Ministerul Educaţiei al Republicii Moldova

Universitatea de Stat din Tiraspol

Facultatea Biologie şi Chimie

Catedra de Chimie

Teză de licenţă

INVESTIGAREA BIOCHIMICA A PROTEINELOR DIN SINGE

Teza a fost

efectuată de

Zaporojan Viorica

Conducător ştiinţific

Ion Arsene

Lector superior

CHIŞINĂU 2014

CUPRINS

ÎNTRODUCERE...................................................................................................3

I. IMPORTANŢA PROTEINELOR ÎN ORGANISMELE VII............................4

1.1. Funcţiile proteinelor....................................................................................5

1.2. α-aminoacizii..............................................................................................7

1.2.1. Clasificarea -aminoacizilor................................................................7

1.2.2. Proprietăţi fizico-chimice ale α-aminoacizilor...................................15

1.3. Clasificarea proteinelor.............................................................................18

1.3.1. Proteinele simple................................................................................19

1.3.2. Proteinele complexe...........................................................................19

1.4. Structura moleculelor proteice..................................................................28

1.4.1. Structura primară................................................................................28

1.4.2. Structura secundară............................................................................29

1.4.3. Structura terţiară.................................................................................30

1.4.4. Structura cuaternară............................................................................30

1.5. Reacţii pentru identificarea protidelor......................................................31

1.5.1. Obţinerea extractelor proteice............................................................31

1.5.2. Reacţii de precipitare..........................................................................32

1.5.3. Reacţii de culoare pentru identificarea proteinelor............................34

II. ANALIZE BIOCHIMICE - ANALIZA PROTEINELOR SANGUINE........40

2.1. Electroforeza serului (proteinograma)......................................................41

2.2. Probe hepatice...........................................................................................41

2.3. Fibrinogenul..............................................................................................42

2.4. Produşi de degradare ai proteinelor..........................................................43

2.5. Dozarea proteinei totale (metoda biuretului)............................................44

III. CONCLUZII.................................................................................................48

IV. BIBLIOGRAFIA..........................................................................................49

2

ÎNTRODUCERE

Proteinele sunt componente de baza ale tuturor celulelor vii, alături de

lipide, glucide, vitamine, enzime, apa şi săruri anorganice, formând împreună un

sistem complex în cadrul căruia se petrec o serie de reacţii chimice care asigura

reproducerea, dezvoltarea şi funcţionarea normala a fiinţelor vii. Sunt

componente ale structurilor celulare şi au funcţii biologice fundamentale:

enzimatice, hormonale , imunologice. Sunt proteine unele substanţe cu puternică

activitate biologică ale celulelor ca: enzimele, pigmenţii respiratori, mulţi

hormoni şi anticorpii. Substanţa contractilă din fibrele musculare, din cilii şi din

flagelele organismelor inferioare, care posedă proprietatea de a transforma

energia chimică în energie mecanică, este de asemenea o proteina. Ele intra în

structura tuturor celulelor, şi ajuta la creşterea şi refacerea celulelor. Proteinele

sunt principalii constituenţi ai corpului animalelor, îndeplinind o mare varietate

de funcţii. S-a demonstrat ca proteinele constituie partea cea mai însemnată din

substanţa uscata a celulelor. În corpul omenesc , 15 % din greutate se datorează

proteinelor. Majoritatea proteinelor din organismul omului provin din alimente

bogate în proteine, fie de origine animala (carne, lapte, brânza, oua), fie de

origine vegetala (fasole, mazăre, soia, linte etc.). Proteinele sunt compuşii de

bază din organismele vii care posedă un înalt grad de organizare structurală şi

care la hidroliză formează aminoacizi, care sunt legaţi prin legături peptidice.

Scopul principal a acestei lucrări a fost investigarea biochimica a

proteinei din sânge.

Obiectivele principale a cestei lucrări de licenţă au fost:

- de a ne familiariza cu rolul şi importanţa proteinelor pentru organismele

vii;

- de a studia principalele reacţii calitative şi cantitative a proteinelor;

- de a însuşii metoda de investigare a proteinei totale din serul sanguin.

3

I. IMPORTANŢA PROTEINELOR ÎN ORGANISMELE VII

Proteina este o substanţă organică complexă care constituie unul din

principalii componenţi ai tuturor organismelor vii. Practic, oamenii de ştiinţă au

ajuns la concluzia că nu există viaţă fără proteină, ea fiind prezentă în tot ce ne

înconjoară într-o proporţie mai mică sau mai mare.

În corpul uman proteina există în fiecare celulă şi este considerată a fi

coloana vertebrală a celulei, purtător al vieţii.

Proteinele sunt de mai multe tipuri şi joacă roluri importante în buna

funcţionare a organismului nostru: enzimele au rol de catalizator în reacţiile

chimice şi biochimice ale celulelor vii, hormonii  reglementează diverse procese

din organisme, imunoglobulinele au rol protector, hemoglobina şi mioglobina au

rolul de transportatori a oxigenului, albumina transportă acizii graşi în sistemul

circulator,  colagenul, elastina şi alte proteine structurale au rolul de a menţine

structurile altor componente biologice, actina şi miozina sunt responsabile de

mişcările musculare, unele proteine au rol de receptori, altele au rol în

dezvoltarea şi coordonarea activităţii celulare, un rol important joacă şi

proteinele cu funcţia de stocare de a forma rezerve de aminoacizi.

Astfel, nu există nici un dubiu că organismul uman are nevoie de proteine

zilnic pentru a funcţiona la cote maxime.

Alimentaţia noastră se compune din trei principii nutritive fundamentale:

proteine, zaharuri şi grăsimi. De ultimele două ne putem lipsi, dar organismul

nostru nu poate funcţiona adecvat o perioadă prea lungă fără cantitatea zilnică

necesară. Proteinele alimentare, reieşind din valoarea lor biochimica, se împart

în 3 categorii: I - proteinele din ou, carne, lapte, peste. Ele conţin toţi

aminoacizii esenţiali în proporţii optime pentru sinteza proteinelor organismului,

menţin echilibrul proteic în organism; II - proteinele din legume uscate, cereale.

Acestea conţin toţi aminoacizii esenţiali, dar nu în proporţii suficiente

pentru sinteza proteinelor omului; III - gelatina din oase, tendoane, cartilagii,

zeina din porumb. în structura proteinelor porumbului lipsesc mai mulţi

4

aminoacizi, şi cei prezentaţi sunt în raporturi dezechilibrate şi au valoarea

biologica scăzută. Valoarea lor biologica poate fi mărita prin asocierea cu

proteine de calitate superioara. De exemplu: mămăliga cu lapte sau brânză.

Lipsa proteinelor în alimentaţie duce la stări de denutriţie cronica, diferite

boli (hepatoza, pelagra s.a.), istovirea celulelor nervoase, reţinerea creşterii la

copii, micşorarea sintezei hormonilor suprarenalelor, hipofizei, tiroidei,

pancreasului, glandelor sexuale, micşorarea masei corpului, anemie, leucopenie,

polihipovitaminoza, dereglări ale metabolismului mineral (osteoporoza); pielea

devine uscata, unghiile - fragile, cade parul.

Fiecare persoană  în funcţie de parametrii pe care îi are îşi poate calcula

necesarul proteic zilnic. În cazul femeilor este necesar 1 gram de proteină per

kilogram, în cazul femeilor sportive 1,5 grame per kilogram. În cazul bărbaţilor

aceştia au nevoie de 1,5 grame de proteină zilnic per kilogram, iar în cazul

bărbaţilor sportivi de cel puţin 2 grame de proteină per kilogram.

De exemplu, o femeie care cântăreşte 60 de kilograme are nevoie de minim 60

de grame de proteină zilnic.

1.1. Funcţiile proteinelor

În funcţie de rolul biologic principal pe care îl îndeplinesc, se disting

următoarele tipuri de proteine:

- Proteine structurale. Acestea sunt reprezentate de proteinele ce joaca rol

plastic, adică acele proteine ce intra în structura membranelor biologice, a

ţesuturilor şi organelor. Proteinele structurale cele mai bine studiate sunt:

colagenul întâlnit în ţesutul conjunctiv din cartilaje, tendoane, piele, oase etc.,

elastina ce intra în structura ţesutului conjunctiv elastic din ligamente, fibroina

din mătasea produsa de Bombix mori, sclerotina întâlnita în exoscheletul

insectelor, keratina ce se găseşte în cantităţi mari în dermă, păr, pene etc.,

proteinele membranare ce intra în structura tuturor membranelor biologice şi

altele.

5

- Proteinele de rezervă au rolul principal de a constitui principala rezervă

de aminoacizi a organismelor vii. Din această grupă fac parte cazeina care este

componenta proteică majoră a laptelui, gliadina din cariopsele cerealelor, zeina

ce reprezintă principala proteină de rezervă din boabele de porumb, ovalbumina

şi lactalbumina din oua şi respectiv din lapte, feritina care facilitează acumularea

ionilor de fier în splină şi altele.

- Proteinele contractile au un rol important pentru mişcarea organismelor

vii fiind implicate în contracţia muşchilor, cililor, flagelilor etc. Cele mai bine

studiate proteine contractile sunt actina şi miozina implicate în contracţia

miofibrilelor şi dineina care asigură mişcarea cililor şi flagelilor la nevertebrate.

- Proteinele de transport sunt proteine cu o structură deseori complexă ce

îndeplinesc un important rol în transportul diferiţilor metaboliţi în organism.

Cele mai bine studiate proteine de transport sunt: hemoglobina care asigură

transportul oxigenului şi dioxidului de carbon, mioglobina cu rol în transportul

oxigenului la nivel muscular, albuminele serice care realizează transportul

acizilor graşi în circulaţia sanguina, -lipoproteinele serice care asigura

transportul lipidelor în sânge etc. Tot din aceasta categorie fac parte şi

transportorii membranari care realizează transportul activ, contra gradientului de

concentraţie, al diferiţilor metaboliţi prin membranele biologice.

