Ing. Elena CIOCÎRLANold.unitbv.ro/Portals/31/Sustineri de doctorat/Rezumate2014/Ciocirlan.pdf ·...

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013

Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”

Domeniul major de intervenţie 1.5. „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării”

Titlul proiectului: Burse doctorale si postdoctorale pentru cercetare de excelenta Numărul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/134378

Beneficiar: Universitatea Transilvania din Braşov

Partener:

Universitatea Transilvania din Brasov

Scoala Doctorala Interdisciplinara

Departament: Silvicultură

Ing. Elena CIOCÎRLAN

STRUCTURA GENETICĂ ÎN POPULAȚII MARGINALE DE

FAG (Fagus sylvatica L.) DIN ROMÂNIA – EVALUĂRI CU

MARKERI MOLECULARI

GENETIC STRUCTURE OF MARGINAL BEECH (Fagus sylvatica

L.) POPULATIONS IN ROMANIA – EVALUATIONS USING

MOLECULAR MARKERS

Conducător ştiinţific

Prof.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA

BRAȘOV, 2014

Structura genetică în populații marginale de fag (Fagus sylvatica L.) din România - evaluări cu markeri moleculari

2

D-lui (D-nei) ...............................................................................................

COMPONENŢA

Comisiei de doctorat

Numită prin ordinul Rectorului Universităţii „Transilvania” din Braşov

Nr. 6878 din 29.09.2014

PREŞEDINTE: Prof.dr.ing. Ovidiu IONESCU

Universitatea Transilvania din Brașov

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof.dr.ing. Neculae ȘOFLETEA


REFERENŢI: Conf.dr.ing. Liviu FĂRTĂIȘ

Universitatea Ștefan cel Mare din Suceava

Cercet.șt.gr.II, dr.ing. Flaviu POPESCU

I.C.A.S. București

Prof.dr.ing. Alexandru Lucian CURTU


Data, ora şi locul susţinerii publice a tezei de doctorat: 06.11.2014, ora 11,

sala SI2.

Eventualele aprecieri sau observaţii asupra conţinutului lucrării vă rugăm să

le transmiteţi în timp util, pe adresa Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere,

Brașov, Șirul Beethoven, nr. 1, 500123, la numărul de fax: 0268.475705 sau la adresa

de e-mail [email protected].

Totodată vă invităm să luaţi parte la şedinţa publică de susţinere a tezei de

doctorat.

Vă mulţumim.

MINISTERUL EDUCAŢIEI NAŢIONALE

UNIVERSITATEA “TRANSILVANIA” DIN BRAŞOV

BRAŞOV, B-DUL EROILOR NR. 29, 500036, TEL. 0040-268-413000, FAX 0040-

268-410525

RECTORAT


3

Mulțumiri

De-a lungul întregii activităţi de cercetare am primit sprijinul profesorilor,

colegilor, prietenilor şi familiei şi consider ca aici este locul potrivit în care să-mi

exprim recunoştinţa faţă de toţi cei care m-au ajutat prin sugestiile, ideile şi mai cu

seamă criticile lor.

Doresc să mulțumesc în primul rând, conducătorului științific al tezei de

doctorat, domnului prof. univ. dr. ing. Neculae ȘOFLETEA, pentru încrederea

acordată la începutul acestui stagiu de doctorat, dar și pentru sprijinul necondiționat,

atât pe plan moral , cât și științific oferit în decursul celor trei ani. Prin profesionalismul

său, prin tactul pedagogic, înțelegerea, răbdarea și cunoștiințele științifice insuflate a

contribuit enorm la elaborarea acestei teze, dar mai ales în formarea și evoluția mea pe

plan profesional.

Recunoştinţa mea se îndreaptă de asemenea spre domnul Decan al Facultății

de Silvicultură și Exploatări Forestiere, prof. univ. dr. ing. Alexandru Lucian CURTU

pentru orientarea de excepţie în cercetarea din domeniul Geneticii Forestiere, pentru

importantele sfaturi și sugestii oferite în conceperea și finalizarea prezentului studiu,

precum și pentru modul în care a știut să mă facă să țintesc spre perfecționalism în

scopul atingerii culmilor celor mai înalte în carieră.

Îi mulțumesc pe această cale și domnului Rector, prof. univ. dr. ing. Ioan

Vasile Abrudan, pentru sprijinul logistic și material oferit pentru desfășurarea

cercetărilor.

Adresez mulțumiri membrilor comisiilor de susținere a referatelor științifice

pentru amabilitatea, observațiile pertinente și sugestiile oferite.

Mulțumiri adresez, de asem enea, tuturor profesorilor pentru răbdarea de

care au dat dovadă de fiecare dată și sfaturile utile oferite în formarea mea ca viitor

cercetător.

În mod deosebit aş dori să mulţumesc actualilor şi foştilor colegi de doctorat

care au contribuit la iniţierea mea în tainele geneticii moleculare. Mulțumesc d-lui tehn.

ing. Andras TOTHPAL pentru ajutorul acordat la recoltarea materialului vegetal

supus analizelor genetice

În mod deosebit mulțumesc familiei mele, care m-a sprijinit, m-a ajutat din

toate punctele de vedere şi mi-a fost alături, ori de câte ori a fost nevoie: părinților

Mihai și Elena pentru răbdarea şi înţelegerea cu care m-au înconjurat, fraților Mihai

și Costel, cumnatei mele Alina și celor mai scumpi nepoței: Octavian și Andrei pentru

încredere, suport, încurajare și pentru că au știut să ma facă să zâmbesc și să trec peste

cele mai grele momente. Rămân profund recunoscătoare bunicilor mei, care mi-au

insuflat dragostea pentru lucrul bine făcut, cinste şi omenie.

Nu în ultimul rând, doresc să adresez mulțumirile cuvenite tuturor prietenilor

care mi-au fost alături în momentele grele și care direct sau indirect m-au susținut și

încurajat, dar m-ai presus de toate m-au făcut să am încredere în mine.


4

CUPRINS

INTRODUCERE ............................................................................................................ 8

CAPITOLUL 1: STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR PRIVIND

VARIABILITATEA MORFOLOGICĂ ȘI DIVERSITATEA GENETICĂ A

FAGULUI ...................................................................................................................... 9

1.1. Considerații generale privind genul Fagus ......................................................... 9

1.2. Aspecte privind variabilitatea taxonomică pe baza caracterelor morfologice .. 10

1.3. Analize genetice efectuate cu ajutorul microsateliților ......................................... 12

CAPITOLUL 2: SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR ............................. 15

2.1. Scopul cercetărilor ............................................................................................ 15

2.2. Obiectivele cercetărilor ..................................................................................... 15

CAPITOLUL 3: MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE.................................. 17

3.1. Materialul și metoda de cercetare pentru observațiile morfologice .................. 17

3.1.1. Material de cercetare .......................................................................................... 17

3.1.2. Metode de analiză morfologică .......................................................................... 17

3.2. Materialul și metoda de cercetare pentru evaluarea diversității genetice.......... 20

3.2.1 Materialul de studiu și localizarea cercetărilor .................................................... 20

3.2.2. Efectuarea analizelor de laborator ...................................................................... 22

3.2.2.1. Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului .......................................... 22

3.2.2.2. Reacția de polimerizare în lanț (PCR) ............................................... 23

3.2.2.3. Electroforeza capilară și interpretarea electroforegramelor .............. 24

3.2.3. Analiza datelor genetice rezultate ...................................................................... 25

3.2.3.1. Prezența alelelor nule, structura Hardy-Weinberg și dezechilibrul

linkage ............................................................................................................ 25

3.2.3.2. Calculul parametrilor genetici ........................................................... 27

3.2.3.3. Structura genetică populațională ....................................................... 28

3.2.3.4. Stabilirea numărului de clustere genetice .......................................... 30

3.2.3.5. Identificarea de schimbări ale structurii populațiilor datorate efectului

de “gât de sticlă” ............................................................................................ 30

3.2.3.6. Testarea acțiunii selecției .................................................................. 32

CAPITOLUL 4: REZULTATE ȘI DISCUȚII ............................................................. 33

4.1. Rezultatele analizelor morfologice ................................................................... 33

4.1.1.Variabilitatea intra și interpopulațională a taxonilor din genul Fagus ................ 33


5

4.1.2. Evaluarea variabilității morfologice prin utilizarea analizelor statistice ............ 36

4.1.2.1. Testarea normalității șirului de valori analizate ................................ 36

4.1.2.2. Analiza Kruskall –Wallis .................................................................. 36

4.1.2.3. Analiza componentelor principale .................................................... 37

4.1.2.4. Analiza Cluster .................................................................................. 39

4.2 Rezultatele analizelor genetice .......................................................................... 43

4.2.1. Echilibrul Hardy-Weinberg și dezechilibrul Linkage ......................................... 43

4.2.2. Estimarea și calculul principalilor parametri care cuantifică diversitatea genetică

...................................................................................................................................... 44

4.2.3. Diferențierea genetică între populații și structura genetică populațională .......... 52

4.2.3.1 Indicii de fixare F-statistic (FIS, FIT, FST) ........................................... 52

4.2.3.2. Structura genetico-populațională....................................................... 54

4.2.3.3. Analiza alocării arborilor din cele 13 populații eșantionate cu ajutorul

programelor STRUCTURE și BAPS ............................................................. 57

4.2.4. Identificarea de schimbări ale structurii populațiilor datorate efectului de “gât de

sticlă” ........................................................................................................................... 60

4.2.5. Testarea acțiunii selecției ................................................................................... 61

4.3. Compararea analizei de grupare a indivizilor pe baza corelației datelor

morfologice cu cele genetice ................................................................................... 62

CAPITOLUL 5: CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.

DISEMINAREA REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE ..... 65

5.1 Concluzii finale ................................................................................................. 65

5.1.1 Concluzii rezultate din efectuarea observațiilor morfologice .............................. 65

5.1.2 Concluzii rezultate din analizele genetice ........................................................... 65

5.2. Contribuții originale ......................................................................................... 67

5.3. Diseminarea rezultatelor ................................................................................... 68

5.4. Direcții viitoare de cercetare ............................................................................. 69

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ................................................................................... 70

REZUMAT .................................................................................................................. 77

CURRICULUM VITAE .............................................................................................. 78


6

CONTENTS

INTRODUCTION .......................................................................................................... 8

CHAPTER 1: CURRENT STATE OF KNOWLEDGE REGARDING THE

MORPHOLOGICAL VARIABILITY AND GENETIC DIVERSITY OF BEECH ..... 9

1.1. General description of genus Fagus ................................................................... 9

1.2. Aspects regarding taxonomic differentiation based on morphological

descriptors analysis .................................................................................................. 10

1.3. Microsatellite analysis ................................... Error! Bookmark not defined.12

CHAPTER 2: THE AIM AND OBJECTIVES OF THE RESEARCHES ................... 15

2.1. Aim of the researche ......................................................................................... 15

2.2. Objectives of researche ..................................................................................... 15

CHAPTER 3: MATERIAL AND METHODS ............................................................ 17

3.1. Material and methods for morphological observations..... Error! Bookmark not

defined.17

3.1.1. Research material ...................................................................................... 17

3.1.2. Morphological analysis methods .............................................................. 17

3.2. Materials and methods for the genetic diversity assessment ........................... 20

3.2.1. Study location ........................................................................................... 20

3.2.2. Laboratory analysis ................................................................................... 22

3.2.2.1. DNA isolation method ...................................................................... 22

3.2.2.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................... 23

3.2.2.3. Capillary electrophoresis and electropherograms

interpretation.............................................................................................................. ....24

3.2.3. Genetic data set analysis ........................................................................... 25

3.2.3.1. Null alleles assessment, Hardy-Weinberg equilibrium and Linkage

disequilibrium ................................................................................................ 25

3.2.3.2. Genetic parameters ............................................................................ 27

3.2.3.3. Population structure .......................................................................... 28

3.2.3.4. Establishment of genetic clusters ...................................................... 30

3.2.3.5. Identification of changes in population structuring due to bottleneck

effect .............................................................................................................. 30

3.2.3.6. Signatures of natural selections ......................................................... 32

CHAPTER 4: RESULT AND DISCUSSIONS

............................................................................................................................ ............33

4.1. Morphological analysis result ........................................................................... 33

4.1.1. Intra and interpopulation morphological variability of genus Fagus ........ 33


7

4.1.2. Evaluation of morphological variability by using statistical analysis ....... 36

4.1.2.1. Normality test analysis ...................................................................... 36

4.1.2.2. Kruskall –Wallis analysis .................................................................. 36

4.1.2.3. Principal Component Analysis .......................................................... 37

4.1.2.4. Cluster analysis ................................................................................. 39

4.2 Genetic analysis result ....................................................................................... 43

4.2.1. Hardy-Weinberg equilibrium and Linkage disequilibrium ...................... 43

4.2.2. Genetic parameters ................................................................................... 44

4.2.3. Genetic diversity assesment ...................................................................... 52

4.2.3.1 Fixation index - F-statistic (FIS, FIT, FST) ........................................... 52

4.2.3.2. Population structuring ....................................................................... 54

4.2.3.3. Analysis of the trees assignment test resulted from STRUCTURE and

BAPS software ............................................................................................... 57

4.2.4. Identification of changes in populations structures due to bottleneck

effect ................................................................................................................... 60

4.2.5. Signatures of natural selection .................................................................. 61

4.3. Comparative analysis of individuals grouping on genetic and morphological

results ...................................................................................................................... 62

CHAPTER 5: FINAL CONCLUSIONS. ORIGINAL CONTRIBUTIONS.

DISSEMINATION. FUTURE RESEARCH DIRECTIONS. ...................................... 65

5.1. Final conclusions .............................................................................................. 65

5.1.1 Conclusions of the morphological observations ........................................ 65

5.1.2 Conclusions of the genetic analyse ............................................................ 65

5.2. Original contributions ....................................................................................... 67

5.3. Dissemination ................................................................................................... 68

5.4. Future research directions ................................................................................. 69

REFERENCES ............................................................................................................. 70

ABSTRACT ................................................................................................................. 77

CURRICULUM VITAE .............................................................................................. 78


8

INTRODUCERE

În contextul schimbărilor climatice, populațiile marginale (populațiile

periferice) joacă un rol important pentru menținerea biodiversității și estimarea

evoluției ecosistmelor (Eckert et al.,2008; Gaston, 2009). De specificat totuși că

populațiile marginale nu sunt afectate doar de aceste schimbări de natură climatică, ci

și de activitățile umane. Deși aceste populații periferice sunt, în general, mai slab

productive și evidențiază efecte cumulative ale factorilor ecologici limitativi de la

marginile arealului speciilor, ele ar putea reprezenta surse inestimabile de

germoplasmă în condițiile noi preconizate ca efect al modificărilor climatice, deoarece

au încorporată informație genetică promovată prin provocările anterioare ale mediului

lor de viață.

Populațiile marginale reprezintă comunități aflate la marginea arealului

speciei și sunt populații cu o diversitate genetică originală, diversitate datorată

condițiilor improprii de supravețuire (Ducci, 2012). Diversitatea genetică mai scăzută

a populațiilor marginale este datorată i) acțiunii derivei genetice; ii) acțiunii mai

intense a selecției; iii) fluxului de gene (migrației) și iiii) numărului mic de arbori din

populație. Dacă în populațiile aflate în centrul arealului prin migrație se pot redobândi

unele variante genetice dispărute în urma acțiunii derivei genetice sau a selecției mai

intense, în populațiile marginale aceasta devine aproape imposibilă, deoarece fluxul de

gene este mai scăzut (Channell, 2004; Chhatre și Rajora, 2014).

Fagus sylvatica, F. orientalis și hibridul natural dintre aceștia, F. x. taurica, se

încadrează din punct de vedere taxonomic în familia Fagaceae, genul Fagus și sunt

taxoni foarte importanți din punct de vedere economic și ecologic, ocupând o suprafață

de aproximativ 17 milioane ha (Milescu et al., 1967).

Deși fagul este una din speciile cu toleranță fiziologică ridicată (Augustaitis et

al., 2012), sensibilitatea la schimbările de natură climatică este un factor-cheie care

limitează distribuția acestuia. Condiţiile climatice influențează atât distribuția

geografică a plantelor, cât și cea a animalelor, iar gradul de adaptare al acestora este

un subiect intens studiat în ultima perioadă (Parmesan și Yohe, 2003). Dacă la început

aceste schimbări au implicații asupra capacităţii de adaptare, mai târziu influențează

capacitatea de supravieţuire, deoarece speciile în contextul acestor schimbări fie

migrează în altitudine sau latitudine, fie se adaptează, fie dispar (Aitken et al., 2008;

Guo, 2014).

Această lucrare a plecat de la ipoteza conform căreia diversitatea genetică este

mai scăzută în populațiile marginale (engl. peripheral population) comparativ cu cele

centrale (engl. core population) și are ca scop testarea acestei ipoteze pe baza analizelor

genetice cu ajutorul markerilor moleculari. Complementar acestor analize genetice, s-

au realizat și analize morfologice la nivelul frunzelor, pentru diferențierea taxonilor din

genul Fagus. Totodată, datele rezultate vor putea fi utilizate pentru fundamentarea pe

criteri genetice a transferului de materiale de reproducere, precum și pentru stabilirea

strategiei de conservare a resurselor genetice de fag din populațiile marginale din

România.


9

CAPITOLUL 1: STADIUL ACTUAL AL CUNOȘTINȚELOR PRIVIND

VARIABILITATEA MORFOLOGICĂ ȘI DIVERSITATEA GENETICĂ A

FAGULUI

1.1. Considerații generale privind genul Fagus

Genul Fagus aparţine familiei Fagaceae şi este considerat unul dintre cele

mai importante genuri de plante lemnoase atât din punct de vedere economic, cât și

ecologic.

Familia Fagaceae cuprinde în prezent peste 1000 de specii, care din punct de

vedere sistematic sunt incluse în nouă genuri, dintre care: Fagus, Castanea, Castanopsis,

Chrysolepis, Colombobalanus, Formanodendron, Lithocarpus, Quercus și

Trigonobalanus (Manos et al., 2001).

Govaerts și Frodin (1998) au menționat apartenența genului Nothofagus la

familia Fagaceae, însă studii mai recente încadrează acest gen la o familie proprie -

Nothofagaceae (Burley et al., 2004).

Cele mai vechi resturi fosile ale genului Fagus în Europa, au fost identificate

în Saxonia (Fagus prisca) și datează din Cretacic, de acum aproximativ 100 milioane de

ani, ceea ce confirmă originea mezozoică a genului (Milescu et al., 1967). Alte resturi

fosile au fost identificate, datând din Paleocen, în America de Nord și Asia Mică

(Grimm, 2003).

Genul Fagus cuprinde 8-10 specii de arbori din zona temperată a emisferei

nordice, răspândite în Europa, Asia Mică, Extremul Orient şi în zonele estice ale

Americii de Nord, în emisfera sudică (Australia, America de Sud) regăsindu-se specii

din genul Northofagus (Rehder, 1960; Denk et al., 2005).

Fagus sylvatica si Fagus orientalis au avut la origine areale distincte, care în

timpul glaciațiunilor cuaternare par să se fi suprapus parțial, ceea ce a dus la apariţia de

forme hibride în zonele de contact. În perioada glaciațiunilor, fagul european s-a restrâns

în mare parte spre sud, în Spania, Franța, Corsica, Sicilia, Apenini, Balcani - inclusiv

Carpați, precum și în Crimea. În postglaciar revine pe vechi teritorii nordice, în neolitic

ajungând aproape de limita nordică a arealului natural actual (Milescu et al., 1967).


10

În Romania, genul Fagus este reprezentat de 3 taxoni: Fagus sylvatica, Fagus

orientalis si Fagus x. taurica, ale caror caracteristici morfologice vor fi prezentate în

cele ce urmează (Şofletea şi Curtu, 2007).

Fagus x. taurica este hibridul rezultat prin contactul ancestral dintre Fagus

sylvatica și Fagus orientalis (Șofletea și Curtu, 2007).

1.2. Aspecte privind variabilitatea taxonomică pe baza caracterelor

morfologice

Carcteristicile morfologice au fost utilizate de-a lungul timpului pentru

testarea unor ipoteze cu privire la ecologia, evoluția, taxonomia și genetica speciilor

(Klingenberg, 2008).

Fagul este o specie cu o variabiltate morfologică redusă, dar prezintă, totuși,

o serie de subspecii, varietăți și forme în funcție de forma coroanei, unele caractere ale

scoarței, frunzelor, jirului etc. (Stănescu și Șofletea, 1998).

