PROIECT IDEI nr. 249/01.10.2007, COD CNCSIS 440
IMPACTUL UNOR TULPINI RIZOBACTERIENE ASUPRA PROCESELOR
DE CRESTERE SI DEZVOLTARE LA PLANTE DE SOIA (GLYCINE MAX L.
MERR.)
- sinteză lucrare fază unică 2008 -
Director proiect, Lect. dr. Ştefan Marius
1. MONTAREA EXPERIENŢELOR ÎN CÂMP
Efectuarea lucrărilor de pregătire a patului germinativ. Înfiinţarea şi întreţinerea dispozitivelor experimentale conform protocolului experimental
Experienţa a fost amplasată în cadrul Staţiunii Didactice a Universităţii Agronomice „Ion Ionescu de la Brad” Iaşi - Ferma Ezăreni (47o07` N, 27o30` E), în toamna anului 2007, pe un sol de tip cernoziom cambic, luto-argilos, format pe depozite loessoide, având panta de 3-4 %, pH-ul slab acid, conţinutul în humus de circa 2,7 %, mijlociu aprovizionat în N şi P2O5 şi bine în K2O. În toamna anului 2007 s-au transpus în teren variantele elaborate, când s-a efectuat şi lucrarea de baza a solului respectiv arătură la 25 cm adâncime, cu plugul reversibil în agregat cu Tractorul Valtra. Pregătirea patului germinativ în primăvara anului 2008 s-a realizat cu combinatorul Lemken în agregat cu tractorul Valtra în preziua semănatului. Semănatul s-a realizat cu SPC-6+U650, utilizându-se o normă de sămânţă de 90 kg/ha (450.000 boabe/ha). Nu s-au administrat îngrăşăminte organo-chimice si nici erbicide preemergente. Combaterea buruienilor s-a realizat numai prin praşile mecanice fără a utiliza nici un fel de produs chimic.
2. STUDIUL DIVERSITATII MORFO-FUNCTIONALE A COMUNITATILOR
MICROBIENE DIN RIZOSFERA PLANTELOR DE SOIA
2.1. Dinamica efectului de rizosfera la plantele de soia pe parcursul dezvoltării ontogenetice
Efectul pe care îl exercită rădăcinile plantelor de soia asupra microorganismelor rizosferice a fost apreciat pe parcursul mai multor faze ale dezvoltării ontogenetice care includ dezvoltarea vegetativă (16.06.2008, 23.06.2008, 2.07.2008), înflorirea (10.07.2008) şi fructificarea (30.07.2008) – Fig. 1. Pentru interpretarea rezultatelor s-au utilizat valorile medii a trei determinări succesive.
4,45
5,61
6,65
3,65 3,68
0
1
2
3
4
5
6
7
R/S
vegetaţievegetaţievegetaţieînflorirefructificare
Pe parcursul dezvoltării ontogenetice a plantelor de soia se constată o modificare cantitativă
permanentă a microbiotei rizosferice. Astfel, sub influenţa directă a substanţelor eliberate masiv la nivel radicular, numărul microorganismelor din rizosferă creşte pe parcursul întregii perioade de creştere vegetativă, fapt demonstrat de existenţa unui raport R/S de aproximativ 6. Consecutiv înfloririi, când planta şi-a atins maturitatea vegetativă, cantitatea de substanţe eliberate la nivelul rădăcinilor începe să scadă ca urmare a diminuării pe ansamblu a proceselor metabolice (Burzo şi colab., 1999). O primă consecinţă a diminuării cantitative a exudatelor radiculare o constituie scăderea efectului de rizosferă, care pe parcursul înflorii şi ulterior fructificării poate fi cuantificat la soia printr-un raport de 3,65 respectiv 3,68.
Rezultatele obţinute în urma studiilor efectuate sunt apropiate de datele existente în literatura de specialitate. Astfel Rouatt şi colab. (1960) apreciază pentru plantele de soia un raport R/S de aproximativ 6 (pentru un număr de microorganisme rizosferice de 1.090 x 106/g şi un număr de microorganisme din solul liber de 184 x 106/g).
2.2. Izolarea microorganismelor rizosferice in culturi pure Pentru izolarea bacteriilor din rizosferă, în scopul obţinerii de culturi pure, s-au utilizat două
metode: însămânţarea suspensiilor-diluţii de sol şi aplicarea unor fragmente de rădăcini (amprentarea) pe mediu Bunt Rovira (Foto 1) - Tsavkelova şi colab., 2001.
