Investigarea unor mecanisme
moleculare din genomul HCV cu
implicaţii în dezvoltarea unor
sisteme de diagnostic şi terapeutice
Proiect CEEX 158 / 2006
Director de proiect: Dr. Gabriela OPRIŞAN
Editura Universitară „Carol Davila”
Bucureşti 2008
2
ISBN: 978-973-708-350-0
Editura Universitară „Carol Davila” Bucureşti
a UMF „Carol Davila” Bucureşti este acreditată de
Consiliul Naţional al Cercetării Ştiinţifice din Învăţământul Superior
(CNCSIS)
cu avizul nr. 11/23.06.2004
Tehnoredactor: Mircea Panait
Coperta: Petruţ Radu
Copyright© 2008
Toate drepturile aparţin Editurii Universitare „Carol Davila”
3
Contract CEEX nr. 158/2006
Responsabil de proiect: Dr. Gabriela Oprişan, CS II
Denumirea proiectului :
„Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu
implicaţii în dezvoltarea unor sisteme de diagnostic şi terapeutice”
Gabriela Oprişan, Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu,
Mircea Panait
INCDMI Cantacuzino (INCDMIC, CO)
şi Consorţiul proiectului CEEX 158/2006
Simona Ruţă; Camelia Sultana; Irina Alexiu; Loredana Manolescu;
Gabriela Anton; Camelia Grancea; Ana Neagu; Carmen Sencovici
Institutul de Virusologie „Şt. S. Nicolau“ (IVN, P1)
Graţiela Ţârdei; Petre Iacob Calistru; Adriana Moţoc; Ştefan Lazăr;
Camelia Ionescu; Augustina Culinescu
Spitalul Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor Babeş”
(SVB, P2)
Emanoil Ceauşu; Cristiana Cristea; Ghe. Voiculescu
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ Bucureşti
(UMF, P3)
Dana Brehar-Cioflec; Emilian Damian Popovici; Graţiana Chicin;
Camelia Claici
Institutul de Sănătate Publică „Prof. Dr. Leonida Georgescu”
Timişoara (ISPT, P4)
4
5
CUPRINS
Introducere 9
Virusul hepatitei C – structură genomică, variabilitate 11
Infecţia cu virusul hepatitei C (HCV) 15
Generalităţi 15
Patogenie 15
Incubaţie 20
Istoria naturală a bolii 20
Boala acută 20
Boala cronică 22
Tratament 25
Diagnosticul pozitiv de infecţie cu virus hepatitic C 27
Teste serologice 27
Determinarea ARN-HCV 29
Genotiparea HCV 31
Rezultate 33
6
7
Cuvinte-cheie: bancă de seruri, încărcătură virală, diagnostic serologic,
genotipare cu teste comerciale, genotipare prin teste moleculare home-
made, optimizare PCR, chestionar, algoritm de diagnostic, infecţie HCV,
diagnostic serologic, DO/CO, teste Western Blot, seroprevalenţă,
diagnostic molecular; secvenţiere, analiză filogenetică, epidemiologie
moleculară, clonare, core+1, corelaţii genotip/răspuns la tratament,
TaqMan, pretratamentul sângelui cu SMARTubeTM, ELISA
8
9
Introducere
Variabilitatea virusului hepatitei virale C pare să influenţeze perfor-
manţele testelor actuale de diagnostic, bazate numai pe antigene proveni-
te din HCV de tip 1. HCV este un virus caracterizat de o mare diversitate
genetică datorită erorilor de încorporare a nucleotidelor de către polimera-
za virală (NS5B), ceea ce duce la variabilitate (genotipuri, subtipuri şi cva-
sispecii). Nomenclatura internaţionalǎ a HCV este bazatǎ pe clasificarea
în tipuri, subtipuri, izolate şi cvasispecii. Pânǎ în prezent, s-au identificat 6
genotipuri majore şi peste 100 subtipuri, cu distribuţie geografică variabilă.
Investigarea şi diagnosticarea rapidǎ şi corectă a HCV joacǎ un
rol crucial în practica clinicǎ şi limitarea extinderii infecţiilor cu acest virus.
Deşi la ora actualǎ apar generaţii noi de teste serologice (generaţia III) şi
kituri de genotipare (generaţia II), acestea nu acoperǎ heterogenitatea ge-
nomului HCV, aspect ce are impact asupra controlului HCV. România
este ţara cu cea mai mare prevalenţǎ de HCV dintre ţǎrile balcanice. În
cazul kiturilor de genotipare acestea nu pot acoperi toate variantele circu-
lante, iar apariţia unor recombinanţi face imposibilǎ validarea prin kituri.
Acest studiu şi-a propus implică atât cercetare fundamentalǎ
(identificarea genotipurilor HCV circulante in Romania, mecanisme de
variabilitate: mutaţii, recombinare, clonarea proteinelor Core şi Core+1)
cât şi o parte de cercetare aplicativǎ şi de transfer tehnologic (îmbunǎtǎ-
ţirea unor sisteme serologice de detecţie a HCV utilizând o proteinǎ nou
descoperitǎ, Core+1, ameliorarea sensibilităţii PCR).
Se pot aduce două argumente în favoarea acestui studiu:
testele comerciale de diagnostic serologic sunt suboptimale
pentru testarea persoanelor infectate şi cu alte genotipuri,
subtipuri sau variante virale decât genotipul 1;
nu existǎ nici un sistem de detecţie a HCV pe baza anticorpi-
lor faţǎ de proteina core+1 şi nu este cunoscută prevalenţa
acestora la pacienţii din Romania.
10
11
Virusul hepatitei C – structură genomică, variabilitate
Virusul hepatitei C (HCV) a fost identificat în 1989 (Choo), graţie
dezvoltării noilor metode moleculare, în special utilizării tehnicilor bazate
pe amplificarea genică (polymerase chain reaction = PCR). În absenţa
unui sistem de cultivare celulară adecvat, caracterizarea diferitelor izo-
late de HCV face apel la datele privind secvenţele. Acumularea acestor
date moleculare a demonstrat că HCV se distinge printr-o variabilitate
genetică importantă. Compararea secvenţelor, bazată pe determinarea
procentajului de omologie stă la baza a două concepte privind varia-
bilitatea genomică: genotipurile şi cvasispeciile. Termenul de genotip
corespunde unei heterogenităţi virale importante, observate între izolate
diferite de HCV (omologie > 75%), clasate astfel ca grupuri distincte din
punct de vedere genetic. Opusul acestui termen este cel de cvasispecii,
care face referire la prezenţa într-un individ infectat a unui număr impor-
tant de secvenţe virale foarte apropiate, care diferă între ele prin cîteva
mutaţii (omologie > 98%). Între aceste limite se situează subtipurile din
cadrul fiecărui genotip, care prezintă peste 85% omologie.
HCV este un virus ARN pozitiv monocatenar, din familia Flaviviri-
dae, genul Hepacivirus (Houghton, 2002). Genomul viral este de aprox.
9.400 nucleotide şi poartă un cadru de lectură deschis (open reading
frame = ORF) foarte lung, care codifică o poliproteină, clivată co- şi post-
translaţional în proteine virale mature, cele structurale fiind situate în
regiunea N-terminală, iar cele nestructurale în jumătatea C-terminală a
poliproteinei. ORF este flancat de două regiuni care nu sunt translate
(untranslated regions = UTR), 5’UTR şi 3’UTR. Procesarea proteolitică a
poliproteinei de către proteazele gazdei şi cele virale duce la obţinerea a
10 proteine virale mature, incluzînd proteina de capsidă (core) C, cele
două glicoproteine de înveliş E1 şi E2 şi proteinele nestructurale p7,
NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A şi NS5B.
12
Regiunea 5’UTR este lungă de 341 de nucleotide şi formează
structuri secundare specifice care funcţionează ca situs intern de intrare a
ribozomului (internal ribosomal entry site = IRES) (Tsukiyama-Kohara,
1992). Dintre toate zonele genomice ale HCV aceasta este cea mai
coonservată (Bukh, 1992), caracteristică ce a fost utilizată ca marker de
diagnostic prin PCR (Smith, 1995). Majoritatea genotipurilor prezintă în
această regiune 5 codoni start (AUG) care nu sunt utilizaţi pentru iniţierea
translaţiei, situaţie similară cu cazul picornavirusurilor. Modele generate
pe calculator prezintă, pe baza secvenţei primare în 5’UTR, structuri
secundare şi terţiare sub forma unor bucle (Honda, 1996). Menţinerea
acestor structuri, cu relevanţă funcţională pentru iniţierea translaţiei, ar fi
explicaţia extremei conservări la nivel de secvenţă a regiunii 5’UTR
asupra căreia se exercită o presiune selectivă (Simmonds, 1993).
Proteina core este o proteină HCV înalt conservată, conţine 191
aminoacizi şi are o masă moleculară de 21kDa. Clivarea poliproteinei de
către o peptidază a celulei gazdă duce la formarea proteinei core imatu-
re, care conţine secvenţa semnal E1 în regiunea C-terminală. Peptidul
semnal este ulterior procesat de către peptidază şi, astfel, rezultă protei-
na core matură. Rolul primar al proteinei core este în formarea nucleo-
capsidei virale, dar are şi alte funcţii: modulează transcrierea genelor vi-
rale, intervine în proliferarea celulară, în moartea celulară, în fenomene
de semnalizare celulară, interferă cu metabolismul lipidelor şi imunosu-
presie (Penin, 2004).
Recent a fost identificată o proteină adiţională numită core+1, F
sau ARFP (Varaklioti, 2002; Walewsky, 2002; Xu, 2001). Această pro-
teină este codificată de către un cadru de citire alternativ din regiunea
capsidei (core), dar funcţia sa rămâne încă necunoscută.
Regiunea NS5 din poliproteină este compusă din două proteine,
NS5A şi NS5B, care sunt eliberate prin scindarea acţionată de proteaza
NS3, în conjuncţie cu NS4A (Clarke, 1997).
13
NS5B reprezintă ARN polimeraza virală, ARN-dependentă. Poli-
meraza virală este o enzimă cu fidelitatea încorporării nucleotidelor rela-
tiv scăzută (absenţa sistemului de corectare a încorporării nucleotidelor,
proof-reading). S-a estimat că rata de substituţie prin greşeli de încorpo-
rare în timpul replicării virale a HCV este de aproximativ un milion de ori
mai mare (10-2 – 10-3) decât rata de substituţie în cazul genomului uman.
Acest fapt conduce la o heterogenitate genomică ridicată care stă la
baza clasificării în cele 6 genotipuri majore, cu peste 60 de subtipuri
(Simmonds, 1999). Deşi prezintă un grad de conservare la nivel nu-
cleotidic mai mic decât 5’UTR, regiunea NS5B prezintă constrîngeri le-
gate de funcţionalitatea sa contra unei variaţii importante de secvenţă.
Contrar regiunilor E1 şi E2, pentru care variabilitatea constituie unul din
mecanismele virale de eludare a sistemului imun, regiunea polimerazei
virale trebuie să menţină motive specifice de aminoacizi, cum este G-D-
D, caracteristic tuturor polimerazelor ARN dependente de ARN. În timpul
replicării virale polimeraza HCV produce erori de încorporare a nucleo-
tidelor numite mutaţii. Unele pot fi tolerate, altele pot modifica profund
funcţionarea ARN viral pînă la abolirea acesteia (mutaţii letale). Genoa-
mele virusurilor strâns înrudite diferă prin mutaţii care privesc o singură
nucleotidă (punctiforme), aflate de obicei în poziţia a treia (redundantă)
a codonului. Această redundanţă a codului genetic permite o evoluţie
mai rapidă şi implicit, o variabilitate mai mare a secvenţei nucleotidice
decât a secvenţei proteice codificate. Mutaţiile care determină o modifi-
care în structura proteinei sunt denumite non-sinonime, prin comparaţie
cu cele care nu schimbă structura în aminoacizi (mutaţii sinonime).
După ce întreg genomul HCV a fost elucidat în 1991 de către
Choo şi colab., mai multe izolate din diferite părţi ale lumii au fost sec-
venţiate. În urma comparării diferitelor secvenţe s-au identificat mai mul-
te tipuri (grupuri filogenetice) distincte de HCV. Diferenţele dintre sec-
venţele studiate sunt folosite pentru realizarea de arbori filogenetici, pe
baza cărora se pot observa grupurile filogenetice (B. Robertson,1998).
14
Primele indicaţii privind nomenclatura şi clasificarea virusului au fost
puse la punct de către Comitetul Internaţional de Taxonomie a Virusuri-
lor (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV). Toate vi-
rusurile hepatitei C izolate până în prezent pot fi grupate în şase grupuri
filogenetice distincte. Cele 6 tipuri genetice majore diferă unul de celălalt
în proporţie de 30%, între subtipuri se înregistrează o diferenţă de 20%,
iar în cadrul aceluiaşi subtip, o diferenţă de până la 10% (M.P. Stumpf,
2002).
Diferitele regiuni ale genomului prezintă grade diferite de variabi-
litate. Zonele netranslate, ce conţin elementele implicate în replicarea
virală şi procesarea proteinelor, sunt înalt conservate intre diferite geno-
tipuri, la fel ca şi gena pentru proteina core. Alte regiuni, cum ar fi E1 şi
E2, care codifică glicoproteinele învelişului viral, prezintă o variabilitate
importantă.
Tipurile şi subtipurile HCV prezintă modele complexe de distribu-
ţie geografică, predominanţă relativă şi moduri de transmitere ce pot fi
bine înţelese dacă sunt clasificate în trei grupuri (M.P. Stumpf, 2002):
1. Grupul epidemic cuprinde subtipurile 1a, 1b, 2a, 2b şi 3a,
care au o distribuţie globală şi sunt responsabile pentru majo-
ritatea infecţiilor din lumea întreagă. Rapida transmitere şi
diseminare globală a acestor subtipuri derivă din transmite-
rea lor eficientă prin sânge si la utilizatorii de droguri intrave-
noase. Subtipurile 1b şi 2a sunt asociate cu transmiterea prin
sânge, în timp ce 1a şi 3a se întâlnesc la dependenţii de
droguri.
2. Grupul endemic are o distribuţie mai redusă decât grupul
epidemic. De exemplu, genotipul 6 se găseşte numai în SE
Asiei. Diversitatea foarte mare a acestui genotip sugerează o
perioadă lungă de evoluţie de la introducerea virusului in
populaţie.
15
3. Grupul local epidemic prezintă o predominanţă mare în
anumite regiuni ale globului şi anumite populaţii. Subtipul 4a
este responsabil de infectarea a mai mult de 10% din popu-
laţia Egiptului şi este rar întâlnit în afara Orientului Mijlociu.
Studiile de epidemiologie moleculară sugerează că acest fe-
nomen a avut loc de-a lungul secolului XX, când au avut loc
campanii de vaccinare împotriva unei boli parazitare.
Toate aceste modele evidenţiază comportamentul epidemiologic
al tipurilor şi subtipurilor HCV, care este dat mai degrabă de modul de
transmitere decât de diferenţele genetice existente între ele. Atât timp
cât virusul are la dispoziţie căi eficiente de transmitere oricare dintre
subtipurile HCV poate genera epidemii.
Infecţia cu virusul hepatitei C (HCV)
Generalităţi
Infecţia cu virusul hepatitei C s-a răspândit în ultima parte a sec.
XX, identificarea virusului (bănuit încă din 1970), fiind posibilă abia în
1989 prin clonare moleculară. Transmiterea predominant pe cale percu-
tană a făcut posibilă apariţia a două epidemii: una legată de utilizarea
drogurilor i.v. în ţările dezvoltate şi utilizarea tratamentelor injectabile ne-
corespunzătoare în ţările în curs de dezvoltare. Rezultatul a fost că la în-
ceputul secolului XX a apărut un mare rezervor de infectaţi cu virus he-
patitic C, majoritatea asimptomatici şi cu progresie lentă a bolii hepatice.
Problemele ce apar sunt legate de instalarea în zeci de ani a complicaţii-
lor (ciroză hepatică, carcinom hepatocelular). După estimări recente ale
OMS, numărul persoanelor infectate cu HCV se ridică la 170 milioane.
Patogenia infecţiei cu virus C, cât şi istoria naturală a acestei boli
sunt şi la ora actuală încă insuficient cunoscute.
Patogenie
Ciclul de replicare a virusului HCV are loc în hepatocite, leucocite
mononucleare, limfocite T şi B, fiind considerat un „virus limfotropic”.
16
La câteva zile după infecţia cu virus C se pot detecta în sânge
particulele virale. Anticorpii anti-virus C apar după aproximativ 45-90 zile
(Seef, 1995). Nu se cunoaşte exact mecanismul prin care se produc le-
ziunile hepatice, dar se pare că sistemul imunitar al gazdei joacă un rol
important în producerea acestora. ARN viral nu se integrează în mate-
rialul genetic al gazdei, de aceea, pentru a se menţine în organism, viru-
sul trebuie să se replice constant şi eficient în celula umană. În ciuda
unui răspuns imun umoral şi celular multispecific îndreptat împotriva
proteinelor structurale şi nestructurale, la aprox. 70-85% din pacienţi
infecţia persistă. Sistemul imun trebuie să elimine rapid infecţia, înainte
ca virusul să aibă timp să dezvolte strategii pentru eludarea răspunsului
imun. Replicarea virală persistentă a fost detectată, în special, în hepa-
tocite şi în limfocitele periferice. Au fost autori care au studiat la autopsii
prezenţa replicării virale şi în alte organe decât ficat (Laskus şi colab.),
la imunodeprimaţi (co-infectaţi HIV/HCV), găsind acest virus şi în gan-
glionii limfatici, pancreas, suprarenale, măduva osoasă, splină. Semnifi-
caţia clinică a prezenţei HCV extrahepatic nu este încă pe deplin eluci-
dată, fiind încă necesare studii mai amănunţite in vivo.
Infecţia cu HCV determină apariţia de anticorpi neutralizanţi, care
nu sunt totuşi eficienţi şi nu protejează împotriva unei reinfecţii. Se pare
că cei care fac infecţie cronică, fie nu pot avea un raspuns imun celular
adecvat de la începutul infecţiei, fie nu îl pot menţine (după un studiu al
lui Gherlach din 1999, 6,15% se încadrează în prima categorie şi
12,31% în a doua categorie).
Există mai multe strategii posibile prin care virusul persistă:
devine mai puţin vizibil pentru sistemul imun;
scade eficienţa citokinelor antivirale;
creşte rezistenţa celulelor infectate la distrugerea mediată de
către limfocitele T citotoxice (CTL);
inducerea toleranţei imune;
eludarea mecanismelor sistemului imun.
17
În general, nici nivelul viremiei din sânge şi nici valoarea ALT nu
se corelează bine cu distrucţia de la nivelul ţesutului hepatic la biopsie.
Se pare însă că nivelul replicării virale în ţesutul hepatic poate fi corelat
cu severitatea afectării hepatice (Gretch şi colab.).
Studiile asupra fiziopatologiei în infecţia cu virus C au fost mult
limitate de lipsa unor sisteme de culturi celulare (posibile abia din 2005)
pentru replicarea virală şi, mai ales, de lipsa unor modele animale la
mamiferele mici. Singurul model animal disponibil a fost cimpanzeul, la
care rata infecţiei cronice a fost foarte ridicată (ca şi la om). Şi la acesta
replicarea virală persistă, în ciuda apariţiei unui răspuns imun specific.
În general, virusul C pare să fie slab citopatic (cu excepţia situa-
ţiei patogenice particulare a hepatitelor colestatice fibrozante). Leziunile
morfologice la nivelul hepatocitelor (atingere citopatică) sunt observate
la un număr mic de celule. Severitatea leziunilor nu se corelează cu ni-
velul viremiei. Experimental, hiperexpresia proteinelor virale la şoarecii
transgenici nu induce leziuni hepatocitare. Persistenţa virală pare a fi
legată, mai ales, de sistemul imun al gazdei care nu poate elimina viru-
sul, deşi posedă capacitatea de a limita replicarea virală.
Persistenţa virală poate avea mecanisme multiple.
O caracteristică importantă a virusului C este extrema variabilita-
te a genomului viral, datorită absenţei unui sistem de corectare a erorilor
de replicare la nivelul ARN polimerazei virale. Acumularea mutaţiilor şi
selecţia variantelor mai bine adaptate au dus la apariţia mai multor
genotipuri. Cea mai conservată parte din virus pare a fi proteina nucleo-
capsidică, iar cele mai variabile zone sunt E1 şi E2 (cea din urmă are o
porţiune hipervariabilă de 30 aminoacizi). La acelaşi pacient infectat cu
HCV, virusul circulă sub diferite variante genetice denumite cvasispecii;
heterogenitatea evoluând odată cu boala. Astfel, la doi indivizi infectaţi
cu acelaşi inocul, variantele virale sunt ulterior diferite. Fenomenul con-
feră virusului o rată crescută de supravieţuire, cu selectarea rapidă a
mutantelor mai bine adaptate mediului imunologic.
18
Pe de altă parte, şi mecanismele imunitare ale gazdei sunt
implicate în persistenţa HCV.
Răspunsul imun nespecific este primul mecanism de apărare
împotriva virusului C. Din păcate, nu se cunoaşte exact rolul celulelor
NK, neutrofilelor, macrofagelor sau al secreţiei precoce de citokine.
Totuşi, există argumente indirecte care sugerează că infecţia cu HCV ar
putea fi evitată într-un stadiu precoce. Astfel, limfocitele subiectilor
infectaţi sau ale cimpanzeilor expuşi la virus pot prezenta o reactivitate
la stimularea antigenică, în absenţa anticorpilor specifici şi pot păstra
memoria limfocitară mai mulţi ani după vindecarea unei hepatite C.