- Proteinele cu rol catalitic şi hormonal reprezintă o grupa extrem de

importanta de proteine funcţionale. Din această grupă fac parte enzimele (care

sunt toate, fără nici o excepţie, proteine), precum şi unii hormoni (hormonii

reglatori ai hipotalamusului, hormonii hipofizei, cei pancreatici, hormonii

paratiroidieni, hormonii timusului etc.).

- Proteine cu rol de protecţie. Acestea sunt proteine implicate în diferite

procese fiziologice de protecţie şi apărare a organismului faţă de anumiţi factori

externi. Cele mai bine studiate sunt trombina (o proteină ce participă la procesul

coagulării sanguine), fibrinogenul (care este precursorul fibrinei, proteina

implicată, de asemenea, în procesul coagulării sanguine), imunoglobulinele sau

6

anticorpii (proteine capabile să formeze complecşi anticorp - antigen cu

proteinele străine organismului respectiv şi altele.

1.2. α-aminoacizii

Aminoacizii sunt derivaţi ai acizilor carboxilici în care atomii de hidrogen

sunt substituiţi cu grupa amino. Aminoacizii reprezintă unitatea structurală de

masă a proteinelor şi peptidelor. Moleculele lor sunt formate din resturi de -

aminoacizi:

Aminoacizii se denumesc folosind cuvântul „acid“, urmat de „amino“ şi

numele acidului corespunzător. Prin prefixele „di“, „tri“ etc., se arată numărul

de grupe amino şi carboxil, iar poziţia relativă a două grupe funcţionale se

precizează cu literele greceşti „α“, „β“, „γ“, „δ“, „ε“, în care acidul este α dacă

grupările amino şi carboxil se leagă de un acelaşi carbon, β dacă grupările

amino şi carboxil se leagă la atomi de carbon alăturaţi, iar, pe măsură ce creşte

distanţa, se vor numi γ, δ, ε. În cazul compuşilor aromatici, se folosesc prefixele

„orto“, „meta“, „para“.

acid α amino-propanoic acid β amino-propanoic

1.2.1. Clasificarea -aminoacizilor

1. În funcţie de natura radicalului:

a) aminoacizi alifatici;

b) aminoacizi ciclici.

7

2. În funcţia de reacţie a lor:

a) aminoacizi neutri;

b) aminoacizi bazici;

c) aminoacizi acizi.

Aminoacizi neutri-conţin o grupă amino şi una carboxil.

3. Cea mai raţională clasificare este aceea ce are la bază polaritatea

radicalilor pH=7. Radicalii aminoacizilor se împarte în 4 categorii:

a) hidrofobi (nepolari);

b) aminoacizi cu radicali polari neîncărcaţi;

c) aminoacizi cu radicali polari încărcaţi pozitiv, bazici;

d) aminoacizi cu radicali polari încărcaţi negativ, acizi.

4. În funcţie de importanţa biologică:

a) neesenţiali;

b) esenţiali.

În organismul animalelor şi omului se sintetizează aproximativ jumătate

din aminoacizii necesari sintezei proteinelor. Aceştia se numesc aminoacizi

neesenţiali sau banali (glicina, alanina, serina, cisteina, tirozina, acidul aspartic,

acidul glutamic, prolina). Ceilalţi aminoacizi nu pot fi sintetizaţi de aceste

organisme. Ei trebuiesc sa pătrundă în organism din hrana şi de aceea se numesc

aminoacizi esenţiali (indispensabili): arginina, fenilalanina,histidina, izoleucina,

leucina, lizina, metionina, treonina, triptofan, valina.

Din cei 20 de aminoacizi (Tabelul 1) cunoscuţi 8 sunt consideraţi

esenţiali, întrucât nu pot fi sintetizaţi în organismul omului şi trebuie aduşi zilnic

cu alimentele. Aceştia sunt valina, lizina, leucina, izoleucina, metionina,

triptofanul, treonina, fenilalanina. Pentru copiii sub 1 an histidina este aminoacid

esential. Ceilalţi au fost numiţi neesenţiali întrucât pot fi sintetizaţi în organism

din alte substanţe. Pentru sinteza proteinelor organismului este nevoie de

aminoacizi esenţiali şi neesenţiali în anumite proporţii.

Aminoacizii esenţiali îndeplinesc funcţii diferite în organism.

8

Valina, insuficienţa ei în raţia alimentară provoacă scăderea consumului

de hrană, dereglări de coordonare a mişcărilor, hipertensiune şi moartea

şobolanilor supuşi experienţei.

Lizina intră în componenţa triptofanului şi metioninei. Insuficienţa de

lizină în raţia alimentară are drept consecinţă dereglarea circulaţiei sanguine,

micşorarea numărului de eritrocite în sânge şi conţinutului de hemoglobină,

provoacă istovirea muşchilor, dereglări în calcificarea oaselor, diverse

modificări patologice în ficat şi plămâni. Insuficienţa lizinei la oameni provoacă

cefalee, vertijuri, greaţă, vomă, anemie, leucopenie. Includerea lizinei în raţia

alimentară face să sporească numărul de reticulocite în măduva oaselor. Sunt

sărace în lizină cerealele. Sursele principale de lizină le constituie brânza de

vaci, carnea, pestele.

Leucina contribuie la normalizarea bilanţului de azot, a metabolismului

proteic şi glucidic. În insuficienţa de leucină la animale se reţine creşterea, se

micşorează masa corpului, apar modificări în ficat, în glanda tiroidă.

Izoleucina intră în componenţa proteinelor organismului. Lipsa

izoleucinei în raţia alimentară provoacă echilibru azotat negativ.

Metionina este donatorul principal de grupe metilice labile, folosite la

sinteza colinei (substanţa cu însuşiri biologice active, cu acţiune lipotropă).

Metionina normalizează metabolismul lipidelor şi al fosfolipidelor în ficat şi se

recomandă la profilaxia şi tratarea aterosclerozei.

Acidul folic stimulează eliminarea grupelor metilice ale metioninei,

asigură sinteza colinei în organism. Metionina este necesară la funcţionarea

suprarenalelor şi la sinteza adrenalinei. Sursa principală de metionină este

brânza de vaci.

Treonina. în lipsa ei la animale se reţine creşterea, se micşorează masa

corpului, provocând chiar moartea lor.

Triptofanul participa la sinteza albuminei şi globulinei, este necesar la

creşterea animalelor şi menţinerea echilibrului azotat, la sinteza proteinelor

9

serice şi a hemoglobinei, a acidului nicotinic şi joacă un rol important în

profilaxia pelagrei.

Surse importante de triptofan sunt carnea, pestele, brânza de vaci, ouăle.

Sunt bogate în triptofan soia, fasolea, mazărea. O cantitate relativ mica de

triptofan conţine proteina porumbului. Din această cauză raţia alimentară cu

utilizarea preponderentă a porumbului poate provoca pelagra.

Fenilalanina participă la normalizarea funcţiei glandei tiroide şi a

suprarenalelor. Din fenilalanină se sintetizează tirozina care contribuie la

formarea adrenalinei.

Histidina participă la sinteza hemoglobinei. Decarboxilarea histidinei

contribuie la formarea histaminei, care dilată vasele, măreşte permeabilitatea

pereţilor lor. Aminoacizii neesenţiali îndeplinesc funcţii diferite în organism.

Acidul glutamic colectează amoniacul în exces şi îl transforma în

glutamina, stimulând capacitatea de concentrare şi memorare;reduce senzaţia de

oboseală; stabilizează controlul asupra poftei de dulce;poate fi precursor pentru

prolina şi arginina.

Alanina întăreşte sistemul imunitar; ajuta la metabolizarea zaharurilor şi a

acizilor organici şi furnizează energie ţesuturilor muscular şi nervos;ajuta la

formarea de anticorpi, mărind capacitatea sistemului imunitar;reduce riscul

formarii de pietre la rinichi;este adjuvant în tratamentul hipoglicemiei.

Arginina este necesara pentru funcţionarea normala a glandei pituitare

(hipofiza); prin combinare cu glicina formează creatina; îmbunătăţeşte răspunsul

imunitar al organismului la acţiunea bacteriilor, virusurilor şi a celulelor

tumorale;ajuta la detoxifierea şi regenerarea ficatului; împreuna cu omitina şi

fenilanina ajuta în procesul de producţie a hormonilor de creştere conducând

astfel la creştere musculara şi repararea ţesuturilor; contribuie la eliminarea

toxinelor;intervine în procesul de spermatogeneza, mărind cantitatea de

sperma;este necesar în sinteza de proteine, colagen, în creştere şi dezvoltare, în

10

mărirea masei musculare; ajuta în procesul de slăbire; ajută la eliminarea din

organism a amoniacului rezultat în urma dezintegrării de proteine.

Asparagina împreuna cu acidul aspartic, ajuta la eliminarea excesului de

amoniac din organism

Cisteina îmbunătăţeşte starea de sănătate a unghiilor, pielii şi a

parului;ajuta la prevenirea cheliei;contribuie la formarea taurinei; atenuează

psoriazisul.

Glicina are rol în sinteza creatinei, din acest motiv fiind folosita în

tratamentul distrofiilor musculare progresive; este folosita în tratamentul

hipoglicemiei (deoarece stimulează formarea glucagonei care mobilizează

glicogenul, eliberat apoi în sânge sub forma de glucoza); ajută la reducerea

hiperacidităţii gastrice; este adjuvânt în tratamentul disfuncţiilor hipofizare; are

efect în anumite tipuri de acidemie (pH scăzut al sângelui), în mod special în

cele cauzate de dezechilibrul leucinei - dezechilibru manifestat prin mirosul

puternic neplăcut al sudorii şi al respiraţiei.

Glutamina este vitala pentru structura şi integritatea musculara,

reprezentând 60% din ţesutul muşchilor scheletici; este sursa de energie pentru

celulele digestive şi cele imunitare; daca nu este suficienta glutamina în sânge

pentru necesităţile lor, corpul va distruge ţesutul muscular pentru a obţine

cantitatea necesara pentru aprovizionarea acestor celule.