Fig. 1 – Dinamica efectului de
rizosferă pe parcursul
ontogenezei plantelor de soia
Au fost izolate, pe baza caracterelor macro-morfologice, un număr de 27 tulpini bacteriene,
din care, în urma examenului microscopic, s-au păstrat pentru determinările ulterioare doar 13 tulpini. 2.3. Analiza macro- şi micromorfologică a tulpinilor bacteriene izolate Pentru descrierea caracterelor macro-morfologice ale tulpinilor izolate s-au urmărit o serie de
caractere ale coloniilor precum: forma, suprafaţa, aspectul marginilor, consistenţa, aderenţa, culoarea etc. În Anexa 1 sunt prezentate principalele caractere morfologice macroscopice ale tulpinilor bacteriene izolate.
Descrierea micro-morfologică s-a efectuat pe frotiuri colorate după tehnica Gram, rezultatele fiind prezentate în Anexa 1. Dimensiunile prezentate sunt medii ale mai multor măsurători efectuate pentru celule şi spori din frotiuri diferite, aparţinând aceleiaşi tulpini.
Studiile microbiotei rizosferice au demonstrat prezenţa, în rizosfera plantelor de soia, a unei populaţii bacteriene relativ diversificate din punct de vedere morfologic. Deşi analiza microscopică a evidenţiat prezenţa cu precădere a tulpinilor bacteriene reprezentate prin bacili sporulaţi şi nesporulaţi, pe suprafaţa rădăcinilor de soia se dezvoltă şi bacterii reprezentate morfologic prin coci (7,69 %) şi cocobacili (15,38 %).
Structura morfologică a microbiotei rizosferice de la plantele de soia descrisă în urma studiilor efectuate de noi corespunde în mare măsură informaţiilor prezente în literatura de specialitate. Astfel, încă din 1958, Krasilnikov afirmă că în solul rizosferic există mai multe bacterii reprezentate morfologic prin tipul bacilar decât coci, cocobacili sau spirili. Observaţiile sale sunt ulterior confirmate de Rovira at al. (1974), Campbell (1985, cit. de Zarnea, 1994), Keister şi Cregan (1991), Atlas (1998).
2.4. Analiza caracterelor fiziologice ale tulpinilor bacteriene izolate. Testarea capacitaţii de
solubilizare a fosforului anorganic. Testarea activităţii antimicrobiene
Rezultatele investigaţiilor privind caracterele fiziologice ale bacteriilor izolate din rizosfera plantelor de soia sunt prezentate în Anexa 2.
În general, bacteriile care se dezvoltă pe rădăcinilor plantelor de soia utilizează cu precădere ca surse de carbon glucidele simple (Fig. 2): monozaharide - în special galactoză şi xiloză (92,3 %), dizaharide - maltoză şi lactoză (92,3 %) şi mai puţin alcoolii (glicerol – 23,07 %, sorbitol – 69,23 %). Acest comportament poate fi explicat prin compoziţia exudatului radicular (bogat în galactoză, xiloză, maltoză, glucoză), precum şi prin extraordinara capacitate de adaptare a bacteriilor la nutrienţii disponibili în această regiune a solului (Hodge, 1998).
Capacitatea rizobacteriilor de solubilizare a fosforului anorganic Mai bine de jumătate (53,84 %, Fig. 3) din tulpinile izolate din rizosfera plantelor de soia au
dovedit capacitate de solubilizare a fosforului anorganic prezent în mediul de cultură: S3/03, S4,S5, S6, S6/03, S7, S9 (Anexa 2).
Prezenţa în număr mare de bacterii cu potenţial solubilizator în rizosfera plantelor de soia poate fi corelată cu necesităţile nutritive deosebite ale acestei specii şi cu interrelaţiile complexe care se stabilesc la nivel radicular. Astfel, se consideră că fosforul favorizează fortificarea plantelor şi formarea nodozităţilor la soia, stimulând totodată dezvoltarea bacteriilor fixatoare de azot (Muntean şi colab., 2003). Din aceste considerente stabilirea, în apropierea rădăcinilor, a unor relaţii mutual
Foto 1 – Fragmente de rădăcini de soia cu sol rizosferic ataşat pe mediu Bunt-Rovira
benefice cu bacterii dotate cu potenţial de solubilizare a fosforului anorganic contribuie la asigurarea necesităţilor nutritive şi determină stimularea indirectă a creşterii şi dezvoltării plantelor. Prezenţa pe suprafaţa rădăcinilor plantelor de soia a numeroase nodozităţi active fixatoare de azot la momentul recoltării probelor de sol rizosferic ce au servit pentru izolarea tulpinilor bacteriene testate constituie o dovadă în plus a influenţelor benefice, directe şi indirecte pe care microorganismele din rizosferă şi rizoplan le exercită asupra plantelor precum şi a interrelaţiilor complexe care apar între microorganismele rizosferice (Lucas-Garcia şi colab., 2004).
