+ All Categories
Home > Documents > Gonta 1 _ mac.

Gonta 1 _ mac.

Date post: 04-Aug-2015
Category:
Upload: anastasia-furtuna
View: 247 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
of 42 /42
CUPRINS Introducere 7 Capitolul I. Formarea N-nitrozoaminelor în apă 11 I.1. Procese de nitrozare a aminelor 11 I.1.1. Nitrozarea aminelor secundare 11 I.1.2. Formarea agenţilor de nitrozare 13 I.1.3. Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice 15 I.1.4. Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice 17 I.1.5. Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice 24 I.1.6. Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice 29 I.1.6.1. Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA 29 I.1.6.2. Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA 33 I.1.6.3. Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei 34 I.2. Nitrozarea aminelor ciclice 37 I.2.1. Nitrozarea morfolinei 37 I.2.1.1. Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului 37 I.2.1.2. Legităţi cinetice în procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi 39 I.2.1.3. Metodele de inhibiţie în procesul de formare a N-nitrozomorfolinei 44 I.3. Nitrozarea amidelor 54 I.3.1. Precursori ai N-nitrozometilureei 54 I.3.2. Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei 56 I.3.3. Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei 59 I.3.4. Denitrozarea N-nitrozometilureei 62 Capitolul II. Formarea N-nitrozoaminelor în tutun şi în fumul de ţigară 67 II.1. Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului 67 II.1.1. Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului din predecesori 68 II.1.2. Formarea endogenă a N-nitrozoaminelor 70 II.2. Materiale şi metode utilizate la analiza NAST şi a predecesorilor din tutun 71 II.3. Formarea N-nitrozoaminelor în tutun şi în fumul de ţigară 74 II.3.1. Determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului în diferite tipuri de ţigări şi a predecesorilor lor în tutun şi în fumul de ţigară 74 II.3.2. Formarea N-nitrozoaminelor la diferite etape de prelucrare şi la arderea tutunului 77 II.3.3. Studiul cinetic al procesului de formare a NAST în sisteme-model 82 II.3.4. Diminuarea conţinutului de N-nitrozoamine specifice tutunului în fumul de ţigară 87 II.3.4.1. Influenţa inhibitorilor asupra procesului de formare a NAST în tutun 87 II.3.4.2. Degradarea fotolitică a N-nitrozoaminelor 89 II.3.4.3. Adsorbţia N-nitrozoaminelor din fum 91 Capitolul III. Formarea N-nitrozoaminelor în produsele alimentare 95 III.1. Formarea N-nitrozocompuşilor volatili şi nevolatili în produsele alimentare 95 III.1.1. Transformarea nitraţilor şi nitriţilor în produsele alimentare 98 III.2. Transformarea nitraţilor, nitriţilor şi formarea N-nitrozoaminelor în produsele alimentare comercializate în Republica Moldova 101 III.2.1. Conţinutul nitraţilor şi nitriţilor în produsele din carne 101 III.2.2. Influenţa substanţelor reducătoare asupra concentraţiei nitriţilor şi nitraţilor în produsele din carne 105 III.2.3. Nitraţi, nitriţi şi N-nitrozoamine în produsele lactate 107 III.2.4. Analiza N-nitrozoaminelor în malţ şi bere 110 III.2.5. Conţinutul NNA în produsele alimentare din carne şi peşte 111 Capitolul IV. Formarea N-nitrozoaminelor în sistemele sucului gastric imitat şi real 117 IV.1. Conversia nitraţilor şi nitriţilor în tractul digestiv 117 IV.2. Transformarea oxidului de azot(II) în organismul uman 120 IV.3. Nitrozarea endogenă a aminelor şi proteinelor în sistemul gastrointestinal 122 —— 3 ——
Transcript
Page 1: Gonta 1 _ mac.

CUPRINS

Introducere 7

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă 11I1 Procese de nitrozare a aminelor 11

I11 Nitrozarea aminelor secundare 11I12 Formarea agenţilor de nitrozare 13I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice 15I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice 17I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice 24I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare

a aminelor secundare alifatice 29I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA 29I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA 33I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei 34

I2 Nitrozarea aminelor ciclice 37I21 Nitrozarea morfolinei 37

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice

asupra organismului 37I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi 39I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei 44

I3 Nitrozarea amidelor 54I31 Precursori ai N-nitrozometilureei 54I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei 56I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei 59I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei 62

Capitolul II Formarea N-nitrozoaminelor icircn tutun şi icircn fumul de ţigară 67II1 Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului 67