Serina contribuie la atenuarea durerilor;contribuie la realizarea de

depozite de glucoza în ficat şi muşchi; promovează producţia de anticorpi,

întărind sistemul imunitar; intervine în procesul de sintetizare a acizilor graşi ce

înconjoară fibrele nervoase (cu rol izolator); poate acţiona ca un antipsihotic

natural.

Taurina stabilizeaza excitabilitatea membranelor în procesul de control al

crizelor epileptice; controlează schimbările biochimice răspunzătoare pentru

procesul de îmbătrânire; intervine în procesul de eliminare a radicalilor liberi.

11

Tirosina ajuta la transmiterea impulsurilor nervoase şi îmbunătăţeşte

memoria; ajută la atenuarea stresului fiind un adjuvant împotriva depresiei;

stimulează apetitul sexual; menţine starea de alerta mentala, îmbunătăţind starea

de spirit;ajuta la buna funcţionare a glandelor suprarenala, tiroida şi

pituitara,poate reduce pofta de mâncare.

Tabelul 1. 20 α-amino-acizi

Nr

.Denumirea Prescurtat Formula

I. -amino-acizi monoaminomonocarboxilici

1. Glicină Gli

2. Alanină Ala

3. Valina Val

4. Leucina Leu

5. Izoleucina Ile

II. -amino-acizi monoaminodicarboxilici

12

6. Acid aspargic Asp

7. Asparagina Asn

8. Acid glutamic Glu

9. Glutamina Gln

III. -amino-acizi diaminomonocarboxilici

10. Lizina Liz

11. Arginină Arg

IV. -amino-acizi hidroxilici

13

12. Serină Ser

13. Treonină Tre

V. Tio--amino-acizi

14. Ciseină Cis

15. Metionină Met

VI. -amino-acizi aromatici

16. Fenilanalină Fen

17. Tirozină Tir

VII. -amino-acizi heterociclici

14

18. Histidină His

19. Triptofan Tri

20. Prolină Pro

1.2.2. Proprietăţi fizico-chimice ale α-aminoacizilor

Proprietăţile fizice –Toţi aminoacizii sunt substanţe solide, incolore,

cristalizate. Forma cristalelor este caracteristică pentru fiecare aminoacid. Se

topesc la temperaturi ridicate (peste 200 C), cu descompunere; nu pot fi distilate

nici chiar în vid. Punctul de topire al cristalelor nu constituie un criteriu de

diferenţiere între ei. Aminoacizii sunt, în general, solubili în apă, însă gradul de

solubilitate este diferit de la un aminoacid la altul. Solubilitatea este determinată

de caracterul mai mult sau mai puţin polar al catenei şi de pH, fiind minimă la

punctul izoelectric. Sunt în general insolubili în solvenţi organici, cu excepţia

prolinei, care este relativ solubilă în etanol. Solubilitatea aminoacizilor ca şi cea

a proteinelor, este influenţată de prezenţa sărurilor.

Proprietăţile acido-bazice – în soluţii apoase aminoacizii neutri se află

sub formă de ioni bipolari:

15

Aminoacizii fiind dizolvaţi în apă acţionează şi ca acid (donor de protoni)

şi ca bază (acceptori de protoni):

Aminoacizii manifestă proprietăţi amfotere şi sunt aminoacizi amfoliţi. În

funcţie de valoarea pH-ului aminoacizii posedă sarcina pozitivă şi negativă.

Pentru fixarea aminoacizilor există o anumită concentraţii a ionilor de hidrogen,

pH-ul caracteristic când se găseşte în soluţie sub formă de moleculă neutră fără

(sarcină electrică) aceasta se numeşte pH izoelectric.

aminoacetat de sodiu

hidroclorura acidului amino propionic

Aminoacizii formează săruri complexe cu ionii metalelor (d), în deosebi

cu ionul de cupru:

16

Aminoacizii formează esteri:

Esterii aminoacizilor se distilează fără a se descompune. Această

proprietate se utilizează la separarea amestecurilor complexe de aminoacizi.

Decarboxilarea sintetică a aminoacizilor se efectuează în condiţiile de

laborator în rezultat se formează amine. În organismele vii biosinteza decurge în

prezenţa enzimelor specifice, bacterii intestinale. Aminele care se formează se

numesc biogene şi manifestă activitate biologică. Unele sunt toxice altele au

acţiuni farmacodinamică sau sunt predecesori ai hormonilor, a enzimelor,

vitaminelor.

Exemplu: Lizina (la descompunerea cadavrelor):

cadoverină

putrescină

17

Reacţiile specifice ale aminoacizilor:

1. Reacţia cu ninhidrina:

2. Eliminarea azotului aminic:

3. Aminoacizii în prezenţa glucidelor la încălzire ne dă o culoare

brună caracteristică:

Aminoacizii se folosesc în medicină pentru prepararea unor medicamente

şi pentru alimentaţia artificială în anumite îmbolnăviri ale sistemului digestiv, în

caz de intervenţii chirurgicale etc. Se folosesc în alimentaţie, pentru

suplimentarea unor produse deficitare în aminoacizi esenţiali, pentru

accentuarea aromelor, pentru prepararea supelor concentrate, a alimentelor

pentru copii, alimentaţia dietetică pentru cosmonauţi, ca antioxidanţi la

prepararea conservelor şi băuturilor etc .

Cantităţi mari de aminoacizi se folosesc în zootehnie, pentru obţinerea

concentratelor furajere şi pentru a mări digestibilitatea furajelor bogate în hidraţi

de carbon şi sărace în proteine complete. Se folosesc, de asemenea, pentru

prepararea unor medii bacteriologice necesare depistării unor boli.

1.3. Clasificarea proteinelor

În funcţie de structura lor chimica, proteinele se împart în doua mari

grupe: proteine simple şi proteine complexe.

1.3.1. Proteinele simple

Acestea sunt proteine ale căror molecule sunt formate numai din catene

polipeptidice. Acest lucru a fost demonstrat prin faptul ca prin hidroliza

18

completa, holoproteinele pun în libertate numai aminoacizi. Din aceasta grupa

fac parte o serie de proteine ce îndeplinesc importante funcţii biochimice şi

fiziologice α, β şi γ-globulinele serice, anticorpii, histonele, protaminele,

fibrinogenul, miozina, actina, colagenul, fibroina, keratinele etc.

Proteinele simple şi peptidele sunt formate din lanţuri de resturi de

aminoacizi legaţi prin legături peptidice.

În molecula proteică există legături covalente-trainice (legătura peptidică

şi disulfidică) şi necovalente-slabe (legătura de hidrogen, interacţiunea

electrostatică şi interacţiunea radicalilor hidrofobi-de respingere).

Denumirile peptidelor sunt determinate de denumirea aminoacizilor

corespunzători fiind numerotaţi succesiv, începând de la restul N-terminal prin

schimbarea sufixului -ină în –il.

1.3.2. Proteinele complexe

Proteinele complexe (numite şi conjugate, sau heteroproteine) conţin în

molecula lor, pe lângă componenta proteica şi o componenta de alta natura

numita grupare prostetică. La rândul lor, heteroproteinele se împart în mai multe

grupe în funcţie de natura chimica a grupărilor prostetice.

La baza clasificării proteinelor stau de obicei doua criterii: forma

particulelor (globulare şi fibrilare) şi constituţia chimică. Deoarece primul

criteriu nu este întotdeauna suficient pentru o diferenţiere completa a

proteinelor, este utilizat frecvent criteriul structurii chimice.

19

După solubilitate, caracterul chimic şi proprietăţile biologice, proteinele

globulare se clasifica:

Albumine – caracter foarte slab acid origine vegetală şi animală

Globuline – caracter slab acid origine vegetală şi animală

Prolamine – caracter acid origine vegetală

Gluteline - caracter acid origine vegetală

Histone - caracter slab bazic origine animală

Protamine - caracter foarte bazic origine animală

Proteinoide (colagene şi keratine) origine animala

Albumine. Albuminele sunt proteine globulare care se găsesc în toate

ţesuturile animale şi vegetale. Sunt substanţe cu caracter slab acid sau neutru,

solubile în apă şi în soluţii diluate de electroliţi. Cu apa formează soluţii

coloidale, din care albuminele precipita sub acţiunea unor soluţii concentrate de

sulfat de amoniu, clorura de sodiu, sulfat de magneziu, etc. , iar prin încălzire

(60 – 70oC) coagulează.

Spuma albă care apare la fierberea legumelor şi fructelor sau care se

formează la suprafaţa laptelui fiert sunt albumine coagulate datorită temperaturii

ridicate.

Reprezentantul tipic al albuminelor este proteina din albuşul de ou

denumita ovoalbumina; în plasma sângelui se găseşte serumalbumina; în lapte –

lactoalbumina; în ţesutul muscular – mioalbumina.

O serie de albumine sunt de origine vegetala; ele se găsesc în toate

organele plantelor, dar în cantitate mai mare fiind în seminţe. Reprezentanţii

albuminelor vegetale sunt leucozina care se găseşte în seminţele cerealelor

(grâu, orz, ovăz, etc.), legumelina din seminţele leguminoaselor (mazăre, linte,

soia, etc.), ricina din seminţele de ricin, etc.

Unele albumine vegetale ca ricina, falina din Amanitha phalloides, crotina

din seminţele de croton, etc. sunt substanţe toxice şi poarta numele generic de

toxalbumine. Ele au proprietatea de a aglutina globulele roşii din sânge. Ricina

20

introdusă în sângele unui iepure, într-o concentraţie foarte mică, de 0,3 – 10-3

miligrame, produce moartea animalului. Albuminele toxice se comporta ca

pseudoanticorpi.

Cercetările mai recente arata ca anticorpii se pot forma şi în plante în

urma infectării acestora cu virusuri fitopatogene.

Albuminele se găsesc în plante în stare libera, sau în asociere cu

globulinele şi cu poliglucidele.

