vărsături, alimente;

septicemii - p.p.: sânge.

Diferenţierea enterobacteriilor

Familia Enterobacteriaceae include germeni care se pot multiplica pe medii simple, sunt

aerobi sau facultativ anaerobi, utilizează glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt

oxidazo-negativi şi catalazo-pozitivi. Formează colonii de tip „S” („R” în cazul culturilor

"vechi") sau „M” (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (Escherichia coli,

KlebsielIa spp.) sau sunt lactoză negativi (Salmonella spp., Shigella spp.). Diferenţierea

enterobacteriilor se realizează prin:

Examen direct:

se efectuează doar din produse patologice normal sterile;

se pot evidenţia bacili G-, ciliaţi (Escherrichia coli, Proteus) sau capsulaţi

(Klebsiella).

Izolare:

- pe medii selectiv-diferenţiale pentru enterobacterii (Leifson, Levine, SS - pentru

Shigella şi Salmonella);

- pe medii diferenţiale (geloză lactozată);

- pe medii geloză sânge.

Identificare: caractere morfotinctoriale

Bacteria Coloraţie Dispoziţie Cili Capsulă

Escherichia coli Bacili G- Neregulat Peritrichi -

Klebsiella Cocobacili G- Diplo - +

Proteus Bacili polimorfi G- Neregulat Peritrichi -

Shigella Bacili G- Neregulat - -

Salmonella Bacili G- Neregulat Peritrichi -

caractere de cultură

Bacteria Cultivare pe mediu de cultură solid

Escherichia coli Formează colonii tip „S”, este lactozo +

Page 20: Lp Bacterio

- pe geloză - lactoză produce colonii galbene;

- pe mediu Levine formează colonii violete cu luciu metalic;

- pe geloză-sânge formează colonii cenuşii, unele tulpini produc

hemoliză β;

- pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermentează sorbitolul

sau îl fermentează tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip „S”, 1-3

mm, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz).

Klebsiella Formează colonii mari de tip „M”, cu aspect de "curgere" pe

suprafaţa mediului de cultură (tendinţă de confluare). Este lactozo

+.

Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi

este parţial inhibată pe cele moderat selective.

Proteus - pe medii cu bilă produce colonii tip „S”, transparente, lactozo - ;

- pe medii fără bilă nu formează colonii. Prezintă fenomen de

căţărare, colonii cu caracter invadant, margini dantelate ce pot

acoperi toată suprafaţa mediului;

- fenomenul Dienes:

- dacă tulpinile provin de la aceeaşi specie şi sunt

însămânţate pe aceeaşi placă prin creştere se suprapun;

- dacă tulpinile sunt diferite, între ele rămâne o zonă de

demarcaţie.

Shigella Formează colonii tip „S”, transparente, lactozo -

Salmonella Formează colonii tip „S”, transparente, lactozo -;

colonii “ochi de pisică” pe mediu SS.

caractere biochimice

- importante pentru diferenţierea enterobacteriilor;

- toate descompun glucoza:

enterobacteriile condiţionat patogene sunt L+:

- pe geloză lactozată formează colonii galbene, culoarea mediului virează în

galben;

- pe mediu Leifso produc colonii roşii, culoarea mediului virează în roşu;

enterobacteriile patogene sunt L-:

- colonii transparente, culoarea mediului rămâne neschimbată.

Caractere biochimice

Bacteria TSI MIU Simmons

G L Z H2S Uree I M

Escherichia coli + + + - - + + -

Klebsiella + + + - + V - +

Proteus + - - + + V + +

Shigella + - - - - V - -

Salmonella + - - + - - + +

Identificare antigenică

Bacteria Tipul de reacţii

Page 21: Lp Bacterio

Escherichia coli Reacţii de aglutinare pe lamă:

- cu seruri polivalente;

- apoi ce seruri monovalente pentru EPEC, EIEC, EHEC

(O157H7).

Klebsiella Reacţia de umflare a capsulei (determină prezenţa antigenului K)

Proteus Reacţii de aglutinare pe lamă anti O şi anti H

Shigella Reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri specifice de grup

Salmonella Reacţii de aglutinare pe lamă:

- cu seruri polivalente de AgO;

- cu seruri monovalente pentru serogrupurile A, B, etc.;

- cu seruri monovalente pentru serotip;

- determinarea antigenului Vi.

Determinarea patogenităţii

Klebsiella pneumoniae inoculată la şoareci intraperitoneal sau subcutanat determină

septicemie mortală;

Shigella - testul keratoconjunctivitei la cobai (testul Sereny).

Antibiograma

se efectuează la toate tulpinile isolate;

tulpinile de Proteus spp. pot prezenta multirezistenţă, mai ales cele izolate din

infecţii nozocomiale.

Diagnostic serologic

În febra tifoidă: detectarea şi titrarea anticorpilor faţă de Ag O, Ag H ai S. typhi şi

paratyphi A, B (reacţia Widal).

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli

Genul Escherichia cuprinde în bună parte germeni comensali. Specia reprezentantivă este

Escherichia coli. Deşi, majotitatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiţionat

patogene, există şi tulpini patogene (patotipuri: E. coli enteroagregativ, E. coli

enterohemoragic, E. coli enteroinvaziv, E. coli enteropatogen, E. coli enterotoxigen, E.

coli aderent difuz). Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă

Recoltarea şi transportul se efectuază cu respectarea regulilor impuse pentra aceste

operaţii. Se recoltază materii fecale, lichid de vărsătură etc.

Examinarea macroscopică este urmată de examen de laborator. În cazul infecţiei

produsă de E. coli enterohemoragic (EHEC), materiile fecale pot avea aspect hemoragic,

cu lambouri de mucoasă epitelială. De obicei se face frotiu. Examinarea se face între

lamă şi lamelă şi se pot observa hematii şi PMN.

Cultura. Cultivată pe MacConkey cu D-sorbitol, tulpina EHEC nu fermentează sorbitolul

sau îl fermentează tardiv. Coloniile suspecte, sunt de tip „S”, 1-3 mm, necolorate

(coloniile sorbitol pozitive au o culoare roz).

Identificarea se face pe baza:

Page 22: Lp Bacterio

- caracterelor morfotinctoriale: bacili gram-negativi;

- caracterelor de cultură: colonii de tip „S”, cu caracterele menţionate mai sus;

- caracterelor biochimice (se examinează numai acolo unde sunt condiţii de

biosiguranţă, conform unei Directive Europene): fermentează glucoza (cu producere de

gaz), lactoză-pozitivi, nu fermentează (sau fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S,

pot produce indol, sunt urează-pozitivi, mobili (există şi tulpini imobile) etc.;

- caracterelor antigenice: prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri

monovalente anti O157 şi anti H7).

Antibiograma este recomandată pentru supravegherea apariţiei fenomenului de

rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul în infecţiile urinare În principal se recoltează urină. În funcţie de forma clinică se poate recolta şi sânge (în

pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. Înainte de recoltarea urinei, pe lângă regulile impuse

este necesar să se realizeze toaleta locală. Atunci când nu se poate recolta prima urină de

dimineaţă, trebuie aşteptat pentru recoltare 3-4 ore după micţiune. Dacă p.p. nu este

prelucrat imediat (în maxim 30 de minute după recoltare), trebuie menţinut la

temperatura de refrigerare, iar transportul trebuie realizat la +4°C. Se recoltează urina

"din mijlocul jetului". Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncţie

şi aspiraţie suprapubiană, cateterizare uretrală, cu riscurile respective).

Examenul macroscopic (urina poate fi tulbure) implică pregătirea „sedimentului urinar".

Examinarea preparatului se face între lamă şi lamel, stabilindu-se numărul de bacterii şi

respectiv numărul de PMN pe câmp (dacă există leucociturie).

Cultura. Pentru cultivare se pot utiliza mai medii diferite. Se face o urocultură cantitativă

pentru determinarea numărului de bacterii/ml de urină. Urina se diluează 1/1.000 şi apoi

se însămânţează 0,1 mililitri de urină diluată. Pentru calcul numărului de bacterii/mL

urină, numărul de colonii apărute după cultivare se multiplică cu 10 şi respectiv cu 1000.

Interpretare urocultură cantitativă: dacă numărul de bacterii/ml este mai mare de

100.000, se consideră urocultura ca fiind pozitivă. Lipsa coloniilor sau un număr de

maxim de 10.000 bacterii/ml, semnifică o urocultură negativă.

Dacă urocultură este pozitive, bacteria izolată se identifică pe baza caracterelor prezentate

mai sus şi se tratează pacientul conform antibiogramei.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Klebsiella

Bacteriile din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradează

glucoza cu producere de gaz şi fermentează lactoza. Specia tip este Klebsiella

pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulaţi). Este un microb condiţionat patogen. Poate

produce TLA de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare

etc., inclusiv infecţii nosocomiale.

Pentru diagnostic, se ia ca exemplu cazul de pneumoniei produse de Klebsiella

pneumoniae. Diagnosticul integral include elemente clinice, paraclinice şi de laborator;

diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei şi tratamentului corespunzător.

Recoltarea şi transportul preparatului patologic se face cu respectarea regulilor

cunoscute. Se recoltează spută.

Page 23: Lp Bacterio

Examenul macroscopic poate evidenţia aspectul mucoid, de culoare roşu închis, "în

jeleu de coacăze" al sputei.

Examenul microscopic al p.p. permite observarea prezenţei macrofagelor alveolare,

celulelor inflamatorii (PMN) şi a barililor gram negativi, de dimensiuni relativ mari, cu

capsulă (halou, vizibil).

Cultura. P.p. se cultivă pe medii de cultură obişnuite (18-24 ore, 35-37°C) şi se

examinează coloniile izolate, pentru identificare. Se recomandă utilizarea mediilor slab

selective (MacConkey), deoarece Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt

selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. K pneumoniae formează

colonii lactoză-pozitive, mari, de tip „M”, cu aspect de "curgere" pe suprafaţa mediului

de cultură (tendinţă de confluare).

Identificarea microorganismului se face pe baza caracterelor:

• morfotinctoriale: barili gram-negativi, dimensiuni mari, capsulaţi, dispuşi în

lanţuri scurte, perechi sau izolaţi;

• de cultură: colonii lactoză pozitive, de tip „M”, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4

mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în "picătură de miere", care dau aspectul de

"curgere" pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare;

• biochimice: glucoza pozitiv (cu producere de gaz), lactoză pozitiv, nu produce

H2S, imobil, urează pozitiv, indol negativ, se dezvoltă folosind citratul ca unică sursă de

C;

• antigenice: se utilizează seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de

Klebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (în laboratoare de referinţă);

• testarea sensibilităţii la bacteriofagi.

Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Proteus

Genul Proteus face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde trei specii cu

importanţă medicală: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris şi Proteus penneri. Germenii

din genul Proteus sunt ubicuitar răspândiţi în natură, putându-se întâlni în sol, ape

reziduale, ape de suprafaţă, în materiile organice în putrefacţie, în intestinul omului, în

alimente şi în produse patologice. Sunt bacili Gram-negativi, aerobi sau facultativ

anaerobi, nu fermentează lactoza, produc urează, sunt ciliaţi peritrichi sau lofotrichi şi

foarte mobili. Sunt polimorfi: au forme variate, de la bastonaşe scurte până la forme

lungi, filamentoase. Nu prezintă capsulă şi nici spori. Sunt germeni condiţionat patogeni.

Pot produce TLA de tip infecţios, infecţii ale tractului urinar (ITU), dar chiar şi alte

infecţii (tegumentare, genitale, infecţii nosocomiale etc.).

Diagnosticul de laborator în cazul infecţiilor tractului urinar (ITU) produse de Proteus

Diagnosticul de laborator microbiologic este, bacteriologic, direct.

Recoltarea şi transportul p.p. se realizează cu respectarea regulilor impuse. Produsul

patologic este urina, care poate fi tulbure, purulentă. Transportul trebuie realizat în

maxim 30 minute, iar dacă nu e posibil, p.p. trebuie transportat "la rece" (+ 4°C).

Examenul microscopic al produsului patologic include realizarea preparatului proaspăt

între lamă şi lamelă, din sedimentul urinar. Acest tip de examinare este foarte important,

uşor de realizat, ieftin şi permite observarea unor elemente utile, care orientează

Page 24: Lp Bacterio

diagnosticul şi stabilirea numărului de leucocite/câmp. De asemenea, mobilitatea poate fi

evaluată.

Cultura. Bacteriile din genul Proteus se cultivă pe medii de cultură simple, nu sunt

pretentioase nutritiv. Pe geloza simplă şi pe geloză-sânge cresc avand o caracteristica

unică în familia Enterobacteriaceae de a invada mediul, fenomen numit ,,fenomen de

căţărare’’, ,,fenomen de invazie’’ sau de ,,roire’’. Din locul inocularii, valuri succesive

de cultură migrează concentric până la marginea mediului sau până la întâlnirea cu valul

migrator al altei colonii. Pentru ca rezultatul să fie pozitiv, numărul de bacterii/ml de urină

trebuie să fie >100.000.