II11 Formarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului din predecesori 68II12 Formarea endogenă a N-nitrozoaminelor 70

II2 Materiale şi metode utilizate la analiza NAST şi a predecesorilor din tutun 71II3 Formarea N-nitrozoaminelor icircn tutun şi icircn fumul de ţigară 74

II31 Determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului icircn diferite tipuri

de ţigări şi a predecesorilor lor icircn tutun şi icircn fumul de ţigară 74II32 Formarea N-nitrozoaminelor la diferite etape de prelucrare

şi la arderea tutunului 77II33 Studiul cinetic al procesului de formare a NAST icircn sisteme-model 82II34 Diminuarea conţinutului de N-nitrozoamine specifice tutunului

icircn fumul de ţigară 87II341 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de formare

a NAST icircn tutun 87II342 Degradarea fotolitică a N-nitrozoaminelor 89II343 Adsorbţia N-nitrozoaminelor din fum 91

Capitolul III Formarea N-nitrozoaminelor icircn produsele alimentare 95III1 Formarea N-nitrozocompuşilor volatili şi nevolatili icircn produsele alimentare 95

III11 Transformarea nitraţilor şi nitriţilor icircn produsele alimentare 98III2 Transformarea nitraţilor nitriţilor şi formarea N-nitrozoaminelor icircn produsele alimentare comercializate icircn Republica Moldova 101

III21 Conţinutul nitraţilor şi nitriţilor icircn produsele din carne 101III22 Influenţa substanţelor reducătoare asupra concentraţiei nitriţilor

şi nitraţilor icircn produsele din carne 105III23 Nitraţi nitriţi şi N-nitrozoamine icircn produsele lactate 107III24 Analiza N-nitrozoaminelor icircn malţ şi bere 110III25 Conţinutul NNA icircn produsele alimentare din carne şi peşte 111

Capitolul IV Formarea N-nitrozoaminelor icircn sistemele sucului gastric

imitat şi real 117IV1 Conversia nitraţilor şi nitriţilor icircn tractul digestiv 117IV2 Transformarea oxidului de azot(II) icircn organismul uman 120IV3 Nitrozarea endogenă a aminelor şi proteinelor icircn sistemul gastrointestinal 122IV4 Nitrozarea substratelor cu nitriţi icircn suc gastric imitat şi real 126

IV41 Concentraţia ionilor nitraţi şi nitriţi icircn sucul gastric icircn funcţie de pH 127IV42 Reducerea enzimatică a ionilor nitraţi icircn prezenţa Bificolului

şi nitrozarea aminelor secundare icircn sucul gastric 129IV5 Nitrozarea enzimatică a metaboliţilor proteinelor cu ioni nitriţi

icircn prezenţa pepsinei tripsinei şi chimotripsinei 132IV6 Inhibiţia procesului de nitrozare a metaboliţilor formaţi

la proteoliza proteinelor 136IV7 Influenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra conţinutului

de substrat proteic şi de aminoacizi la proteoliza cazeinei 137

Capitolul V Formarea methemoglobinei sub acţiunea ionilor nitriţi

la oxidarea oxihemoglobinei cu nitriţi 145

mdashmdash 3 mdashmdash

V1 Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitriţi şi alte xenobiotice 145V11 Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriţi 146V12 Participarea altor xenobiotice icircn oxidarea hemoglobinei 148

V2 Metode de inhibiţie icircn procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitriţi 150V21 Descompunerea peroxidului de hidrogen 150V22 Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenului 151V23 Captarea radicalilor NO2

153V24 Reducerea methemoglobinei 154

V3 Noi metode de inhibiţie icircn procesul de oxidare a hemoglobinei cu nitriţi 155V31 Metode experimentale de cercetare 156V32 Legităţile cinetice icircn sistemele HbO2 ndash NO2

- şi HbO2 ndash NO2- ndash H2O2

156V33 Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2

- icircn prezenţa inhibitorilor 159V331 Utilizarea acidului ascorbic icircn inhibiţia procesului

de oxidare a HbO2 160V332 Influenţa dihidroxifumaratului acid de sodiu

asupra oxidării HbO2 cu NO2 161

Capitolul VI Mecanismul procesului de reducere a ionilor nitriţi

icircn prezenţa antioxidanţilor 165VI1 Efectul protector al unor reducători naturali icircn apariţia cancerului

Transformarea nitriţilor icircn prezenţa compuşilor reducători 165VI2 Reducerea ionilor nitriţi cu polifenoli acid ascorbic acid dihidroxifumaric

şi derivaţii lui 168VI21 Reducerea ionilor nitriţi sub acţiunea acidului ascorbic 169VI22 Reducerea nitriţilor icircn prezenţa acidului dihidroxifumaric