În cursul fazei iniţiale a infecţiei poate fi detectată prin metode
imunoenzimatice o imunitate umorală specifică îndreptată împotriva
virusului C. şi anume producerea de anticorpi specifici pentru epitopii de
pe proteinele structurale şi nestructurale ale virusului. Se pare că unii
dintre aceşti anticorpi ar avea un rol neutralizant. Totuşi, nu s-a constat
până acum nici o diferenţă calitativă sau cantitativă a răspusului imun
umoral între pacienţii care se vindecă şi cei care dezvoltă infecţie cro-
nică după un episod acut. În schimb, se pare că anticorpii antivirus C ar
fi cei implicaţi în manifestările extrahepatice, fiind asociaţi cu crioglobuli-
nemia tip II sau III. În concluzie, răspunsul imun umoral specific împo-
triva HCV, deşi are un oarecare efect neutralizant, nu este suficient
pentru a proteja pacientul impotriva unei eventuale reinfecţii şi nici împo-
triva răspândirii virusului în organism în cursul infecţiei acute. Un
răspuns umoral important poate determina formarea de complexe imune
ce pot determina patologii asociate crioglobulinemiei (glomerulonefrită,
neuropatie, vasculită cutanată, artrită).
Răspunsul celular limfocitar T CD4+ specific este cuantificabil
la pacienţii cu hepatită acută sau cronică prin măsurarea răspunsului
proliferativ antigen-specific al celulelor mononucleare din sângele perife-
ric faţă de antigenele recombinante ale HCV. Limfocitele T CD4+ speci-
fice apar în sângele periferic la 3-4 săptămâni după contaminare, iar
19
apariţia lor în infiltratele celulare de la nivelul ficatului coincide cu creşte-
rea transaminazelor. Proteinele capsidei, precum şi proteinele nestructu-
rale NS3 şi NS4A sunt cele mai imunogene. Un răspuns puternic şi sus-
ţinut în limfocite CD4+ se corelează cu eliminarea virusului în timpul
fazei acute a infecţiei; recunoaşterea unui epitop imunodominanat al
proteinei NS3 (situat între aminoacizii 1251 şi 1259) pare asociat cu
evoluţia favorabilă a bolii. Studiile de proliferare limfocitară a T CD4+ cir-
culante şi analiza producerii în periferie de citokine ca răspuns la diferiţii
epitopi virali (core, E1, NS3, NS4, NS5) au arătat că secreţia de citokine
imunoreglatoare Th1 (IL2, IFN gamma) care activează limfocitele T
citotoxice, predomină la bolnavii care au tendinţa de vindecare spontană
(mai ales dacă secreţia lor este precoce şi durabilă), în timp ce secreţia
de citokine proinflamatorii Th2 (IL4, IL5, IL10) apare mai ales la pacienţii
care dezvoltă boala cronică.
Astfel, persistenţa infecţiei după faza acută s-ar explica printr-un
răspuns insuficient în limfocite T CD4+ specifice şi o secreţie redusă de
citokine de tip Th1.
Răspunsul celular limfocitar T citotoxic (CD8+). În infecţia cu
virusul hepatitic C apare un răspuns citotoxic specific modulat de com-
plexul major de histocompatibilitate HLA clasa I, atât în mononuclearele
din sângele periferic, cât şi în ficat. S-a dovedit că, în cursul hepatitei
acute, numărul de clone limfocitareT CD8+ specifice, producătoare de
interferon gamma în sângele periferic, se corelează cu eradicarea infec-
ţiei la 6 luni de la debutul ei. În hepatita cronică, numărul acestor celule
este mai mare în infiltratul celular hepatic decât în sângele periferic.
Aceste celule T citotoxice ar fi implicate în eliminarea virusului prin liza
celulelor infectate prin apoptoză şi/sau acţiunea unor citokine (interferon
gamma sau TNF alfa), care pot inhiba replicarea intracelulară virală. S-a
stabilit, de asemenea, că există un raport invers proporţional între răs-
punsul citotoxic şi viremie, ceea ce sugerează că replicarea virala ar fi
parţial controlabilă prin limfocitele citotoxice. Studii cantitative ale
20
răspunsului citotoxic în hepatita cronică au arătat că, deşi acest răspuns
este întotdeauna prezent la nivelul ficatului, el este mai slab ca intensi-
tate decât în cazul altor infecţii virale, cum ar fi cele cu CMV, EBV etc.
În concluzie, persistenţa virală în hepatita C s-ar explica printr-un
deficit funcţional al răspunsului în limfocite T citotoxice CD8+, precum şi
prin limitarea recunoaşterii antigenice de către limfocitele T CD4+.
Factorii genetici legaţi de gazdă ar putea influenţa natura răs-
punsului imun şi interacţiunea lui cu virusul. Este vorba, în primul rând,
despre sistemul HLA, care a fost mai bine studiat. Deşi s-a pus în evi-
denţă o legatură între unele gene şi evoluţia favorabilă a infecţiei, nu s-
au putut, totuşi, identifica haplotipuri caracteristice în populaţia generală.
Incubaţie
Între momentul infectării cu virus hepatitic C şi apariţia simptome-
lor (hepatită acută), există un interval de 2 până la 26 săptămâni (în ge-
neral, între 6 şi 9 săptămâni); incubaţia medie a fost stabilită pe studii
prospective post-transfuzionale (7-8 săptămâni). Perioada de incubaţie,
dar şi severitatea bolii acute par să fie în legătură cu inoculul.
Istoria naturală a bolii
Dacă pentru primele două decade ce urmează infectării cu virus
C istoria naturală a putut fi mai bine studiată, în schimb, ceea ce se
întamplă după douăzeci de ani de evoluţie cronică a infecţiei nu este
încă suficient de bine cunoscut.
Istoria naturală a infecţiei cu virus C cuprinde atât hepatita acută,
cât şi pe cea cronică.
Boala acută
Denumită înainte de 1989 hepatită acută nonA-nonB (post-trans-
fuzională), hepatita acută cu HCV este şi în prezent o boală puţin cunos-
cută. Acest lucru se datorează, pe de o parte faptului că numai 1 din 10
pacienţi sunt simptomatici, pe de altă parte pentru că în momentul insta-
lării simptomelor este posibil ca anticorpii antivirus C să nu fie încă
21
prezenţi (ei apar în general după 3-12 săptămâni după infectare), ceea
ce întârzie diagnosticul, sau îl face să fie subestimat. Istoria naturală a
infecţiei cu virus C este şi ea încă insuficient cunoscută, căci datele din
literatură referitoare la faza acută a bolii sunt destul de sărace. De
aceea, definirea cazului de hepatită acută se face coroborând datele
epidemiogice (expunere potenţială la virus cu 2 săptămâni până la 6 luni
anterior îmbolnăvirii), criterii clinice (boală acută cu debut discret de
hepatită acută şi, eventual, icter), criterii de laborator (creşterea trans-
aminazelor de peste 7 ori valoarea maximă admisă şi Ac anti-HCV pozi-
tivi prin două metode, ELISA şi RIBA. Totuşi, 10% din cazuri nu au Ac
anti-HCV prezenţi la testarea iniţială (nu au făcut seroconversia), 3%
rămân negativi şi la testările ulterioare deşi au infecţie cu HCV. Pe de
altă parte, prezenţa Ac anti-HCV nu distinge între o infecţie acută, una
cronică sau una eradicată. Absenţa HCV în sânge nu exclude o infecţie
cu virusul C.
Hepatita acută C se referă la perioada de 6 luni care urmează
infecţiei cu HCV, în care până la 75% din pacienţi pot fi asimptomatici.
Perioada prodromală lipseşte în general, iar simptomele, când apar,
sunt în general uşoare şi nespecifice: sindrom pseudogripal, oboseală,
dureri musculare, greţuri, vărsături, subfebrilitate, dureri abdominale,
uneori icter, ce se însoţesc de creşteri ale transaminazelor serice. În
formele simptomatice, boala durează de obicei 2 până la 12 săptămâni.
Icterul apare rar în hepatita acută C (până la 20% din cazurile
simptomatice), dar pare a fi asociat cu o evoluţie favorabilă a infecţiei.
Se pare că icterul apare mai puţin frecvent la hepatitele transmise prin
injectare i.v. de droguri.
Alţi autori susţin că nu numai formele icterice, dar chiar formele
de hepatită acută simptomatică se vindecă spontan în proporţie mai
mare decât infecţiile cu virus C asimptomatice (care, de obicei, se croni-
cizează). Mecanismul acestei vindecări nu este cunoscut, dar studiile au
arătat că răspunsul imun, mai ales celular de tip T CD4+ şi CD8+ joacă
22
un rol foarte important. Un factor predictiv favorabil ar fi restrângerea
numărului şi a diversităţii de cvasispecii, ce ar anunţa vindecarea, pe
când expansiunea acestora anunţă cronicizarea (R.T. Chung).
Există şi alţi factori care par să influenţeze eliminarea spontană a
virusului:
vârsta în momentul infectării - contrar modului în care se
petrec lucrurile în infecţia cu HBV, 40-45% din copiii născuţi
din mame infectate cu HCV se vindecă spontan; unele studii
au arătat că persoanele infectate înainte de 20 ani au şanse
de vindecare de 70%, pe când cei infectaţi după 20 ani se
vindecă numai în proporţie de 24%;
rasa - studii au arătat că pacienţii din rasa neagră se vindecă
numai în 14% din cazuri, pe când caucazienii în proporţie de
până la 32%;
statusul imun în momentul infectării - pacienţii coinfectaţi cu
HIV prezintă cronicizarea infecţiei cu HCV în proporţie mult
mai mare decât persoanele imunocompetente.
Boala cronică
După hepatita acută urmează fie vindecarea (caracterizată prin
eliminarea definitivă a virusului, normalizarea ALT, scăderea progresivă
a anticorpilor, care rămân însă detectabili mai mulţi ani), fie cronicizarea
bolii.
Evoluţia de la faza acută la cea cronică este, de obicei, asimpto-
matică timp de 20 ani, după care poate rămâne asimptomatică sau pot
apărea simptome, în general uşoare, legate de boala cronică de ficat, de
complicaţii ale acesteia sau de manifestări extrahepatice.
Cronicizarea infecţiei se caracterizează prin nivele uşor crescute
(sau normale) ale ALT, ARN-HCV detectabil (posibil după o negativare
tranzitorie). Până la stadiile finale, boala evoluează în medie 20-40 ani.
Coinfecţiile (HIV, HBV) sau comorbidităţile (consumul de alcool),
influenţează semnificativ evoluţia bolii şi scurtează acest interval.
23
Au fost efectuate studii care au încercat să stabilească istoria na-
turală a bolii. Unele au fost retrospective (Kiyosawa, Tong, Yano, Nide-
rau, Gorgon) şi au arătat că pentru un interval de la expunerea la virus
de 9-29 ani, dezvoltarea cirozei a apărut în 17-55% cazuri (în medie
42%), neoplasmul hepatic în 1-23% cazuri, iar decesele legate de boala
hepatică în 4-15% din cazuri. Alte studii prospective (Di Bisceglie, Ko-
retz, Mattson, Tremolada) au evidenţiat pentru un interval de la expu-
nerea la virus de 8-16 ani, instalarea cirozei în 7-16% (în medie 11%)
din cazuri, neoplasmul hepatic în 0,7-1,3% iar decesele legate de boala
hepatică în 1,3-3,7% cazuri.
Mai mulţi factori ar putea influenţa progresia hepatitei cronice:
Factori legaţi de virus - nivelul viremiei pare să nu influenţe-
ze progresia bolii, iar cvasispeciile influenţează numai trece-
rea de la faza acută la cea cronică, dar nu şi progresia bolii
cronice de ficat deja instalate.
Factori legaţi de gazdă:
vârsta: pacienţii peste 40 ani au progresie mai rapidă;
sex: femeile par sa aibe o progresie mai lentă;
coinfecţiile cu HIV, HBV grăbesc progresia bolii;
comorbidităţi: hemocromatoza, non-alcoholic steatohepa-
titis (NASH), obezitatea, parazitozele (schistosomiaza)
determină o progresie mai rapidă;
factori genetici: Ag din sistemul HLA clasa II care intervin
în imunitate;
expresia bolii: de obicei, formele cu transaminaze nor-
male progresează mai lent;
factori externi: alcoolul este factorul cel mai important de
accelerare a progresiei bolii; un consum peste 50 g/zi se
asociază cu o instalare mai rapidă a cirozei;
fumatul şi factori toxici din mediu au fost de asemenea
24
corelaţi, în unele studii, cu o progresie mai rapidă către
stadiile finale ale bolii hepatice.
În medie, durata de instalare a cirozei este de 30 ani, însă diferă
în funcţie de factorii amintiţi; astfel, bărbaţii care beau şi persoanele
infectate la o vârstă de peste 40 ani pot evolua către ciroza în 13 ani, pe
când femeile care nu beau, persoanele infectate înainte de 40 ani pot
prezenta această complicaţie şi după 42 ani (Poynard, Lancet, 1997).
Dacă se instalează ciroza hepatică, supravieţuirea pacienţilor
după 10 ani este de 80%; în 20 ani, 40% din aceşti bolnavi vor prezenta
complicaţii legate de ciroză (hipertensiune portală, insuficienţă hepatică
cu encefalopatie cronică, carcinom hepatic).
Tabloul clinic în hepatita cronică C diferă mult. O parte din paci-
enţi nu prezintă semne sau simptome de boală hepatică, au valori nor-
male ale transaminazelor, iar la puncţia biopsie-hepatică (PBH) prezintă
un oarecare grad de hepatită (uşoară); aceştia au de obicei un prognos-
tic favorabil. La polul opus, sunt pacienţii cu hepatită cronică severă, cu
simptome prezente, cu ARN-HCV prezent în ser; sunt pacienţii care vor
dezvolta ciroză hepatică şi stadii finale de boală hepatică. Între aceste
două categorii se află majoritatea pacienţilor, care au câteva simptome
(sau sunt asimptomatici), transaminaze uşor sau moderat crescute; ei
au un prognostic incert.
Hepatita cronică cu virus C este considerată o boală silenţioasă.
Deşi date recente au arătat că în cursul bolii cronice pot fi infectate până
la 50% din hepatocite, simptomele din hepatita cronică C sunt uşoare,
nespecifice, intermitente şi numai în 10% din cazuri sunt legate de boala
hepatică. Ele includ: oboseala, de departe cel mai frecvent simptom
descris; disconfort în hipocondrul drept (descris de pacienţi ca ”dureri
hepatice”); greţuri; scăderea apetitului; dureri musculare şi articulare.
Examenul obiectiv în hepatita necomplicată poate fi normal sau
poate arăta hepatomegalie, de consistenţă mai fermă; unii pacienţi pot
prezenta steluţe vasculare şi eritroză palmară.
25
În ciroză, pe lângă oboseala care este mai accentuată, mai apar:
slăbiciune musculară, inapetenţă, greţuri, scădere ponderală, prurit, urini
hipercrome, edeme, ascită. În hepatita C, sunt întâlnite uneori manifes-
tări extrahepatice care pot constitui în 1-2% din cazuri singurele simpto-
me sau semne de boală. Astfel, cel mai frecvent apare crioglobulinemia,
care se manifestă prin: senzaţie de slabiciune, rash cutanat (sub forma
de purpură, mai ales la nivelul membrelor inferioare, vasculită, urticarie),
dureri articulare, afectare renală (edeme renale), neuropatie (dureri pe
traiectul nervilor), sindrom Raynaud, modificări serice (prezenţa de crio-
globuline, factor reumatoid, scăderea complementului seric). Alte mani-
festări extrahepatice pot fi: glomerulonefrita şi porfiria cutanata tardivă.
Tratament
Tratamentul se instituie pentru perioade lungi de timp şi se
bazează, în general, pe asocierea interferonului (mai nou interferonul
pegylat) cu ribavirină.
Ribavirina este un analog nucleozidic care prezintă in vitro o
anumită activitate antivirală contra unor virusuri ARN şi ADN, inclusiv
membrii din familia Flaviviridae. Deşi ribavirina nu poate interveni pentru
scăderea nivelului de ARN viral din ser, totuşi asocierea sa cu
interferonul conduce la un răspuns la terapia combinată mai susţinut
decît monoterapia cu interferon alfa (Kumagai, 2004). Cu toate acestea,
aprox. 50% dintre pacienţii cu genotip 1b nu au un răspuns adecvat la
tratament. S-a demonstrat recent că activitatea antivirală exercitată de
ribavirină poate fi explicată prin capacitatea polimerazei virale (codificată
de regiunea genomică NS5B) de a utiliza ribavirin trifosfatul şi a-l
încorpora în genomul viral, determinând mutaţii şi concentraţii mai
scăzute de virus infecţios.
Literatura de specialitate este legată şi de aprecierea rezultatelor
terapiei după o serie de markeri virali (încărcatura virală detectată la
variate perioade de timp de la iniţierea tratamentului), astfel:
26
Răspuns virusologic rapid (RVR) - scăderea încărcării virale
(ARN-HCV) sub 50UI/mL (limita detecţiei) după 4 săptămâni
de tratament combinat peginterferon+ribavirină.
Răspuns virusologic timpuriu (RVT) - scăderea încărcării
virale (ARN-HCV) cu peste 2 log10 (de 100 ori) după 12
săptămâni de tratament combinat peginterferon + ribavirină.
Răspuns virusologic complet (RVC) - scăderea încărcării
virale (ARN-HCV) sub 50UI/mL după 12 săptămâni de
tratament combinat peginterferon + ribavirină.
Răspuns virusologic parţial (RVP) - scăderea încărcării
virale cu peste 2 log10 (de 100 ori) după 12 săptămâni de
tratament combinat peginterferon + ribavirină, dar persistenţa
încărcării virale (ARN-HCV) detectabile după 24 săptămâni
de tratament combinat.
Răspuns virusologic lent (RVL) - scăderea încărcarii virale
(ARN-HCV) sub 50UI/mL (limita detecţiei) după 12 sau 24
săptămâni de tratament combinat.
Răspuns virusologic nul (NVR) - scăderea încărcării virale
(ARN-HCV) mai puţin de 100 ori după 12 săptămâni de
tratament combinat peginterferon + ribavirină.
Răspuns virusologic compromis (breakthrough) –
persistenţa încărcării virale (ARN-HCV) detectabile după ce
s-a obţinut RVC.
Recăderea - recurenţa încărcării virale după terminarea
tratamentului, deşi în timpul curei s-a obţinut RVC.
Răspuns virusologic susţinut (SVR) - menţinerea
permanentă a încărcării virale (ARN-HCV) sub 50UI/mL
(limita detecţiei) chiar şi fără tratament.
RVR survine la 15% dintre pacienţii infectaţi cu genotipul 1 şi la
66% din cei infectaţi cu genotipurile 2/3. Aceşti pacienţi au evoluţia cea
mai bună înregistrând în 90% din cazuri SVR, dacă menţin tratamentul
27
cel puţin 48 săptămâni în cazul infecţiei cu genotipul 1 sau cel puţin 48
săptămâni în cazul infecţiei cu genotipul 2/3.
RVR este un predictor mai bun decât RVT pentru perspectiva
atingerii SVR. Absenţa RVT este considerată un element consistent
pentru lipsa de răspuns (RVN) şi un criteriu pentru stoparea terapiei
combinate. Dacă sub tratament nu se obţine în 24 săptămâni decât o
scădere moderată a încărcării virale trebuie apelat la o altă schemă
terapeutică.
Reculul şi recăderea semnifică reapariţia încărcării virale după
un interval în care ARN-HCV nu a fost detectabil. Reculul se referă la
detectarea încărcării virale după un interval în care ARN-HCV nu a fost
detectat în repetate rânduri; recăderea înseamnă reapariţia încărcării vi-
rale după terminarea tratamentului. Cel mai frecvent, cauza acestor epi-
soade este întreruperea prematură a medicaţiei sau lipsa de continuitate
în administrararea dozelor. Întreruperea medicaţiei înainte de 48 săptă-
mâni conduce la o rată a recăderilor de 12%, în timp ce un tratament
dus până la capăt nu este grevat decât de 3% recăderi. Dozele sub-
optimale de interferon sau ribavirină sunt, de asemenea, cauze recunos-
cute ale reculului şi recăderilor.
Rezumând, prin folosirea testelor de genotipare se poate face un
prognostic al evoluţiei post-terapeutice a pacientului, iar prin detecţia
RVR se poate aprecia valoarea predictivă negativă a încărcării virale
ARN-HCV din săptămâna 4, justificând astfel întreruperea timpurie a tra-
tamentului. Monitorizarea virusologică timpurie poate, de asemenea,
limita toxicitatea şi costurile inutile ale tratamentului.
Diagnosticul pozitiv de infecţie cu virus hepatitic C
Teste serologice
În practica curentă, depistarea infectiei cu HCV începe cu
evidenţierea prezenţei Ac anti-HCV (prin teste serologice). Anticorpii pot
fi detectaţi în plasmă sau ser prin metode EIA (Enzyme Immuno Assay)
28
de generaţia a 3-a, care evidenţiază un amestec de anticorpi dirijaţi îm-
potriva unor epitopi de pe HCV. Se folosesc antigene recombinante pen-
tru a captura anticorpii circulanţi. Prezenţa acestor anticorpi este eviden-
ţiată prin anticorpi anti-HCV care participă la declanşarea unei reacţii en-
zimatice ce determină colorarea substratului. Raportul între densitatea
optică a probei şi densitatea optică de control este direct proporţional cu
nivelul anticorpilor din plasmă sau ser. Specificitatea testelor EIA de ge-
neraţia a 3-a este peste 99%. Sensibilitatea metodei este mai greu de
apreciat, deoarece nu există un standard de aur, dar metoda este foarte
bună pentru pacienţii imunocompetenţi. De asemenea, metoda este
automatizată şi poate fi folosită pentru un volum mare de teste.
