Date post: | 06-Apr-2018 |
Category: |
Documents |
Upload: | nicolae-creanga |
View: | 224 times |
Download: | 5 times |
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 1/64
LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE GENERALA
L.1. Reguli de protecţ ie a muncii în laboratorul de microbiologie;
Microscopul. Utilizarea microscopului
L.2. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin
colorare simpla
L.3. Studiul microbiologic al bacteriilor - Studiul bacteriilor prin
colorare diferenț iala
L.4. Studiul microbiologic al drojdiilor (Saccharomyces, Pichia,
Torulopsis)
L.5. Studiul microbiologic al drojdiilor (Candida, Rhodotorula,Kloeckera)
L.6. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Mucor, Rhizopus)
L.7. Studiul microbiologic al mucegaiurilor ( Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, Aspergillus glaucus, Penicillium expansum)
L.8. Studiul microbiologic al mucegaiurilor (Botrytis, Geotrichum,
Alternaria, Fusarium, Cladosporium)
L.9. Tehnici de izolare a culturilor pure
L.10. Tehnici indirecte (culturale) de evaluare a numărului de
microorganisme - Tehnica clasic ă de numărare prin cultivare pe medii
dense
L.11. Metoda directă de numărare a bacteriilor în preparate fixate şi
colorate - Metoda Breed
L.12. Metode directe de numărare - Numărarea cu citometre
L.13. Influenţ a factorilor de mediu asupra dezvoltării
microorganismelor
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 2/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
REGULI DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DEMICROBIOLOGIE
Într-un laborator de microbiologie trebuie respectate anumite reguli de ordineinterioar ă, după cum urmează:
Este strict interzis accesul persoanelor str ăine în laborator;
Intrarea în laborator şi participarea la lucr ările practice se va face numai după audierea şi însuşirea regulilor de protecţie a muncii (dovedită prin semnătur ă pe un proces verbal);
Intrarea în laboratorul de microbiologie necesită purtarea obligatorie aechipamentului de protecţie (halat cu mâneci lungi, mănuşi sterile, etc.). Serecomandă ca echipamentul de protecţ ie să fie păstrat separat de haineleutilizate în exterior;
Nu se mănâncă şi nu se fumează în laborator.
Manipulările trebuiesc efectuate cu multa atenţ ie, chiar dacă nu se lucrează cumicroorganisme patogene. Culturile, preparatele microscopice umede, toatematerialele care conţ in sau s-au aflat în contact cu microorganisme vii trebuiemânuite cu grija.
În laboratorul de microbiologie, poate exista şi pericolul generat de utilizareatensiunii înalte, a radiaţ iilor ultraviolete şi a altor radiaţ ii. Radiaţ iile ultraviolete
(λ=250-270 nm) sunt folosite pentru sterilizarea aerului şi suprafeţ elor de lucru.iradierea se face timp de 15 min - 2 ore, în func ţ ie de dimensiunea încăperii şigradul presupus de contaminare a aerului. În timpul funcţ ionarii lămpii, nu estepermis accesul personalului în încăpere decât cu ochelari de protecţ ie şi pentruscurta durata, deoarece razele ultraviolete ataca retina, iar in doze mari potproduce arsuri ale epidermei;
Rănile şi zgârieturile de pe mâini trebuie să fie complet protejate de pansamenterezistente la apa şi de mănuşi chirurgicale;
Să se evite pe cât posibil atingerea părului, ţ inând cent ca nivelul de
contaminare a acestuia este de aproximativ 1 milion/cm2. Persoanele cu păr lung este necesar să-l strângă, pentru a evita accidentele, ţ inând seama ca deobicei se lucrează în. apropierea becului de gaz;
Când o cultura este pipetată din greşeala pe bancul de lucru sau pe podea, nuva gr ăbiţ i să ştergeţ i locul respectiv, ci aplicaţ i peste suspensia respectiva osoluţ ie dezinfectanta, aşteptaţ i aproximativ 20 minute şi abia apoi cur ăţ aţ i;
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 3/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
Evacuarea rapidă a conţ inutului pipetelor poate produce aerosoli. Aerosolii pot figeneraţ i şi la mânuirea firului sau ansei, şi la îndepărtarea dopului de vata saude cauciuc din eprubetele cu culturi şi la deşurubarea capacelor sticlelor cuculturi. În general, în munca din laboratorul de microbiologie se prefera mişcărilelente, negr ăbite;
Utilizarea firului sau ansei necesită bune deprinderi la mânuirea acestora, pentrua se evita contaminarea aerului şi a zonei de lucru. Firul şi ansa trebuie să fiesterilizate înainte şi după utilizare, prin flambare la roşu, în flacăra unui becBunsen pe toata lungimea firului metalic. Împr ăştierea materialului aderent seevita prin introducerea firului metalic în flacăra, în mod gradat;
Eprubetele cu culturi vor fi ţ inute întotdeauna în stativele pentru eprubete. Nulăsaţ i niciodată eprubete sau pipete utilizate pe bancul de lucru. Placa Petri încare se număra microorganismele nu va fi privită ca fiind lipsita de risc, chiar dacă inocularea ei s-a f ăcut dintr-un aliment bun pentru consum;
Dopul de vată de la capătul pipetei se află acolo pentru a preveni contaminarealichidului care trebuie pipetat şi pentru a preveni infectarea utilizatorului. Pipetelefolosite nu se vor lăsa nici o data pe bancul de lucru. Ele se vor introduce într-unrecipient conţ inând soluţ ie dezinfectantă (bicromat de potasiu 5%). Lamele şilamelele se vor aşeza după utilizare în vase conţ inând soluţ ii dezinfectante,după ce în prealabil lamelele au fost separate de lame cu ajutorul unei pensete;
Să se eticheteze corect culturile înainte de depozitarea lor la termostate sau înalte zone;
După terminarea lucrului se va cur ăţ a zona de lucru. Aceasta se va şterge cu osoluţ ie dezinfectanta (cloramina 6.5-3%, formol sau fenol 3-5%, HgCI2 0.1%).Mâinile se igienizează prin introducerea lor într-o substanţă antiseptică pentrucâteva minute, apoi se spală cu apă caldă si săpun.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 4/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
MICROSCOPUL. UTILIZAREA MICROSCOPULUI
Microscopul este instrumentul cel mai utilizat şi cel mai important în laboratorul de
microbiologie. Cu ajutorul microscopului optic se realizează studiul morfologic almicroorganismelor (bacterii, drojdii şi mucegaiuri) şi numărarea directă a acestora.Studiul virusurilor şi a ultrastructurilor celulare necesita utilizarea microscopuluielectronic.
Reguli de utilizare a microscopului
Întotdeauna microscopul se transportă cu două mâini, o mână se aşează labaza, iar cu cealaltă se prinde coloana sau stâlpul microscopului;
Se aşează cu atenţ ie microscopul pe masa de lucru. În cazul unei mişcăriviolente sau după un şoc acesta se poate deregla;
Nu se înclină niciodată microscopul, chiar dacă există această posibilitate.Când se utilizează obiectivul de imersie, prin inclinare, uleiul de cedru ser ăspândeşte pe măsuţ a microscopului;
Pentru cur ăţ are, întotdeauna se foloseşte hârtie specială pentru cur ăţ arealentilelor. Dacă rezultatele nu sunt corespunzătoare prin utilizarea hârtiei, sepoate folosi o cantitate mică de benzen. Nu se va utiliza alcoolul sau alt produscare-poate determina desprinderea lentilelor;
Să se observe permanent diferenţ ele dintre obiectivele folosite pentru studiulpreparatelor microscopice umede şi obiectivele de imersie (pentru studiulpreparatelor microscopice colorate). Obiectivul de imersie este fragil, el trebuieutilizat cu foarte multă atenţ ie;
De fiecare data când se utilizează microscopul este necesar să se cureţ e toatelentilele: ale obiectivului, ocularului şi condensatorului;
Se aşează întotdeauna în centrul optic al microscopului obiectivul cel mai mic şise coboar ă tubul cât este posibil;
Se acoper ă microscopul după utilizare cu un sistem de protecţ ie;
Nu se vor întreprinde niciodată reparaţ ii. Acest lucru se realizează de cătreechipele specializate.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 5/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
Elementele microscopului
Microscopul se compune dintr-un stativ portant, un sistem optic, o măsuţă port-obiect şiun sistem de iluminare. Sistemul optic şi măsuţ a sunt mobile.
1 Oculare 7 Şurub pentru deplasarea pe axa y
2 Dispozitiv port-obiective 8 Şurub micrometric pentru clarificareaimaginii3 Obiective 9 Şurub pentru deplasarea pe axa x4 Clema pentru fixarea preparatului 10 Buton de pornire oprire5 Măsuţă 11 Şurub de ajustare a luminozităţ ii
6Şurub macrometric pentru prindereaimaginii
12 Lampa
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 6/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
3
Ocularele
Curent se utilizează oculare care au puterea de mărire de x8, x10, x12.
Obiectivele
Dispozitivul port-obiectiv permite selecţ ionarea obiectivului dorit prin simpla rotaţ ie.Obiectivele utilizate în microbiologie sunt în general obiective acromatice şi dacă esteposibil plan-acromatice. Gama obiectivelor necesare au puterea de mărire de x10, x20,x40, iar obiectivele de imersie au puterea de mărire de x90, x100.