Identificarea microorganismului se va realiza pe baza caracterelor:

• morfotinctoriale: bacili gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme

filamentoase de peste 30 μm);

• de cultură:

- fenomenul de invazie (dacă însămânţăm o tulpină la periferia unei plăci Petri cu

mediu simplu, cultura se "dezvoltă în valuri concentrice", pe toată suprafaţa mediului). Pe

anumite medii selective (cu săruri biliare), invazia este inhibată şi se obţin colonii izolate,

de tip „S”, lactoză negative;

- fenomenul "liniei de demarcaţie" (dacă pe o placă cu mediu solid cultivăm 2

tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadând până în apropierea

liniei de întâlnire, unde se va crea o "linie de demarcaţie" între cele 2 tulpini);

- fenomenul de "căţărare";

• biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte caractere biochimice se pot

studia pe mediile mulţi test, TSI, MTU etc.), glucoză pozitive (cu formare de acid şi

gaze), produc H2S, mobile, urează pozitive, fenilalanină pozitive, se pot dezvolta folosind

citratul ca unică sursă de carbon. Specia Proteus vulgaris este singura care produce indol;

• antigenice. Speciile de Proteus prezintă:- antigen somatic O, cu specificitate de

grup şi antigen flagelar H, cu specificitate de tip.

Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice. Sunt,

în general, destul de rezistente la dezinfectanţi şi antiseptice obişnuite. Sunt destul de

răspîndite în mediul spitalicesc şi au rezstenţă destul de mare la antibiotice.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Shigella

Genul Shigella face parte din familia Enterobacteriaceae şi reuneşte 4 subgrupe: A.

Shigella dysenteriae (13 serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18

serotipuri) şi D. S. sonnei (1 serotip cu 2 faze, R şi S). Sunt bacterii strict adaptate

omului, întotdeauna patogene. Sunt întâlnite în intestinul şi materiile fecale ale

bolnavului, convalescentului şi purtătorului aparent sănătos. Sunt bacili Gram-negativi,

neciliaţi, necapsulaţi, nesporulaţi. Sunt bacili gram negativi, imobili, nesporulaţi,

necapsulaţi, aerobi sau facultativ anaerobi, glucoză pozitivi (fără producere de gaz),

oxidază negativi, lactoză negativi. Subgrupele se pot diferenţia, pe baza fermentării

manitei (subgrupul A este manită negativ).

Omul reprezintă rezervorul de Shigella. Bacteriile sunt eliminate în mediul extern prin

materiile fecale, contaminând apa, alimentele, solul. Transmiterea este directă fecal-orală.

Poarta de intrare este tractul digestiv, prin consum de apa şi alimente contaminate.

Page 25: Lp Bacterio

Speciile mai frecvent întâlnite sunt S. dysenteriae şi S. flexneri, fiind şi cele maivirulente.

Controlul infecţiei se face prin igiena personală şi comunitară.

Produc infecţii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate să apară după ingestia a

numai 10-100 bacterii. Shigella spp. pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.

Shigelele produc exotoxine care acţionează ca enterotoxine (toxina Shiga în cazul

infecţiei cu Shigella dysenteriae, cu efect neurotoxic, citotoxic, enterotoxic).

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) şi trebuie stabilit rapid.

Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale) se efectuează cu respectarea regulilor

cunoscute.

Examenul macroscopic al materiilor fecale poate indica prezenţa unor cantităţi mici de

mucus, puroi, sânge. Transportul trebuie să fie realizat rapid (se recomandă însămânţarea

la patul bolnavului; altfel, trebuie să fie folosit un mediu de transport, Cary-Blair).

Recoltarea se poate face şi cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoid.

Examenul microscopic al p.p. este foarte important. El poate oferi un răspuns concret,

rapid şi util. Se examinează preparatul între lamă şi lamelă, iniţial cu obiectivul 40x.

Dacă se evidenţiează numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip invaziv,

iar dacă se remarcă un procent de peste 75% PMN, alături de hematii, acest aspect este

sugestiv pentru dizenteria bacteriană.

Cultura. Prima izolare se face pe medii slab sau moderat selective şi medii diferenţiale

(ADCL, Istrate-Meitert). Dacă apar colonii lactoză negative, coloniile transparente,

lactozo-negative sunt însămânţate pe medii (TSI, MIU, MILF, Simmons-citrat, uree),

pentru identificare biochimică prezumptivă.

Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:

morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, unele tulpini posedă capsulă;

de cultură: produc colonii de tip „S”, lactoză negative, 1-2 mm, transparente;

biochimice: sunt glucoză pozitivi, fără producere de gaz, lactoză negativi, nu

produc H2S, imobili, urează negativi, indol negativi (excepţie S. flexneri), oxidază

negatvi, citrat negativi, lizină negativi;

antigenice: se utilizează seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri imune

specifice de tip (reacţii de aglutinare pe lamă, conform schemelor de lucru). Antigenele

mai importante sunt: antigenul somatic O, care stă la baza împărţirii în 4 grupe

antigenice; Grupul A: S. Dysenteria; Grupul B: S. Flexneri; Grupul C: S. Boydii; Grupul

D: S. sonnei şi antigenul K;

testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizată în scop

epidemiologic.

Antibiograma este recomandată. Se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată

atât în special în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente, cât şi pentru

stabilirea tratamentului antimicrobian corespunzător.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Salmonella

Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde o singura specie,

Salmonella enterica. Aceasta specie cuprinde peste 2300 serotipuri diferenţiate pe baza

antigenelor somatice O şi flagelare H. Principalul habitat al salmonelelor este tractul

intestinal al omului şi animalelor. Aceste doua surse vor determina poluarea solului,

Page 26: Lp Bacterio

apelor reziduale, apelor de suprafaţă în care pot supravieţui de la câteva luni la câţiva ani,

în condiţii de temperatură şi pH favorabile.

Genul Salmonella include bacili gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, mobili cu cili

peritrichi, necapsulaţi, nesporulaţi, nu fermentează lactoza, produc H2S, utilizează citratul

ca unică sursă de carbon. Pot produce salmoneloze minore (TIA) şi salmoneloze majore

(febra tifoidă). În cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic,

direct. În cazul afecţiunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic şi serologic.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cu localizare digestivă

Recoltarea şi transportul p.p. se efectuează cu respectarea regulilor cunoscute.

Preparatul patologic este reprezentat de materii fecale.

Examenul microscopic al p.p. se face între lamă şi lamelă şi se remarcă prezenţa

granulocitelor.

Cultura. Salmonella spp. se cultivă pe următoarele medii de cultură: un mediu lichid de

îmbogăţire (bulion selenit) şi două medii selectivo-diferenţiale (MacConkey şi ADCL).

După 18-24 ore la 35-37°C, pe mediile solide pot apărea colonii bacteriene suspecte

(lactozo-negative) din care se obţine cultura pură. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit

se repică pe medii solide. Pe mediile selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-

negative de tip „S”. Producerea de H2S, evidenţiată prin apariţia unei pete de culoare

neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească ,, în ochi de pisică’’. Pe

mediul Wilson-Blair formează colonii opace, rugoase, cu margini neregulate, negre, cu

luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru Salmonella sunt mediile cu selenit, azid de

sodiu şi bulionMuller-Kauffmann.

Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:

morfotinctoriale: sunt bacili gram-negativi;

de cultură: pe medii selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-negative de

tip „S”, necolorate (pe mediu MacConkey). Producerea de H2S, evidenţiată prin aparţia

unei pete de culoare neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească ,, în ochi

de pisică’’ (pe mediu ADCL). Pe mediul Wilson-Blair formează colonii opace, rugoase,

cu margini neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru Salmonella

sunt mediile selenit azid de sodiu şi bulionMuller-Kauffmann;

biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt germeni lactoză-

negativi, produc H2S, indol negativi, lizină pozitivi şi utilizează citratul ca unică sursă de

carbon;

antigenice: reacţii de aglutinare pe lamă prin utilizarea serurilor imune cu Ac anti-

O şi ulterior Ac anti-H, cu respectarea protocolului de lucru. Salmonella prezintă trei

tipuri importante de antigene: antigenul somatic O, este rezistent la căldură şi alcool,

prezintă specificitate de grup; antigenele de suprafaţă (înveliş, antigenul Vi este un

antigen specific de suprafaţă întlânit doar la trei serovaruri Salmonella: typhy, paratyphy

C, Dublin; antigenele flagelare H, sunt proteine labile termic situate la nivelul cililor.

Fenomenul de variaţie de fază se întâlneşte la multe tipuri de salmonele, astfel putând să-

şi schimbe tipul de specificitate al flagelilor cu un altul.

LPS (lipopolizaharidul) bacteriilor din genul Salmonella este conţinut de învelişul celular

şi eliberat după liza bacteriană şi funcţionează ca endotoxină. Aceasta poate juca un rol

important în patogeneza multor manifestări clinice: febră, activarea sistemelor de

coagulare, scăderea contractilităţii miocardului, şoc septic. Patogenitatea salmonelelor

Page 27: Lp Bacterio

este datorată factorilor de virulenţă, adezinele şi toxinele enterotoxinele termo-stabilă

(ST), termo-labilă (LT), verotoxina (toxina Shiga-like), citotoxina implicată în invazia şi

distrucţia celulară, antigenul Vi cu rol de adezină, fimbrii.

sensibilitate la bacteriofagi.

Antibiograma este recomandată în cazul pacienţilor foarte în vârstă sau în cazul copiilor

foarte mici, prematuri, cu alte boli adăugate şi pentru supravegherea apariţiei

fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice. Sunt sensibile la cloramfenicol,

streptomiocină, tetraciclină, ampicilină, dar au apărut şi tulpini plurirezistente.

Diagnosticul de laborator în febrele enterale (febra tifoidă)

Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea şi identificarea bacteriei S. typhi din p.p.

Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele prezentate anterior.

În prima săptămână de boală, p.p. este reprezentat de sânge; ulterior pot fi recolte materii

fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. Dacă p.p. este reprezentat de materii

fecale, se respectă procedura indicată mai sus (există şi unele particularităţi). Coloniile de

S. typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL. S. typhi nu produce gaz

din glucoză, H2S fiind produs în cantitate mică. Nu foloseşte citratul ca unică sursă de

carbon. Pentru identificarea AgO este necesară o inactivare prealabilă (termică). Prezenţa

AgVi poate crea probleme în identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utilă. Testarea

sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice este indicată în toate infecţiile produse de S.

typhi.

Diagnosticul serologic se realizează cu respectarea principiile generale. Serodiagnosticul

Widal (folosind culturi vii) nu se mai practică astăzi. Tehnica actuală poartă numele de

analiză serică cantitativă (aglutinare în tuburi), în cadrul căreia se utilizează serii de

tuburi (câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Pentru a evidenţia Ac anti-O (TO

- S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphiB) şi anti-H (d - S. typhi, a-S. paratyphi

A, b -S. paratyphi B) se folosesc 6 serii de tuburi. Se pregătesc diluţiile, se incubează

pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei, iar

pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei şi apoi se

procedează la citirea reacţia. Un titru de 1/250 în cazul Ac anti-O şi unul de 1/2.500 în

cazul Ac anti-H sunt sugestive. Creşterea de 4 ori a titrului, la 2 determinări succesive

confirmă diagnosticul.

În cazul convalescenţilor şi purtătorilor este recomandată reacţia de aglutinare în tuburi

pentru identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi (titru mai mare de 1/40).

Page 28: Lp Bacterio

1

Diagnosticul de laborator al infecţiilor virale: Hepatita, infecţii

virale respiratorii, infecţia HIV/SIDA

Virusuri

Particularităţi

Virusurile reprezintă structuri acelulare cu potenţial infecţios, cu dimensiuni de ordinul

nm (20-400 nm). Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic (AN:

ADN sau ARN). Virusurile sunt lipsite de metabolism propriu, fiind paraziţi obligaţi

intracelulari. Nu cresc şi nu se divid, se reproduc în celule vii, nu pot fi cultivate pe medii

artificiale. Manifestă rezistenţă naturală la antibiotice.

Clasificarea virusurilor

- după tipul AN (cu genom ARN/ADN);

- după dimensiuni (mici: 20-50 nm; medii: 50-150 nm, mari: peste 150 nm);

- după tipul de simetrie a capsidei (helicoidală, cubică, mixtă);

- după compoziţia chimică: virusuri simple constituite din acid nucleic (AN) şi înveliş

proteic - capsida (ansamblu numit nucleocapsidă); virusuri complexe alcătuite din

nucleocapsidă şi un înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsidă, peplos);

- după gazdă (om, animal, insectă, bacterie);

- după sensibilitatea în mediul extern, la substanţe chimice, etc.

Diagnosticul hepatitelor virale

Hepatitele virale reprezintă probabil cel mai comun tip de infecţie virală din lume.

Cercetările asupra etiologiei acestor boli au dat rezultate remarcabile în ultimii 25 ani.

Astfel, sunt identificate şi bine caracterizate o serie de virusuri hepatotrope: virusurile

hepatitelor A, B, C, D şi E. În ultimii doi ani au mai fost descrise două virusuri cu

tropism hepatic la om: virusurile hepatitei F si G.

Diagnosticul hepatiei virale A

Hepatita A. Virusul hepatitei A (HAV) a fost descoperit în anul 1972. Este un

picornavirus (aparţine genului Enterovirus) şi se prezintă sub forma unei particule sferice

de 27 nm care conţine ARN. Viremia este de foarte scurtă durată şi, de aceea,

determinarea HAV în sânge este lipsită de importanţă. Hepatita A este cea mai uşoara

formă de hepatită, se vindecă în 99% din cazuri, se transmite pe cale orală prin apă şi

alimente infectate, mâini murdare, alimente crude consumate nespălate; virusul se

elimina prin materiile fecale; de obicei, boala se vindecă rapid şi complet, nu duce la

hepatită cronică. După o scurtă perioadă de incubaţie, virusul este excretat în fecale,

fazele preicterică şi icterică apărând la aproximativ două săptămâni. Încă de la debutul

acestor faze apar de regulă şi IgM anti-HAV şi cresc transaminazele. Nivelurile crescute

ale IgM anti-HAV sunt prezente doar în faza acută şi dispar în aproximativ 10 săptămâni.