Cele mai multe studii pentru diferențierea morfologică a taxonilor din genul

Fagus au la bază metodologiile propuse de Kremer et al., 2002; Denk, 2003;

Papageorgiou et al., 2008.

Denk (2003) a realizat un studiu amplu cu privire la filogenia taxonilor din

genul Fagus, fiind analizate 41 de caractere cu privire la lujeri, muguri, frunze , flori,

cupe, fructe, polen etc. Pe baza acestui studiu s-a realizat încadrarea taxonomică a

speciilor din genul Fagus. Studiul a avut la bază cercetări întreprinse de același autor în

anul 1999, cercetări prin care au fost analizate din punct de vedere morfologic mai multe

ecotipuri de fag european și fag oriental, în special caractere referitoare la mărimea

frunzei – indexul laminei, perechile de nervuri, lungimea pețiolului, marginea frunzei,

dimensiunile stomatelor, pedunculul cupei și forma apendiculilor.

Bussotti et al. (2005) au testat sensibiliatea speciei Fagus sylvatica la

schimbările climatice sau poluare. Pentru aceasta s-a făcut atât o analiză morfologică

(aria frunzei, masa frunzei în stare uscată, grosimea frunzei, densitatea stomatelor), cât

și o analiză chimică (conținutul frunzelor în C, N, P, S, K, Ca și Mg). Astfel s-a observat

faptul că numărul mai mare de stomate corelat cu dimensiunile mai mici ale acestora


11

asigură o reglare mai bună a transpiraţiei, respectiv sugerează faptul că morfologia

frunzei ar fi într-o oarecare măsură influențată de climă și de gradul de poluare al

atmosferei.

Bayramzadeh et al. (2011) au analizat diferențele la nivel morfologic pentru

5 populații de Fagus orientalis din Iran. Au fost măsurați 9 descriptori morfologici:

lungimea laminei (LL), lățimea laminei (LW), aria frunzei (LA), lungimea pețiolului

(PL), distanța dintre nervuri (DBV), masa frunzei în stare uscată (DM), grosimea laminei

(LT), densitatea frunzei (LD) și raportul între masa frunzei uscate și aria frunzei (LMA).

S-a constatat un nivel ridicat al variabilității morfologice între populațiile analizate, fapt

ce se datorează cel mai probabil condițiilor diferite de mediu. În 2014, Bayramzadeh și

Ghadiri, prin măsurarea distanței dintre nervuri, mărimii și densității stomatelor au

constatat că distanța dintre nervuri nu este o variabilă influențată de condițiile de mediu,

pe când numărul și mărimea stomatelor este în strânsă legătura cu cantitatea de

precipitații .

Într-un studiu recent cu privire la morfologia frunzelor de fag (Fagus

sylvatica) Hatziskakis et al. (2011) au analizat material de la 896 de arbori din 38 de

populații, pentru fiecare frunză fiind observate/măsurate 31 de caractere morfologice

printre care: lungimea pețiolului (PL), lungimea maximă a laminei (LL), lățimea maximă

a laminei (LW), numărul de nervuri (NV), distanța de la baza frunzei până la zona de

lățime maximă a laminei (LMW) etc. După stabilirea acestor indici, cu ajutorul testului

Mantel s-a analizat corelația între caracterele morfologice evaluate și distanțele genetice,

pentru a putea investiga o posibilă relație între morfologia frunzelor și recolonizarea

postglaciară a fagului în Grecia.

În România, cercetări privind variabiltatea fagului au fost făcute începând din

anul 1927, de către Grințescu G., pentru populația de fag de la Luncavița (Urechiatu,

1989).

Dobrescu et al., 1963 și Burduja et al., 1982 au efectuat cercetări pentru

stabilirea corologiei taxonilor Fagus orientalis și Fagus x taurica, analizând

caracteristici morfologice ale frunzelor și cupelor.


12

În 1988, Urechiatu M., a realizat un studiu privind variabilitatea morfolgică a

fagului carpatin, analizând caracteristici ale frunzelor, mugurilor, trunchiului și

coroanei; s-a putut observa o variabiltate mare a caracteristicilor analizate, altfel spus o

diversitate intra și interpopulațională mare, ceea ce relevă faptul că teritoriul românesc

este o zonă de tranziție între fagul boreal și cel atlantic.

Deoarece diferențele la nivel morfologic între cei 3 taxoni sunt destul de mici,

pentru încadrarea taxonomică a acestora s-a recurs ulterior la analize cu ajutorul

markerilor biochimici sau moleculari.

1.3. Analize genetice efectuate cu ajutorul microsateliților

Microsateliții sau secvențele simple repetitive (engl. Simple Sequence

Repeats - SSRs) sunt formați din succesiuni de 1-6 nucleotide, repetabile, găsite în

genomul nuclear (Selkoe și Toonen, 2006). Microsateliții au fost folosiți pentru a stabili

diversitatea genetică a unor populații, pentru estimarea fluxului de polen și migrația

semințelor, pentru identificarea sursei de sămânță (Hasenkamp et al., 2011; Tanaka et

al.,1999), pentru realizarea unor structuri genetice spațiale (Dounavi et al., 2010),

precum și în procesele de adaptabilitate (Kraj și Sztorc, 2009).

De mare actualitate sunt EST-SSR (engl. Expressed Sequence Tags) care

reprezintă microsateliți situați în regiunile de codificare (regiuni care conțin informație

genetică), pricipalul avantaj al acestora fiind transferabilitatea mare între specii (Seifert,

2011; Seifert et al., 2012; Ellis și Burke, 2007), existența unui număr mic de alele nule

și artefacte (Woodhead et al., 2005). Principalul dezavantaj este dat de faptul că sunt

mai puțin polimorfici decât SSRs, selecția în cazul acestor loci putând influența

estimarea diversității genetice (Pashley et al., 2006).

În 2003, Pastorelli et al. au descris 7 markeri de tipul microsateliților, markeri

ce au fost dezvoltați pentru Fagus sylvatica și Fagus orientalis și prezintă nivel ridicat

de polimorfism.

Vornam et al. (2004) au analizat distribuția spațială a variației genetice în

populații de fag cu ajutorul microsateliților, microsateliți ce au fost dezvoltați inițial


13

pentru Fagus japonica și Fagus crenata. S-a observat că numărul de alele pentru Fagus

sylvatica a fost diferit doar la 3 din cei 6 markeri analizați: mfc5, mfc9-2, mfc11.

Jump și Peñuelas (2006) au constatat faptul că în pădurile marginale de fag,

la limita arealului de distribuție din Spania, există un grad ridicat de consangvinizare și

o diversitate genetică redusă, acestea fiind cel mai probabil efecte ale ”gâtului de sticlă”

(engl. bottleneck), studiul având la bază analize de 6 microsateliți (FS1-03, FS1-15,

FS3-04, FS4-46, FCM5 – marker dezvoltat pentru Fagus crenata, CsCAT14 - marker

dezvoltat pentru Castanea sativa).

Buiteveld et al. (2007) au analizat diversitatea și structura genetică a fagului

cu ajutorul a patru microsateliți, pentru 10 populații din Europa. Prin acest studiu s-a

evaluat impactul managementului forestier asupra diversității genetice. Pentru că

diferențele au fost nesemnificative în ceea ce privește numărul efectiv de alele,

heterozigoția observată și heterozigoția așteptată, s-a putut concluziona faptul că, în

cazurile analizate, managementul pădurilor nu a influențat semnificativ diversitatea

genetică. De asemenea, într-un alt studiu efectuat în Germania s-a încercat determinarea

impactului activităților de gestionare a pădurilor asupra structurii genetice spațiale a

fagului în 29 de populații (10 populații negestionate și 19 populații gestionate). S-au

folosit șase markeri SSR dezvoltați inițial pentru F. sylvatica și trei markeri EST-SSR

dezvoltați inițial pentru Quercus spp., în 3 multiplexe (Rajendra 2011, 2014). S-a putut

constata faptul că modul de gestionare a pădurilor de fag nu are un impact negativ asupra

diversității genetice, deoarce diversitatea genetică în populațiile analizate a avut o

valoare relativ mare (He = 0.703).

Studiind variația genetică în populații de fag aflate în stadii fenologice

diferite, Kraj și Sztorc (2009) au remarcat: 1) înghețurile târzii influențează diversitatea

genetică; 2) diferențele genetice sesizate între stadiile fenologice analizate nu sunt

datorate adaptabilității speciei întru-cât microsateliții sunt markeri genetici neutri care

nu sunt legați în mod direct de variația genetică adaptativă .

Relativ recent, s-au dezvoltat pentru Fagus sylvatica un set de microsateliți,

grupați în două multiplexe, și care permit amplificarea rapidă a 16 loci polimorfici

(Lefevre et al., 2011).


14

Bilela et al. (2012) au calculat variația genetică și cum influențează aceasta

adaptabilitatea speciei, în cadrul unor populații formate atât din exemplare adulte, cât și

exemplare tinere, aflate în condiții de mediu diferite (unele aflate în zone cu climat rece

si umed, respectiv altele aflate în zone cu climat cald și uscat) și pe expoziții diferite. S-

a putut observa că există o diferențiere genetică între exemplarele adulte și cele tinere

pentru populația din nord-est (climat rece și umed), dar în același timp o asemănare a

exemplarelor tinere din cadrul acestei populații cu exemplarele din populația din sud –

vest (climat cald și uscat). Deoarece s-a dovedit că populațiile luate în considerare au

aceeași origine, singura cauză care ar fi putut duce la această diferențiere era actiunea

selecției în contextul schimbărilor climatice. În schimb, Muller (2013) a relatat ca nu

există diferențe semnificative în ceea ce privește indicii diversității genetici între

populații de fag aflate în stadiu juvenil și populații de fag adulte.

Alți markeri moleculari, utilizați în studiile de filogenie sau pentru cartarea

unor gene implicate în controlul unor caractere cantitative sunt cei de tipul AFLP (engl.

Amplified Fragment Length Polimorfism). Enzimele de restricție și tehnologia PCR sunt

folosite pentru a produce fragmente de diferite dimensiuni de la ADN-ul genomic total.

Markeri AFLP sunt markeri dominanți, astfel încât poate fi analizată doar prezența sau

absența unui fragment; sunt considerați markeri anonimi datorită faptului că poziția

fragmentelor în genom este necunoscută. Principalul dezavantaj al acestei metode este

faptul ca nu se poate face distincție între exemplarele homozigote și cele heterozigote

(Nybom, 2004; Campbell et al., 2003).

Markeri AFLP au fost folosiți pentru stabilirea relaţiilor genetice şi evolutive

între Fagus sylvatica și Fagus orientalis (Gailing și von Wuehlisch , 2004), precum și

pentru analiza structurii genetice spațiale a fagului, Jump și Penuelas (2007) identificând

o structură genetică spațială extensivă a acestuia.

În 2004, Scalfi et al., cu ajutorul markerilor AFLP, RAPDs (engl. Random

Amplified Polymorphic DNA – ADN-ul polimorfic amplificat randomizat) și a

microsateliților au realizat o harta genetică a fagului.


15

CAPITOLUL 2: SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR

2.1. Scopul cercetărilor

Populațiile de fag din România au fost foarte puțin explorate din punct de

vedere genetic. De aceea, cercetările au ca scop evaluarea diversității genetice a

populațiilor existente în arealul autohton al fagului, analizând în primul rând populații

reprezentative pentru poziția lor arealistică marginală (populații izolate, populații de

mică și de mare altitudine din cadrul aceluiași transect, respectiv populații de la limita

răsăriteană a arealului general al fagului). Această prospectare va servi atât pentru

implementarea rezultatelor obținute în stabilirea limitelor de circulație și de utilizare în

culturi a materialelor forestiere de reproducere, cât și în stabilirea stategiei de conservare

a resurselor genetice forestiere de fag. Provocările mediogene din aceste populații

marginale ar fi putut genera structuri genetice cu valoare adaptativă, care în condițiile

modificărilor climatice preconizate și a translatării arealului speciilor vor putea fi

valorificate în gestionarea pădurilor viitorului. În final, evaluările genetice și

morfologice, din unele populații eșantionate au ca scop identificarea efectelor genetice

ce ar fi putut decurge din contactul ancestral al speciilor Fagus sylvatica și Fagus

orientalis.

2.2. Obiectivele cercetărilor

Pentru atingerea scopului propus și în concordanță cu stadiul actual al

cunoașterii s-au formulat ipoteze de lucru, pe baza cărora s-au stabilit urmatoarele

obiective:

1) Evaluarea variabilității morfologice inter și intrapopulaționale,

prin analiza unor descriptori foliari, în staţiuni de coabitare prezumtivă între Fagus

sylvatica și Fagus orientalis.

2) Evaluarea variabilității genetice intrapopulaționale și

interpopulaționale prin utilizarea de markeri genetici cu aplicabilitate la fag; analiza va


16

include, între altele, populații gradientale, de mare și de mică altitudine, situate pe

transecte în care amplitudinea altitudinală a populațiilor actuale este mare.

3) Testarea ipotezei conform căreia diversitatea genetică este mai

scăzută în populațiile de la limita arealului și identificarea cauzelor care au determinat

acest lucru (numărul mic de exemplare, acțiunea derivei genetice sau a selecției).


17

CAPITOLUL 3: MATERIAL ȘI METODE DE CERCETARE

3.1. Materialul și metoda de cercetare pentru observațiile morfologice

3.1.1. Material de cercetare

Observațiile cu privire la morfologia speciilor din genul Fagus au fost

efectuate pe material biologic recoltat din făgetele de la Luncavița (Munții Măcinului)

și cele din Podișul Covurluiului (populațiile Tălășmani și Buciumeni), unde au fost

făcute consemnări (Urechiatu, 1989; Geacu și Loghin, 2001) în ceea ce privește

coexistența speciilor Fagus sylvatica, F. orientalis și a hibridului F. x taurica.

S-au analizat un număr de 157 de arbori, mărimea eșantionului pentru fiecare

populație fiind redată în tabelul 3.1. Arborii s-au ales astfel încât între exemplare să fie

o distanță de aproximativ 50 m. În populația Tălășmani distanța a fost uneori mai mică

de 50 m, deoarece s-au recoltat probe de la toate exemplarele de fag existente în trupul

de pădure. Fiecărui arbore i-a fost dat un număr de identificare, notat pe acesta cu

ajutorul unui marker iar apoi cu ajutorul unei foarfece telescopice s-au recoltat lujeri cu

frunze din partea mediană a coroanei.

Tabelul 3.1. Localizarea populațiilor eșantionate și numărul de arbori analizați

Table 3.1. Location of sampled populations and the number of analyzed trees

Nr.

crt. Populația Latitudine Longitudine Altitudinea

medie

Număr de

arbori analizați

1 Măcin 45016´09,89 28010´54,92 125 m 86

2 Tălășmani 46007´13,82 27050´21,49 230 m 21

3 Buciumeni 46001´48,63 27017´54,11 260 m 50

3.1.2. Metode de analiză morfologică

Cercetările la nivel morfologic s-au axat pe studiul frunzelor, deoarece în vara

anului 2012, atunci când a avut loc recoltarea materialului nu s-au gasit suficiente


18

exemplare cu cupe pentru a putea studia prezența/absența apendiculilor

subulați/frunzoși, pețiolați/nepețiolați.

Astfel, s-au prelevat de pe lujeri câte 5 frunze pentru fiecare arbore, au fost

numerotate cu cifre de la 1 la 5, presate și apoi analizate cu ajutorul programului

WinFOLIA.

Din descrierea morfologică a frunzelor celor trei taxoni s-a putut observa că

există diferențe în ceea ce privește dimensiunile frunzelor, numărul de perechi de nervuri

laterale, lungimea pețiolului, caractere ce variaza în funcție de sursa bibliografică

analizată.

Studii cu privire la morfologia fagului precizează faptul că un exemplar de

Fagus sylvatica poate prezenta în anii secetoși caractere de Fagus orientalis (Milescu et

al., 1967).

Pentru realizarea acestor analize s-au luat în considerare metodologiile

propuse de Denk (2003), Bayramzadeh et al. (2011) și Papageorgiou et al. (2008),

luându-se în considerare următorii descriptori morfologici ai frunzelor: lungimea

laminei (engl. lamina length, abv. LL); lungimea peţiolului (engl. petiole length, abv.

PL); lungimea laminei de la bază până în zona de lăţime maximă (engl. distance between

the lower point of the lamina and the maximum width point on the axis, abv. LMW);

lățimea maximă a laminei (engl. lamina width, abv. LW); distanța dintre nervuri (engl.

distance between veins, abv. DBV); numărul perchilor de nervuri (engl. number of veins,

abv. NV), respectiv trei indici calculați: al laminei (engl. leaf index, abv. LI:

LL/LW*100), al lățimii maxime a laminei (engl. maximum width idex, abv. MWI:

LMW/LL*100) și al pețiolului (engl. petiole idex, abv. PI: PL/LL*100).

Pe lângă descriptorii menționați anterior, literatura de specialitate (Denk,

2003; Bussotti, 2005) menționează existența unor diferențe la nivel micromorfologic și

anume dimensiunile sau densitatea stomatelor. Complementar variabilelor enumerate s-

a determinat densitatea stomatelor (engl. stomatal density, abv. S) pentru fiecare din cele

5 frunze. Astfel, pe dosul fiecărei frunze, între nervuri, s-a aplicat o peliculă de nitrolac

cu ajutorul unei pensule. Dupa aproximativ 24 de ore, pelicula de nitrolac a fost

îndepartată de pe frunză și pusă pe o lamă de sticlă. Peste această peliculă s-a adugat o


19

picătură de apă și apoi o lamelă microscopică. Preparatul rezultat a fost analizat la

microscop iar cu ajutorul softwer-ului QuickPhotoMicro 2.3: s-au numărat stomatele

din aria obiectivului microscopului (98100 µm2) și apoi acest număr s-a extrapolat la

întreaga suprafață a laminei.

Datele morfologice au fost stocate într-un fișier MicrosoftExcel și s-au

prelucrat utilizând programele de analiză statistică STATISTICA V.8.0. și XLSTAT

2014. S-au determinat valorile medii pentru fiecare arbore, iar apoi s-a făcut analiza

varianței, analiza componentelor principale (engl. Principal Components Analysis, abv.

PCA) și analiza cluster (engl. Cluster Analysis).

Înainte de a trece la analiza statistică a varianței s-a testat dacă variabilele

analizate urmează sau nu o distribuție normală, mai ales datorită faptului că populațiile

luate în considerare au un număr inegal de arbori analizați. Razali și Wah (2011) afirmă

că pentru testarea normalității unui șir de valori cel mai bun ar fi testul Shapiro – Wilk,

care are la bază analiza distribuției normale cu ajutorul coeficienților de corelație și

regresie. Testul ia în considerare două ipoteze: prima ipoteză sau ipoteza nulă (H0) - nu

există diferențe semnificative statistic între distribuția variabilei investigate și distribuția

normală; a doua ipoteză (H1) - există diferențe semnificative statistic între distribuția

variabilei investigate și distribuția normală. Astfel, dacă probabilitatea de transgresiune

p este mai mare ca 0,05 spunem că se acceptă ipoteza nulă H0, în caz contrar (p < 0,05)

se acceptă ipoteza alternativă (H1).

Deoarece s-a constatat că o parte din variabilele luate în considerare nu

urmăresc o distibuție normală s-a stabilit faptul că pentru analiza varianței este necesar

să se utilizeze o analiză neparametrică și anume analiza Kruskal – Wallis. Aceasta

reprezintă o alternativă la analiza simpla a varianței (abv. ANOVA) și este folosită în

cazul în care avem mai mult de două eșantioane. Ipotezele asociate acestei analize sunt:

prima ipoteză - nu există diferențe semnificative din punct de vedere statistic pentru

grupurile analizate (în studiul de față - arborii aparțin aceluiaşi taxon) și a doua ipoteză

- grupurile analizate diferă în mod semnificativ (exemplarele analizate pot fi încadrate

ca aparținând unor taxoni diferiți).


20

Analiza componentelor principale este o metodă ce permite reprezentarea

grafică a arborilor dupa asemănarile morfologice, utilizând simultan mai mulţi

descriptori și totodata permite determinarea componentelor principale care duc la

diferențierea dintre arborii analizați, prin alocarea unei ponderi fiecărui descriptor.

Analiza cluster este o analiză ce permite gruparea arborilor în funcție de

variabilele măsurate sau calculate. Prin “cluster” se înțelege un grup de obiecte

asemănatoare între ele (omogene). În studiile cu privire la morfologia și genetica

speciilor, aceste analize mai sunt numite și analize filogenetice (arbori filogenetici) iar

arborii asemănatori dintr-un anumit punct de vedere aparţin aceluiași filotip (engl.

phylotype), altfel spus se regăsesc în același cluster.

