Prepararea mediului de cultur Soluii stoc

Laborator nr. 3

http://www.ejpau.media.pl/volume5/issue1/agronomy/art-04.html

Mediu de cultur = amestec de substane, coninnd nutrieni, utilizat la creterea plantelor in vitro Compoziia mediilor de cultur de baz: - macroelemente - microelemente - vitamine - surs de Fe - surs de CTipuri de medii de cultur: a. dup compoziie: - de baz (macroelemente, microelmente, vitamine) - complexe (de baz + regulatori de cretere) b. dup consisten: - lichide - solide

Macroelemente (milimoli): C = Carbon - rol plastic, energetic (proteine, celuloz) H = Hidrogen - rol plastic, energetic (proteine, glucide) O = Oxigen - rol metabolic, energetic (respiraie celular) P = Fosfor - rol metabolic, plastic (ATP, comunicare celular) K = Potasiu - rol metabolic (pomp de ioni - stomate) N = Azot - rol plastic, metabolic (proteine, ADN) S = Sulf - rol plastic (aminoacizi, proteine) Ca = Calciu - rol metabolic, plastic (pereii celulari, transportul nutrienilor)

Mg = Magneziu - rol metabolic, plastic (pigmentul clorofilian, cofactor enzimatic)

Microelemente (micromoli):

Fe = Fier - rol metabolic, plastic (cofactor enzimatic)Mo = Molibden - rol metabolic (cofactor enzimatic) B = Bor - rol metabolic (transportul glucidelor, diviziune celular)

Cu = Cupru - rol metabolic (activator enzimatic, fotosintez)Mn = Mangan - rol metabolic (cloroplaste) Zn = Zinc - rol metabolic (sinteza i activarea enzimelor)

Cl = Clor - rol metabolic (fotosintez)Hormoni vegetali (regulatori de cretere): - auxine: acid indolil acetic (AIA), acid naftilacetic (ANA), acid indolil butiric (AIB), acid 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D) - citochinine: 6-benzilaminopurina (BAP), 6-benziladenina (BA), kinetina, zeatina - gibereline: acid giberelinic - etilen

FitohormoniiAuxinele: - produse n vrful tulpinii, al rdcinii i n muguri - rol: - stimuleaz alungirea celulelor - menin dominana apical (inhib creterea mugurilor laterali) - stimuleaz diviziunea celular a cambiului, n combinaie cu citokininele n culturile de celule - mediaz fototropismul i gravitropismul rdcinii

Citokininele: - produse n meristeme i zone de cretere intens (frunze tinere, fructe, semine) - rol: - stimuleaz diviziunea celular - stimuleaz morfogeneza n cultur in vitro - stimuleaz creterea mugurilor laterali

Giberelinele: - produse n esuturile tinere ale rdcinii, smn - rol: - stimuleaz alungirea tulpinii prin stimularea diviziunii celulare - stimuleaz nflorirea ca rspuns la fotoperioad (zile mai lungi)

Mediu de baz Murashige and Skoog (MSO)Macronutrieni (mg/l) Azotat de amoniu (NH4NO3) 1.650mg/l Azotat de potasiu (KNO3) 1.900mg/l Micronutrieni (mg/l) Sulfat de mangan (MnSO4*4H2O) 22,3mg/l Sulfat de zinc (ZnSO4*7H2O) 8,6mg/l

Clorur de calciu (CaCl2*H2O) 440mg/l

Acid boric (H3BO3) 6,2mg/l

Sulfat de magneziu (MgSO4*7H2O) 370mg/l Iodur de potasiu (KI) 0,83mg/l Fosfat monopotasic (KH2PO4) 170mg/l Vitamine Molibdat de natriu (Na2MoO4*2H2O) 0,25mg/l Clorur de cobalt (CoCl2*6H2O) 0,025mg/l Sulfat de cupru (CuSO4*5H2O) 0,025mg/l Sulfat feros (FeSO4*7H2O) 27,8mg/l Na2EDTA*2H2O 37,2mg/l