Măsuţa port-obiect
Măsuţ a port-obiect reprezintă un suport pentru lamă. Deplasarea pe cele doua axeorizontale perpendiculare se realizează cu ajutorul unui şurub situat lateral.
Sistemul de iluminare
Se compune dintr-o sursa de lumina şi un condensator. Condensatoarele curente sunt
dotate cu o diafragma. Sistemul de iluminare este independent sau încorporat înmicroscop.
Sistemul de deplasare a obiectivelor
Se realizează cu un şurub pentru mişcările rapide şi un alt şurub pentru reglaremicrometrică. Distanta frontală, adică distanta între preparat şi obiectiv, depinde deputerea de mărire a obiectivului.
Puterea de mărire
Puterea de rezoluţ ie este capacitatea de separare a doua obiecte foarte apropiate.
Puterea de mărire variază de la 100-1200 corespunzător sistemului oculare — obiectivutilizat. Se calculează prin produsul dintre puterea de mărire a ocularului şi aobiectivului.
Utilizarea microscopului
Cur ăţ area cu ajutorul unei hârtii speciale a elementelor optice ale microscopului;
Reglarea luminozităţ ii;
Fixarea preparatului pe măsuţă cu ajutorul unei cleme. Partea preparatului careinteresează se aşează în centrul port-obiectului;
Obiectivul este selecţ ionat: iniţ ial se fixează obiectivul cu puterea de mărire ceamai mică (x10) pentru prinderea imaginii;
Se coboar ă obiectivul la o distanţă de 0.5-1 cm de preparat cu ajutorul şurubului
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 7/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
4
macrometric;
Pentru studiu se schimba obiectivul cu un altul cu putere de mărire superioar ă prin rotirea dispozitivului port obiective;
După obţ inerea imaginii, se realizează clarificarea acesteia cu ajutorul şurubuluimicrometric;
În cazul utilizării obiectivului de imersie, se depune o picătur ă de ulei de imersie în zona care interesează şi se imersează obiectivul în aceasta zonă;
După utilizare, obiectivele de imersie trebuie sa fie cur ăţ ate cu benzen;
Lamele examinate vor fi imediat îndepărtate pentru a se evita contaminarea.
Cauzele care duc la obţ inerea unor imagini necorespunz ătoare sunt:
Executarea unor preparate necorespunzătoare;
Preparate care nu sunt centrate corespunzător;
Elemente optice murdare;
Obiective şi oculare dereglate;
Luminozitate reglată necorespunzător.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 8/64
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 9/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
bacterii patogene – ingerare alimente contaminate – toxiinfecţ iialimentare;
bacterii patogene – pot să paraziteze organismele vii dând îmbolnăviri grave (tuberculoza, febra tifoidă, dizenteria, sifilis, bruceloza,antrax, ş.a.), bacterioze la plante.
Caractere morfologiceBacteriile prezintă forme celulare foarte diversificate, dintre care forme de bază,monocelulare, precum şi forme derivate ale acestora ce rezultă în urma asocieriicelulelor rezultate prin reproducere.
Dintre formele de bază fac parte următoarele (Anexa 2):- forma sferică – coccus → sfera este perfectă (micrococi), ovalar ă (enterococi),
lanceolată (pneumococi) şi reniformă (gonococi);- forma bacilar ă – cilindrică → drepte cu capete rotunjite (g. Enterobacter), cu
capete retezate (g. Bacillus), fusiforme, măciucate (g. Corynebacterium), cudiametru variabil (g. Mycobacterium);
- formele spiralate-elicoidale → specifice bacteriilor patogeneforma vibrio forma spirillum → filamente rigide cu spire largiforma spirocheta → filamente flexibile cu mai multe spire;
- formele filamentoase → specifice bacteriilor miceliene (actinomicete,chlamydobacterii etc.).
Mediul de bază pentru cultivarea bacteriilor – bulionul de carne lichid sau solidificatcu agar (BCA). Prin reproducere pe mediu nutritiv solidificat ia naştere o colonie alcătuită din biomasa de celule rezultate prin sciziune din celula unică:
- colonii de tip S (smooth – neted lucios)
- colonii de tip R (rough – rugos, aspru, zbârcit)- colonii de tip M – la bacterii producătoare de capsule, cu consistenţă gelatinoasă,
mucoidă Coloniile de bacterii:
pe medii solide culori de alb, alb-crem, galben-auriu, oranj-roşu, albastru fluorescenţă
pe medii nutritive lichide pot da tulburare şi sediment – bacteriile anaerobe formează voal caracteristic, fragil, cutat, gelatinos – bacteriile aerobe.
Caractere fiziologice generalebacteriile se dezvoltă într-un domeniu larg de temperatura → 10°C şi 90°C;
în raport cu oxigenul majoritatea bacteriilor sunt aerobe (ex. bacterii acetice), carecresc în semiaerobioză (ex. bacterii lactice), dar un grup restrâns de bacterii suntadaptate să crească în strictă anaerobioză (ex. genul Clostridium).pH=1-11 → optim la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice,lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacţ ie.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 10/64
1
Facultate
Prepara
Coloran
(colora
Colorar
1.
2.
Etapele
Ş tiinţ a şi In
TUDIU
tele micro
A.
B.
ţ ii utilizaţ i
e simpl ă )
a simplă
bţ inerea f
olorarea s
prelevării
ineria Alime
L BAC
copice su
Preparat
Frotiuri (
n studiul b
sau în sco
rezintă do
otiurilor;
implă prop
probelor p
Fig
telor
ERIILO
nt de două
umede –
reparate-u
acteriilor a
pul identifi
uă etape:
riu-zisă.
ntru reali
ra 1. Etap
PRIN
tipuri:
pentru stu
scate) – p
u ca scop
cării (colo
area froti
ele prelev
L
COLOR
diul drojdii
ntru studi
accentuar
r ările dife
rilor sunt
rii probelo
borator Micr
ARE SI
lor si a mu
l bacteriil
ea contras
enţ iale).
rezentate
r
biologie gen
PLĂ
cegaiurilo
r.
ul prepara
în figura 1
eral ă|
;
telor
.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 11/64
2
Facultate Obţ iner
fixare şi
FR
O
TI
U
Etalare
utilizată
Picătur
obţ ină o
Uscare
violentă
Fixarea
se realiFrotiul
Ş tiinţ a şi In
a frotiuril
de colora
este rea
pentru pre
de suspe
distribuţ ie
se efectu
.
se realize
ează r ăcir oate fi an
ineria Alime
r presupu
e (Fig. 2)
2.
5.
Figlizată por
paratele u
nsie se et
foarte fină
ează deas
ază trecân
ea.lizat în co
telor
ne etalare
1. Sterilizare la
dăugare apă di
3. Sterilizare an
4. Prelevare pr
lasare probă p
6. Etalare pro
7. Uscare
8. Fixare
9. Răcire
ura 2. Etaind de la
ede în st
alează cu
, omogen
upra flăcă
d lama de
tinuare su
a celulelo
ă
istilată
sa
bă
lamă
ă
ele realizprelevar
re proasp
ajutorul fir
.
ii unui bec
2-3 ori pri
b aceasta
L
r de studi
rii frotiuluia probele
ătă.
ului metali
de gaz pe
n flacăra
formă sau
borator Micr
t, urmată
i, etapă i
c steril as
ntru a se
ecului de
colorat.
biologie gen
de uscar
entică cu
fel încât s
vita o înc
gaz, după
eral ă|
, de
cea
ă se
lzire
care
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 12/64
3
Facultate
Se realisec – 2
Exame
Coloran
Etapele
Ş tiinţ a şi In
ează prinmin (A), d
ul microsc
ţ ii utilizaţ i f
realizării c
ineria Alime
acoperirepă care s
opic se efe
recvent su
olor ării sim
CO
LOR
AR
E
S
IM
PL
Ă
Fig
A
telor
frotiurilor realizeaz
ctuează c
t: albastr
ple sunt p
ra. 3 Eta
fixate cu cspălarea
obiectiv
de metile
ezentate î
2. A
3.
6.
ele realiză
L
âteva picăt(B) şi zvâ
le de ime
sau fucsi
n figura 3.
1. Obţ iner
dăugare colo
Menţ inere col
4. Spălare
5. Zvântare
. Adăugare ul
rii color ării
B
borator Micr
uri de colotarea prep
sie (x90,
na.
e frotiu
rant (fucsină
lorant 1 min.
colorant
preparat
ei de cedru
simple
biologie gen
rant timp daratelor (C
100).
)
eral ă|
e 30).
C
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 13/64
Iaurturil
termofil
Există u
cealaltă
doua).
e sunt fa
:
Lact Stre
n sinergis
(activitate
B
ricate cu
bacillus btococcus t
între cel
peptidazic
acteri
ajutorul l
lgaricus,ermophilu
e două ba
ă de către
i din I
ptelui pas
gent de a, formeaz
cterii; aces
prima bact
1.
Suntnespor
termofil
Ferme
câteod
lactic.
2.
