MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR AEROGENE

MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIFTERIEIDIFTERIA toxiinfecie acut, caracterizat printr-o angin pseudo-membranoas cu efecte toxice la distan (miocardul, SNC i rinichii).Este provocat de mi/o din genul Corynebacterium, familia Corynebacteriaceae.Genul Corynebacterium reunete mi/o care se caracterizeaz prin prezena in compoziia peretelui celular:- Acidului mezo-diaminopimelicAcizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi de C)Coninutul GC ntre 46-74 %.Prezint asemnri cu mi/o din genurile Mycobacterium i Nocardia

Clasificarea genului CorynebacteriumCorinebacterii fitopatogeneCorinebacterii patogene pentru animale, care afecteaz accidental omul: C.pseudotuberculosis, C.ulceransCorinebacterii cu tropism uman:Specie patogen: C.diphtheriae (biovaruri gravis, mitis, intermedius). Colonizeaz frecvent rinofaringele, mai rar tegumentul. Exist i purttori sntoi.Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): C.xerosis, C.jeikeium, C.pseudodiphthericum, etc

1821 Bretonneau individualizeaz difteria i demonstreaz aspectul ei contagios 1883 - Klebs descrie bacteria n membranele false de angine difterice1884 - Loeffler izoleaz bacteria, apoi demonstreaz patogenitatea pe cobai1888 - Roux i Yersin demonstreaz secreia exotoxinei i inoculnd-o la animal reproduc manifestrile difteriei1890 - Behring i Kitasato imunizeaz animalele cu toxin modificat1923 - Ramon prepar anatoxina difteric, primul vaccin antidifteric

Caractere morfotinctoriale ale C.diphtheriaeBacterii (bastonae) de 1-8 m x 0,3-0,8 m, drepte sau puin ncurbate, cu extremitile rotunjite sau ngroate (aspect de halter sau de mciuc), datorit granulaiilor de volutin (corpii Babe-Ernst). n frotiuri se aranjeaz ungiular, n palisade sau sub forma caracterelor chinezeti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, asporogene, necapsulate.Se coloreaz G+, pentru evidenierea granulaiilor de volutin - Loeffler, Neisser

Caractere de cultur C.diphtheriae este o specie facultativ anaerob, exigent la cultivare, temperatura optim de cultivare 37C, pH 7,4.Medii de cultur elective:Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuii, apar peste 16-24 ore de cultivareGeloz-snge (identic)

Medii de cultur selective diferenialeMediul Clauberg (geloz-snge cu telurit de potasiu). C.diphtheriae gravis: colonii R, mari, negre (reducerea teluritului n teluriu), crenelate, aspect de floare de margaret, nehemolitice; mitis: colonii S, mijlocii, negre, bombate, cu zon de hemolizMediul Tinsdale (geloz-ser-cistin-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun Mediul Bucin (geloz-snge cu hinozol) colonii albastre

Medii de transportGeloz-ser semilichid cu telurit de KMediul OCST (ou-cistin-ser-telurit)

Activitatea biochimic a C.diphtheriae: Proteolitic: Ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-. Zaharolitic: Gravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-Mitis: glucoza+, amidon-, zaharoza-Posed catalaz, oxidazo-

Se disting 22 lizotipuri de C.diphtheriae i multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) i serovaruri (antigen K proteic)

Factori de patogenitateToxina difteric - origine proteic, secretat de tulpinile lizogene (fagi beta, purttori ai genei Tox), n prezena unor cantiti reduse de Fe (cantiti mari inhib toxigeneza).Exotoxin tipic (fragmente polipeptidice A i B). Mecanismul de aciune - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare EF-2 (activitate de ADP-riboziltransferaz). O singur molecul este letal pentru celul. Altereaz sinteza proteic n cteva ore.Toxina difuzeaz n organism perturbnd funcionarea diferitor organe (n special SNC, cord, rinichi, suprarenale) Poate fi transformat n anatoxin, utilizat n vaccinare

Enzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidaza, IgA-proteazaCord Factor un glicolipid toxic din peretele celular Patogeneza i formele clinice de difterie Sursa de infecie: bolnavul cu difterie i purttorii sntoi de germeni (colonizeaz rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva).Mecanismele i cile de transmitere:Direct pe cale aerogen (picturi) sau contact cu plgi contaminateIndirect prin obiecte (jucrii, cri), praf sau alimente contaminate (lactate)

La poarta de intrare bacteriile se multiplic i provoac un focar inflamator local, determinat de aciunea toxinei, care fiind ulterior difuzat pe cale limfo- i hematogen provoac starea de intoxicaie general.Focarul inflamator se localizeaz n faringe (angina difteric), mai rar n laringe (crupul difteric), nas, urechi, conjunctiv, mucoasa organelor genitale, plgi cutanate.