84,61100
83,3100
23,07
92,392,3
69,23
020
4060
80100
Xiloză
Arabino
ză
Galacto
ză
Glucoză
Lacto
ză
Maltoză
Glicerol
Sorbito
l
%
Fig. 2 – Reprezentarea procentuală a utilizării glucidelor de către bacteriile izolate din rizosfera
plantelor de soia
53,84%
46,16%
tulpini cu potenţialsolubilizator
tulpini fără potenţialsolubilizator
Testarea activităţii antimicrobiane a rizobacteriilor izolate În urma investigaţiilor efectuate, ale căror rezultate sunt prezentate în Anexa 2, s-a constatat că
tulpinile izolate din rizosfera plantelor de soia prezintă o activitate antimicrobiană selectivă, dovedindu-se active atât faţă de bacteriile Gram pozitive cât şi faţă de cele Gram negative utilizate.
Faţă de bacteriile Gram pozitive testate, tulpinile analizate s-au comportat diferit în sensul că au existat:
tulpini active numai faţă de una dintre bacteriile Gram pozitive testate, respectiv active faţă de Staphylococcus aureus ATCC – 6538P: S4, S6; active faţă de Bacillus cereus ATCC - 9634: S1, S2, S5;
tulpini active faţă de ambele bacteriile Gram pozitive testate: S3. Faţă de bacteriile Gram negative, tulpinile analizate s-au dovedit active faţă de ambele
bacterii testate: tulpini active numai faţă de una dintre bacteriile Gram negative testate, respectiv active faţă de
Pseudomonas aeruginosa IP – 5838: S4; active faţă de Escherichia coli ATCC –10536: S1, S2; tulpini active faţă de ambele bacteriile Gram negative testate: S9.
2.5. Identificarea taxonomica a tulpinilor bacteriene izolate
Încadrarea taxonomică a tulpinilor studiate s-a realizat pe baza caracterelor macro - şi micro-
morfologice, precum şi a proprietăţilor fiziologice şi biochimice, utilizându-se determinatorul “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”, ed. a IX-a, vol. 2, 1986.
Au fost încadrate în genuri şi specii doar acele tulpini cu importanţă practică deosebită, rezultatele fiind prezentate în Tabelul 1.
Fig. 3 – Clasificarea tulpinilor
bacteriene izolate din rizosfera
plantelor de soia în funcţie de
potenţialul de solubilizare a P
anorganic
Tabel 1 – Încadrarea taxonomică a tulpinilor rizobacteriene studiate Tulpina Genul Specia
S7
S9
Arthrobacter
globiformis
S6/03 Bacillus circulans
S1 S4 S6
Bacillus
macerans
3. STUDIUL INFLUENTEI PGPR ASUPRA DEZVOLTARII IN VITRO A PLANTELOR DE
SOIA S-a urmărit influenţa exercitată de tulpinile rizobacteriene izolate atât asupra germinaţiei cât şi
asupra dezvoltării plantulelor de soia în condiţii in vitro. Pentru studiile privind germinaţia, seminţele de soia (probă şi control) sterilizate iniţial au fost
puse la germinat pe hârtie de filtru sterilă şi hidratate în permanenţă cu apă distilată sterilă (Foto 11, Anexa 2). Seminţele probă au fost inoculate cu un amestec din tulpinile rizobacteriene descrise mai sus.
Pentru studiile privind dezvoltarea plantulelor, seminţele probă (sterilizate şi apoi inoculate cu rizobacterii) şi cele control (sterile) au fost introduse în vase mici de vegetaţie cu sol sterilizat prin autoclavare (Foto 12, Anexa 2).
Rezultatele obţinute în urma investigaţiilor privind influenţa rizobacteriilor testate asupra germinaţiei in vitro a seminţelor de soia demonstrează că microorganismele inoculate pot inhiba procesele germinative, dovadă fiind observaţiile efectuate direct (Foto 13, Anexa 2) precum şi evoluţia conţinutului de proteine (Fig. 4). Acest efect inhibitor indus de PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) nu se datorează unui stres biologic, fapt demonstrat de inexistenţa unor diferenţe statistic semnificative între activităţile unor markeri enzimatici ai stresului oxidativ: catalază (Fig. 5), superoxidismutază (Fig. 6), peroxidază (Fig. 7), ci probabil unei competiţii pentru nutrienţi care apare între rizobacterii şi seminţele de soia (ipoteza este întărită şi de faptul că pe timpul germinaţiei, seminţele au fost udate în permanenţă cu apă distilată sterilă, neutilizându-se soluţii nutritive, dezvoltarea lor făcându-se pe hârtie de filtru şi nu pe un mediu nutritiv).
În plus faţă de obiectivele propuse iniţial am investigat şi alţi markeri enzimatici (aspartat aminotransferaza şi alanin aminotransferaza), evoluţia acestora demonstrând aceeaşi întârziere în germinaţie apărută la seminţele inoculate cu PGPR în comparaţie cu cele neinoculate (control) – Fig. 8 şi Fig. 9.