Deşi testele de generaţia a 3-a folosite în prezent sunt mai sensi-
bile şi mai specifice decât cele folosite înainte, sunt totuşi posibile rezul-
tate fals-pozitive sau fals-negative. Deseori, este necesară confirmarea
infecţiei prin căutarea ARN viral în ser (cantitativ sau calitativ) sau prin
RIBA (Recombinant Immunoblot Assay). Astfel, deşi anticorpii sunt pre-
zenţi la aproape toţi pacienţii la o lună de la debutul bolii acute (la peste
8 săptămâni de la infecţie), la unii bolnavi acestia pot să apară mai târ-
ziu, chiar până la 3 luni de la debutul bolii, virajul serologic de la negativ
la pozitiv constituind un criteriu de diagnostic pozitiv de infecţie acută cu
HCV. În aceste cazuri care nu prezintă Ac anti-HCV, dacă totuşi se sus-
pectează infecţia acută cu virus C, se caută ARN-HCV, care apare în
primele 1-2 săptămâni de la infecţie. O altă situaţie de reacţie fals nega-
tivă apare în cazul pacienţilor imunodeprimaţi (infecţie HIV, hemodializa-
ţi). Dacă la aceştia apare o boală hepatică a cărei etiologie nu este cla-
ră, se recomandă căutarea infecţiei cu HCV prin evidenţierea ARN-HCV.
Testele de tip RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) numite şi
Western Blot sunt teste complementare ce pun în evidenţă prezenţa
unor anticorpi anti-HCV în serul sau plasma pacienţilor care prezintă
reacţii pozitive pentru Ac anti-HCV la EIA, în absenţa ARN-HCV. Aceste
teste diferenţiază reacţiile fals-pozitive de infecţiile cu virus C vindecate.
29
Pentru Riba-2 şi Riba-3 se folosesc 4 antigene recombinante: 5-1-1(NS-
4), c100-3(NS-4), C33C(NS-3), C22C(NS-3). Testele sunt considerate
pozitive când pun în evidenţă minimum două proteine şi indeterminate
când evidenţiază o singura proteină. În cazul unei infecţii cu HCV vinde-
cate, cu persistenţa anticorpilor, RIBA va fi pozitiv, pe când în cazul unei
reacţii EIA fals-pozitive RIBA va fi negativă. Situaţia de indeterminare
necesită supravegherea în continuare prin ARN-HCV.
Alte teste serologice. Într-un studiu efectuat în China şi publicat
în 2001 (Scand. J. Immunol. 54, 409-413, 2001 - Analysis of HCV Isoty-
pe complexes by a novel Immuno-capture RT-PCR method, X.X.Peng,
H.Zhu şi col.) s-a arătat că HCV poate circula în sânge fie liber, fie legat
în complexe circulante virion-imunoglobulină, care pot fi puse în evi-
denţă prin teste specifice. Toate tipurile de Ig pot forma complexe virale,
dar nu este clar ce rol joacă fiecare în eliminarea virusului şi nici semnifi-
caţia clinică a lor. În acest studiu s-au detectat HCV-IgM în proporţie de
66,7%, HCV-IgG în proporţie de 51% şi HCV-IgA în proporţie de 62,7%.
Determinarea serologică a genotipului e posibilă prin căutarea
directă a epitopilor specifici pentru genotip. Metoda Murex HCV de sero-
tipare identifică tipurile 1-6 de HCV, dar nu poate diferenţia subtipurile.
Pot apare reactivităţi serologice complexe prin prezenţa mai multor tipuri
de virus la acelaşi pacient, prin reactivitate încrucişată sau prin vindeca-
rea după infecţia cu un genotip şi persistenţa viremiei cu alt genotip.
Determinarea ARN-HCV
Determinarea calitativă se poate face prin metode PCR (Polyme-
rase Chain Reaction) sau TMA (Transcription Mediated Amplification).
Prin aceste metode, ARN-HCV este extras şi transformat prin transcriere
inversă într-un lanţ dublu-catenar complementar de ADN (cADN). Acesta
este procesat printr-o reacţie enzimatică ciclică, determinând formarea
unui mare număr de copii. Prin PCR, se sintetizează còpii de ADN dublu
catenar, iar prin TMA còpii de ARN monocatenar.
30
Tabel I. Diverse sisteme de evaluare a viremiei HCV în funcţie de
producător şi metodă.
Metodă Fabricant Tehnică
Limită inf.
detecţie
(UI/mL)
Determinare
cantitativă
(UI/mL)
Amplicor HCV
v2.0
Roche
Molecular
Systems
RT-PCR
manual 50
Cobas Amplicor
HCV v2.0
Roche
Molecular
Systems
RT-PCR
semi-
automat
50
HCV Versant
RNA calitativ
Bayer Health
Care
TMA
manual 10
Amplicor HCV
Monitor v2.0
Roche
Molecular
Systems
RT-PCR
manual 600 600-500.000
Cobas Amplicor
HCV Monitor
v2.0
Roche
Molecular
Systems
RT-PCR
semi-
automat
600 600-700.000
LCx HCV RNA
cantitativ
Abbott
Diagnostic
RT-PCR
semi-
automat
25 25-2.630.000
Versant HCV
RNA Bayer H.C.
bDNA semi-
automat 615 615–7.700.000
Cobas Taq Man
HCV
Roche
Molecular
Systems
real time
PCR 15 23-1.400.000
Abbott Real
Time
Abbott
Diagnostic
real time
PCR 12 12–100.000.000
Determinarea calitativă pune în evidenţă cantităţi mici de virus.
Pragul minim de pozitivitate acceptat în general pentru testele calitative
este de 50UI/mL şi are o sensibilitate egală pentru toate genotipurile.
Există şi metode mai sensibile care pun în evidenţă cantităţi foarte mici de
virus, dar limita inferioară variază în funcţie de metoda (Tabel I).
31
Determinarea cantitativă a ARN-HCV se face prin tehnici de
amplificare a ţintei (PCR competitiv sau real time) sau a semnalului prin
bDNA(branched DNA) (Tabel I). Prin real time PCR, fiecare ciclu de am-
plificare duce la emiterea unui semnal fluorescent, iar numărul de sem-
nale din ciclu este proporţional cu viremia din proba iniţială.
Genotiparea HCV
Deoarece distribuţia geografică, evoluţia bolii sau răspunsul la
terapie sunt legate de diferite genotipuri de HCV, identificarea corectă a
acestora constituie un test clinic şi epidemiologic. Metoda de genotipare
de referinţă este secvenţierea unor regiuni genomice amplificate prin
PCR, urmată de analiză filogenetică. În acest mod se pot identifica noi
tipuri şi subtipuri virale. Se utilizează în mod curent pentru secvenţiere
regiunile 5’ UTR, core, E1 şi NS5, avînd grade de consevare diferite.
Datorită faptului că, în general, secvenţierea în întregime a geno-
mului este dificilă, iar metoda este destul de costisitoare, au fost identifi-
cate metode rapide de determinare a genotipurilor. Acestea se bazează
pe amplificarea genică in vitro (PCR) şi pe detectarea anticorpilor speci-
fici de tip dar presupun cunoaşterea prealabilă a secvenţelor. Genotipa-
rea cu primeri specifici de tip a fost utilizată prima oară de Okamoto et
al. (1992), în regiunea core. Acest sistem s-a dovedit lipsit de sensibili-
tate şi specificitate. Unele teste bazate pe hibridizarea ADN au fost apli-
cate în cazul kiturilor comerciale, cum este InnoLipa, dar sunt puţin dis-
criminatorii în privinţa unor subtipuri (exemplu între 1a şi 1b sau între 2a
şi 2c) deoarece vizează regiunea 5’UTR, cu un grad înalt de conservare.
În practica clinică, genotipul poate fi determinat prin kituri comerciale ce
analizează direct secvenţele regiunii non-codante 5' (Trugene 5'NC HCV
genotyping kit, Bayer) sau prin analiza hibridizării inverse, folosind teste
specifice de genotip (INNO-LiPA HCV II Immunogenetics sau Versant
HCV Genotyping Assay Bayer).
32
Alte sisteme fac apel la utilizarea enzimelor de restricţie pentru
determinarea polimorfismului lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP).
În această metodă, un fragment de ADN amplificat prin PCR este dige-
rat cu endonucleaze de restricţie care recunosc situsuri specifice de cli-
vare pentru fiecare genotip (Xavier, 1998). Prin restricţia unor fragmente
PCR, amplificate în regiuni ca 5’ UTR sau NS5, se obţin fragmente de
diferite lungimi care se vizualizează în gel de agaroză.
Deşi toate aceste metode sunt capabile să identifice corect majori-
tatea genotipurilor, numai secvenţierea poate discrimina între diferitele
subtipuri. Secvenţele obţinute sunt aliniate şi supuse analizei filogenetice.
Metodele de filogenie moleculară se bazează pe ipoteza conform căreia
asemănările între 2 izolate sunt cu atât mai numeroase cu cât între ele
există legături de înrudire mai strânse. După compararea secvenţelor de
acizi nucleici se aplică programe informatice bazate pe modele matemati-
ce complexe care permit reconstituirea filogeniei secvenţelor (Felsen-
stein, 1993). În general, se utilizează 3 categorii de metode: analiza de
parcimonie, analiza asemănării maxime şi analiza de distanţă. Rezultatele
sunt vizualizate grafic ca arbori filogenetici în care lungimea braţelor este
proporţională cu distanţa observată între secvenţe. Nici una dintre aceste
metode nu este perfectă, fiind necesară testarea mai multor algoritmi.
Pentru aprecierea robusteţii arborilor şi validarea lor se efectueză analize
statistice (analiza eşantionării sau bootstrap), care vor estima, printr-o ex-
tragere aleatorie a secvenţelor studiate, topologia arborelui obţinut, expri-
mată ca numere la încrengătura braţelor (Hillis, 1993).
Genotiparea se foloseşte pentru studii epidemiologice în care
este necesară determinarea exactă a subtipurilor şi variantelor virale
pentru identificarea focarelor şi trasarea infecţiilor.
33
Rezultate
1. Realizarea unei bǎnci de seruri bine caracterizate şi definirea
criteriilor de selecţie a pacienţilor şi a serurilor în cadrul
consorţiului
În Institutul Cantacuzino a fost constituită o bancă de seruri
bine caracterizate din punct de vedere virusologic, cu concursul
INCDMIC şi al partenerilor la proiect (Spitalul Clinic de Boli Infecţioa-
se şi Tropicale „Dr. Victor Babeş” şi ISP Timişoara): un lot de seruri
HCV pozitive (400) şi un lot martor de seruri negative pentru virusuri he-
patitice (200). Pacienţii provin din zona de sud (inclusiv Bucureşti) şi cea
de vest a României. Studiile realizate au fost retrospective (incluzând
probe din serotecile fiecărui institut) si prospective, care au presupus
selectarea tuturor pacienţilor după criteriile stabilite în cadrul consorţiu-
lui. Probele din banca de seruri au fost înregistrate informatic. Banca de
seruri constituită în Institutul Cantacuzino şi Institutul de Virusologie a
fost analizată din punct de vedere molecular privind distribuţia genotipu-
rilor, a variantelor virale şi a recombinanţilor, precum şi pentru dezvolta-
rea noului sistem ELISA de identificare a anticorpilor anti-core+1 in ser.
Institutul de Virusologie „Ştefan S. Nicolau” (P1) a selectat
50 de pacienţi care prezentau sau nu semne clinice de afectare hepatică
şi, corespunzător, un lot de control format din 55 de pacienţi anti-HCV
negativi (vârstă medie 53,8 ± 2,8 ani), fără semne clinice de hepatită,
care s-au prezentat pentru testări de rutină pentru diferite afecţiuni în
Institutul de Virusologie „Ştefan S. Nicolau”.
Spitalul Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor
Babeş” (P2) a selectat probe (200) cu serologia HCV-pozitivă în ELISA
şi RIBA, încărcarea virală cunoscută, evaluarea biologică şi histologică a
pacientului, factori de risc.
Institutul de Sănătate Publică Timişoara (P4) a trimis 100 se-
ruri pozitive, pozitive cu dublă infecţie sau cu rezultate indeterminate,
34
precum şi seruri negative (pentru orice fel de agent infecţios), pentru
constituirea lotului martor. Pentru acest proiect au fost selectaţi lucrători
în domeniul sanitar, pacienţi cu hepatopatii, pacienţi cu ITS (infecţii cu
transmitere sexuală) şi afecţiuni dermatologice şi pacienţi cu afecţiuni
hematologice.
2. Stabilirea algoritmului de diagnostic virusologic pentru
prezenţa markerilor infecţiei cu virusuri hepatitice cu
transmitere parenterală
Institutul de Virusologie „Ştefan S. Nicolau” a elaborat un
chestionar cuprinzând informaţii despre caracteristicile socio-demografi-
ce ale pacienţilor, factorii de risc pentru infecţia cu HCV, datele clinice,
biochimice şi virusologice care servesc la selecţia pacientilor inrolati in
studiu pe toata durata proiectului. Acest chestionar a fost analizat de că-
tre toţi partenerii şi a fost elaborată versiunea finală după ce Institutul
de Sănătate Publică Timişoara (P4) a adus cîteva completări.
S-a stabilit următorul algoritm de diagnostic: serurile vor fi tes-
tate pentru prezenţa markerilor de infecţie cu HBV: AgHBs, AgHbe, an-
ticorpi anti-HBc şi anticorpi anti-HBs, utilizând truse ELISA comerciale.
Toate serurile vor fi testate initial pentru anticorpi totali, ulterior cei anti-
HBc-pozitivi vor fi evaluaţi pentru prezenţa antigenului HBs, surprinzând
astfel ponderea hepatitelor B cronice, iar cei cu AgHBs pozitivi şi pentru
antigenul HBe, ca marker de infectivitate virală ridicată şi hepatită
cronică agresivă. Pacienţii cu AgHBs-pozitiv vor fi testaţi pentru
anticorpii anti-HDV, având în vedere că virusul hepatitei delta (HDV)
poate coinfecta sau suprainfecta doar pacienţii cu hepatită acută şi, res-
pectiv, cronică HBV şi antigen HBs-pozitivi. HDV este un virus defectiv
care necesită prezenţa AgHBs pentru a se putea replica.
În continuare prezentăm un exemplu din chestionarul completat
pentru 52 de pacienţi de către ISP Timişoara:
35
CHESTIONAR ISP TIMIŞOARA
CODUL PROBEI = 2748/2005
DATELE PERSONALE ALE PACIENTULUI
Iniţialele numelui M.V
Vârsta 35 ani Sex (M/F) M
Judeţul de domiciliu Mediu (U/R):
Instituţionalizat? Da Penitenciar Timişoara
COMPORTAMENTE ŞI RISCURI
Consum de alcool? Nu Ocazional Da
Consum în comun periuţă de dinţi/aparat de ras? Nu
Tatuaje, cercei, găuri pentru cercei? Nu De când?-
Manichiura, pedichiura sau bărbierit la salon specializat? Nu
Consum de droguri i.v.? Da De cand?-
Comportament sexual cu risc? Nu BTS Nu
Contact familial/de colectivitate/profesional cu Hepatite Virale? Nu
ANTECEDENTE
Tratamente dentare Nu Tratamente parenterale Nu
Intervenţii chirurgicale Nu
Transfuzie de sange Nu
Tratament cu factori de coagulare Nu
Dializă renală Nu
Transplant organe/ţesuturi Nu
Vaccinat anti-HBV Nu
Coinfecţii: HBV Nu HBV-HDV Nu HIV Nu
DIAGNOSTIC = UTILIZATOR DE DROGURI
PBH Nu
DATE DE LABORATOR
Transaminaze Nu
Serologie HCV ELISA POZITIV DO/CO = 3,07 / 0,361
Western Blot profil benzi ____________
ARN HCV iniţial___netestat________nedetectabil_________ nr UI/ml ____________
Pacient tratat?_________
ARN HCV la 3 luni după tratament__________
ARN HCV la 6 luni de la oprire tratament_____ _________
Genotip____3a_________
36
3. Teste biochimice
Determinările biochimice s-au efectuat cu reactivi Human pe
analizor semiautomat pentru determinări biochimice Humalyzer Junior.
Nivelul ALT seric (valori normale de referinţă 0 - 42UI/L) a fost conside-
rat cel mai reprezentativ. Rezultatele au fost exprimate ca raport al ALT
(rALT), definit ca raportul dintre valoarea ALT a probei şi valoarea maxi-
mă normală acceptată pentru testul utilizat, astfel încât rALT > 1 apare
numai în cazul pacienţilor cu valori ale transaminazemiei ALT crescute.
4. Testarea serologică a probelor (testarea anticorpilor anti-HCV
prin tehnici imunoenzimatice – ELISA şi teste de confirmare –
imunoblot; testarea anticorpilor anti-HBc, anti-HBs)
Din totalul probelor testate de P1, indiferent de rezultatele la EIA,
3,7% au fost indeterminate la Western Blot (WB). Nici o astfel de probă
nu s-a înregistrat la pacienţii cu EIA negativă. Dintre probele cu reactivi-
tăţi mari în EIA şi transaminaze serice crescute, majoritatea - 97.6% - au
fost WB pozitive, una singură având profil WB indeterminat. Concordan-
ţa dintre rezultatul EIA şi cel WB a fost mult mai mică în cazul probelor
cu reactivităţi scăzute. Un test imunoblot ce prezintă reactivitate pentru
banda core sau NS3, reprezintă cu mare probabilitate un rezultat anti-
HCV real pozitiv şi nu o reactivitate nespecifică. În plus, la majoritatea
acestor pacienţi s-a evidenţiat prezenţa viremiei, în special cei cu factori
de risc identificabili pentru infecţia HCV, sau cu semne clinice de hepa-
tită. În aceste condiţii se impune reevaluarea necesităţii testelor de
confirmare in diagnosticul infecţiei HCV.
Testarea de triaj (screening) a fost efectuată în compartimentul de
serologie al Laboratorului de analize medicale din SVB, cu teste ELISA
certificate pentru diagnosticul in vitro, în varianta semiautomată sau au-
tomată, utilizând sistemul Miniswift, Tecan, Austria. Alternativ, o serie de
teste au fost efectuate cu analizorul de chemiluminiscenţă Access,
BioRad, în care designul imunoenzimatic al testului este similar cu cel al
37
testului ELISA, inclusiv sub aspectul selecţiei antigenelor de captură a
anticorpilor anti-HCV. În faza solidă a testelor imunoenzimatice de triaj
(ELISA şi chemiluminiscenţă) sunt incluse antigene ale HCV, şi anume:
proteine recombinante din regiunile NS3, NS4 şi din capsidă. Monolisa
HCV Ag-Ab Ultra, BioRad, un test utilizat în această perioadă, conţine în
faza solidă şi un anticorp monoclonal anti-capsida HCV, pentru sporirea
sensibilităţii în fereastra serologică. Creşterea sensibilităţii testului de
triaj se face în detrimentul specificităţii, astfel ca in unele cazuri cu
reactivitate de zona gri sau slab pozitiva este vorba de reactivitati false,
nespecifice infectiei HCV.
Confirmarea serologică a fost efectuată cu kit RIBA de diagnostic
in vitro, DeciScan, BioRad. Toate kiturile au fost utilizate conform ins-
trucţiunilor producătorilor. În faza solidă a RIBA sunt incluse proteina de
fuziune GST, şi antigene din C1, C2, NS3 şi NS4. Criteriile de diagnostic
ale testului de confirmare serologică RIBA sunt după cum urmează: re-
zultatul pozitiv este dat de prezenţa a cel puţin 2 benzi corespunzând
unor gene diferite (capsidă, NS3, NS4) cu intensitate de minim 0,5+; re-
zultatul negativ este dat de absenţa oricărei benzi specifice HCV; rezul-
tatul indeterminat este dat de o singură bandă din orice genă sau două
benzi de capsidă.
Pretratamentul SMARTubeTM are la baza principiul stimulării in vitro
şi accelerării producţiei de anticorpi de către limfocitele B sensibilizate
de contactul in vivo cu antigene specifice HCV. În esenţă, acest pretra-
tament are ca scop declarat de producător, reducerea fereastrei serolo-
gice fiziologice şi, în subsidiar, minimalizarea reactivităţilor nespecifice
obişnuite în testarea serologică de triaj HCV. Sângele prelevat de la su-
biectul investigat este anticoagulat cu heparină pentru a permite cultura
in vitro pentru 3-5 zile, în prezenţa unui mediu conţinând un mitogen
pentru limfocitele T şi B. O limită a metodei este că testarea se poate
efectua numai cu sânge prelevat proaspăt (de maximum 24 ore). Pe
scurt, 1mL sânge anticoagulat cu heparină este amestecat cu 2mL me-
38
diu de pretratament într-un tub de cultură celulară (capac cu posibilitate
de schimb gazos cu mediul exterior). Tubul astfel preparat este transfe-
rat in incubatorul de 37˚C în atmosferă umedă şi 5% CO2. După 3-5 zile
de incubare, tuburile de cultură celulară sunt centrifugate pentru a sepa-
ra masa celulară de supernatantul culturii, un amestec 1:5 de plasmă,
prezumtiv îmbogăţită în anticorpi şi mediu de pretratament mitogenic.
Acest supernatant este testat pentru prezenţa anticorpilor anti-HCV prin
tehnici serologice clasice de triaj. În acest moment intervine cel de al
doilea dezavantaj al metodei, factorul de diluţie indus de mediul de pre-
tratament, 1:5. Tehnicile serologice de triaj care nu permit compensarea
acestei predilutii sunt susceptibile de a scădea semnificativ sensibilitatea
metodei in ansamblul ei, pretratament + test serologic de triaj.
Au fost evaluate 15 probe de sânge provenind de la 13 cazuri de ex-
puneri la HCV (chirurgical, cu şi fără transfuzie de sânge, sau profesio-
nal). Unsprezece dintre aceste cazuri au avut serologie HCV negativă
prin amblele metode de testare serologică de triaj, cu şi fără pretrata-
ment SMARTube. Două cazuri au realizat seroconversie HCV in cursul
spitalizării în SVB. În ambele cazuri, seroconversia HCV a survenit după
o intervenţie chirugicală cu transfuzie de sânge într-un caz, şi fără trans-
fuzie de sânge, în celălalt caz, în context de citoliză hepatică acută cu
viremie evidenţiată în ambele cazuri.
Pretratamentul SMARTubeTM nu a permis semnalarea seroconversi-
ei HCV în desfăşurare, deci această metodă nu şi-a dovedit eficacitatea
pentru reducerea ferestrei imunologice.