Globuline. Globulinele sunt cele mai răspândite proteine globulare din

organismele vegetale şi animale. Sunt insolubile în apa, dar se dizolvă cu

uşurinţă în soluţii diluate de săruri (NaCl, Na2SO4, etc.). Pentru separarea lor din

soluţia salină în care s-au dizolvat, se adaugă sulfat de amoniu (concentraţie

50%) sau se adaugă multă apă sau se dializează folosind o membrană

semipermeabilă.

Globulinele sunt cele mai răspândite proteine din organismul animal.

Împreună cu albuminele formează proteinele protoplasmei celulei. Astfel în

plasma sanguină se găsesc serumglobulina şi fibrinogenul; în lapte –

lactoglubulina; în ou – ovoglobulina; în muşchi – proteina contractilă care se

numeşte miozina. În stările infecţioase se înregistrează o creştere a cantităţii de

globuline din sânge ca urmare a formarii compuşilor de apărare (răspunsul

imun) – anticorpi – în compoziţia cărora întra imunoglobulina (Ig).

Se cunosc numeroase globuline vegetale: faseolina în seminţele de fasole

alba; legumina în mazăre, linte; glicina în soia; vicilina în bob; edestina în

cânepa; amandina în migdale; conglutina în lupin; excelsina în nuca de cocos.

Prolamine. Prolaminele sunt proteine de origine vegetală, care s-au

identificat numai în cereale. Existenţa prolaminelor numai în cereale prezintă o

trăsătura caracteristica pentru acest grup de plante.

Prolaminele sunt insolubile în apa şi soluţii de săruri, însa sunt solubile în

alcool etilic 70%. Datorita acestei solubilităţi, prolaminele se pot separa de

celelalte proteine. Se mai pot dizolva în alcool metilic, alcool propilic şi glicerol.

21

Prolaminele nu coagulează sub acţiunea căldurii. Ele au o valoare

nutritivă slabă, deoarece conţin în cantităţi extrem de mici aminoacizi esenţiali:

lizina şi triptofanul.

Principalele prolamine sunt: gliadina din grâu şi secara; zeina din porumb;

hordeina din orz, avenina din ovăz.

Gluteline. Glutelinele sunt ca şi gliadinele proteine de origine vegetala.

Ca şi gliadinele, glutelinele sunt insolubile în apa şi în soluţii saline, dar sunt

solubile în soluţii apoase alcaline sau acide. Spre deosebire de gliadine,

glutelinele nu sunt solubile în alcool apos. Glutelinele apar în frunzele plantelor

şi însoţesc mai ales gliadinele în seminţele cerealelor, unde se găsesc în

proporţie diferita. După natura cerealei, glutelinele iau denumiri diferite şi

anume glutenina în cazul seminţelor de grâu, secara şi orz, orizeina în cazul

orezului.

Glutelinele au o valoare alimentara mai mare decât prolaminele deoarece

conţin într-o proporţie mai mare diferiţi aminoacizi esenţiali. În glutenina

porumbului lizina se afla în proporţie de aproximativ 3%, în timp ce în zeina

lipseşte complet.

Amestecul format din glutenină şi gliadină, care se izolează din faina de

grâu poartă denumirea de gluten. Proteinele din gluten, prin punţile lor - S – S - ,

conferă făinii de grâu proprietatea de a da cu apa un aluat elastic care reţine într-

un mod caracteristic bioxidul de carbon format în timpul dospirii (in timpul

fermentării alcoolice parţiale) şi în timpul coacerii, dând pâinii o structură

poroasă şi un volum corespunzător.

Spunem din această cauză că faina grâului are însuşiri de panificaţie.

Glutenul conţine în medie două treimi apă şi o treime substanţă uscată.

Glutenul din faina de grâu conţine aproximativ 40 – 50% gliadina, 30 – 40%

glutelina, 6 – 10% globulina, 3 – 5% albumina, 2 – 3% glucide solubile, 6 – 7%

amidon, 1 – 2% celuloza, 2 – 3% lipide, 1 – 1,5% cenuşa.

22

Glutenul deci “forţa” unui aluat, permite cu alte cuvinte ca aluatul unei

făini să se umfle şi să crească, să-şi mărească volumul în timpul dospirii şi să

devină poros, fără să se rupă. Aceasta este posibil datorită faptului ca glutenul

are însuşiri de elasticitate. Elasticitatea este o proprietate a materiei, determinată

de 2 factori şi anume de extensibilitate, adică de proprietatea de a se întinde, şi

de tenacitate, adică de rezistenţa ce se opune extensiei. După raportul diferit în

care se găsesc aceşti doi factori, elasticitatea glutenului ia valori diferite: spunem

din aceasta cauza ca glutenul este de diferite calităţi. De proporţia şi de calitatea

glutenului depinde calitatea unei faini de grâu cu însuşirile ei de panificaţie,

adică însuşirile ei de a da naştere unei pâini cât mai poroase şi mai digestibile.

Numai faina grâului are însuşiri bune de panificaţie, numai ea poate forma

gluten. Faina de porumb şi faina de orez nu pot forma gluten, nu au deci însuşiri

de panificaţie; faina de orz şi de secara au calităţi slabe de panificaţie.

Histone. Histonele formează o familie de proteine animale, care în

organism nu se găsesc în stare libera, ci conjugate mai ales ca cromoproteide şi

nucleoproteide. Astfel, ele se găsesc mai ales în nucleele celulelor, în sperma, în

celulele timusului, în nucleul globulelor roşii ale păsărilor, în sânge, etc.

Protamine. Protaminele sunt de origine animală, nu coagulează prin

încălzire, fiind considerate cele mai simple proteine. Au o solubilitate mare în

apă, datorită greutăţii moleculare mici (2000 – 3000).

Protaminele spre deosebire de histone nu sunt degradate hidrolitic de

pepsina şi de alte enzime proteolitice.

Protaminele au fost izolate din nucleul celulelor spermale (din nucleul

spermatozoizilor), din peste , unde se găsesc combinate cu acizii nucleici,

formând astfel nucleoproteide. Protaminele nu au fost găsite în organismele

vegetale.

Proteinoide (scleroproteine). Proteinoidele sunt proteine de tip fibrilar

care exercită în organismul animal un rol plastic, de susţinere, protecţie şi

23

rezistenţă mecanică. În general, ele întra în constituţia ţesuturilor conjunctive, de

susţinere şi epidermice.

Proprietăţile mecanice caracteristice ale scleroproteinelor se datoresc

formei fibrilare alungite a moleculelor, precum şi faptului că în organism unele

se află în stare solidă.

Particularitatea deosebită a acestor proteine o constituie totala lor

insolubilitate în apa, soluţii alcaline, acizi şi baze diluate şi nedigestibilitatea lor

sub acţiunea enzimelor din tractul digestiv. Au un conţinut mai mic în azot şi

unul mai mare în oxigen, conţin o cantitate mare de glicocol şi de cisteina. De

fapt, conţinutul ridicat de sulf este o caracteristică a proteinoidelor.

Dintre diferiţii reprezentanţi ai acestei grupe de proteine transformate,

trebuie menţionat colagenul, keratinele, elastinele:

- Keratinele sunt proteinele constituente ale epidermei, parului, penelor şi

formaţiunilor cornoase (unghii, copite, coarne). Îndeplinesc un rol de protecţie şi

sub acţiunea enzimelor proteolitice nu sunt hidrolizate.

- Elastinele participă la structura fibrelor elastice din artere şi tendoane,

manifestând proprietăţi elastice şi termoelastice. Elastinele prezintă analogii cu

colagenul; se deosebesc însa de acesta prin incapacitatea de a fi convertite în

gelatine.

Heteroproteide

Heteroproteidele sau proteinele conjugate sunt proteine cuplate cu diferite

substanţe ce formează grupările lor prostetice.

Deci, proteinele sunt apte de a lega o varietate de compuşi chimici cu

masa moleculară foarte diferită, formând ansambluri moleculare heterogene ca

structură. Proteinele conjugate reprezintă asocierea prin legături covalente şi

necovalente a unei componente proteice şi a unei componente neproteice, de

natura chimica diversa.

24

După natura grupării prostetice proteidele se clasifică în mai multe grupe:

glicoproteide, fosfoproteide, lipoproteide, cromoproteide, metalproteide,

nucleoproteide

Glicoproteide. Glicoproteidele formează o familie de proteide animale, a

căror grupare prostetică este o polizaharidă formată din monozaharide sau

derivaţi ai acestora.

Glicoproteidele au o larga răspândire în organismul animal, fiind

distribuite în diverse ţesuturi, în plasmă, în secreţia mucoaselor, în salivă; de

asemenea, se găsesc asociate cu unele enzime şi hormoni. După felul grupării

prostetice, glicoproteidele pot avea caracter acid sau neutru. Cele mai importante

glicoproteide cu caracter acid sunt mucinele, mucoidele şi condroidele.

Mucinele protejează mucoasele tractului intestinal de acţiunea nocivă a unor

compuşi chimici sau agenţi mecanici; mucidele intra în constituţia cartilagiilor,

oaselor (osteomucoide), a tendoanelor şi ligamentelor.

În sânge se găsesc glicoproteide neutre, care determina specificitatea

grupelor sanguine. Ele conţin glucozamina, galactozamina, galactoza şi fucoza.

Fosfoproteide. Fosfoproteidele sunt proteine vii cuplate cu acidul fosforic

(prin restul fosforil), pentru care motiv au un caracter acid foarte pronunţat. În

molecula de fosfoproteida, resturile de acid fosforic (-PO3H2) se leagă prin

legături esterice cu grupările hidroxilice ale oxiaminoacizilor care întra în

structura lanţului polipeptidic al proteinei.

Fosfoproteidele sunt substanţe insolubile în apă, solubile în alcalii diluate,

formând săruri, de unde precipită prin acidulare. Sub acţiunea alcaliilor diluate,

la cald, fosfoproteidele se hidrolizează uşor, eliminând gruparea fosforica.

