Analiza K-RAS si mutatiile P53 in probele de sputa

Asist.univ.dr.Covaci AureliaLab 24Tehnici speciale utilizate n biologia molecular: Studiul ADN-ului Amplificarea genicPCRDefinire. GeneralitiReacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele mediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentar, epidemiologie etc. Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare) Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz).

Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel :ADN d.c. matri ADN m.c. ataarea primerilor polimerizare ADN polimeraz ADN dependent termostabil 2 molecule ADN d.c. identice cu molecula matri Principalele componente ale reaciei sunt : ADN matri, o ADN polimeraz termostabil, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacie, ioni de Mg++. O reacie PCR este format din n cicluri (ntre 25 i 40), n fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale: denaturarea termic a matriei (deci, desfacerea dublului helix ADN), ataarea primerilor i polimerizarea propriu-zis. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultat este dubl fa de matri. Mai mult, produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel nct numrul final de copii ADN este de 2n x y, unde y = numrul iniial de copii, iar n = numrul de cicluri de replicare.

Este de subliniat faptul c moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale matriei care la capete au incorporai primerii. In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr a fi necesar o prealabila clonare molecular a acestora

Tehnici de biologie molecularIzolarea ADNVerificarea puritatii si determinarea cantitatii de ADNReactia de polimerizare in lant (Polymerase chain reaction - PCR)Electroforeza in gelSecventiereaClonarea moleculara si Expresia genelor

Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici: PCR Northern Blot Southern Blot FISH MicroarrayPCR Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a polimerazei)Mullis & Faloona Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, 1987Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-polimeraza) a numrului de copii ale unei regiuni specifice dintr-un lan ADNT E H N O L O G I A P C RReacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. Pe scurt, tehnica PCR permite ca o singura copie a unei secvente de ADN sa fie copiata de milioane de ori sau chiar sa fie modificata pe parcursul amplificarii (atunci cand este dorit acest lucru: ex. Introducerea unei mutatii). Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare).Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz).

Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel :

TIPURI DE PCRReal Time PCR (PCR cantitativ), Real Time PCR este o metoda diferita fata de RT-PCR (reverse transcriptase PCR). Real Time PCR este o metoda care include atat amplificarea fragmentului ADN in timp real cat si analiza acestuia.Se folosesc cantitati foarte mici de proba. Se pot amplifica atat probe ADN cat si probe ADNc cu aceeasi viteza si eficientaUn numar mult mai mare de probe de concentratii diferite pot fi analizate in acelasi timp.Amplificarea fragmentului ADN se poate vizualiza cu ajutorul moleculei reporter pe tot parcursul reactiei, nu la sfarsit.Aplicaii Real-Time PCRReal-Time PCR poate fi utilizat pentru:Genotipare Trisomii si detectarea numarului de gene unice din genom Genotiparea microdeletiilor Haplotipare Analiza cantitativa a microsatelitilor Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sangele maternDiagnosticul cancerelor Cuantificarea expresiei genelorMasurarea expunerii la radiatii Studiul ADN mitocondrial Detectia metilarii Detectia inactivarii cromosomului X

Aplicatii Real-Time PCRVerificarea existentei ADN in probele biologice Controlul calitatii Testarea stabilitatii genetice Monitorizarea eficientei medicamentelor pe AND microorganisme Detectare si cuantificare a ADN viral Detectia si cuantificarea patogenilor

ADNAcid nucleic (dezoxiribonucleic)Lant dublu catenar:5 (fosfatat) 3 (hidroxilat)3 5Nucleotid:Nucleozid:Baza azotataPentozaGrupare fosfat

BAZELE AZOTATEBaze purinice:Adenina (A)Guanina (G)Baze pirimidinice:Citozina (C)Timina (T)Legaturi de hidrogen:A:TC:GADENINA

CITOZINA

GUANINA

TIMINA

ADN

5 3TCACACTGAGCGTGCTGAGTGTGACTCGCACGAC3 5TEHNICA PCRADN de amplificatPrimeri (oligonucleotide, amplimeri)ADN-polimerazadNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)Solutie tampon (Mg2+ sau Mn2+, K+)

ADN-UL DE AMPLIFICATCantitati mici (1 molecula)Poate fi impur, vechi, degradatSurse:SangeSpermaParPeriuta de dintiInsecte (in chilhlimbar)MumiiAmprenteUrina

PRIMERII20-30 de dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5 sau 3 ale fragmentului de amplificatSintetizai n laboratorLungimea ~ specificitateaIn exces n mediul de reacieADN-POLIMERAZA enzima care catalizeaza polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea primerilor)Taq polimeraza:Thermus aquaticus (bacterie termofilica)Ape termaleActivitate optima la 75-80 CAlte polimeraze:E. ColiPfu (Pyrococcus furiosus)

TEHNICA PCREtapa de meninere a unei temperaturi nalte (90 C, timp de 1-9 minute)20-40 cicluri (serii de modificri de temperatur repetate)Fiecare ciclu are 2-3 trepte de temperaturTemperaturile i durata aplicrii variaz n funcie de:ADN-polimerazConcentraia ionilor bivaleniConcentraia dNTP-urilorTemperatura de legare a primerilorETAPELE PCRDenaturarea ADN-ului dublu catenar

Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu catenar

Extensia primerilorDENATURAREA ADN-ULUI94-98 C, timp de 20-30 de secundeADN-ul dublu catenar este desfurat n dou lanuri complementare, de care se vor lega apoi primeriiLa sfritul acestei etape n mediul de reacie vor fi prezente dou lanuri ADN simplu-catenare

CUPLAREA PRIMERILORSe scade temperatura la 50-65 C, timp de 20-40 de secundePrimerii sunt n exces n mediul de reacieLan dublu-catenar hibrid primeri i ADN de amplificat

EXTENSIA PRIMERILORTemperatura depinde de ADN-polimeraza (de obicei 72C)ADN-polimeraza: Se leag de lanul hibridCitete secvena lanului ADN-intAlungete primerii prin adugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritii

TEHNICA PCR

Denaturarea la 94-98 CCuplarea primerilor la 50-65 CExtensia la 72 CTerminarea primului ciclu i dublarea cantitii de ADNTEHNICA PCR

FAZELE AMPLIFICARIIAmplificare exponenial: la fiecare etap cantitatea de ADN se dubleazLevelling off: se consum reactivii, reaciile se defoar mai lentPlatou: epuizarea reactivilor (primeri, dNTP)VIZUALIZAREA PRODUSILOR DE AMPLIFICARE

MW: amestec de fragmente cu dimensiuni cunoscute1: ~1850 bp2: ~800 bp3: nu s-a amplificat4: ~800 bp5: benzi multipleAPLICAIITestarea unor mutaii (ex.: fibroza chistic, gene tumorale)Testare prenatal (i screening preimplantare)Infecii virale (HIV), bacteriene (BK)Teste de histocompatibilitateMedicina legal:Teste de paternitateIdentificarea de persoaneCladistica

GENE TUMORALE

TESTE DE PATERNITATE

1 Tatal2 Copilul3 MamaIDENTIFICAREA DE PERSOANESTR (Short Tandem Repeats)

IDENTIFICAREA DE PERSOANE

CLADE