Corelaţie între profilul serologic şi valorile transaminazelor
serice. Pe baza reactivităţii anti-HCV (DO/CO din testul EIA) şi a rALT
pacienţii evaluaţi de P1 au fost împărţiţi în următoarele grupuri:
Grupul A: pacienţi anti-HCV pozitivi, cu reactivitate înaltă şi
transaminaze crescute (DO/ CO ≥ 3, rALT >1).
Grupul B: pacienţi anti-HCV pozitivi, cu reactivitate slabă şi
transaminaze normale (1 ≤ DO/ CO < 3, rALT < 1).
39
Grupul C: pacienţi anti-HCV pozitivi, cu reactivitate slabă şi
transaminaze crescute (1 ≤ DO/ CO < 3, rALT > 1).
Grupul D (control): pacienţi anti HCV negativi (DO/ CO < 1),
indiferent de rALT.
(DO/CO - valoarea densităţii optice a probei raportată la cut off în testul
imunoenzimatic; rALT- valoarea alanilaminotransferazei serice raportată
la limita normală maximă admisă de test.)
Este de remarcat că 11.5% dintre pacienţii seropozitivi HCV au
transaminazemia ALT în limite normale, infecţia HCV fiind recunoscută
prin nivelul fluctuant al transaminazelor serice. De asemenea, se obser-
vă că în grupul pacienţilor seronegativi HCV există un procent de 3.6%
care prezintă niveluri crescute ale ALT, datorat probabil altor cauze de
hepatită cronică nonvirală (alcoolică, autoimună, medicamentoasă etc.)
ce modifica markerii biochimici independent de prezenţa infecţiei HCV.
Screeningul anti HCV s-a realizat printr-un test imunoenzimatic
comercial de generaţia a 3a: HCV – Ab, DIA. PRO., Dia Pro Diagnostics
Bioprobes, conform protocolului producătorului. Pentru confirmarea
testelor imunoenzimatice au fost utilizate teste imunoblot de generaţia
a 3a: Deciscan HCV PLUS –BIORAD.
5. Metode moleculare de evaluare cantitativă a ARN-HCV
plasmatic şi genotipare cu kituri comerciale
Evaluarea cantitativă a ARN HCV plasmatic s-a realizat prin RT
PCR cu un kit comercial AMPLICOR HCV MONITOR ROCHE vs. 2.0.
Pentru prelucrarea statistică a datelor Institutul de Virusologie
a utilizat testul Fisher exact, disponibil la GraphPad InStat, o valoare p<
0,05 fiind considerată semnificativă din punct de vedere statistic.
Evaluarea cantitativă a ARN-HCV plasmatic şi determinarea
valorii predictive a profilului testelor de confirmare de tip Western
Blot (WB) pentru prezenţa replicării virale active.
40
Pe scurt, 100µL ser sau control intern sunt supuşi unei proceduri
de extracţie ARN, în urma căreia se obţine 1mL suspensie conţinând
ARN din serul de testat şi serurile control. Extracţia ARN este o proce-
dură manuală, care presupune liză, precipitare şi spălarea ARN. Fiecare
sesiune de lucru include un set de 3 seruri control: negativ, pozitiv mic,
pozitiv mare. Obţinerea unor rezultate conforme lotului de fabricaţie indi-
cat de producător validează rezultatele obţinute pentru serurile de testat.
Extracţia este urmată de amplificare şi detecţie, operaţii complet auto-
matizate, efectuate de analizorul Cobas Amplicor, Roche. Rezultatele
sunt exacte în intervalul de linearitate 600 – 700.000UI/mL. Valorile mai
mari de 700.000UI/mL au un grad progresiv de eroare, motiv pentru
care, în intenţia de a obţine valori exacte, este recomandată retestarea
serului într-o nouă sesiune de lucru, procesând serul într-o diluţie de
1:100. Pentru evitarea repetărilor numeroase, în Laboratorul de Biologie
Moleculară al SVB, serurile de la pacienţi simptomatici, aflaţi la prima
evaluare a încărcarii virale, sunt testati in dilutie 1:10. Intervalul de
linearitate al determinărilor devine 6.000 – 7.000.000UI/mL.
Evaluarea cantitativă a ARN-HCV plasmatic de către P1 a arătat
că RT-PCR a fost pozitiv la 92,7% din pacienţii cu reactivitate mare în
testele imunoenzimatice, comparativ cu numai 18,2% la pacienţii cu
DO/CO cu valori între 1 şi 3, indiferent de nivelul transaminazelor serice
(p<0,05). Una din problemele cele mai controversate legate de diagnos-
ticul infecţiei HCV este interpretarea valorii rezultatelor indeterminate în
testele imunoblot, cu apariţia unică a diferitelor benzi antigenice. La
11,2% din determinări s-au obţinut rezultate divergente folosind RT-PCR
şi WB în paralel. Cea mai frecventă combinaţie a fost WB pozitiv şi
ARN-HCV negativ, respectiv în 7.4% din cazuri. Aceasta indică faptul că
infecţia HCV serologic confirmată nu este obligatoriu activă, RT-PCR ră-
mânând singurul test sensibil şi specific în detectarea prezenţei viremiei
şi prin aceasta, a pacienţilor potenţial capabili de a transmite infecţia
HCV. Institutul de Virusologie (P1) constată că o mai bună corelare a
41
RT-PCR şi WB s-a observat la pacienţii cu reactivitate mare în EIA
(DO/CO > 3), cele două teste dând rezultate similare între ele la 90,2%
din pacienţi.
În Laboratorul de Biologie Moleculară al SVB a fost utilizat şi
testul TaqMan de determinare a încărcăturii virale HCV prin tehnologie
real-time PCR. În acest scop, am utilizat un kit cu autorizare de utilizare
în diagnosticul in vitro (marcat IVD), produs de Roche Diagnostics, cu
extracţie manuală şi amplificare şi detecţie real-time pe analizorul Cobas
TaqMan 48. Această metodă prezintă următoarele avantaje în raport cu
metoda de PCR clasic, executată pe Cobas Amplicor: sensibilitate mult
mai bună, cu prag de detecţie la 28UI/mL, linearitatea cuantificării până
la 109 UI/mL, condiţii de biosecuritate sporită în procedurile de extracţie
şi amplificare-detecţie, timp de lucru sensibil mai mic. Dezavantajele
metodei sunt: consumul mai mare de produs biologic (500µL în loc de
100µL) şi obţinerea unui volum mic de ARN eluat din procesul de extrac-
ţie (70µL în loc de 1mL), care nu permite repetarea detecţiei în cazul
unui eşec de amplificare şi/sau utilizarea restului de material extras în
procedura de genotipare – secvenţiere.
Genotiparea tulpinilor virale a fost realizată de către P1 cu o
trusa comercială, VERSANT™ HCV Genotype 2.0 Assay, Innogenetics,
care utilizează reacţia Line Probe Assay, pentru evidenţierea profilului
specific unui genotip prezent într-un amplicon obţinut după RT-PCR cu
primeri specifici secvenţei virale 5’NTR şi hibridizare cu sonde molecula-
re cu specificitate pentru regiuni conservate din cadrul genotipurilor şi
subtipurilor.
6. Studii epidemiologice
S-a stabilit să se facă două tipuri de studii :
1) studiu retrospectiv (din banca de seruri a fiecăruia);
2) studiu prospectiv luând în calcul (în măsura posibilităţilor):
seruri cu încărcătură virală cunoscută (toate gradele de
viremie);
42
seruri cu serologie netă, dar şi cu serologie la limita
detecţiei, cu reactivitate incompletă în imunoblot;
analiza serurilor pentru cinetica viremiei înainte şi după
tratamentul pacienţilor;
date epidemiologice (pacienţi din aceeaşi familie, aceeaşi
zonă, surse posibile de infecţie, stadiul bolii etc.);
serologie pozitivă, dar viremie nedetectabilă.
Serurile de la SVB şi ISP Timişoara au fost trimise la Institutul
Cantacuzino (analiză moleculară; dezvoltarea unui sistem ELISA
core+1) şi la Institutul de Virusologie pentru completarea unor investiga-
ţii (WB, genotipare cu kituri comerciale, ELISA core+1).
Analiza factorilor de risc pentru achiziţia infecţiei cu HCV
evaluaţi de Spitalul V. Babeş (prin chestionar)
1. Transfuzie de sânge 33,8%
2. Transplant organe/ţesuturi 0,15%
3. Primitor factori de coagulare 0,00%
4. Dializă renală 0,15%
5. Intervenţii chirurgicale 70,4%
6. Tratamente stomatologice 78,9%
7. Tratamente injectabile multiple ( 5) 57,7%
8. Droguri pe cale IV 2,8%
9. Contact sexual cu partener cunoscut HCV+ / cu parteneri multipli/
boli cu transmitere sexuală în antecedente 8,5%
10. Lucru în mediu spitalicesc/dispensar/ laborator 8,5%
11. Tatuaje 4,2%
12. Găuri de cercei sau alte piercing-uri 12,7%
13. Utilizare frecventă a serviciilor comerciale pentru manecură,
pedicură sau barbierit 21,1%
14. Utilizarea în familie, în comun, a uneia/mai multora: periuţă de dinţi,
aparat de ras, aparat de epilat, forfecuţe, unghiere 9,9%
43
Conform analizei UMF unul dintre cei mai importanţi factori de
risc pentru achiziţia infecţiei HCV îl reprezintă intervenţiile chirurgicale
(74,35%), realizate în cea mai mare parte (87,3%) înainte de 1990, ceea
ce sugerează rolul manevrelor iatrogene, fapt susţinut şi de tipul patolo-
giei caracteristice sexului feminin şi de adresabilitatea crescută a femei-
lor către medic. În lotul studiat, pacienţii HCV pozitivi au în antecedente
mai frecvent tratamente injectabile multiple (61,54%), tratamente
stomatologice invazive (74,35%) şi transfuzii de sânge (30,76%).
Majoritatea pacienţilor infectaţi (85,6%) prezintă factori de risc intricaţi,
cei mai mulţi asociind chiar trei sau patru factori, ceea ce indică faptul că
în România numărul manevrelor parenterale administrate înainte de
1989 era extrem de crescut. De sesizat că, în România calea de trans-
mitere iatrogenă este prevalentă, în timp ce în ţările dezvoltate consu-
mul de droguri injectabile este mai frecvent implicat.
Din aplicarea chestionarului, am observat o serie de corelaţii
între constantele biochimice şi severitatea leziunilor hepatice. Sta-
diile histopatologice ale leziunilor hepatice reprezintă factorul determi-
nant al progresiei hepatitei cronice C, fiind extrem de importante în iniţie-
rea şi conducerea tratamentului bolii. Dar puncţia-biopsie este o mane-
vră invazivă, cu numeroase reacţii adverse, în timp ce determinarea
markerilor biochimici este accesibilă şi lipsită de risc pentru pacient.
Constantele biochimice pe care le-am luat în studiu sunt transaminaza
glutamic-oxalacetică (TGO/AST), transaminaza glutamic-piruvică
(TGP/ALT), gamma-glutamil transpeptidaza (GGT), bilirubina totală,
alpha 2-macroglobulina, alpha 2-globulina, apolipoproteina A1, beta glo-
bulina, gamma globulina şi albumina. Aceste determinări au fost realiza-
te pe analizorul semiautomat Humalyzer Junior, cu reactivi Human. De-
terminările biochimice s-au efectuat pe plasma proaspăt recoltată în
aceeaşi zi cu biopsia. Stadiile histopatologice au fost apreciate după cla-
sificarea METAVIR la 33 de pacienţi diagnosticaţi cu infecţie cronică
cu HCV (fibroză: absentă-F0, fibroză portală stelată fără septuri-F1, fi-
44
broză portală cu septuri-F2, fibroză şi septuri dar fără ciroză-F3 şi ciroză-
F4; activitatea necroinflamatorie: A0-absentă, A1-activitate minimă, la pe-
riferia unor spaţii porte, A2-activitate moderată la periferia unor spaţii
porte sau focală la periferia tuturor spaţiilor porte, A3-activitate severă).
Pacienţii au fost incluşi în 3 mari grupuri, în funcţie de severitatea
afectării hepatice: (a) fără leziuni histologice importante (A<2 şi F<2)–
57,6%; (b) cu leziuni histologice grave (A>2 sau F=2 sau ambele)–
27,3%; (c) leziuni avansate cu septuri fibrotice numeroase sau ciroză
(F3, F4)–15,1%. Fibroza hepatică şi activitatea necro-inflamatorie sem-
nificative clinic (F2, F3, F4 şi respectiv, A2 sau A3) sunt diagnosticate
cel mai bine pe baza regresiei logistice, printr-un indice care a combinat
6 constante biochimice: gamma-glutamil transpeptidaza, bilirubina tota-
lă, alpha 2-globulina, apolipoproteina A1, beta globulina şi gamma glo-
bulina. Un indice al fibrozei cuprins între 0 - 0.20 indică absenţa fibrozei,
în timp ce valori cuprinse intre 0.80 - 1 semnalează leziuni evolutive cu
prognostic sever. Indicele de fibroză poate fi o metodă neinvazivă şi fa-
cilă de evaluare iniţială şi decizie terapeutică.
Printre serurile analizate de ISP Timişoara se află şi cel al unui
copil de 2 luni, suspect de transmitere materno-fetală. De asemenea, se
constată un procent ridicat de pacienţi din mediul medical (medici, asis-
tente, infirmiere). La unii pacienţi, riscul de infecţie cu HCV se leagă de
transfuzii sau tratamente chirurgicale dar şi de utilizare de droguri. Sunt
prezente şi cazuri de coinfecţie HCV/HBV. Pe lîngă cazuri de hepatită
cronică, se înregistrează şi un caz de hepatită acută.
În Institutul de Virusologie a fost realizat un studiu asupra
seroprevalentei markerilor infecţiei cu HCV la adolescenţi HIV
pozitivi, supravieţuitori de lungă durată. P1 a realizat un studiu asupra
prezenţei anticorpilor anti-HCV la 359 pacienţi HIV-pozitivi (vârsta medie
la intrarea în studiu 13.8 1.3 ani), cu infecţie achiziţionată pe cale pa-
renterală, între 1988-1992, proveniţi din regiuni cu prevalenţă ridicată a
infecţiei HIV (161 din Constanţa şi 198 din Giurgiu), 69% sub terapie
45
antiretrovirală de înaltă eficienţă, 78,2% - în stadii clinice B şi C ale in-
fectiei HIV. La lotul studiat, provenit din seroteca Institutului de Virusolo-
gie, s-a evidenţiat o prevalenţă surprinzator de scăzută a co-infectiei
HCV - 2.04%, în contrast cu prevalenţa foarte mare a co-infecţiei cu
HBV (78,2% prezentau markeri ai trecerii prin infecţia HBV - anticorpi
anti-HBc pozitivi şi 38,3% erau purtători cronici de AgHBs); chiar şi pre-
valenţa co-infecţiei cu HDV a fost mai mare decât cu HCV, de 5,6%, în
ciuda posibilităţii transmiterii comune pe cale parenterală. Toţi pacienţii
cu markeri serologici ai infecţiei HCV erau co-infectaţi HBV/HIV şi se
aflau sub tratament antiretroviral de tip HAART. La pacienţii co-infectaţi
HCV/HBV/HIV, replicarea activă a HBV, dovedită prin prezenţa AgHBe
şi încărcare virală în titru ridicat (>40.000 copii ADN-HBV/mL) a fost evi-
denţiată la 33,3% din cazuri şi a fost asociată cu deteriorarea statusului
imun (numărul de celule CD4 < 100/mL plasmă) şi cu prezenţa replicării
virale active a HIV (valorile medii ale încărcării virale au depăşit 750.000
copii ARN-HIV/mL). Cu toate acestea, pacienţii prezentau în proporţie
de numai 16,3% valori detectabile ale ARN-HCV (încărcare virală medie
110.550 copii ARN-HCV/mL), cu valori ale transaminazelor semnificativ
crescute (media fiind 156UI/dL). Pacienţii co-infectaţi cu HCV/HBV/HIV,
fără replicare virală activă HBV prezentau un răspuns bun la terapia de
tip HAART, cu restaurare imunologică. Evoluţia pe termen scurt a infec-
ţiei cu HCV nu pare să fie semnificativ influenţată de imunosupresia
HIV-asociată, însă se impune supravegherea atentă a acestor pacienţi,
la care insuficienţa hepatică este mai frecventă şi mortalitatea asociată
bolii hepatice terminale mai ridicată.
Corelaţie între replicarea virală activă şi profilul serologic al
pacienţilor cu infecţii HCV. Testând un număr mai mare de seruri de la
pacienţi cu infecţie HCV atât în faza acută, cât şi cu infecţie cronică, s-a
confirmat importanţa evidenţierii unei reactivităţi ELISA crescute în
testele imunoenzimatice de triaj şi prezenţa viremiei. Pacienţii anti-HCV
pozitivi cu reactivitate înaltă în testele de triaj (DO/CO ≥ 3), prezintă în
46
procent de 93,2% profil complet în testele de confirmare şi în procent de
92.6% ARN HCV detectabil. În cazul probelor cu reactivităţi scăzute şi
transaminaze crescute, ARN-HCV a fost detectat în 40% din cazuri, iar
concordanţa între rezultatele WB şi RT-PCR este de numai 20%. Toate
probele cu reactivităţi EIA scăzute şi transaminaze normale au fost RT-
PCR negative, concordanţa cu rezultatele testelor Western Blot serologi-
ce fiind 33,3%. Patru probe au avut rezultate indeterminate în Western
Blot, două au prezentat RT-PCR pozitiv, amândouă având reactivitate
profil unic pentru banda core, indiferent de nivelul reactivităţii în EIA.
Celelalte două probe, ambele cu reactivitate scăzută în EIA şi cu pre-
zenţa unei reactivităţi singulare pentru proteina NS5A, nu au prezentat
ARN-HCV detectabil. Este important de stabilit o corelaţie între profilul
testelor WB indeterminate şi prezenţa ARN-HCV seric, în privinţa repli-
cării virale, evoluţia bolii hepatice sau a mecanismului imun aflat la baza
acestui răspuns particular. Un profil WB indeterminat cu prezenţa singu-
lară a benzii NS5, este dificil de interpretat. Proteina NS5A este antago-
nistă a IFN direct, inhibând PKR sau prin intermediul IL-8, chemokina
proinflamatorie care probabil alterează expresia genelor IFRG (interfe-
ron responsive genes). Studii recente au arătat că la 18% dintre paci-
enţii cu semne de afectare hepatică care prezintă un astfel de profil
ARN-HCV este prezent, în timp ce la donatori de sânge cu acelaşi profil
WB încărcarea virală este nedetectabilă.
Trei probe cu rezultate indeterminate în testul WB au fost trimise
şi la Institutul Cantacuzino pentru a fi evaluate prin sistemele home-
made de amplificare în core şi NS5B. În plus, cele 3 probe au fost testa-
te şi prin RT-PCR în regiunea E1/E2. Cele 3 probe nu au putut fi amplifi-
cate în E1/E2 şi NS5B, dar au prezentat benzi foarte slabe şi benzi nes-
pecifice în regiunea core. Pacienţii respectivi au avut probabil o infecţie
HCV reală, dar cu un nivel de multiplicare virală foarte scăzut.
În Institutul de Virusologie s-au analizat corelaţiile între date-
le virusologice şi evoluţia postterapeutică. La un număr de 25 paci-
47
enţi HCV pozitivi, de la care existau date clinice, răspuns post-terapie,
indicatori biochimici şi virusologici, s-a evaluat genotipul viral cu kituri
comerciale şi impactul acestuia asupra ratei de obţinere a răspunsului
virusologic susţinut. Datorită prevalenţei genotipului 1b (refractar la tra-
tament), a fost studiat un lot separat de 32 pacienţi - proveniti dintre cei
care s-au prezentat în Institutul de Virusologie - privind gradul de obţine-
re a unui răspuns virusologic rapid – RVR (la 28 zile), marker al obţinerii
răspunsului virusologic susţinut - RVS (la 6 luni după oprirea terapiei).
Rezultate obţinute
La 23 probe am evidenţiat profilul specific genotipului 1b; iar la 2
probe s-a evidenţiat subtipul 1a. Comparaţia între metoda de genoti-
pare comercială şi metoda in house în regiunea core - RFLP/
secvenţiere - s-a soldat cu o concordanţă totală la probele testate.
Deoarece în practică, genotiparea se bazează numai pe polimorfismul
unei singure regiuni genomice (5'NTR/NS5B/core), este imposibil să se
estimeze real frecvenţa infecţiilor multiple sau a evenimentelor de re-
combinare. Genotipul 1b predomină în Europa şi America, dar din ce în
ce mai mult apar infecţii HCV de genotip 1a şi 3, frecvent întâlnit la utili-
zatorii de droguri injectabile (IDU). Studiile anterioare realizate în Româ-
nia vizând infecţia HCV au fost aproape exclusiv bazate pe seropreva-
lenţa infecţiei HCV în populaţia generală sau pe grupe de risc. Studii se-
rologice ale grupului nostru din anii trecuţi, au arătat o seroprevalenţă a
infecţiei HCV în populaţia generală de 4,8%, cu predominanţă la femei
în grupa de vârstă 40-60 ani, sugerând calea de transmitere parentera-
lă. Apariţia genotipului 1a ridică problema introducerii unor căi de trans-
mitere a infecţiei cu extindere în special în rândul toxicomanilor. În Bucu-
reşti, s-au raportat niveluri ridicate de răspândire a unor comportamente
la risc în ceea ce priveşte utilizatorii de droguri injectabile, estimându-se
că peste 24.000 de persoane (aproximativ 1% din populaţia oraşului) îşi
injectează heroină, acest fapt putând conduce la o explozie a infecţiilor
cu aşa-numiţii „blood borne pathogens" (HIV, HBV, HCV).