Fosfoproteidele apar în cantitate mare în ouă (vitelinele) şi lapte (caseina)

sub formă de săruri de Ca sau K. Servesc pentru hrănirea animalelor tinere,

respectiv a embrionului.

Caseina are caracter acid şi se găseşte sub forma de sare de calciu solubilă

(în laptele de vacă) şi de sare de potasiu (în laptele de femeie). Ea nu coagulează

25

prin căldură; sub acţiunea acizilor precipită; precipită ireversibil şi sub acţiunea

enzimelor specifice numite renine sau chimizine (cheagul) şi pepsina, care sunt

prezente în sucul gastric al animalelor tinere.

Fenomenul brânzirii laptelui are la baza precipitarea caseinei

(caseogenului) din lapte cu ajutorul acizilor sau a enzimelor.

Lipoproteide. Lipoproteidele formează o grupă de proteide a căror

grupare prostetică aparţine unei substanţe din grupa lipidelor (lecitina, cefalina,

colesterol). Spre deosebire de lipide, lipoproteidele sunt solubile în apă şi

insolubile în solvenţi organici.

Lipoproteidele au o largă distribuţie, fiind componente structurale ale

celulelor, biomembranelor, mitocondriilor, reticulului endoplasmatic, nucleului,

tecilor de mielină a neuronilor, etc. Se găsesc în ţesutul nervos, plasma sângelui,

lapte, gălbenuş de ou.

Cromoproteide. Cromoproteidele dau prin hidroliză o proteină şi o

grupare prostetica colorată, din care cauză ele intră în grupa pigmenţilor naturali

(formează subgrupa Pigmenţi–proteide). Particularitatea deosebit de importantă

a cromoproteidelor o reprezintă activitatea lor biologică foarte mare. Ele joacă

un rol esenţial în procesele vitale, deoarece în general sunt biocatalizatori care

intensifică în organism unele procese biochimice importante, cum sunt

fotosinteza şi reacţiile de oxido–reducere.

Cel mai studiat reprezentant al cromoproteidelor este hemoglobina din

sângele animalelor vertebrate şi al omului, care este concentrata în eritrocite, şi

care fixează, transportă şi depune oxigenul atmosferic la nivelul ţesuturilor. Este

alcătuită dintr-o componentă proteica denumită globină şi una prostetica

colorata care este hemul.

Clorofila este un pigment verde, care se găseşte în cloroplaste. Clorofila

formează materia colorantă verde a frunzelor, asigurând activitatea fotosintetică

a plantelor, şi reprezintă în realitate un amestec de doi pigmenţi, clorofila A de

culoare verde–albăstruie şi clorofila B de culoare verde–galbenă.

26

Metaloproteide. Metaloproteidele sunt heteroproteide care au ca grupare

prostetica un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co, etc.), fixat prin legături complexe

direct de componenta proteica, fără existenţa unor anumite grupări speciale de

atomi.

Unele metaloproteide îndeplinesc în organism funcţia de proteine

transportoare de metal, cum este transferina plasmatică sau lactotransferina din

lapte care transportă fier şi ceruloplasmina din plasmă care transportă cupru.

Altele reprezintă rezerve de fier pentru organism, cum este cazul feritinei sau

hemosiderinei. La proteinele transportoare conţinutul de metal reprezintă sub

1%, la cele de depozit acest procent este mult mai mare (în feritină ajunge la

20%).

Nucleoproteide. Nucleoproteidele sunt heteroproteide complexe cu rol

esenţial în activitatea vitala a organismelor. Nucleoproteidele formează masa

principala a tuturor nucleelor celulare. Ele apar de asemenea şi în protoplasma şi

în diferitele lichide biologice şi constituie componenta principală a virusurilor

din plante (fitopatogene), care sunt constituite aproape numai din nucleoproteide

şi a virusurilor din animale care au o organizaţie superioara, precum şi a

bacteriofagilor (virusurile care ataca bacteriile).

Nucleoproteidele sunt substanţe solide, cu caracter slab acid, solubile în

apă şi în prezenţa alcaliilor diluate sau a carbonaţilor alcalini, de unde precipită

la acidulare cu acid acetic.

Nucleopriteidele au rol în procesele de diviziune celulară, în sinteza

proteinelor şi în transmiterea caracterelor ereditare.

Caracterele lor chimice şi fiziologice sunt imprimate mai ales de gruparea

prostetică, de acizii nucleici.

Acizii nucleici sunt substanţe cu structura macromoleculară complicată, cu rol în

stocarea şi transmiterea informaţiei genetice.

27

1.4. Structura moleculelor proteice

Structura proteinelor este complexa şi depinde atât de mărimea

macromoleculelor de polipeptide, de tipul şi secvenţa amino-acizilor, de

configuraţia amino-acizilor naturali, de conformaţia lanţurilor de polipeptide, de

legăturile de hidrogen intra - şi intermoleculare, de prezenta mai multor lanţuri

polipetidice ca şi de prezenta unor grupe prostetice din proteinele complexe.

Exista mai multe nivele de cunoaştere şi caracterizare a structurii: structura

primara, structura secundara, structura terţiara şi structura cuaternara.

1.4.1. Structura primară

Structura primară-prezintă lanţului polipeptidice liniar de aminoacizi

aranjaţi într-o anumită ordine şi legaţi între ei prin legături peptidice:

Structura primara se refera la tipul, numărul şi secvenţa amino-acizilor din

lanţurile polipeptidice din proteine. Pentru determinarea structurii primare se

parcurg următoarele etape:

- separarea proteinelor de grupele prostetice;

28

- separarea lanţurilor de polipetide prin scindarea legăturilor covalente

care pot sa existe între lanţuri (de exemplu legăturile disulfidice -S-S- care apar

între grupele –SH din resturile de cisteină);

- hidroliza parţiala şi totală a proteinelor pentru analiza compoziţiei

proteinei sau a fragmentelor rezultate prin hidroliza parţială;

- analiza secvenţiala a polipeptidelor prin analiza grupelor N- şi C-

terminale;

În final structura primara arata alcătuirea lanţurilor polipeptidice din

proteine şi legăturile covalente (punţile disulfidice) sau alte tipuri de legături

dintre lanţurile de polipeptide şi chiar şi legăturile posibile cu grupele

prostetice);

1.4.2. Structura secundară

Structura secundară-aranjarea spaţială a unor regiuni distincte ale

moleculei proteice, fără a ţine cont de interacţiunile radicalilor laterali de

aminoacizi. Ea se stabilizează prin punţi de hidrogen între grupele carboxil şi

iminice.

Structura secundara se refera la aşezarea spaţiala a macromoleculelor de

proteine sau a unor fragmente de polipeptide. Aşezarea spaţiala este determinată

atât de configuraţia S (L, după convenţia E. Fischer) cât şi de posibilitatea

formarii legăturilor de hidrogen între grupele C=O şi N-H din legătura peptidică

(N-H…..O=C). Astfel de legături se pot forma intramolecular atunci când catena

–Csp3-NH-CO-Csp3- nu este coplanara, sau intermolecular atunci când este

coplanara.

Structura secundara a fost determinata prin difracţie de raze X pe proteine

cristalizate de către L. Pauling care a studiat cele doua tipuri de proteine

fibroase naturale (β-cheratina şi α-cheratina). Au fost astfel identificate două

tipuri de structuri secundare care apar în toate tipurile de proteine:

Structura β sau structura pliată care apare în cazul β-cheratinei. În acest

caz lanţurile polipeptidice sunt liniare (unghiul diedru este de 0) şi legăturile de

29

hidrogen NH…OC sunt intermoleculare, între lanţurile liniare paralele.

Legăturile de hidrogen sunt liniare astfel încât doua lanţuri polipeptidice legate

prin legături de hidrogen sunt coplanare. Pe de alta parte între aceste planuri sunt

unghiuri diedre astfel încât structura în ansamblu este pliată.

Structura α sau elicea (spirală α). Este structura α-cheratinei şi a

proteinelor globulare, în care lanţul polipeptidic nu este coplanar, unghiul diedru

dintre legăturile Csp3-CO-NH şi HN-CO-C sp3 este diferit de 0 sau 180 (este de

obicei de 30) astfel încât atomii din catena sunt aranjaţi pe spiralele unei elice.

Datorita configuraţiei S (L) a amino-acizilor naturali elicea este dreaptă sau α

(în sensul acelor ceasornicului). Spirele elicei sunt stabilizate de legăturile de

hidrogen care se formează între grupele NH….OC. Într-o astfel de elice

legăturile de hidrogen sunt intramoleculare spre deosebire de legăturile

intermoleculare din structura β.

În cazul α-cheratinei şi a altor proteine fibroase aceste lanţuri de

polipeptide sub forma de elice a sunt paralele şi legate între ele şi prin legături

de hidrogen intermoleculare formând structuri împletite filiforme.

1.4.3. Structura terţiară

Structura terţiară - modul de împachetare a catenei polipeptidice în spaţiu

tridimensional. După modul de împachetare se împart globulare, fibrilare

(muşchii). În cazul proteinelor globulare care prezinta predominant structuri de

elice a, aceste elice devin încolăcite în structuri supramoleculare (superelice α)

care sunt definite ca structuri terţiare ale proteinelor globulare.

La stabilirea structurii terţiare participă legăturile:

1. covalente bisulfidice;

2. polare legătura de hidrogen;

3. ionice, electrostatice.

1.4.4. Structura cuaternară

Structura cuaternară-proteinele conjugate sunt formate din câteva lanţuri

polipeptidice (număr par 4, 6, 8) şi fiecare lanţ are structura sa primară,

30

secundară, terţiară şi sunt unite într-o structură cuaternară. Structurile cuaternare

caracterizează mai ales proteinele complexe formate din mai multe lanţuri

polipeptidice şi grupe prostetice. Astfel sunt cunoscute în prezent structurile

complete (inclusiv cele cuaternare) ale unor enzime, ale hemoglobinei,

citocromilor etc. Exemplu: hemoglobina, partea proteică din 4 lanţuri 2 şi 2 şi

se deosebesc după structura primară, secundară şi terţiară.