şi a derivaţilor lui 170VI3 Reducerea ionilor nitriţi cu polifenoli 174

VI31 Efectul reducerii ionilor nitriţi cu rezveratrol 174VI32 Efectul reducerii nitriţilor cu (+)-catehină şi cvercetină 179VI33 Gradul de reducere a ionilor nitriţi cu reducători icircn funcţie de diferiţi parametri ai mediului 181

Capitolul VII Determinarea activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor 185VII1 Activitatea antioxidantă a reducătorilor naturali 185VII2 Metode de evaluare a activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor

prin testul cu radicalul DPPH˙ 190VII21 Studiul activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor naturali

prin utilizarea testului cu radicalul DPPH˙ 192

Capitolul VIII Metode electrochimice de reducere a nitraţilor şi nitriţilor din apă 197VIII1 Metode biologice de reducere a compuşilor minerali ai azotului 197VIII2 Metode fizico-chimice de icircnlăturare a ionilor de NO3

- din apă 199VIII3 Metode electrochimice de icircnlăturare a ionilor de NO-

3 din apă 201VIII4 Reducerea electrochimică a nitraţilor şi nitriţilor cu anozi solubili 203

VIII41 Metode şi materiale 203VIII42 Reducerea concentraţiei de NO3

- din soluţii-model şi ape naturale la tratarea lor electrochimică cu anozi solubili de aluminiu 205VIII421 Reducerea concentraţiei ionilor nitraţi icircn sisteme-model 205VIII422 Tratarea electrochimică a apelor naturale de NO3

-

cu anozi solubili de aluminiu 213VIII423 Reducerea electrochimică a ionilor nitraţi din sisteme-model

şi ape naturale cu anozi solubili de magneziu şi fier 215VIII43 Reducerea concentraţiei ionilor nitriţi din soluţii-model şi ape naturale

la tratarea lor electrochimică cu anozi solubili de aluminiu 217VIII431 Tratarea electrochimică 217VIII432 Reducerea electrochimică a ionilor nitriţi

cu anozi insolubili 220

Concluzii 222

Bibliografie 225

Anexe 255

mdashmdash 4 mdashmdash

Introducere

Icircn ultimele decenii s-au efectuat multiple investigaţii urmărindu-se estimarea riscului pentru om al substanţelor cancerigene care persistă icircn mediul ambiant Printre numărul mare de astfel de substanţe un loc deosebit icircl ocupă N-nitrozo compuşii (NNC) dintre care ~ 80 posedă acţiune cancerigenă şi induc apariţia tumorilor maligne practic icircn orice organe ale omului şi animalelor

N-nitrozocompuşii se formează destul de uşor icircn organismul uman mediul ambiant produsele alimentare şi icircn fumul de ţigară Sinteza acestor compuşi se realizează preponderent din amine secundare şi nitriţi sau oxizi de azot

Cercetările ştiinţifice icircn domeniul cancerogenezei acestor compuşi se dezvoltă icircn cacircteva direcţii (1) ndash identificarea noilor cancerigeni activi (2) ndash monitorizarea surselor de NNC cunoscuţi icircn mediul ambiant (3) ndash determinarea mecanismelor de formare a cancirigenilor şi (4) ndash elaborarea metodelor de prevenire a apariţiei şi răspacircndirii agenţilor cancerigeni

Pentru profilaxia şi inhibiţia apariţiei tumorilor pot fi utilizaţi diferiţi antimutageni şi anticancerigeni Cu toate acestea pacircnă icircn prezent rămacircn neclare unele aspecte ale proceselor date la care etape ale procesului de cancerogeneză este posibilă inhibiţia reală ce grupe ale inhibitori chimici sunt mai cu perspectivă pentru utilizarea icircn practică şi studiul anticancerogenezei care sunt mecanismele de acţiune inhibitoare icircn cancerogeneză ce sisteme de testare pot fi recomandate pentru selectarea anticancerigenilor care sunt gradele de corelare a efectelor antimutagenelor şi anti-cancerigenelor şi cum este posibilă extrapolarea rezultatelor experimentale asupra populaţiei Cunoaşterea mecanismelor de formare a N-nitrozocompuşilor elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei agenţilor de nitrozare şi de inhibiţie a procesului de nitrozare a diferitelor substraturi in vitro şi in vivo ar permite stabilirea mecanismelor de formare a substanţelor cancerigene şi elaborarea unui sistem de profilaxie şi de preicircntacircmpinare a dezvoltării diferitelor boli oncologice