Din acest moment, apar IgG anti-HAV care conferă protecţie. În practică se dozează doar

IgG. Din punct de vedere evolutiv este notabilă absenţa portajului cronic. Receptivitatea

la boală este generală. Profilaxia se realizează prin izolarea bolnavilor şi controlul

Page 29: Lp Bacterio

2

contacţilor, educaţie sanitară, protecţia apei şi alimentelor, controlul igienico-sanitar.

Există şi profilaxia specifică, în cazuri individuale, cu gamaglobulină.

Produs patologic:

- sânge, salivă - pentru evidenţierea anticorpilor;

- materiile fecale;

- biopsie din ficat pentru evidenţierea virusului.

Examen direct (nu se practică de rutină) se face din biopsie hepatică prin reacţii

imunohistochimice şi din materii fecale prin reacţii antigen-anticorp (greu evidenţiabile la

începutul bolii) pentru evidenţierea virusului din materii fecale prin ME şi evidenţierea

antigenelor virale.

Izolare: nu se practică de rutină; deşi virusul poate creşte pe linii celulare, nu produce

efect citopatic.

Diagnosticul serologic urmăreşte dinamica apariţiei anticorpilor:

- IgM: apar odată cu primele simptome de boală - ajung la titru maxim în 1-3

săptămâni, dispar în 3-6 luni;

- IgG: apar după aproximativ o lună de la infecţie, ajung la titru maxim în 3-6 luni,

apoi persistă la un nivel detectabil toată viaţa;

- anticorpii se detectează prin ELISA.

Diagnosticul Hepatitei virale B

Hepatita B este o boală de natură infecţioasă, agentul patogen fiind virusul hepatitei B

(HBV).Virusul este de tip ADN (adenovirus) (aparţine familiei Hepadnaviridae), iar

boala mai este cunoscută şi sub denumirea de hepatită serică. Particula virală de 27 nm

este alcătuită dintr-o anvelopă lipoproteică care conţine antigenul HBs şi o nucleocapsidă

centrală (miez) care conţine ADN circular şi ADN-polimerază. Capsida formează

antigenul central (HBc) căruia îi este asociat (sub formă mascată) antigenul HBe. Acesta

din urmă poate fi regăsit în sângele circulant sub formă liberă sau asociată. Mai trebuie

mentionat că antigenul HBs prezintă numeroase subtipuri. Virusul hepatitei B este

prezent în sange şi în ţesuturi, se elimină prin salivă, lacrimi, secreţii genitale, spermă,

sînge menstrual, care sunt şi principalele elementele de transmitere a bolii; se poate

transmite de la mamă la copilul nou născut în timpul sarcinii; din 100 de bolnavi adulţi cu

hepatită acută B, 95 se vindecă, 5 fac hepatită cronică şi 2 mor prin complicaţii ale

hepatitei cronice (ciroză sau cancer de ficat); dacă hepatita acută B a fost făcută în

copilarie, sub vârsta de 5 ani, riscul de a deveni purtator este de cca 90%, iar cel de

cronicizare este de 25-80%. Dacă hepatita acută a fost contractată în perioada de adult,

riscul de cronicizare este mult mai mic de 3-10%.

Produs patologic:

- sânge pentru detectarea markerilor virali (antigene şi anticorpi);

- ţesut hepatic - detectarea antigenelor virale;

- virusul se mai elimină prin secreţii genitale, salivă.

Izolare: virusul HBV nu este cultivabil.

Diagnostic:

Cei mai utilizaţi markeri virali în aprecierea evoluţiei sau nu a infecţiei cu virus B sunt:

Page 30: Lp Bacterio

3

Antigenul HBs (Ag HBs) o proteina de la suprafaţa virusului B al hepatitei:

- apare la 4 săptămâni de la contactul cu virusul B;

- în hepatita cronică persistă mai mult de 6 luni;

- dispare în caz de vindecare dar uneori persistă în organism chiar dupa vindecare,

situaţie numită de “purtător sănătos (inactiv) de virus B hepatitic”.

Anticorpii HBs (Ac HBs) sunt anticorpii impotriva proteinei S a virusului:

- apar atunci când se elimină virusul din corp, dar şi în cazul vaccinării;

- prezenţa sa în organism, nu înseamna că ai virusul, ci ca ai anticorpi împotriva

virusului, obtinuţi prin vindecarea unei hepatite sau în urma vaccinarii împotriva

virusului B;

- cine are acesti anticorpi, este imun la virusul hepatitei B.

Antigenul HBc (Ag HBc) este o substanţă care se găseşte în interiorul virusului, prezenţa

sa arată ca virusul se găseşte în interiorul organismului uman, în sânge şi ficat.

Anticorpii impotriva HBc (Anti-HBc) sunt anticorpii impotriva proteinei C, prezenţa lor

nu înseamnă vindecarea hepatitei, decât dacă se asociază şi cu prezenţa AcHBs. Sunt

doua tipuri de anticorpi anti HBc: Anti HBc IgM, care arată un contact recent cu virusul

hepatitei B (infecţie acută) de cel mult 6 luni; Anti HBc IgG, care arată o infecţie veche

(cronică) cu virusul hepatitei B şi faţă de cel anterior, persistă toată viţta (nu numai 6

luni).

Antigenul HBe (Ag HBe) este o proteina a virusului hepatitei B:

- se găsşste în sînge doar dacă este prezent şi virusul;

- de obicei dispare la vindecarea bolii;

- există şi variante de virus hepatitic B fără acest antigen (mutanţi), destul de

frecvente şi în România, mai ales dacă pacientul a facut tratament cu lamivudină.

Anticorpii impotriva HBe (Anti HBe) sunt anticoprii împotriva proteinei E a virusului B:

- apariţia lor într-o hepatită acută înseamană vindecarea bolii;

- persistă o perioadă îndelungată în sânge;

- apariţia lor într-o hepatită cronică poate însemna vindecarea sau lipsa de îmulţire a

virusului.

Acidul nucleic al viruslui B (AND-VHB):

- detecţia sa în sânge înseamnă prezenţa virusului;

- în funcţie de concentraţia sa, se poate spune că persoana are:

hepatită cronică cu virus B, dacă concentratia >2.000 UI/ml;

purtator inactiv de virus B, dacă concentraţia <2.000 UI/ml;

hepatita B ocultă, dacă concentraţia este <200 UI/ml.

Markeri virali detectabili din sânge prin ELISA:

- Ag HBs, Ac anti HBs;

- Ag HBe, Ac anti HBe;

- Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare);

- Ac anti HBc;

- din sânge se mai poate evidenţia ADN-ul viral prin PCR, polimeraza (cercetare).

Markeri virali detectabili din biopsie hepatică prin imunohistochimie:

-Ag HBs;

- Ag HBc;

- AgHBx (markerul cronicizării şi al malignizării - cercetare);

Page 31: Lp Bacterio

4

- ADN viral.

Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge:

AgHBs:

- se evidenţiază primul, apare în perioada de incubaţie (la 1-2 săptămâni de la

infecţie) scade în convalescenţă;

- dispare odată cu apariţia anticorpilor antiHBs;

- detectarea lui după 6 luni de la infecţie semnifică cronicizare.

AgHBe:

- se evidenţiază încă din perioada de incubaţie, imediat după apariţia AgHBs;

- dispare în convalescenţă odată cu apariţia anticorpilor antiHBe;

- detectarea lui indică infectivitatea persoanei.

Anticorpi antiHBc:

- primii anticorpi produsi, apar odată cu simptomele bolii şi persistă mai mulţi ani;

- se determină IgM sau Ig totale (IgG+IgM);

- detectarea IgM indică replicare virală.

Anticorpi antiHBe: apar după anticorpii antiHBc.

Anticorpi antiHBs:

- apar la câteva luni sau ani de la infecţie, după anticorpi antiHBe;

- detectarea lor indică instalarea imunităţii.

Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge

Profiluri serologice posibile în hepatita virală B:

Prezenţa AgHBe = infectivitate:

- AgHBs + IgM antiHBc = hepatită acută;

- AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecţie persistentă;

- AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatită cronică.

Prezenţa Ac anti HBs = vindecare:

- Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecţie recentă, vindecată;

- Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru scăzut) = infecţie în antecedente,

vindecată;

- Ac anti HBs (fără alţi markeri) = imunitate postvaccinală;

- Persistenţa AgHBs după 6 luni = infecţie persistentă.

Page 32: Lp Bacterio

5

Diagnosticul Hepatitei virale C

Hepatita C. Virusul hepatitei virale C (HCV) este denumit şi virusul hepatitei non A-B,

like-B sau virusul posttransfuzional. Aparţine familiei Flaviviridae şi se prezintă sub

forma unei particule cu diametrul de 50-60 nm care conţine o anvelopă lipidică cu

proteine transmembranare şi ARN monocatenar.

Majoritatea subiecţilor infectaţi cu HCV prezintă modificări clinice minime şi doar câţiva

necesită spitalizare. Perioada de incubaţie este de 3-150 zile (cel mai frecvent fiind de 8

săptămâni). Mai mult de 60% din cazurile infectate prezintă niveluri uşor crescute ale

transaminazelor pe o perioadă mai mare de un an, iar biopsia hepatică arată în majoritatea

cazurilor caracteristici de afectare hepatică, iar în 10% din cazuri ciroză. O variaţie

marcată într-o perioadă scurtă de timp a nivelului transaminazelor este o trăsătură a

hepatitei C. Debutul formei acute este nespecific şi la 25% din cazuri este urmat de icter.

Boala nu poate fi diferenţiată de hepatita B doar prin examen clinic. Virusul este prezent

în sânge şi ţesuturi, care reprezintă principalele elemente de transmitere; transmiterea prin

contact sexual şi de la mamă la copil în timpul sarcinii sunt foarte rare; poate să evolueze

către hepatită cronică mai frecvent decât hepatita B - 80% din cazuri, aceasta putând să se

complice cu ciroză sau cancer de ficat.

Seroconversia este tardivă, prezenţa anticorpilor fiind caracteristică mai ales perioadei de

convalescenţă şi hepatitei cronice. Doar în 55% din cazuri anticorpii apar în prima lună;

15% din cazurile de hepatită C sunt seronegative. De asemenea, există reacţii fals

pozitive obţinute prin utilizarea truselor ELISA anti-HCV. Cea mai sigură metodă de

diagnostic este determinarea ARN viral din plasmă prin PCR (polymerase chain reaction)

la subiecţii pozitivi în urma unui test ELISA. În prezent, sângele donatorilor este testat

prin ELISA pentru HBV, HCV şi HIV.

Produs patologic:

- sânge;

- ţesut hepatic.

Examen direct: evidenţierea acidului nucleic din sânge (viremie) sau din ficat prin PCR.

Izolarea nu se practică.

Diagnostic serologic:

- detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA, metode radioimune, folosind antigene

recombinate;

- detectarea imunoglobulinelor prin metode Western-blot.

Diagnosticul hepatiei virale D

Hepatita D. Virusul hepatitei D (HDV) a fost descoperit în 1976 şi se mai numeşte şi

agentul delta. Este un virus hepatotropic defectiv, întrucât replicarea şi infectivitatea sa se

realizează doar în prezenţa HBV de care depinde sinteza anvelopei externe. Calea de

transmitere este cea parenterală. Infecţia cu HDV este acută sau cronică. Există două

forme de infecţie acută: coinfecţia cu HBV. Ea se poate asocia cu cazuri de hepatită

fulminantă. Este sugerată doar de serologie (apariţia anticorpilor anti-HDV);

suprainfecţia cu HDV a unor cazuri de hepatită B cronică; în 80-90% din cazuri se trece

la cronicizarea infecţiei, cu persistenţa HDV în ficat. Clasic, se descrie situaţia unui

purtător cronic de HBV, cu nivele normale ale transaminazelor. Apoi are loc creşterea

Page 33: Lp Bacterio

6

persistentă a acestor enzime cu apariţia anticorpilor anti-HDV care persistă la un titru

ridicat o perioadă lungă de timp. Infecţia cronică are un prognostic prost pentru bolnav.

70-80% din aceste forme evoluează spre ciroză (15% în mai puţin de doi ani). În practică,

serologia determină doar IgM anti-HDV. Evoluţia favorabilă este dată de scăderea rapidă

a titrului de anticorpi. De asemenea, se mai pot determina (mai greu şi nu curent)

antigenul HDV şi ARN viral, utile în cazurile de cronicizare.

Produs patologic:

- sânge;

- ţesut hepatic.

Examen direct:

- evidenţierea virusului în nucleul hepatocitelor prin ME, metode imunohistochimice;

- evidenţierea ARN-ului viral din sânge, după tratarea serului cu detergenţi pentru a

îndepărta AgHBs care înveleşte virusul.

Diagnostic serologic:

- evidenţierea anticorpilor anti HDV prin ELISA.

Diagnosticul hepatitei virală E

Hepatita E. Virusul hepatitei E(HEV) a fost descoperit în 1988 şi aparţine familiei

calicivirusurilor. Nu prezintă anvelopă externă, are dimensiuni de 32-34 nm şi conţine

ARN. A mai fost denumit virusul hepatitei non-A-B A-like, iar anglosaxonii îl notează

Hev. Infecţia are o cale de transmitere oro-fecală şi se întâlneste în regiuni ale lumii a

treia cu condiţii precare de igienă (Africa de Nord, Orientul Apropiat şi Mijlociu). Are o

perioadă de incubaţie de 21-42 de zile, iar boala survine, de obicei, acut şi nu se însoţeşte

de icter. Serologia nu este încă aplicabilă. Din punct de vedere evolutiv, infecţia nu este

urmată de portaj cronic. De menţionat este însă gravitatea bolii la gravide, mortalitatea

cazurilor infectate ajungând la 20%. În rândul populaţiei generale mortalitatea este de 1-

2%.

Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinând forme uşoare de boală, cu excepţia

femeilor gravide la care boala poate avea o evoluţie letală.

Boala evoluează epidemic în Asia, în nord-vestul Africii şi în Mexic. Foarte rar apare în

SUA. Nu s-au descris cazuri la noi în ţară.

Hepatita F. Hepatita F (hepatita non-A-E) a fost raportată recent în cazuri izolate din

Europa de Vest, S.U.A. şi India. HFV a fost izolat din fecalele subiecţilor infectaţi, unde

apare sub formă de particule cu dimensiuni de 27-37 nm care conţin o moleculă de ADN

dublucatenar de aproximativ 20 kb. Acest virus diferă substanţial de HAV şi HEV,

ambele alcătuite din câte o moleculă de ARN monocatenar de 7,5 kb. Nu există teste

serologice pentru diagnosticul hepatitei F, dar el poate fi pus în evidenţă în urma

examinării prin microscopie electronică a scaunului pacienţilor. Sunt suspecte de a

prezenta infecţia acele cazuri de hepatită a căror etiologie nu poate fi determinată în urma

testării pentru celelalte virusuri.

epatita G. Virusul hepatitei G (HGV) a fost descoperit recent şi mai este frecvent

denumit virusul GB. HGV aparţine familiei Flaviviridae şi are un genom reprezentat de o

Page 34: Lp Bacterio

7

moleculă de ARN monocatenar de aproximativ 9,5 kb. Se transmite şi are evoluţie ca a

virusului hepatitic C.

Diagnosticul de laborator în afecţiuni respiratorii

Diagnosticul de laborator în gripă

Gripa este o boală infecţioasă acută foarte contagioasă, obişnuit autolimitată, febrilă,

cauzată de virusul gripal.

Virusul gripal (Myxovirus influenzae):

- aparţine familiei Orthomyxoviridae;

- are o forma sferică, cu diametrul de 80-120 nm;

- conţine un lanţ unic negativ ARN compus din 8 fragmente care codifică 10 proteine

virale;

- fragmentele de ARN au un înveliş proteic comun, constituit dintr-o membrană

lipidică, care le uneşte formând nucleoproteidul (antigen-S), care determină tipul

virusului (A, B sau C);

- la suprafaţa virusului se află structurile superficiale: hemaglutinina (hemaglutinina

asigura capacitatea virusului de a se uni cu celula receptor) şi neuraminidaza (răspunde

de capacitatea particulei virale de a pătrunde în celula gazdă şi de a ieşi din celulă după

multiplicare);

- structurile superficiale (hemaglutinina şi neuraminidaza) au specificitate de subtip şi

de tulpină; determină diferitele tulpini ale unui tip de virus. Există 16 subtipuri antigenice

ale hemaglutininei (H1-H16) şi 9 ale neuraminidazei (N1-N9).

Virusul gripal A:

- produce îmbolnăvirea de gravitate medie sau mare;

- infectează atât omul cât şi unele animale domestice (calul, porcul, păsările);

- este responsabil de apariţia pandemiilor şi a epidemiilor extinse;

- prezintă o multitudine de subtipuri ale gripei A, clasificate după antigenii

superficiali (16 tipuri de hemaglutinină şi 9 tipuri de neuraminidază).

Virusul gripal B:

- este capabil să îşi modifice structura antigenică;

- este prezent numai la om şi are manifestări epidemice moderate, cu o evoluţie lentă.

Virusul gripei C:

- este destul de puţin studiat;

- conţine doar 7 fragmente de acid ribonucleic şi un antigen superficial;

- infectează doar omul;

- simptomele bolii sunt foarte uşoare sau nu se manifestă deloc;

- nu produce epidemii şi nu duce la urmări serioase;

- este cauza unor îmbolnăviri sporadice, în special, la copii;

- structura antigenului nu este supusă unor transformări ca la virusul gripei A.

Variaţia antigenică este particularitatea fundamentală a virusurilor gripale A si B. Aceasta

are loc la nivelul antigenilor superficiali ai virusului (hemaglutinina şi neuraminidaza).

Există două mecanisme ale variaţiei antigenice: minoră (antigenic drift) şi majoră

(antigenic shift). La virusul gripal A se întâlnesc ambele variaţii antigenice, în timp ce la

virusul B se manifestă numai variaţia antigenică minoră.

Page 35: Lp Bacterio

8

Evoluţia gripei este endemică, cu manifestări epidemice la interval de 2-3 ani pentru

virusul de tip A şi 4-6 ani pentru virusul de tip B. Pandemiile care apar datorită unor

tulpini complet noi a virusului, provenite, de obicei, din Extremul Orient, intervin la 10-

20 ani. Gripa prezintă periodicitate sezonieră, cazurile apărând în sezonul rece, de obicei,

iarna-primăvara:

incubaţia: 18-36-72 de ore;

debutul este brusc, uneori brutal cu frisoane, febră 39-40°C, mialgii, cefalee,

astenie;

perioada de stare este dominată de semne toxice generale; sunt prezente:

- febra înaltă 3-5 zile, faciesul uşor congestionat, cefalee, dureri în globii oculari,

mialgii, astenie marcată, tulburări de somn, apatie, iritabilitate;

- manifestări respiratorii: catar nazal, enantem difuz, durere sau arsură

retrosternală (traheite), tuse uscată;

- manifestări viscerale diverse: cardiovasculare, digestive;

perioada de convalescenţă în care persistă manifestări ca astenie, subfebrilitate,

tuse, irascibilitate.

Diagnosticul virusologic este necesar în cazul unei epidemii într-o colectivitate (institut)

sau când rezultatul poate influenţa decizia terapeutică.

Produs patologic:

- secreţie faringiană, nazală sau nazofaringiană;

- lichid de spălătură nazofaringiană;

- aspirat bronşic;

- ţesut pulmonar - diagnostic postmortem;

- sânge:

Examen direct:

- evidenţierea antigenelor virale: prin RIF, ELISA (RHA-HAI);

- se pot diferenţia tipurile A si B prin metode rapide (15-30 minute) -

imunocromatografice;

- rezultatele negative se verifică prin metoda de cultivare;

- evidenţierea acizilor nucleici virali RT - PCR.

Izolare şi identificare:

Izolarea virusului este singura metodă care permite caracterizarea specifică a subtipurilor

circulante.

cultivare pe OGE - inoculare intra-amniotică: se determină prezenţa

hemaglutininelor (hemadsorbţie);

cultivare pe culturi de celule:

- efect citopatogen discret;

- replicarea virală se evidenţiază prin hemadsorbţie;

- RIF - diferenţiază tipurile A şi B.

Diagnostic serologic:

- evidenţierea seroconversiei: RFC;

- reacţia de hemaglutinoinhibare.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de rhinovirusuri

Rhinovirusuri sunt agenţi etiologici ai răcelii comune.

Page 36: Lp Bacterio

9

Produs patologic:

- lichidul de spălătură nazală - recoltat în perioada de început a bolii, cînd excreţia

virală este maximă.

Examen direct:

- detectarea antigenelor virale în lichidul de spălătură nazală - reacţia ELISA.

Izolarea şi identificarea:

- linii celulare HeLa sau culturi de fibroblaşti umani;

- efectul citopatic - rotunjirea celulelor.

Diagnostic serologic:

- detectarea anticorpilor prin:

- reacţia de virus-neutralizare;

- reacţia ELISA.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de virusul sinciţial respirator (VSR)

virusul sinciţial respirator face parte din familia Paramyxoviridae;

afectează persoane de toate vârstele, în special copii până la 2-3 an;

produce epidemii iarna;

cel mai frecvent determină:

- simptome asemănătoare răcelii;

- pneumonie;

- bronşiolită (gravă la pacienţi imunodeprimaţi).

Produs patologic:

- lichid de spălătură nazofaringiană;

- sânge.

Examen direct:

- evidenţierea antigenelor virale prin RIF, ELISA;

- evidenţierea ARN prin RT-PCR.

Izolare şi identificare:

- cultivare pe linie HeLa sau HEp-2 - evidenţierea efectului citopatogen.

Diagnostic serologic:

- evidenţierea seroconversiei: RFC, ELISA.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de adenovirusuri

determină apariţia unor infecţii cu localizări multiple:

- infecţii respiratorii inferioare şi superioare;

- conjunctivită;

- cistită hemoragică;

- gastroenterite;

- infecţii la pacienţi cu transplant de organe.

Produs patologic:

- exsudat faringian, nazal, nazofaringian;

- spută;

- secreţie conjunctivală;

- urină;

Page 37: Lp Bacterio

10

- materii fecale;

- sânge.

Diagnostic direct:

detectarea antigenelor virale prin RIF

Izolare şi identificare:

- linii celulare: efect citopatogen (aglomerarea celulelor în ciorchine), incluzii

nucleare;

- unele adenovirusuri enterice nu sunt cultivabile:

Diagnostic serologic:

determinarea seroconversiei:

- RFC - detectează anticorpi specifici de grup;

- RHAI - anticorpi specifici de tip.

Diagnosticul de laborator în infecţia HIV

HIV reprezintă prescurtarea în limba engleză a Human Immunodeficiency Virus (Virusul

Imunodeficienţei Umane). Aceste virusuri fac parte din categoria retrovirusurilor.

Virusurile HIV se împart în două grupe:

- grupa HIV-1 care cuprinde trei subtipuri M, N şi O. Virusurile din subtipul M, cu

răspâdirea cea mai largă în lume, se împarte la rândul lui în subtipurile A şi B. Subtipul B

este cel mai răspândit în Europa de vest şi în America de Nord;

- grupa HIV-2 se împarte la rândul său în subtipuri. Cele mai frecvente sunt

subtipurile A şi B. Această subgrupă este prezentă preponderent în Africa de vest, dar

care se răspndeşte însă şi în Europa; 15% din persoanele nou infectate în Portugalia în

2005 au fost infectate cu virusul HIV-2.

HIV-1 şi HIV-2 se aseamănă din punct de vedere al evoluţiei şi simptomelor clinice a

infecţiei. Evoluţia HIV-2 se pare că este mai lentă decât HIV-1. Ambele virsuri au

aceeaşi prezentare sub microscopul electronic, dar se deosebesc prin greutatea moleculară

a proteinelor şi ordinea genelor.

Contaminarea

Virusul HIV (HIV) se transmite prin sânge, spermă, secreţii genitale, lichid cefalo-

rahidian (LCR) şi lapte matern. Porţile de intrare cele mai frecvente sunt rănile proaspete,

sângerânde din mucoasă (oculară, bucală, vaginală, anală) sau rănile nevindecate sau

insuficient protejate de pe oricare parte a pielii corpului.

Căile de transmitere:

- vaginale sau anale datorate nefolosirii prezervativelor şi practicii sexuale orale;

- intravenoase prin folosirea în comun de toxicomani a acelor de seringă;

- transfuzii de sânge şi produse preparate din sânge;

- intrauterine sau la naştere în timpul travaliului, cînd HIV se poate transmite de la

mamă la făt (în 10-30% din cazuri);

- prin înţepături, tăieturi sau contactul direct pe pielea lezată, neprotejată

corespunzător în cazul personalului sanitar care poate veni în contact cu secreţiile şi

sângele pacientului infectat.

Structură şi funcţionare - HIV este un retrovirus circular, cu diametrul este de 100-200 nm, din specia

lentivirusurilor;

Page 38: Lp Bacterio

11

- este înconjurat de un înveliş lipoproteic, care se formează din membrana celulei

gazdă, având şi o parte din proteinele membranare ale celulei gazdă (molecule HLA I şi

II şi proteine de adeziune, de legare);

- prezintă sub înveliş circa 72-100 de complexe glicoproteice, formate dintr-o parte

externă (gp 120 cu rol de legare de receptorii CD4 ai celulei ţintă) şi o parte

transmembranară de înveliş (gp41);

- genomul virusului HI este mai complex decât cel a altor retrovirusuri, fiind

constituit din 2 lanţuri scurte de ARN, compuse din 9200 nucleotide precum şi enzime

virale, clasificate astfel: proteine structurale/enzime virale (produşii genelor Gag, Pol,

Env): revers-transcriptaza, proteaza, ribonucleaza şi integraza, toate încapsulate într-o

anvelopă lipidică, care conţine antigenul Gp120 cu rol foarte important în legarea de CD4

a genomului HIV; proteine reglatoare: Tat şi Rev (HIV) şi Tax/Rex (HTLV) care

modulează transcripţia şi sunt esenţiale pentru propagarea virusului şi proteine auxiliare:

Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Nef, unele cu rol încă neelucidat;

- ARN-ul viral se află în interiorul a două capside alături de enzime;

- nu este vizibil sub microscopul electronic din cauza diametrului foarte mic;

- infecţiile cu acest tip de virus decurg de regulă cronic, cu o perioadă lungă de

latenţă, afectând şi sistemul nervos.