1.5. Reacţii pentru identificarea protidelor

Protidele sunt componente structurale şi funcţionale cele mai importante ale

organismelor vii.

Prezente în toate organismele animale şi vegetale, protidele îndeplinesc

multiple roluri: structural (constituent principal al protoplasmei şi nucleului

celular); fizico-chimic (regulator al echilibrului electrostatic acido-bazic);

catalitic (componenţi proteici ai biocatalizatorilor); energetic (furnizor de

energie).

În mod convenţional, în grupul protidelor sunt cuprinse toate substanţele

naturale care prin hidroliză totală pun în libertate aminoacizi.

1.5.1. Obţinerea extractelor proteice

- de origine vegetală: 50 g făină de grâu se amestecă cu 200 ml apă şi se

lasă să stea 30-40 minute, agitând din când în când. Se filtrează. Primele porţiuni

tulburi se retoarnă pe filtru;

- de origine animală: la 100 ml lapte se adaugă un volum egal de apă şi

apoi, sub agitare, 0,5-0,6 ml acid acetic glacial, până la formarea unui precipitat

floconos. După 5-10 minute amestecul se filtrează printr-o pânză umezită în

prealabil. Primele cantităţi de filtrat, tulburi, se refulează. Soluţia limpede puţin

gălbuie, conţine albumină şi o parte din globulinele din lapte. Reziduul de pe

filtru este format din cazeină amestecată cu grăsimi.

31

- Laptelui proaspăt i se adaugă un volum egal de soluţie saturată de sulfat

de amoniu (NH4)2SO4. Precipită cazeina şi globulinele, antrenând grăsimi.

Suspensia se filtrează pe hârtie de filtru.

- Albuşul unui ou de găină se agită bine cu 100-150 ml apă distilată.

Suspensia opalescentă astfel obţinută se filtrează pe o pânză udată cu apă, din

care s-a îndepărtat apretul, prin spălare.

- O soluţie concentrată de proteine se obţine dintr-un albuş de ou la care

se adaugă 5-6 g NaCl. Se agită puţin şi se pune într-un vas de 500 ml agitându-

se încă puţin. O soluţie diluată se obţine din această soluţie la care se adaugă un

volum de 2-3 ori apă distilată.

1.5.2. Reacţii de precipitare

În câte o eprubetă se iau câte 1-3 ml soluţie proteică la care se adaugă,

separat următorii reactivi:

Tabelul 2. Reacţii de precipitare

Reactivul adăugat Aspectul şi comportarea produsului de reacţie

a. Alcool diluat sau

acetonă diluată

După agitare rezultă un

precipitat floconos

Solubil în apă distilată,

sub agitare

b. soluţie de sulfat de

amoniu sau de Mg, Na

Apare o tulbureală sau

fulgi care se depun

La diluare cu apă

precipitatul se redizolvă

a. prin încălzire la peste

600 C

Se formează un precipitat

floconos (coagul)

Fenomen ireversibil

b. ACZI MINERALI

concentraţi:

HCl, HNO3, H2SO4

Precipită la nivelul de

separare a celor două

lichide

Prin agitare sistemul se

clarifică

HNO3 concentrat Precipitat galben Insolubil prin agitare în

exces de reactiv

c. Acizi organici:

tricloracetic,

sulfosalicilic,

Precipitat abundent Insolubil prin agitare

32

naftalinsulfonic;

d. Reactiv Esbach Precipitat galben Insolubil prin agitare

e. Săruri ale metalelor

grele (Pb, Cu, Hg, Ag) în

soluţii 0,5-3%

Precipitat alb Solubil în exces de

reactiv, cel de Pb şi Cu.

Insolubil cel de Hg şi Ag

f. Soluţie apoasă saturată

de tanin, în prezenţa:

acid acetic 1%, acid

picric,fenol

Precipitat galben,

respectiv, alb

Insolubil în exces de

reactiv

Coagularea la punctul izoelectric

Moleculele substanţelor proteice au caracter amfoter datorită grupelor

funcţionale pe care le conţin. La punctul izoelectric, sau pH-ului izoelectric,

când numărul sarcinilor pozitive şi negative devin egale, ca urmare adăugării

unui acid sau baze, are loc precipitarea soluţiei proteice.

H2N CH CO NH CH

R R

CO NH CH

R

CO NH CH

R

COO-

Punctul izoelectric este o constantă fizico-chimică caracteristică fiecărei

proteine (ex. gelatina = 4,6; cazeina = 4,7).

Determinarea punctului izoelectric al gelatinei

Reactivi necesari. Amestec tampon, soluţie de gelatină.

Modul de lucru

- În 6 eprubete se realizează amestecul tampon corespunzător pH-ului

cuprins între 4,1 şi 5,6, prin amestecarea soluţiilor componente în raportul

indicat în tabelul 3.

33

Tabelul 3. Amestecul tampon corespunzător pH-ului

Nr.

eprubeteipH-ul

CH3COOH

0,1 N ml

CH3COONa

0,1 N ml

apă

distilată.

Total

volum

1.

2.

3.

4.

5.

6.

4,1

4,4

4,7

5,0

5,3

5,6

1,2

2

2

2

2

2

4,8

4

2

1

0,5

0,25

-

-

2

3

3,5

3,75

6 ml

6 ml

6 ml

6 ml

6 ml

6 ml

- Se adaugă în fiecare eprubetă câte 2 ml soluţie de gelatină 1% şi

aproximativ 8 ml alcool (cu o pipetă), agitând puternic până la apariţia unei

tulbureli albe.

- Se lasă în repaus 30 minute şi se notează în care eprubetă s-a format cea

mai mare cantitate precipitat. Valoarea pH-ului corespunzător eprubetei cu cea

mai mare cantitate de precipitat reprezintă (punctul izoelectric) pH-ul gelatinei.

1.5.3. Reacţii de culoare pentru identificarea proteinelor

Aproape roate reacţiile de culoare se datoresc anumitor aminoacizi

existenţi în proteine:

Tabelul 4. Reacţii de culoare

Numele reacţiei

(reactivului)

Modul de lucru Aspectul produsului de

reacţie

a. Reacţia biuretului La un ml soluţie puternic

alcalină se adaugă 3

picături soluţie diluată de

CuSO4 1%. Se va evita

excesul de CuSO4 de

Culoare albastră-violetă

34

oarece se formează un

precipitat de Cu(OH)2

care marchează culoarea

violetă

Reacţia biuretului se datoreşte legăturilor peptidice. Identificarea se poate realiza

şi pe secţiuni de material biologic (cartofi, mazăre seminţe de grâu, etc. după 20

minute).

b. Reacţia xantoproteică La 2-3 ml soluţie proteică

se adaugă 2-3 ml HNO3

concentrat.

Se obţine un precipitat

alb, care la fierbere se

solubilizează şi se

colorează în galben.

Sub acţiunea NH4OH soluţia devine portocalie. Reacţia este datorată

formării nitroderivaţilor aromatici (triptofan, tirozina, fenilalanina etc.)

Se poate executa şi pe materialul vegetal.

HO CH2 CH

COOH

NH2 + HNO3 HO

NO2

NO2

CH2 CH

COOH

NH2

c. Reacţia Millon La 3 ml soluţie proteică

se adaugă 1 ml reactiv

Millon (Hg(NO3)2 în

HNO3).

Precipitat alb. La

încălzire devine roşu.

Reacţia este datorată aminoacizilor cu grupă fenolică

d. Reacţia Libermann Soluţia proteică

coagulată prin încălzire +

5 ml HCl concentrat se

fierbe până la dizolvarea

precipitatului.

Culoarea violet-brună

e. Reacţia Sakaguchi Soluţia proteică Culoare roşie-carmin.

35

alcanilizată cu NaOH

10% + NaBrO

(hipobromit de Na) +

naftol + apă până la 1l.

Dispare la cald.

Hidroliza substanţelor proteice

Prin hidroliză acidă, alcalină sau enzimatică substanţele proteice se desfac

treptat în compuşi mai simpli. În hidrolizatul complet al substanţelor proteice se

pot găsi, pe lângă aminoacizii constituenţi şi substanţe de natură neproteică

reprezentând grupări prostetice ale heteroproteidelor.

Hidroliza acidă a gelatinei

Reactivi necesari: gelatină solidă sau în soluţie; HCl concentrat; H2SO4

25%; NaOH 20-30%; CuSO4 5%, AgNO3 5%.

Modul de lucru

- Într-un balon sau flacon Erlenmayer cu şlif de 150-300 ml, prevăzută cu

refrigerent ascendent se iau 20-30 ml soluţie de gelatină (sau 30-40 g gelatină

solidă) peste care se adaugă 20-25 ml HCl concentrat sau H2SO4 25%. Se lasă un

timp, agitând din când în când până ce gelatina se dizolvă complet.

- Se încălzeşte pe baia de apă, sub nişă; de obicei soluţia se colorează în

violet-violet intens sau negru-brun, datorită substanţelor humice care se separă

uneori. Din când în când, după o oră de încălzire, se iau câte 1-2 ml din soluţie,

se fierb cu cărbune animal în eprubetă, se filtrează, se precipită cu AgNO3, se

filtrează din nou iar în filtrat se execută reacţia biuretului (vezi reacţiile de

culoare pentru identificarea proteinelor, pag 141). Funcţie de cantitatea de

substanţe proteice luate, hidroliza poate dura 1-7 ore. Hidroliza se consideră

completă când reacţia biuretului este negativă.

Dozarea aminoacizilor prin metoda SŐRENSEN

Deoarece aminoacizii au caracter amfoter, gruparea acidă nu poate fi

titrată cu o bază decât după ce gruparea amino a fost blocată printr-o reacţie de

36

condensare cu aldehidă formică: Aminoacidul amfoter devine astfel un compus

metilenic cu funcţie carboxilică liberă, care poate reacţiona cu NaOH:

R CHNH2

COOH+ C

O

HH R CH

N

COOH

CN2+ H2O

R CHN

COOH

CH2

+ NaOH R CHN CH2

COONa+ H2O

Reactivi necesari: soluţie de aldehidă formică 20%, neutralizată cu NaOH

în prezenţa unei picături de fenolftaleină; soluţie de NaOH 0,1 N cu titru

cunoscut; soluţie de HCl 0,1 N; soluţie alcoolică de fenolftaleină.