Analiza cluster permite gruparea arborilor din punct de vedere al asemănărilor

(engl. similarity) sau deosebirilor (engl. disimilarity) dintre anumite variabile, printr-o

metodă “aglomerativă”. Dintre metodele “aglomerative” cele mai utilizate în studiile de

încadrare taxonomică sunt metoda înlănțuirii complete (engl. complete linkage), metoda

varianței minime a lui Ward (engl. Ward’s method) și metoda legăturii medii (engl.

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean - UPGMA).

S-au realizat analize cluster pentru 3 dintre distanțele existente în cadrul

programului XLSTAT, și anume distanța Euclidiană, distanța Manhattan și distanța

Mahalanobis, deoarece acestea sunt cel mai adesea utilizate în studiile de taxonomie

relevante pentru genul Fagus (Bayramzadeh et al., 2011; Denk et al., 2002).

3.2. Materialul și metoda de cercetare pentru evaluarea diversității

genetice

3.2.1 Materialul de studiu și localizarea cercetărilor

Materialul de studiu s-a recoltat din 4 populații aflate la limita arealului de

distiribuție a fagului în Romania (Snagov, Măcin-Luncavița, Buciumeni, Stârmina)

(Floricică, 1973; Oprea et al., 2011; Geacu și Loghin, 2001; Milescu et al., 1967), în

care izolarea geografică față de alte populații de fag ar fi putut conduce la fenomene de


21

evoluție divergentă, respectiv la apariția de specializări genetico-adaptative. De

asemenea, s-au inclus în eșantionul de cercetare 3 transecte din zone cu dezvoltare

altitudinală mare a arealului fagului (Novaci-Rânca, Sebeș 1- Sebeș 2 și respectiv

Apuseni - Huedin), în care s-au recoltat probe din câte două populații: de la mare și

respectiv de la mică altitudine. Eșantionul cercetat include, de asemenea, două populații

de fag din arealul continuu (Câmpina-Prahova și Anghelești-Vrancea) și 4 exemplare de

fag din populația Bucovăț-Craiova (exemplare izolate).

În vederea efectuării analizelor s-au recoltat din fiecare populație lujeri cu

muguri sau frunze, un total de 588 de arbori, numărul de arbori specific fiecărei populații

analizate fiind redat în tabelul 3.2.

Tabelul 3.2. Localizarea populațiilor eșantionate pentru analiza genetică

Table 3.2. Sampled populations location for genetic analyzis

Nr.

crt. Populația Latitudine Longitudine Altitudinea

medie

Număr de

exemplare

analizate

T

(0C)

P

(mm)

1 Măcin 45016´09,89 28010´54,92 125 m 100 10.5 479

2 Snagov 44043´00,89 26009´51,63 92 m 37(exhaustiv) 10.6 585

3 Stârmina 44029´46,75 22045´44,97 77 m 50 10.4 591

4 Tălășmani 46007´13,82 27050´21,49 230 m 21(exhaustiv) 9.4 538

5 Huedin 46058´16,28 22043´51,53 446 m 50 8.7 672

6 Apuseni 46040´28,55 23001´15,29 1130 m 50 5.9 821

7 Sebeș1 45038´49,99 23036´06,64 1346 m 50 5.4 868

8 Sebeș2 45054´46,81 23030´09,32 447 m 50 9.2 631

9 Novaci 45013´18,17 23040´05,87 560 m 50 8.3 702

10 Rânca 45014´38,85 23041´42,10 1360 m 25 5.1 870

11 Câmpina

Prahova 45006´46,2 25043´00,12 520 m 50

8.3 673

12 Anghelești Vrancea

46005´34,54 27001´59,65 315 m 50 11.3 559

13 Bucovăț 44018´33,3 23042´77,6 390 m 4(exhaustiv) 8.7 579

T - temperatura medie anuală (0C); P- cantitatea de precipitații medii anuale (mm) – valori extrase de pe

site-ul http://www.worldclim.org/


22

3.2.2. Efectuarea analizelor de laborator

Analizele genetice au constat în analiza ADN-ului nuclear cu ajutorul

markerilor moleculari. Pentru o bună diferențiere a speciilor s-a folosit un set de 8

markeri nucleari, șapte dintre acești fiind markeri genomici (SSRs) dezvoltați inițial

pentru Fagus crenata (sfc 0018, sfc 0161, sfc 1063, sfc 1143) și Fagus sylvatica (FS3-

04, FS4-46 și MFS11); unul de tipul EST – SSR (FIR065) dezvoltat și utilizat inițial

pentru Quercus robur.

3.2.2.1. Pregătirea probelor și izolarea ADN-ului

Pentru extragerea ADN-ului s-au luat 2-3 muguri bine dezvoltaţi cărora li s-a

îndepărtat partea lemnoasă și solzii cu ajutorul unui bisturiu și a unei pensete, pe o placă

dezinfectată în prealabil cu alcool . Dezinfectarea cu alcool s-a făcut pentru a preveni

contaminarea probelor (Crăciunesc et al., 2011).

Materialul vegetal astfel pregătit (aproximativ 60 - 70 mg mugure) s-a

introdus într-un tub de 2 ml, etichetat cu numărul arborelui și populația din care provine,

împreună cu două bile de wolfram. Cu ajutorul unei mori de tipul Tissue Lyser Rotch

MM400 s-a efectuat măcinarea probelor, în două etape succesive a câte 2-3 minute, cu

o frecvență de 30 Hz. Izolarea propriu-zisă a ADN-ului s-a realizat cu ajutorul

protocolului CTAB (Doyle și Doyle 1987, 1990), protocol ce presupune izolarea ADN

– ului în mai multe etape. Într-o primă etapă, pentru ruperea membranelor celulare se

adăugă 1000 µl 2 x CTAB Extraction Buffer (substanță ce conține CTAB, PVP și β-

mercaptoethanol) și 10 µl Proteinase K, după care tuburile astfel pregătite se introduc

într-un thermomixer pentru 30 de minute la o temperatura de 65 oC și 550 rotații pe

minut. Proteinase K are rolul de a împiedica acțiunea unor enzime care pot duce la

degradarea acizilor nucleici.

Într-o etapă ulterioară s-au adăugat 200 µl Wet Chlorophorm, pentru a separa

și denatura unele proteine existente, 600 µl Izopropanol (-20 oC ) și 1000 µl de Wash


23

Buffer (50 µl acetat de amoniu + 40 ml etanol 76% + 10 ml H2O) pentru eliminare unor

reziduri de CTAB și purificarea ADN-ului extras.

La final, peste produsul rezultat s-au adăugat 50 µl TE (1ml TRIS + 200 µl

EDTA + 98,8 ml H2O) pentru dizolvarea ADN-ului și înlăturarea impurităților rămase.

După izolarea ADN-ului s-a făcut testarea calității și concentrației

acestuia, testare ce s-a realizat cu ajutorul spectrofotometrului NanoDrop 8000. Pentru

aceasta, s-a utilizat un volum de 1μl de ADN din soluția stoc. Concentrațiile au fost

destul de mari însă calitatea ADN-ul, apreciată în funcție de raportul 260/280 la care

valorile optime sunt cuprinse în intervalul 1,8 – 2,0, a fost uneori destul de slabă datorită

conținutului mare de impurități. În funcție de cantitatea și calitatea ADN-ului s-au

efectuat diluții de 1:30 sau 1:50, pentru a obține o concentrație de aproximativ 20 –

30ng/μl.

3.2.2.2. Reacția de polimerizare în lanț (PCR)

Pentru eficientizarea reacției PCR markerii s-au grupat în 2 kit-uri de analiză

(redate în tabelul 3.3.), prin introducerea a patru perechi de primeri în același kit,

volumul final al soluției fiind de 10 µl.

Tabel 3.3. Protocolul reacției de polimerizare în lanț pentru cele 2 kituri

Table 3.3. Polymerase chain reaction protocol for the two kits

KIT 1 KIT 2

Volum (µl) Volum(µl)

PCR Puffer 5x 2,00 PCR Puffer 5x 2,00

MgCl2 25 mM 1,00 MgCl2 25 mM 1,00

dNTPs (2mM of each) 1,00 dNTPs (2mM of each) 1,00

Sfc0018 R 0,50 FS4-46 R 0,50

Sfc0018 F 0,50 FS4-46 F 0,50

Sfc0161 R 0,50 Mfs11 R 0,50

Sfc0161 F 0,50 Mfs11 F 0,50

Sfc1063 R 0,50 Sfc1143 R 0,40

Sfc 1063 F 0,50 Sfc1143 F 0,40

FS3-04 R 0,30 FIR065 R 0,40

FS3-04 F 0,30 FIR065 F 0,40

Promega Taq Polymerase 0,10 Promega Taq Polymerase 0,10

H2O 0,30 H2O 0,30

MasterMix 8,00 MasterMix 8,00

DNA 2,00 DNA 2,00

Total 10,00 Total 10,00


24

Reacțiile de polimerizare în lanț s-au efectuat pentru kit-ul 1 în Palm-Cycler

CG1-96 (Corbett) și pentru kit-ul 2 în Mastercycler Gradient (Eppendorf). După

efectuarea unor teste, pe baza unor gradienți de temperatură și studiul literaturii de

specialitate s-au stabilit temperaturile optime pentru fiecare pas al recției.

Astfel, protocolul reacției PCR stabilit a constat într-un prim pas de

denaturare inițială a ADN-ului la temperatura de 95°C, timp de 3 minute, urmat de 30

de cicluri cu următoarea structură: ruperea punților de hidrogen dintre nucleotidele

complementare la 94°C, timp de 60 de secunde, legarea primerilor la 55°C (kit-ul 1) sau

47 °C (kit-ul 2) timp de 30 secunde, sintetizarea noilor catene la temperatura de 72°C,

timp de 1 minut. Etapa finală presupune o sintetizare suplimentară, timp de 20 minute,

la temperatura de 72°C. Pentru evitarea degradării produselor PCR, după finalizarea

tuturor pașilor descriși, programul prevede menținerea unei temperaturi constante de 4-

8°C în blocul mașinii până la preluarea lor.

Produsele PCR au fost testate cu ajutorul electroforezei orizontale pe un gel

de agaroză cu concentrația de 1,5%, la tensiunea de 100V, timp de 25 minute.

3.2.2.3. Electroforeza capilară și interpretarea electroforegramelor

În funcție de intensitatea produsului PCR s-au efectuat anumite diluții pentru

fiecare probă. Apoi, în placa supusă electroforezei capilare s-au adăugat 2 µl produs PCR

diluat în prealabil cu H2O2, 37,68 µl Sample Loading Solution (SLS400) și 0,32 µl Size

Standard.

Principiul separării electroforezei capilare constă într-un proces de migrare

diferențiată a compușilor încărcați electric, dintr-un amestec aflat într-o capilară umplută

cu gel, la aplicarea unui câmp electric constant.

Rezultatele separării se prezintă sub forma electroforegramelor, care sunt

niște reprezentări grafice ale semnalului detectorului și care redau sub forma peak-urilor

(vârfurilor de semnal) distribuția concentrației componenților în coloana capilară.


25

Citirea markerilor și vizualizarea sub forma de curbe a fiecărui fragment

(electroforegrame) s-a realizat cu ajutorul secvențiatorului Beckman Coulter prin

metoda Frag – 3 care cuprinde:

Denaturarea la temperatura de 90˚C timp de 120 de secunde;

Injecția la un voltaj de 2000V timp de 30 de secunde;

Separarea la un voltaj de 6000V timp de 35 de minute.

Electroforegramele rezultate în urma electroforezei capilare au fost examinate

vizual, pentru a putea prelua genotipul fiecărui arbore, pentru fiecare pereche de primeri

analizată. Astfel, genotipurile homozigote sunt reprezentate printr-un singur peak (vârf),

corespunzător alelei comune celor doi cromozomi pereche, iar genotipurile heterozigote

sunt reprezentate de două peak-uri, corespunzătoare celor două alele diferite de pe

cromozomii pereche.

Datele obținute în urma electroforezei capilare s-au introdus într-un fișier

MicrosoftExcel pentru a putea realiza structura genotipică a arborilor la fiecare marker

genic analizat. Fagul este specie diploidă, de aceea prezintă două alele pentru fiecare

genotip, una moștenită de la arborele donator de polen și cealaltă de la arborele mamă.

Fiecare alelă a fost rotunjită la un număr întreg, deoarece aceeași alelă poate varia în

cadrul unui marker genic cu valori cuprinse între 0,1-1 pb.

3.2.3. Analiza datelor genetice rezultate

3.2.3.1. Prezența alelelor nule, structura Hardy-Weinberg și

dezechilibrul linkage

Alelele nule (engl. null alleles) rezultă în urma unor modificări (mutații) în

regiunea flanc (inserții sau deleții) și împiedică legarea primerilor, altfel spus duc la

imposibilitatea amplificării ADN-ului în timpul reacției PCR (Oddou-Muratorio, 2008).

Pentru a determina frecvența alelelor nule în cadrul populațiilor analizate s-

au utilizat programele MICROCHECKER 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004b) și

GENEPOP 4.2.1. (Rousset, 2008).


26

Tabel 3.4. Frecvențele alelelor nule calculate cu metota Oosterhout

Table 3.4. Frequencies of the null alleles calculated with the Oosterhout method

Marker Frecvență alele nule –

Oosterhout (%) Marker

Frecvență alele nule -

Oosterhout (%)

Sfc0018 11,3% Sfc1143 -

Sfc0161 11,9% MFS11 -

Sfc1063 - FIR065 10,6%

FS3-04 - FS4-46 24,8%

Complementar cu determinarea frecvenței alelelor nule, programul

MICROCHECKER poate analiza și posibilele erori de citire (engl. scoring errors).

Aceste erori pot apărea datorită prezenței unor alele care diferă doar printr-o pereche de

baze (engl. stuttering) sau omiterea unor alele de lungime mare (engl. large allele drop-

out) (Van Oosterhout et al., 2004a).

Pentru programul MICROCHECKER testele au presupus 1000 de

randomizări ale alelelor la fiecare marker din fiecare populație, cu un interval de

încredere de 95%.

Rezultatele indică o posibilă apariție a alelelor nule la 4 din cei 8 loci analizați

(tabelul 3.4), cea mai mare probabilitate de apariție a alelelor nule fiind la markerul FS4-

46 (24,8 %). În ceea ce privește apariția unor erori de citire, posibile erori datorate

prezenţei unor alele care diferă doar printr-o pereche de baze (engl. stuttering) se pot

observa la markerii la care se regăsesc și alelele nule. Erori de citire cauzate de omiterea

unei alele de lungime mare (engl. large allele drop-out) nu au fost identificate în niciunul

dintre cazurile analizate.

Frecvența alelelor nule calculată cu ajutorul programului GENEPOP 4.2.1,

indică faptul că aceasta variază mult de la o populație la alta. Se poate observa că cea

mai mare frecvență a alelelor nule o întâlnim tot la markerul FS4-46, însă cu o valoare

diminuată (11,2%) față de rezultatele menționate anterior.

Dezechilibrul linkage (engl. linkage desequilibrum, abv. LD) reprezintă

asocierea nerandomizată a alelelor pentru unul sau doi loci (Slatkin, 2008), iar detectarea

acestui dezechilibru nu reprezintă o legătură sau o lipsă de echilibru, cel mai posibil

oferă o informație cu privire la evenimentele din trecut (mutație, derivă genetică, selecție


27

naturală sau artificială) (Hartl și Clark, 1997). Acest dezechilibru a fost analizat cu

ajutorul programului GENEPOP 4.2.1 (Rousset, 2008), prin metoda testului exact (engl.

exact test) bazat pe analiza MC (engl. Markov Chain) cu: 10000 randomizări, 100 loturi

și 5000 iterații/lot.

Echilibrul Hardy-Weinberg pentru fiecare populație sau marker, a fost

analizat cu același software, GENEPOP (Rousset, 2008), rezultatele fiind redate în

capitolul următor. Se spune despre o populație că se află în echilibru Hardy-Weinberg

atunci când frecvenţele genelor și repectiv ale genotipurilor rămân constante de la o

generaţie la alta, în absenţa unor factori perturbatori (încrucișare nerandomizată, mutație,

selecție, deriva genetică, flux genic) (Șofletea, 2005).

3.2.3.2. Calculul parametrilor genetici

Pentru evaluarea structurilor genetice cu ajutorului programului GENALEX

6.5 (Peakall și Smouse, 2006; 2012) au fost calculați următorii parametri genetici: AT

(numărul total de alele), Ne (numărul efectiv de alele pe locus), Na (numărul mediu de

alele pe locus), Ho (heterozigoția observată), He (heterozigoția așteptată, diversitatea

genetică), F (indicele de fixare).

Indicii de fixare F-statistic (FST, FIS, FIT) au fost calculați și analizați cu

ajutorul programului ARLEQUIN 3.5 (Excoffier și Lischer, 2010).

Parametrii genetici astfel calculați au fost analizați comparativ pentru

populațiile marginale izolate și populațiile din arealul cvasicontinuu; respectiv pentru

populațiile marginale de mică și de mare altitudine.Parametrul AR (engl. allelic richness)

s-a calculat cu ajutorul programul FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002) și reprezintă o metodă

de estimare a diversității genetice atunci când populațiile luate în studiu au un număr

diferit de arbori analizați (El Mousadik și Petit, 1996).


28

3.2.3.3. Structura genetică populațională

Variațiile genetice dintre indivizi sau populații sunt rezultatul diferitelor forțe

evolutive, mai mult sau mai puțin dependente unele de altele. Aceste forțe pot fi induse

prin procese neutre (driftul genetic), procese demografice (migrație și expansiune) sau

prin procese de adaptare biologică (selecția). De aceea, se poate spune că istoria

demografică asociată cu diferite procese evolutive redau structura genetică a populației

(Jay et al., 2011).

Deoarece structura genetică populațională nu este întotdeauna reflectată în

proximitatea regiunii geografice, pentru alocarea genetică a indivizilor la o populație

(engl. genetic assignment) sau la o specie se utilizează o serie de programe care au

implementate diferite metode statistice.

Una dintre cele mai vechi metode de asociere genetică a indivizilor o

constituie metoda arborilor filogenetici. Analiza presupune gruparea indivizilor pe baza

unei metode care nu prezintă o structură predefinită, și anume gruparea indivizilor prin

construcția unei matrici care conțin distanțele genetice pentru fiecare pereche de indivizi.

Această analiză s-a realizat cu ajutorul programului POPULATION 1.2.32 (Langella,

1999). Inițial s-a realizat un fișier input cu ajutorul programului GENEALEX 6.5

(Peakall și Smouse, 2012), după care s-a utilizat metoda „aglomerativă” UPGMA (engl.

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), care a permis gruparea

populațiilor pe baza calculării a două distanțe genetice: Nei (engl. Nei's standard genetic

distance, 1983) și Cavalli-Sforza (engl. Cavalli-Sforza chord distance, 1967). S-au

folosit 200 iterații (bootstrap) pentru gruparea populațiilor într-unul sau mai multe

grupuri asemănătoare. La final, dendrogramele s-au vizualizat cu ajutorul programului

TREEVIEW X (Roderic, 2000).

Cele mai noi programe pentru alocare genetică a indivizilor la o structură

populațională utilizează o analiză statistică bayesiană. Analiza bayesiană presupune

existența unui echilibru Hardy – Weinberg și a unui echilibru linkage.

Exemplificarea acestei analize pentru prezentul studiu s-a realizat cu ajutorul

următoarelor software-uri: STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) și BAPS (Corander și


29

Marttinen, 2006). Pentru toate programele s-au realizat fișiere input cu ajutorul software-

ului GENALEX 6.5, fără a cunoaște originea exemplarelor analizate, urmărindu-se ca

gruparea indivizilor să se realizeze doar pe baza genotipurilor multilocus.

Analiza bayesiană a strucurii populaționale a fost efectuată în cadrul

programului STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard et al., 2000) utilizând Admixture Model

(model mixt) pe baza unui set de parametri. Astfel, parametrii stabiliți au fost: 100000

de pași pentru burn-in, urmați de 200000 repetări MCMC (engl. Markov Chain Monte

Carlo), pentru valoari ale lui K de la 1 la 13 (numărul populațiilor analizate). De precizat

este faptul că pentru această analiză a fost selectată opțiunea LocPrior pentru a se putea

creea o structură populațională care are la bază doar structura genotipică.

