Explorarea în laborator a

metabolismului proteic

Lucrarea practică nr. 7

Laborator Biochimie Clinica

Clasele de proteine plasmatice

Plasma - amestec coloidal

Clasele de proteine plasmatice:

albuminele

globulinele

Indexul de disproteinemie:

raportul de concentraţie

A/G = 0,8 - 1,2.

Proteinemia concentraţia proteinelor totale din plasmă

Metode:

În ser sau plasmă:

Metodă fotometrică: reacţia biuretului: în mediu alcalin

legăturile peptidice reacţionează cu ionii de Cu(II) cu formarea unui

compus colorat violet, a cărei întensitate se determină la 546 nm;

metoda Kjeldahl: -se bazează pe determinarea conţinutului în azot

- metoda de referință în estimarea conținutului

în proteine

În urină sau LCR:

Metoda Coomassie: utilizarea colorantului Coomassie Brillant

Blue (prag de detecţie: 100-1000 ng proteine) - macrometoda

pyrogallol red ( prag de detecţie: 1μg proteină/ml) - micrometoda

Material biologic : ser, plasmă (heparinată), urină, LCR, lichide

de puncţie – r.Rivalta (acid acetic glacial)

Proteinemia

Reacția biuretului

Proteinemia

Valori normale:

ser sau plasmă:

60 - 80 g/l (adult)

45-75 g/l (nou-născuţi şi sugari)

urină: < 150 mg/zi

LCR: 0,15- 0,45 g/l

Proteinemia

Disproteinemie – modificarea calitativă/cantitativă a

conţinutului în proteine a plasmei;

Valori scăzute (hipoproteinemie):

insuficienţă hepatică, sindrom nefrotic, arsuri, enteropatii,

malnutriţie / malabsorbţie, insuficienţă panceatică;

pseudohipoproteimemie: prin diluţie (recoltare de pe branulă)

Valori crescute (hiperproteinemie):

hiperproteinemii absolute: hiperimunoglobulinemie: cronice,

gamopatii monoclonale;

hiperproteinemii relative: hemoconcentraţie, diabet insipid, diaree.

Albumine forma globulară, dimensiune și greutate moleculară mică (60000-69000Da)

factori stabilizanți ai echilibrului coloidal al plasmei – solubilitate bună

Dozare ser: metode fotometrice (verde de bromcrezol)

procentaj relativ din proteinogramă sau cantitate absolută calculată din valoarea proteinemiei

imunodifuziune radială

nefelometrie imună

imunturbidimetrie

Dozare urină şi LCR: nefelometrie, turbidimetrie;

Valori normale: ser: 55-65% din totalul proteinelor plasmatice; 34 - 48 g/l.

Urină: sub 20 mg/l;

LCR: 110-350 mg/l;

Valori scăzute: insuficienţă hepatică, sindrom nefrotic, arsuri, inflamaţii acute şi cronice, enteropatii, tumori maligne.

Probe biologice: ser, urină, LCR;

Microalbuminuria

Apare în anumite stări patologice: DZ, obezitate, hiperlipidemie, hipertensiune arterială, rezistenţă la insulină, consum de alcool.

Valoare normală: prima urină de dimineaţă < 20 mg/l

urină pe 24 ore: <30 mg/zi

Creşteri uşoare ale microalbuminuriei caracterizează faza reversibilă a nefropatiei diabetice, care răspunde favorabil la terapie.

Metode de dozare:

- imunotirbidimetrie,

- inmunonefelometrie

Proteinuria Bence-Jones

lanţurile uşoare de tip sau kappa sau lambda

apare în - plasmocitoame

- macroglobulinemia Waldenström.

Metode de evidenţiere:

imunofixare (prag de sensibilitate: 20-30 mg/l)

electroforeza urinară (prag de sensibilitate: aprox. 100 mg/l).

Electroforeza proteinelor

metodă analitică de separare a particulelor sau

ansamblurilor de particule încărcate electric, sub

acţiunea unui câmp electric extern

o particulă încărcată electric se va deplasa cu o

viteză constantă determinată de acţiunea

următoarelor forţe:

forţa de atracţie electroforetică F1 :

F1= Q · E

forţa de frecare Stokes F2:

F2 = 6π ·η· r · v

Electroforeza proteinelor

viteza electroforetică v:

v = Q· E / 6 π· η· r

mobilitatea

electroforetică μ :

μ= v / E,

μ = Q / 6π · η ·r

particulele pentru care

raportul Q/r este identic

vor avea mobilităţi

electroforetice identice

Electroforeza proteinelor

Mediu de migrare: agaroză,

pH: 8.6 (tampon TRIS

barbital),

Colorant: amido black

Electroforeza proteinelor

Se aplică 5 µl de ser pe gelul de agaroză

Se aşteaptă 10 min. (penetrarea serului în gel)

Se introduce gelul înaparatul de electroforeză

Se aplică tamponul TRIS barbital

Se alege programul de migrare

După migrare şi uscare se transferă gelul în unitatea de colorare

Electroforeza proteinelor

După colorare se

interpretează

Inspecţie

Interpretare

densitometrică

Fracţiunile electroforeticeFracţiunile proteinelor serice:

albumina

α1- globuline:

α1- lipoproteină (HDL),

α1-glicoproteina acidă,

α1-antitripsină,

α 1-antichimotripsină,

α2-globuline:

haptoglobină,

ceruloplasmină,,

α2-macroglobulină,

β1 şi β2 globuline:

β-lipoproteine,

hemopexina,

factorul C3,

transferina,

PCR,

fibrinogen.

fracţiunea γ-globulinelor:

IgM, IgA şi IgG.