Sunt
imobili,
lanţ uri. Fermen
uneori
temper
URT
Labo
teurizat, i
idifiere şiaroma.
tea produ
erie, acid
actobaci
bacili alaţ i, im
i (tempera
tează glu
tă galact
treptoco
oci, Gra
grupaţ i în
tează lact
galactoza
tura maxi
rator Micro
noculat cu
romă;
compuşi
ormic prod
lus bulga
lungiţ i,obili, ho
ura de dez
oza, lacto
za cu pro
cus ther
m pozitiv
perechi
oza, zahar
cu formare
ma de cre
iologie gen
două ba
utili una p
us de cea
icus
ram pomoferment
voltare 45
za, fructo
ducere de
ophilus
i, nespor
i câteoda
oza, gluco
de acid l
tere 50-5
ral ă|
terii
ntru
de a
itivi,ativi,
C).
a şi
acid
ulaţ i,
ă în
a şi
ctic,
°C.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 14/64
S
Spuncttemper
F
mântâna a
unt coci (le vederetura de 45
ermenteaz
Bac
cidă este f
lanţ uri denutriţ iona
°C.
ă lactoza şi
erii d
treptoc
rmentată
coci), G+,l, cresc l
maltoza.
n SM
occus c
e Streptoc
nesporulatempera
NTÂ
Labo
emoris
occus cre
ţ i, micro-atura de
Ă
rator Micro
oris.
erofili, foa10°C, da
iologie gen
te exigenţ r nu cres
ral ă|
i dinc la
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 15/64
Sunt b
(temper
Lactoba
cili alung
atura de d
cillus delb
iţ i, Gram
zvoltare 4
ueckii ferm
acter
actobac
pozitivi, n
°C).
entează la
i din
illus del
sporulaţ i,
ctoza.
ORŞ
Labo
rueckii
imobili, h
rator Micro
omoferme
iologie gen
tativi, ter
ral ă|
ofili
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 16/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL BACTERIILOR PRIN COLORARE SIMPLĂ Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor şi aparaturii de laborator ;
Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificării bacteriilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Bacterii din IAURT
Bacterii din SMÂNTÂNĂ
Bacterii din BORŞ
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 17/64
1
Facultate STU
Prepara
Coloran(colora
Colorar GRAMcompoz
stabiliteColorar
1.2.
Obţ iner fixare şi
Frotiulviolet, titimp de
joaca ro
Frotiulapă (E)celulele
Ş tiinţ a şi In
DIUL B
tele micro
A. Prep
B. Froti
ţ ii utilizaţ ie simpl ă )
a Gram pNEGATIViţ iei perete
de bacteria GRAM
bţ inerea f olorarea
a frotiurilde colora
scat şi fixmp de 1câteva s
l de morda
Aste supus
, acesta sbacteriilo
ineria Alime
CTERI
copice su
rate ume
ri (prepara
n studiul bsau în sco
ermite diviE (G-). Alui celular
ologul danrezintă d
otiurilor;RAM prop
r presupue
at se acoinut (A),cunde (3
nt (C);
acţ iunii aacoper ă
r Gram ne
telor
ILOR P
(
nt de două
e – pentr
te-uscate)
acteriilor apul identifi
area bactceasta mla cele do
ez Hans Cuă etape:
riu-zisă.
ne etalare
er ă cu câpoi se clă
sec) cu
lcoolului ecu al doilative (F).
IN CO
RAM)
tipuri:
studiul dr
– pentru s
u ca scopcării (colo
riilor în dtoda seuă grupe
hristian Gr
a celulelo
teva picătteşte cu asoluţ ie Lu
Btilic - 96°a coloran
Labo
ORAR
ojdiilor si
udiul bact
accentuar r ările dife
uă grupe:bazează de bacterii
am, în anu
r de studi
ri de violpă (B). Segol (iod î
(D). După t (fucsina
rator Micro
DIFER
mucegaiu
riilor.
ea contrasenţ iale).
GRAM Pe diferen
i. Bazele
l 1884.
t, urmată
t de genţ iacoper ă iodura d
Cspălareabazică) ca
iologie gen
ENŢIA
rilor;
ul prepara
ZITIVE (Gţ a structuetodei au
de uscar
ană sau cpoi prepa
e potasiu)
reparatulre recolor
ral ă|
Ă
telor
+) şiii şifost
, de
ristalratulcare
i cuază
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 18/64
2
Facultate
După sstudier
În urmabacterii
Prezent
Ş tiinţ a şi In
pălareaa acestui
acesteile G+ se v
area sche
ineria Alime
Dreparatulcu obiect
etode deor colora î
matică a c
C
O
L
O
R
A
RE
D
I
F
E
R
E
N
ŢI
A
L
Ă
Fig
telor
i cu apăiv de 90x
coloraren violet.
olor ării Gr
2
ra. 1 Etap
E(G) se
imersat în
acteriile
am se reg
1.
. Adăugare col
Menţ i
3.
M
4.
6. Adăug
Menţ i
7.
8. Zv
9. Adău
5.
ele realiză
Labo
realizeazăulei de ce
H- vor ave
ăseşte în
Obţ inere frotiu
orant (violet d
cristal violet)
ere colorant 1
dăugare Lugo
nţ inere 30 sec
pălare cu alco
are colorant (f
ere colorant 1
pălare cu apă
ântare prepara
gare ulei de ce
Spălare cu ap
rii color ării
rator Micro
Fzvântare
dru.
a culoare
igura 1.
genţ iană sau
min.
l
.
ol
ucsină)
min.
t
dru
GRAM
iologie gen
a (H) şi
roz-roşi
ral ă|
apoi
; iar
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 19/64
3
Facultate
Reactivi/ rat
Frotiunecolorat
Cristal viol
Soluţ ie Lu
Alcool etili
Fucsină,colorantcontrast
Ş tiinţ a şi In
repa Duraaplic
fixat, -
et 1’,clătir
gol 1’,
clătir
c 96° 10-15clătir
de1’,clătir apă,zvântaer studiuobiec90x
în ucedru
ineria Alime
E
a dere
Re
-
apoicu apă
Colreagrunegme
apoi
cu apă
Iod
moata
’’, apoicu apă
SolcolceldifubacpozdecGradatchiper
apoicu
are încald,
cuiv deimersatlei de
Colfixe
încamcelGra
înslibecoGrasun
telor
apele c
c ţ ii
oranţ ii bcţ ionează pe încăativ din p
brană şi cito
ul are
dant şi măşarea
enţ iirantul şi iodule. Color zează din cteriilor itive mult maiât în cazulm negorită compo
ice şi groetelui celular
orantul bazicază de grurcate negatiele tipurile. La bactm pozitive
puţ ine gre de cristal vparativ cum negativet complet libe
NEXA
olor ării
Aspec
Celuleculoar de viz
azicicu
caterete
sol
AtâtGramşi cnegaticolorat
închis.efect
eşte
Ambel
bactericolorat închis.
pală l dinantulelularamlent
celor tive,ziţ ieisimii
Bacter pozitivcolorat
închisbacterinegatiincolor de obs
sepele
dinde
eriilesuntrupeioletcelecarere
Celulepozitivcolorat
închiscoloraprimar celuleldevinroz(culoacoloracontra
Labo
GRAM
t celule
f ăr ă şi dificil
alizat
bacteriilepozitive câtele Grame sunte în violet
e grupe de
ii r ămâne în violet
iile Grame r ămâne în violet în timp ceiile Grame devin
e şi dificilervat.
le Grame r ămâne în violet
(culoareatului
) în timp cee Gramcolorate însau roşueatului de
st)
rator Micro
Gram poziti (G+)
iologie gen
e Gramnegative
ral ă|
(G-)
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 20/64
1.
f
ş
2.
b
c
3.
s
aractere
rmează pe
i neuniform
aractere
acterii cu
aracterizaţ i
ăspândir
unt foarte r
acrosco
Plate Cou
.
icroscop
forma de
prin aptitud
şi rol
spândite î
Bacill
ice (colo
t Agar, du
ice
astonaşe,
inea de sp
natur ă, în
s su
iale).
ă 48h de c
G+, aerob
rulare.
special în s
tilis
L
ultivare la
e, mezofil
ol şi pe pro
borator Micr
7°C, coloni
în gener
usele veg
biologie gen
i alb-crem,
al mobile.
tale.
eral ă|
plate
Sunt
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 21/64
S
Setanolul
P
S
Î
unt bacili,
unt agenţ iui.
aracteristi
rin colorar
unt bacteri
industrie
G-, nespo
de ferme
ca principa
ea Gram e
ii de conta
sunt utiliza
acter
Acet
rulaţ i, în g
tare aceti
lă este pro
e apar de
inare a p
te pentru
ii din
bacter
neral mo
că, care e
ducerea d
culoare ro
oduselor a
bţ inerea o
Ţ ET
Labo
ceti
ili, aerobi.
ste de fap
e acid ace
ie.
lcoolizate
ţ etului.
rator Micro
t o oxidar
ic pornind
pe care le
iologie gen
e incompl
de la etan
acidifică.
ral ă|
tă a
ol.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 22/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL MORFOLOGIC AL UNOR SPECII DE BACTERII PRIN
COLORARE GRAM Scopul: Formarea deprinderilor de manipulare a ustensilelor şi aparaturii delaborator; Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificăriibacteriilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Bacillus subtilis
Bacterii din OŢET
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 23/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
Fermentare anaeroba a zahărului
STUDIUL DROJDIILOR
DefiniţieDrojdiile reprezint ă un grup taxonomic complex şi eterogen de microorganisme
monocelulare de tip eucariot , care se înmul ţ esc prin înmugurire, ca formă general ă dereproducere şi în mod particular prin ascospori formaţ i pe cale asexuat ă şi sexuat ă.