Leziunile locale se caracterizeaz prin inflamaie fibrinoas. Exotoxina cauzeaz necroz, dilatarea vaselor i creterea permeabilitii, eliminarea fibrinogenului, care coaguleaz cu formarea unei pseudomembrane fibrinoase. Ea conine bacterii, hematii, PMN i celule necrozate. Se detaeaz dificil, nu se dizolv n ap, este reproductibil in situ n cteva ore. Membrana are tendin s se extind. n forma malign difteria este nsoit de edem al gtului, semne toxice i paralizia vlului palatin.

Intoxicaia general afecteaz SNC (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite), suprarenalele (insuficien a suprarenalelor), rinichii (nefroz)Tulpini de C.ulcerans pot produce toxin identic cu cea diftericDiagnosticul de laborator al difterieiEste URGENT!!!Prelevate n funcie de forma clinic, respectnd strict regulile de prelevare i transport (membrana fals, tampoane de la periferia membranelor, tampoane cutanate, conjunctivale, etc).

Metode de diagnosticExamenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser), microscopia imunofluorescent Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei obligator. Se efectueaz prin RN cu ser antitoxic in vivo (cobai), in vitro (RP Elek), sau depistarea genei Tox n prelevat sau n cultura pur prin PCR.

Examenul serologic retrospectiv, RA cu seruri perechi (I sptmn i a III) i cultur de C.diphtheriae. Titrul semnificativ 1:100 sau creterea titrului de Ac.Evaluarea titrului de antitoxine n serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nu depete 0,5 UI/mlReceptivitatea la difterie poate fi determinat prin:Testul Schick (in vivo): i/dermic 0,1 ml toxin difteric (1/40 DLM). Reacie+: eritem 1cm (receptivitate la difterie), reacie-: lipsa eritemului (persoan imun)RN in vitroRHAIELISATitru antitoxinelor > 0,1 UI/ml protectorTitru inferior 0,01 UI/ml lipsa proteciei

Tratamentul difterieiSeroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizeaz activitatea toxinei, blocnd fixarea ei pe receptorii celulari. Antibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). Asigur eradicarea germenilor.Tratament simptomatic

Profilaxia specific a difterieiVaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccinri cu anatoxin difteric. Exist vaccinuri asociate: ADT, ADTP. Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni; revaccinarea la 22-24 luni cu ADTP; la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT.Recent a fost obinut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezint un polipeptid antigenic situat la jonciunea fragmentelor A i B a toxinei difterice, o molecul peptidic purttoare i un adjuvant sintetic.

MICOBACTERIILE. MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TUBERCULOZEIFamilia MycobacteriaceaeGenul MycobacteriumSpecii:Responsabile de tuberculoza uman: M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum (complex tuberculosis)Agentul leprei: M.leprae (strict uman)Micobacterii atipice, condiionat patogene: M.avium, M.ulcerans, M.fortuitum, M.kansasii, M.marinum, etc. Cauzeaz micobacterioze la persoane imunocompromiseMicobacterii nepatogene: M.smegmatis, M.gastri, M.phley

Caracteristica general a micobacteriilor: Bastonae G+ drepte sau uor ncurbate, necapsulate, asporogene, imobile, peretele celular este bogat n acizi micolici, responsabili de acido-alcoolorezisten la colorarea Ziehl-Neelsen.M.tuberculosis este o bacterie patogen strict uman, responsabil de tuberculoz. Este sensibil la cldur, lumin solar direct, raze UV sau X. Rezistent la frig sau desicare. Este puin sensibil la acizi, baze (se utilizeaz n decontaminarea prelevatelor) sau detergeni i foarte sensibil la soluia de alcool de 70.