Proteinograma Valori normale (procentual

calculate din densitograme):

albumină: 45-60%

α1-globuline: 2.5-7.0 %

α2-globuline: 7.0-14.0 %

β-globuline: 9.0-17.0 %

γ-globuline: 16.0-24.8%

Trasee electroforetice

Ciroză hepatică cu pod

beta-gamma

Ciroză hepatică cu ascită;

Proteine totale: 71 g/l

Albumină: 49 g/l

Hipoalbuminemie;

Pod beta-gamma;

Trasee electroforetice

Sindrom nefrotic Proteinurie 9,5g/24 ore;

Proteine totale: 35 g/l;

Albumină: 18 g/l;

↓ albuminemie;

↑ Alfa1- globulinemie;

↑ alfa2-globulinemie;

↑ beta-globulinemie;

Trasee electroforetice

Sindrom inflamator

cronic (sindrom Crohn)

Proteine totale: 61 g/l;

Albumină: 26 g/l;

↓ albuminemie;

↑alfa2- şi alfa2 glubuline;

↑ gammaglobulinemie

policlonală;

Trasee electrofretice

Inflamaţie acută

(otită medie, mastiodită)

Băiat de 2 ani;

Proteine totale: 57 g/l;

Albumină: 36 g/l;

↓ albuminemie;

↑ alfa1- şi alfa2

globulinemie;

↑ gammaglobulinemie;

Trasee electroforetice

Anemie feriprivă Proteine totale: 73 g/l;

Albumină: 43 g/l;

↑ beta-globulinemie

(transferina!);

Trasee electroforetice

Hipogamaglobulinemie

(leucemie mieloidă acută)

Proteine totale: 61 g/l;

Albumină: 44 g/l;

↓ albuminemie;

↑ alfa1- alfa2 globulinemie;

↑ betaglobulinemie;

↓gammaglobulinemie;

Trasee electroforetice

Hipogamaglobulinemie

(leucemie limfatică

cronică)

Proteine totale: 55 g/l;

Albumină: 49 g/l;

↓ albuminemie;

↓ gammaglobulinemie;

Trasee electroforetice

Mielom multiplu Proteine totale: 109 g/l;

Albumină: 36 g/l;

↓ albuminemie;

Gradient M în gamma1

Proteinuria:

Clasificare: proteinurii renale:

proteinurie glomerulară: trecerea în urină a proteinelor cu greutate moleculară mare; proteinurie selectivă: apare doar albumina şi transferina;

proteinurie neselectivă: pe lângă albumină şi transferină apar proteine cu greutate moleculară mare (de ex. Imunoglobuline);

proteinurii tubulare: apariţia proteinelor cu greutate moleculară mică datorită reabsorbţiei tubulare deficitare;

forme mixte: în special în cazurile de afecţiuni renale avansate apare proteinurie glomerulară şi tubulară;

Proteinurii postrenale: infecţii şi hemoragii urogenitale;

Proteinurii prerenale: hiperproteinemii (gamopatie monoclonală);

Electroforeză urinară

Indici de selectivitate a

proteinuriilor:

IgG/ albumină

• Proteinurie renală < 0,2

• Proteinurie glomerulară selectivă < 0,03

• Proteinurie glomerulară neselectivă > 0,03

• Proteinurie postrenală > 0,2

Electroforeză urinară

Electroforeza LCR

Valori normale:

Prealbumina: 2-7%

Albumina: 56-76%

α1-globuline: 2-7%

α1-globuline: 3,5-12%

β1 şi β2 globuline: 8-18%

γ globuline: 7-12%

Utilitate clinică:

- Scleroza multiplă – apar fracțiuni oligoclonale de proteine

- Infecții ale SNC

Electroforeza LCR

Metode de dozare - turbidimetrie

Turbidimetria măsoară scaderea

intensitatii unei radiatii

luminoase ,care nu isi modifica

drumul optic, la trecerea prin

proba de analizat, datorita reflectiei,

absorbtiei sau imprastierii.

Turbiditatea intr-un lichid –

cauzata de prezenta particulelor

suspendate, care sunt fin divizate.

Daca o raza trece printr-o proba

turbida, intensitatea este redusa de

imprastiere, iar cantitatea luminii

imprastiate este dependenta de

concentratia si marimea particulelor.

Metode de dozare - nefelometria Măsurarea intensităţii unei radiaţii

luminoase reflectate sub un anumit unghi;

Nefelometria măsoară intensitatea luminii

împrăștiate sub un anumit unghi, la trecerea unei radiații prin proba de analizat.

Turbidimetria - masoara intensitatea

luminii transmise prin proba

- utilizata in cuantificarea proteinelor serice

- IgG, IgA, IgM si IgE

- C3, C4, C1 inhibitor

- haptoglobina, PCR, transferina, albumina, alfa1-antitripsina, alfa2-macroglobulina, fibrinogenul, ceruloplasmina, factorulreumatoid