Importanţă /rolproduc fermentarea glucidelor simple în anaerobioză cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon → fabricarea alcoolului, a vinului, berii şi pâinii.sunt utilizate ca sursă de proteine în alimentaţ ia umană, cu denumirea de SCP(single cell protein) sau în alimentaţ ia animalelor.din biomasa de drojdie se obţ in:
- extracte folosite ca aditivi alimentari;- vitamine hidrosolubile: B1, B2, PP, ergosterol;
- enzime: β - fructofuranozidaza şi β - galactozidaza;- prin hibridizări şi inginerie genetică, din mutanţ i ai specieiSaccharomyces cerevisiae s-a obţ inut interferonul.
Răspândire în sol, celulele de drojdie se întâlnesc în straturile superficiale până la adâncimide aproximativ 30 cm, în concentraţ ii de 102- 2·105/g.din sol, prin acţ iunea unor factori (fizici, mecanici, biologici), microorganismele sepot afla temporar în aer şi să se r ăspândească la distanţ e mari;din sol şi aer drojdiile pot ajunge în ape şi unele specii pot fi întâlnite chiar laadâncimi de 4000 m.in microbiota epifita a plantelor.
Caractere morfologice generale
Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive lichide:
Exemple de genuri cu importanţă in industria alimentar ă:forma oval ă (elipsoidal ă ) – g. Saccharomyces; forma sferic ă – g. Torulopsis; forma apiculat ă (de l ămâie) – g. Kloeckera; forma cilindric ă – g. Candida; forma de sticl ă – g. Saccharomycodes.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 24/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
succesivă
[1]. Tulburare mediu[2]. Producere spumă [3]. Depunere sediment[4]. Limpezirea supernatantului
Cultivarea celulelor de drojdie pe medii nutritive solide sau solidificate (de exemplu:must de malţ cu agar)
Coloniile de drojdiiau aspect cremos lucioase sau mate
alb-crem → drojdii din g. Rhodotorula colonii roşu-pastelat
Colonia în secţiune poate avea:un profil lenticular, semicircular sau triunghiular perimetrul circular, umbonat, cu margini ondulate
Caractere fiziologice generale ale drojdiilor O proprietate importantă a unor drojdii cu utilizări în industria alimentar ă este aceea dea fermenta în condiţ ii de anaerobioză glucide (hexoze, diglucie, triglucide) cu formarede alcool etilic şi dioxid de carbon şi produse secundare care dau aroma caracteristică produselor fermentate.
În condiţ ii de aerobioză, drojdiile asimilează glucidele transformându-le prin respiraţ ie laCO2 şi H2O, iar energia eliberată favorizează creşterea şi înmulţ irea celulelor.
Celulele de drojdie, în funcţ ie de condiţ iile de cultivare şi vârstă pot prezenta activitatemetabolică diferenţ iată concretizată prin trei stări în care se pot afla celulele şi anume:
• starea de metabioz ă (activ ă ), în care celulele au activitate metabolică maximă. În condiţ ii favorabile de cultur ă, celulele cresc, se reproduc şi acumulează intracelular substanţ e de rezervă glicogen şi trehaloză;• starea de anabioz ă (latent ă ), celulele î şi menţ in caracteristicile vitale, dar nu sepot înmulţ i. Această stare apare când substanţ ele nutritive ale mediului sunt
epuizate, iar celulele consumă din substanţ ele de rezervă intracelulare;• starea de autoliz ă (moartea fiziologic ă ). Se produce o solubilizare acompuşilor intracelulari sub acţ iunea enzimelor proprii celulei.
Înmugurire
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 25/64
1.
coav
2.
di
3.
a
aractere
Dupălonii de cuând diame
aractere
celulpuse sing se re
ăspândir
microrişe);
este
Sacc
acrosco
3 zile deloare alb-crul de 1 - 2
icroscop
le au for lar, in per roduc prin
şi rol
flora epifită
tilizată la: fa la în la
arom
ice (colo
cultivare lem, convmm.
ice
a elipsoidchi sau laînmugurir
a fructelor
ricarea spibţ inerea d
panificaţ ie;abricarea
yces
iale).
25°C, for xe, cu pe
ală, globoţ uri;, iar mugu
dulci (strug
rtului;rojdiei com
nor sortim
erevi
L
mează peimetrul cir
să sau el
rele poate
uri, mere,
rimate;
nte de ber
iae
borator Micr
MEA (Malular şi su
lipsoidal al
fi alipit de c
ere, prune,
e.
biologie gen
t Extractrafaţ a luci
ungită şi
elula mam
gutui, coa
eral ă|
gar),asă,
ot fi
ă.
ăze,
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 26/64
1.
chiar n
2.
în lanţ Poate f
3.
a alcool
păstrat
aractere
formregulat, c
aractere prezi
ri sau asorma 1- 4
ăspândir micro se de
lului etilic; este
in vase cu
Pichi
acrosco
ază, pe maspect m
icroscoptă celule aciaţ ii, for scospori.
şi rol flora produzvolta pe li
agent degol de aer.
me
ice (colo
ust de mat, rugos, d
icelungite, cili
ând pse
elor vegethide slab a
lterare a
bran
iale).
lţ cu agar,e culoare a
drice, cu cdomicelii
le conservlcoolice ( 7
băuturilor
efaci
L
colonii culbă sau alb
apetele asrezultate p
te prin mu- 9 ° alcool)
lab alcooli
ens
borator Micr
perimetrul-cenuşie.
uţ ite sau r rin înmugu
are;, producân
zate (vin d
biologie gen
slab lobat
tunjite disrire multip
oxidarea t
e masa,
eral ă|
sau
uselar ă.
otală
ere),
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 27/64
1.
albe, ci
2.
netezi.
3.
mur ătu
aractere
formrculate, co
aractere
celul
se re
form
ăspândir
drojdi
ilor; a fost
acrosco
ază pe muvexe, apla
icroscop
le sunt mi
roduc prin
ază 1-4 a
şi rol
a este pr
izolată din
orulo
ice (colo
st de malţ izate, cu s
ice
i, elipsoida
înmugurir
scospori,
zentă în
băuturi r ă
sis h
iale).
cu agar, dprafaţ a lu
le;
şi apar iz
u formă
aramura î
oritoare, d
lmii
L
pă 3 zileioasă.
late sau a
ferică pâ
n fazele i
pe măslin
borator Micr
e cultivate
ociate;
ă la elips
cipiente d
e verzi şi fr
biologie gen
la 25°C, c
oidală şi
e ferment
ucte citrice
eral ă|
lonii
ereţ i
re a
.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 28/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare identificării drojdiilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Saccharomyces cerevisiae
Pichia membranaefaciens
Torulopsis holmii
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 29/64
1.
culoare
2.
sau sla
r ămân
3.
cereali
defectu
murare
Cand
aractere
colonalb-cenuşi
aractere
celulascuţ ite. pot f
lipite.
ăspândir face în c
re; este
l numit „flo
prod.
da va
acrosco
iile dezvoltsau uneo
icroscop
le sunt de
orma pseu
şi rol arte din mizuri rare,
agent derea vinului"
ce alter ări
lida (
ice (colo
te pe mei alb-crem.
ice
ormă elips
domiceliu,
crobiota epse întâln
alterare a;
ale băutu
andi
iale).
iu solidific
idal - alun
deoarece
ifită a fructeşte în m
vinurilor sl
ilor r ăcorit
a my
L
at prezintă
ită, cilindri
prin înmu
lor şi a unicrobiota
lab alcooli
are şi a
oder
borator Micr
un aspec
că, cu extr
urire multi
r legume;eminţ elor
e, slab s
roduselor
a)
biologie gen
mat, cuta
mităţ ile rot
polar ă, cel
oleaginoas
lfitate, pro
conservate
eral ă|
t, de
njite
lulele
e şi
duce
prin
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 30/64
1.
convex
pastela
2.
înmugur
alungite.
3.
cereale,
căpşuni.
aractere
forme, cu perim
t.
aractere
celulire pe între celul
.
ăspândir este l
se îna măslinel poate poate
Rh
acrosco
ază pe Metrul circul
icroscop
le au formaga supraf
pot fi izo
şi rol arg r ăspân
tâlneşte înr ; produce r produce
odot
ice (colo
EA (Maltr, cu supra
ice
ă elipsoidalţă;late sau a
dită pe su
microbiota
r alter ări alalter ări al
rula
iale).
xtract Agfaţ a lucioa
ă şi dimen
sociate pe
rafaţ a fruc
epifită a
e fructelor sucurilor
lutini
L
r), după ă sau asp
siuni medii
rechi. Unel
elor şi legu
frunzelor ş
i legumeloinsuficient
borator Micr
zile dect mucos,
; reproduce
le tulpini p
melor proa
i tulpinilor,
; pasteuriz
biologie gen
ultivare, cde culoare
rea are lo
ot forma c
păt recolta
a boabel
te de me
eral ă|
loniiroşu
prin
elule
te;
r de
re şi
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 31/64
1.
de culo
2.
mono s
3.