Modul de lucru

a. Se cântăresc 10 g material vegetal şi se majorează cu 20 ml apă

distilată caldă (400 C); amestecul se trece cantitativ într-un cilindru gradat de

100 ml. Se aduce la cotă cu apă distilată, se omogenizează şi se lasă să stea cam

10 minute, agitând din când în când pentru realizarea extracţiei.

Proba astfel pregătită se filtrează printr-un filtru uscat într-un flacon

Erlenmayer uscat şi curat. Se i-au, într-un flacon, 20 ml filtrat, se neutralizează

cu NaOH 0,1 N în prezenţa fenolftaleinei, până la slab roz persistent, se adaugă

10 ml aldehidă formică 20% şi se titrează cu NaOH 0,1 N până la slab roz.

Calcul. Cantitatea de aminoacizi, exprimată în % azot aminic (sau

glicocol) se stabileşte după formula:

% azot animic din aminoacizi =

unde:

V = ml NaOH 0,1 N utilizat la titrarea probei după reacţia de condensare

cu aldehidă formică;

T = titrul soluţiei de NaOH 0,1 N exprimat în azot sau glicocol

(EN = 14; Eglicocol = 75) g/ml;

m = masa de material vegetal analizat, g;

37

d = diluţia cu care s-a lucrat.

b. Ca probă de analizat se poate utiliza şi 10 ml din hidrolizatul acid

obţinut din gelatină. Se neutralizează, în prezenţa de fenolftaleină, cu NaOH 0,1

N până la slab roz; se adaugă 10 ml aldehidă formică 20% (neutralizată în

prealabil cu NaOH 0,1 N în prezenţa de fenolftaleină) şi se titrează cu NaOH 0,1

N până la slab roz.

Calcul.

% aminoacid faţă de volumul hidrolizat luat în analiză =

unde:

V = ml NaOH 0,1 N consumat la titrare după condensarea cu aldehidă

formică;

f = factorul soluţiei de NaOH;

T= titrul aminoacidului considerat (Tglicocol = 0,75; Talanină = 0,008) g/ml.

Separarea aminoacizilor dintr-un amestec prin cromatografie pe hârtie.

Reactivi şi materiale necesare:

- Amestec de 2-3 aminoacizi (1 mg/cm3, 0,1%); soluţii etalon (de control)

de aminoacizi (1mg/cm3); amestec de developare: n-butanol + acid acetic + apă

(4:1:5); soluţie de ninhidrină (0, 1-0, 2% în n-butanol); hârtie cromatografică

Whatman nr.1; micropipete.

Modul de lucru

- Pe o foaie de hârtie cromatografică se trasează cu creionul o linie

paralelă cu unul din capetele hârtiei la o distanţă de 20 cm de marginea hârtiei.

- Pe această linie (start) se plasează, cu ajutorul unei micropipete o

picătură din soluţia de cercetat şi separat, din soluţia etalon, la cca. 2 cm

interval. Se notează în prealabil aceste locuri. Diametrul picăturilor trebuie să fie

de 2-3 mm, iar cantitatea maximă de aminoacid într-o pată, în jur de 0,03 mg.

- Hârtia cromatografică, cu petele uscate, se introduce în camera

cromatografică, care conţine un strat de amestec de developare de 2-3 mm

38

grosime, astfel încât capătul pe care au fost puşi aminoacizii să ajungă în acesta.

Peretele aminoacizilor nu trebuie să intre în amestecul de developare.

- Se lasă timp până când frontul solventului ajunge la 1-2 cm de marginea

superioară a hârtiei (developare ascendentă);

- Se scoate hârtia, se notează cu creionul frontul solventului, se usucă în

etuvă la 1000.

- Se pulverizează cu soluţie de ninhidrină şi se introduce timp de10

minute într-o etuvă la 900.

- Se examinează poziţia şi intensitatea culorii petelor apărute şi se

calculează Rf-urile. Valorile Rf-urilor câtorva aminoacizi în condiţia

experienţei:

Tabelul 5. Valorile Rf-urilor câtorva aminoacizi.

leucină 0,01 alanina 0,24 arginină 0,10

fenilalanină 0,53 acid glutamic 0,17 cisteina 0,08

- triptofan 0,43 glicocol 0,17

39

II. ANALIZE BIOCHIMICE - ANALIZA PROTEINELOR SANGUINE

Proteinele totale reprezintă cantitatea globala a proteinelor sanguine

exprimate în grame la 100 ml ser sanguin.

Valorile normale ale proteinelor sanguine sunt:

- la adulţi = 6,6- 8,6 g la 100ml

- la copii 1-3 ani = 6,0 - 8,6 g la 100ml.

Din acestea, circa 60% (3,6-4,8g) sunt constituite din albumină restul din

globuline. Cantitatea de proteine din ser depinde şi de alimentaţie, când

alimentaţia este foarte bogată în proteine, creşte şi concentraţia lor în sânge şi

invers proteinele sanguine scad din sânge în subnutriţia proteică.

Scăderea proteinelor sanguine se întâlneşte în diferite boli. Astfel, când

ficatul care este laboratorul ce fabrica proteinele, se îmbolnăveşte scade şi

concentraţia proteinelor din sânge. La fel se întâmplă când omul pierde

proteinele prin hemoragii sau prin urina (albuminurie). Vărsăturile, care

împiedică alimentaţia normala, bolile de stomac, intestin şi pancreas care

perturba digerarea proteinelor, diareea sunt numai o parte din cauzele care scad

concentraţia sanguina de proteine. De asemenea, efortul fizic intens, stresul

nervos, precum şi bolile care produc febra prin consumul crescut de proteine,

contribuie la scăderea proteinelor organismului. Scăzând proteinele din sânge,

organismul caută sa le înlocuiască apelând la proteinele din organele sale şi mai

ales din muşchi, fapt ce duce la slăbirea şi la scăderea în greutate a corpului.

Deoarece proteinele sanguine au capacitatea de a retine apa în vasele sanguine,

prin scăderea lor, apa din vasele sanguine trece în ţesuturile corpului (mâini,

picioare etc.) producând edeme.

Mai rar, proteinele sanguine pot sa aibă valori crescute, ca în unele boli

genetice şi parazitare sau ca în hipertensiunea arteriala.

40

2.1. Electroforeza serului (proteinograma)

Dacă pe o hârtie de filtru pusa în legătură cu un curent electric continuu se

pune o picătura de ser sanguin, proteinele totale din ser sunt descompuse în 5

categorii de substanţe numite fracţiuni proteinice. Valorile medii normale ale

acestor fracţiuni (care se refera la persoanele de vârsta adulta şi normal hrănite)

pot sa varieze pana la 10% în plus sau în minus, în special la copii, vârstnici sau

la persoane care nu se alimentează normal.

Tabelul 6. Valori normale

Fracţiunea proteica a serului Proporţii în procente Proporţii în grame

Albumine 52-62% 3,64-4,34

Globuline

din care:

38-48% 2,66-3,36

alfa-1-globuline 2-5% 0,14-0,35

alfa-2-globuline 6-9% 0,42-0,63

beta-globuline 8-11% 0,56-0,77

gama-globuline 14-21% 0,98-1,47

2.2. Probe hepatice

Probele hepatice sau testele de disproteinemie, sunt analize care

explorează capacitatea ficatului de a sintetiza proteinele normale, necesare

organismului. Un ser cu proteine normale în prezenta reactivilor cu care se fac

probele hepatice, nu produce modificări vizibile. Dar un ser cu proteine

modificate, în urma unor boli, produce cu reactivii respectivi o tulbureala. Cu

cat tulbureala este mai mare, cu atât şi modificările biochimice ale proteinelor

sunt mai intense.

În categoria analizelor care explorează funcţia hepatica intra reacţia cu

Timol, reacţia Takata, Gros etc. Aceste analize devin anormale (pozitive) mai

ales în bolile de ficat: hepatita acuta şi cronica, ciroza, colecistita. Dar ele devin

pozitive şi în alte boli, în care se produc fracţiuni proteinice anormale: boli de

41

rinichi, de plămâni, de splina, boli de sânge şi tumorale. Deci nu orice proba

hepatica cu valori crescute arata o boala de ficat după cum nu indica totdeauna

nici gradul de gravitate al bolii. De altfel aceste probe se pot modifica de la o

luna la alta după tratament şi regim alimentar. De aceea probele hepatice se

interpretează întotdeauna în corelaţie cu alte analize ajutătoare: proteinele totale,

electroforeza etc.

Serul prea gras falsifica rezultatele probelor hepatice. De aceea,

persoanele care îşi fac aceste analize nu vor manca cu 12 ore înainte de

recoltarea sângelui. Bolnavii cu diabet, netratat au un sânge gras. Înainte de a-si

face probele hepatice, ei trebuie sa-si trateze mai întâi diabetul, caci grăsimile

din serul lor nu scad numai cu regim alimentar.

Tabelul 7. Valori normale ale probelor hepatice

Testul, analiza Valori normale

Timol 1-4 unităţi Mag Lagan

Takata-Ara Reacţia negativa (analiza normala) se notează cu minus

Reacţia pozitiva (analiza anormala) se notează cu 1-3 plusuri

Gros Reacţia negativa (analiza normala) se notează cu minus

Reacţia pozitiva (analiza anormala) se notează cu 1-3 plusuri

Sulfat de cadmiu Reacţia negativa (analiza normala) se notează cu minus

Reacţia pozitiva (analiza anormala) se notează cu 1-3 plusuri

Sulfat de zinc

(Kunkel)

2-12 unităţi

2.3. Fibrinogenul

Fibrinogenul este o substanţa proteinica din sânge care este sintetizata de

ficat şi care are rol important în coagularea sângelui.