Pentru compararea structurii populaționale rezultată în urma rulării

programului STRUCTURE s-a utilizat software-ul BAPS 6 (Bayesian Analysis of

Population Structure) (Corander și Marttinen, 2004), pentru a realiza o altă analiză

bayesiană nespațială (engl. non-spatial). Programul BAPS folosește două module:

„mixture” sau „admixture”. Deoarece s-a dorit o analiză fără a se cunoște apartenența

unui individ la o anumită populație, s-a selectat modulul “clustering of individuals”,

fisierul output fiind folosit de modulul „admixture of individuals based on mixture

clustering”. Pentru rularea celui de-al doilea model au fost stabiliți un set de parametri

cu următoarele caracteristici:

Mărimea minimă a populației pentru modelul „admixture” (engl. minimum

population size for admixture estimation) = 5;

Numărul de iterații (engl. number of iterations) = 1000;

Numărul indivizilor de referință din fiecare populație (engl. number of reference

individuals) = 50;

Numărul de iterații pentru indivizii de referință (engl. number of iterations for

reference individuals)= 100.

Fișierul output conține infomații cu privire la cea mai bună grupare a

populațiilor pe clustere, precum și valoarea parametrului k (numărul de clustere).


30

Toate cele trei tipuri de analize s-au relizat pentru a observa dacă populațiile

marginale se deosebesc de celelalte populații analizate din punct de vedere al structurii

genetice.

3.2.3.4. Stabilirea numărului de clustere genetice

Așa cum am precizat anterior, în cadrul analizei bayesiene s-a optat ca

parametrul k (numărul de clustere) să i-a succesiv valori de la 1 la 13, fiecare valoare cu

un număr de 3 iterații.

Pentru a stabili care din alocări este cea mai potrivită pentru cei 588 de arbori

analizați, cu alte cuvinte pentru a stabili numărul de grupuri omogene din punct de

vedere genetic (K), s-au analizat mai întâi valorile parametrului Ln P(D) afișate de

programul STRUCTURE în meniul simulation summary, deoarece Hampton et al.

(2004) sugerează faptul că numărul de clustere corespunde valorii maxime a

parametrului Ln P(D). Evanno et al. (2005) afirmă însă faptul că o metodă mai precisă

pentru determinarea numărului de clustere ar fi calcularea parametrului ΔK. Astfel,

pentru aceasta s-a utilizat programul disponibil online, STRUCTURE HARVESTER

V.0.6 (Earl și VonHoldt, 2012), pentru calculul parametrului ΔK fiind necesar un fișier

care să conțină toate rezultatele rulărilor efectuate de programul STRUCTURE.

3.2.3.5. Identificarea de schimbări ale structurii populațiilor datorate

efectului de “gât de sticlă”

Prin reducerea masivă a efectivului unei populații se pot produce pierderi ale

diversității genetice, creșterea fenomenului de consangvinzare, precum și fixarea unor

alele prin homozigotare. Este cunoscut faptul că populațiile care au suferit un blocaj în

istoria lor sunt mai predispuse la extincție decât restul populațiilor, chiar și după

recuperarea dimensiunii lor anterioare (Bijlsma et al. 2000). Astfel, dacă într-o populație

se reduce drastic numărul de indivizi iar apoi în decurs de una sau mai multe generații


31

se revine la numărul inițial al acesteia, spunem că acesta a trecut printr-un “gât de sticlă”

(engl. bottleneck).

Datorită acestui fapt, în studiul populațiilor marginale sau a populațiilor

izolate este foarte importantă cunoașterea evoluției acestora pentru fundamentarea unor

concluzii privind diversitatea genetică.

Pentru a determina acest efect “gât de sticlă” la nivelul populațiilor

eșantionate s-a utilizat programul BOTTLENEK 1.2.02 (Piry et al. 1999). Pentru rulare

este nevoie de un fișier input (realizat cu ajutorul programului GENEALEX 6.5) și de

minim 4 loci microsatelitici.

Deoarece de cele mai multe ori efectul “gât de sticlă” duce la o scădere a

heterozigoției în cadrul populațiilor, programul BOTTLENEK are la bază compararea

valorilor heterozigoției aștepate cu cele ale heterozigoției observate. Astfel, programul

calculează pentru fiecare populație și pentru fiecare locus distribuirea heterozigoției

așteptate în raport cu numărul total de alele și mărimea eșantionului, pornind de la

ipoteza că populațiile se află în echilibru Hardy – Weinberg. Pentru rularea programului

s-a stabilit un set de parametri, după cum urmează:

1) Selectarea unui model IAM (engl. Infinite Allele Model), SMM (engl.

Stepwise Mutation Model) sau TPM (engl. Two Phase Model);

2) Selectarea numărului de iterații (n=2000);

3) Selectarea unui test statistic de semnificație. S-au ales două teste, și anume un

test simplu de semnificație (engl. sign test), respectiv un altul bazat pe calculul

abaterii standard (engl. standard deviation).

Concomitent cu parametrii menționați anterior a fost luat în considerare și

descriptorul distribuției frecvențelor alelelor (engl. mode-shift indicator). S-a optat

pentru modelul de analiză IAM (engl. Infinite Allele Model), deoarece admitem în

prealabil că orice alelă poate suferi mutații.


32

3.2.3.6. Testarea acțiunii selecției

Influența acțiunii selecției asupra diversității genetice este una dintre cele mai

cercetate problemele cu aplicabilitate mare în formularea unor strategii de conservare a

speciilor.

Pentru testarea acțiunii selecției, la fiecare dintre cei 8 markeri analizați s-a

utilizat programul LOSITAN (engl. Looking for Selection In a TANgled dataset)

(Beaumont și Nichols, 1996; Antao et al., 2008). Programul calculează mai întâi indicele

Fst iar în cele ce urmează permite identificarea pe de o parte a locilor care se află sub

presiunea selecției, iar pe de altă parte a locilor “outlier” care influențează în mod

negativ estimarea parametrilor genetici.

Metoda are la bază identificarea relației dintre indicele de fixare (FST) și

heterozigoția așteptată (He) prin selectarea a două opțiuni: 1) neutral mean FST și 2) force

mean FST.

Pentru rularea programului a fost necesar creearea unui fișier Input, realizat

cu ajutorul software-ului GENEALEX 6.5 prin exportarea datelor într-un fișier text în

format GENEPOP. Aplicația generează în mod automat pe baza fișierului Input numărul

de nuclee (CPU = 2), media parametrului FST și numărul total de populații (13), urmând

să fie selectate modelul mutației (IAM - Infinite allele mutation) și opțiunile neutral

mean FST sau force mean Fst.


33

CAPITOLUL 4: REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1. Rezultatele analizelor morfologice

4.1.1.Variabilitatea intra și interpopulațională a taxonilor din genul

Fagus

Pentru a analiza variabilitatea morfologică intra și interpopulațională pentru

cele 3 populații, s-au compararat valorie medii individuale (redate în tabelul 4.1) ale

celor 11 descriptori analizați la nivleul frunzelor.

Descriptorii LA, LL, LW înregistrează valorile maxime în populația Măcin

(54,69 cm2; 11,40 cm; respectiv 7,27 cm), valorile medii fiind asemănătoare cu cele

obținute în alte studii pentru Fagus sylvatica, respectiv Fagus orientalis (Hatziskakis,

2011; Papageorgioiu et al., 2008; Denk, 1999 a, b). Dacă se compară valorile medii

obținute în prezentul studiu, în cadrul populației Măcin, cu cele obținute de Urechiatu

(1989) pentru aceiași populație (LL=9,81; LW=6,13; PL=1,01; NV=10), se observă o

ușoară creștere a valorilor acestora, ceea ce sugerează adaptarea speciilor la schimbările

de mediu în decursul timpului.

Lungimea laminei, indexul laminei, numărul perechilor de nervuri și lungimea

pețiolului au fost principalii parametri utilizați de Denk et al., 2002 pentru a diferenția

taxonii din genul Fagus. Deși valorile medii ale lungimii și lățimii laminei sunt foarte

apropiate pentru cele 3 populații, se constată faptul că există diferențe din punct de

vedere al numărului perechilor de nervuri, acest parametru înregistrînd valoarea maximă

de 11,4 în populația Măcin și o valoare minimă de 7,00 în populația Buciumeni. Valoarea

medie din populația Măcin pare specifică pentru F. orientalis.

Distanța dintre nervuri (DBV) este un caracter imperceptibil pe fondul

schimbărilor condiţiilor de mediu (Bayramzadeh și Ghadiri, 2014), valorile obţinute de

noi (valoarea medie de 0,88 cm) fiind mai mari decât cele obţinute de Sijacik-Nikoloic

(2013) pentru diferite provenienţe balcanice şi central europene (0,61 cm pentru o

provenienţă din Austria, respectiv 0,74 cm pentru o provenienţă din Bosnia).


34

Tabelul 4.1. Valorile minime, maxime și medii pentru descriptorii analizați

Table 4.1. Minimum, maximum and the mean of analyzed descriptors

Descriptor Populația Număr

de arbori

analizați

Valoarea

minimă

Valoarea

maximă Media Abaterea

standard

Coef. de

variație

% LA (cm2)

Tălășmani 21 27,99 48,60 35,81 4,793 13,4

Buciumeni 50 22,92 50,74 37,13 4,977 13,4

Măcin 86 26,09 54,69 35,53 5,091 14,3

LL(cm)

Tălășmani 21 8,25 10,35 9,22 0,598 6,5

Buciumeni 50 7,22 10,75 9,29 0,696 7,5

Măcin 86 7,99 11,40 9,29 0,697 7,5

PL(cm)

Tălășmani 21 0,76 1,38 0,88 0,530 25,0

Buciumeni 50 0,55 1,28 0,89 0,154 17,3

Măcin 86 0,60 1,17 0,84 0,128 15,2

LW(cm)

Tălășmani 21 4,39 6,66 5,57 0,534 9,6

Buciumeni 50 4,51 7,26 5,79 0,485 8,4

Măcin 86 4,49 7,27 5,55 0,473 8,5

LMW(cm)

Tălășmani 21 3,36 5,33 4,34 0,520 12,0

Buciumeni 50 2,74 5,48 4,39 0,513 11,7

Măcin 86 3,59 5,48 4,48 0,433 9,7

DBV(cm)

Tălășmani 21 0,73 1,09 0,93 0,086 9,2

Buciumeni 50 0,69 1,25 0,87 0,114 13,2

Măcin 86 0,66 1,11 0,88 0,091 10,4

NV

Tălășmani 21 7,60 9,60 8,68 0,512 5,9

Buciumeni 50 7,00 10,80 8,93 0,811 9,1

Măcin 86 7,40 11,40 9,18 0,721 7,9

S (mm-2)

Tălășmani 21 101,94 207,95 151,55 26,498 17,5

Buciumeni 50 114,17 205,91 151,48 23,522 15,5

Măcin 86 103,98 195,72 138,18 16,978 12,3

LI

Tălășmani 21 133,80 210,16 166,39 14,740 8,9

Buciumeni 50 128,39 183,52 161,24 12,905 8,0

Măcin 86 144,08 199,77 168,01 12,079 7,2

MWI

Tălășmani 21 39,52 54,13 46,98 3,803 8,1

Buciumeni 50 35,56 52,60 47,18 3,290 7,0

Măcin 86 42,89 52,93 48,20 2,283 4,7

PI

Tălășmani 21 8,71 21,39 11,26 4,397 29,6

Buciumeni 50 6,30 14,60 9,59 1,717 17,9

Măcin 86 5,61 12,33 9,05 1,256 13,9

LA – aria laminei; LL - lungimea laminei; PL - lungimea peţiolului; LMW - lungimea laminei de la bază până

în zona de lăţime maximă; LW - lățimea maximă a laminei; DBV - distanța între nervuri; NV - numărul

perchilor de nervuri; S – densitatea stomatelor; LI - indicele laminei; MWI - indicele lățimii maxime a laminei; PI – indicele pețiolului.

Densitatea stomatelor (S) este legată de capacitatea de reglare a schimbului de

gaze și apă la nivelul laminei (Abrams, 1994),numărul acestora poate varia din cauza


35

unor factori de mediu, cum ar fi lumina, umiditatea aerului, disponibilitatea apei și

concentraţia atmosferică în CO2 (Woodward și Kelly, 1995; Parascan și Danciu, 2001).

Valorile medii ale acestei variabile descresc de la 151,48 mm-2 (Buciumeni)

la 138, 18 mm-2 (Măcin). Se observă o amplitudine destul de mare a densității numărului

de stomate în cadrul populației Tălășmani, descriptorul având valori cuprinse între

101,94 mm-2 și 207,95 mm-2, cel mai probabil această variație se datorează faptului că

frunzele au fost recoltate atât de la arbori maturi cât și de la exemplare mai tinere, sau

datorită factorului limitativ apa, deoarece un număr mare de stomate corelat cu

dimensiunile mici ale acestora, asigură o reglare mai bună a transpirației (Bussotti et al.,

2005). Valoarea minimă a acestui descriptor în cadrul populației Măcin subliniază

profilul xerofitic al acesteia, un număr mic de stomate indicând o umiditate scăzută,

respectiv o adaptare a speciilor în condiții de secetă. Dacă Canova et al. (2008) a

specificat faptul că densitatea medie a stomatelor în cazul speciei Fagus sylvatica ar avea

valori cuprinse între 165,8 mm-2 și 238 mm-2, Masarovicova et al. (1996) raportează o

valoare medie de 103 mm-2 – 135 mm-2. Literatura de specialitate menționează faptul că

s-a observat o descreștere a densității stomatelor în funcție de stadiul de dezvoltare al

frunzei, frunzele tinere prezintă densități mai ridicate (Canova et al., 2008; Menghiu et

al., 2012), de aceea se poate preciza faptul că diferențele observate de noi, în studiul de

față, între arbori sau între populații nu pot fi o consecință a acestei afirmații, întrucât

frunzele au fost recoltate în aceiași perioadă, respectiv același stadiu de dezvoltare.

În ceea ce privește descriptorul PL - lungimea pețiolului, acesta este influențat

de doi factori: în primul rând lumina și căldura, frunzele expuse la soare au pețiolul mai

lung decât cele umbrite, iar în al doilea rând sunt corelate cu forma bazei laminei (Denk,

1999a). Așa cum s-a precizat în capitolul anterior, s-au recoltat frunze din partea

mediană a coroanei cu scopul de a elimina existența unor diferențe datorate expunerii în

plină lumină sau nu. Deși lungimea pețiolului variază destul de mult în interiorul

populațiilor, diferențele între populații sunt destul de mici, valoarea maximă fiind

obținută pentru populaţia Buciumeni (0,89 cm) iar valoarea minimă pentru populaţia

Măcin (0,84 cm). Denk et al. (2012) constată o diferență între lungimea pețiolului frunzei

la speciile din genul Fagus analizate. Astfel, valorile medii ale acestui parametru ar fi


36

cuprinse între 0,51 și 0,58 cm pentru Fagus orientalis, respectiv 0,76 și 0,93 cm pentru

Fagus sylvatica. În acest context, materialul analizat de noi corespunde datelor pentru

F. sylvatica.

Lungimea pețiolului se află în strânsă legătură cu indicele pețiolului (PI).

Astfel, comparând valorile acestui indice pentru fiecare populație se poate constata că

acesta prezintă valoarea maximă (11,26) pentru populația Tălășmani (valoare

intermediară între cele obținute de Papageorgiou et al., 2008 pentru populațiile de F.

sylvatica din Grecia – populația Elatia 12,11; populația Echinos 10,31), valoarea de 9,59

pentru populația Buciumeni, valorile fiind de data aceasta asemănatoare cu cea obținută

de Papageorgioiu et. al. (2008) pentru o populație de Fagus orientalis din Grecia (PI =

9,56).

4.1.2. Evaluarea variabilității morfologice prin utilizarea analizelor

statistice

4.1.2.1. Testarea normalității șirului de valori analizate

Rezultatele testului de normalitate Shapiro – Wilk indică faptul că 7 din cele

11 variabile se abat de la o distribuție normală (p<0,05). De aceea, s-a optat în cele ce

urmează pentru o analiză neparametrică a varianței, prin aceasta urmărindu-se

identificarea variabilelor care generează diferențe semnificative între populații.

4.1.2.2. Analiza Kruskall –Wallis

Pentru început s-au determinat valorile minime, maxime și medii pentru toți

parametrii analizați, pe ansamblul celor 3 populaţii, iar apoi s-a calculat abaterea

standard, respectiv coeficientul de variație.

Pe baza testului Kruskall – Wallis se poate observa faptul că diferențele

distinct semnificative (p<0,01) între populații s-ar putea datora variabilității următorilor

descriptori: lungimea pețiolului (PL), densitatea stomatelor (S), numărului de nervuri


37

(NV) și indicele pețiolului (PI), iar diferențele semnificative ( 0,01 < p < 0,05) datorită

distanței dintre nervuri (DBV), lățimii laminei (LW), ariei frunzei (LA), precum și

indicelui laminei (LI) – Tabelul 4.2.

Dacă se analizează coeficientul de variație se poate observa că una dintre

variabilele care indică gruparea cea mai mare a variabilelor în jurul valorii medii ar fi

indicele lățimii maxime a laminei (MWI).

Tabelul 4.2. Rezultatele testului neparametric Kruskall – Wallis

Table 4.2. Result from nonparametric test Kruskall - Wallis

Parametrul Valoarea

minimă

Valoarea

maximă

Valoarea

medie

Abaterea

standard

Coeficientul

de variație p

LA (cm2) 22,924 54,686 36,075 5,038 0,140 0,047

LL(cm) 7,218 11,396 9,284 0,681 0,073 0,697

PL(cm) 0,546 1,820 0,901 0,254 0,282 0,000

LW(cm) 4,390 7,272 5,628 0,494 0,088 0,010

LMW(cm) 2,740 5,482 4,435 0,472 0,106 0,467

DBV(cm) 0,656 1,250 0,880 0,100 0,113 0,022

NV 7,000 11,400 9,032 0,745 0,083 0,009

S(mm-2) 101,937 207,951 144,205 21,565 0,150 0,002

LI 128,388 210,159 165,639 13,001 0,078 0,026

MWI 35,557 54,126 47,711 2,895 0,061 0,167

PI 5,612 21,387 9,740 2,542 0,262 0,000

LL - lungimea laminei; PL - lungimea peţiolului; LMW - lungimea laminei de la bază

până în zona de lăţime maximă; LW - lățimea maximă a laminei; DBV - distanța între

nervuri; NV - numărul perchilor de nervuri; S – densitatea stomatelor; LI - indicele

laminei; MWI - indicele lățimii maxime a laminei; PI – indicele pețiolului.

4.1.2.3. Analiza componentelor principale

Analiza componentelor principale s-a realizat pentru cei 157 de arbori, din

cele 3 populații, pentru toate cele 11 variabile luate în considerare. Au rezultat 8

componente principale cu valori pozitive, 4 dintre acestea au valori proprii (engl.

eigenvalue) mai mari decât 1 și reprezintă peste 85 % din variabilitatea totală.

Se poate observa faptul că prima componentă este influențată de variabilele

care redau mărimea frunzei (LA, LL, LW, LMW), cea de-a doua componentă de


38

parametrul LI, parametru care redă forma frunzei și cea de-a treia componentă este în

mare parte influențată de lungimea pețiolului (PL).

Pentru început s-a analizat relaţiile dintre arbori, luând în considerare primele

2 componente, deoarece acestea prezintă cea mai mare variabilitate (33,15 %, respectiv

21,4 %), urmând ca în cele din urmă să se ia în considerare primele 3 componente

principale (acestea având o variabilitate cumulată de 73,93 %). Din reprezentările grafice

(figura 4.1, respectiv figura 4.2) se poate constata o suprapunere a arborilor din cele 3

populații, ceea ce indică faptul că nu există o comasare a acestora pe taxoni sau pe

populație, în funcţie de variabilele utilizate.

Figura 4.1. Analiza componentelor principale pentru primele 3 componente (F1

(33,15%), F2 (21,98%) ȘI F3 (18,8%))

Figure 4.1. Principal Components Analysis for the first 3 component (F1 (33.15%),

F2 (21.98%) and F3 (18.8%))


39

Fgura 4.2. Graficul PCA în funcție de primele două componente principale

Figure 4.2. PCA graph based on first two principal components

4.1.2.4. Analiza Cluster

Așa cum s-a precizat în capitolul anterior, s-au realizat mai multe analize

cluster (dendrograme), pentru 3 distanțe și 4 metode ”aglomerative”, însă dintre acestea

cele mai concludente au fost cele bazate pe metoda înlănțuirii complete (engl. complete

linkage) și distanțele Manhattan și Euclidiană, respectiv metoda UPGMA (engl.