Analiza electroforetică a proteinelor solubile a demonstrat variaţii calitative (apariţia respectiv dispariţia unor fracţii proteice corespunzătoare maselor moleculare de 94,9; 90,7; 39,6 kDa) puse probabil pe seama aceluiaşi efect de întârziere a procesului de germinaţie indus de prezenţa rizobacteriilor (Foto 14, Anexa 2).
0
50
100
150
200
250
72 120 168
timp (ore)
prot
eine
sol
ubile
(mg/
g)
seminte neinoculate seminte inoculate cu PGPR
Fig. 4 – Dinamica conţinutului de proteine solubile în seminţele de soia
pe durata germinaţiei in vitro
0
5000
10000
15000
20000
25000
72 120 168timp (ore)
Mic
rom
oli H
2O2/m
in/g
seminte neinoculate seminte inoculate cu PGPR
Fig. 5 – Dinamica activităţii catalazei înregistrată pe durata germinării in vitro a seminţelor de
soia
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
72 120 168
timp (ore)
USO
D/m
in/m
g pr
otei
na
seminte neinoculate seminte inoculate cu PGPR
Fig. 6 – Dinamica activităţii superoxid dismutazei înregistrată pe durata germinării in vitro a
seminţelor de soia
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
72 120 168timp (ore)
mU
/g/m
in
seminte neinoculate seminte inculate cu PGPR
Fig. 7 – Dinamica activităţii peroxidazei înregistrată pe durata germinării in vitro a seminţelor
de soia
0
10
20
30
40
50
60
72 120 168
timp (ore)
mic
roM
aci
d pi
ruvi
c/m
in/g
seminte neinoculate seminte inoculate cu PGPR
Fig. 8 – Dinamica activităţii aspartat-aminotransferazei înregistrată pe durata germinării in
vitro a seminţelor de soia
0
100
200
300
400
500
600
72 120 168timp (ore)
mic
roM
aci
d pi
ruvi
c/m
in/g
seminte neinoculate seminte inoculate cu PGPR
Fig. 9 – Dinamica activităţii alanin-aminotransferazei înregistrată pe durata germinării in vitro
a seminţelor de soia
Investigaţiile efectuate în cazul dezvoltării in vitro a plantulelor de soia inoculate cu rizobacterii au demonstrat existenţa unui efect stimulator exercitat de microorganismele testate. Astfel, indicii biometrici studiaţi (înălţime, nr. frunze, lungime foliolă, lăţime foliolă (Fig. 10) şi suprafaţă foliară arată o mai bună dezvoltare a plantulelor inoculate cu PGPR (probă) în comparaţie cu cele neinoculate (martor).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
05.08.2008 13.08.2008 12.09.08
Latim
e fr
unza
(cm
)
Martor Proba
Fig. 10 – Evoluţia lăţimii ultimei foliole complet formate la plante de soia pe parcursul
dezvoltării in vitro
Dezvoltarea mai bună a plantelor inoculate este de asemenea indicată şi de o serie de parametri biochimici. Astfel, se poate observa o creştere a conţinutului de proteine solubile (Fig. 11) şi o creştere a concentraţiei de pigmenţi asimilatori (clorofilă a, b, caroteni – Fig. 12) în cazul plantulelor lotului proba comparativ cu cele ale lotului martor. Menţionăm că în ambele situaţii s-au înregistrat diferenţe semnificative statistic. De asemenea, concentraţia glucidelor reducătoare este mai mare în cazul plantelor inoculate, toţi aceşti parametri indicând o intensificare a proceselor fotosintetice. Ca urmare, cantitatea de apă oxigenată din ţesuturile foliare creşte, fiind necesară intervenţia catalazei. Datele experimentale obţinute legate de activitatea acestei enzime (Fig. 17) întăresc această ipoteză, nivelul catalazei fiind statistic semnificativ mai mare în plantele inoculate faţă de cele neinoculate.
În cazul concentraţiei de lipide totale s-au înregistrat variaţii mici: 19,51 gr la sută de grame material uscat în ţesuturile foliare ale plantulelor inoculate cu PGPR, respectiv 19,03 gr la sută de grame material uscat în ţesuturile foliare ale plantulelor martor.
0
5
10
15
20
25
mg
prot
eina
/g
Martor Proba
Fig. 11 – Conţinutul de proteine solubile în frunzele plantelor de soia cu vârsta de 61 de zile
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Clorofila A Clorofila B Caroteni
mg
%
Martor Proba
Fig. 12 – Concentraţia pigmenţilor asimilatori în ţesuturile foliare ale plantelor de soia cu vârsta
de 61 de zile Evoluţia celorlalţi markeri ai stresului oxidativ demonstrează ca prezenţa şi activitatea
rizobacteriilor inoculate nu se constituie ca un factor de stres biologic, diferenţele înregistrate pentru activităţile superoxiddismutazei şi peroxidazei între cele două loturi nefiind semnificative statistic (Fig. 18 şi Fig. 19).