şi siropu
aractere
formare alb-cre
aractere
celulu bipolari,
ăspândir a fost
ri de fructe prod prod
Kl
acrosco
ază pe ME, aproape
icroscop
le au fie f are se găs
şi rol izolată de
ce fermentce alterare
ecke
ice (colo
A (Malt Extsemisferice
ice
orma elipssc singuri
pe căpşuni
ţ ia alcoolicsmochine
a api
iale).
ract Agar), cu margin
idală, fiesau perech
; afine, stru
ă a mustullor, tomatel
culat
L
upă 3 zilei circulare ş
piculată,i.
guri, must
i de struguor şi cireşel
borator Micr
de cultivar i suprafaţ a
atorită mu
e struguri,
ri;or.
biologie gen
la 25°C, clucioasă.
gurilor term
sucuri de
eral ă|
olonii
inali,
itrice
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 32/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL DROJDIILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare identificării drojdiilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Candida mycoderma
Rhodotorula glutinis
Kloeckera apiculata
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 33/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
STUDIUL MUCEGAIURILOR
Definiţie
Mucegaiurile sunt microorganisme de tip eucariot , monocelulare sau pluricelulare,
diferenţ iate din punct de vedere morfologic şi care se reproduc prin spori formaţ i numai
pe cale asexuat ă sau pe cale mixt ă (asexuat ă şi sexuat ă ).
Răspândire
în sol, în special în stratul superficial al solului care le asigur ă condiţ ii decreştere şi supravieţ uire.
din sol, sporii de mucegai sunt antrenaţ i pe calea aerului la distanţ efoarte mari. În aer, mucegaiurile sub formă de spori sau hife vegetative potsupravieţ ui un timp îndelungat.
în apă prezenţ a mucegaiurilor este ocazională sporii de mucegai se întâlnesc frecvent la suprafaţa plantelor , în tractul
digestiv, în special la ierbivore. în microbiota plantelor, pe suprafaţ a fructelor şi legumelor .la om şi animale mucegaiurile patogene produc un număr mai redus de
îmbolnăviri, se dezvoltă pe piele, unghii, păr.
Rol
rol important în natur ă:
Prin activitatea lor de degradare a materiei organice vii, mucegaiurileparticipă la transformarea unor compuşi organici (celuloza, hemiceluloze,substanţ e pectice, amidon, lipide) la compuşi mai simpli şi sunt consideraţ iagenţi de putrezire.Mucegaiurile participă astfel la circuitul carbonului în natur ă şi îmbogăţ escsolul în substanţ e cu molecule mici care pot fi folosite de alte microorganismesau de către plante.
în industria alimentar ă, culturi fungice selecţ ionate se pot folosi la fabricarea
brânzeturilor – tip Roqueforti, Camemberti sau la maturarea salamurilor crude. în biotehnologie se pot obţ ine compuşi deosebit de valoroşi:
antibiotice: peniciline Penicillium chrysogenum, etc.;acizi organici (citric, lactic, gluconic, kojic, malic, fumaric); vitamine (B2, ergosterol – provitamina D2); enzime (amilaze, proteaze, lipaze, celulaze etc.).
îmbogăţirea în proteine a f ăinurilor vegetaleagenţi de depoluare a apelor rezidualeobţinere SCP
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 34/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
Caractere morfologice
Mucegaiurile se r ăspândesc în natur ă sub formă de spori rezistenţi lauscăciune, formă în care se menţ in în stare viabilă ani de zile.
Dacă un astfel de spor ajunge pe suprafaţ a unui mediu favorabil pentru creştere,cu o cantitate suficientă de apă liber ă care să-i permită absorbţ ia substanţ elor nutritive,
în primul stadiu care poate să dureze 3-4 ore, are loc absorbţ ia apei şi activizareasistemelor enzimatice, apoi are loc germinarea celulei sporale şi formarea tuburilor vegetative numite hife (lat. hypha) sau thal (thallus).
Hifele cresc numai prin vârf şi deci au o creştere apicală după care se ramifică rezultând miceliul.
Hifele se extind pe suprafaţ a mediului, se diversifică şi îndeplinesc anumitefuncţ ii specializate.
Hifele de extindere se pot dezvolta şi în profunzimea mediului realizândabsorbţia nutrienţilor şi au rol de susţinere;
Hifele de r ăspândire se pot dezvolta de-a lungul mediului sau aerian. La unanumit grad de dezvoltare a acestor hife vegetative se formează hifele
reproducătoare, generatoare de spori, diferenţ iate în funcţ ie de gen şi specie.
Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid în condiţ ii favorabile; astfel îninterval de 2-3 zile pe mediu nutritiv se formează colonii vizibile, diferenţ iate.
În cazul mucegaiurilor inferioare coloniile se dezvoltă rapid, sunt extinse,cu tendinţ a de a ocupa tot spaţ iul disponibil, au aspect pâslos şi culori, alb,bej, cenuşiu, brun.
Mucegaiurile superioare caracterizate formează colonii cu o creştereradială limitată şi culori ce difer ă de la alb la galben, brun, verde, portocaliu,albastru, cu diferite nuanţ e specifice în funcţ ie de gen şi specie.
Caractere fiziologice generale
sunt microorganisme aerobe deci necesită pentru creştere prezenţ a oxigenuluidin aer sau a oxigenului dizolvat în mediul lichid. Un număr limitat de specii suntmicroaerofile şi pot produce mucegăirea internă a untului şi a ouălor.se dezvolta în limite largi de pH (15-9), valoare optimă în domeniu acid 5.5-6.microorganisme mezofile cu temperaturi optime de creştere la 25°C, un număr restrâns sunt termofile - cele patogene au temperatura optimă la 37°C, iar altelesunt adaptate la temperaturi scăzute (0-3°C). Majoritatea sunt inactivate latemperaturi de 80°C; cei mai rezistenţ i spori sunt distruşi la 88°C/10 minute.
Totalitatea hifelor vegetative şi reproducătoare alcătuieşte miceliul.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 35/64
1.
gălbui;
2.
vegetat
şi elibe
3.
prepara
aractere
colon
aractere
Spor ivă; Spor Colu Cola
area sporil Spor
ăspândir
se înt prod
telor de ca
acrosco
ii dense, pâ
icroscop
ngioforii
ngii sfericiela→ for
ul→ se or;ngiospori
şi rol
âlneşte pece mucegne.
Muco
ice (colo
sloase şi o
ice
→ lungi ş
;a cilindric
servă prin
i→ oval-cil
resturi vegirea cereal
r muc
iale)
culoare ce
i neramific
, piriformă ruperea sa
indrici, nete
tale şi dejeelor, pâinii,
edo
Labo
variază de
aţ i, de obi
sau ovală;solubiliza
zi şi hialini.
cţ ii.a produsel
rator Micro
la cenuşiu
cei perpen
rea membr
lor lactate
iologie gen
-argintiu pâ
diculari pe
nei sporan
cide, a că
rală|
nă la
hifa
gelui
nii şi
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 36/64
1.
2.
brun - î
3.
aractere colon
aractere
Stilo Colu Spor
chis.
ăspândir
în nat altera prod
R
acroscoii extinse, c
icroscop
porangeleela → sngiospori
şi rol
ur ă, în solrea fructeloce mucegă
izop
ice (coloun miceli
ice
→ sferic,misferică,i → elibera
i pe produsr şi legumeirea produs
s stol
iale)dens, pâsl
e culoareu apofiza lţ i prin spar
e vegetale;lor depozitaelor alimen
nife
L
os şi culoa
rună - neaargă;erea spor
te;tare şi poat
borator Micr
e cenuşie
gr ă la matu
ngelui sunt
e elabora
biologie gen
ritate;
de formă o
icotoxine.
eral ă|
vală,
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 37/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare identificării
mucegaiurilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Mucor mucedo
Rhizopus stolonifer
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 38/64
1.
gălbuiedevine
r ămân
2.
dispuse
formă s
3.
(tubercsăli de
acid glu
aractere
colon. Odată cubrun închis rever
lbe sau sl
aractere
Coni Vezi Fiali
în două râI.II.
Fialo
ferică sau
ăspândir
se înli, r ădăcini,abricaţ ie. tulpin
conic, galic
acrosco
ia se dezvformarea c- negru;ul colonieib gălbui.
icroscop
ioforii seula este mele se deznduri:
FialideleFialidele
sporii se d
loboasă.
şi rol
âlneşte înseminţ e, fr
i selecţ iona, citric, fum
sper
ice (colo
ltă rapid,onidiosporil
poate fi in
ice
ezvolta dere, sferică
volta radial
primare susecundarezvolta bas
sol, materiucte, cerea
te se folosric, oxalic.
illus
iale)
u un miceor, colonia
olor sau co
obicei diresau globoape întreag
nt mai lungisunt mult
ipetal, în la
i vegetalele) şi produ
esc industr
iger
Labo
liu catifelatcapătă un
lorat în gal
t din substsă;a suprafaţ a
i decât celeai scurte.ţ uri lungi,
n descomsele lor de
ial pentru
rator Micro
, de culoaaspect gra
ben-pal; m
at;
laterală a
secundare
in fialidele
unere, miprelucrare,
bţ inerea d
iologie gen
e albă sauular şi cul
rginile colo
veziculei şi
;
secundare;
roflora vegepozite, pi
e acizi org
ral ă|
alb-area
niilor
sunt
au o
etală niţ e,
anici:
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 39/64
1.
2.