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) și distanța Euclidiană.

Astfel, în prima dendrogramă (figura 4.3) se poate observa constituirea a 3

grupuri omogene ale căror caracteristici sunt redate în tabelul 4.3.


40

Tabelul 4.3. Valorile medii ale filotipurilor (cluster) constituite pe baza distanței

Manhattan și a metodei înlănțuirii complete

Table 4.3. The average values with phillotip(cluster) up on Manhattan distance and

complete linkage method

Filotip (cluster) 1 2 3

LA (cm2) 38,525 34,925 33,668

LL(cm) 9,369 9,136 9,426

PL(cm) 0,848 0,957 0,889

LW(cm) 5,927 5,551 5,203

LMW(cm) 4,449 4,343 4,601

DBV(cm) 0,907 0,865 0,856

NV 8,918 9,018 9,284

S(mm-2) 128,674 163,977 133,307

LI 158,238 165,119 181,290

MWI 47,429 47,470 48,771

PI 9,074 10,511 9,431

LL - lungimea laminei; PL - lungimea peţiolului; LMW - lungimea laminei de la bază

până în zona de lăţime maximă; LW - lățimea maximă a laminei; DBV - distanța între

nervuri; NV - numărul perchilor de nervuri; S – densitatea stomatelor; LI - indicele

laminei; MWI - indicele lățimii maxime a laminei; PI – indicele pețiolului.

Prin compararea valorii medii a indicelui laminei pentru cele 3 filotipuri, cu

valorile obținute de Denk et al. (1999 a, b) s-ar putea spune că arborii grupați în primul

cluster aparțin speciei Fagus sylvatica, cel de-al doilea cluster taxonului Fagus x. taurica

(deoarece prezintă o valoare intermediară) și cei din al treilea cluster speciei Fagus

orientalis. Denk et al., 2002 precizează că valoarea medie a indicelui laminei ar fi

cuprinsă între 149-163 pentru Fagus sylvatica, în jurul valorii de 170 pentru Fagus

moesiaca, respectiv mai mare de 180 pentru Fagus orientalis. Însă dacă am lua în

considerare alte variabile, nu s-ar putea face această încadrare deoarece valorile medii

obținute pentru cele trei filotipuri sunt destul de apropiate. Un alt parametru destul de

variabil ar fi densitatea stomatelor, acesta având o valoare maximă (163,977mm-2) pentu

al doilea filotip și o valoare minimă (128,674 mm-2) pentru primul filotip, dar studiile

efectuate până în prezent nu redau faptul că acest descriptor ar duce la o diferențiere

clară între cei trei taxoni, ci sugerează că acesta ar fi într-o strânsă legătură cu condițiile

climato-edafice. În consecință, datele acestei analize morfologice indică o oarecare


41

impuritate taxonomică a materialului analizat, dar de foarte slabă intensitate. Acest fapt

s-ar putea datora efectelor introgresiunilor repetate produse in intervalul de timp

indelungat de la separarea arealului fagului european de cel oriental.

Pentru cea de-a doua dendrogramă, la care s-au luat în considerare distanța

euclidiană și metoda înlănțuirii complete, au rezultat de asemenea 3 clustere, în fiecare

dintre acestea regăsindu-se arbori din toate cele trei populații: în primul cluster fiind

grupați un număr de 122 de arbori, în cel de-al doilea cluster 24 de arbori iar în cel de-

al treilea cluster 11 arbori, situație destul de diferită față de cea anterioară. Dacă în cazul

distanței Manhattan pe baza indicelui laminei (LI) se putea emite o ipoteză cu privire la

aprarteneța unui grup de arbori din cadrul unui cluster la un anumit taxon, în această

situație acest lucru nu mai este relevant. Alte variabile care ar fi putut duce la

diferențierea clară (distanța dintre nervuri, numărul de nervuri, lungimea pețiolului) au

valori medii destul de apropiate pentu cele 3 clustere. Atât în cadrul acestei analize

cluster cât și în primul caz s-a constatat că indicele lățimii maxime are valori mai mici

decât cele efectuate în alte studii cu privire la morfologia fagului europen sau a fagului

oriental, unde avea o valoare de peste 50 (Papageorgiou, 2008).


42

Fig

ura

4.3

. A

nal

iza

clust

er p

e b

aza

dis

tanțe

i M

anhat

tan

Fig

ure

4.3

. C

lust

er A

na

lysi

s b

ase

d o

n M

anh

att

an d

ista

nce


43

În concluzie, analizele morfologice realizate pe baza celor 11 descriptori nu

permit o departajare clară a arborilor analizați în funcție de taxon (Ciocîrlan, 2014).

Totuși, dacă se ia în considerare doar un anumit descriptor, spre exemplu numărul de

perechi de nervuri (NV), din măsurătorile efectuate la nivelul frunzelor în populațiile

Buciumeni și Măcin, se poate confirma coexistența celor trei taxoni pentru că se observă

arbori care prezintă atât valori specifice fagului european și fagului oriental cât și valori

intermediare. Valorile medii ala descriptorului NV la Buciumeni şi Măcin sunt mai

apropiate de F. orientalis (Denk et al., 2002). O amplitudine mare de variație se poate

observa și la nivelul celorlalți descriptori, ceea ce subliniază faptul că cel mai probabil

la nivelul acestor populații au avut loc hibridări introgresive.

4.2 Rezultatele analizelor genetice

4.2.1. Echilibrul Hardy-Weinberg și dezechilibrul Linkage

Echilibrul Hardy – Weinberg s-a testat atât pentru cazurile în care există

abateri datorate excesului de heterozigoți, cât și pentru cazurile în care abaterile sunt o

consecință a deficitului de heterozigoți.

Abateri datorită excesului de heterozigoți se înregistrează atunci când în

eșantion sunt mai puțini homozigoți decât ar fi fost de așteptat pentru realizarea unui

echilibru Hardy-Weinberg. Astfel de abateri se înregistrează și în prezentul studiu pentru

3 markeri (Sfc1143, MFS11 şi FIR065).

În cazul deficitului de heterozigoți se poate observa că toți locii analizați

prezintă abateri de la echilibrul Hardy – Weinberg (p<0.05), cei mai afectați markeri

fiind FS4-46 și Sfc0161. Cu toate acestea, dacă ne referim la echilibru Hardy –Weinberg

la nivel de populație se poate constata faptul că populațiile Bucovăț și Rânca nu prezintă

abateri de la acest echilibru.

Cele mai multe abateri de la echilibrul Hardy-Weinberg se înregistrează

datorită deficitului de heterozigoți, fiind cel mai probabil pe de o parte o consecință a

faptului că populațiile analizate nu respectă criteriile unei “populații ideale” (încrucișare

randomizată, lipsa mutațiilor, derivei, selecției sau fluxului genic), iar pe de altă parte o


44

consecință a eșecului de amplificare a unor alele în cadrul unui locus (prezența alelelor

nule) (Selkoe și Toonen, 2006). Totodată, într-o anumită măsură deficitul de heterozigoți

ar putea fi pus în legătură și cu poziția marginală a populațiilor analizate, deși nu s-a

putut dovedi până în prezent că selecția naturală ar putea orienta structura genotipică a

populaților într-o astfel de direcție.

Dezechilibrul linkage a fost testat pentru toți locii analizați, în cadrul fiecărei

populații. Din cele 56 de cazuri posibile s-au identificat 13 pentru care există o

probabilitate distinct semnificativă (p>0,05) ca acestea să se afle într-un dezechilbru

linkage.

Cele mai multe dezechilibre linkage se constată la nivelul markerului FS4-46,

acest lucru se datorează cel mai probabil pe de o parte polimorfismului ridicat iar pe de

altă parte faptului că pentru acest marker a fost identificată o proporție mare a alelelor

nule.

4.2.2. Estimarea și calculul principalilor parametri care cuantifică

diversitatea genetică

Diversitatea genetică este unul dintre cele mai importante aspecte ce trebuie

analizate în populațiile naturale ale speciilor sălbatice sau în cele rezultate, în cazul

arborilor, din culturi forestiere. În primul rând, populațiile care prezintă o diversitate

genetică ridicată sunt capabile să se adapteze mai ușor la schimbările bruște de mediu

comparativ cu cele care prezintă o diversitate genetică scăzută.

Valorile parametrilor genetici pentru markerii analizați sunt prezentate în

tabelul 4.4. Primele concluzii ce se pot desprinde din analiza acestora sunt:

markerul FS4-46 a înregistrat valori maxime pentru 5 din cei 6 parametri genetici

analizați, singurul parametru pentru care nu a înregistrat valoarea maximă a fost

heterozigoția observată. Se poate constata că la polul opus cu valori minime pentru 5 din

6 parametri se află markerul FS3-04, de această dată parametrul care nu înregistrează

valoarea minimă la acest marker este indicele de fixarea (F).


45

valorile medii obținute pentru heterozigoția observată și cea aștepată la markerul

FS3-04 sunt mai mici decât cele menționate de Pastorelli et al., 2003 pentru descrierea

acestui marker.

Cele 13 populații analizate au fost încadrate în 3 mari categorii, după cum

urmează: populații marginale izolate (Măcin, Snagov, Tălăşmani, Bucovăţ), populații

marginale de limită altitudinală (limită superioară: Rânca, Sebeş1, Apuseni; limită

inferioară: Novaci, Sebeş2, Huedin) și populații din arealul cvasicontinuu al fagului

(Angheleşti Vrancea şi Câmpina Prahova). În tabelul 4.5 sunt prezentați parametrii

genetici la nivel de populație, precum și media caracteristică fiecărei categorii. Valorile

medii ale indicilor calculați s-au discutat în cele ce urmează. S-au comparat pe de o parte

valorile populațiilor marginale izolate cu cele ale populațiilor din arealul cvasicontinuu

al fagului, iar pe de altă parte populațiile marginale de altitudine mică cu cele de

altitudine mare. Gradul de semnificație a diferențelor dintre valorile medii obținute

pentru fiecare populație, în funcție de categoria din care face parte s-a testat cu ajutorul

programului XLSTAT prin aplicarea a trei teste statistice (Tukey, Newman-Keuls și

Duncan).

Tabel 4.4. Principalii parametri statistici calculați la nivel de marker

Table 4.4.. The statistical parameters calculated for each marker

Marker AT Na Ne Ho He F

Sfc0018 14 9,538 4,017 0,609 0,682 0,109

Sfc0161 22 12,615 6,362 0,706 0,826 0,145

Sfc1063 18 10,308 5,870 0,765 0,785 0,035

FS3-04 9 4,385 1,751 0,380 0,400 0,045

Sfc1143 15 8,462 4,454 0,747 0,760 0,023

MFS11 13 7,308 3,328 0,682 0,688 0,007

FIR065 11 6,154 2,994 0,674 0,642 -0,072

FS4-46 55 15,154 6,835 0,648 0,844 0,223

Media 19,62 9.240 4,450 0.650 0,703 0,064

AT – numărul total de alele; Na – numărul mediu de alele; Ne – numărul efectiv de alele; Ho – Heterozigoția

observată; He – Heterozigoția așteptată (diversitatea genetică); F – indicele de fixare.

A) Numărul mediu de alele (Na)

Prin analiza genetică a celor 8 markeri moleculari s-a constatat că aceștia au

un grad ridicat de polimorfism, ca urmare a numărului mare de alele pe locus. S-a

identificat un total de 147 de alele care caracterizează cele 13 populații la nivelul celor


46

8 markeri. Cel mai polimorfic este markerul FS4-46, pentru care numărul mediu de alele

(Na) este de 15,154, la polul opus aflându-se markerul FS3-04 cu 4,385 alele pe locus.

Markerul FS3-04 a înregistarat valori minime și în cadrul unor cercetări întreprinse

pentru populații de fag din Germania (3,77 – Rajendra, 2011; 3,92 – Muller, 2013).

Dacă analizăm acest parametru la nivel de populație se poate constata că

acesta prezintă valori maxime pentru populația din Apuseni (11,625), iar valori minime

pentru populațiile Bucovăț (4,625) și Tălășmani (6,125). Valorile minime pentru cele

două populații sunt cel mai probabil o consecință a numărului mic de arbori existenți în

populație, fiind analizați numai 4 arbori din populația Bucovăț, respectiv 21 din

populația Tălășmani. Raporatat la întregul eșantion, acest indice are o valoare medie de

9,240.

Acest parametru înregistrează diferențe semnificative între populațiile

marginale izolate, unde prezintă o valoare medie de 7,9 și populațiile din arealul

cvasicontinuu la care numărul mediu de alele este de 10,8. Diferențe mai mici se pot

observa între populațiile de limită altitudinală, astfel populațiile aflate la mică altitudine

au un număr mediu de alele mai mare decât cel al populațiilor aflate la altitudine mare.

B) Numărul efectiv de alele (Ne)

Numărul efectiv de alele cuantifică variația genetică luând în considerare

frecvența relativă a alelelor. Se consideră că un marker prezintă o variație ridicată atunci

când frecvențele relative ale alelor sunt aproximativ egale.

Cele mai mari valori ale acestui parametru s-au înregistrat pentru markerii FS4-

46 (6,835) și Sfc0161 (6,362), iar cele mai mici valori pentru markerul FS3-04 (1,751).

De remarcat este faptul că lmarkerul FS4-46 a prezentat valori asemănătoare pentru

populația Abruzzo din centrul Italiei (6,8) (Buiteveld et al., 2007).

Valoarea medie a numărului efectiv de alele (4,45) pentru întreg eșantionul

analizat (13 populații) este mai mare decât valoarea obținută pentru numărul efectiv de

alele în populațiile: Sebeș1 (3,162), Tălășmani (3,207), Bucovăț (3,454), Rânca (4,109)

și Huedin (4,346). Valoarea maximă s-a obținut pentru populația Novaci, unde numărul

efectiv de alele este de 5,291.


47

Dacă diferențele în ceea ce privește numărul mediu de alele erau semnificative

între populațiile marginale și cele din arealul cvasicontinuu, în ceea ce privește numărul

efectiv de alele se pot constata diferențe destul de mici între cele 2 categorii de populații.

Cea mai mică valoare a numărului efectiv de alele a fost semnalată pentru populațiile

marginale de limită altitudinală mare (3,89).

C) Heterozigoția observată (Ho)

Parametrul heterozigoția observată corespunde valorii proporției

heterozigoților la un anumit locus în cadrul populațiilor analizate. Se poate observa în

tabelul 4.10. că acest parametru variază destul de mult de la un marker la altul,

prezentând valori minime pentru markerul FS3-04 (0,380) și valori maxime pentru

markerul Sfc1063 (0,765). Același lucru a fost semnalat și în cercetările întreprinse de

Muller (2013) pentru populații de fag din Germania, acesta obținând o valoare a

heterozigoției observate de 0,304 pentru markerul FS3-04, respectiv 0.794 pentru

markerul Sfc1063.

În ceea ce privește studiul acestui parametru la nivel de populație putem sesiza

faptul că cea mai mare proporție a heterozigoților se înregistrează în populațiile Rânca

şi Angheleşti, în timp ce populația Tălășmani, situată la limita estică a arealului speciei,

izolată față de alte populații din zona respectivă, înregistrează cea mai mică proporție de

heterozigoți. Valoarea medie de 0,651 este apropiată de cea obținută pentru populații de

fag din Austria (0,633), Franța (0,635), Italia (0,682) și Olanda (0,646) (Buiteveld et al.,

2007), însă puțin mai mare decât valoarea medie obținută pentru diferite populații din

Germania (Rajendra, 2011; Muller, 2013; Buiteveld et al., 2007).

În studiul comparativ dintre populațiile de fag marginale și cele din arealul

cvasicontinuu, la nivelul celor 8 microsateliți analizați se pot observa valori apropiate

ale HO în populațiile marginale de limită altitudinală (populațiile de mică altiudine –

0,655, populațiile de mare altitudine – 0,682). Totodată aceste valori sunt mai mici decât

cele calculate pentru acest parametru la nivelul populațiilor din arealul cvasicontinuu

(0,737) și mai mari decât valorile obținute pentru populațiile marginale izolate (0,598).


48


49

D) Heterozigoția așteptată (He)

Heterozigoția așteptată este parametrul cel mai utilizat pentru caracterizarea

structurii genetice a populațiilor, fiind cunoscut și sub denumirea de diversitatea

genetică și reprezintă procentul așteptat de heterozigoți într-o populație sau la un anumit

marker, in cazul în care populaţia s-ar afla într-un echilibru Hardy – Weinberg.

Studiul diversității genetice este de mare importanță pentru proiectarea unor

strategii de conservare, practici de management și programe de ameliorare a speciilor

(Cotovelea și Ciocîrlan, 2014).

Cea mai ridicată valoare a diversității genetice se poate observa pentu markerii

FS4-46 și Sfc0161, unde se așteaptă ca peste 80% din indivizi să fie heterozigoți. Așa

cum era de așteptat, pe de o parte datorită nivelului scăzut al polimorfismului, iar pe de

altă parte valorii mici a heterozigoției observate, markerul FS3-04 prezintă cea mai

scăzută valoare a diversității genetice și anume 0,40.

Dacă în schimb analizăm acestă valoare la nivel de populație, valoarea maximă

se înregistrează pentru populația Câmpina (0,762), iar valoarea minimă pentru populația

Tălășmani (0,538).

Așa cum era de așteptat, cele mai mici valori ale diversității genetice se regăsesc

în cadrul populațiilor marginale izolate (0,683) și în cadrul populațiilor de limită

altitudinală superioară (0,673), iar cele mai mari valori se înregistrează pentru populațiile

din centrul arealului, acestea prezintând o valoare medie a diversității genetice de 0,752.

Acest fapt poate fi pus în legătură cu presiunea selectivă mai mare determinată de mediul

climatic în cazurile în care diversitatea genetică este mai mică.

Interesant este faptul că, dacă analizăm diversitatea genetică la nivelul

transectelor altitudinale se observă că pentru două dintre acestea (Novaci - Rânca,

Sebeș1 – Sebeș2) diferențele sunt destul de mari, iar populațiile de mică altitudine

prezintă o diversitate genetică mai ridicată decât populațiile aflate la altitudine

superioară, însă pentru transectul altitudinal din zona Apuseni difențele sunt foarte mici.

Deși se observă diferențe între valorile obținute pentru cele patru categorii de

populații eșantionate (marginale izolate, din arealul cvasicontinuu sau de limită

altitudinală), acestea nu sunt semnificative din punct de vedere statistic. Pentru


50

examinarea semnificației diferențelor dintre medii s-au utilizat o serie de teste statistice

(Tukey, Newman-Keuls și Duncan) implementate în programul XLSTAT.

E) Indicele de fixare (F)

Acest parametru mai este cunoscut și sub denumirea de indice de

consangvinizare, și se calculează pe baza valorilor obținute pentru heterozigoța

observată, respectiv valoarea heterozigoției așteptate, după formula F= (HE-H0)/HE. De

precizat faptul că acest indice nu trebuie confundat cu indicii statistici de fixare (Fis, Fit,

Fst).

Indicele de fixare (F) a înregistrat valoarea maximă (0,223) pentru markerul

FS4-46, însă apreciem că această valoare ar fi putut fi influențată de faptul că cea mai

mare proporție a alelelor nule, respectiv cele mai multe abateri de la echilibru Hardy-

Weinberg s-au sezizat pentru acest marker.

În tabelul 4.5 se poate observa ca valorile acestui parametru sunt fie pozitive ,

fie negative. Valorile negative sugerează faptul că în populațiile respective au avut loc

unele procese evolutive, spre exemplu acțiunea selecției împotriva arborilor

consangvini. De menționat faptul că valori mai mari ale acestui indice (F>0,1) s-au

obținut pentru cinci populații marginale (Măcin, Snagov, Stârmina și Tălășmani –

populații marginale izolate, Apuseni – populație marginală de limită altitudinală mare),

cel mai probabil aceste valori sugerează faptul că încrucișările nu au fost întru-totul

întâmplătoare. Dacă luăm în considerare faptul că la nivelul populațiilor Măcin, Snagov

și Tălășmani a fost semnalată prezența hibridului Fagus x taurica, valoarea superioară a

acestui indice la nivelul celor trei populații poate fi o consecință a încrucișărilor

intraspecifice (Boșcaiu și Rațiu, 1982).

Valoarea medie (0,064) indică faptul că pentru întreg eșantionul, cei 588 de

arbori analizați, încrucișările s-au realizat cel mai probabil în mod aleatoriu, valoarea

fiind apropiată de 0 (F=0, nu există consangvinizare).