Imaginea virusului HI

Stadii în evoluţia infecţiei cu HIV:

- stadiul I: infecţie lipsită de simptomatologie sau cu simptome ce pot fi întâlnite şi în

alte afecţiuni infecţioase sau neinfecţioase: dureri de cap, dureri musculare şi articulare,

febră, greţuri, scăderea poftei de mâncare, umflarea ganglionilor (simetrică);

- stadiul II: infecţie asimptomatică cu excepţia umflării ganglionilor;

- stadiul III: apar simptome ce reflectă prezenţa unor infecţii fără gravitate: dureri de

cap, febră, transpiraţii nocturne, oboseală cronică, diaree, afecţiuni ale pielii, leziuni ale

mucoasei bucale;

- stadiul IV: infecţie simptomatică: boli gastrointestinale, boli pulmonare, boli

neurologice;

Page 39: Lp Bacterio

12

- stadiul V: pierdere de greutate, debilitate pronunţată, afectarea sistemului nervos

central.

O infectare cu HIV-1 şi HIV-2 duce după o perioadă lungă de incubare, de ani, chiar zeci

de ani, la declanşarea bolii SIDA (sindromul imunodeficienţei dobândite) letală.

Diagnosticul de laborator în infecţia HIV

Produs patologic:

·sânge (pentru examen direct şi serologic):

- ser;

- plasmă pe EDTA;

- sânge integral;

secreţii genitale, salivă, urină, LCR, lapte de mamă, unde poate fi identificat HIV;

lapte de mamă şi salivă, unde pot fi găsiţi anticorpii specifici.

În cursul diagnosticului infecţiei cu HIV se evidenţiază:

- antigene virale;

- ARN viral, ADN proviral;

- anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope.

Dinamica producerii markerilor virali

Antigenul p24:

- se găseşte în serul persoanei infectate;

- detectabil în infecţiile recente, înainte de apariţia anticorpilor;

- dispar după apariţia anticorpilor anti p24;

- reapar în stadiile tardive de boală (SIDA), semnificând replicare virală intensă şi un

prognostic grav.

Anticorpii anti p24:

- apar la 3-12 săptămâni de la infecţie. Perioada de la infecţie până la apariţia lor se

numeşte “fereastră imunologică”.

Anticorpii anti gp120:

- nu au rol protector;

- sunt folosiţi ca marker de diagnostic.

Dinamica producerii markerilor virali

Diagnostic

Page 40: Lp Bacterio

13

Diagnosticarea infectării cu virusul HI se împarte în depistare şi confirmare. Scopul

depistării este descoperirea tuturor persoanelor seropozitive, cu riscul de a depista în

această primă fază şi falşi seropozitivi. Din cauza posibiltăţii unui test fals pozitiv, se

recurge la confirmarea seropozitivităţii, testare care se supune unei stricte

confidenţialităţi medicale pentru protejarea sferei de intimitate a celui posibil seropozitiv.

Acest proces de secretizare a identităţii celui testat este reglementat în România prin lege.

Confirmarea infectării cu HIV se face în laboratoare specializate.

Protocolul standard de diagnostic:

se evidenţiază anticorpii prin metoda ELISA, prima etapă de diagnostic a infecţiei

HIV (screening), având sensibilitate de aproape 100% şi specificitatea de 99,5%:

- generaţia I: se foloseşte lizatul total viral de pe culturi de limfocite („whole virus”);

- generaţia II: se folosesc antigene clonale;

- generaţia III: se folosesc antigene recombinate;

- generaţia IV: metode combinate care testează simultan prezenţa anticorpilor anti

HIV şi a antigenului P24; Metodele de generaţie III şi IV au sensibilitate şi specificitate

ridicate, dar este posibilă şi apariţia unor rezultate false:

- fals negative [„fereastra imunologică”, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) şi

subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M)];

- fals pozitive (probe de sânge alterate, incorect etichetate sau schimbate, greşeli de

laborator, contaminarea probelor).

Rezultatul pozitiv al testării ELISA se raportează ca „ser reactiv” şi nu confirmă

diagnosticul pozitiv de infecţie HIV.

În cazul pozitivării se face o retestare printr-o metodă cel puţin la fel de sensibilă din

aceeaşi probă de sânge (determinare ELISA la centre de referinţă). După retestare,

probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot:

se detectează proteinele specifice virale:

- glicoproteine de înveliş („env”): gp41, gp120, gp160;

- proteine nucleare („gag”): p18, p24/25, p55;

- endonucleaze-polimeraze („pol”): p34, p40, p52, p68;

se consideră pozitive probele care prezintă:

- 2 benzi pentru antigene din grupul „env” (după World Health Organization

WHO);

- 1 bandă (glicoproteină) + 1 bandă (altă proteină specifică HIV) (după Deutsches

Institut für Normung - DIN);

- benzi pentru P24, p34, gp41, gp120/160 (după Food and Drug Administration).

Page 41: Lp Bacterio

14

Testul Western-Blot are o senzitivitate de 99,9996% ceea ce înseamnă că doar 0,0004%

primesc un rezultat pozitiv fals, motiv pentru care este indicat pentru confirmarea

seropozitivităţii HIV.

Testul Western Bolt determină mai mulţi anticorpi din sânge care s-au format contra

anumitor componente proteice, fiind adresat anticorpilor este însă şi el aplicabil doar

după 12 săptămâni de la expunere; testul ELISA determină masa generală de anticorpi

HIV-1, HIV-2.

Teste rapide de diagnostic („point-of-care”, „bedside” tests): Se bazează pe 4 principii:

aglutinare, immunodot, imunofiltrare sau imunocromatografie. Se pot efectua din sânge

capilar/venos. Rezultatele se obţin în 15-30 min. Testele OraQuick™, Reveal™, Uni-

Gold Recombigen™ au specificitate şi sensibilitate înalte.

Diagnostic direct:

nu se face de rutină;

detectarea AN virali: ADN proviral din limfocite sau ARN viral;

reprezintă marker de infecţie;

se foloseşte în situaţii speciale:

- calitativ: suspiciune de infecţie primară, când Ac lipsesc (fereastra imunologică);

nou născut din mamă infectată cu serologie pozitivă (Ac materni);

- cantitativ (încărcătura virală): marker de prognostic; monitorizarea tratamentului.

Nu se foloseşte ca metodă de diagnostic

PCR (polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA (nucleic

acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction).

Izolarea virusului:

- rezervată pentru cazuri speciale, se face în laboratoare specializate;

- pe culturi de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinină, în prezenţa

interleukinelor;

- efect citopatogen în 2-3 săptămâni.

Page 42: Lp Bacterio

15

Protocol de diagnostic şi management în cazul infecţiei HIV

Page 43: Lp Bacterio

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul: Neisseria,

Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Bacillus, Clostridium, Treponema

Diagnosticul de laborator în infecţii cauzate de germenii din genul Pseudomonas

Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind reprezentată de

Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic/"bacilul puroiului albastru"). Sunt bacili

Gram - negativi, aerobi, oxidază pozitivi, nesporulaţi, mobili (cu unu sau mai mulţi cili

polari).

Pseudomonas aeruginos, poate produce diferite infecţii grave (tegumentare superficiale

sau profunde, sepsis cu evoluţie gravă etc.). Infectează persoanele care prezintă arsuri.

Poate fi implicat în diferite infecţii de spital. P. aeruginosa este izolat de la pacienţii cu

fibroză chistică. Pseudomonas aeruginosa face parte din categoria germenilor de spital,

determinând infecţii nozocomiale, ceea ce implică recoltarea de probe de pe instrumente,

instalaţii sanitare, soluţii medicamentoase şi dezinfectante.

Diagnosticul de laborator în infecţiile supurative ale tegumentelor este un diagnostic

bacteriologic, direct.

Produse patologice:

- exsudate purulente, puroi din plăgi, arsuri suprainfectate, leziuni necrotice cutanate;

- secreţii nasofaringiene, spută;

- urină;

- materii fecale, bilă;

- sânge;

- LCR;

- secreţii vaginale;

- secreţii conjunctivale.

Recoltarea şi transportul p.p. (puroi) respectă recomandările cunoscute.

Examen direct:

- macroscopic al p.p. poate evidenţia un aspect sugestiv (culoare albastră/galben-

verzui fluorescentă). Puroiul poate degajă un miros caracteristic aromat;

- microscopic se practică doar din produse biologice în mod normal sterile din care se

realizează cel puţin 2 frotiuri (colorate cu A.M. şi Gram). Se observă prezenţa celulelor

inflamatorii (PMN) şi a bacililor Gram negativi, subţiri, dispuşi în lanţuri scurte, perechi

sau izolaţi, cu un cil polar, necapsulaţi, nesporulaţi.

Cultura. Cultivarea se poate face pe medii de cultură obişnuite şi difernţiale (bulion,

geloză simplă, geloză sânge, medii selective şi diferenţiale pentru enterobacterii:

Leifson), timp de 18-24 ore. Bacilul piocianic se poate multiplica la temperaturi care

variază între 5-42°C, însă dezvoltarea optimă este la 30-37oC. Pentru p.p. contaminate se

recomandă utilizarea unor medii de cultură selective. Se formează colonii de tip „S” care

se pigmentează, însoţindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde

fluorescent). Cultura poate avea un miros asemănător florilor de tei.

Identificarea microorganismului se bazează pe caracterele:

- morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi,

relativ polimorfi. În culturi mai vechi pot apărea diferite forme (filamentoase, cocoide).

Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspăt, între lamă şi lamelă.

Page 44: Lp Bacterio

- de cultură: în mediu lichid - tulbură uniform mediul, formează o peliculă la

suprafaţă (strict aerob) sub care se acumulează pigment; pe mediu solid - colonii de tip

„S”, lactozo - negative, uneori cu luciu metalic. Pe măsură ce cultura îmbătrâneşte,

coloniile devin de tip „R”, se produce un pigment verzui difuzibil.·Pe geloză sânge - se

dezvoltă colonii cenuşii, unele produc hemoliză beta;

- biochimice: bacteriile din genul Pseudomonas sunt oxidază pozitive;

- pe geloză lactozată nu fermentează lactoza;

- lichefiază mediul Loffler (produce proteoliză);

- pe geloză sânge - hemoliză beta;

- produc colonii de tip „S” pigmentate (se remarcă şi pigmentarea mediului,

albastru sau galben-verde fluorescent). Pigmenţii sunt: piocianina, specific, verde -

albăstrui, solubil în cloroform; pioverdina (fluoresceină), galben - verzuie, solubilă în

apă.

Tipizare:

lizotipie este utilă în scop epidemiologic pentru stabilirea sursei unei infecţii

nozocomiale;

piocinotipie se foloseşte pentru identificare pe baza tipizării piocianinei, care este

specifică fiecărui tip.

Antibiograma este obligatorie, multe tulpini de Pseudomonas prezentând rezistenţă

multiplă la antibiotice. Antibiograma se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul de laborator al holerei: genul Vibrio

Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscută specie este Vibrio

cholerae. Bacteria Vibrio cholerae este considerată potenţial periculoasă şi letală de aceea

se impune respectarea riguroasă a măsurilor de protecţia a muncii. Vibrio cholerae

(vibrionul holeric) este un germen mobil, aerob sau facultativ anaerob, oxidază pozitiv,

rezistent la pH alcalin şi săruri biliare. Produce toxina holerică şi respectiv holera.

Diagnosticul este bacteriologic, direct şi trebuie realizat urgent.

Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile impuse. Se recoltează materii fecale

sau/şi lichid de vărsătură. Dacă nu se poate ajunge la laborator în 1-3 ore este necesar să

se folosească mediul de transport Cary-Blair. Apa peptonată alcalină (pH 9-9,5) poate fi

utilizată ca mediu de transport, dar şi ca mediu de îmbogăţire. Produsele patologice mai

pot fi reprezentate de probe de apă şi de alimente.

Examen direct:

- macroscopic: scaun apos, cu conţinut fecaloid minim, aspect riziform. Materiile

fecale au culoare verzuie, miros fetid, conţin mucus;

- microscopic. Pentru examenul microscopic al p.p. se face un preparat între lamă şi

lamelă (nu frotiuri). Se utilizăm obiectivul 40x. Nu se evidenţiază PMN. Există vibrioni

care prezintă mişcări active. Prin coloraţie Gram se observă bacili Gram negativi, subţiri,

încurbaţi, sub formă de virgulă, care prezintă un cil la un capăt, necapsulaţi, nesporulaţi.

Pentru examenul microscopic pe fond întunecat se efectuează un preparat nativ. Sunt

germeni foarte mobili. Testul de imobilizare se efectuează cu ser imun anti-O1, anti-

O:139. Imobilizarea germenilor din preparat ridică suspiciunea prezenţei vibrionului în

preparat.

Cultura. Se cultivă (direct sau după transport) în apă peptonată alcalină (APA). După 6-

Page 45: Lp Bacterio

8 ore la 35-37°C, se trece pe un mediu selectiv, cu săruri biliare [TCBS (tiosulfat, citrat,

bilă, zaharoză) şi/sau BSA (bile salt, agar)], prelevând de la suprafaţa mediului lichid

(unde ar putea să apară un „văl"). Dacă se examinează microscopic (între lamă şi lamelă)

conţinutul „vălului" se poate grăbi diagnosticul. Se poate cultiva şi pe mediu geloză-

sânge.

Identificarea se face pe baza caracterelor:

- morfotinctoriale: bacili gram-negativi;

- de cultură: în mediu lichid creşte foarte rapid şi formează un văl la suprafaţă, mediul

rămâne clar; pe mediul TCBS produc colonii de tip „S”, galbene, mari de 2-4 mm; pe

mediul BSA se formnează colonii de tip „S”, rotunde, strălucitoare, transparente ca

picăturile de rouă; pe geloză sânge cresc colonii de tip „S”, mici, mate, alb-cenuşii,

nehemolitice;

- biochimice: germeni oxidază pozitivi;

- alte teste biochimice se pot efectua în laboratorul de referinţă;

- antigenice: se utilizează ser anti-holeric O:1 (reacţii de aglutinare pe lamă). În

laboratorul de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se identifică serotipul (Ogawa,

Inaba sau Hikojima); dacă rezultatele sunt negative se foloseşte şi serul anti-holeric

O:139;

Testarea sensibilităţii la bacteriofagi se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop

de cercetare (în laboratorul de referinţă).