Analiza electroforetică a proteinelor solubile nu a evidenţiat diferenţe de natură calitativă, ci doar mici variaţii cantitative considerate normale în această fază de dezvoltare.
0,59
0,77
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
g % probămartor
Fig. 13 – Conţinutul de monoglucide reducătoare în ţesuturile foliare ale plantelor de soia cu
vârsta de 61 de zile
8,735
9,125
8,4 8,6 8,8 9 9,2
g % probămartor
Fig. 14 – Conţinutul de diglucide reducătoare în ţesuturile foliare ale plantelor de soia cu vârsta
de 61 de zile
1,26
2,335
0 0,5 1 1,5 2 2,5
g % probămartor
Fig. 15 – Conţinutul de poliglucide solubile reducătoare în ţesuturile foliare ale plantelor de soia
cu vârsta de 61 de zile
8,52
9,7
7,5 8 8,5 9 9,5 10
g % probămartor
Fig. 16 – Conţinutul de poliglucide insolubile reducătoare în ţesuturile foliare ale plantelor de
soia cu vârsta de 61 de zile
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
mic
rom
oli H
2O2/m
in/g
Martor Proba
Fig. 17 – Activitatea catalazei în frunzele plantelor de soia cu vârsta de 61 de zile
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Martor Proba
USO
D/m
in/m
g pr
otei
na
Fig. 18 – Activitatea superoxiddismutazei în frunzele plantelor de soia cu vârsta de 61 de zile
0
1
2
3
4
5
6
7
mU
P/g/
min
Martor Proba
Fig. 19 – Activitatea peroxidazică în frunzele plantelor de soia cu vârsta de 61 de zile
CONCLUZII
1. Numărul microorganismelor din rizosferă creşte pe parcursul întregii perioade de
dezvoltare vegetativă, atingând un raport R/S maxim de aproximativ 6 înaintea înfloririi, diminuând ulterior spre fructificare.
2. Microbiota rizosferică a plantelor de soia este relativ diversificată din punct de vedere morfologic, fiind reprezentată predominant prin bacili sporulaţi şi nesporulaţi, Gram pozitivi, dar şi prin coci (7,69 %) şi cocobacili (15,38 %).
3. Galactoza şi xiloza sunt principalele monozaharide utilizate ca surse de carbon de către bacteriile care se dezvoltă pe rădăcinilor plantelor de soia.
4. Mai bine de jumătate din tulpinile bacteriene izolate de pe rădăcinile plantelor de soia prezintă potenţial de solubilizare a fosforului din combinaţii anorganice insolubile.
5. Tulpinile bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia se caracterizează printr-o activitate antimicrobiană selectivă, fiind active atât faţă de bacteriile Gram pozitive cât şi faţă de cele Gram negative utilizate.
6. Tulpinile rizobacteriene studiate pot inhiba procesul de germinaţie in vitro al seminţelor de soia, efectul fiind indus probabil de competiţia pentru nutrienţi şi mai puţin de stresul biologic.
7. Microorganismele izolate din rizosfera plantelor de soia pot induce un efect stimulator asupra dezvoltării in vitro a plantulelor de soia.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Atlas, R.M., Bartha, R., 1998 – Microbial ecology – fundamentals and applications, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 99-133.
2. Ausubel, M. F., Brent R., Kingston, E. R. , Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K.. 2002 - Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, vol. I, 1-3;10-25 – 10-27
3. Bradford, M. 1976. - A Rapid and Sensitive Method for the Quantization of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem, 72, 248-254.
4. Burzo, I., Toma, S., Dobrescu, A., Ungurean, L., Ştefan, V., 1999 – Fiziologia plantelor de cultură, vol. 2, Fiziologia culturilor de câmp, Întreprinderea Editorial-Poligrafică Ştiinţa, Chişinău, 6-53, 208-283.
5. Curl, E.A., Truelove, B., 1986 – The rhizosphere, Springer-Verlag, Berlin, 12-89, 112-158. 6. Dunca, S., Ailiesei, O., Nimiţan, E., Ştefan, M., 2004 – Microbiologie aplicată, Ed. Tehnopress,
Iaşi, 217-220. 7. Eliade, G., Ghinea, L., Ştefanic, G., 1975 – Microbiologia solului, Ed. Ceres, Bucureşti, 144-
175. 8. Foster, R.C., 1986 – The ultrastructure of the rhizoplane and rhizosphere, Annu. Rev.