Valoarea medie obținută pentru indicele de fixare este aproximativ egală cu

cea relatată de Sułkowska et al., 2012 (0,065) pentru populații de fag din România, într-


51

un studiu care a presupus evaluarea diversității genetice cu ajutorul markerilor

biochimici (izoenzime).

F) Bogăția alelică (engl. alleic richness) (AR)

Reprezintă un parametru al diversității genetice luat în considerare pentru

stabilirea unor strategii de conservare a speciilor și poate fi defint ca suma numărului de

alele observate în fiecare populație și numărul așteptat al alelelor care lipsesc din

populația respectivă, luând în considerare mărimea minimă a eșantionului (Foulley și

Ollivier, 2006).

Dacă diversitatea genetică oferă populațiilor, respectiv speciilor capacitatea

de a răspunde selecției, imediat sau pe termen scurt, bogăția alelică este importantă

pentru supraviețuirea și evoluția acestora pe termen lung (Pandey și Rajora, 2012).

Deoarece acest indice se calculează în funcție de mărimea minimă a

eșantionului, s-au calculat valorile AR specifice fiecărui marker (tabelul 4.13) pentru 12

populații, populația Bucovăț fiind exclusă (mărimea minimă a eșantionului fiind de 21

de arbori). Populația Bucovăț a fost exclusă deoarece este un caz aparte, ca urmare a

numărului foarte mic de probe analizate, aceasta fiind nerelevantă la nivelul întregului

eșantion pentru analiza parametrului AR. Cele mai mari valori au fost obținute pentru

markerul FS4-46.

Astfel, din analiza valorilor parametrului AR se constată o puternică

distorsionare a valorilor față de cele calculate pentru Na. În acest context, a rezultat că

bogăția alelică minimă caracterizează markerul FS3-04, respectiv cea maximă markerul

FS4-46. La nivelul celor 12 populații rămase în analiză au rezultat valori minime de 5,56

în populația Sebeș 1 și 5,76 în populația Tălășmani, respectiv maxime de 7,91 în

populația Câmpina și 7,85 în populația Apuseni. În populațiile de mare și de mică

altitudine situate pe același transect rezultă și de această dată diferențe mari între Sebeș1

și Sebeș 2, respectiv mici între Rânca și Novaci, dar mai ales între Huedin și Apuseni.

Aceste similitudini între parametrii genetici din zona Apuseni-Huedin par să confirme

datele din literatură (Magri, 2008) privind posibilitatea existenței în zona respectivă a

unui refugiu glaciar secundar.


52

Pe de altă parte, valorile parametrului AR obținute la nivel de populație sunt

inferioare celor obținute de Rajendra pentru probe din Germania (2014) sau Buiteveld

pentru probe din Austria, Franța, Germania, Italia și Olanda (2007).

Examinarea semnificației diferențelor dintre valorile medii prin utilizarea

testelor statistice a reliefat faptul că nu există diferențe semnificative între valorile

obținute pentru fiecare categorie de populație.

4.2.3. Diferențierea genetică între populații și structura genetică

populațională

4.2.3.1 Indicii de fixare F-statistic (FIS, FIT, FST)

Indicii de fixare F-statistic (Wright, 1951) redau diferențierea dintre populații

sau specii la nivel de individ în raport cu: numărul total de arbori (FIT) sau populația din

care face parte (FIS); gradul de diferențiere al unei populații față de numărul total de

arbori analizați (FST) (Walser, 2013).

Indicele de fixare FST este o măsură a diferențierii genetice a populațiilor,

bazată în general pe gradul de polimorfism al locilor analizați, prin compararea

variabilității genetice inter și intrapopulaționale.

Cea mai bună diferențiere la nivel de individ se realizează la nivelul

markerului FS4-46 (FIS=0,233, FIT=0,304), în schimb grdul de diferențiere maximă la

nivel de populație se observă pentru markerul FIR065 (FST=0,121).

Valoarea medie a indicelui de fixare FST (0,082) la nivelul celor 13 populații

analizate este mai mare decât valorea obținută pentru acest indice în populații din

Germania, unde valoarea medie a fost de 0,017 (Rajendra, 2011).

Diferența medie pe perechi (engl. pairwise FST differences) într-o populație

poate fi calculată ca suma diferențelor pe pereche împărțit la numărul total de perechi.

În reprezentare grafică din figura 4.4, rezultată în urma comparării valorilor

indicilor Fst din cadrul fiecărei populații, se poate observa variația genetică între oricare


53

două populații analizate, valorile Fst fiind redate printr-un gradient de culoare. Valorile

specifice fiecărei culori s-au afișat în legenda din partea dreaptă a graficului.

Figura. 4.4. Reprezentarea grafică a parametrului Fst pentru fiecare populație

Figure 4.4. Grafic results of pairwise Fst matrix

Cel mai mic grad de diferențiere s-a observat între populațiile Apuseni și

Sebeș2 (media pe perechi FST=0,0746), urmat de perechea Apuseni și Huedin (media pe

perechi FST=0,087). Totodată cel mai mare grad de diferențiere s-a semnalat între

populațiile Huedin și Tălășmani (medie perechi FST= 0,1854).

La nivel de populații marginale izolate cel mai mic grad de diferențiere

genetică s-a constatat între populațiile Măcin și Snagov (media pe perechi FST=0,0215),


54

în timp ce pentru populațiile Măcin și Tălășmani s-a semnalat relativ cel mai mare grad

de diferențiere (media pe perechi FST= 0,1015).

Între populațiile marginale de altiudine mică și cele de altiudine mare există

o diferențiere moderată cu o valoare medie pe perechi de 0,02.

4.2.3.2. Structura genetico-populațională

În ceea ce privește structura populațională, s-a realizat gruparea indivizilor

din cele 13 populații pe baza a 2 metode: o primă metodă presupune constituirea unor

arbori filogenetici prin calculul unor distanțe genetice, iar cea de-a doua metodă este de

atribuire genetică (engl. genetic assignement) și presupune realizarea structurii genetice

pe baza analizei bayesiene.

1) Constituirea arborilor filogenetici

Pentru distanța genetică Nei (figura 4.5) se poate observa o grupare a

populațiilor marginale într-un cluster, respectiv o altă grupare a celorlalte populații pe

regiuni geografice, cu valori bootstrap mai mari de 40.


55

Figura 4.5. Arbore filogenetic obținut pe baza distanței genetice Nei: bootstrap pe

locus

Figure 4.5. Phylogenetic trees obtained using Nei genetic distance:bootstrap on locus

O situație puțin diferită se observă la gruparea populațiilor pe baza distanțelor

genetice Cavallis-Sfortza, unde în primul rând se poate remarca gruparea populațiilor

Măcin și Snagov pe baza unei legături puternice (BS=71). Cu o valoare bootstrap destul

de mică le este asociată în cadrul grupului populația Tălășmani. De această dată

populația Stârmina se încadrează în același grup cu populațiile centrale și cele de limită

altitudinală.

Valori bootstrap mari (BS>70) au fost reliefate la gruparea populației Huedin

cu populația Apuseni.

În ambele cazuri populația Bucovăț se individualizează de restul grupului, cel

mai probabil datorită numărului mic de idivizi analizați.

Cele două dendrograme realizate cu ajutorul algoritmului UPGMA

(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) au reliefat aceleași grupuri cu

aproximativ aceleași valori bootstrap atât în cazul realizării arborilor filogenetici pe

populație prin realizarea unor legături la nivel de locus (engl. philogenetic tree of


56

population with bootstrap on locus), cât și atunci când populațiile s-au grupat prin

realizarea legăturilor la nivel de individ (engl. phylogenetic tree of population with

bootstrap on individuals).

În urma acestei analize datorită observării faptului că populațiile din cadrul

transectelor altitudinale se grupează în același cluster, se poate testa dacă structurile

genetice ale celor 6 populații sunt sau nu dependente de distanța geografică. Pentru

aceasta cu ajutorul programului GENEALEX 6.5 s-au calculat mai întâi distanțele

geografice și indicele de diferențiere a populațiilor în funcție de structura lor genetică

(Fst), iar apoi s-a aplicat testul Mantel pentru a putea clarifica ipoteza menționată

anterior.

Deși în figura 4.6 se poate observa o grupare difuză a populațiilor analizate,

din punct de vedere statistic diferențele sunt nesemnificative (p>0,05), ceea ce indică

faptul că asocierea populațiilor într-un anumit cluster nu reprezintă o consecință a

grupării în funcție de distanțele geografice mici dintre acestea.

Figura 4.6. Rezultatele testului Mantel

Figure 4.6. Mantel test results

P=0,170


57

2) Analiza bayesiană

Deoarece metoda bayesiană presupune gruparea arborilor pe baza

genotipurilor multilocus, astfel încât există probabilitatea ca fiecare individ analizat să

aparțină uneia din cele k populații care nu au fost predefinite (selectarea obțiunii

LocPrior), pentru derularea acesteia este foarte important satabilirea numărului de

clustere.

Stabilirea numărului de clustere

Așa cum s-a precizat în capitolul anterior, s-au folosit două metode pentru

stabilirea numărului de clustere: o primă metodă constă în compararea valorilor obținute

pentru Ln P(D), iar cea de-a doua metodă, sugerată de Evanno et al. (2005), presupune

calcularea parametrului ΔK.

Pentru k cu valori de la 1 la 13 (numărul de populații analizate), nu s-a putut

stabili cu exactitate o valoare maximă pentru Ln P(D) deoarece nu există suport statistic

la nivelul acestei variabile; astfel s-a recurs la ce-a de-a doua metodă – estimarea

parametrului ΔK, pentru stabilirea numărului de clustere.

Rezultatele obținute în urma rulării programului STRUCTURE

HARVESTER (Earl și vonHoldt, 2012) sugerează faptul că cei 588 de arbori eșantionați

se împart în două grupuri omogene, valorile maxime pentru parametrul ΔK

înregistrându-se de asemenea pentru k=2.

4.2.3.3. Analiza alocării arborilor din cele 13 populații eșantionate cu

ajutorul programelor STRUCTURE și BAPS

Datorită faptului că structura genetică a populațiior marginale poate fi

influențată în mare parte de acțiunea derivei genetice (engl. genetic drift) iar efectele

acesteia pe termen lung se fac resimțite în ceea ce privește variabilitatea speciilor și

diferențierea structurii populaționale (Myking et al., 2008), în continuare s-au prezentat

două modele de assignement genetic.


58

1) Analiza grupării populațiilor cu programul STRUCTURE

Histograma (figura 4.7) rezultată în urma rulării programului STRUCTURE

2.3.4. (Pritchard et al., 2000), pentru K=2 relevă o structură genetică bine diferențiată a

populațiilor marginale (Măcin, Snagov, Stârmina și Tălășmani) față de restul

populațiilor.

Figura 4.7. Rezultatele grupării pe populații pentru K=2, fără opțiunea LOCPRIOR

(1 - Măcin, 2 - Snagov, 3 - Stârmina, 4 –Tălășmani, 5- Apuseni, 6 – Huedin, 7 –

Sebeș1, 8 – Sebeș2, 9 – Novaci, 10 – Rânca, 11 – Câmpina (Prahova), 12 – Anghelești

Vrancea, 13 – Bucovăț)

Figure 4.7. The results of the population assignment for K=2, without LOCPRIOR

option (1 - Măcin, 2 - Snagov, 3 - Stârmina, 4 –Tălășmani, 5- Apuseni, 6 – Huedin, 7 –

Sebeș1, 8 – Sebeș2, 9 – Novaci, 10 – Rânca, 11 – Câmpina (Prahova), 12 – Anghelești

Vrancea, 13 – Bucovăț)

Atât în cazul populațiilor marginale cât și în cazul celorlalte populații se pot

identifica și indivizi cu genotipuri intermediare. Dacă ne referim strict la populațiile

Măcin, Tălășmani și Snagov, acolo unde a fost menționată coexistența taxonilor din

genul Fagus ( F. sylvatica, F. orientalis și F. x taurica), genotipurile intermediare pot fi

un rezultat al hibridărilor dintre aceștia. Însă, dacă facem referire la întreg eșantionul

putem spune că aceste genotipuri intermediare ar putea fi și o consecință a

recombinărilor genetice care guvernează panmixia locală, ori un efect a fluxului


59

interpopulațional de gene determinat de migrarea polenului. Un alt punct forte în

schimbările structurii populaționale îl constiuie potențialul arborilor de a se adapta la

schimbările de mediu (Piotti et al., 2013). Privind prin prisma acestui factor, populațiile

realtiv izolate sau cele de la limită altitudinală de răspândire a fagului sunt cele mai

afectate.

2) Analiza grupării populațiilor cu programul BAPS

Din analiza realizată cu ajutorul programului BAPS se remarcă pe de o parte

o omogenitate mare a indivizilor grupați în cele două grupuri, iar pe de altă parte faptul

că asocierea indivizilor nu diferă semnificativ față de alocarea realizată prin programul

STRUCTURE (figura 4.8). Astfel s-au diferențiat două grupuri, un grup al populațiilor

marginale izolate (redat în cadrul histogramei cu culoarea roșie), respectiv un grup al

populațiilor din arealul cvasicontinuu (redat pe histogramă cu culoarea verde). Se poate

remarca și de această dată faptul că populațiile marginale au o structură genetică proprie,

bine diferențiată față de structura genetică a populațiilor din arealul continuu. Cel mai

probabil acest fapt este datorat izolării reproductive care nu este de dată recentă, în

condițiile unei presiuni de selecție remaniatoare realizată în condițiile climatice

particulare din aceste areale marginale.

Figura 4.8. Rezultatele grupării pe populații pentru K=2, cu ajutorul programul BAPS

Figure 4.8. Results of the populations assignment for K=2, using BAPS software


60

În general, un flux mare de gene menține omogenitatea genetică a

populațiilor, pe când un flux de gene scăzut duce la izolare prin distanță și acțiunea

derivei genetice (Mimura și Aitken, 2007).

4.2.4. Identificarea de schimbări ale structurii populațiilor datorate

efectului de “gât de sticlă”

Efectul „gâtului de sticlă” (numit și efectul de „strangulare a populației”;

engl. bottleneck) este un eveniment evolutiv în care o proporție semnificativă a unei

populații sau specii dispare (Ambrose, 2003).

Deoarece efectul gât de sticlă presupune scăderea drastică a numărului de

indivizi dintr-o populație, urmată de o creștere rapidă a acestora, efectele se pot vedea

concomitent atât la nivelul numărului de alele, cât și al diversității genetice.

Programul BOTTLENECK este unul dintre cele mai utilizate în literatura de

specialitate pentru determinarea unor blocaje recente la nivelul poplațiilor de arbori,

termenul de “recent” fiind perceput ca reprezentând o perioadă specifică unei populații

în urma cu câteva zeci de generații (Luikart et al, 1998). Acesta presupune compararea

valorilor heterozigoției observate cu cele ale heterozigoției așteptate, iar pentru cele 13

populații analizate testele au reliefat faptul că, cel mai probabil, populația Măcin ar fi

fost afectată recent de efectul “gât de sticlă” (p<0,05) pentru un test neparametric de

semnificație (engl. sign test). Pentru un alt test statistic de semnificație, și anume testul

diferențelor standardizate (engl. standardized differences test) se poate constata faptul

că alte două populații (Snagov și Bucovăț) au trecut recent print-un blocaj (bottleneck).

Efectele nu sunt vizibile neapărat în acest moment, însă se fac resimțite în

timp prin creșterea omogenității din punct de vedere genetic a populației, ceea ce poate

duce la o scădere a capacității de adaptare (engl. fitness) în populațiile afectate de acest

blocaj (Măcin, Snagov, Bucovăț).


61

4.2.5. Testarea acțiunii selecției

O întrebare care s-a impus a fost dacă structura genetică actuală a populațiilor

marginale a fost influențată major de acțiunea cu mai mare intensitate a selecției naturale.

În acest scop, cu ajutorul programului LOSITAN s-a încercat să se obțină un răspuns

privind acest fenomen asupra populațiilor analizate. Metoda este fondată pe ideea că

diferențierea genetică între populații, măsurată în acest caz cu ajutorul coeficientului FST,

ar trebui să fie aceeași pentru cei 8 loci microsatelitici analizați în cadrul fiecărei

populații, datorită istoriei demografice comune a arborilor din care este constituită

populația respectivă (Geahlen et al., 2013).

Programul LOSITAN s-a rulat atât pentru cazul în care valoarea indicelui FST

obținută era comparată printr-o serie de simulări cu valoarea medie (prin bifarea opțiunii

mean FST) – figura 4.9 – a), cât și prin compararea cu o valoare “forțată” (engl. force

mean FST) – figura 4.9 – b).

Figura 4.9. Loci aflați sub acțiunea selecției: a) prin selectarea opțiunii mean Fst; b)

prin selectarea opțiunii force mean Fst

Figure 4.9. Loci under selection: a) by selecting mean Fst options; b) by selecting

mean force Fst options

a) b)


62

În ambele cazuri se observă poziția informativă a markerului Sfc0161, care

este situat pe diagramă în zona marcată cu galben (engl. outlier locus) și indică acținea

unei selecții care promovează un polimorfism balansat (engl. balancing selection).

Aceasta se referă la o serie de procese selective prin care mai multe alele (versiuni

diferite ale unei gene) sunt menținute în fondul genetic al unei populații la frecvențe mai

mari decât mutațiile genetice. Acest lucru se întâmplă de obicei atunci când heterozigoții

pentru alelele analizate au o valoare adaptativă mai mare decât homozigoții (Chhatre și

Rajora, 2014).

În cel de-al doilea caz (figura 4.9 b) se poate observa că simulările intreprinse

au scos în evidență faptul că markerul FIR065 se află în zona unei selecții direcționale

(engl. positive selection), marcată pe grafic prin culoarea roșie. Restul microsatelițiilor

se află într-o zonă neutră. O selecție direcțională duce la avantajarea unei anumite alele,

a cărei frecvență va crește continuu în decursul a câtorva generații, în condițiile unei

presiuni selective din partea mediului, ceea ce duce la creșterea adaptabilității în

condițiile schimbărilor de mediu, dar în același timp duce la scăderea diversității

genetice.

4.3. Compararea analizei de grupare a indivizilor pe baza corelației

datelor morfologice cu cele genetice

Scopul acestei comparații este acela de a vedea dacă arborii încadrați

morfologic, după caractere ale frunzelor, ca aparținând unuia dintre cei trei taxoni ai

genului Fagus, se regăsesc într-un cluster constituit pe baza datelor rezultate din

analizele genetice Această analiză s-a realizat pentru cei 86 de arbori din populația

Măcin, deoarece s-a dispus atât de analiza descriptorilor morfologici, cât și de structura

genotipică pentru 8 loci marker.

Prin analiza morfologică a celor 11 descriptori analizați la nivelul frunzelor,

pe baza distanței Manhatan cei 86 de arbori s-au grupat în 3 clustere. În continuare s-a

încercat identificarea apartenenței unui cluster la un anumit taxon, însă pe baza valorilor

medii pentru fiecare cluster nu s-a putut preciza cu exactitate dacă unul din grupuri este


63

constituit numai din taxoni de Fagus sylvatica, respectiv Fagus orientalis sau Fagus x

taurica. De aceea, prin studiul mai multor surse bibliografice (a se vedea Capitolul 1) s-

a putut discerne faptul că unul dintre descriptorii cei mai importanți, care permite

diferențierea între cei trei taxoni ar fi numărul de perechi de nervuri (NV). Astfel, pe

baza analizei acestui descriptor cei 86 de arbori au fost grupați în 3 populații statistice,

în funcție de valoarea medie obținută pentru cele 5 frunze evaluate la fiecare arbore. În

prima populație statistică au fost grupați arborii care au o probabilitate mare de apartenţă

la taxonul Fagus sylvatica (valoarea medie a numărului de perechi de nervuri nu

depăşeşte 8,5 - 55 de arbori; în cea de-a doua populaţie exemplare cu o probabilitate

mare de apartenenţă la Fagus orientalis (valoarea medie a numărului de perechi de

nervuri mai mare de 9,5) – 16 arbori; restul arborilor (15), care prezintă o valoare medie

intermediară între cele două grupuri anterioare pentru numărul de perechi de nervuri, s-

au grupat în cea de-a treia populaţie statistică, apreciindu-se că încadrarea poate fi

considerată specifică taxonului Fagus x taurica.