Identificare antigenică se face pe baza antigenului O (O:1, O:139). Diagnosticul

definitiv se confirmă în laboratoare de referinţă.

Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, pentru

supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Neisseria

Familia Neisseriaceae include mai multe genuri.

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de meningococ (Neisseria meningitidis)

şi gonococ (Neisseria gonorrhoeae)

Bacteriile din genul Neisseria sunt coci gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,

imobili, înconjuraţi de o structura capsulară comună. In funcţie de structura capsulei

există mai multe serogrupuri. Sunt oxidază pozitivi. Sunt germeni pretenţioşi. Au nevoie

de CO2.

Diagnosticul în meningită meningococică

Diagnosticul include elemente clinice, într-un context epidemiologie. Pentru stabilirea

etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct) şi urgent. Este recomandat ca primele

etape să fie efectuate la patul bolnavului.

Recoltarea p.p. (LCR, puncţie după realizarea examenului „fundului de ochi") ar trebui

realizată la patul bolnavului, unde se repartiză o cantitate de LCR pentru examenul

citologic şi biochimic, restul pentru frotiuri şi culturi. Dacă transportul este inevitabil,

trebuie efectuat fără întârziere şi nu la temperaturi scăzute ci aproape de temperatura

corpului. Meningococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale

sau faringiene etc.

Page 46: Lp Bacterio

Examinarea microscopică a p.p. permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) şi a

cocilor gram-negativi, dispuşi în diplo, capsulaţi, situaţi intra sau extraleucocitar.

Cultura. Cultivarea se face pe medii complexe, în atmosferă de 3-5% CO2 la 37°C.

Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:

- morfotinctoriale: coci gram-negativi, în diplo, reniformi;

- de cultură: colonii de tip „S”, 1-2 mm; pot fi şi de tip „M”;

- biochimice: metabolizează diferite glucide (glucoză şi maltoză) şi produc citocrom-

oxidază (testul oxidazei este test cheie în identificare);

- antigenice: se poate identifica serogrupa (pot aparţine grupului A, B, C, Y sau W-

135).

Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Diagnosticul de laborator în gonoree

La bărbaţi apare uretrita gonococică. La femei, gonoreea se localizează endocervical. La

nou-născutul care se naşte pe cale naturală din mamă cu gonoree, poate să apară oftalmia

gonococică. Gonococul poate disemina cu apariţia unor leziuni la distanţă. Diagnosticul

de laborator este numai bacteriologic (direct).

Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute. La bărbat se recoltează

secreţia uretrală iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la

nivelul colului uterin. Secreţiile au, de obicei, un aspect purulent. Este de preferat

cultivarea foarte rapidă, pe medii de cultură complexe (în atmosferă de CO2). Transportul

trebuie realizat foarte rapid în medii de transport (Amies plus cărbune activat).

Examen microscopic al p.p. pune diagnosticul. Se notează prezenţa celulelor, celulelor

inflamatorii (leucocite) şi a cocilor gram-negativi (în diplo, situaţi intra sau

extraleucocitar).

Cultura. Cultivarea se face pe medii selective (medii cu vancomicină, colistin,

trimetoprim şi nistatin) dacă p.p. este contaminat. Se recomandă cultivarea atât pe medii

selective, cât şi pe medii neselective, în atmosferă de 3-10% CO2, la 35-37°C. Coloniile

apar în 24-48 de ore. Sunt colonii de tip „S”, de 0,5-1 mm, sau colonii de tip „M”.

Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:

- morfotinctoriale: coci gram-negativi, în diplo, eventual înconjuraţi de o structură

capsulară comună;

- de cultură: coloniile sunt de tip „S” sau „M”;

- biochimice: metabolizează diferite glucide (glucoza) şi produc citocrom-oxidază

(testul oxidazei este testul cheie în identificare); testul catalazei este intens pozitiv;

- antigenice;

- altor caractere (studiate prin metode ale biologiei moleculare).

Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Este necesară testarea producerii de α 3-lactamază.

Diagnosticul de laborator al infecţiei cărbunoase: Bacillus anthracis

Produse patologice:

- în cărbunele cutanat - exsudat din pustula malignă;

- în cărbunele intestinal - materii fecale;

- în cărbunele pulmonar - spută;

Page 47: Lp Bacterio

- în formele septicemice - sânge;

- pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe.

Examen direct:

- frotiu Gram;

- bacili Gram pozitivi, cu capetele retezate sau uşor concave, asezaţi în lanţuri, cu

aspect ce imită trestia de bambus;

- prezintă un spor central;

- în produsul patologic prezintă capsulă.

Izolare: germene nepretenţios, poate fi cultivat pe:

- bulion;

- geloză simplă;

- geloză sânge.

Identificarea se face pe baza caracterelor:

- morfotinctoriale: sunt bacili Gram pozitivi, mari (3-5 μm lungime/1-1,2 μm

grosime), cu capetele tăiate drept sau uşor concave, imobili. Pe frotiurile din ţesuturile

animalelor bolnave apar dispuşi în lanţuri scurte sau în perechi înconjuraţi de o capsulă

unică. Pe frotiurile din cultură bacilii sunt dispuşi în lanţuri paralele şi sunt sporulaţi.

Sporul, format numai în prezenţa oxigenului, are diametrul egal sau mai mic decât

grosimea bacilului, este oval şi este dispus central;

- de cultură: este o bacterie aerobă facultativ anaerobă, nepretenţioasă nutritiv, se

dezvoltă pe medii simple, la 35-37°C. Limitele de temperatură la care se poate dezvolta

sunt foarte largi: 12-40°C. Sporularea are loc la temperature camerei. În mediu lichid

formează un depozit floconos, mediul rămâne clar; pe medii solide se formează colonii de

tip „R” cu suprafaţa rugoasă, centrul ombilicat, margini dantelate cu prelungiri laterale

(cap de Medusă); în geloză dreaptă apar creste sub forma unui brad inversat. Pe geloza

sânge nu produce hemoliză;

- biochimice: este o bacterie catalază pozitivă. Are activitate proteolitică, lichefiază

gelatina, dar nu produce urează. Fermentează unele zaharuri (glucoza, maltoza,

zaharoza). Produce acetil-metil-carbinol (reacţia Vogues-Proskauer pozitivă) proprietate

utilă în clasificarea speciilor de Bacillus. Reduce nitraţii, hidrolizează cazeina, este indol

negativă.

Diagnostic diferenţial faţă de alţi germeni din genul Bacillus (B. cereus):

- sensibilitatea la penicilină: B. anthracis este sensibil, B. cereus este rezistent;

- hemoliza: B. anthracis nu produce hemoliză, B. cereus produce hemoliză;

- sensibilitatea faţă de bacteriofagi.

Diagnostic retrospectiv:

- reacţia Ascoli. Prin reacţia Ascoli sau prin tehnici imunoenzimatice se poate

identifica antigenul polizaharidic termostabil în extracte tisulare;

- reacţie de precipitare inelară;

- evidenţiază prezenţa antigenelor în fragmente de organe recoltate de la cadavre.

Diagnosticul serologic constă în demonstrarea anticorpilor prin metoda fluorescentă

directă, este posibil dar nu este util.

Page 48: Lp Bacterio

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu bacterii din genul Clostridium

Genul Clostridium include mai multe specii care se găsesc în intestinul animalelor de

unde sunt eliminate în mediul extern prin materii fecale şi sporulează. Sporii rezistă pe

sol timp îndelungat şi sunt termorezistenţi. Sunt bacili gram pozitivi, anaerobi, sporulaţi,

de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau lanţuri, mobili cu cili peritrichi (Clostridium

perfringens este capsulat).

Clostridium tetani sintetizează toxina tetanică şi produce tetanos descendent la om.

Toxina blochează eliberarea unor mediatori cu rol inhibitor, neuronii motori spinali

rămân în stare de excitaţie rezultând contracturi/spasme (paralizie spastică). Afectează

musculatura feţei - „risus sardonicus”, musculatura membrelor, musculatura coloanei

vertebrale - opistotonus. Orice stimul extern poate determina atacul de tetanos. Moartea

se poate poate produce prin asfixie, paralizia musculaturii respiratorii. Mortalitatea este

de circa 50%.

Produse patologice:

- fragmente bioptice din plăgi contaminate;

- probe de pământ, de metal;

- materii fecale;

- medicamente injectabile;

- cat-gut.

Clostridium botulinum sintetizează toxina botulinică (există 8 tipuri de toxină). Cel mai

frecvent determină toxiinfecţii alimentare de tip toxic (toxina se află, deja, în aliment).

După ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, prin circulaţie ajunge la nivelul

plăcilor neuromusculare şi împiedică eliberarea de acetilcolină (paralizie flască).

Botulismul debutează cu afectarea globilor oculari, ptoză palpebrală; evoluţie este

descendentă; decesul survine prin paralizia musculaturii respiratorii.

Produse patologice:

- ser;

- probe de alimente;

- urină;

- materii fecale;

- fragmente de organe.

Clostridium perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C.

sporogenes etc. pot produce, în asociere, gangrena gazoasă. Sporii ajung în ţesuturi după

traumatisme deschise şi dacă se creează condiţii de anaerobioză germinează, formele

vegetative se multiplică, sintetizează toxine histotrope, fermentează zaharuri (cu

producere de gaz). Apar edeme, senzaţia prezenţei de gaz, necroză. În 20-80% din cazuri

evoluţia este gravă, spre deces. Clostridium perfringens este implicat în toxiinfecţii

alimentare, produce o toxină, alterează epiteliul intestinal şi produce diaree apoasă.

Produse patologice:

- ser;

- probe de alimente;

- materii fecale.

Examen microscopic are rol orientativ şi poate servi la alegerea terapiei antimicrobiene.

Germenii sunt bacili G+, sporulaţi.

Page 49: Lp Bacterio

Cultura. Pentru culitivarea clostridiilor este obligatorie asigurarea condiţiilor de

anaerobioză prin:

- metode fizice - anaerostat;

- metode chimice - hârtie de filtru îmbibată cu pirogalol (se lipeste în interiorul cutiei

Petri, absoarbe oxigenul);

- metode biologice - cultivare pe aceeaşi cutie Petri şi germeni aerobi şi anaerobi.

Cultivarea se face pe mediu Schaedler - geloză sânge glucozată,·pe geloză simplă sau pe

bulion VF plus neomicină. Incubarea se face în aerobioză şi anaerobioză şi se evaluează

în funcţie de apariţia coloniilor dacă sunt germeni aerobi sau anaerobi. Incubarea în

condiţii de anaerobioză durează 24-48 de ore, la 35-37°C.

Identificarea se face pe baza:

caracterelor morfotinctoriale:

Specia Coloraţie Cili Capsulă Spori Forma

celulei

C. tetani Bacili Gram + Peritrichi - Spor rotund

+ (terminal) C. botulinum Bacili Gram + Peritrichi - Spor oval

+ (subterminal) C. perfringens Bacili Gram + - + Spor oval

+ (subterminal)

caracterelor de cultură:

Specia Geloză dreaptă Schaedler

C. tetani Colonii pufoase Colonii tip „R”

C. botulinum Colonii cu centrul transparent Colonii tip „R”

C. perfringens Colonii lenticulare Colonii tip „R”

Speciile mobile (majoritatea) formează colonii de tip „S”, cu margini ondulate şi tendinţă

de invadare a mediului; dacă a avut loc inocularea şi în profunzimea mediului, coloniile au

aspect pufos; Clostridium perfringens (imobil) formează colonii de dimensiuni mari, de

tip „S”, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea şi aspect „R”);

caracterelor biochimice:

- produc hemoliză β pe mediu Schaedler;

- unele tulpini sintetizează lecitinază. Pentru acestea se pot verifica mobilitatea,

fermentarea lactozei, producerea de lipază, urează, hidroliza gelatinei, digestia cărnii;

- mirosul este caracteristic:

- de corn ars - C. tetani;

- de rânced - C. botulinum;

- de acid butiric - C. perfringens.

Costridiile sunt sensibilie la vancomicină şi rezistente la colistin.

Caractere antigenice:

- se demonstrează prezenţa tetanospasminei prin seroneutralizare la şoareci;

- se testează prezenţa anti-toxinei tetanice (titrul protectiv >0,01UAI/ml);

- se demonstrează prezenţa toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în

medii de cultură [se prelevează cultură din bulion VF, se centrifugează şi supernatantul se

împarte în 2 tuburi; un tub se încălzeşte la 100°C; se răceşte; se inoculează intraperitoneal

la două loturi de şoareci; dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba

Page 50: Lp Bacterio

de toxina botulinică (pentru că toxina botulinică este termosensibilă)]; prezenţa toxinei

botulinice poate fi confirmată prin seroneutralizare (se protejează un şoarece cu anti-

toxină de tip A şi un alt şoarece cu anti-toxină de tip B, apoi se injectează cu p.p.; dacă

animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieţuieşte, iar celălalt animal moare cu

semne caracteristice pentru botulism, în mediul de cultură a existat C. botulinum de tip

A).