Scopul prezentei lucrări rezidă icircn stabilirea mecanismelor de nitrozare icircn sistemele-model şi reale a procedeelor de inhibiţie prin utilizarea diferitelor substanţe obţinute din produse secundare vinicole şi icircn elaborarea metodelor de diminuare a poluării mediului ambiant

Pentru realizarea scopului au fost propuse următoarele sarcini stabilirea mecanismelor de nitrozare a aminelor secundare alifatice heterociclice a amidelor şi determinarea legităţilor cinetice de nitrozare icircn

funcţie de diferiţi parametri cercetarea procesului de formare a NNC la diferite etape de prelucrare şi determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului şi fumului de

ţigară cercetarea proceselor de transformare a nitraţilor nitriţilor şi de formare a N-nitrozoaminelor icircn diferite produse alimentare stabilirea particularităţilor de nitrozare enzimatică şi neenzimatică a unor amine şi peptide icircn sucul gastric determinarea legităţilor cinetice de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriţi in vitro şi in vivo şi a mecanismelor de acţiune a unor inhibitori

naturali icircn aceste procese elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei nitriţilor şi nitraţilor ca predecesori ai procesului de nitrozare icircn sisteme-model şi ape

naturale elaborarea metodelor de inhibiţie icircn procesul de formare al N-nitrozocompuşilor prin utilizarea unor reductoni naturali obţinuţi din produse

secundare vinicole şi determinarea activităţii lor antioxidanteantiradicalice

Icircn rezultatul studiilor experimentale pentru prima dată s-a determinat mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse

secundare vinicole pentru prima dată s-a constatat efectul inhibitor al acidului dihridroxifumaric icircn procesul de formare a N-nitrozonornicotinei in vitro şi in vivo s-a stabilit că gradul de inhibiţie icircn procesul de nitrozare a aminelor secundare depinde de natura inhibitorului şi bazicitatea aminei s-a stabilit că tartratul de dipotasiu este un inhibitor mai efectiv icircn procesul de nitrozare a nicotinei comparativ cu acizii citric şi tartric iar

utilizarea lui icircmbunătăţeşte calitatea tutunului aroma fumului şi acţionează pozitiv asupra duratei de ardere a tutunului analiza conţinutului substratului proteic nehidrolizat la proteoliza cazeinei a arătat că hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu utilizat icircn calitate de

inhibitor la nitrozarea metaboliţilor formaţi nu influenţează asupra activităţii enzimelor specifice s-a determinat mecanismul de acţiune a hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra procesului de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni

nitriţi care se bazează pe interacţiunea cu radicalul OH şi HO2

Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn procesul de formare a substanţelor cancerigene prin utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole (acidul dihidroxifumaric hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu rezveratrol esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric) S-a stabilit mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice şi ciclice cu ioni nitriţi Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn oxidarea oxihemoglobinei cu ioni nitriţi cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole şi s-a stabilit mecanismul acestor procese

Valoarea aplicativă a lucrării este determinată de metodele elaborate pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi nitriţi şi N-nitrozocompuşi icircn apă produse alimentare sacircnge suc gastric tutun şi fum de ţigară

Icircn acest context s-au optimizat condiţiile de utilizare a reducătorilor obţinuţi din produse secundare vinicole pentru inhibiţia proceselor de formare al N-

nitrozocompuşilor s-a stabilit posibilitatea utilizării reducătorilor studiaţi pentru diminuarea concentraţiei NNA din sucului gastric eliminarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului la fermentarea şi arderea tutunului s-a efectuat prin utilizarea tartratului de potasiu şi folosirea

diatomitelor din Republica Moldova s-a constatat că utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a acidului tartric icircn dieta alimentară diminuează conţinutul de N-nitrozonornicotină care

se formează la nitrozarea nornicotinei cu ioni nitriţi in vivo s-a stabilit rolul inhibitor al acidului dihidroxifumaric la nitrozarea diureticelor (hidroclortiazida) cu ioni nitriţi icircn sistemele sucului gastric prin

diminuarea concentraţiei nitrozohipotiazidei s-au optimizat condiţiile de tratare a apelor naturale pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi şi nitriţi prin metoda electrochimică icircn celula

cu anozi solubili de aluminiu şi anozi insolubili de fier şi magneziu icircn funcţie de concen traţia lor timpul tratării intensitatea curentului electric şi pH-ul soluţiei

introducerea hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu icircn tehnologia de fabricare a salamurilor a micşorat concentraţia ionilor de nitriţi şi nitraţi iar indicele ascorbat care determină proprietatea de reducere a nitriţilor icircn diferite produse creşte odată cu mărirea concentraţiei reducătorilor

mdashmdash 5 mdashmdash

Cuvinte cheie N-nitrozoamine N-nitrozoamide agenţi de nitrozare mecanisme de nitrozare inhibiţia nitrozării reductoni activitate antioxidantăantiradicalică constante de viteză methemoglobină ioni nitriţi şi nitraţi amine amide tutun fum de ţigară N-nitrozoamine specifice tutunului suc gastric metode electrochimice produse alimentare