3.
oryzae
aractere
colon rever
aractere
Coni Capu Vezi Fiali Coni
ăspândir
se po- orez), mal
A
acrosco
ia are culoaul coloniei
icroscop
ioforii sunl conidial ula este sf ele sunt uniosporii s
şi rol
ate izola diţ fructe, pro
sperg
ice (colo
re gălbuieeste incolo
ice
t înalţ i cu pste sferic.rică şi preziseriate. Unt elipsoid
n sol, de pduse alime
llus o
iale)
pre galben.
reţ i subţ iri
intă pe 2/3eori pot fi pli, piriformi
resturi vetare.
ryzae
Labo
-orange, br
şi aspect ru
din suprafarezente şi f , sau globo
etale, sem
rator Micro
un-oliv;
gos, sub v
ţ aialide secui la maturit
inţ e, în spe
iologie gen
ziculă.
dare.ate
cial de ore
ral ă|
(lat.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 40/64
1.
margini
2.
vezicul
vezicul
3.
conser zahăr (
aractere
colon rever
.
aractere
Coni
, de formă Capu
Fiali
se pot for Fialo
ăspândir
este Aspe
ate prin uucuri, siro a fost
A
acrosco
ia are culoaul coloniei
icroscop
ioforii suovală.l conidialele se for a noi coni
sporii au fo
şi rol
ăspândit îngillus glau care (cereuri, fructe cizolat de p
pergi
ice (colo
re verde geste slab
ice
t netezi, in
ste mare,ează direiofori scur ţ rma elipsoi
natura, fiincus esteale, seminţ onfiate).
pâine, lap
llus gl
iale)
lbui sau vecolorat în
colori, cu
feric sau ot pe vezic
i.dală sau pi
frecvent î agent dee oleagino
te concentr
aucus
Labo
rde cenuşiuanţ e gal
iametrul c
al.lă, la part
iformă.
tâlnit în solmucegăirease, fructe
at, unt.
rator Micro
;en-verzui,
re se lărg
a superio
l.al prodususcate) s
iologie gen
brun - roş
şte treptat
r ă. Adese
elor alimeu cu adao
ral ă|
at la
spre
ri pe
ntares de
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 41/64
1.
2.
3.
viguros35°C.
brună.
aractere
colon rever
aractere
Coni Prezi Form
ăspândir
Peni la 0°C). S
Este
A fos Foart Prod
Pe
acrosco
ia are culoaul este col
icroscop
ioforii aută fialide f
ează conid
şi rol
illium expae dezvoltă
prezentat î
izolat şi dee r ăspânditce micotox
icilliu
ice (colo
re verde-alrat în brun
ice
ereţ i netezie cu formăii elipsoidal
sum esteoptim la 2
mod frec
pe căpşunpe alimentine de tipul
m ex
iale)
ăstrui, cu închis sau
i.de fiolă, fiee, cu pereţ i
un mucega°C. Temp
ent pe m
i şi tomate.cum sunt
patulinei şi
ansu
Labo
spect catif portocaliu-
cu formă cnetezi.
i psihrofil (ratura ma
re şi pere
carnea şi pcitrininei.
rator Micro
lat;run.
ilindrică.
oate creştimă de de
la care pro
odusele di
iologie gen
la -6°C; cvoltare es
duce putre
carne.
ral ă|
reştee de
zirea
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 42/64
Cadrul didactic
Tema: STUDIUL MICROBIOLOGIC AL MUCEGAIURILOR Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare identificării
mucegaiurilor
NUME/PRENUME STUDENT
GRUPA
Data
Aspergillus niger Aspergillus oryzae
Penicillium expansum Aspergillus glaucus
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 43/64
1.
închis p
2.
purtând
3.
maxim
(strugu
calitate
aractere
forme măsura f
rever
aractere
Coniterminal u Coni
ăspândir
Botry de 28-35° este
i, mere, pe poate în to
superioara
acrosco
ază coloniirmarii coniul este de
icroscop
ioforii semănunchiiile format
şi rol
tis cinerea şi optime
un mucege, căpşunisă producmnele însdin boabel
otry
ice (colo
extinse, flodiilor.culoare gri.
ice
formează de ramuripe aceste
se dezvoltala 22-25°C,i întâlnit î
).putrezirearite produstafidite.
is cin
iale)
conoase.
din hifelecurte, avâramuri scu
în domeni, şi într-un i
zonele t
fructelor şie "botritiza
rea
Labo
iceliul este
aeriene,d capetelerte sunt eli
i de tempeterval de pmperate,
legumelor rea nobila"
rator Micro
iniţ ial alb,
u diferiterotunjite.soidale, ne
raturi miniH de 2-8.pe legume
şi în condiţ iicu obţ ine
iologie gen
ar devine
lungimi, fi
tede şi lun
e de -2 - .
(roşii) şi f
de refriger ea de vinu
ral ă|
ri-gri
care
i.
5°C,
ructe
re.ri de
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 44/64
Botrytis cinerea
Laborator Microbiologie general ă|
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 45/64
1.
cea a d
2.
perpen
formân
sferici.
3.
slab la
drojdieigrapefr aliment
a fost d
aractere
micelrojdiilor. Pe rever
aractere
Preziicular hife Hifel
arthrosp Arth
ăspândir
se deemperaturi este
comprimuit), în timare. este
enumit "mu
Ge
acrosco
iul are culMEA colo
s necolorat
icroscop
ntă hife vreproducreproducri hialini, cosporii au
şi rol
zvoltă la tesub 10°C.
agentul dete. Produul depozit
ontaminancegaiul util
trich
ice (colo
are alb-cr iile sunt e
ice
egetative,toare, car ătoare seilindrici sau
tendinţ a
mperaturi o
contaminae putrezir rii acestor
t frecvent aajelor".
m ca
iale)
m, înălţ imtinse, au c
ramificatenu se dife
ragmenteaelipsoidali,
de aranjar
ptime de 2
e al produa acr ă, î
a. Produce
l utilajelor
didu
Labo
i reduse şiuloare albă
dichotomirenţ iază deză la matu, cu capete
în zig-z
5-30°C şi
selor lactan specialrâncezire
in industri
rator Micro
textura a, aspect pu
c, pe cahifele veg
ritate aproarotunjite.g, iar la
axime de
e, al zemiia fructelo
untului şi
laptelui, m
iologie gen
emănătoalverulent.
e se deztative.pe în între
aturitate
5-38°C. C
de mur ătcitrice (l
a altor gr
otiv pentru
ral ă|
e cu
volta
ime,
evin
reşte
ri, almâi,simi
care
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 46/64
1.
cenuşi
2.
unor clongitu
3.
recoltat
aractere
micel. rever
spect mi
prezi form
nidiofori f inale, sunt
ăspândir se î
e când pre
Al
oloniale
iul este pu
sul coloniei
roscopic
tă hife suază lanţ uriarte scur ţ piriforme şi
şi rol tâlneşte î enţ a lor po
erna
os, are iniţ
are culoar
ţ iri, septatede conidii
i care nudispuse c
microflor ate fi consi
ia alt
ial culoare
brun pân
.(cca., 10 cse pot dipartea as
cerealelderată dre
rnat
Labo
alb murda
la negru.
onidii), ramtinge. Couţ ita elong
r, seminţ t indice de
rator Micro
r-gri, iar a
ificate nereidiile preziata, spre c
lor oleagiprospeţ im
iologie gen
oi devine
gulat, la cantă 2-3 snidiofor.
oase proale acest
ral ă|
run-
pătulpturi
spătra.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 47/64
1.
este ro
margin
2.
3.
coroan
aractere
Micel-cenuşiu Reve
.
spect mi
În pr ra
for ne
ăspândir
Se d Este
a la plante Se p Poat
Fus
oloniale
iul are asppre auriu-
rsul este
roscopic
parat micr macrocoificaţ i, de
clamidomaţ i intercezi sau ru
şi rol
zvolta optir ăspânditde grâu, pate întâlnielabora
rium
ect pâslosrunolorat în
oscopic senidii, caobicei în m
pori, car lar, de-a loşi, hialini
m la 24-26n natura şrumb).si pe planticotoxine
gram
, dens, şi
portocaliu-
pot obser e se for ănunchi, fu
-sunt monngul hifelsau de cul
°C, la pHi este fitop
e (mazăre,e tipul sci
near
Labo
se extinde
brun cu n
a:mează psiformi, cu
o sau plurir sau la ni
oare brun
,7-7,2.atogen al
, cartofi, bapene (zea
m
rator Micro
rapid în
uanţ e mai
conidiof 5 septuri.
celulari, develul macr al.
gramineelo
nane).ralenone).
iologie gen
laca. Cul
deschise
ri simpli
obicei gloconidiilor;
r (putrezir
ral ă|
area
spre
sau
boşi,sunt
a în
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 48/64
1.