Phytopathol., 24:211-234. 9. Keister, D.L., Cregan, P.B., 1991 – The rhizosphere and plant growth – Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, Netherlands, 21-94, 113-165. 10. Krasilnikov, N.A., 1958 – Soil microorganisms and higher plants, Published by the Academy of
Sciences of the USSR, Moscow, 112-135. 11. Lucas-Garcia, J.A., Probanza, A., Ramos, B., Colon-Flores, J.J., Gutierrez-Manero, F.J., 2004 –
Effects of plant growth promoting rhizobateria (PGPRs) on the biological nitrogen fixation, nodulation and growth of Lupinus albus I. cv. Multolupa, Engineering, Life Sciences, 4:71-77.
12. Muntean, L.S., Roman, G.V., Borcean, I., Axinte, M., 2003 – Fitotehnie, Ed. USAMV „Ion Ionescu de la Brad” Iaşi, 160-189, 256-276, 303-333.
13. Rouatt, J.W., Katznelson, H., Payne, T.M.B., 1960 – Statistical evolution of the rhizosphere effect, Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 24:271-273.
14. Rovira, A.D., Newman, E.I., Bowen, H.J., Campbell, R., 1974 –Quantitative assessment of the rhizoplane microflora by direct microscopy. Soil. Biol. Biochem., 6:211-216.
15. Sambrook J, Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, vol. I, 18-55 – 18-57.
16. Sylvia, D.M., Fuhrmann, J.J., Hartel, P.G., Zuberer, D.A., 1999 – Principles and applications of soil microbiology, Prentice Hall Inc, Upper Saddle River, NJ, 389-407.
17. Tsavkelova, E.A., Cherdyntseva, T.A., Lobakova, E.S., Kolomeitseva, G.L., Netrusov, A.I., 2001 – Microbiota of the orchid rhizoplane, Microbiology, vol 70, 4:492-497.
18. Zarnea, G., 1994 – Tratat de microbiologie generală, Vol. V, Ed. Academiei Române, Bucureşti, 587-665.
ANEXA 1 – ASPECTE MACRO - ŞI MICRO-MORFOLOGICE ALE TULPINILOR RIZOBACTERIENE INVESTIGATE
Tabel 1 – Descrierea macro-morfologică a tulpinilor izolate din rizosfera plantelor de soia
TULPINA CARACTERE MORFOLOGICE S1 Colonii de tip S, margini regulate, perimetru circular, profil plat, slab
aderente de substrat, culoare alb-crem S1/03 Colonii de tip S, margini neregulate, perimetru circular, profil plat, slab
aderente de substrat, culoare albă S2 Colonii de tip S, margini regulate, perimetru circular, profil bombat, slab
aderente de substrat, culoare albă S3 Colonii de tip S, punctiforme, margini regulate, profil bombat, slab aderente
de substrat, culoare albă S3/03 Colonii de tip S, margini regulate, perimetru circular, profil bombat, slab
aderente de substrat, culoare galbenă S4 Colonii tip R, margini şi formă neregulate, profil plat, uşor aderente de
substrat, culoare alb-crem S4/03 Colonii de tip S, aspect punctiform, profil bombat, slab aderente de substrat,
culoare alb-crem S5 Colonii tip R, margini neregulate, perimetru aprox. circular, profil plat, uşor
aderente de substrat, culoare albă S6 Colonii de tip S, aspect mucos, margini regulate, perimetru aprox. circular,
profil plat, slab aderente de substrat, culoare alb-crem S6/03 Colonii tip R, margini neregulate, perimetru circular, profil plat, uşor
aderente de substrat, culoare alb-crem S7 Colonii de tip S, aspect mucos, margini regulate, perimetru circular, profil
plat, slab aderente de substrat, culoare alb-crem S8 Colonii de tip S, aspect mucos, margini regulate, perimetru circular, profil
bombat, slab aderente de substrat, culoare alb-crem S9 Colonii de tip S, aspect mucos, punctiforme, profil bombat, slab aderente de
substrat, culoare alb-crem
Tabel 2 – Descrierea micro-morfologică a tulpinilor izolate din rizosfera plantelor de soia
Tulp.
Aspect morfologic
Gram
Dimensiuni (µm):
L x diam.
Grupare
Spori (µm): L x diam.