48
Prin analogie cu epidemia HIV nu trebuie neglijată posibilitatea
unor shifturi majore la nivelul distribuţiei cladelor dominante, cu posibili-
tatea expansiunii rapide a unei tulpini care a circulat anterior la nivel
scăzut, fie prin propagare în rândul unei populaţii cu risc înalt, până
atunci slab reprezentate la nivel populaţional (IDU), fie prin dobândirea
unei eficienţe mai mari de transmitere. La fel, circulaţia concomitentă a
mai multor subtipuri poate genera infecţii multiple, cu apariţia recombi-
nanţilor (CRF) care pot deveni dominanţi în unele zone geografice,
(există deja date globale asupra emergenţei recombinanţilor intergenoti-
pici-de tip 2k/1b, cât şi intragenotipici 1a/1b). Deoarece HCV este un
virus ARN, este foarte probabil ca recombinarea sǎ constituie unul dintre
mecanismele evolutive, ocazionatǎ de infecţii cronice ale aceluiaşi paci-
ent cu genotipuri sau subtipuri diferite. Recombinarea joacǎ rolul unei
adaptǎri a virusului la condiţiile gazdei şi poate influenţa evoluţia bolii.
Rezistenţa la tratamentul cu interferon, riscul de cronicizare sau evoluţia
cǎtre neoplasm pot fi astfel modificate.
Implicatile biologice ale genotipurilor/subtipurilor în managemen-
tul pacienţilor sunt impresionante în infectia HCV, existând subtipuri cu
răspuns diferit la tratament, astfel că predicţia răspunsului la tratament
depinde de genotip: genotipurile 2 şi 3 au răspuns favorabil comparativ
cu genotipul 1b, la care este necesar un tratament combinat pe o peri-
oadă de 48 de săptămâni.
Datorită prevalenţei genotipului 1b, refractar la tratament, s-a stu-
diat un lot separat de 32 pacienţi, proveniţi dintre cei care s-au prezentat
în Institutul de Virusologie, gradul de obţinere al unui răspuns virusologic
rapid – RVR (la 28 zile), marker al obţinerii răspunsului virusologic susţi-
nut - RVS (la 6 luni după oprirea tratamentului), şi am observat că 21
pacienţi au răspuns rapid (încărcare virală nedetectabilă la 28 zile), iar
alţii au răspuns parţial sau deloc (non-responder = la 6 luni de la oprirea
tratamentului) – vezi Fig. 1.
49
Perioada dupa initierea tratamentului
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 7 14 21 28
Non-responder
8 pacienti (25%)
Responder partial3 pacienti (9.4%)
Responder rapid21pacienti (65.6%)
Limita de
detectieAR
N V
HC
(lo
g U
I/m
L)
(zile)
Fig. 1. Raspunsul virusologic rapid (28 zile de terapie antivirala)
Rata răspunsului virusologic susţinut (RVS) la pacienţii rapid res-
ponderi a fost de 95%, faţă de 37% la non-rapid responderi (Fig. 2).
21
11
20
4
0
5
10
15
20
25
RR NRR
total
RVS
Fig 2. Rata RVS la pacientii rapid respoderi = 95% vs. rata RVS la pacientii non rapid respoderi = 37%
50
În literatură sunt publicate date prin care se afirmă că răspunsul
virusologic rapid survine la 15% dintre pacienţii infectaţi cu genotipul 1 şi
la 66% dintre cei infectaţi cu genotipul 2 sau 3. Aceşti pacienţi au evolu-
ţia cea mai bună, înregistrând în 90% din cazuri răspuns virusologic sus-
ţinut (RVS), dacă menţin tratamentul cel puţin 48 săptămâni în cazul in-
fecţiei cu genotipul 1, sau cel puţin 24 săptămâni în cazul infecţiei cu ge-
notipul 2 sau 3. Cu cât pacientul beneficiază mai timpuriu sub terapie de
atingerea pragului nedetectabil al încărcării virale (ARN-VHC) sub 50
UI/mL (limita detecţiei), cu atât probabilitatea recăderilor este mai mică
şi invers. Rata recăderilor poate fi redusă şi la cei cu răspuns virusologic
lent (RVL), scăderea încărcarii virale sub limita detecţiei după 12 sau 24
săptămâni de tratament combinat, extinzând durata terapiei combinate
de la 48 la cel puţin 72 săptămâni. În aceste condiţii, incidenţa recăderi-
lor scade de la 50 la 20%. Terapia combinată este suportată cu dificulta-
te din cauza reacţiilor adverse la interferon. Prelungirea curei poate fi
suportată mai uşor reducând treptat dozele de interferon sau/şi ribaviri-
nă, fără însă a întrerupe tratamentul.
Pentru aplicarea clinică imediată preconizăm introducerea de de-
terminări precoce, ca markeri predictivi ai eficienţei tratamentului:
Răspuns virusologic rapid (RVR) - scăderea încărcării virale
(ARN-HCV) sub 50UI/mL (limita detecţiei) după 4 săptămâni
de tratament combinat peginterferon+ribavirină.
Răspuns virusologic timpuriu (RVT) - scăderea încărcării vi-
rale cu peste 2 log (de 100 ori) după 12 săptămâni de trata-
ment combinat peginterferon+ribavirină.
Răspuns virusologic complet (RVC) - scăderea încărcării vi-
rale sub 50UI/mL după 4 săptămâni şi după 12 săptămâni de
tratament combinat peginterferon+ribavirină.
De asemenea, analiza atentă a ratei de diversificare a genotipuri-
lor circulante aduce informaţii valoroase privind extinderea epidemiei la
grupe populaţionale vulnerabile (toxicomani, homosexuali, pacienţi cu
51
imunosupresie HIV-indusă, pacienţi cu infecţii cu transmitere sexuală) şi
permite formularea în timp real a unor strategii de prevenţie şi control.
7. Analize moleculare efectuate cu sistemele home-made de RT-
PCR şi secvenţiere
Desemnarea genotipurilor se poate face cu o serie de metode
bazate pe 5'UTR (kituri Immunogenetics, RFLP), însă aceste proceduri
rapide nu asigură identificarea unor subtipuri cu acurateţe, în primul rînd
datorită gradului de conservare între acestea la nivelul 5'UTR. De ex.
pot subtipate greşit unele genotipuri (1c, 2c, 3d-3e) pentru că regiunea
lor 5'UTR este identică cu cea a altor genotipuri (1a, 2a, 3a, 1b). În plus,
toate testele de genotipare au fost dezvoltate pe baza câtorva genotipuri
reprezentative din Europa de Vest, USA şi Japonia. Astfel, subtipuri şi
variante HCV din Europa de Est pot fi genotipate greşit prin aceste me-
tode. Din acest motiv, ne-am propus să facem un prim screening prin
sistemul PCR-RFLP în 5'UTR, dezvoltat de Valerie Thiers de la Institutul
Pasteur din Paris (1997), urmat de confirmarea prin PCR, secvenţiere şi
analiza filogenetică într-o altă regiune genomică (core şi/sau NS5B).
INCDMI Cantacuzino a proiectat 2 sisteme de RT-PCR în regiu-
nile core şi NS5B şi le-a optimizat. A realizat un screening pe serurile
din colecţia consorţiului prin analiză moleculară în regiunea 5’UTR. Pro-
bele cu un profil RFLP care indică un alt genotip sau cu profiluri atipice
au fost incluse în analiza moleculară prin cele 2 sisteme de RT-PCR
home-made (regiunea core şi regiunea genomică a polimerazei virale –
NS5B). Secvenţele obţinute au fost analizate cu diferite programe infor-
matice pentru identificarea genotipului, subtipului sau variantelor virale.
Prin aceleaşi metode au fost comparate tulpinile de HCV izolate în Ro-
mânia cu cele din alte regiuni geografice (secvenţe din băncile de date
Los Alamos, EMBL). Rezultatele moleculare au fost comparate cu cele
obţinute în cadrul consorţiului.
În Institutul Cantacuzino au fost testate şi optimizate testele
moleculare prin revers transcriere (RT) şi PCR în regiunile genomice
52
5’UTR, core, NS5B. Ampliconii obţinuţi în regiunea 5’UTR au fost supuşi
analizei de restricţie (RFLP), iar profilurile obţinute în urma migrării în gel
de agaroză au fost comparate cu cele ale unor genotipuri cunoscute.
Genotiparea în regiunea 5’UTR a fost confirmată prin genotiparea în re-
giunile core sau NS5B, care s-a realizat prin RT-PCR (optimizarea reac-
ţiilor în cele 2 regiuni genomice), purificarea ampliconilor prin extracţie
din gel, secvenţierea, purificarea produşilor din reacţia de secvenţiere,
analiza ampliconilor pe un secvenţiator cu capilare în sistem automat
(Applied Biosystems), prelucrarea secvenţelor obţinute (cu programele
BioEdit, Clustal W, Fasta, Blast) şi analiza filogenetică a secvenţelor
obţinute (programele BioEdit, Mega 3, PHYLIP, PUZZLE etc.).
Secvenţele obţinute în regiunea core au fost introduse în
banca de date EMBL/GenBank cu numereIe de acces (AM114084 –
AM114101 şi AM422808 – AM422831).
În cursul acestui studiu au fost proiectate mai multe tipuri de pri-
meri, care să amplifice prin PCR două zone genomice situate la distan-
ţă: una în regiunea proteinei de capsidă core, cealaltă în regiunea
NS5B, corespunzătoare polimerazei virale. În regiunea core s-au obţinut
amplificări specifice, dar pentru acest sistem era necesară ameliorarea
condiţiilor de reacţie deoarece se obţineau şi multe benzi parazite. Ne-
am propus să exploatăm şi această regiune pentru a extinde analiza tul-
pinilor de HCV şi în regiunea codificatoare pentru capsida virală – core,
cu atât mai mult cu cât în această regiune genomică au fost evidenţiate
cadre de citire alternative care conduc la apariţia unor proteine diferite,
cu rol necunoscut în patogenie şi în evoluţia bolii. ARN viral a fost extras
din 140µL de ser cu ajutorul kitului QIAamp Viral RNA Mini Kit şi supus
unei transcrieri inverse (RT) pentru obţinerea unui ADN complementar şi
apoi unei reacţii de amplificare în lanţ (PCR) de tip “nested” în regiunile
5’NCR, core şi NS5B.
RT-PCR
Au fost analizate 3 zone genomice prin RT-PCR:
53
1. În regiunea NS5B (care codifică pentru polimeraza virală) s-a
obţinut un fragment de 577 pb (PCR II), într-un sistem de PCR
„nested”, utilizându-se primerii externi PANS5-1S1/PANS5-2R şi
primerii interni PANS5-3S/PANS5-4R:
a) Primeri NS5B sens externi (PANS5-1S):
5’-CCT ACG AGY CTT CAC GGA GG-3’ = PANS5-1S
5’-CCT GAG AGY CTT CAC GGA GG-3’ = PANS5-1Sb
Poziţie: 8603-8622 (pentru secvenţa 1b D10750)
b) Primer NS5B sens intern (PANS5-3S):
5’-gyc ttc acg gag gct atg ac-3’
Poziţie: 8610-8629 (pentru secvenţa 1b D10750)
c) Primeri NS5B anti-sens externi (PANS-2R):
5’-GAC ASG CTG TGA TAA ATG TC-3’ = PANS5-2R
5’-CAC ASG CTG TGA TAA GTG TC-3’ = PANS5-2Rb
Poziţie: 9273-9294 (pentru secvenţa 1b D10750)
d) Primeri NS5B anti-sens interni (PANS5-4R):
5’-ACT GCC CAG TTR AAG AG-3’ = PANS5-4R
5’-ACC GCC CAG TTR AAG AG-3’ = PANS5-4Rb
Poziţie: 9171-9187 (pentru secvenţa 1b D10750)
2. În regiunea 5’NCR a fost amplificat un fragment de 240 pb într-
un sistem de PCR-RFLP standardizat (Thiers V. et al. 1997.
J.Virol. Methods, 65, 9-17) utilizat pentru comparaţie cu sistemul
nostru de genotipare în NS5B şi pentru detectarea virusurilor re-
combinante. În acest sistem nested PCR au fost utilizaţi primerii
externi out+ şi out- şi cei interni, nest+ si nest-.
3. În regiunea core (regiunea care codifică pentru capsida virală).
Pe lângă regiunile NS5B şi 5’NCR a fost utilizat sistemul de am-
plificare în regiunea core, dezvoltat in prima faza a proiectului si
optimizat ulterior. Cei doi primeri sens (extern şi intern) sunt pozi-
ţionaţi în regiunea 5’NCR, extremitatea 3’, chiar înainte de codo-
nul start pentru poliproteină, fiind decalaţi între ei cu 4 nucleotide.
54
Printre cele 64 de secvenţe aliniate pentru această zonă, nu
există decât o singură secvenţă (pentru genotipul 3a) care poartă
o mutaţie punctiformă în zona primerului sens extern, unde un T
este substituit de un C.
a) Primer core sens extern (PACO-1S):
5’-ACT GCC TGA TAG GGT GCT TGC GAG-3’
Poziţie: 288-311 (numerotarea din secvenţa nucleotidică
pentru tipul 1b D10750)
b) Primer core sens intern (PACO-3S):
5’-CCG GGA GGT CTC GTA GAC CGT G- 3’
Poziţie: 316-337 (pentru secvenţa 1b D10750)
Pentru regiunea 3’ a genei pentru capsida virala nu există
un consens de secvenţă pentru toate genotipurile disponi-
bile în băncile de date. A fost necesar să fie construiţi pri-
meri degeneraţi (conţin amestecuri de primeri care pre-
zintă nucleotide diferite în poziţiile în care apar mutaţii fa-
ţă de celelalte secvenţe) pentru a se reuşi amplificarea
unui numar cât mai ridicat de genotipuri virale.
c) Primeri core anti-sens externi (PACO-2R):
5’-AAG ATA GAA AAA GAG CAA CC-3’ = PACO-2R
5’-AAG ATA GAR AAG GAG CAA CC-3’ = PACO-2Rb
Poziţie: 852-871 (pentru secvenţa 1b D17050)
Ampliconul generat prin utilizarea primerilor externi are
aprox. 580 perechi de baze, iar ampliconul intern, obţinut
cu ajutorul primerilor core interni, este de aprox. 421 pb.
Transcrierea inversă a fost realizată cu un volum de 11,5µL din
ARN extras, 100U din Moloney Murine Reverse Transcriptase (Gibco-
BRL), 250µM dNTP, 25U RNA-sine şi 50 pmoli din primerii externi anti-
sens. Au fost utilizaţi şi random hexameri pentru comparaţie cu randa-
mentul obţinut cu ajutorul primerilor specifici. Volumul de 20µL a fost in-
cubat la 37ºC pentru 60 min, apoi la 94ºC pentru 10 minute.
55
În prima rundă de amplificare prin PCR s-au utilizat 2µL din ADN
complementar (cDNA), 50pmoli din fiecare primer extern, 200µM din
dNTP şi 2,5 U din Taq DNA polimeraza. Programul PCR pentru regiunile
core şi NS5B (termocycler MJ Research) a fost următorul: un ciclu – 3
min la 95 C, 1min la 50 C, 1 min la 72 C; 40 de cicluri, fiecare având:
35s la 95 C, 45s la 50 C, 45s la 72 C, un ciclu final de 10min la 72 C.
Produsul din prima rundă de amplificare (2µL) a fost utilizat în nested
PCR, realizat în aceleaşi condiţii ca şi PCR I, cu excepţia primerilor ex-
terni, înlocuiti de cei interni. Programul PCR pentru regiunea 5’NCR a
presupus 30 de cicluri de amplificare, fiecare ciclu cu etapele: 30 s la
94 C, 30 s la 55 C, 30 s la 72 C). Dupa amplificare produsii PCR au fost
migrati intr-un gel de agaroza 2% cu bromura de etidiu si vizualizati sub
UV.
Sistemul de genotipare prin RFLP în regiunea 5’NCR presu-
pune liza ampliconilor din PCR II (primerii nest+ şi nest-) cu 3 enzime de
restricţie: Bst NI (cu izoschizomerul MvaI), Bst UI (cu izoschizomerul
MvnI) şi Sau3AI.
Din ampliconul obţinut în PCR II se utilizează 18μL ADN care se
incubează împreună cu enzima (1μL = 10U) şi tamponul corespunzător
(3μL) (conform indicaţiilor producătorului), timp de 2 ore la 37ºC. Frag-
mentele obţinute sunt migrate în tris/acetat/EDTA într-un gel de agaroză
3%, de înaltă rezoluţie, care permite separarea fragmentelor foarte apro-
piate ca mărime. Greutăţile moleculare sunt comparate faţă de un mar-
ker de greutate moleculară (Phi X174/HaeIII).
Profilurile de restricţie obţinute cu cele 3 enzime permit diferenţi-
erea a 5 genotipuri: 1a, 1b, 2, 3a şi 4/5. Cu alte cuvinte, sistemul este
capabil să discrimineze între subtipurile 1a şi 1b, pentru genotipul 2 nu
identifică şi subtipurile, genotipul 3 nu este reprezentat decât de subtipul
3a, iar între genotipurile 4 şi 5 nu poate face diferenţiere.
56
Genotip Produs PCR (pb)
BstN1/MvaI BstU1/MvnI Sau3AI
1a 240 38, 63, 41, 97 193, 45 240
124, 116
1b 240 38, 63, 41, 97 163, 30, 45 240
124, 116
2 240 38, 202 240 240
3a 240 38, 202 163, 30, 45 168, 72
4/5 240 38, 202 193, 45 240
124, 116
Tabel II. Profilurile benzilor obţinute în sistemul RFLP în 5’NCR
(V. Thiers, 1997)
După un prim screening prin PCR-RFLP (Fig. 3) în regiunea
5’NCR, o parte din tulpinile cu profil 1b şi toate cele care prezentau pro-
file diferite de acesta sau nu se încadrau în nici unul din profilele prevă-
zute de sistemul standardizat au fost secvenţiate în una sau două
regiuni (core şi NS5B).
NdeI MvaI MvnI
NC 1a 1b 3a 4 1b 1a 1b 3a 4 1b 1a 1b 3a 4 1b
Fig. 3. Genotipare in 5’UTR prin metoda RFLP cu 3 enzime de restricţie
57
Secvenţierea produşilor de amplificare în regiunile core şi NS5B
Purificarea produşilor de amplificare obţinuţi prin PCR este nece-
sară înainte de secvenţiere datorită fragmentelor amplificate nespecific.
Produşii PCR au fost purificaţi cu QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen). Acest protocol permite purificarea ADN dublu şi monocatenar
cu mărimi cuprinse între 100pb şi 10kb. Pentru obţinerea unor electrofo-
regrame de calitate prin secvenţiere, a fost necesară purificarea produşi-
lor PCR care prezentau benzi suplimentare, nespecifice. Produşii PCR
au fost purificaţi prin tehnica de migrare în gel de agaroză cu temperatu-
ră joasă de topire (low-melting), urmată de extracţia ADN.
Pentru analiza secvenţelor HCV există 2 baze de date specifice:
baza de secvenţe de la Los Alamos (http://hcv.lanl.gov/) şi baza de la
Institut de Biologie et Chimie des Proteines (http://hepatitis.ibcp.fr/).
Aceste site-uri prezintă, pe lîngă avantajul unor bănci de secvenţe ex-
haustive şi diferite alte programe de analiză şi comparare de secvenţe
(distribuţia geografică a genotipurilor, programe locale de comparare de
secvenţe ca BLAST, Sequence locator şi Primalign), constituind un aju-
tor substanţial în analiza filogenetică a secvenţelor precum şi in identifi-
carea rapidă a unor tipuri de secvenţe.
În studiul nostru am utilizat programele Fasta şi Blast, de compa-
rare a secvenţelor obţinute cu cele introduse în băncile de date. În urma
comparării cu toate secvenţele asemănătoare din GenBank, DJJ etc.
sunt identificate cele mai apropiate ca omologie şi sunt prezentate
scoruri. Acestea permit o primă identificare de genotip, în funcţie de sec-
venţele care prezintă scoruri > 80% cu cea de identificat. Fiecare sec-
venţă transmisă de secvenţiatorul automat în format text a fost compara-
tă cu electroforegrama corespunzătoare pentru a fi controlate erorile de
citire şi de transcriere de către aparat. Programele BioEdit sau ReMap
au fost utilizate pentru a se deduce secvenţa proteică din cea nucleotidi-
58
că. Acestea permit şi identificarea unor profiluri de restricţie într-o sec-
venţă dată pentru definirea enzimelor de restricţie pentru testele RFLP.
Metodele de aliniere multiplă a secvenţelor au fost utilizate de
programele ClustalW care caută alinierile optime utilizînd toată lungimea
secvenţelor (prin compararea de perechi de secvenţe). Secvenţele sînt
comparate două cîte două, pentru fiecare aliniere fiind prezentat un scor
de similaritate, organizat conform unei matrice de similitudine care va
servi la producerea unei dendrograme.
În cursul studiului de faţă au fost utilizate programele din pache-
tul PHYLIP, programul PUZZLE 4.0 şi programul MEGA 4. Toţi arborii
filogenetici construiţi prin aceste metode au fost validaţi prin metodele
statistice de Bootstrap (reeşantionare) şi Quartet puzzeling. Diferite pro-
grame permit vizualizarea şi manipularea arborilor, cum sunt NJplot şi
Treeview (Page, 1996). Treeview (utilizat în cadrul acestor studii) pro-
pune diferite prezentări ale arborelui (cladograme, diagrame radiale etc.)
şi permite vizualizarea valorilor bootstrap.
Rezultatele secvenţierii în core şi NS5B
Analiza secventelor în regiunea core a permis obţinerea unor ar-
bori filogenetici (Fig. 4). Tulpinile 1b predomină şi se înrudesc cu tulpini
din Europa (Germania) şi cu tulpini din SUA. Probabil că am găsi simili-
tudini şi cu tulpini HCV din spaţiul balcanic dar, din păcate, foarte puţine
tulpini de HCV au fost secvenţiate din această zonă şi introduse în băn-
cile de secvenţe.
Tulpinile 1600/04, 3284/05 şi 2228/05 au fost genotipate ca 4a
în toate regiunile secvenţiate. Este un genotip mai puţin întîlnit în Euro-
pa, fiind endemic în Egipt. O serie de persoane au fost contaminate în
această ţară datorită unei campanii contra parazitului Schistosoma, cu
tratament injectabil realizat în condiţii neigienice (Ray, 2000). Transmite-
rea HCV între indivizii care au primit tratamentul a fost studiată prin
compararea secvenţelor virale.