Mycobacterium tuberculosis a fost cauza "Pestei Albe" n sec. 17 i 18 n Europa. n aceast perioad 100 % din populaia Europei a fost infectat cu M.tbc i 25 % din aduli au decedat. Tuberculoza (TB) n prezent este prima cauz de deces din lume din toate infeciile bacteriene. Maladia afecteaz 1.7 bilioane oameni/an

Caractere morfotinctorialeM.tbc este un bastona fin sau uor ncurbat, n frotiu se observ izolat, n grmezi sau corzi. Se coloreaz in rou prin tehnica Ziehl-Neelsen

Caractere de culturM.tbc este o bacterie strict aerob, foarte exigent la cultivare. Toate mediile de izolare au la baz ou coagulat. Mediul de referin Lowenstein-Jensen (ou, glicerin, asparagin). Alte medii solide Popescu (acid glutamic in locul asparaginei), Finn (glutamat de Na). Micobacteriile patogene cresc lent (perioada de generaie 20 ore), la 37C, pH 6,8-7,0.Coloniile de M.tbc apar peste 2-4 sptmni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme, opace, de culoare crem-bej.M.bovis i M.africanum formeaz colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8 sptmni.

Mediul lichid Sauton. Contine sruri minerale, asparagin, glicerin. M.tbc crete n 8-10 zile sub form de voal. Este utilizat i pentru repicarea tulpinilor de BCG.Activitatea biochimic a micobacteriilor patogeneToate micobacteriile patogene produc o catalaz termolabil, distrus la 68C timp de 20 min. Celelalte micobacterii posed catalaz termostabil.M.tbs i M.bovis hidrolizeaz ureeaM.tbc produce acid nicotinic (niacin), reduce nitraii n nitrii. M.bovis nu manifest astfel de activitate.

Compoziia chimic i factorii de patogenitate ai micobacteriilorLipidele constituie 20-60% din masa celulei. Se cunosc 3 componente lipidice majore:Acizii micolici. Previn distrugerea micobacteriilor n macrofage,protejaz micobacteriile extracelulare de complementul din ser. Condiioneaz transformarea macrofagelor n celule epitelioide i celule gigante Langhans. Cord-factorul (sulfo-lipid) perturb respiraia n mitocondrii i inhib migraia PMN. Induce cultivarea n corzi (cosie) a M.tbc. Cerurile. Este componentul major al adjuvantului complet Freund.

Lipidele din peretele celular al Mycobacterium tuberculosis sunt asociate cu urmtoarele proprieti ale bacteriei: Impermeabilitate la colorare Rezisten la multe antibiotice Rezisten la substane acide i alcaline Rezisten la activitatea litic a complementului Rezisten la oxidare i supravieuire n interiorul macrofagelorPolizaharidele joac un rol important n formarea Ac serici, conferind specificitatea imunologic. Proteinele reprezint suportul imunitii celulare i a hipersensibilitii tardive.

Patogeneza i formele clinice de tuberculozSursa de infecie omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise n bronii (M.tbc, M.africanum) sau bovinele bolnave (M.bovis).Transmiterea se efectueaz pe cale aerian (picturi, praf). Rareori este posibil contaminarea prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mini contaminate.Receptivitatea este influenat de vrst i factorii de mediu: carene nutritive, alcoolism, stare imunosupresiv, etc

Primoinfecia tuberculoas. Reprezint un ansamblu de manifestari clinice, umorale i anatomice care se desfoara n organism n urma primului contact cu agentul TBC.Dup contaminare (mai frecvent in copilarie), bacteriile nimeresc n alveolele pulmonare (90 %), unde sunt captate de macrofage n care se multiplic (bacterii facultativ intracelulare, mpiedic formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare nespecific.

Peste cteva sptmni (4-12) se dezvolt o imunitate celular i leziunea exsudativ evolueaz n leziune granulomatoas: sub aciunea unor citokine secretate de limfocitele T (n special IFN gamma) are loc activarea macrofagelor, care devin deja capabile sa distrug micobacteriile. n acelai timp macrofagele activate se difereniaz n celule epitelioide i celule multinucleate gigante. Ele sunt nconjurate de limfocite i fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infeciei. Infecia se extinde pe cale limfatic, cu afectarea ganglionilor regionali.

- Primoinfecia inaparent. La cca 85% leziunile se vindec i se pot autosteriliza. Nici o expresie clinic sau radiologic.Infecia primar subclinic. Dac multiplicarea bacteriilor este masiv, n leziunile tuberculoase se realizeaz o necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent are loc calcifierea tuberculomului (leziunea este vizibil radiologic), cu autosterilizarea spontan sau cu persistena unor bacterii n leziune (complexul Ghon).Consecinele primoinfeciei inaparente sau subclinice: dezvoltarea imunitii antituberculoase i a sensibilizrii tuberculinice.