S1 Bacili + 1,65 x 0,27 izolaţi ovali, terminali deformanţi, 0,31 x 0,26
S1/03 Bacili + 1,56 x 0,46 lanţuri ovali, centrali nedeformanţi, 0,53 x 0,23
S2 Bacili - 1,17 x 0,31 izolaţi - S3 Bacili - 1,61 x 0,32 izolaţi -
S3/03 Coci + diam. - 0,26 izolaţi - S4 Bacili + 1,46 x 0,27 izolaţi ovali, terminali deformanţi,
0,56 x 0,34 S4/03 Bacili + 1,64 x 0,30 izolaţi - S5 Bacili + 0,76 x 0,30 izolaţi,
paralel -
S6 Bacili + 1,38 x 0,31 izolaţi ovali, terminali deformanţi, 0,32 x 0,16
S6/03 Bacili + 1,55 x 0,50 diplo ovali, centrali nedeformanţi, 0,66 x 0,22
S7 Cocobacili + 0,48 x 0,30 izolaţi - S8 Bacili - 0,83 x 0,32 izolaţi - S9 Cocobacili + 0,90 x 0,30 izolaţi -
Foto 1 – Tulpina S1: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 2 – Tulpina S1/03: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 3 – Tulpina S2: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 4 – Tulpina S3: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 5 – Tulpina S3/03: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 6 – Tulpina S4: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 7 – Tulpina S4/03: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 8 – Tulpina S5: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 9 – Tulpina S6: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 10 – Tulpina S6/03: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 11 – Tulpina S7: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 12 – Tulpina S8: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
Foto 13 – Tulpina S9: dr. - aspect macroscopic; stg. - aspect microscopic (1000 x)
ANEXA 2
REZULTATELE INVESTIGAŢIILOR PRIVIND CARACTERELE FIZIOLOGICE ALE BACTERIILOR IZOLATE DIN RIZOSFERA PLANTELOR DE SOIA
Tabel 1 – Utilizarea diferitelor glucide de către bacteriile izolate din rizosfera plantelor de soia
GLUCIDE TESTATE TULPINA xiloză arabinoză galactoză glucoză lactoză maltoză glicerol sorbitol
S1 + + + + + + - + S1/03 + + + - + + - - S2 - + + + + + - - S3 + + + + + + - -
S3/03 + + + + + + - + S4 + + + + + + - +
S4/03 + + + + - + - + S5 + - + + + + + + S6 + + + + + + - -
S6/03 + + + + + + + + S7 + + + - + + - + S8 + + + + + + - + S9 + - + - + + + + Legendă: + : reacţie pozitivă;
- : reacţie negativă.
Foto 1 – Tulpina S6/03: testarea capacităţii de utilizare a glucidelor (stg. martor - culoare albastră; dr. reacţii
pozitive - dispariţia culorii albastre după adăugarea indicatorului albastru bromtimol)
Tabel 2 – Evidenţierea proprietăţilor de utilizare a glucidelor:
reacţia roşu de metil şi Voges-Proskauer Tulpina Reacţia roşu de metil Reacţia Voges -Proskauer
S1 - - S1/03 + - S2 - - S3 - -
S3/03 - - S4 - -
S4/03 - - S5 + - S6 + -
S6/03 + - S7 - - S8 - -
Tulpina Reacţia roşu de metil Reacţia Voges -Proskauer S9 - -
Legendă: + : reacţie pozitivă - : reacţie negativă
Tabel 3 – Evidenţierea proprietăţilor de reducere a nitraţilor
Tulpina Reducerea nitraţilor
S1 + S1/03 + S2 + S3 +
S3/03 + S4 +
S4/03 + S5 + S6 +
S6/03 + S7 + S8 - S9 +
Legendă: + : reacţie pozitivă; - : reacţie negativă.
Tabel 4 – Reacţii de hidroliză TULPINA Hidroliza
amidonului Hidroliza cazeinei
Hidroliza gelatinei
Hidroliza ureei
Hidroliza triptofanului
S1 - - - + -
S1/03 + + - - -
S2 + - - - -
S3 - + - - -
S3/03 - - + - -
Foto 2 – Reducerea nitraţilor la nitriţi: stg. -
martor, dr. - tulpinile S3/03 şi S6: reacţii
pozitive (apariţia culorii roşu)
TULPINA Hidroliza amidonului
Hidroliza cazeinei
Hidroliza gelatinei
Hidroliza ureei
Hidroliza triptofanului
S4 + + - + -
S4/03 + + - - -
S5 - - - + -
S6 + + - + -
S6/03 - - + - -
S7 - - - + -
S8 - - - + -
S9 - + + + -
Legendă: + : reacţie pozitivă; - : reacţie negativă.