59
Au fost identificate omologii foarte ridicate între aceste secvenţe
virale, care pledează pentru ipoteza unei singure surse de infecţie. Sub-
tipul 4a este practic răspîndit pe tot teritoriul Egiptului şi coexistă cu alte
subtipuri ale genotipului 4 precum şi cu 1b. Probele româneşti sunt foar-
te apropiate genetic de tulpini 4a din Egipt, mai precis de tulpina de refe-
rinţă ED43 care provine de la un egiptean politransfuzat în anii ’80 în
Cairo. Este posibil ca tulpina sursa să fi fost importată la noi din această
regiune. În ultima vreme, se constată o oarecare schimbare în spectrul
genotipurilor de la noi, datorită apariţiei subtipului 1a. Din cele peste 250
de tulpini analizate, 10 aparţin subtipului 1a. De altfel, istoria reconstruită
a epidemiei cu HCV înregistrează o creştere exponenţială a subtipurilor
1a şi 3a care tind să înlocuiască subtipul 1b, majoritar în ţările europene.
Un grup de risc pentru aceste subtipuri este reprezentat de utilizatorii de
60
droguri. Din păcate se constată că şi în Romania s-a răspândit această
practică printre tineri. Arborele filogenetic, construit pe baza secvenţelor
core a tulpinilor 1a, izolate în România şi în Europa sau SUA, este
prezentat în Fig. 5.
Din Fig. 5 se constată că tulpinile româneşti de genotip 1a for-
mează o grupare între ele, fiind mai puţin apropiate genetic de alte tulpi-
ni 1a circulante în Europa şi SUA. Distanţa genetică foarte mică între tul-
pinile româneşti este un indicator al introducerii recente a acestui subtip
în România şi circulaţia în populaţia de tineri care utilizează droguri in-
jectabile a unor variante virale provenite din acelaşi virus. În construcţia
filogenetică prezentată, tulpinile româneşti de genotip 1b şi 3a formează
linii separate de grupul tulpinilor 1a (grupate împreună cu H77, tulpina
de referinţă 1a).
Probele consecutive nr. 2575, 3557 şi 4026 de la pacienta BA,
22 ani, caz social IDU, cu coinfecţie HCV/HIV – prezintă tulpini HCV po-
sibil recombinante 1a/1b, evidenţiate prin secvenţiere în core, şi protei-
nele de înveliş E1/E2 (regiunea hipervariabilă 1 - HVR1).
EU362905 USA
6025 USA
X84079 GB
12353 FR
155355 CH
RO-1078 1a
RO-1026 1a
RO-2575 1a
RO-3031 1a
RO-3969 1a
H77 1a
687193 USA
362891 USA
RO-4843 1b
RO-2748 3a
0.005
Fig. 5. Arbore filogenetic construit in CORE pentru tulpini 1a Metoda Neighbor-Joining
61
Singura tulpină HCV de genotip 3a, RO-2748, provine din lotul
de seruri trimis de ISP Timişoara de la un deţinut de 35 ani, care este şi
utilizator de droguri. Vârsta utilizatorilor de droguri investigaţi în cadrul
proiectului este cuprinsă între 19 şi 35 de ani. Menţionăm că, la utilizato-
rii de droguri injectabile cu vârste tinere (20-21 de ani), am identificat şi
2 cazuri cu tulpini HCV de subtip 1b.
Aşa cum am menţionat deja cazul tinerei BA, o parte din cazurile
cu coinfecţie HCV/HIV sunt utilizatori de droguri intravenoase. Două ti-
nere paciente de 17 ani au achiziţionat coinfecţia HCV 1b/HIV, probabil
prin transfuzie de sânge. Coinfecţia HCV/HBV a fost prezentă la două
cazuri de 60, respectiv 76 ani, cu intervenţii chirurgicale în antecedente
şi un caz în vîrstă de 40 ani, de profesie medic.
Genotiparea şi analiza filogenetică în regiunea NS5B
Proba 1600 a fost evaluată prin RFLP în regiunea 5’NCR ca fiind
de genotip 4 sau 5, acest sistem neputând discrimina între cele două
genotipuri. În regiunea core, prin programul BLAST şi analiză filogeneti-
că, tulpina 1600 a fost subtipată ca 4a (cel mai mare scor de similaritate:
96% cu 4a). PCR şi secvenţierea în NS5B au condus la aceeaşi conclu-
zie: prin BLAST tulpina 1600 aparţine subtipului 4a.
În Figura 6 este prezentat arborele filogenic în NS5B realizat prin
programul Mega 4, metoda Neighbor-Joining, construit pentru a verifica
genotiparea în celelalte două regiuni. Tulpina cea mai apropiată din grupul
cu genotip 4 este tulpina de referinţă 4a, ED43, care provine de la un
pacient egiptean din Cairo care a primit în 1982 mai multe transfuzii
sanguine. Ceva mai îndepărtată, dar aparţinînd aceluiaşi grup 4a, este o
tulpină din Franţa, FrSSD. Proba 1600 se încadrează în acelaşi cluster 4a
şi prin metoda UPGMA aplicată prin programele PHYLIP, PUZZLE şi
DNADIST. În acelaşi mod au fost verificate şi alte tulpini care nu aparţin
subtipului 1b prin secvenţiere în regiunea core.
62
Secvenţele obţinute în INCDMI Cantacuzino au fost analizate cu
programe informatice pentru identificarea genotipului, subtipului sau vari-
antelor virale, apoi tulpinile de HCV izolate în România au fost comparate
cu cele din alte regiuni geografice (secvenţe din băncile de date Los Ala-
mos, EMBL). Secvenţele obţinute în regiunea core la tulpini de HCV izo-
late în cadrul consorţiului au fost analizate prin programul Bio Edit, pentru
prezenţa unor cadre de citire decalate (ORF decalat, alternativ), care co-
difică proteine alternative core (core+1, ARF sau proteina F).
Premizele studiului privind evaluarea in silico (informatizată) a
prezenţei unor proteine în ORF decalat la izolate HCV din România
Similar altor virusuri care persistă în organism, HCV exprimă pro-
teine cu rol în inhibarea mecanismelor de apărare şi eliminare a patoge-
nului. Date recente indică faptul că genomul HCV conţine un cadru de
citire +1 decalat care codifică antigene core alternative (Walewski JL,
2001; Xu Z, 2001; Varaklioti A, 2002). Existenţa proteinelor core alterna-
tive a fost dovedită prin studii in vitro şi in vivo, prin identificarea anticor-
pilor anti-core+1 la pacienţi.
63
Până în prezent, nu există un consens privind mecanismele mo-
leculare care stau la originea sintezei unor proteine alternative. Pentru
genotipul 1a, proteina în cadrul decalat core +1 (ARFP – alternative rea-
ding protein, numită şi proteina F), schimbarea cadrului de citire (frame-
shift) s-ar produce lângă codonul 11, iar proteina se termină la codonul
161. În schimb, pentru genotipul 1b, frameshift-ul s-ar produce la codo-
nul 42, urmat, pentru unele virusuri, de o revenire în ORF normal la co-
donul stop 144. Desi lungimea proteinelor diferă, proteinele core+1 de la
genotipurile 1a şi 1b prezintă un domeniu comun al proteinei, de 101 aa,
între codonul 43 si codonul 144.
Încă nu a fost identificat rolul proteinei core+1 în evoluţia spre
cronicizare şi în patogeneză. Prin acest proiect ne-am propus să eva-
luăm prezenţa proteinei core +1 prin analiza secvenţelor obţinute prin
sistemul nostru RT-PCR in-house. Pe baza acestor rezultate şi prin ana-
liza secvenţei integrale a regiunii core (obţinută după clonare şi secven-
ţiere), am urmărit identificarea zonelor conservate din proteina core +1
pentru a construi peptide utilizabile în sistem ELISA la testarea anticorpi-
lor anti-core+1 în serul pacienţilor din România.
Evaluarea prezenţei proteinei core+1 la tulpinile din
România, precum şi la alte genotipuri/subtipuri decât 1a prin
analiza informatică a secvenţelor
Seruri bine caracterizate din punct de vedere virusologic (serolo-
gie HCV, teste de confirmare, încărcare virală) şi clinic, furnizate în ca-
drul consorţiului de către Spitalul Victor Babeş, INCDMI Cantacuzino şi
ISP Timişoara, au servit pentru sinteza ADN complementar, PCR în re-
giunea core (sisteme in-house, în colaborare cu dr. Valerie Thiers de la
Institutul Pasteur din Paris) şi secvenţiere în sistem automat.
Fragmentul PCR este localizat între poziţiile nucleotidice 14 şi
359 din gena core (sau, la nivelul întregului genom, între poziţiile 355 şi
700 din tulpina de referinţă 1a H77).
64
După ce produşii PCR în regiunea core au fost secventiaţi, s-a
trecut la evaluarea genotipurilor prin scanarea virusurilor genotipate din
băncile de secvenţe şi compararea lor cu secvenţele de identificat cu
ajutorul programului BLAST. Secvenţele HCV din România, genotipate,
au fost depuse în banca de secvenţe EMBL. S-a realizat un aliniament
(programul BioEdit) care conţine secvenţele româneşti de genotip: 4a,
3a, 2a, 1a şi 1b, împreună cu virusuri de referinţă sau virusuri genotipate
provenite din diferite regiuni geografice (Egipt, Olanda, Franţa, Rusia
etc.). Aliniamentul, realizat cu programul Clustal W, a fost ajustat la
aceeaşi lungime a secvenţelor (aprox. 300nt). Programul BioEdit conţine
o funcţie care permite translarea secvenţelor nucleotidice în secvenţele
proteice corespunzătoare, în cele 3 cadre de citire posibile (ORF).
Precizarea privind evaluarea core+1 la alte genotipuri decât 1a
se referă la faptul că această proteină a fost evidenţiată pentru prima
oară şi studiată extensiv in vitro şi in vivo la acest genotip. Informaţiile
privind celelalte genotipuri sunt mai puţine.
În Fig. 7 este reprezentat aliniamentul de secvenţe proteice HCV
în ORF decalat (core+1). Aminoacizii identici cu cei din prima secvenţă
de genotip 4a (RO-3284/2006) sunt prezentaţi grafic cu puncte şi pe blo-
curi de culori diferite. Pe aliniament, aminoacizii diferiţi apar marcaţi cu
alte culori, evidenţiindu-se mai clar zonele cu variabilitate.
După cum se constată, toate secvenţele aliniate în zona core
(desemnată prin sistemul nostru), prezintă şi proteina core +1 (asteriscul
indică un codon stop şi întreruperea cadrului de citire). Prin comparaţie
cu proteina core normală, cu un grad înalt de conservare, zona core+1
prezintă zone cu variabilitate importantă. Acest lucru e surprinzător pen-
tru o proteină derivată dintr-o zonă nucleotidică, recunoscută pentru gra-
dul de conservare intragenotipic. Este posibil ca variabilitatea la nivel de
core +1 să denote funcţionalitatea acestei proteine in vivo (de ex. pentru
mecanismele prin care virusul scapă de reacţia imunologică faţă de pro-
teina de capsidă normală) sau ca proteină cu rol în patogeneză.
Fig. 7 Aliniament realizat cu secvenţe HCV din România şi din alte zone geografice în PROTEINA CORE+1
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
RO-3284/06_4a APWTSSSRVVARSLAEFTCCRAGAPGWVCARLGRLRSGRNLVGDANLSPRRVDPREGPGH
RO-1600/04_4a ............................................................
Olanda-4a ...M*N..AA....V.......................H...AGVS.....AG..A...L
Egipt_ED43_4a .Q..L....................D................E.................
RO-2748/06_3a .HR......AG...V.Y.......HD.....RVK.LN.HS.AD.DS....H.GAKA....
Australia_3a .HR.L....AD...V.Y.......HD.....RVK.LN.HSPAD.DS......RAEA...L
7330_2a .HK.L.F.AA......Y..............Q......PSH..G.SP.LKIGA.LAS..E
Franta_2a .HK.L.F.AA......Y..............Q......PSH..G.SP..KIGA.LAS..E
RO-1078/04_1a .HR......AV...V.........LD.....R...P.....EV.VS......G..A...L
RO-1026/04_1a .HR.......V...V.........LD.....R...P.....EV.VSP.....G..A...L
Italia_1a .HR......AV...V.........LD.....R...P......V..S......G..A...L
Rusia-1a .HR.L....SV...V.........LD.....R...P.....EV.VS.........A...L
Danemarca-1a .HR......AV...V.........LD.....R...P.....EV.VS....H.G..A...L
1a.COLONEL .HR......AV...V.........LD.....R...P.....EV.VS....H.G..A...L
RO-3315/06_1b .HR.....A.V...V....................P..H...EGD..F..LAN..A...L
RO-P98841/06_1b .HR.....A.V..SV....................P......EGD.....LA.L.A...P
RO-C164-7/06_1b .HR.......V...V....................P..H...EGD.....LAV..A...P
RO-B13/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-4581/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAG..A...L
RO-3388/06_1b .HR.L...A.V..SV...............Q....LN.....EGD.....LAS..A...L
RO-2759/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAG..V...L
RO-1651/06_1b .HR.L...A.V...V.........L..........P......EGD.....LAG..V...L
RO-1450/06_1b .HR.....A.V..SV....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-2/06_1b .HR.L.....V...V....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-1/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-C1/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-29512/06_1b .HR.......V...V....................P......EGD.....LAS..V...R
RO-3501/06_1b .HR.L...A.V...V....................P......EGDS....L.G..A...P
RO-3316/06_1b .HR.....A.V...V..........S.........P..H...EGD.....LAN..A...L
RO-3034/06_1b .HR.L...AA....V....................P......EGD.....LAS..A...L
RO-2940/06_1b .HR.L...A.V..SV....................P......EGD.....LAV..A...P
RO-2524/06_1b .HR.....A.V...V....................P......EGD.....LAS..V...L
RO-1582/06_1b .HR.....A.V...V.........LD.........P......EGD.....LA...A...L
RO-00264/06_1b .HR.......V...V....................P......EGD.....LAG..A...L
Dacă pe aliniamentul de core normal, izolatele HCV de genotip
4a sunt practic identice cu izolatul 4a din Egipt, din care probabil au deri-
vat, în core +1 au 6 aminoacizi diferiţi. Şi numeroasele tulpini HCV 1b
prezintă o variabilitate mult mai mare decât în zona core normală. În
această zonă codantă există motive uşor de recunoscut între genotipuri
(ex. 1a, 2a, 3a).
Prin acest studiu am putut evalua in silico prezenţa proteinei în
ORF decalat core+1 la izolatele de diferite genotipuri din România.
Clonarea întregii regiuni genomice core şi secvenţierea
clonelor pentru evaluarea variabilităţii genomice a regiunii şi a
potenţialului diagnostic al proteinei codificate în cadru de citire
decalat (core+1)
Materiale şi metode folosite pentru clonarea genei CORE din
genomul HCV (Subtipul 4a)
1. Sistemul PCR. Obţinerea ampliconilor pentru clonare
Clonarea s-a relizat pentru regiunea core din genomul HCV apar-
ţinând subtipului 4a (proba 1600).
Acidul nucleic viral a fost extras cu trusa comercială QIAamp
Viral Mini kit, care are ca principiu extracţia ARN cu tioizocianat de gua-
nidină şi fixarea acestuia pe o coloană de silice, urmată de spălare şi
eluţie. Reverstranscrierea s-a realizat utilizând reverstranscriptaza AMV,
random hexameri şi dNTPs.
Amplificarea regiunii core din genomul HCV s-a facut utilizând
primeri degeneraţi (Invitrogen). S-a folosit un sistem nested PCR în care
primerii externi şi interni sunt situaţi în zonele genomice care delimitează
gena core, respectiv 5’UTR şi E1. S-a utilizat Taq polimeraza Gotaq
Flexi (5U/μL, Promega). Pentru amplificare s-a folosit maşina PCR MJ
Research şi următorul program:
a) 94ºC; 3min;
b) 95ºC; 30sec;
67
c) 60ºC; 30sec;
d) 72ºC; 30sec;
e) ciclurile b, c si d se repetă de 40 ori, la fiecare două cicluri se
scade temperatura de hibridizare cu un grad;
f) 72ºC; 7min;
g) 4ºC.
S-a folosit kitul de purificare SV Gel and PCR Clean-Up System
produs de Promega.
2. TOPO TA Cloning (Stratagene)
TOPO TA Cloning este un kit care permite clonarea rapidă, într-o
singură etapă, prin inserţia directă a produşilor de amplificare într-un
vector plasmid. Metoda nu presupune proceduri post-amplificare, iar pri-
merii folosiţi în amplificare nu necesită design deosebit. Vectorul plasmid
(pCR®II-TOPO®) este furnizat sub formă liniară. Fiecare dintre cele 2
catene ale vectorului prezintă în plus o timină la capătul 5’. De această
timină este legată, printr-o punte fosfat, topoizomeraza I (enzima se lea-
gă printr-un rest de tirozină). Topoizomeraza I (izolată din virusul vacci-
nia) taie legăturile fosfodiesterice din duplexul ADN după secvenţa
5’CCCT. Energia rezultată în urma clivării este folosită pentru realizarea
unei noi legături între restul 274 Tyr al enzimei şi gruparea fosfat liberă a
ADN, formată dupa scindarea catenei.
Taq polimeaza are ca proprietate (indiferent de matriţă), ataşarea
unei adenine în plus la capătul 3’, la finalul sintezei. Produsul PCR se va
integra în vectorul liniarizat datorită complementarităţii dintre adenina 3’
şi timina 5’ a vectorului. În urma realizarii integrării, topoizomeraza I va
fi eliberată, iar vectorul va trece în formă circulară.
Kitul de clonare conţine: Mediu S.O.C, Celule TOPO 10, ADN
control PUC19.
3. Transformarea
Compoziţie mediu (pH 7): tristonă 1%; extract de drojdie 0,5%;
NaCl 1%.
68
Prepararea mixului de clonare:
Reactiv Volum
Produs PCR 4μL
Solutie salină 1μL
Apă până la 5μL
Vector TOPO 1μL
Volum final 6μL
1. Se amestecă uşor şi se incubează 5min. la temperatura camerei.
2. Se păstrează pe gheaţă până se pregătesc celulele.
Etapele transformării:
1. Plăcile cu mediu selectiv se preîncălzesc la 37°C timp de 30 min.
2. Pe suprafaţa mediului se distribuie 40μL X-Gal (40mg/mL). Se
distribuie 40μL IPTG (100mM).
3. Se incubează la 37°C.
4. Se adaugă 2μL mix TOPO Cloning într-un tub care conţine celule
E. coli competente. Se agită uşor fără a se pipeta.
5. Se incubează pe gheaţă între 5 şi 30 minute.
6. Se încălzesc rapid celulele la 42°C timp de 30 secunde.
7. Se transferă rapid pe gheaţă.
8. Se adaugă 250 L mediu S.O.C (echilibrat la temperatura camerei).
9. Se agită tuburile orizontal (200 rpm) la 37°C timp de o oră.
10. Se distribuie pe suprafaţa plăcilor (menţinute la 37°C) şi se
incubează peste noapte.
4. Analiza clonelor
12 colonii albe au fost colectate de pe placa de cultură şi au fost
incubate peste noapte în mediu LB cu ampicilină 50μg/mL. S-a preparat
un volum de 1,5mL lizat din cultură din bulion prin fierbere timp de 15
minute.
69
Plasmidul care conţine fragmentul de interes a fost izolat folosind
kitul comercial DNA purification System (Promega cat. no # A1330):
1. 1,5 mL lizat a fost transferat în coloana de separare.
2. Coloana a fost centrifugată la 13.000g timp de 3 minute.
3. Se adaugă 560μL soluţie de spălare.
4. Se centrifughează un minut la 13.000g.
5. Se repetă punctele 3 şi 4.
6. Se eluează coloană cu 250μL apă fără nucleaze (preîncălzită la
65ºC)
7. Se centrifughează pentru colectarea ADN la13.000g, 1 minut.
ADN obţinut a fost utilizat ca matriţă în reacţia de secvenţiere, fo-
losind primerii HCV-UTR-62 FORWARD şi HCV4-E1out REVERSE şi
kitul comercial Big Dye Terminator v3.1 Matrix Standard Kit. Secvenţie-
rea s-a realizat automat pe aparatul ABI PRISM 3100 AVANT GENETIC
ANALYZER.
Secvenţa primerilor HCV Core tip 4 (nested PCR) pentru amplifi-
carea întregii regiuni core
PCR 1 (extern):
HCV-UTR-62-FORWARD 5' - CTT GTG GTA TGC CTG ATAG -
3' (situat la sfârşitul 5'UTR)
HCV4-E1out REVERSE 5' - CAC TAT GCT KGA RTT CGG G A
(situat la începutul regiunii E1)
PCR 2 (nested)
HCV-UTR-22-FORWARD 5'- GAG GTC TCG TAG ACC GTG
CA -3' (in 5'UTR)
HCV4-E1in- REVERSE 5'- ATT CGG GCA RTC RTT GTT GA
(în E1)
Dimensiunea produşilor de amplificare: 700pb PCR extern şi
660pb PCR nested.
70
Rezultatele clonării şi analiza secvenţelor core, core+1
În urma secvenţierii clonelor (12 colonii albe selectate) au fost
obţinute secvenţele integrale din regiunea core (573pb) pentru proba
1600 – genotip 4a, izolată în România.
Scorurile de omologie obţinute prin alinierea cu programul Clus-
tal W între clonele probei 4a din România sunt ridicate, cu valori de 98,
99%. Acest lucru indică faptul că ele sunt foarte asemănătoare, dar nu
identice, datorită prezenţei quasispeciilor în serul pacienţilor infectaţi cu
HCV. Această variabilitate, întâlnită la izolate virale provenite de la ace-
laşi pacient, favorizează apariţia variantelor virale care conturează răs-
punsul imun al gazdei şi produc rezistenţa la tratament. Clona AM-4
prezintă şi o deleţie de 2 nucleotide, în poziţiile 114 şi 115. Scorurile de
omologie dintre aceste clone şi izolatul 4a din Egipt sunt de 95-96%.