2.
dendriti
neregulpot pre
3.
cuprins
şi prod
aractere
colon
rever
spect mi
prezi Coni
c. form
ate datoritenta 1-2 s
ăspândir
se po între -1-0° este
se din car prod
Clad
oloniale
ii catifelate,
s de culoar
roscopic
tă hife suioforii su
ază coni
cicatricilor epturi trans
şi rol
ate dezvolt şi 32°C.n contamie, oua, legce pete ne
ospor
netede uş
brun oliv
ţ iri, septatent ramific
ii elipsoidmugurale.ersale.
a până la
ant frecveume proasgre pe carn
um h
r ridate, d
ână la ne
.ţ i neregul
ale până Conidiile s
n aw de 0.
nt al produete, alune
ea păstrat
rbar
Labo
culoare ol
ru-bleuma
at, ceea
la cilindriunt de obic
88 şi într-u
elor alime, cereale., în condiţ ii
m
rator Micro
iv.
in (ca o pa
e le con
ce, cu exei neseptat
n domeniu
tare, este
i de refriger
iologie gen
ă de cerne
er ă un a
tremităţ i ue, dar cele
de temper
întâlnit pe
are.
ral ă|
ală).
pect
neorimari
atura
ame
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 49/64
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 50/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
TEHNICI DE IZOLARE A CULTURILOR PURE
Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaţ ii de
prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare în medii de cultur ă specifice şi,după cultivare în condiţ ii optime, izolarea şi studiul coloniilor izolate, repicare pentruobţ inerea de culturi pure.
Prin cultur ă pur ă se înţ elege biomasa de celule rezultate prin reproduceredintr-o singur ă celul ă aflat ă într-un mediu nutritiv steril cu volum limitat.
Astfel, o cultur ă pur ă este format ă din celule apar ţ inând unei singurespecii sau unei singure tulpini.
In funcţ ie de principiul realizării lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate îndouă grupe mari, şi anume:
metode bazate pe principiul separ ării fizico-mecanice a celulelor;
metode biologice.
La rândul lor, fiecare din aceste două grupe cuprinde metode generale, care se pretează afi utilizate pentru izolarea majorităţ ii microorganismelor, sau metode de izolare specificepentru un anumit grup sau un microorganism individual.
Procedee fizice de izolare a culturilor pure
Metoda Koch
Se bazează pe r ăspândirea microorganismelor recoltate din medii naturale într-un mediunutritiv şi fixarea distanţ ată a celulelor în urma solidificăm mediului cu formare prinmultiplicare de colonii izolate între ele.
Metoda este folosită în special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul der ăspândire este mustul de malţ cu gelatină, repartizat câte 20cm3 în 3 eprubete,fluidificat şi menţ inut la 35-40°C. Din proba aleasă pentru izolare se recoltează celulele cuajutorul unei anse, care apoi este trecută succesiv în cele 3 eprubete. După inoculareşi uniformizare, conţ inutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o placă Petri, iar prinsolidificarea mediului celulele care r ămân fixate în gel vor forma prin multiplicare coloniiizolate.
În funcţ ie de densitatea celulelor recoltate ini
ţ ial, în placa a 2 a sau a 3 a pot exista colonii
izolate (la o distanţă de cca. 2 cm), iar după studiul caracterelor microscopice alecoloniilor reprezentative se face repicarea în eprubete cu Malt Extract Agar, ob ţ inându-seculturi pure (fig. 1).
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 51/64
2
Facultate
Metoda
În plăci
Cu ajut(fig. 3),solidificaceluleleformeze
Ş tiinţ a şi In
scarificat
etri sterile
rul firuluiapoi cu fir t, astfel însă r ămânăcolonii izol
ineria Alime
Fi
se repartiz
Fig.
etalic sel încărcat
ât prin druataşate dte.
telor
. 1. Tehni
ează medi
2 Repartiz
recoltează cu celuleul cât maimediu şi
a de izolar
ul de cultur
are mediu
celule dine traseaz
i sinuos paprin termo
L
a culturilo
ă adecvat
de cultur ă
mediul nastriuri dif
rcurs de fir statare 48-
borator Micr
r pure
(BCA sau
decvat
tural sau derite pe su(Fig.4), înt72 h să s
biologie gen
MA) (fig.
in culturiprafaţ a me-o zonă adezvolte
eral ă|
).
ixtediuluiplăciişi să
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 52/64
3
Facultate
Se realisunt rep
Ş tiinţ a şi In
ează apoiicate în epr
F
ineria Alime
Fig
tudiul morf ubete cu m
ig. 4 Trasa
telor
. 3 Recolta
ologic al codiu steril,
e striuri p
Fig. 5 Obţ i
rea celulel
loniilor repr bţ inându-s
suprafaţ a
ere de cul
L
r din cultu
ezentativee astfel cul
unui mediu
uri pure
borator Micr
i mixte
şi culturileuri pure (fi
solidificat
biologie gen
are interes. 5).
eral ă|
ează
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 53/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
1
TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A
NUMĂRULUI DE MICROORGANISME
Tehnica clasic ă de numărare prin cultivare pe medii dense
Metoda culturala Koch
Metodologia de analiză presupune inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm3 din
fiecare diluţie se transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. Peste suspensia dinfiecare placă se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific, cu agar (10-15
cm3), fluidificat şi temperat. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin mişcăriorizontale, circulare ale plăcii. După solidificarea mediului, prin termostatare în condiţiioptime, se vor forma colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia.
Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ
anaerobe, dar şi microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. în cazul
microorganismelor anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în mediu şi solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă unstrat de mediu steril.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 54/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
2
Citire a şi interpretarea rezultatelor
După termostatarea în condiţii optime, apariţia vizibilă a coloniilor va depinde departicularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare,de obicei după 48-72 h de cultivare.
În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care s-a făcut numărarea n,se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm 3 probă de analiză, cuformula:
∑
N – numărul de celule/cm3(g) probă;
Σ n – suma numărului coloniilor din plăcile din care se face numărarea;
x1 – numărul plăcilor din prima diluţie aleasa pentru numărare;
x2 - numărul plăcilor din a doua diluţie aleasa pentru numărare;
k – coeficientul de diluţie corespunzător primei diluţii aleasă pentru număr are;
0,1 – coeficient care egalează diluţiile.
Atenţie!!! Numărarea se realizează din plăcile Petri în care s-au dezvoltat între 25 – 250 de colonii
În cazul în care numărul de colonii pe placă este mare, în imposibilitatea repetăriianalizei, pentru a înlesni numărarea fie se împarte placa în mai multe sectoare, se
numără coloniile pe un sector şi, în final, se însumează coloniile pe întreaga placă, fiese delimitează pe reversul mediului o suprafaţă de 1 cm2, care conţine un număr mediude microorganisme, se numără coloniile de pe această suprafaţă şi, în final, seraportează la total suprafaţă mediul din placă.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 55/64
Cadrul didactic
Tema: TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A NUMĂRULUI DEMICROORGANISME
Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţ iunilor necesare evaluării numărului demicroorganisme
1. Completaţi schema de lucru pentru realizarea diluţiilor si inocularea probelor
2. Înregistraţi in tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (in plăcile selectate pentru numărare)
ProbaDiluţia
Nr. colonii/placă
1
2
3. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau mlprodus:
Proba 1 _______________ Proba 2 _______________
NUME/PRENUME STUDENTGRUPAData
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 56/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
1
METODA DIRECTĂ DE NUMĂRARE A BACTERIILOR ÎNPREPARATE FIXATE ŞI COLORATE
METODA BREED
Celulele de bacterii aflate într- un volum cunoscut de lichid se repartizează pe o
suprafaţă limitată de frotiu, iar după fixare şi colorare simplă se stabileştenumărul de celule prin examen microscopic direct.
Pe o lamă de sticlă degresată se conturează cu markerul o suprafaţă S d de2-6 cm2 (a).
Se inversează lama şi, central, cu ajutorul unei micropipete sterile, se
plasează o picătură din suspensia de analizat cu un volum cunoscut V p , egal cu 0.02-0.05cm3 (b). Imediat cu ajutorul firului se repartizează cantitatea de probă cât mai uniform,pe întreaga suprafaţă conturată.
Se realizează uscarea în curent de aer cald (c, d), fixarea (de preferat cusoluţie de alcool 96%, timp de 20 min) (e), colorarea simplă (f), spălarea (g) şi uscarea.
Preparatul se studiază apoi la microscop, cu obiectiv de imersie, având grijăca picătura de ulei de cedru să fie pusă în momentul în care se face numărarea.
Se numără celulele de bacterii din mai multe câmpuri microscopice(minimum 25; Σn=600-1000) aflate în diferite zone ale frotiului. După numărare; se
a
bc d
e f
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 57/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
2
calculează numărul mediu de celule pe câmp microscopic (x = numărul de câmpuricercetate):
∑
Pentru determinarea numărului de celule prezente într -un gram sau cm3
produs analizat este necesar să se cunoască: gradul de diluţie, volumul de suspensiefolosit la obţinerea frotiului, mărimea suprafeţei delimitate pe care s -a realizat frotiul şisuprafaţa câmpului microscopic.