Tuberculoza primar manifest necomplicat. Pacienii au febr, astenie, pierdere n greutate, transpiraii, etc. Etapa ganglionar poate fi depit cu diseminri hematogene i afectarea pleurei, meningelui, mduvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fie spre cicatrizare.Tuberculoza primar cu complicaii. Rareori (10% cazuri), evoluia este defavorabil: masele necrotice sunt evacuate n bronii, vase sanguine, pleur sau pericard cu formarea unei caverne, unde bacteriile se multiplic intens. Fistulizarea ntr-un vas sangvin disemineaz infecia sistemic (tuberculoza miliar). Starea general este alterat, apare febr, tuse, uneori hemoptizie. Bolnavul este contagios, eliminnd bacterii cu sputa.

Tuberculoza secundar. Se manifest n condiii de scdere a reactivitii imune, prin reinfecii masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar n ritm lent i evolueaz cronic fr tendin de vindecare spontan.Alte forme clinice de tuberculoz: ganglionar, meningean, osteo-articular, uro-genital.Imunitatea antituberculoas este celular, nesteril. Hipersensibilitatea tardiv nsoete imunitatea celular. Ac circulani nu au rol protector.

Diagnosticul de laborator al tuberculozeiPrelevate: n funcie de forma clinic (sputa matinal (5-10 ml), tubaje gastrice, urin, lichid pleural, articular, peritoneal, LCR, bioptate, etc) n caz de necesitate se efectueaz omogenizarea /decontaminarea i concentrarea (prin centrifugare) a prelevatelor.Metode de diagnostic1. Examenul microscopic frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonae purpurii izolate) sau cu auramin (bastonase galbene pe fondul negru). Sensibilitatea 104 bacili/ml

2. Examenul bacteriologic izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilitii la chimioterapice (prin metoda diluiilor n mediu solid)3. Metoda biologic (inocularea la cobai). Servete uneori pentru confirmarea virulenei micobacteriei3. PCR pentru detectarea rapid a micobacteriilor direct n prelevate4. Intradermoreacia la tuberculin (reacia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitate cutanat la tuberculin. Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat de M.tuberculosis.

Pe faa anterioar a antebraului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin n volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reacia pozitiv se manifest printr-o induraie i congestie cu diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz n funcie de contextul clinicReacia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecie), sau a fost vaccinat cu BCG, sau este bolnav de tuberculoz (n acest caz diametrul depete 10 mm).Reacia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz i indic receptivitatea individului la tuberculoz.

Tratamentul tuberculozeiAntibiotice cu spectru larg: rifampicin, streptomicin, kanamicin, D-cicloserinFluorochinoloneChimioterapice care inhib sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul, Etionamida)Exigenele terapiei antituberculoase: a mpiedica selecia mutanilor rezisteni i a steriliza definitiv focarul.n acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4 droguri pe o perioad de 6-12 luni.

Profilaxia specificVaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezint o tulpin vie avirulent de M.bovis. A fost obinut de Calmette i Guerin n 1921 dup multiple repicri (230 pasaje) pe mediu cu cartof, bil i glicerin.Vaccinul se administreaz i/dermic la vrsta de 4-5 zile de la natere. Revaccinarea la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reacia Mantoux negativ).

MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TUSEI CONVULSIVE

Familia AlcaligenaceaeGenul BordetellaSpecii:Bordetella pertussis (agentul tusei convulsive)Bordetella parapertussis (agentul parapertusei)Bordetella bronhiseptica (pneumonii, bacteriemii)Bordetella aviumBordetella holmensii (izolat din hemoculturi)Bordetella hinzii (izolat din prelevate respiratorii)Bordetella trematum (infecii cutanate i auriculare)

B.pertussis agentul cauzal al tusei convulsiveCaractere morfobiologiceCocobacterii G-, asporogene, imobile, formeaz microcapsul, n frotiu se dispun separat, n perechi sau lanuri scurte. Reprezint mi/o strict aerobe, foarte pretenioase la cultivare.Medii speciale de izolare: - mediul Bordet-Gengou (geloz-snge cu amidon i glicerin)geloz-cazein-snge-crbune activatMediul de transport Kuzneov (soluie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% crbune activat)

Peste 3-5 zile de incubare n atmosfer umed la 37 C apar colonii S mici, bombate, lucioase, cu aspect de picturi de mercur, hemolitice (corespund bacteriilor virulente faza I), forme R avirulente, faza IV.Coloniile de B.parapertussis apar n 48 ore, B.bronchiseptica n 24 ore B.pertussis manifest activitate biochimic redus: oxidaza+, nu fermenteaz glucidele, ureaza-, nitrat-reductaza- .