Boala experimentală

C. tetani inoculat la cobai/şoareci pe cale subcutanată determină paralizie spastică;

C. botulinum inoculat la:

- şoareci conduce la paralizia flască a trenului posterior;

- cobai produce paralizia mm. abdominali;

- pisică determină diaree, tulburări de acomodare.

Antibiograma nu se recomandă, în infecţiile cu bacili Gram-pozitivi sporulaţi (lucrurile

diferă în cazul germenilor anaerobi Gram-negativi). Clostridiile sunt sensibile la

penicilină, cefalosporine, vancomicină, tetracicline, metronidazol etc., însă tratamentul

este mai complex.

Diagnosticul de laborator în infecţii cauzate de Acinetobacter

Genul Acinetobacter cuprinde 19 specii dintre care, mai frecvent implicate în patologia

umană sunt speciile:

- Acinetobacter baumannii;

- Acinetobacter lwoffi;

- Acinetobacter calcoaceticus;

- Acinetobacter haemolyticus;

- Acinetobacter junii.

Sunt cocobacililor Gram negativi nefermentativi, aerobi, catalază pozitivi, oxidază

negativi, nepigmentogeni. Bacteriile din genul Acinetobacter sunt larg răspândit în

mediu, colonizează mucoasele, fiind germeni cu potenţial nosocomial cu rezistenţă

naturală faţă de multe antibiotice. Tratamentele antibiotice prelungite favorizează apariţia

infecţiilor.

Patogenie la om:

Cele mai frecvente entităţi clinice având ca etiologie specii de Acinetobacter sunt:

- infecţii respiratorii,

- infecţii ale plăgilor şi arsurilor,

- bacteriemii;

- infecţii de cateter;

- meningite;

- infecţii ale tractului urinar;

- endocardite la cei cu proteze valvulare;

- peritonită la cei cu dializă peritoneală;

- infecţii oculare.

Produse patologice:

- spută;

- aspirat bronşic;

- puroi;

Page 51: Lp Bacterio

- urină;

- sânge;

- LCR;

- catetere:

Examen direct:

- microscopic: bacili pleomorfi, scurţi, groşi, până la cocoizi, Gram negativi, adesea

dispuşi în perechi. Pe acelaşi frotiu se pot întâlni forme cocoide şi forme filamentoase cu

o lungime de câteva zeci de micrometri. Sunt germeni imobili, frecvent capsulaţi.

Cultura. Creşte pe medii uzuale, geloză simplă, geloză sânge, MacConkey, fiind un

germen nepretenţios. În funcţie de specie cresc la temperaturi cuprinse între 10-35oC.

Identificarea se bsazează pe caracterele:

- morfotinctoriale: sunt bacili pleomorfi, scurţi, groşi, până la cocoizi, Gram

negativi, adesea dispuşi în perechi. Pe acelaşi frotiu se pot întâlni forme cocoide şi forme

filamentoase cu o lungime de câteva zeci de micrometri. Sunt imobili, frecvent capsulaţi.

Pe frotiul colorat Gram adesea pot fi confundaţi cu Haemophilus influenzae;

- de cultură: colonii de tip „S”, rotunde, netede, convexe, lucioase sau mate,

nepigmentate; unele specii produc hemoliză beta pe geloză sânge. Este un germen

nepretenţios, se cultivă pe medii uzuale şi creşte la temperaturi cuprinse între 10-35ºC, în

funcţie de specie;

- biochimice: nu fermentează glucoza (germen nefermentativ), catalază pozitive,

oxidază negative, lactoză negative, nu reduc nitraţii.

Identificarea de specie se face pe baza caracterelor de cultivare (temperatura de creştere)

şi biochimice (acidifierea glucozei, hidroliza gelatinei, hemoliza, auxonograma).

Antibiograma este obligatorie.

Diagnosticul de laborator al infecţiei cu bacterii din genul Treponema (Sifilis)

Microorganismele din acest gen sunt bacterii spiralate, subţiri, foarte mobile. Sunt strict

aerobe sau microaerofile şi sunt foarte pretenţioase nutritiv. Există specii patogene şi

specii care fac parte din flora normală a cavităţii bucale şi a mucoaselor genitale.

Speciile patogene pentru om sunt Treponema pallidum cu trei subspecii: pallidum,

agentul etiologic al sifilisului, subspecia endemicum, agentul etiologic al bejelului şi

subspecia pertenue, agentul etiologic al pianului.

Patogenie. Boala la om

Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului venerian care se transmite prin

contact sexual, direct cu leziunile ulcerative ale persoanei infectate. La gravidele

infectate, în perioadele de bacteriemie, T. pallidum trece transplacentar determinând

sifilisul congenital. Sifilisul dobândit poate evolua în mai multe etape: sifilisul primar,

secundar, latent şi terţiar. În 2-10 săptămâni de la contactul infectant, la locul inoculării

se formează şancrul dur (cu lichid clar, foarte bogat în treponeme). După alte 2-10

săptămâni apar leziunile secundare (maculopapule roşii, localizate la orice nivel, dar şi

condiloame în diferite regiuni ale corpului.

Diagnosticul porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice şi trebuie confirmat prin

metode de laborator; poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.

Produse patologice:

- serozitate din şancrul sifilitic (stadiul I.)

Page 52: Lp Bacterio

- sânge (serologic).

Recoltarea şi transportul p.p. se face cu multă atenţie cu respectarea unor particularităţi.

Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar de la nivelul leziunilor primare, de

la nivelul leziunilor secundare sau din ganglionii limfatici regionali etc. Produsul

patologic se recoltează cu grijă după îndepărtarea crustelor care acoperă leziunea (nu

trebuie să producem sângerare).

Examen microscopic: se realizează preparate microscopice între lamă şi lamelă.

Examinarea trebuie făcută rapid, în maxim 20 de minute. Această etapă este deosebit de

importantă. Examen direct microscopic al preparatului nativ se face la microscop cu

fond întunecat. Pentru examenul microscopie pe fond întunecat (MFI), se pregătesc 2

lame pentru fiecare leziune din care au fost recoltate p.p. Preparatele „în aşteptare" sunt

menţinute într-o cutie Petri în care există puţină vată umezită, pentru a păstra atmosfera

umedă şi a preveni uscarea. Preparatul trebuie examinat insistent, cel puţin 10 minute în

cazul unui rezultat aparent negativ. Trebuie să existe antrenament şi experienţă pentru a

identifica aspectele caracteristice: microorganisme foarte subţiri şi lungi, spiralate,

luminoase pe fondul negru al câmpului; mobile - deplasarea nu este foarte rapidă,

seamănă cu o mişcare de înşurubare. Rezultatul pozitiv pune diagnosticul de sifilis

primar. O problemă ar putea fi reprezentată de existenţa treponemelor saprofite, care

microscopic arată foarte asemănător cu Treponema pallidum. EF directă permite

diferenţierea Treponema pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcaţi

fluorescent. Pot fi realizare şi preparate colorate: coloraţie Giemsa; coloraţie negativă

(Burri); impregnare argentică (Fontana-Tribondeau).

Rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis; în cazul unui pacient suspect, se

repetă testul după 1 săptămână, 1 lună şi la 3 luni.

Se ia în considerare un rezultat pozitiv în corelaţie cu rezultatul obţinut la testul

treponemic, diagnosticul bacteriologic, elementele clinice şi epidemiologice. Un rezultat

pozitiv în condiţiile în care toate celelalte date sunt negative este, de obicei, un rezultat

fals pozitiv. Pot apărea rezultate fals pozitive la persoane cu hepatită virală acută,

pneumonii virale, rujeolă, malarie, mononucleoză infecţioasă, alte infecţii virale, la

persoane care au fost recent vaccinate, precum şi la persoane cu boli ale ţesutului colagen,

persoane care se droghează, la persoanele în vârstă etc. Reacţiile fals pozitive pot apărea

şi pe parcursul sarcinii. Rezultatul este intens pozitiv atunci când sunt vizualizate

flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar.

Caractere morfotinctoriale: Treponema pallidum este o bacterie spiralată, cu spire

regulate şi cu capetele drepte. Este foarte subţire şi relativ scurtă având lungimea de 2-20

μm şi grosimea de 0,1-0,3 μm. Este foarte mobilă, mobilitatea fiindu-i asigurată prin mai

multe fibre axiale periplasmice înfăşurate în jurul protoplastului şi inserate la

extremităţile cilindrului protoplasmic prin corpii bazali. Mişcarea caracteristică se

observă prin examinarea treponemelor la microscopul cu fond întunecat unde apar ca

spirochete fine, cu 6 - 14 spire regulate (1,1 μm lungimea de undă şi 0,3 μm amplitudine)

capetele efilate, animate de mişcări graţioase de înşurubare, flexie şi translaţie.

Caractere de cultură: Treponema pallidum nu se poate cultiva pe medii de cultură

artificiale. Poate fi menţinută în viaţă prin inoculări intratesticulare la iepure care

dezvoltă o orhită sifilitică. În acest mod s-a păstrat în laboratoarele de referinţă tulpina

Nichols de Troponema pallidum obţinută în 1912 de la un pacient care a decedat de

neurosifilis. Din această tulpină se prepară antigenele necesare diagnosticului serologic.

Page 53: Lp Bacterio

Caractere biochimice: Este un germen microaerofil şi pentru că nu poate fi cultivat in

vitro caracterele biochimice nu sunt cunoscute.

Izolare prin metode biologice:

- treponemele patogene nu pot fi cultivate pe medii arificiale;

- inoculare intratesticulară la iepure - orhită sifilitică.

Diagnostic indirect - serologic:

reacţii serologice clasice:

- evidenţierea anticorpilor antilipoidici;

- antigen folosit: cardiolipina;

- reacţia de floculare (VDRL);

- latexaglutinare (RPR). Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) se realizează pe cârduri

din material plastic (există mai multe cercuri cu diametrul de 18 mm). Ag este preparat

asemănător VDRL (dar nu mai este necesară inactivarea prin căldură); conţine şi particule

de cărbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat în cercul de pe cârd. Dacă

există Ac anti-Treponema pallidum, are loc combinarea cu particulele lipidice din Ag şi

rezultă aglutinarea. Apar granule negre pe fondul alb al cârdului;

- reacţia de fixare a complementului (RFC):

- pot apare reacţii fals positive;

- pentru confirmare, diagnosticul se completează cu reacţii moderne

(specifice).

reacţii serologice moderne:

- evidenţiază anticorpii antiproteici;

- antigene folosite - antigene treponemice specifice de gen şi de specie;

reacţii cu specificitate de gen:

- RFC, care utilizează Ag treponemice extrase din T. reiter (specificitate de

grup). Mai importante sunt reacţiile care utilizează Ag treponemice extrase din tulpina

Nichols de Treponema. pallidum (au specificitate mare, de tip);

- CIEF;

Reacţii cu specificitate de specie:

- FTA - Abs (Fluorescent Treponemal Antibody Absorbtion Test). Testele de

imunofluorescenţă indirectă au folosit iniţial serul de cercetat diluat 1/5, ulterior diluţia a

fost de 1/200 (FTA-200). În ultimii 45 de ani s-a utilizat tehnica FTA-Abs, care implica:

obţinerea din tulpina T. reiter a unui extract Ag, util pentru îndepărtarea Ac care nu sunt

specifici pentru T. Pallidum; diluarea serului de la pacient la 1/5; punerea serului în

contact cu extractul care conţine Ag treponemice de grup/Reiter pentru înlăturarea Ac

nespecifici; apoi se practică DF). În cazul în care serul de cercetat este pozitiv, treponemele

apar fluorescente (galben verzui);

- TPHA (reacţie de hemaglutinare pasivă);

- TIT (testul de imobilizare a treponemelor). Serul de cercetat este diluat şi

amestecat cu complement şi treponeme vii, mobile (obţinute din testicul de iepure). Dacă

în ser există Ac specifici, treponemele sunt imobilizate (examinarea se face cu MFÎ);

- ELISA. Tehnica ELISA (detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum) este

utilă pentru diagnosticul sifilisului congenital. Interpretarea rezultatelor se face în context

clinic, epidemiologie şi de laborator. Dacă atât VDRL, cât şi FTA dau un rezultat negativ,

infecţia este, de obicei, exclusă. Însă, în cazul în care pacientul se află la debutul bolii iar

Page 54: Lp Bacterio

Ac nu sunt nedectabili (suspiciunea clinică sau epidemiologică persistă), se repetă testele

după 3 săptămâni.

Rezistenţa faţă de agenţii fizici, chimici şi biologici: Treponema pallidum este distrusă

de uscăciune, de temperaturi de 42°C, de săruri de mercur şi bismut, de antiseptice,

dezinfectante. Este sensibilă faţă de antibioticele beta-lactamice, în special, faţă de

penicilină. Treponema pallidum rămâne viabilă mai mulţi ani în suspensia păstrată la -

70°C.

Structura antigenică

Se diferenţiază trei structuri antigenice importante:

- antigenul cardiolipinic. Este prezent la toate treponemele dar şi la alte bacterii, la

unele plante şi în ţesuturile animale, cum ar fi cordul de bou. Acest antigen determină

formarea de anticorpi antilipoidici, denumiţi în trecut şi reagine;

- antigenul proteic Reiter. Are specificitate de gen şi este prezent la toate

treponemele, indiferent dacă sunt patogene sau nu. Împotriva lui se formează anticorpi

antiproteici;

- antigenul specific numai pentru Treponema pallidum. Faţă de acest antigen se

formează anticorpi antiproteici, antipolizaharidici şi imobilizine.