Valori normale ale fibrinogenului: 200-400 mg la 100 ml sânge.

Scăderea fibrinogenului sub aceste valori poate produce hemoragii la

bolnavii cu boli ale ficatului. Fibrinogenul creste însa foarte mult (peste 500 mg

42

la 100 ml sânge) în bolile infecţioase acute şi mai ales în reumatismul articular

acut.

2.4. Produşi de degradare ai proteinelor

Ca urmare a consumului de proteine de către organism rezulta şi o serie de

produşi de degradare sau deşeuri, care nu mai pot fi utilizate şi pe care

organismul le elimina din sânge în urina, iar în cantităţi mai mici şi prin

transpiraţie. Cele mai importante deşeuri de proteine sunt: acidul uric, creatinina

şi ureea. Aceste substanţe se găsesc în mod normal, în sânge, în concentraţii

mici, dar ele devin otrăvitoare pentru organism dacă depăşesc un anumit nivel

de concentraţie. De aceea, organismul le elimina prin rinichi în urina.

Acidul uric, creatinina şi ureea cresc în sânge şi urina după consumul de

alimente bogate în proteine, în bolile care distrug sau consuma în mod exagerat

proteinele corpului (boli infecţioase, boli de sânge etc.). în bolile de rinichi

(nefrita acuta şi cronica, insuficienta renala) aceste substanţe nu mai pot fi

filtrate şi eliminate prin rinichi şi atunci se acumulează în sânge, producând

tulburări grave în organism. în urma efortului fizic, concentraţia acestor

substanţe este de asemenea mai mare decât în stare de repaus.

Acidul uric creste foarte mult la persoanele care consuma cantităţi mari de

carne şi organe (ficat, rinichi, splina, creier, icre) precum şi la unele persoane

predispuse sa producă mult acid uric. Creşterea peste măsură a acidului uric în

sânge produce boala numita guta asemănătoare cu reumatismul, iar eliminarea

de cantităţi mari de acid uric în urina poate sa ducă la formarea de calculi urinari

compuşi din acid uric. Alcoolul, cafeaua, ceaiul, unele medicamente (vitamina

C, aspirina, antinevralgicele, cortizonul etc.) cresc concentraţia acidului uric din

sânge. De aceea aceste substanţe nu se vor consuma cu 24 ore înainte de

efectuarea analizelor.

43

Tabelul 8. Valori normale ale deşeurilor proteice

Deşeurile proteice În sânge În urină

Acidul uric 2-5 mg/100 ml 0,30-0,80 g/24h

Ureea 20-50 mg/100 ml 15-35 g/24h

Creatinina 0,6-1,2 mg/100 ml 0,8-1,9 g/24h

Concentraţia ureei sanguine este mai mică la femei şi la copii, la

persoanele subnutrite, în bolile de ficat, când acest organ nu mai poate produce

uree. Insuficienţa renală acută şi cronică, infecţiile însoţite de febră, obstrucţia

cailor urinare (litiaza urinarea, mărirea prostatei) sunt cauze patologice care

cresc peste normal ureea sanguină.

2.5. Dozarea proteinei totale (metoda biuretului)

Principiu: Proteinele reacţionează în mediul alcalin cu sulfatul de cupru

formând un compus complex de culoare roşu-violet.

Reactivi:

1. Soluţie de clorură de sodiu 0,9 %;

2. Soluţie de NaOH 0,2 M, liberă de CO2.

3. Reactiv biuret: 4,50 g sare Segnet se dizolvă în 40

cm3 soluţie de NaOH 0,2 M. Se adaugă 1,50 g CuSO4×5H2O şi 0,50

g iodură de potasiu. Se aduce la 100 cm3 cu soluţie de NaOH 0,2 M.

Se păstrează într-un vas de sticlă brună. Soluţia este stabilă.

4. Soluţie de iodură de potasiu 0,5 % în soluţie de

NaOH 0,2 M. Se păstrează într-un vas de sticlă brună nu mai mult de

2 săptămâni.

5. Soluţia de lucru a reactivului biuret: 20 cm3 reactiv

biuret se amestecă cu 80 cm3 soluţie iodură de potasiu. Soluţia este

stabilă.

44

6. Soluţia standard de albumină (din ser uman sau de

bovine): 100 g/l de albumină în soluţie de clorură de sodiu 0,9 %; 1

cm3 soluţie conţine 0,1 g de proteină.

Toţi reactivii trebuie să fie de calitate analitică sau chimică şi apa folosită

să fie distilată, pregătită după GOST 6709-72 sau apă de puritate echivalentă.

Utilaj:

- Analizator biochimic sau fotometru electronic;

- Cântar analitic cu precizia de 0,0002 g;

- Balanţă tehnică de lucru cu precizia de 0,01 g;

- Baloane cotate după GOST 1770-74 cu capacitatea de 100 cm3;

- Pipetă cu capacitatea de 10,0±0,1 cm3;

- Pipetă cu capacitatea de 1,0±0,005 cm3;

- Pipetă cu capacitatea de 0,1±0,0005 cm3;

- Cronometru.

-

Tehnica de lucru:

La 0,1 cm3 de ser se adaugă 5 cm3 reactiv biuret de lucru, se amestecă fără

să se formeze spumă. Peste 30 minute (şi nu mai târziu de o oră) se citeşte

valoarea absorbţiei probei faţă de martor 540 nm în cuvă de 1 cm (filtru verde).

Paralel cu proba de cercetare se montează probele cu material de control

(una cu conţinut normal şi alta-patologic); ele se prelucrează la fel ca şi proba de

cercetat.

Martor. La 5 cm3 de reactiv de lucru biuret se adaugă 0,1 cm3 soluţie de

clorură de sodiu 0,9 %; în continuare se prelucrează ca şi probă de cercetat.

Calcularea rezultatelor se efectuează după curba etalon.

Construirea curbei etalon. Din soluţia stoc standard se prepară soluţii

standard de lucru, conform tabelului 9.

45

Tabelul 9. Prepararea soluţiilor standard de lucru.

Nr

d/r

Soluţie standard de

proteină (cm3)

Soluţie de clorură de

sodiu 0,9 % (cm3)

Concentraţia proteinei

în g/l

1 0,20 0,80 20,0

2 0,40 0,60 40,0

3 0,60 0,40 60,0

4 0,80 0,20 80,0

5 1,00 - 100,0

Din fiecare diluţie se ia câte 0,1 cm3 soluţie de lucru şi se adaugă câte 5

cm3 reactiv biuret de lucru, peste 30-60 minute se citeşte valoarea absorbţiei,

analizat faţă de martor.

Valori de referinţă: 65,0-85,0 g/l.

Construirea curbei etalon:

46

Figura 1. Curba etalon

Notă:

1. Conţinutul de proteină în soluţia standard trebuie să fie mai mică

de 70 g/l;

2. Când conţinutul proteinei în ser depăşeşte 100 g/l serul trebuie

diluat cu soluţie fiziologică, şi rezultatul se înmulţeşte cu coeficientul

de diluţie;

3. Toţi reactivii trebuie să fie pregătiţi pe apă distilată fiartă.

47

III. CONCLUZII

Proteinele sunt substanţe organice macromoleculare formate din lanţuri

simple sau complexe de aminoacizi. Ele sunt prezente în celulele tuturor

organismelor vii în proporţie de peste 50% din greutatea uscată. Proteinele

constituie, alături de grăsimi şi de hidraţii de carbon o componenta importanta a

raţiei alimentare zilnice.

Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvenţa acestora

este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvenţa ei unică de

aminoacizi, determinată de secvenţa nucleotidică a genei.

Ele sunt necesare pentru creşterea organismului pentru refacerea celulelor

uzate, precum şi pentru producerea de energie calorica, un gram de proteine

producând 4 calorii.

Majoritatea proteinelor din organismul omului provin din alimente bogate

în proteine, fie de origine animala (carne, lapte, brânza, oua), fie de origine

vegetala (fasole, mazăre, soia, linte etc.). Protidele sunt compuşii de bază din

organismele vii care posedă un înalt grad de organizare structurală şi care la

hidroliză formează aminoacizi, care sunt legaţi prin legături peptidice. În

organism,proteinele se hidrolizează enzimatic până la polipeptide, peptide şi în

final se obţin aminoacizii. Acestea sunt transportaţi de sânge, în ţesuturile

diverselor organe, unde, în mare parte se recombină, pentru a forma proteinele

proprii organismului respectiv, şi în cantităţi mici, se consuma la sinteza acizilor

nucleici şi la scindarea oxidativa pentru a furniza energia necesară organismului.

S-a efectuat analiza proteinelor şi s-a construit graficul de calibrare din

serul sanguin.

Exista mai multe feluri de analize care explorează diferite componente ale

proteinelor, astfel: proteine totale, electroforeza, fibrinogenul, teste hepatice etc.

Din cele analizate putem spune că sângele poate sta la baza a numeroase

cercetări biochimice care se pot efectua în condiţii de laborator.

48

IV. BIBLIOGRAFIA

1. C. D. Neniţescu, Chimie organică-vol. I şi vol. II, Editura Didactică şi

Pedagogică, Bucureşti, 1980.

2. . Margareta Avram, Chimie organică-vol. I şi vol. II, Editura Academiei,

Bucureşti, 1982

3. LÎSÎI L. Biochimie medicală. Chişinău, 2007.

4. Standard/Protocol a deprinderilor practice. Colegiul naţional de medicină

şi farmacie. Chişinău, 2007, p. 76-79.

5. DINU V., TRUTIA E., POPA-CRISTEA E., POPESCU A. Biochimie

medicală. Mic tratat. Bucureşti. 1996.

6. Metode curente pentru analize de laborator clinic, Ministerul Sănătăţii şi

Academia de Ştiinţe Medicale, Ed. Medicală, Bucureşti, 1982.

7. Valentin Gudumac şi alţii. Investigaţii biochimice (elaborare metodică).

Chişinău 2008, p. 18-19.

49