Structura antigenic a B.pertussis este complex: exist Ag capsulare polizaharidice, Ag proteice, Ag fimbrial (hemaglutinina), Ag lipopolizaharidic.Factorii de patogenitateAdezine:- Hemaglutinina filamentoas (purtat de pili). Permite ataarea bacteriei la mucoasa tractului respirator, de asemenea se fixeaz pe macrofage i limfocite.

Aglutinogene. Proteine de suprafa situate pe fimbrii. Particip la ataarea B.pertussis la celulele epiteliale ciliate.Pertactina. Protein a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucarioteSubunitatea B a toxinei pertusice. Se fixeaz pe leucocite i mpiedic migrarea lor spre focarul inflamator.

2. Toxine Toxina pertussis (citotoxin de tip A-B). Acioneaz asupra diferitor celule eucariote, mrind concentraia intracelular de AMP ciclic (n special n celulele epiteliale ale TR). Provoac hiperlimfocitoz, sensibilizare la histamin, hipersecreie de insulin.Adenilat-ciclaza-hemolizin. Hemolizina provoac moartea macrofagelor i monocitelor, adenilat-ciclaza perturb activitatea bactericid a PMN, monocitelor i macrofagelor i stimuleaz secreia sero-mucoas a cilor respiratorii.

Toxina dermonecrotic. Se elibereaz n urma lizei bacteriene.Toxina citotraheal. Glicopeptid care inhib sinteza ADN, provocnd distrugerea celulelor ciliate Endotoxina

Patogeneza tusei convulsive Sursa de infecie omul bolnav, n special n perioada de debut al bolii. Mecanismul de transmitere aerogen, prin picturi

B.pertussis manifest tropism pentru mucoasa cilor respiratorii: faringe, trahee, bronii, bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat mpiedic eliminarea mucusului, el fiind eliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza iritaiei mucoasei de ctre endotoxina bacterian. Excitaia de lung durat a receptorilor terminali ai nervului pneumogastric determin un flux continuu de impulsuri n bulbul rahidian, ce duce la formarea unui focar de excitaie dominant. El atrage excitaii nespecifice de la ali receptori, fapt ce determin accesele de tuse, care devin tot mai grave i mai frecvente.

Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil, persist i dup dispariia bacteriei din organism. n evoluia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade):Perioada de incubaie (3-15 zile)Perioada cataral, foarte contagioas. Caracterizat prin tuse seac, rinoree (3-14 zile)Perioada convulsiv (paroxistic). Accese de tuse spasmodic, epuizant, asociat cu cianoz, vom, convulsii. (2-4 sptmni)Perioada de convalescen (2-4 sptmni)

Complicaii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite.

Imunitatea este durabil, umoral. Rol protector au Ac anti-toxin pertussis i anti-hemaglutinin filamentoas.

Diagnosticul de laborator al tusei convulsivePrelevate: mucoziti nasofaringiene sau bronice, recoltate ct mai precoce.Metode de diagnosticRIFExamenul bacteriologic (nsmnare cu tamponul sau prin tehnica plcilor tuite)Tehnnici de biologie molecular (PCR)Examenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reaciile se pozitiveaz din sptmna a II a perioadei convulsive. Se examineaz seruri perechi prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativ este o cretere de cel puin 4 ori a titrului Ac.

Tratamentul tusei convulsiveEritromicin sau cloramfenicol cel puin 10 zile (pn la apariia Ac)Imunoglobulin uman antipertussis

Profilaxia specific- Imunizarea artificial obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentat de o suspensie de bordetele de faza I, adsorbite pe adjuvant. Vaccinul acelular conine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutinina filamentoas). Este mai bine tolerat, dar mai puin eficace.- Imunoglobulin uman antipertussis