Page 55: Lp Bacterio

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul Mycobacterium, Corynebacterium,

Diagnosticul de laborator în infecţii produse de Mycobacterium tuberculosis varianta

hominis

Genul Mycobacterium include peste 100 de specii şi subspecii diferite, dintre care

Mycobacterium tuberculosis prezintă importanţă medicală. Germenii din genul

Mycobacterium sunt bacili care nu cedează colorantul nici sub acţiunea combinată a

acidului diluat şi a alcoolului. Din acest motiv se numesc bacilli „acido-alcoolo-

rezistenţi”. Această proprietate se datorează cantităţii mari de lipide şi ceruri din peretele

bacterian. Mycobacterium tuberculosis produce tuberculoză (TB), care poate avea diferite

localizări. Tuberculoza se manifestă sub formă de:

- tuberculoză pulmonară:

• primoinfecţie latentă;

• primoinfecţie manifestă;

• forma cavitară comună;

• pleurezie;

• forme mediastinale;

• forme miliare;

- tuberculoză extrapulmonară, care este rară şi are localizări meningiene, renale,

genitale, osoase, articulare, ganglionare sau digestive. Cea mai frecvent întâlnită este TB

pulmonară.

Epidemiologie: pacienţii cu TB pulmonară (elimină prin spută bacili acid/alcool

rezistenţi/BAAR) şi reprezintă sursa de infecţie. Diagnosticul şi tratamentul corect şi

complet al acestor pacienţi sunt esenţiale.

Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (radiologie) şi de alte elemente de

laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea şi identificarea bacteriei Mycobacterium

tuberculosis.

Diagnosticul de laborator este esenţialmente bacteriologic, direct. Datele obţinute în cadrul

diagnosticului imunobiologic şi serologic pot fi utile şi completa informaţiile.

Produse patologice:

- lichid de spălătură bronşică;

- LCR;

- urină;

- lichide recoltate prin puncţie articulară,

- probe obţinute prin biopsie;

- puroi;

- secreţii vaginale;

- spută.

Recoltarea şi transportul p.p. se realizează cu respectarea anumitor reguli şi a normelor

privind protecţia personalului medical. În tuberculoza pulmonară se recoltează spută

eliminată după un puseu de tuse sau la copii recoltată prin spălătură gastrică.

Sputa trebuie decontaminată (prin tratare cu NaOH 4%) şi neutralizată (cu acid) în vederea

realizării etapelor următoare.

Page 56: Lp Bacterio

Examen microscopic. Examinarea microscopică a p.p. implică prepararea a minimum 3

frotiuri (colorate A.M., Gram şi Ziehl Neelsen). Se observă la microscop prezenţa

macrofage alveolare de la nivelul tractului respirator inferior, prezenţa celulelor

inflamatorii (PMN) şi prezenţa BAAR. BAAR apar ca bacili subţiri, drepţi, de 0,4/3 μm,

roşii pe fond albastru (celelalte structuri au culoare albastră).

Rezultatele examenului microscopic (TQF/Z-N) trebuie să fie cuantificate prin numărul de

BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-30 câmpuri în cazul 1F, 100-300

în cazul Z-N). De ex. 1-9 BAAR/10 câmpuri (în IF) sau 1-9 BAAR/100 de câmpuri (Z-N)

permite să se noteze în buletinul de analiză 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9 BAAR/1

câmp/Z-N). Acest mod de notare permite compararea rezultatelor între laboratoare diferite

sau compararea rezultatelor unui bolnav în cursul tratamentului. Examenul microscopic

negativ nu exclude diagnosticul de TB.

Cultura. Cultivarea se poate face pe 3 grupe de medii de cultură [(lichide, semisolide şi

solide, pe bază de ou (mediul Lowenstein-Jensen)]. La compoziţia mediului L-J se adaugă

verde malachit pentru inhibarea multiplicării unor microorganisme. Pentru izolare este

necesară o atmosferă care conţine 8-10% CO2. Incubarea se face la 35-37°C. Este foarte

important să se examineze mediile în fiecare zi (în prima săptămână după inoculare),

ulterior săptămânal până la împlinirea a 6-12 săptămâni (Mycobacterium tubercidosis are

o rată de diviziune de 12-27 ore). Există şi metode de cultură „rapide:

sisteme bifazice de izolare şi identificare care detectează Mycobacterium

tuberculosis în 20 de zile;

sisteme respirometrice care constau în detectarea radiometrică sau fotometrică a

CO2 eliminat în metabolismul bacterian evidenţiind creşterea bacteriană în 15 zile;

-metode chimice, cromatografice de analiză a acizilor micolici din peretele

bacterian permit identificarea de specie;

reacţii de tip PCR aplicabile direct produsului patologic permit un diagnostic în

câteva ore şi au o mare sensibilitate;

metode de hibridare a ADN-ului şi ARN-ului bacterian cu sonde marcate sau

detectarea acidului tuberculo-stearic prin cromatografie gazoasă şi spectrometrie de masă

sunt metode rapide de identificare a tulpinii de Mycobacterium tuberculosis.

Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:

• morfotinctoriale: BAAR;

• de cultură: Mycobacterium tuberculosis formează colonii de tip „R”, rugoase,

grunjoase, nepigmentate sau pigmentate crem-bej, cu suprafaţa zbârcită, uscate,

conopidiforme asemănate cu firimiturile de pâine. Pe mediul lichid Mycobacterium

tuberculosis creşte sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridică pe

peretele flaconului de cultură. Astfel de creştere pe medii de cultură o numim creştere

eugonică (abundentă, optimă). Tulpinile de Mycobacterium tuberculosis rezistente la

HTN pot forma colonii „S”;

• biochimice: bacterie strict aerobă, produce:

- acid nicotinic sau niacină;

- nitrat-reductază, catalază, urează;

- este sensibil faţă de pirazinamidă;

- este rezistent faţă de hidrazida acidului tiophen-2-carboxilic;

antigenice (se examinează în centre de referinţă). Mycobacterium tuberculosis

prezintă la nivelul peretelui celular următoarele structuri antigenice:

Page 57: Lp Bacterio

- tuberculolipidele reprezentate de acizii micolici, ceruri şi alcooli superiori. În

peretele tulpinilor patogene se găseşte un sulfo-lipid care induce dezvoltarea pe cultură

sub formă de cordoane: „cord-factor”;

- tuberculoproteinele induc sensibilizare de tip anafilactic iar în asociere cu

tuberculolipide induc răspuns imun predominant celular;

- polizaharidele induc formarea de anticorpicirculanţ;

• de patogenitate: Mycobacterium tuberculosis este patogen pentru cobai.

Antibiograma este necesară, se realizează conform recomandărilor Programului Naţional

de Control al TB şi se efectuează paralel cu identificarea. Se pot utiliza metodele: metoda

proporţiilor, metoda rapoartelor de rezistenţă etc.

Diagnosticul imunobiologic presupune detectarea stării de sensibilizare faţă de

proteinele bacilului tuberculos prin intradermoreaţii şi are la bază un mecanism de RIC.

Se utilizează BDR cu PPD.

Diagnosticul serologic se bazează pe răspunsul imun de tip umoral (Ac anti-

micobacterieni pot fi evidenţiaţi prin tehnica ELISA). În diagnosticul TB nici un element

nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importanţă într-un context clinic, paraclinic şi

epidemiologic.

Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul Corynebacterium

Genul Corynebacterium reuneşte microorganisme care se caracterizează prin prezenţa în

compoziţia peretelui celular a:

- acidului mezo-diaminopimelic;

- acizilor micolici cu catenă scurtă (22-38 atomi de C).

Conţinutul de GC este cuprins între 46-74%.

Prezintă asemănări cu microoganismele din genurile Mycobacterium şi Nocardia.

Genul Corynebacterium cuprinde:

corinebacterii fitopatogene;

corinebacterii patogene pentru animale, care afectează accidental omul:

Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans;

corinebacterii cu tropism uman:

- specie patogenă: Corynebacterium diphtheriae (biovaruri: gravis, mitis,

intermedius). Colonizează frecvent rinofaringele, mai rar tegumentul. Există şi purtători

sănătoşi;

- specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): Corynebacterium xerosis,

Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium pseudodiphthericum, etc

Diagnosticul de laborator în difterie

Bacterie patogenă: Corynebacterium diphtheriae.

Produsul patologic:

- falsă membrană, secreţie faringiană;

- secreţie nazală la purtători;

- secreţie conjunctivală, vulvară, din plăgi.

Recoltarea se face cu 3 tampoane. Ca medii de transport şi îmbogăţire se pot folosi:

geloză-ser semilichidă cu telurit de K; mediul OCST (ou-cistină-ser-telurit).

Page 58: Lp Bacterio

Examen microscopic:

Cu primul tampon se efectuează 3 frotiuri:

frotiu colorat Gram pentru observarea morfologiei şi dispoziţiei spaţiale a

bacteriei Corynebacterium diphtheriae - bacil Gram pozitiv, uşor încurbat, cu capetele

măciucate, dispus caracteristic (litere chinezeşti, chibrituri aruncate pe masă);

frotiu colorat Neisser pentru evidenţierea corpusculilor metacomatici Babes-

Ernst. Corynebacterium diphtheriae prezintă corpusculi metacromatici la capete;

frotiu colorat Giemsa pentru diagnosticul diferenţial cu angina fuso-spiralară pe

frotiu când se evidenţiază fusobacterii şi forme spiralate (Treponema vincenti).

Cultura. Tamponul al doilea se însămânţează pe mediul de îmbogăţire OCST şi se

incubează 12-18 ore, după care se izolează pe medii caracteristice.

Tamponul al treilea se descarcă pe medii de cultură folosite pentru izolare şi identificare.

Caractere morfotinctoriale ale Corynebacterium diphtheriae:

Bacterii (bastonaşe) de 1-8 μm x 0,3-0,8 μm, drepte sau puţin încurbate, cu extremităţile

rotunjite sau îngroşate (aspect de halteră sau de măciucă), datorită granulaţiilor de

volutină (corpii Babeş-Ernst). În frotiuri se aranjează ungiular, în palisade sau sub forma

caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V, imobile,

asporogene, necapsulate. Se colorează G+, pentru evidenţierea granulaţiilor de volutină -

Loeffler, Neisser

Caractere de cultură:

Corynebacterium diphtheriae este o specie facultativ anaerobă, exigentă la cultivare,

temperatura optimă de cultivare fiind de 37°C, pH 7,4.

Medii de cultură elective:

mediul Löffler (ser bovin coagulat): colonii “S”, caracteristice‚ circulare‚ uşor

crenelate‚ mici, netede, opace, albe-gălbui sau albe-cenuşii, apar peste 16-24 ore de

cultivare;

geloză-sânge - colonii albe-gri‚ perlate‚ friabile.

Medii de cultură selective diferenţiale:

mediul Clauberg (geloză-sânge cu telurit de potasiu). Corynebacterium

diphtheriae gravis: colonii “R”‚ mari, negre (reducerea teluritului în teluriu), crenelate,

aspect de “floare de margaretă”, nehemolitice; mitis: colonii “S”, mijlocii, negre,

bombate, cu zonă de hemoliză ;

mediul Tinsdale (geloză-ser-cistină-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu

halou brun;

mediul Bucin (geloză-sânge cu hinozol) - colonii albastre;

mediul Gundel Tietz - se diferenţiază cele trei tipuri de bacil difteric:

- tipul gravis - colonii negre‚ de tip “R”‚ plate‚ cu margini crenelate‚ centrul

mamelonat‚ cu striaţiuni radiare‚ ca o “floare de margaretă”;

- tipul mitis - colonii negre‚ de tip “S”;

- tipul intermedius - colonii de tip “S-R”;

bulion:

- tipul gravis - formează peliculă la suprafaţă‚ restul mediului rămâne clar;

- tipul mitis - tulbură uniform mediul;

- tipul intermedius - formează inel la suprafaţă‚ depozit si tulbură uniform

mediul.

Caractere biochimice:

Page 59: Lp Bacterio

- producerea de H2S - se studiază pe mediul PISU (cu cisteină);

- ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-;

- fermentarea zaharurilor (metabolism zaharolitic): în funcţie de fermentarea

monozaharidelor (glucoză‚ maltoză si zaharoză)‚ bacilii difterici se pot încadra în specie

(Corynebacerium diphtheriae‚ hoffmanii‚ xerosis); în funcţie de fermentarea

polizaharidelor (dextrină‚ amidon si glicogen)‚ se face încadrarea Corynebacterium

diphtheriae în tip:

- gravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-

- mitis: glucoza+, amidon-, zaharoza-

- intermedius.

Posedă catalază, citocromi a, b, c şi este oxidază- .

Caractere de patogenitate - cercetarea producerii de exotoxină difterică:

teste in vivo;

teste in vitro;

testul Elek - reacţie de precipitare în gel:

- se toarnă geloză peste o hârtie de filtru impregnată în ser antidifteric;

- se însămânţează în striuri tulpinile de cercetat;

- dacă o tulpină produce exotoxină difterică (Ag)‚ aceasta este eliberată în mediu

şi apare o bandă de precipitare;

testul Ramon - reacţie de floculare prin care se dozează putere toxică a toxinei.

Diagnosticul indirect

IDR Shick - IDR de neutralizare. Se injectează strict intradermic 1 unitate de

toxină. Dacă organismul nu are anticorpi‚ toxina îşi exercită efectul şi la locul inoculării

apare un eritem - organism receptiv.

Dacă organismul are anticorpi‚ acestia vor neutraliza toxina‚ deci nu apar modificări la

locul inoculării - organism imun;

Reacţii de hemaglutinare pasivă - determinarea cantitativă a antitoxinelor.


Recommended