Genotipul 4a a fost recent introdus în România. Din 250 de pro-
be genotipate în cadrul programului CEEX, 1,5% sunt de genotip 4a. Se
constată că, deşi genotipul 1b rămâne majoritar, încep să fie introduse
la noi în ţară şi alte genotipuri, specifice unor practici în rândul tinerilor,
cum este utilizarea drogurilor (1a şi 3a). Genotipul 4a este predominant
în Egipt, unde prevalenţa HCV este foarte ridicată, ca urmare a utilizării
unor instrumente contaminate pentru vaccinarea în masă. Este posibil
ca şi genotipul 4a să fi fost introdus în România prin intermediul utilizato-
rilor de droguri pe cale intravenoasă, aşa cum s-a întâmplat în ţări din
Europa (Franţa, Olanda etc.).
Analizând secvenţele integrale ale genei de capsidă, core, la în-
tregul grup al genotipului 4, se constată o variabilitate importantă la sub-
tipurile 4b, 4c, 4d, 4f, şi 4z. Prezenţa numeroaselor subtipuri la ţări din
Africa (ex. Camerun, unde apar şi subtipuri noi - 4t, 4p, 4k) indică faptul
că genotipul 4 a pătruns cu mai mult timp în urmă în aceste ţări decât în
România, astfel încât evoluţia prin mutaţii şi drift antigenic a creat noi va-
riante virale (Njouom R, 2003). Această variabilitate semnificativă poate
71
conduce la performanţe scazute ale kiturilor de diagnostic (cu creşterea
numărului de falşi negativi).
Din studiul filogenetic realizat de noi în două zone genomice (re-
giunea capsidei şi a polimerazei virale – NS5B), rezultă că variantele vi-
rale din cadrul genotipurilor circulante la noi (1b, 1a, 3a şi 4a) nu for-
mează grupuri separate ci se grupeaza cu tulpini de referinţă omologe
sau se intercalează cu tulpini circulante din alte zone geografice.
Cele mai lungi proteine în ORF decalat aparţin subtipurilor 4b, 4z
şi 4r pentru secvenţa subtip 4a (185-187 aa). Trebuie remarcat faptul că
aceleaşi proteine mai lungi prezintă deleţii de câte un aminoacid în poz.
22, 122 şi 136. Clonele AM analizate sunt mai scurte, de 121 aa, la fel
ca tulpina 4a ED-43, endemică în Egipt sau ca alte subtipuri 4, din Ca-
merun, Franţa etc. Nu cunoaştem semnificaţia faptului că unele proteine
core+1 sunt mai lungi decât altele. Acest lucru este corelat, probabil cu
motivele nucleotidice care conduc la „frameshift”-ul în cadru decalat şi la
apariţia unui codon stop care induce revenirea în cadrul normal de citire.
Existenţa acestor proteine core derivate a fost demonstrată in vivo.
Structura variabilă a acestora poate să indice epitopi imunodominanţi di-
feriţi. Variabilitatea constatată în secventele core+1 este probabil corela-
tă cu prevalenţa mai scazută a anticorpilor anti-core+1 (62%) comparativ
cu prevalenţa anticorpilor anti-core (97%) (Komurian-Pradel F, 2004).
Selectarea unor regiuni din core+1 care să constituie
peptidele pe baza cărora s-a dezvoltat sistemul ELISA
În pofida variabilităţii din secvenţele core+1, există totuşi un grad
de conservare între genotipuri la nivelul unor epitopi specifici pentru răs-
punsul celular.
În zona delimitată de sistemul core in-house am identificat pre-
zenţa unor epitopi imunodominanţi T-specifici, unii superpozabili.
72
Epitopi specifici MHC clasa I (class I restricted epitopes, Bain
C, 2004):
APGWVCARL (aa 24-32)
WVCARLGRL (aa 27-35)
RLRSGRNLV (aa 34-42)
Epitopi specifici CTL (HLA-A*0201-restricted CTL epitopes,
Troesch M, 2005):
SLAEFTCCRA (aa 13-22)
CRAGAPDWV (aa 20-28)
ALDRLGAQMI (aa 85-94)
Cu caractere îngroşate sunt marcaţi aminoacizii conservaţi între
genotipuri.
Utilizând aceste peptide într-un sistem ELISA, se poate identifica
prezenţa anticorpilor anti-core+1 în serul pacienţilor HCV+, precum şi
existenţa unei reacţii încrucişate între genotipuri. Epitopii CTL codificaţi
de proteina core+1 (proteina F) pot interveni în patogenie după infecta-
rea gazdei şi expresia proteinei core în cadru normal. Din acest motiv,
proteina core+1 poate reprezenta un candidat potenţial pentru dezvolta-
rea unui vaccin anti-HCV.
Deoarece încă nu există la noi în ţară sisteme de detectare a an-
ticorpilor core+1 în serul pacienţilor, ne-am propus dezvoltarea unui sis-
tem ELISA pentru determinarea dinamicii apariţiei anticorpilor anti-
core+1, faţă de diferite genotipuri şi în diferite stadii ale bolii.
Pe baza rezultatelor obţinute prin alinierea secvenţelor core din
România şi prin analiza secvenţei integrale a regiunii core, obţinută
după clonare, am identificat zone conservate din proteina core +1 care
au servit la construirea de peptide, utilizate la dezvoltarea unui sistem
ELISA, pentru testarea anticorpilor anti-core+1 în serul pacienţilor.
Au fost generate 10 nonapeptide, folosind programele on-line
Peptide Binding Predictions (www.bimas.cit.nih.gov/molbio/hlabind/) şi
SYFPEITHI (www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction)
73
din categoria HLA-A*0201. După generare au fost comandate la firma
Eurogentec din Belgia.
Secvenţele celor 10 peptide selecţionate, specificitatea de geno-
tip, precum şi caracteristicile obţinute de la furnizor sunt prezentate în
Tabelul III.
Nr. crt. Peptid Proteina/Genotip
1 RLPSGHNLV Core+ 1b
2 KLLNGHSLA Core+1 3a
3 SLSPRHVGA Core+1 3a
4 RNLEVDVSL Core+1 1a
5 LVALGLVGA Core+1 1a
6 RLRSGRNLV Core+1 4a
7 WVCARLGRL Core+1 1b/4a
8 WVCARRVKL Core+1 3a
9 WVCARRGRL Core+1 1a
10 QIVGGVYLL Core / Toate genotipurile
Tabel III. Structura nonapeptidelor selectate in sistemul ELISA core+1
Dezvoltarea şi optimizarea noului sistem ELISA pentru
detectarea în serul pacienţilor HCV a anticorpilor anti-core+1
INCDMI Cantacuzino a optimizat următorii parametrii (cu partici-
parea dr. Cornelia Ceianu din INCDMI Cantacuzino şi a dr. Graţiela
Ţârdei, Spitalul Victor Babeş):
a) Diluţia optimă de ser pentru plăcile Greiner s-a dovedit a fi
1/100, iar pentru plăcile MaxiSorp 1/400.
b) Prin încercări succesive, s-a dedus că este necesară diluţia
de conjugat 1/80.000.
c) S-a comparat blocarea situsurilor nespecifice cu albumină
serică bovină şi cu lapte ecremat; nu s-au constatat diferenţe
semnificative între cele 2 procedee. S-a optat pentru lapte
ecremat 5%.
74
d) S-au comparat 2 tipuri de plăci, MaxiSorp (Nunc) şi Greiner.
S-a evidenţiat faptul că, în aceleaşi condiţii, plăcile maxiSorp
au o afinitate de legare a antigenului mai mare decât plăcile
Greiner.
e) Nu s-au evidenţiat diferenţe semnificative între coating-ul cu
100ng şi 200ng antigen. S-a ales varianta cu 100ng antigen.
f) S-a constatat că o perioadă de 15 minute este suficientă pen-
tru developarea reacţiei.
g) Un număr mare de spălări între etapele protocolului duce la o
scădere a legărilor nespecifice.
Protocol final
1. Coating cu 100ng (100μL soluţie 1μg/mL) peptid, 4ºC peste
noapte, placă MaxiSorp Nunc.
2. Se aruncă soluţia de coating.
3. Spălare cu PBS cu Tween 0,05%.
4. Saturare cu 200μL lapte ecremat (5% în PBS cu 0,1%
Tween), o oră la temperatura camerei.
5. Spălare de 5 × (cu PBS cu 0,05% Tween).
6. Adăugare 100μL ser diluat 1/400, incubare 1 oră la 37ºC, în
cameră umedă.
7. Spălare de 5 × (cu PBS cu 0,05% Tween).
8. Adăugare 100μL conjugat cu peroxidază 1/80.000.
9. Spălare de 10 × (cu PBS cu 0,05% Tween).
10. Adăugare substrat TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidină),
100μL, verificare evoluţie culoare.
11. Stopare la 15 minute cu 100μL acid sulfuric 4M.
12. Citire densitate optică la 450nm.
În Fig. 8 sunt prezentate rezultatele realizate cu peptidul 7 (core+1
1b/4a), iar în Fig. 9 sunt prezentate cele realizate cu peptidul 5 (core+1
1a), utilizându-se aceleaşi seruri HCV pozitive şi seruri negative.
75
Fig.8 Rezultatele ELISA pentru peptidul core +1 1b/4a (diluţia de ser 1/400,
diluţia de conjugat 1/80.000, placă MaxiSorp)
Media martorilor negativi = 0.149
Deviaţia standard a martorilor negativi = 0.0629
Valoarea minimă pentru o probă pozitivă = 0.63846
Observaţii: probele 4843 (genotip 1b) şi 3162(genotip 1a) sunt pozitive
0
0.
0.
0.
0.
1
1.
1.
D
Proba
Peptidul 7 Core+1 1b/4a
M
P4843
P4844
P3162
P1600
P2228
P3636
P3205
P2601
P3315
P4611
P4732
P3135
P2940
P1450
P2602
76
Fig.9 Rezultatele ELISA pentru peptidul core +1 1a (diluţia de ser 1/400, diluţia
de conjugat 1/80.000, placă MaxiSorp)
Media martorilor negativi = 0.08875
Deviaţia standard a martorilor negativi = 0.06173
Valoarea minimă pentru o probă pozitivă = 0.45144
Observaţii: probele 4843 (genotip 1b), 3162 (genotip 1a), 3205 (genotip 1b)
sunt pozitive
În acest studiu au fost analizate 30 de probe obţinute de la Spita-
lul Victor Babeş (Partener 2), aparţinând genotipurilor 1b (25 probe), 1a
(3 probe) şi 4a (două probe). Pentru cinci dintre aceste probe s-au de-
tectat anticorpi anticore, iar la trei s-au detectat anticorpi anticore +1
(4843 - 1b, 3162 -1a, 3205 -1b). S-a observat o reactivitate încrucişată
între anticorpii core+1 provenind de la pacienţi infectaţi cu un anumit ge-
notip şi peptidul specific altui genotip.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
DO
Proba
Peptdul 5 Core +1 1a
M
P4843
P4844
P3162
P1600
P2228
P3636
P3205
P2601
P3315
P4611
P4732
P3135
P2940
P1450
P2602
77
În rezumat, INCDMI Cantacuzino (Co) a testat secvenţele din
regiunea core (sistem in-house), pentru prezenţa proteinei în ORF decalat
core+1. Atât secvenţele obţinute în zona RT-PCR in-house, cât şi core
integral, conţin şi proteina core în ORF decalat. Aceasta prezintă o
variabilitate mult mai mare decât proteina codificată în cadru de citire
normal. Au fost selectate 10 peptide care reprezintă epitopi imunodomi-
nanţi pentru interacţia virusului cu limfocitele T, pentru a fi utilizate în sis-
tem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core (peptid 10) şi anti-core+1
specifice pentru genotipurile circulante în Romania (peptidele 1-9).
Sistemul ELISA a fost optimizat prin modificarea unor parametri
(cantitatea de peptid utilizată pentru peliculizarea pe plăci, marca de pla-
că, diluţiile optime de conjugat şi serul de testat, tipul de blocant pentru si-
tusurile nespecifice, timpul de stopare a reacţiei, numărul de spălări etc.).
Serurile a trei pacienti (4843 – genotip 1b, 3205 -1b şi 3162 –
genotip 1a) au prezentat reactivitate încrucişată faţă de cele 3 nonapep-
tide core+1 testate (peptid 4 – 1a; peptid 5 -1a; peptid 7 – 1b/4a). Acest
lucru este posibil datorită faptului că nonapeptidele selectate reprezintă
şi epitopi imunodominanţi T-specifici. Faptul că aceşti epitopi prezintă
funcţii similare (interacţia cu limfocitele T), poate fi explicaţia pentru re-
activitatea încrucişată între subtipurile 1a şi 1b ale aceluiaşi genotip
HCV. Probele pozitive pentru anticorpii core+1 au prezentat încărcături
virale de 153.000UI/mL – proba 4843, genotip 1b, 537.000UI/mL - proba
3205 şi 293.000UI/mL - proba 3162, genotip 1a.
Studiile noastre realizate cu noul sistem ELISA confirmă
prezenţa anticorpilor core+1 în serul unor pacienţi HCV pozitivi din
România.
Şi în Institutul de Virusologie „Şt. S Nicolau” (P1) a fost opti-
mizat un protocol pentru obţinerea unui sistem de detecţie imunoenzimatic
(ELISA) pentru prezenţa în serul pacientilor infectaţi HCV a anticorpilor
anti-core+1. Optimizarea protocolului a implicat, pe de o parte, evaluarea
protocoalelor din literatură, dar şi a celor deja folosite şi iniţiate în Institutul
78
de Virusologie “Şt. S. Nicolau” în timpul epidemiei de meningoencefalitî
West-Nile din România, 1996 (500 de cazuri, 17 decese) (CERNESCU C,
NEDELCU I., TARDEI G., RUTA SM, TSAI T. Continued transmission of West
Nile virus to humans in South-Eastern Romania 1997 - 1998. J Inf Dis, 18
(2), pp. 710-712, 2000).
O altă direcţie cercetată au fost studiile de serotipare realizate în
Institutul de Virusologie “Şt. S. Nicolau” în cadrul epidemiei HIV/SIDA din
România, când folosirea reactivităţii serurilor faţă de peptide sintetice ce
mimau structura glicoproteinelor virale HIV a facut posibilă înţelegerea di-
ferenţelor antigenice între tulpinile HIV1 circulante în România (C.
CERNESCU, RUTA SM. Reactivity of HIV1 positive sera with synthetic pepti-
des; Rev Rom Virol, 44, 3-4, pp 175-186, 1994; CERNESCU C., TARDEI G.,
NECULA A., RUTA SM, C.P. PAU. The serologic significance of F viral geno-
type for Human Immunodeficiency Virus type 1 epidemic. J Inf Dis,170,
pp. 1043-1044, 1994).
În Institutul de Virusologie “Şt. S. Nicolau” s-au realizat standardi-
zarea şi evaluarea reproductibilităţii noului sistem ELISA: peliculizarea
peptidelor selectate din genotipul HCV1, fixarea pe plăci ELISA, identifica-
rea reactivilor necesari şi a concentraţiei optime de utilizat în reacţie. S-a
continuat genotiparea secvenţelor HCV cu ajutorul testului comercial de
genotipare VERSANT™ HCV Genotype 2.0 Assay, Innogenetics pentru
obţinerea unor date referitoare la prezenţa anticorpilor anti-core+1 în serul
pacienţilor infectaţi cu genotipuri diferite de virus hepatitic C.
Materiale şi reactivi
Plăci soft FALCON flexibile plate, 96 well U-Bottom (fund rotunjit)
Tampon de îmbrăcare: PBS 0,01M,pH 7,4
0,01%merthiolate
0,1%Tween-20, se păstrează la 40C
Tampon carbonat 0,05M/L, pH=9,6, pentru peliculizarea peptide-
lor sintetice pe suprafaţa plăcii, apoi acestea sunt lăsate 18 ore
şi spălate de 2 ori înainte de a pune probele.
79
Tampon de spălare: PBS 0,01M, pH 7,4
0,01% merthiolate
0,1% Tween 20, se păstrează la 40C
Diluant de probe: PBS, 0,01M, pH 7,4 (realizând blocarea la
această etapă)
0,01% merthiolate
0,1% Tween 20
+/- 5% lapte ecremat, se păstrează la 40C,
maxim 4 sapt.
Tampon carbonat-bicarbonat 0,05 M pH 9,6, pentru peliculizare
(SIGMA - 0,005M carbonate-bicarbonate buffer pH9,6)
Conjugat anti-IgG uman cuplat cu peroxidază (PROMEGA - anti –
human IgG (H+L), HRP) se păstrează la 40C, sau 200C, alicotat);
diluţia 1:2500 este cea specificată de producător. Optimizările
Institutului de Virusologie au inclus: 1:2.500, 1/5.000, 1/10.000, iar
dilutia optimă din studiile noastre este 1/10.000.
Tampon substrat corespunzător enzimei din conjugat
(PROMEGA - TMB one solution - chromogen substrate, 3,3,5,5-
tetrametylbenzidine) se păstrează la 40C.
Linie ELISA:
incubator 370C pentru plăci cu 96 godeuri;
spălător automat de plăci;
spectrofotometru pentru citirea plăcilor cu 96 godeuri, cu po-
sibilitate de citire la lungime de undă corespunzătoare (pentru
reactivii folosiţi: filtru de 450nm, cu filtru de referinţă 620nm).
Pipete automate: simple, fixe de 10µL şi 100µL şi/sau reglabile
între 1-10µL şi 20-100µL.
Pipete automate multichannel reglabile pentru 90µL şi 100µL
Vârfuri adaptate pipetelor automate
Pipete de 5mL şi 10mL şi pară sau Pipetus
Tuburi de 12mL şi 50mL
80
Recipiente pentru lichidele de distribuit cu pipeta multichannel,
vas cu soluţie hipoclorit pentru aruncat vârfurile, hârtie de filtru,
cronometru.
Optimizarea protocolului de lucru
ZIUA 1
1. Prepararea solutiei stoc de peptid s-a realizat după următorul
algoritm:
diluţia peptidului se realizează în tampon carbonat/bicar-
bonat pH=9,6;
concentraţia peptidului trebuie adusă de la Cs=200µg/mL
la o concentraţie finală Cf=2µg/mL (stocare la -200C);
optimizarile Institutului de Virusologie au indicat o con-
centraţie finală bună Cf=1µg/mL pentru peptidul 5/1a şi
peptidul 7 1b/4°.
2. Peliculizarea plăcuţelor cu peptid: în această etapă s-au în-
cercat numeroase optimizări ale protocolului de lucru: am in-
cubat cu câte 100µL/godeu tampon carbonat + peptid 2µg
sau 1µg/mL (0,2µg = 200ng); rezultatele noastre nu indică di-
ferenţe majore, cu excepţia unei uşoare stabilizări la o con-
centraţie finală de peptid de 1µg/mL.
O cantitate de 2µg/mL de peptid sintetic (2.000ng/mL) a fost
peliculizată (incubată overnight la 40C pe plăcile soft în tam-
pon carbonat-bicarbonat 0,1M pH 9,6 (în unele optimizări
chiar peste 18 ore); alte plăci au fost peliculizate în acelaşi
mod, dar variind concentraţiile de peptid (concentraţia finală
de peptid 20µg/mL, 2µg/mL, 0,2µg/mL, 1µg/mL şi 0,1µg/mL).
Plăcuţele se acoperă cu folie/capac pentru evitarea evaporă-
rii pe durata celor 18 ore.
Institutul de Virusologie a primit peptidele achiziţionate de
coordonatorul de proiect de la EUROGENTEC-LIEGE Belgia.
81
ZIUA 2
1. Spălarea plăcuţei de 2-3 ori cu 250µL solutie de spălare
(PBS, 0,01% Merthiolate şi 0,05% Tween 20) la spălătorul de
plăci Plate Washer DAS, cu programul corespunzător.
2. Blocarea siturilor nespecifice:
a) Varianta 1 - blocarea siturilor nespecifice prin incubarea
în godeuri la 370C timp de 1 oră a 200μL soluţie de bloca-
re (fie PBS cu 5% lapte ecremat şi 0,05% Tween 20, fie
PBS cu 2% BSA şi 0,05% Tween 20.
b) Varianta 2 - blocare prin adăugarea a 5% lapte ecremat în
diluantul de probe (se poate face diluţia probelor direct în
PBS cu lapte ecremat), se lasă la incubat 1 oră la 37oC.
După studiile noastre, nu există diferenţe de blocare la
BSA şi 5% lapte ecremat, alegând diluţia probelor în dilu-
antul de spălare.
3. Diluţia probelor se face prin optimizări: (1/50, 1/100, 1/200,
1/400, 1/800, 1/1600 – grupul nostru de studiu a ales 1/100 şi
1/200 - se lasă la incubat 1 oră la 370 C.
4. Se distribuie 100µL ser diluat/godeu şi se incubează cu pepti-
dul imobilizat pentru 1 oră la 370C.
5. Spălarea de 6-10 ori cu soluţie de spălare.
6. Adăugarea a 100µL de conjugat anti-human Ig G marcat cu
peroxidază în lapte ecremat 5%, în PBS plus 0,05 Tween. Di-
luţiile de conjugat încercate au fost cuprinse între 1/5.000 şi
1/10.000); rezultatele obţinute sunt similare pentru blocare cu
BSA 1% în PBS cu dry milk sau cu BSA 2% în acelaşi tam-
pon/BSA 2% în PBS - timp de incubare 1 oră la 370C.
7. Spălare de 5 ori până la 10 × soluţie de spălare.
8. Adăugarea substratului TMB one solution (PROMEGA), câte
100 L/godeu timp de aprox. 5 min.
9. Stoparea reacţiei cu acid sulfuric 2M, 50-100µL/godeu.
82
10. Citire la spectrofotometru la lungime de undă 450nm, cu filtru
de referinţă 620 nm.