Inițial s-a realizat o grupare a celor 86 de arbori care are la bază analiza

genotipurilor multilocus pentru cei 8 microsateliți analizați, iar apoi s-a realizat un

assignement genetic (figura 4.17) pentru cei 2 loci marker (FS3-04, FS4-46) care,

conform literaturii de specialitate (Pastorelli, 2003), prezintă alele cu lungimi diferite

pentru Fagus sylvatica (201-207 bp la markerul FS3-04, respectiv 209-371 bp pentru

markerul FS4-46) și Fagus orientalis (192-204 bp la markerul FS3-04 și 176-272 bp la

markerul FS4-46).


64

Figura 4.10. Atribuirea genetică a arborilor din cele 3 populații statistice pentru

markerii FS3-04 și FS4-46, realizată cu ajutorul programului GENALEX 6.5

Figure 4.10. Genetic assignement of the three statistical populations for markers FS3-

04 and FS4-46 performed using GENALEX 6.5. software

Deși în cazul primei metode de assignement (pe baza celor 8 microsateliți),

realizată cu ajutorul programului STRUCTURE s-a cunoscut originea celor 86 de arbori

(55 arbori de F. sylvatica – populația 1, 16 arbori F. orientalis – populația 2 și 15 arbori

Fagus x taurica – populația 3) nu s-a constatat faptul că cele 3 populații statistice ar

prezenta o structură genetică specifică fiecăreia dintre acestea.

Pentru cea de-a doua metodă de grupare a indivizilor (pe baza genotipurilor

multilocus), nu au rezultat grupuri care să prezinte corespondență cu încadrarea

taxonomică realizată anterior pe baza descriptorului NV. În concluzie, dacă markerii

morfologici și genetici utilizați în această analiză oferă putere de discriminare

taxonomică între F. sylvatica și F. orientalis, este posibil ca distribuția acestora realizată

cu ajutorul programului GENALEX 6.5 (vezi figura 4.10) să fie consecința hibridărilor

introgresive produse de-a lungul timpului, după separarea arealelor celor două specii.

-6.000

-5.000

-4.000

-3.000

-2.000

-1.000

0.000

-6.000 -5.000 -4.000 -3.000 -2.000 -1.000 0.000

Fagus sylvatica Fagus orientalis Fagus x taurica


65

CAPITOLUL 5: CONCLUZII FINALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.

DISEMINAREA REZULTATELOR. DIRECȚII VIITOARE DE CERCETARE

5.1 Concluzii finale

5.1.1 Concluzii rezultate din efectuarea observațiilor morfologice

Diferențierea morfologică la nivelul frunzelor a fost destul de slabă pentru

cele 3 populații în care literatura a menționat existența celor 3 taxoni ai genului Fagus.

În urma evaluării descriptorilor analizați cu ajutorul testului statistic

neparametric Kruskal – Wallis s-a constatat că diferențele semnificative între arbori

analizați sunt datorate în principal diferențelor la nivelul lungimii pețiolului, densității

stomatelor și numărului de perechi de nervuri.

Prin analiza componentelor principale (PCA), nu s-a putut observa o grupare

clară a arborilor analizați pe taxoni sau pe regiuni de proveniență (populații).

Analiza cluster a surprins o grupare a arborilor analizați în 3 grupuri distincte.

Această separare a fost realizată atât în cazul în care s-au analizat toți arborii din fiecare

populație, căt și în cazul fiecărei populații în parte, însă fără ca aceste grupuri

morfologice să prezinte corespondențe taxonomice.

Cel mai probabil, diferențele mici observate la nivelul descriptorilor

morfologici sunt datorate efectelor hibridărilor introgresive produse în intervalul de timp

îndelungat de la separarea arealului fagului european de cel oriental sau lipsei taxonului

F. orientalis în populaţiile analizate.

5.1.2 Concluzii rezultate din analizele genetice

Prin compararea diversității genetice a populațiilor marginale (izolate sau de

limită altitudinală) cu diversitatea genetică a populațiilor din arealul cvasicontinuu s-a

putut constata că cele din urmă prezintă o valoare superioară a acesteia, însă din punct

de vedere statistic aceste diferențe sunt nesemnificative.


66

Parametrii genetici calculați la nivelul populațiilor marginale izolate (numărul

mediu de alele pe locus, numărul efectiv de alele, heterozigoția observată, heterozigoția

aștepatată) au valori mai mici decât cele calculate pentru populațiile din arealul

cvasicontinuu, cea ce sugerează faptul că fragmentarea arealului are efecte negative pe

termen lung asupra evoluției speciilor.

S-au identificat diferențe genetice mai mari între populațiile de mare și mică

altitudine doar pentru 2 din cele 3 transecte altitudinale, diferențele minime la nivelul

parametrilor genetici calculați pentru transectul altitudinal din Munții Apuseni fiind

datorate originii acestei populații (existența unui presupus refugiu glaciar în această

zonă).

Diferențierea genetică a fost semnificativ mai mare în populațiile marginale

izolate (FST=0,084) comparativ cu populațiile din arealul cvasicontinuu (FST=0,012).

Construirea arborilor filogenetici a permis separarea clară a populațiilor

marginale izolate de restul grupurilor. Populațiile marginale de limită altitudinală au

format același grup, în funcție de zona geografică în care se află, însă această grupare nu

a fost semnificativ influențată de distanța geografică mică dintre oricare 2 populații

analizate de-a lungul unui transect altitudinal.

Analiza bayesiană (realizată cu ajutorul a două programe STRUCTURE și

BAPS) a permis diferențierea structurală clară între populațiile marginale izolate și restul

populațiilor analizate, ceea ce indică faptul că populațiile marginale izolate au o structură

genetică proprie, datorată cel mai probabil condițiilor limitative de dezvoltare a speciilor,

care au generat un anumit sens și o intensitate aparte presiunii selective; de aceea, aceste

populații sunt de mare importanță pentru practica silvică, în contextul schimbărilor

climatice preconizate.

S-a consemnat faptul că trei dintre populațiile marginale izolate ar fi trecut

recent printr-un gât de sticlă; acesta justifică în mare parte diversitatea genetică mai

scăzută din cadrul acestor populații.

Prin testarea acțiunii selecției la nivelul celor 8 microsateliți analizați s-a putut

constata acțiunea unei selecții direcționale la nivelul markerului FIR065; aceasta duce


67

pe de o parte la creșterea gradului de adapatare a speciilor la condiții diferite de mediu,

iar pe de altă parte la scăderea diversității genetice.

Prin analize comparative s-a observat că atât prin utilizarea descriptorilor

morfologici la nivelul frunzelor, cât și pe baza analizelor genetice (cu 8 sau cu 2 markeri

microsatelitici) nu s-a obținut un nivel ridicat de diferențiere interspecifică, altfel spus

nu s-a realizat o grupare clară a arborilor pe taxoni, ceea ce indică faptul că populația de

fag de la Măcin nu este formată preponderent din exemplare de fag oriental, ci, mai

degrabă, reprezintă un rezultat al hibridărilor introgresive între F. sylvatica și F.

orientalis.

5.2. Contribuții originale

S-a realizat pentru prima dată un studiu comparativ de diferențiere a celor 3

taxoni din genul Fagus pe baza analizelor morfologice la nivelul frunzelor și a analizelor

genetice la nivelul ADN-ului nuclear.

S-a constituit banca de ADN pentru 588 de arbori de fag, aflați în diferite

regiuni ale țării în populații situate atât în arealul cvasicontinuu, cât și populațiile aflate

la limita arealului de distribuție a fagului în Romania.

S-au realizat optimizări metodologice pentru extragerea ADN-ului și

reducerea costurilor reacției PCR prin gruparea markerilor moleculari utilizați în două

multiplexe.

Pentru prima dată s-a realizat în România un studiu cu privire la diversitatea

genetică a populațiilor marginale de fag, populații care sunt supuse unor continue

procese de adaptare în contextul schimbărilor climatice actuale.

S-au obținut date care permit fundamentarea pe baze genetice a strategiei de

conservare a resurselor genetice forestiere de fag din România.

S-au realizat pentru prima dată testări în populații izolate de fag din România

în privința trecerii populaţiior printr-un “gât de sticlă” (bottleneck).


68

5.3. Diseminarea rezultatelor

A. Lucrari publicate în reviste ISI:

• Ciocîrlan, E., Curtu, A.L., Șofletea, N. 2014: Genetic variability along

altitudinal gradient in Romania beech population, Notulae Botanicae Horti

Agrobotanici Cluj-Napoca, vol 42, nr.2. (în analiză spre publicare)

B. Lucrări publicate în reviste indexate în baze de date internaționale (BDI):

• Crăciunesc, I., Ciocîrlan, E., Şofletea, N., Curtu, A.L., 2011: Genetic

diversity of pedunculate oak (Quercus robur L.) in Prejmer Natural Reserve. Bulletin

of the Transilvania University of Braşov, Seria a II-a, Vol. 4 (53), Nr. 1: 15-20;

• Ciocîrlan, E., Șofletea, N., 2013: Genetic Diversity of Romanian Populations

of Fagus sylvatica – A review. Bulletin of the Transilvania University of Braşov,

Seria a II-a, Vol. 6 (55), Nr. 1: 27-32;

• Ciocîrlan, E., 2014: Comparative morphological analyses in marginal beech

population. Bulletin of the Transilvania University of Braşov, Seria a II-a, Vol. 7

(56), Nr. 1: 7-12;

• Cotovelea, A., Ciocîrlan, E., 2014: Genetica moleculară, un instrument util

în conservarea speciilor de arbori și faună sălbatică . Revista de silvicultură și

cinegetică, XVIII/34.

C. Lucrări prezentate la simpozioane și conferințe naționale sau internaționale:

Analiza morfologică multivariată la specii din familia Fagaceae.

Simpozionul: Stadiul actual și perspective în dezvoltarea dendrologiei, București,

România 13 septembrie 2012

Morphological evaluation in marginal populations of beech in Romania.

Forest and Sustainable Developement, Brașov, România 19-20 Octombrie 2012.

Genetica moleculară - un instrument esențial în conservarea pe termen lung

a speciilor de arbori si animale sălbatice. AFCO, Brasov, România, 21 Mai 2014.


69

Nuclear DNA analysis of beech in Apuseni Mountains. Prospects for the 3rd

Millennium Agriculture, Cluj, România, 25-27 Septembrie 2014.

Genetic variability along altitudinal gradient in Romania beech population.

Forest and Sustainable Developement, Brașov, România 24-25 Octombrie 2014.

5.4. Direcții viitoare de cercetare

Referitor la analizele morfologice, direcțiile viitoare de cercetare vor trebui

să ia în considerare analiza altor descriptori foliari dar și evaluarea unor descriptori la

nivelul conformației perigonului florilor staminale sau a apendiculilor cupei precum și

evaluarea morfologică și genetică în cadrul unor culturi comparative și rezervații de

seminte.

În ceea ce privesc analizele genetice, ar fi util pe de o parte realizarea unor

analize la nivelul ADN-ului cloroplastic pentru identificarea haplotipurilor de fag

existente și stabilirea rutelor de migrație postglaciară, iar pe de altă parte realizarea unor

analize de ADN nuclear cu ajutorul markerilor de tip SNP pentru identificarea gradului

de adaptare al speciilor la condițiile limitative de mediu în contextul schimbările de

natură climatică.

http://www.usamvcluj.ro/symposium

http://www.usamvcluj.ro/symposium


70

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Abrams, M.D., 1994: Genotypic and phenotypic variation as stress adaptations in

woody plants. Tree Physiology,14,833-842.

2. Aitken, S.N., Yeaman, S., Holliday, J., Wang, T., Curtis-McLane, S., 2008:

Adaptation, migration or extirpation: climate change outcomes for tree populations.

Evolutionary Applications, 1, 95–111.

3. Ambrose, S.H., 2003: Population bottleneck, Robinson, R.(Ed.), Genetics, 3,

Macmillan Reference, NewYork, 167–171.

4. Antao, T., Lopes, A., Lopes, R., Beja-Pereira, A., Luikart, G., 2008: LOSITAN: A

workbench to detect molecular adaptation based on a FST-outlier method. BMC

Bioinformatics 9, 323.

5. Augustaitis, A., Jasineviciene, D., Girgzdiene, R., Kliucius, A., Marozas, V.,

2012: Sensitivity of beech trees to global environmental changes at most north-eastern

latitude of their occurrence in Europe. The ScientificWorld Journal, 743926, 1-12.

6. Bayramzadeh, V., Attarod, P., Ahmadi, M.T., Ghadiri, M., Akbari, R., Safarkar,

T., Shirvany, A., 2011: Variation of leaf morphological traits in natural populations of

Fagus orientalis Lipsky in the Caspian forests of Northern Iran. Annals of Forest

Research 55(1), 33-42.

7. Bayramzadeh, V., Ghadiri, M., 2014: Responses by stomata and veins on Fagus

orientalis leaves to environmental conditions (A case from mazandaran province, Iran).

International journal of biosciences, 6655, 133–139.

8. Beaumont, M., Nichols, R., 1996: Evaluating loci for use in the genetic analysis

of population structure. Proceedings: Biological Sciences 263, 1619-1626.

9. Bijlsma, R., Bundgaard, J., Boerema, A.C., 2000: Does inbreeding affect the

extinction risk of small populations ?: predictions from Drosophila. Journal of

Evolutionary Biology,13, 502–514.

10. Bilela, S., Dounavi, A., Fussi, B., Konnert, M., Holst, J., Mayer, H., Rennenberg,

H., Simion, J., 2012: Natural regeneration of Fagus sylvatica L. adapts with maturation

to warmer and drier microclimatic conditions. Forest Ecology and Management, 275,

60–67.

11. Boșcaiu, N., Rațiu, F., 1982: O ipoteză aeropalinologică cu privire la

variabilitatea fagului în România. Făgetele Carpatine - Semnificația lor bioistorică și

ecoprotectivă, Editura Academia Republicii socialiste România, 33-60.

12. Buiteveld, J., Vendramin, G.G., Leonardi, S., Kamer, K., Geburek, T., 2007:

Genetic diversity and differentiation in European beech (Fagus sylvatica L.) stands

varying in management history. Forest Ecology and Management, 247, 98–106.

13. Burduja, C., Sârbu, I., Lupu, I.A., 1982: Contribuții la cunoașterea taxonomică,

corologică și fitocenotică a fagului din spațiul pericarpatic al Moldovei. Culegere de

studii şi articole de biologie, Grădina Botanică Iaşi, 2, 268-276.

14. Burley, J., Evans, J., Youngquist, J., 2014: Enciclopedia of forest science,

Elsevier, Academic Press, Vol. I, 1419-1424.

15. Bussotti, F., Prancrazi, M., Matteucci, G., Gerosa, G., 2005: Leaf morphology

and chemistry in Fagus sylvatica (beech) trees as affected by site factors and ozone:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378112712001429


71

results from CONECOFOR permanent monitoring plots in Italy. Tree physiology, 25,

211–229.

16. Campbell, D., Duchesne, P., Bernatchez, L., 2003: AFLP utility for population

assignment studies: analytical investigation and empirical comparison with

microsatellites. Molecular Ecology, 12, 1979–1991.

17. Canova, I., Durkovic, J., Hladká, D., 2008: Stomatal and chlorophyll

fluorescence characteristics in European beech cultivars during leaf development.

Biologia Plantarum, 52 (3), 577–581.

18. Cavalli-Sforza, L.L., Edwards, A.W.F., 1967: Phylogenetic analysis: models and

estimation procedures. American Journal of Human Genetics, 19, 233-257.

19. Channell, R., 2004: The Conservation Value of Peripheral Populations : the

supporting science. Proceedings of the Species at Risk 2004 Pathways to Recovery

Conference, March 2–6, Victoria, 1–17.

20. Chhatre, V., Rajora, OM., 2014: Genetic divergence and signatures of natural

selection in marginal populations of a keystone, long-lived conifer, Eastern White Pine

(Pinus strobus) from Northern Ontario. Plosone, 9 (5), e97291.

21. Ciocîrlan, E., Șofletea, N., 2013: Genetic Diversity of Romanian Populations of

Fagus sylvatica – A review. Bulletin of the Transilvania University of Braşov, Seria a

II-a, Vol. 6 (55), Nr. 1: 27-32.

22. Ciocîrlan, E., 2014: Comparative morphological analyses in marginal beech

population. Bulletin of the Transilvania University of Braşov, Seria a II-a, Vol. 7 (56),

Nr. 1: 7-12.

23. Corander, J., Marttinen, P., 2006: Bayesian identification of admixture events

using multilocus molecular markers. Molecular ecology, 15 (10), 2833–2843.

24. Corander, J., Waldmann, P., Marttinen, P., Sillanpä, MJ., 2004: BAPS 2:

enhanced possibilities for the analysis of genetic population structure. Bioinformatics

(Oxford, England), 20, 2363–2369.

25. Cotovelea, A., Ciocîrlan, E., 2014: Genetica moleculară, un instrument util în

conservarea speciilor de arbori și faună sălbatică. Revista de silvicultură și cinegetică,

XVIII/34.

26. Crăciunesc, I., Ciocîrlan, E., Şofletea, N., Curtu, A.L., 2011: Genetic diversity

of pedunculate oak (Quercus robur L.) in Prejmer Natural Reserve. Bulletin of the

Transilvania University of Braşov, Seria a II-a, Vol. 4 (53), Nr. 1: 15-20.

27. Denk, T., Grimm, G., Stögerer, K., Langer, M., Hemleben, V., 2002: The

evolutionary history of Fagus in western Eurasia: Evidence from genes, morphology

and the fossil record. Plant Systematics and Evolution, 232, 213–236.

28. Denk, T., 2003: Phylogeny of Fagus L. (Fagaceae) based on morphological data.

Plant Systematics and Evolution, 240, 55–81.

29. Denk, T., Grímsson, F., Zetter, R., 2012: Fagaceae from the early Oligocene of

Central Europe: persisting new world and emerging old world biogeographic links.

Review of Palaeobotany and Palynology, 169, 7–20.

30. Dobrescu, C., Bîrca, C., Lazăr, M., 1963: Contribuții la cunoașterea chorologiei

speciilor de Fagus orientalis Lipski și Fagus taurica Popl. în R.P.R. Analele științifice

ale Universității Alexandru Ioan Cuza din Iași, 287-290.

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.cell.com%2Fajhg%2Fhome&ei=ca8ZVL3fFKWuygPrv4KgCg&usg=AFQjCNEGw7qZg3_2S8eOP5SVDECVs8Hxvg&sig2=AwtPPMdSaMUunedomAGftg


72

31. Doyle, J.J., Doyle, J.L., 1987: A rapid DNA isolation procedure for small

quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical bulletin, 19, 11-15.

32. Doyle, J.J., Doyle, J.L., 1990: Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus,

12, 13-15.

33. Dounavi, A., Koutsias, N., Ziehe, M., Hattemer, H.H., 2010: Spatial patterns and

genetic structures within beech populations (Fagus sylvatica L .) of forked and non-

forked individuals. European Journal of Forest Research, 129, 1191–1202.

34. Ducci, F., 2012: Strengthening conservation: a key issue for adaptation of

marginal/peripheral populations (MaP-FGR) of forest tree to climate change in Europe.

COST Office Open Call Full Proposal oc-2011-2-10938, 1–44.

35. Earl, D. A., vonHoldt B.M., 2011: STRUCTURE HARVESTER: a website and

program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method.

Conservation Genetics Resources, 4, 359–361.

36. Eckert, G. D., Samis, K. E., Lougheed, S. C., 2008: Genetic variation across

species’ geographical ranges: the central–marginal hypothesis and beyond. Molecular

Ecology, 17, 1170–1188.

37. Ellis, J.R., Burke, J.M., 2007: EST-SSRs as a resource for population genetic

analyses. Heredity, 99, 125–132.

38. Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J., 2005: Detecting the number of clusters of

individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular ecology, 14,

2611–2620.

39. Excoffier, L., Lischer, H., 2010: Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs

to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular ecology

resources, 10, 564–567.

40. Floricică, N., 1973: Prezența fagului în pădurile Ocolului silvic Snagov. Revista

Pădurilor, 88, 367-370.

41. Gailing, O., von Wuehlisch, G., 2004: Nuclear markers (AFLPs) and chloroplast

micro-satellites differ between Fagus sylvatica and F. orientalis. Silvae Genetica, 53,

105-110.

42. Gaston, K., 2009: Geographic range limits of species. Proceedings. Biological

sciences / The Royal Society, 276, 1391–1393.

43. Geacu, S., Loghin, C., 2001: Fagul din colinele Covurluiului. Revista Pădurilor,

1.