Foto 3 – Hidroliza amidonului: tulpina S6 - reacţie pozitivă (apariţia
de zone clare de hidroliză la adăugarea soluţiei Lugol)
zone de hidroliză a amidonului
Foto 5 – Hidroliza ureei: stg. - martor, dr. - tulpinile S1,
S4, S7, S9: reacţii pozitive (apariţia culorii roşu)
Foto 4 – Hidroliza gelatinei: sus - martor, jos - tulpina
S3/03: reacţie pozitivă (lichefierea gelatinei)
Tabel 5 – Teste biochimice diverse TULPINA Utilizarea
citratului Evidenţierea
catalazei Evidenţierea
oxidazei Producerea
de H2S Evidenţierea
descompunerii fenilalaninei
S1 + ++ - + -
S1/03 - - - - -
S2 - - - - -
S3 + ++ - + -
S3/03 - + - + +
S4 + ++ - ++ -
S4/03 - + - + -
S5 - ++ + - -
S6 - ++ - + -
S6/03 - + - - -
S7 + ++ - + -
S8 - + - + -
S9 + ++ - + -
Legendă: ++ : reacţie pozitivă puternică; + : reacţie pozitivă;
- : reacţie negativă.
Foto 6 – Tulpina S7: reacţie pozitivă la utilizarea citratului (colorarea
mediului în albastru)
Foto 7 – Tulpinile S7 şi S9: reacţie pozitivă la testul catalazei (producerea de
efervescenţă)
Foto 8 – Evidenţierea producerii de oxidaze: reacţie pozitivă la tulpina S5 (apariţia
culorii negru)
Tabel 6 – Dezvoltarea tulpinilor bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia în mediu cu lapte turnesolat Tulpina Reacţie
acidă Reacţie alcalină
Reducerea turnesolului
Peptonizare Precipitare
S1 - - + - - S1/03 - - - - + S2 - - + - - S3 - - + - -
S3/03 - + - - - S4 - - - + -
S4/03 - + - - - S5 - + - - - S6 - - + - -
S6/03 - + - - - S7 - + - - - S8 - + - - - S9 - + - - -
Legendă: + : reacţie pozitivă; - : reacţie negativă.
Tabel 7 – Dezvoltare în medii diverse
Dezvoltare în medii cu pH diferit
TULPINA
Creştere în bulion Voges-Proskauer
Dezvoltare în mediu cu manitol pH – 5,7 pH – 6,8
S1 > 7 + - +
S1/03 < 6 + - +
S2 > 7 - - +
S3 > 7 - - +
S3/03 < 6 - + +
S4 < 6 + - +
S4/03 > 7 - - +
S5 < 6 + - +
S6 < 6 + - +
S6/03 < 6 + + +
S7 > 7 + - +
S8 > 7 - - +
S9 > 7 + + +
Legendă: + : reacţie pozitivă; - : reacţie negativă.
Foto 9 – Dezvoltare pe mediu cu manitol: sus – martor, jos – tulpina S7: reacţie pozitivă (colorarea mediului în
roşu)
Tabel 8 – Testarea tulpinilor bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia privind capacitatea de solubilizare a fosforului insolubil
TULPINA TESTATĂ REZULTAT S1 -
S1/03 - S2 - S3 -
S3/03 + S4 +++
S4/03 - S5 + S6 +
S6/03 + S7 + S8 - S9 +
Legendă: +++ : activitate intensă; + : reacţie pozitivă; - : reacţie negativă.
Foto 10 – Tulpina S4: dezvoltarea coloniilor cu clarificarea mediului Pikovskaya
Tabel 9 – Testarea activităţii antimicrobiene a tulpinilor bacteriene izolate din rizosfera plantelor de soia
TULP. Staphylococcus aureus
ATCC - 6538P Bacillus cereus ATCC - 9634
Pseudomonas aeruginosa IP -
5838
Escherichia coli ATCC -
10536 S1 - + - +
S1/03 - - - - S2 - + - + S3 + + - -
S3/03 - - - - S4 + - + -
S4/03 - - - - S5 - + - - S6 + - - -
S6/03 - - - - S7 - - - - S8 - - - - S9 - - + +
zone de clarificare a mediului
colonii
Legendă: + : reacţie pozitivă (apariţia zonei de inhibiţie a creşterii); - : reacţie negativă (absenţa zonei de inhibiţie a creşterii).
Foto 11 – Seminţe de Glycine max L.: germinaţie in vitro
Foto 12 – Plantule de Glycine max L.: dezvoltare in vitro
Foto 13 – Germinaţie in vitro la soia: stg. – seminţe neinoculate, dr. - seminţe inoculate cu PGPR (120 ore de
germinaţie)
Foto 14 - SDS-PAGE pentru proteine totale solubile. În dreapta markerul de greutate moleculară în kDa. Fiecare linie: 125 micrograme proteine:
M. Marker Sigma Wide Range 1. Seminţe neinoculate, 72 ore de germinaţie
2. Seminţe inoculate cu rizobacterii, 72 ore de germinaţie 3. Seminţe neinoculate, 120 ore de germinaţie
4. Seminţe inoculate cu rizobacterii, 120 ore de germinaţie 5. Seminţe neinoculate, 168 ore de germinaţie
6. Seminţe inoculate cu rizobacterii, 168 ore de germinaţie