Rezultatele optimizării protocolului
Plăcuţe soft sau clear microplate (cod DY990, R&D) - se ob-
servă o peliculizare mai bună pe plăcuţele clear microplate.
Peliculizarea diferită a plăcuţelor: cu concentraţii finale de
peptid 200ng şi 100ng/mL. Diluţia probelor: încercări diluţii diferite
1/10, 1/50, 1/100, 1/1.000, diluţia probelor făcându-se în diluantul de
probe menţionat la reactivii necesari. Am ales diluţia probelor în PBS cu
0,05%Tween 20.
Tamponul de blocare - nonfat-dry milk 5% în tamponul de spă-
lare menţionat anterior, am încercat şi 2% BSA pentru blocare, neapă-
rând diferenţe majore.
Diluţia conjugatului: o placă cu conjugat la diluţia 1/10000, dată
de furnizor (PROMEGA),
Temperatura de lucru: incubare probe/conjugat/substrat a fost
variată între 37oC şi alte temperatura camerei - conform altor protocoale,
fără a se observa o diferenţă semnificativă.
Validarea testului:
- DO pentru martorii negativi să fie mai mic de 0,300
- DO pentru martorul (martorii) pozitiv să fie peste 0.800
Stabilirea cut-off:
CO = MN +3 DS, unde:
MN - media martorilor negativi (4 martori negativi cel puţin)
DS - deviaţia standard
Aprecierea reactivităţilor. Se calculează reactivitatea faţă de
peptidele peliculizate scăzând din valoarea DO obţinută pentru godeul
îmbrăcat valoarea DO obţinută pentru godeul cu îmbrăcare mock, pen-
tru aceeaşi probă/acelaşi martor. DO a unui pool de 30 martori negativi
testaţi individual este folosită pentru calcularea DO medii (media aritme-
tică). Se calculează abaterea faţă de DO medie a fiecărui martor negativ
83
obţinând astfel media abaterilor (deviaţia standard =DS). Se calculează
DS, deviaţia standard obţinută este de ± 0,071. Se apreciază prezenţa
IgG specifice pentru peptidele peliculizate în probele testate, astfel:
Negativă: dacă DO a probei este < valoarea cut-off.
Pozitivă: dacă DO a probei este > valoarea cut off. Se poate
lua ]n considerare şi o zonă gri de 10-15% din valoarea cut-
off, pentru care probele se consideră indeterminate.
În Institutul de Virusologie s-au testat 27 de seruri provenite de la
pacienţi HCV-pozitivi din lotul selectat în etapele anterioare, foarte bine
caracterizaţi din punct de vedere serologic şi molecular. Genotiparea
probelor a indicat: 26 au genotipul 1b şi o probă are genotipul 1a.
Testarea serologică imunoblot de generaţia a 3 - Deciscan HCV
PLUS –BIORAD a fost realizată, de asemenea, la toate probele. Pentru
peptidul 10/core, care reacţionează cu anticorpii anticore totali din serul
pacienţilor infectaţi HCV, indiferent de genotipul implicat, DO pentru pro-
bele testate este cu mult peste valoarea prag calculată (DO medie =
1.279 ± 0.537, la CO=0,450). Numai 2 probe sunt sub această valoare,
ambele fiind de genotip 1b şi prezentând banda core pozitivă în testul
imunoblot de generaţia a 3a.
Pentru peptidul 5/1, care reacţionează cu anticorpii anticore+1
din serul pacienţilor infectaţi cu genotipul 1a HCV, DO variază mai mult,
totuşi distingându-se 20 de teste pozitive, deşi majoritatea pacienţilor
studiaţi sunt infectaţi cu genotipul 1b.
Pentru peptidul 7 1b/4, care reacţionează cu anticorpii anti-
core+1 din serul pacientilor infectaţi cu genotipul 1b sau 4a, DO se situ-
ează peste prag la majoritatea serurilor, 1b fiind genotipul regăsit în 26
dintre probe.
Atât în studiile realizate în cadrul acestui proiect, cât şi din
literatură se constată că la nivelul răspunsurilor imune umorale există
cross-reactivitate antigenică printre proteinele core+1 derivate din subti-
puri HCV diferite, în legătură cu gradul înalt de conservare intersubtipuri
84
ale secvenţelor de aminoacizi ale proteinei. Imunitatea mediată celular
faţă de proteina core+1 poate fi detectată la mulţi pacienţi co-infectaţi cu
HCV şi HIV. Aceste răspunsuri pot fi cross-reactive între subtipurile de
HCV. Troesch şi colab. (2005) au studiat prevalenţa şi caracteristicile
răspunsurilor imune mediate umoral şi celular faţă de proteina F a HCV
la pacienţii co-infectaţi cu HIV. Rezultatele studiului au indicat că la paci-
enţii co-infectaţi cu HCV şi HIV-1 pot creşte valorile imunoglobulinelor şi
răspunsurile limfocitelor T citotoxice (CTL) faţă de proteina F (core+1) a
HCV. Răspunsurile imunologice sunt comparabile cu cele observate la
pacienţii infectaţi doar cu HCV.
Deoarece secvenţele proteinei core+1 sunt constrânse de pre-
zenţa structurilor secundare ARN şi de suprapunerea pe secvenţele
core, nivelul lor de conservare intersubtip este important. Epitopii CTL
codificaţi în această regiune ar putea fi mai puţin susceptibili la mutaţii
faţă de alte segmente ale genomului HCV, cum ar fi E1,E2 şi NS3.
CONCLUZII
Rezultatele acestui proiect permit formularea următoarelor reco-
mandări pentru laboratoarele de diagnostic şi pentru clinicienii implicaţi
în tratamentul şi monitorizarea pacienţilor cu infecţie HCV:
1. Necesitatea utilizării unui prag critic al reactivităţii serurilor în EIA,
pentru stabilirea rezultatelor real pozitive şi pentru aprecierea
oportunităţii unor teste suplimentare de confirmare. Stabilirea co-
relaţiei dintre reactivitatea mare a serurilor în testele imunoenzi-
matice de triaj şi prezenta unei replicări virale active permite scă-
derea semnificativă a costului asociat investigării pacienţilor.
2. Obligativitatea utilizării testelor moleculare ca element decisiv în
aprecierea infectivităţii, care permit în cadrul diagnosticului HCV
monitorizarea corectă a pacienţilor şi crearea unei baze uniforme
de date clinice şi virusologice.
85
3. Necesitatea unor noi studii pentru a determina eventuala contri-
buţie a genotipurilor HCV la apariţia rezultatelor imunoblot inde-
terminate cu PCR pozitiv, cu impact direct asupra perioadei de
administrare a tratamentului antiviral şi asupra monitorizării efici-
ente a acestuia.
În urma analizei factorilor de risc la lotul de pacienţi infectaţi,
UMF Bucureşti sugerează implicarea intervenţiilor injectabile efectuate
în condiţii nesterile, cu seringi şi ace folosite în serie la mai mulţi pacienţi
înainte de 1989. Calea de transmitere nosocomială fiind prezentă mai
ales în ţările în curs de dezvoltare, este indicată implicarea în continuare
a Autorităţilor de Sănătate Publică în limitarea manevrelor injectabile
strict la cazurile necesare şi implementarea folosirii instrumentarului de
unică folosinţă. Deşi în ultimele decade numărul injecţiilor suplimentare
a fost limitat, totuşi acestea sunt în continuare folosite de rutină în trata-
rea anumitor boli şi, uneori, în mediul extraspitalicesc. Acestea disemi-
nează infecţia HCV, HBV şi infecţia HIV, ceea ce ar putea determina o
creştere a morbidităţii acestor infecţii în următorii ani. Riscul transmiterii
HCV prin transfuzii de sânge fiind mult diminuat după introducerea
screening-ului sângelui, rămâne în acest fel prevalent riscul transmiterii
prin injecţii, intervenţii chirurgicale sau stomatologice realizate în condiţii
improprii de sterilizare.
Studiul Institutului de Virusologie a urmărit evaluarea eficienţei
screening-ului prin EIA-3 în identificarea pacienţilor potenţial infecţioşi,
capabili să transmită infecţia cu virus hepatitic C, prin compararea rezul-
tatelor testului EIA cu rezultatele testelor biochimice (nivelul ALT), ale
testelor de confirmare imunoblot şi moleculare, detecţia ARN-HCV prin
RT-PCR fiind considerată markerul standard de infectivitate virală. Re-
zultatele obţinute arată că o reactivitate mare în EIA anti-HCV este
aproape întotdeauna indicatoare pentru infecţia HCV, putându-se recur-
ge direct la testarea statusului replicării virale (ARN-HCV plasmatic), fă-
86
ră necesitatea unui test de confirmare. Această informaţie poate fi apli-
cată în toate laboratoarele care realizează diagnosticul infecţiei HCV.
Se recomandă testarea ARN-HCV pentru diagnosticarea infecţiei
HCV la pacienţii imunosupresaţi. De asemenea, se propune introduce-
rea în clinică a evaluării timpurii a răspunsului la tratament (la 12 săptă-
mâni de la iniţiere) ca marker de prognostic pentru obţinerea unui răs-
puns virusologic susţinut, cu impact major asupra deciziei de a iniţia sau
opri tratamentul, şi asupra costurilor asociate tratării recăderilor sau eşe-
curilor virusologice.
Conform analizelor efectuate în Spitalul Victor Babeş, rata cea
mai mare de transmitere a infecţiei HCV o reprezintă tratamentele sto-
matologice (81%) şi intervenţiile chirurgicale (75%), urmate de tratamen-
tele injectabile multiple (48%) şi de transfuziile de sânge (40%). Aceste
informaţii sunt extrem de importante pentru prevenirea infecţiilor legate,
în special, de tratamentele parenterale.
De asemenea, analiza atentă a ratei de diversificare a genotipu-
rilor circulante aduce informaţii valoroase privind extinderea epidemiei la
grupe populaţionale vulnerabile (toxicomani, homosexuali, pacienţi cu
imunosupresie HIV-indusă, pacienţi cu infecţii cu transmitere sexuală) şi
permite formularea în timp real a unor strategii de prevenţie şi control.
Rata recăderilor poate fi redusă la pacienţii cu răspuns virusolo-
gic lent, extinzând durata terapiei combinate de la 48 la cel puţin 72 săp-
tămâni. În aceste condiţii, incidenţa recăderilor scade de la 50 la 20%.
În rezumat, INCDMI Cantacuzino a proiectat două sisteme de
RT-PCR în regiunile core şi NS5B, pe care le-a optimizat. Colectivul din
acest institut a fost implicat în testarea molecularǎ a probelor (PCR: opti-
mizarea şi evaluarea sensibilitǎţii reacţiei, genotipare prin RFLP, sec-
venţiere), analiza informaticǎ a secvenţelor şi analiza epidemiologicǎ.
INCDMI „Cantacuzino” a testat un număr semnificativ de seruri
utilizând markerii moleculari dezvoltaţi în regiunile genomice core şi
NS5bB. Genotiparea a fost realizată în 5’NCR prin analiza fragmentelor
87
de restricţie (RFLP) şi confirmată prin PCR, secvenţiere şi analiză filoge-
netică în core şi NS5B.
Din studiul molecular realizat în Institutul Cantacuzino, a rezul-
tat că subtipul HCV predominant este 1b (95%). Pe lângă acesta, au
mai fost identificate şi alte subtipuri, cum sunt 1a (3%) şi 3a (0,5%),
întâlnite mai ales la utilizatorii de droguri, 2a (în Republica Moldova), dar
şi un subtip cunoscut ca fiind endemic în Egipt – 4a (1,5%).
INCDMI „Cantacuzino” a testat secvenţele din regiunea core (sis-
tem in-house) pentru prezenţa proteinei în ORF decalat, core+1. A reali-
zat clonarea integrală a genei codificatoare pentru capsida HCV – core
din gentipul 4a, izolat în România, utilizând primeri situaţi în zonele adia-
cente core (5’UTR si E1) şi sistemul de clonare TOPO TA Cloning. Atât
secvenţele core scurte (300pb), cât şi secvenţele core integral au fost
aliniate cu programul Clustal W şi analizate pentru evaluarea variabilităţii
şi a prezenţei core+1 cu programul BioEdit. Atât secvenţele obţinute în
zona RT-PCR in-house, cât şi core integral conţin şi proteina core în
ORF decalat. Aceasta prezintă o variabilitate mult mai mare decât prote-
ina codificată în cadrul de citire normal. Clonele core sunt foarte asemă-
nătoare între ele, dar nu identice, reflectând prezenţa cvasispeciilor la
acelaşi pacient. Între subtipurile genotipului 4, izolate în diferite zone
geografice, există diferenţe importante. De asemenea, secvenţele clone-
lor, ca şi ale multor subtipuri 4, sunt mai scurte (121aa) decât ale altor
subtipuri (4b, 4z şi 4r).
Au fost selectate zece peptide, care reprezintă epitopi imu-
nodominanţi pentru interacţia virusului cu limfocitele T, pentru a fi
utilizate în sistem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core+1.
Toate secvenţele aliniate în zona core, desemnată prin sistemul
nostru, prezintă şi proteina core +1. Identificarea in silico a prezenţei
proteinei în ORF decalat core+1 la izolatele de diferite genotipuri din
România, a fost confirmată într-un sistem ELISA cu peptide sintetice,
derivate din secvenţele tulpinilor circulante în România. Atât Co cât şi
88
P1, au obţinut rezultate pozitive în ELISA pentru core+1. Reactivitatea
încrucişată a anticorpilor anti-core+1 din serul pacienţilor cu genotip 1b
faţă de peptidele core+1 specifice genotipului 1a, poate fi explicată prin
faptul cp proteinele core alternative prezintǎ un domeniu comun pentru
genotipurile 1a şi 1b (Bain, 2004).
Dezvoltarea acestui sistem ELISA poate reprezenta un mijloc
complementar de diagnostic şi deschide perspectiva unor noi terapii,
care ţintesc proteinele HCV sintetizate în cadru de citire alternativ. Avan-
tajul acestui sistem faţă de sistemele comerciale actuale este că ar pu-
tea identifica prezenţa infecţiei HCV indiferent de genotip.
Continuarea supravegherii tulpinilor virale circulante este indis-
pensabilă în vederea obţinerii unor date suplimentare asupra epidemiei
HCV în România. Rezultatele noastre indică o diversificare a genotipuri-
lor circulante, sugestivă pentru apariţia unor noi grupe de risc, cu căi de
transmitere distincte faţă de cele recunoscute la ora actuală în România.
Genotipurile 1a, dar şi 3a, sunt mai frecvent raportate la utilizato-
rii de droguri injectabile (UDIV). Istoria reconstruită a epidemiei HCV în-
registrează o creştere exponenţială a incidenţei subtipurilor 1a şi 3a în
Europa, care tind să înlocuiascî genotipul 1b majoritar până în prezent
89
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. ANTIPA C, POPESCU A, TELEGUŢĂ M, RUŢĂ S, CERNESCU C, ŢÂRDEI G, COPE-
LOVICI Y, STOIAN M, TIVGĂ N, HOINĂRESCU M ET AL. 1993 Seroprevalence of
hepatitis C virus among the multiply transfused. Rom J Virol;44(1-2):9-15.
2. ANTIPA C, RUŢĂ S, CERNESCU C. 1996 Serological profile assessment of the
infection with hepatitis C virus (HCV) in haemophiliacs and thalassemic
patients. Rom J Virol;47(1-4):3-11.
3. BAIN C, P PARROCHE, JP LAVERGNE, B DUVERGER, C VIEUX ET AL. 2004. Me-
mory T-cell-mediated immune responses specific to an alternative core
protein in hepatitis C virus infection. J Virol 78:10460-10469.
4. BUKH J, R H PURCELL, AND RH MILLER. 1992. Importance of primer selection
for the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reacti-
on assay. Proc Natl Acad Sci USA 89:187-191.
5. COHEN, J. 1999. The scientific challenge of hepatitis C. Science 285:26-30.
6. COLINA R, CASANE D, VASQUEZ S, GARCIA-AGUIRRE L, CHUNGA A, ROMERO H,
KHAN B, CRISTINA J. 2004 Evidence of intratypic recombination in natural
populations of hepatitis C virus. J Gen Virol ;85(Pt 1):31-7.
7. HOUGHTON M. Hepatitis C Viruses. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM
(eds). Fields Virology, 3rd edn.New York:Raven Press , 1035-1058. 2002.
8. IANCU LS, PANDELE GI, STANCIU C, LUCA V. 2002 Hepatitis C virus serotypes
in Romanian patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Rev Med Chir Soc
Med Nat;106(1):79-82.
9. KALININA, O., H. NORDER, S. MUKOMOLOV, AND L. O. MAGNIUS. 2002. A natu-
ral intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Peters-
burg. J Virol 76:4034-4043.
10. KATO, N. 2000. Genome of human hepatitis C virus (HCV): gene organizati-
on, sequence diversity, and variation. Microb Comp Genomics 5:129-15.
11. KOMURIAN-PRADEL F, RAJOHARISON A ET AL. 2004. Antigenic Relevance of F
Protein in Chronic Hepatitis C Virus Infection. Hepatology, 40 (4):900-909.
12. MARISOL DEVESA , KHUDYAKOV YE, CAPRILES F, BLITZ L, FIELDS HA, LIPRANDI
F, PUJOL FH 1997, Reduced antibody reactivity to hepatitis C virus antigens
in hemodialysis patients coinfected with hepatitis B virus. Clin Diagn Lab
Immunol 4(6):639-42.
90
13. NAOUMOV, NV 1999. Hepatitis C virus infection in Eastern Europe. Journal
of Hepatology 31 (Suppl. 1): 84-87.
14. NEVILLE, JA, LE PRESCOTT, V BHATTACHERJEE, N ADAMS, I PIKE, B RODGERS,
AEL ZAYADI, S HAMID, GM DUSHEIKO, AA SAEED, GH HAYDON, AND P.
SIMMONDS. 1997. Antigenic variation of core, NS3, and NS5 proteins among
genotypes of hepatitis C virus. J Clin Microbiol 35:3062-3070.
15. NJOUOM R, PASQUIERC,AYOUBA A, SANDRES-SAUNE K, MFOUPOUENDOUN J,
MONY LOBE M, TENE G, THONNON J, IZOPET J, NERRIENET E. 2003. Hepatitis
C virus infection among pregnant women in Yaounde, Cameroon: Prevalen-
ce, viremia, and genotypes. J Med Virol 69:384–390.
16. PENIN F, DUBUISSON J, REY FA, MORADPOUR D, PAWLOTSKY JM. 2004
Structural biology of hepatitis C virus. Hepatology 39(1):5-19.
17. PURCELL R. The hepatitis C virus: overview. Hepatology 1997;26:11S–14S.
18. PYBUS OG, COCHRANE A, HOLMES EC, SIMMONDS P. 2005 The hepatitis C
virus epidemic among injecting drug users. Infect Genet Evol 5(2):131-9.
19. REED KE, RICE CM. Overview of hepatitis C virus genome structure, poly-
protein processing, and protein properties. Curr Top Microbiol Immunol
2000; 242:55– 84.
20. RICHTER SS. 2002 Laboratory assays for diagnosis and management of he-
patitis C virus infection. J Clin Microbiol 40(12):4407-12.
21. SIMMONDS P, BUKH J, COMBET C, DELEAGE G, ENOMOTO N, FEINSTONE S,
HALFON P, INCHAUSPE G, KUIKEN C, MAERTENS G, MIZOKAMI M, MURPHY DG,
OKAMOTO H, PAWLOTSKY JM, PENIN F, SABLON E, SHIN-I T, STUYVER LJ,
THIEL HJ, VIAZOV S, WEINER AJ, WIDELL A. 2005 Consensus proposals for a
unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes. Hepatology
42(4):962-73.
22. SIMMONDS, P. 1999. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus. J Hepatol
31 [Suppl 1]:54-60.
23. SMITH DB, MELLOR J, JARVIS LM, DAVIDSON F, KOLBERG J, URDEA M, ZAP P-L,
SIMMONDS P & THE INTERNATIONAL HCV COLLABORATIVE STUDY GROUP.
1995. J Gen Virol 76:1749-1761. Variation of the hepatitis C virus 5’ non-co-
ding region: implications for secondary structure, virus detection and typing.
91
24. TROESCH M, JALBERT E, CANOBIO S ET. AL. 2005. Characterization of humo-
ral and cell-mediated immune responses directed against HCV F protein in
subjects co-infected with hepatitis C virus and HIV-1. AIDS 19:775-784.
25. TSUKIYAMA-KOHARA K, IIZUKA N, KOHARA M, NOMOTO A 1992 Internal riboso-
me entry site within hepatitis C virus RNA. J Virol 66(3):1476-83.
26. VARAKLIOTI, A, N VASSILAKI, U GEORGOPOULOU, AND P MAVROMARA 2002.
Alternate translation occurs within the core coding region of the hepatitis C
viral genome. J Biol Chem 277:17713-17721.
27. WALEWSKI JL, KELLER TR, STUMP DD, BRANCH AD. Evidence for a new
hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame. RNA
2001;7:710 –721.
28. WALEWSKI, JL, JA GUTIERREZ, W BRANCH-ELLIMAN, DD STUMP, TR KELLER, A
RODRIGUEZ, G BENSON, AND AD BRANCH. 2002. Mutation Master: profiles of
substitutions in hepatitis C virus RNA of the core, alternate reading frame,
and NS2 coding regions. RNA 8:557-571.
29. WOLF M, DIMITROVA M THOMAS F. BAUMERT AND CATHERINE SCHUSTER. The
major form of hepatitis C virus alternate reading frame protein is suppres-
sed by core protein expression. Nucleic Acids Res 2008 May; 36(9): 3054–
3064.
30. XU, Z, J CHOI, TS YEN, W LU, A STROHECKER, S GOVINDARAJAN, D CHIEN, MJ
SELBY, AND J OU. 2001. Synthesis of a novel hepatitis C virus protein by ri-
bosomal frameshift. EMBO J 20:3840-3848.
31. ZEIN, NN. 2000. Clinical significance of hepatitis C virus genotypes. Clin
Microbiol Rev 13:223-235.
92