Piridoxin*HCl (Vitamina B6) 0,5mg/lTiamin *HCl (Vitamina B1) 0,1mg/l Acid Nicotinic (Vitamina PP) 0,5mg/l Ali compui organici

Glicin (aminoacid) 2,0g/lMezoinozitol (alcool) 100mg/l Zaharoz 30g/l Agar 10g/l

Medii de cultur pentru subcultivarea explantelor caulinare sau foliare: MSO MSP1 = MSO + 6BAP (0,5 mg/l) + ANA (2,0 mg/l) MSD3 = MSO + 6BAP (1,0 mg/l) + AIA (2,0 mg/l) Mediu de cultur pentru nrdcinare: MS = MSO + ANA (1,0 mg/l) Medii de cultur folosite n culturile de calus Medii de cultur pentru iniiere i cretere: MS1 = MSO + BAP (0,1 - 0,25 mg/l) + zaharoz (30 g/l) MS1 = MSO + 2,4D (2,5 mg/l) + BAP (0,1 - 0,25 mg/l) + zaharoz (20 g/l) MS3 = MSO + BAP (1,0 - 3,0 mg/l) + 2,4D (2,5 mg/l) + zaharoz (40 g/l)

Soluii stoc = soluii concentrate, se adaug la mediul de culturSoluie stoc de macroelemente MS, concentraie 10x, pentru 1l mediu se adaug 100 ml KNO3 1l mediu.1900mg/l 10 l mediu = 10x.x x = 10*1900mg/l = 19000mg/l = 19g/l NH4NO3..16,5g CaCl2*2H2O4,4g MgSO4*7H2O..3,7g KH2PO.1,7g TOTAL...45,3g Se toarn 250 ml ap bidistilat ntr-un vas de 1l. Se cntresc i se adaug pe rnd n apa din vas substanele de mai sus. Se completeaz cu ap bidistilat pn la 1l. Se eticheteaz i dateaz. Se ine la frigider.

Prepararea mediilor de culturMediu de cultur MS cu 2,5 mg/l 2,4D 1. ntr-un vas Erlenmeyer de 1l turnai 1l ap (msurat cu cilindrul gradat) i nsemnai cu markerul nivelul apei din vas, apoi golii vasul. 2. Cltii vasul Erlenmeyer cu ap bidistilat. 3. Turnai n vasul cltit 700 ml ap bidistilat 4. Cu ajutorul pipetei msurai i adugai soluiile stoc de macroelemente, microelemente i vitamine: piridoxin, tiamin, acid nicotinic (10 ml la 1l sau vezi instruciunile de pe sticl) 5. Msurai cu ajutorul balanei analitice: -30 g zaharoz -2 mg glicin -100 mg mezoinozitol -9 mg Na2FeEDTA -2,5 mg 2,4D -6g agar 6. Adugai substanele cntrite pe rnd, mai puin agarul, i punei vasul pe plita cu agitator dup ce ai introdus magnetul (cltit n prealabil n ap distilat) n vas 7. Dup dizolvarea substanelor aducei pH-ul soluiei la 5,5 cu ajutorul NaOH 1N 8. Adugai agarul i aducei la semn cu ap bidistilat 9. nclzii soluia pe plita cu agitator pn la dizolvarea agarului, respectiv fierberea soluiei 10. Distribuii mediul de cultur n borcane curate 11. Punei mediul de cultur distribuit n borcane la autoclavat

Bibliografie:

http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Plant_Biotechno logy/Tissue_Culture_Protocols/Media_Preparation.html http://www.unizh.ch/botinst/Cyto_Website/schneitzLab/Materials/MSmedium. html Micropropagarea ndrumtor practic, Corina Ctan, Ed. Risoprint, ClujNapoca, 2005 Biotehnologii celulare, Corina Ctan , Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca, 2005