44. Geahlen, J., Lapid, C., Thorell, K., Nikolskiy, I., Huh, J.W., Oates, E., Lennerz,

J., Tian, X., Weis, V., Khurana, S., Lundin, S., Templeton, A., Mills, J., 2013: Evolution

of the human gastrokine locus and confounding factors regarding the pseudogenicity of

GKN3. Physiological Genomics, 45(15), 667–683.

45. Grimm, G., 2003: Tracing the Mode and Speed of Intrageneric Evolution - A

phylogenetic case study on genus Acer L. (Aceraceae) and genus Fagus L. (Fagaceae)

using fossil, morphological, and molecular data. D.Sc. thesis, Eberhard-Karls-

Universität, Tübingen, Germany, 159.

46. Goudet, J., 2002: FSTAT: a program to estimate and test gene diversities and

fixation indices. Version 2.9.3.2. Disponibil la: http://unil.ch/izea/softwares/fstat.html

47. Guo, Q., 2014: Central-marginal population dynamics in species invasions.

Frontiers in Ecology and Evolution, 2, 1–17.

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fjournalseeker.researchbib.com%2F%3Fissn%3D08983437&ei=br4ZVLaBCYLMyAO80IH4Cw&usg=AFQjCNHb2Suxd4Lb9PmQIxYvxqHAj5RUKw&sig2=ZqXnfpch4IVd_9B1jHOQGA

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.springer.com%2Flife%2Bsciences%2Fforestry%2Fjournal%2F10342&ei=IsAZVMXIKqj8ygPCl4CwDw&usg=AFQjCNFGQrG6jwdYqT45Td_kpEoA3Gn5Hg&sig2=7GheaJ_tmWZ0f6KbcnTjQw


73

48. Hartl, D. L., Clark, A.G., 1997: Principles of Population Genetics. 3 ed. Sinauer

Associates, Sunderland, Massachusetts, 542.

49. Hasenkamp, N., Ziegenhagen, B., Mengel, C., Schulze, L., Schmitt, H.P., Liepelt,

S., 2011: Towards a DNA marker assisted seed source identification: a pilot study in

European beech (Fagus sylvatica L.). European Journal of Forest Research 130, 513-

519.

50. Hatziskakis, S., Tsiripidis, I., Papageorgiou, A.C., 2011: Leaf morphological

variation in beech ( Fagus sylvatica L .) populations in Greece and its relation to their

post-glacial origin. Botanical Journal of the Linnean Society, 165 (4), 422–436.

51. Jump, A.S., Peñuelas, J., 2006: Genetic effects of chronic habitat fragmentation

in a wind-pollinated tree. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 103, 8096–8100.

52. Jump, A.S., Peñuelas, J., 2007: Extensive spatial genetic structure revealed by

AFLP but not SSR molecular markers in the wind-pollinated tree, Fagus sylvatica.

Molecular ecology, 16, 925–936.

53. Kraj, W., Sztorc, A., 2009: Genetic structure and variability of phenological

forms in the European beech (Fagus sylvatica L.). Annals of. Forest Science, 66, 203.

54. Kremer, A., Dupouey, J.L., Deans, J.D., Cottrel, J., Csaikl, U.M., Finkeldey, R.,

Espinel, S., Jensen, J.S., Kleinschmit, J., Van Dam, B., Ducousso, A., Forrest, I., De

Herdia, U.L., Lowe Andew, J., Tutkova, M., Minro, R.C., Badeau, V., 2002: Leaf

morphological differentiation between Quercus robur and Quercus petraea is stable

across westernEuropean mixed stand. Annals Science Forest, 59, 777 – 787.

55. Langella, O., 1999: Populations Version 1.2.30. Distributed by the author, CNRS

UPR9034, France.

56. Lefèvre, S., Wagner, S., Petit, R.J., Lafontaine, G., 2011: Multiplexed

microsatellite markers for genetic studies of beech. Molecular Ecology Resources 12,

484-491.

57. Luikart, G., Allendorf, F., Cornuet J-M., Sherwin, W., 1998: Distortion of allele

frequency distributions provides a test for recent population bottlenecks. Journal

Heredity, 89, 238-247.

58. Magri, D., 2008: Patterns of post-glacial spread and the extent of glacial refugia

of European beech (Fagus sylvatica). Journal of Biogeography, 35, 450–463.

59. Manos, P., Zhou, Z., Cannon, C., 2001: Systematics of Fagaceae: Phylogenetic

Tests of Reproductive Trait Evolution. International Journal of Plant Sciences, 162,

1361–1379.

60. Masarovičová, E., Cicák, A., Štefančík, I., 1996: Ecophysiological, biochemical,

anatomical and productional characteristics of beech (Fagus sylvatica L.) leaves from

regions with different degree of immision impact. Ekológia, 15, 337-351.

61. Menghiu, G., Iriza, E., Danciu, A., Zsombori, O.T., Găman, C., Muntean, H-E.,

2012: Biomonitoring of urban area by anatomical leaf changes. Annals of West

University of Timişoara, Biology, XV (2), 125-130.

62. Milescu, I., Alexe, A., Nicovescu, H., Suciu, P., 1967: Fagul. Editura Agro-

Silvică, București, 581.


74

63. Mimura, M., Aitken, S., 2007: Increased selfing and decreased effective pollen

donor number in peripheral relative to central populations in Picea sitchensis

(Pinaceae). American Journal of Botany, 94, 991–998.

64. El Mousadik, A., Petit, R.J., 1996: High level of genetic differentiation for allelic

richness among population of the tree (Argania spinosa(L.) Skeels) endemic to Morocco.

Theoretical and Applied Genetics, 92, 832–839.

65. Muller M., 2013: A candidate gene-based association study to investigate

potentially adaptative genetic variation in European beech (Fagus sylvatica L.). PhD

Thesis Georg-August Universität Göttingen, Göttingen, Germany.

66. Myking, T., Vakkari, P., Skroppa, T., 2008: Genetic variation in northern

marginal Taxus baccata L. populations. Implications for conservation. Forestry, 82,

529–539.

67. Nei, M., Tajima, F., Tateno, Y., 1983: Accuracy of estimated phylogenetic trees

from molecular data. Journal of Molecular Evolution 19, 153 –170.

68. Nei, M., 1973: Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings

of the National Academy of Sciences USA 70, 3321–3323.

69. Nybom, H., 2004: Comparison of different nuclear DNA markers for estimating

intraspecific genetic diversity in plants. Molecular ecology, 13, 1143–1455.

70. Oddou-Muratorio, S., Vendramin, G.G., Buiteveld, J., Fady, B., 2008:

Population estimators or progeny tests: what is the best method to assess null allele

frequencies at SSR loci?. Conservation Genetics, 10, 1343–1347.

71. Van Oosterhout, C., Van Heuven, M.K., Brakefield, P.M., 2004a: On the

neutrality of molecular genetic markers: pedigree analysis of genetic variation in

fragmented populations. Molecular ecology, 13, 1025–1034.

72. Van Oosterhout, C., Hutchinson, W.F., Wills, D., Shipley, P., 2004b: Micro-

Checker: Software for Identifying and Correcting Genotyping Errors in Microsatellite

Data. Molecular Ecology Notes, 4, 535–538.

73. Oprea, A., Sîrbu, C., Goia, I., 2011: The vegetation of the natural reserve ValEA

Fagilor – Luncavița (Tulcea County, Romania). Contribuții botanice, Cluj - Napoca,

XLVI, 17-32.

74. Pandey, M., Rajora, O.M., 2012: Genetic diversity and diferentiation of core vs.

peripheral populations of eastern white cedar, Thuja occidentalis (Cupressaceae).

American Journal of Botany, 99 (4), 690-699.

75. Papageorgiou, AC., Vidalis, A., Gailing, O., Tsiripidis, I., Hatziskaki, S.,

Boutsios, S., Galatsidas, S., Finkeldey, R., 2008: Genetic variation of beech (Fagus

sylvatica L.) in Rodopi (N.E. Greece). European Journal of Forest Research, 127, 81–

88.

76. Parmesan, C., Yohe, G., 2003: A globally coherent fingerprint of climate change

impacts across natural systems. Nature, 421, 37–42.

77. Pashley, C., Ellis, J., McCauley, D., Burke, J., 2006: EST databases as a source

for molecular markers: lessons from Helianthus. Journal of Heredity, 97, 381–388.

78. Pastorelli, R., Smulders, M.J.M., Van't Westende, W., Vosman, B., Giannini, R.,

Vettori, C., Vendramin, G.G., 2003: Characterization of microsatellite markers in

Fagus sylvatica L. and Fagus orientalis Lipsky. Molecular Ecology Notes, 3, 76-78.

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Flink.springer.com%2Fjournal%2F122&ei=BK8aVPuaDMnmyQPal4IQ&usg=AFQjCNHiQna7C54jgjSINMZYvyrWGwmzKg&sig2=PFZAsKu8pMD7G_wWN0imUA

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pnas.org%2F&ei=sagaVKGSLOb_ygOisoDgCQ&usg=AFQjCNF8L8b8kaHKmCj0CPzwGkSLYL9tsA&sig2=T4TsBwJ7lfURLq8YxFHTfQ

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pnas.org%2F&ei=sagaVKGSLOb_ygOisoDgCQ&usg=AFQjCNF8L8b8kaHKmCj0CPzwGkSLYL9tsA&sig2=T4TsBwJ7lfURLq8YxFHTfQ


75

79. Parascan, D., Danciu, M., 2001: Fiziologia plantelor lemnoase. Editura Pentru

Viață, Brașov.

80. Peakall, R., Smouse, P.E., 2006: GenALEx 6: genetic analysis in Excel.

Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6 (1),

288-295.

81. Peakall, R, Smouse, P.E., 2012: GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel.

Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics

(Oxford, England), 28, 2537–2539.

82. Piotti, A., Leonardi, S., Heuertz, M., Heuertz, M., Buiteveld,J., Geburek T.,

Gerber, S., Kramer, K., Vettori, C., Vendramin, G.G., 2013: Within-population genetic

structure in beech (Fagus sylvatica L.) stands characterized by different disturbance

histories: does forest management simplify population substructure?, PloSone, 8,

e73391.

83. Piry, S., Luikart, G., Cornuet, J-M., 1999: BOTTLENECK: a computer program

for detecting recent reductions in the effective population size using allele frequency

data. Journal of Heredity, 90, 502–503.

84. Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000: Inference of population

structure using multilocus genotype data. Genetics, 155, 945–959.

85. Rajendra, K.C., 2011: Spatial dynamics of intraspecific genetic variation in

European beech (Fagus sylvatica L.). PhD Thesis Georg-August Universität Göttingen,

Göttingen, Germany.

86. Rajendra, K.C., Seifert, S., Prinz, K., Gailing, O., Finkeldey, R., 2014: Subtle

human impacts on neutral genetic diversity and spatial patterns of genetic variation in

European beech (Fagus sylvatica). Forest Ecology and Management, 319, 138–149.

87. Razali, N.M., Wah Y.B., 2011: Power comparisons of Shapiro-Wilk ,

Kolmogorov-Smirnov , Lilliefors and Anderson-Darling tests. Journal of Statistical

Modeling and Analytics , 2 (1), 21–33.

88. Rehder, A., 1960: Manual of cultivated trees and shrubs - second edition. The

Macmillan Company, New York, 166 – 167.

89. Roderic, D. M., 2000: TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees

on personal computers. Computer Applications in the Biosciences, 12, 357-358.

90. Rousset, F., 2008: Genepop’007: a complete re-implementation of the genepop

software for Windows and Linux. Molecular ecology resources, 8, 103–106.

91. Săvulescu., T., 1952: Flora Republicii Populare Române I. Editura Academiei

Republicii Populare Române, București, 219-224.

92. Scalfi, M., Troggio, M., Piovani, P., Leonardi, S., Magnaschi, G., Vendramin,

G.G., Menozzi, P., 2004: A RAPD, AFLP and SSR linkage map, and QTL analysis in

European beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and applied genetics, 108, 433–441.

93. Seifert, S., 2011: Variation of candidate genes related to climate change in

European beech (Fagus sylvatica L.). PhD Thesis Georg-August Universität Göttingen,

Göttingen, Germany.

94. Seifert, S., Vornam, B., Finkeldey, R., 2012: DNA sequence variation and

development of SNP markers in beech (Fagus sylvatica L.). European Journal of Forest

Research, 131, 1761–1770.

http://www.unboundmedicine.com/medline/?st=M&author=Leonardi%20S

http://www.unboundmedicine.com/medline/?st=M&author=Magnaschi%20G

http://www.unboundmedicine.com/medline/?st=M&author=Vendramin%20GG

http://www.unboundmedicine.com/medline/?st=M&author=Vendramin%20GG

http://www.unboundmedicine.com/medline/?st=M&author=Menozzi%20P


76

95. Selkoe, K.A., Toonen, R.J., 2006: Microsatellites for ecologists: a practical

guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology letters, 9, 615–629.

96. Sijacic-Nikolic, M., Milovanovic, J., Nonic, M., Knezevic, R., Stankovic, D.,

2013: Leaf morphometric characteristics variability of different beech provenances in

juvenile development stage. Genetika, 45, 369–380.

97. Şofletea, N., 2005: Genetică şi ameliorarea arborilor. Editura Pentru Viaţă,

Braşov.

98. Şofletea, N., Curtu, L.A., 2007: Dendrologie. Edtura Universității Transilvania,

Brașov.

99. Șofletea, N., Târziu, D., Spârchez, G., Curtu, A.L., 2002: Cercetări de genetica

ecologică privind climatipurile și edafotipurile la cvercinee și fag, în vederea

fundamentării măsurilor silvotehnice și de conservare a acestor arborete. Analele

I.C.A.S., 45, 57-67.

100. Stănescu, V., Şofletea, N., 1998: Silvicultură cu bazele geneticii forestiere.

Editura Ceres, Bucureşti.

101. Tanaka, K., Tsumura, Y., Nakamura, T., 1999: Development and polymorphism

of microsatellite markers for Fagus crenata and the closely related species, F. japonica.

Theoretical and Applied Genetics, 99, 11-15.

102. Urechiatu, M., 1988: Aspecte privind variabilitatea intra și interpopulațională a

fagului carpatin (I). Revista Pădurilor, 103, 178-183.

103. Urechiatu, M., 1989: Aspecte privind variabilitatea intra și interpopulațională a

fagului carpatin (II). Revista Pădurilor, 104, 183-191.

104. Vornam, B., Decarli, N., Gailing, O., 2004: Spatial distribution of genetic

variation in a natural beech stand ( Fagus sylvatica L .) based on microsatellite markers.

Conservation Genetics, 5(4), 561-570.

105. Walser J.C., 2013: Population Genetics: F-statistic. Universitat Basel, HS2013.

106. Woodhead, M., Russell, J., Squirrell, J., Hollingsworth, P.M., Mackenzie, K.,

Gibby, M., Powell, W., 2005: Comparative analysis of population genetic structure in

Athyrium distentifolium (Pteridophyta) using AFLPs and SSRs from anonymous and

transcribed gene regions. Molecular ecology, 14, 1681–1695.

107. Woodward, F.I.; Kelly, C.K., 1995: The influence of CO2 concentration on

stomatal density. New Phytologist, 131, 311- 327.

108. *** http://www.worldclim.org/

109. *** QuickPhotoMicro 2.3., 2011, Promicra, Czech Republic.

110. *** STATISTICA 8, 2008, StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA.

111. *** WinFOLIA, 2007, Regent Instruments INC.

112. *** XLSTAT, 2014, Addinsoft.

https://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CCAQFjAA&url=http%3A%2F%2Flink.springer.com%2Fjournal%2F122&ei=XZ4aVIydKo_OaJn3gvgG&usg=AFQjCNHiQna7C54jgjSINMZYvyrWGwmzKg&sig2=mFJJ15sGQ2pizHobiZhKWg

http://link.springer.com/journal/10592

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hollingsworth%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15836642

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mackenzie%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15836642

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gibby%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15836642

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Powell%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15836642


77

REZUMAT

Fagul este una dintre cele mai răspândite specii de la noi din țară iar datorită

schimbărilor de natură climatică, populațiile marginale sunt predispuse dispariției.

Studiul de față are ca scop pe de o parte identificarea variabilității morfologice la

nivelul celor 3 taxoni existenți la nivelul populațiilor marginale, cât și estimarea

diversității genetice, identificarea unor structuri populaționale specifice datorate

condițiilor limitative de supraviețuire a speciilor în cadrul acestor populații .

Variabilitatea morfologică scăzută la nivelul celor 3 populații analizate este

datorată cel mai probail hibridărilor introgresive produse în intervalul de timp

îndelungat de la separarea arealului fagului european de cel oriental.

Analizele de alocare genetică a celor 588 de arbori analizați, din 13 populații

(izolate, centrale sau marginale de limită altitudinală) au reliefat faptul că populațiile

marginale izolate au o structură specifică și o diversitate genetică mai scăzută decât

celelalte populații analizate, toate acestea fiind datorate acțiunii derivei genetice,

selecției și fragmentării arelului.

ABSTRACT

Beech is one of the most common species in Romania and due to climate

changes, marginal populations are susceptible to extinction. The aim of this study is to

identify the morphological variability of the 3 taxons, which coexists in marginal

populations, to estimate the genetic diversity, respectively population structure and to

identify specific population structuring resulted from limiting conditions available for

species survival in these populations.

Low morphological variability determined at the 3 analyzed populations is

due to the introgressive hybridizations which most probably have been produced in a

long interval from the distribution range separation of the European beech for the

Oriental beech.

Genetic assignment was done for 588 trees from 13 populations (isolated,

core and altitudinal limit population). Results indicated that peripheral populations are

registering a specific structure and a lower genetic diversity than the rest of analyzed

populations, thus being determined by the action of genetic drift, selection and

fragmentation of natural range distributions.


78

CURRICULUM VITAE

Date personale

Nume: CIOCÎRLAN

Prenume: Elena

Adresa: str. Cuza-Vodă, nr.1, bl. A1, sc.A, ap. 13, etj. 3 Tîrgu Neamț, Neamț

Data și locul nașterii: 17.04.1986, Tîrgu Neamț, Neamț

Cetățenie: română

Starea civilă: necăsătorită

Telefon: 0746083982

E-mail: [email protected]

Educație

2001-2005: Diplomă de bacalaureat - Colegiul Național “Ștefan cel Mare”

Tîrgu Neamț, profil real, specializarea matematică-informatică;

2005-2009: Diplomă de inginer silvic: Facultatea de Silvicultură și Exploatări

Forestiere, Universitatea Transilvania din Brașov, specializarea: Silvicultură.

2009-2011: Master: Managementul ecosistemelor forestiere - Facultatea de

Silvicultură și Exploatări Forestiere, Universitatea Transilvania din Brașov;

2011-2014: Doctorand - Facultatea de Silvicultură și Exploatări Forestiere,

Universitatea Transilvania din Brașov,

Limbi străine: Engleză (B2); Franceză (B2)

Publicații

A. Lucrări publicate în reviste ISI: 1 ( prim autor)

B. Lucrări publicate în reviste indexate în baze de date internaționale (BDI):

4 (3 ca prim autor, 1 coautor).

C. Lucrări prezentate la simpozioane și conferințe internaționale: 5

mailto:[email protected]


79

CURRICULUM VITAE

Personal data

Name: CIOCÎRLAN

First name: Elena

Address: 1, Cuza-Vodă Street, bl. A1, entrance A, apartment 13, Tîrgu

Neamț, Neamț

Date and place of birth: 17 of April 1986, Tîrgu Neamț, Neamț

Nationality: Romanian

Marital status: unmarried

Phone: 0746083982

E-mail: [email protected]

Education

2000-2004: National College “Ștefan cel Mare” Tîrgu Neamț, Matematics-

Informatics – Baccalaureate Diploma

2004-2009: Faculty of Silviculture and Forest Engineering, Transilvania

University of Brașov – Diploma of Forest Engineer

2009-2011: Master: Management Forest Ecosystem - Faculty of Silviculture

and Forest Engineering, Transilvania University of Brașov;

2011–2014: Phd student - Faculty of Silviculture and Forest Engineering,

Transilvania University of Brașov;

Foreign languages: English (B2); French (B2)

Publication

A. Papers published in ISI journals: 1 (first author)

B. Papers published in BDI journals: 4 (3 as first author)

C. Papers presented at international conferences and symposia: 5

Date post:	22-Jan-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	17 times
Download:	0 times

Ing. Elena CIOCÎRLANold.unitbv.ro/Portals/31/Sustineri de doctorat/Rezumate2014/Ciocirlan.pdf ·...

Documents