Suprafaţa câmpului microscopic S c se determină cu ajutorul micrometruluiobiectiv. Se înlocuieşte preparatul analizat cu lama micrometrului obiectiv şi, cu acelaşiobiectiv cu care s-a făcut numărarea, se măsoară diametrul câmpului dc cu ajutorul scăriigradate (1 mm:100 diviziuni):
unde: n d este numărul de diviziuni de pe scara micrometrului obiectiv care se
cuprind exact în câmpul microscopic:
Numărul de câmpuri microscopice posibil de studiat pe suprafaţa de frotiudelimitată - N c se calculează cu formula:
Numărul de bacterii prezente într -un cm3 sau un g produs analizat sedetermină cu formula:
în care: k este coeficientul de diluţie.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 58/64
Cadrul didactic
Tema: METODA DIRECTĂ DE NUMĂRARE A BACTERIILOR ÎN PREPARATEFIXATE ŞI COLORATE - METODA BREED
Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare evaluăriinumărului de microorganisme
1. Înregistraţi datele obţinute în tabelul de mai jos:
Suprafaţa delimitată, cm2 S d =
Volumul suspensiei de analizat, cm3 V p = Numărul mediu de celule pe câmp microscopic:
x (numărul de câmpuricercetate)
n (nr. celulele debacterii)
x (numărul de câmpuricercetate)
n (nr. celulele debacterii)
1 13
2 14
3 154 16
5 17
6 18
7 19
8 20
9 21
10 22
11 23
12 24
25
∑
Diametrul câmpului microscopic, mm
dc =
Suprafaţa câmpului microscopic, cm2
S c =
Numărul de câmpuri microscopice pe suprafaţa de frotiu delimitată
N c =
Numărul de bacterii prezente într -un ml sau un g
N =
NUME/PRENUME STUDENTGRUPAData
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 59/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
1
METODE DIRECTE DE NUMĂRARE
NUMĂRAREA CU CITOMETRE
Celulele de drojdii şi sporii de mucegai se pot număra, prin examen microscopicdirect, cu ajutorul citometrelor (camerelor de numărat) .
Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Türk, Bürker, Rosenthal,
Goreaev ş.a., construite pe acelaşi principiu.
Un citometru este o lamă de sticlă groasă, prevăzută cu trei platforme separate între ele prin rigole în sticlă. Platforma centrală este denivelată faţă de celelalte douăcu o înălţime de 0,1- 0,2 mm (înscrisă pe fiecare cameră). Pe platforma centrală estegravată o reţea de linii perpendiculare, care delimitează o anumită suprafaţă divizată
de către linii perpendiculare în microcelule de formă pătratică (pătrăţele elementare).Diferenţierea dintre tipurile de citometre constă în mărimea variabilă a
suprafeţei unui pătrăţel elementar, în cazul citometrului Thoma, suprafaţa de 1mm2 este divizată de către linii în 400 de pătrăţele elementare cu (Fig. 1) latura de
1/20 mm.
Fig. 1 Profilul şi reţeaua citometrului Thoma
Pentru numărare se plasează o picătură din suspensia de celule de analizat peplatforma centrală, în dreptul suprafeţei delimitate. Peste suspensie se plasează olamelă care se sprijină pe cele două platforme laterale şi astfel între lamelă şi citometruse creează o peliculă de lichid cu înălţime egală cu denivelarea platformei centrale (0,1mm).
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 60/64
Facultatea Ştiinţa şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie generală|
2
Preparatul obţinut se studiază la microscop cu obiectiv cu grosisment x 40, când în câmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 pătrăţele elementare, din care
se numără celulele a căror suprafaţă se află mai mult de jumătate în interiorul careuluide 4x4 pătrăţele elementare. Se fac numărări de celule din mai multe câmpurimicroscopice (∑n = 100) şi se calculează numărul mediu de celule pe un pătrăţelelementar.
Suprafaţa (S) de 1 mm2 este divizată de către linii în 400 de pătrăţeleelementare cu latura de 1/20 mm. Suprafaţa pătrăţelului elementar este:
Înălţimea platformei centrale:
Volumul pătrăţelului elementar:
Numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar:
∑
Numărul de celule prezente într -un cm3 de suspensie de analizat se
determină cu formula:
în care:
n - numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar;
k - coeficient de diluţie.
În cazul bacteriilor, această metodă este greu de aplicat, atât din cauza
dimensiunilor reduse ale celulelor cât şi a faptului că de multe ori ele prezintămobilitate.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 61/64
Cadrul didactic
Tema: METODE DIRECTE DE NUMĂRARE – NUMĂRAREA CU CITOMETRE
Scopul: Cunoaşterea şi utilizarea adecvată a noţiunilor necesare evaluării
numărului de microorganisme 1. Analizaţi profilul şi reţeaua citometrului Thoma
2. Înregistraţi datele obţinute în tabelul de mai jos:
Suprafaţa pătrăţelului elementar, mm2
S pe =
Înălţimea platformei centrale, mm
h =
Volumul pătrăţelului elementar, cm3
Vpe
Numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar: x (numărul de câmpuricercetate)
n (nr.celulele )
x (numărul de câmpuricercetate)
n (nr.celulele )
1 6
2 7
3 8
4 9
5 10
∑
Numărul de celule prezente într -un cm3
de suspensie
N =
NUME/PRENUME STUDENTGRUPAData
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 62/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
1
INFLUENŢA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA DEZVOLTĂRII
MICROORGANISMELOR
În procesul de nutriţ ie şi deci în cel de dezvoltare a microorganismelor, acestea suntsupuse influenţ elor unor factori de mediu care condiţ ionează activitatea microbiană determinând fie stimularea creşterii şi reproducerii, fie inhibarea activităţ ii(inactivarea microorganismelor).
Procesele metabolice se desf ășoar ă în limite stricte de temperatura, specificefiecărui microorganism. Factorul temperatur ă poate favoriza sau inhiba dezvoltareamicroorganismelor, iar în anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora.
Modul de lucru
Pentru a testa influenţ a temperaturii asupra dezvoltării microorganismelor sefolosesc două microorganisme test (Bacillus subtilis şi Saccharomyces cerevisiae),sub formă de suspensie.
Pentru fiecare microorganism luat în studiu, se iau câte trei plăci Petri sterile. Cu opipetă sterilă se introduc în fiecare placă, cate 1 cm3 suspensie. În fiecare placă
Petri se toarnă apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA – bulion de carne cu agar,pentru Bacillus subtilis şi MMA – must de malț cu agar, pentru Saccharomyces
cerevisiae) fluidificat şi r ăcit la 45±5°C. Mediile se repartizează uniform în plăci prinrotirea acestora în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se producesolidificarea. Pe capacul plăcilor se notează numele probei, mediul utilizat şi apoi setermostatează la temperaturi de 4, 25, 37°C, timp de 3 zile. După perioada determostatare se va evalua creșterea microorganismelor în fiecare placă şi se va notanivelul de creștere, în tabelul din fisa de lucru.
Pentru a aprecia dezvoltarea microorganismelor sau activitatea enzimelor estenecesar să se cunoască valoarea activității apei.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 63/64
Facultatea Ş tiinţ a şi Ingineria Alimentelor
Laborator Microbiologie general ă|
2
Disponibilitatea apei dintr-un mediu de cultur ă pentru transferul de substanțe şireacțiile chimice este exprimată prin activitatea apei (aw). Acest parametru ia valoride la 0 la 1. Prezenţ a substanțelor solubile în apa face ca activitatea apei pure să scadă sub valoarea 1. Cu cât concentrația unei soluții este mai mare, cu atâtscăderea valorii activității apei este mai mare şi vice-versa, ceea ce poate crea un
soc osmotic.
Mod de lucru
Pentru a testa influenţ a temperaturii asupra dezvoltării microorganismelor sefolosesc două microorganisme test, Bacillus subtilis şi Saccharomyces cerevisiae,sub formă de suspensie şi medii de cultura cu concentrații diferite de sare (0%,0.5%, 2% NaCl)/ diferite activităţ i ale aw.
Pentru fiecare microorganism luat în studiu, se iau câte trei placi Petri sterile. Cu o
pipetă sterilă se introduc în fiecare placă, cate 1 cm3 suspensie. În fiecare placă Petri se toarnă apoi cca. 15 cm3 mediu de cultura (BCA – bulion de carne cu agar pentru Bacillus subtilis şi MMA – must de malț cu agar pentru Saccharomyces
cerevisiae) fluidificat şi r ăcit la 45±5°C. Mediile se repartizează uniform în placi prinrotirea acestora în plan orizontal, apoi sunt lăsate în repaus până se producesolidificarea. Pe capacul plăcilor se notează numele probei, mediul utilizat,concentrația de sare şi apoi se termostatează la temperatura de 25°C timp de 3-5zile plăcile inoculate cu suspensie de Saccharomyces cerevisiae şi temperatura de37°C, timp de 48 ore, plăcile inoculate cu suspensie de Bacillus subtilis. După
perioada de termostatare se va evalua creșterea microorganismelor în fiecare placă şi se va nota nivelul de creștere în tabelul din fisa de lucru.
8/3/2019 Laborator Microbiologie generala_2011-2012
http://slidepdf.com/reader/full/laborator-microbiologie-generala2011-2012 64/64
Tema: FACTORI CARE INFLUENŢEAZĂ DEZVOLTAREA
MICROORGANISMELOR
Scopul: Înţelegerea modului în care diverşi factori influenţează dezvoltareamicroorganismelor
1. Influenţa temperaturii asupra dezvoltării microorganismelor
Notaţi în tabel nivelul de creştere a microorganismelor după termostatare la diferite
temperaturi.
MICROORGANISM TEMPERATURA
4°C 25°C 37°C
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
++ creştere maximă + creştere medie
- creştere nulă
2. Influenţa activităţii apei asupra dezvoltării microorganismelor
Notaţi în tabel nivelul de creştere a microorganismelor după inoculare pe medii de cultura
cu concentraţii diferite de NaCl si valori diferite ale activităţii apei.
MICROORGANISM Concentraţie NaCl/aw 0% 0,5% 2%
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
++ creştere maximă + creştere medie
- creştere nulă
NUME/PRENUME STUDENT