Lista abrevierilorNNC ndash N-nitrozocompuşi DFH4 ndash acidul dihridroxifumaric DMA ndash dimetilamina DEA ndash dietilamina NDEA ndash N-nitrozodietilamina NDMA ndash N-nitrzodimetilamina NNA ndash N-nitrozoamine DFH3Na ndash hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu MOR ndash morfolina NMOR ndash N-nitromorfolina EDMT ndash esterul dimetilic al acidului tartric EDMD ndash esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric MU ndash N-metilureea NMU ndash N-nitrozometilureea (+)ndashCat ndash (+)ndashcatehina NNN ndash N-nitrozonornicotina NNK ndash 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-1-butanona NNAL ndash acidul 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-butiric NNAC ndash acidul [4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-but-1-il]-β-O-D-glucoziduronic NAST ndash N-nitrozoamine specifice tutunului NPJP ndash N-nitrozopiperidina AAs ndash acid ascorbic AGl ndash acid galic NOCP ndash predecesorii N-nitrozoaminelor ATE ndash analiza termo-energetică PC ndash pigment caratenoidic Alb ndash albumina MetHb ndash methemoglobina HbO2 ndash oxihemoglobina RedH2 ndash compuşi cu proprietăţi reducătoare Red ndash produs de oxidare al RedH2 Rezv ndash rezveratrol DPPHbull ndash 22-difenil-1-picrilhirazil PAR ndash puterea antiradicalică CE50 ndash concentraţia eficientă Cv ndash cvercetina Eneox ndash extract de enotanine din seminţe de struguri ENOXIL - extract de enotanine din seminţe de struguri modificat NVNC ndash N-nitrozoamine volatile SG ndash suc gastric GI ndash grad de inhibiţie EC ndash epicatehina ECG ndash epicatehină galat EGCG ndash epigalocatehingalat EGC ndash epigalocatehină ABTS+bull ndash 22 azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-6-acid sulfonic

mdashmdash 6 mdashmdash

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă

I1 Procese de nitrozare a aminelor

I11 Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine amide) şi acidul azotos Răspacircndirea largă a acestei grupe de compuşi icircn mediul ambiant proprietatea evidenţiată de a provoca tumori icircn diferite organe efectele cancerigen mutagen transplacentar şi alte particularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale şi om Principala primejdie a NNC comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice aflatoxinele bifenilii policloruraţi) este proprietatea de a se forma uşor din predecesori icircn organisme vii şi icircn mediul ambiant

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N) amidelor secundare (RCONHR1O) şi terţiare (RCONR1R2) N-substituenţii ureei (R1HNCONH2) guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) şi uretanii (RR1NCOR) Cei mai răspacircndiţi NNC derivă de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1]

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate icircn ecosistem dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări dar icircn unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii Introducerea excesivă a icircngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu nitraţi uree) poluarea mediului cu oxizi de azot formaţi icircn industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului astfel icircn biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se formează aceşti cancerigeni

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis Rid Mirvish şi Williams) Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la pHlt 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează direct cu aminosubstratul Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează icircn rezultatul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y- care este de exemplu NO2

- Cl- SCN-) cu acidul azotos protonat icircntr-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre (I11 I12 şi I13) [1]

NO2- + H3O+ HNO2 + H2O (I11)

HNO2 + H3O+ H2O + NO+ (I12)

H2O + NO+ + Y- Y-NO + H2O (I13)

R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+ (I14)

R2NH + Y-NO rarr R2NNO + HY (I15)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I14) reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I15) [5] Astfel icircn şirul echilibrelor prezentate direcţia procesului va depinde de pH bazicitatea aminosubstratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y -) Icircn absenţa altor nucleofili ionul nitrit acţionează icircn calitate de catalizator Y- şi icircn acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3 format icircn reacţia chimică

2HNO2 N2O3 + H2O (I16)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I17 [2]

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi de la azot astfel icircn soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec I18) iar constanta de echilibru

reprezintă constanta de bazicitate (kb)

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO- (I18)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi Cu cacirct mai scăzută este bazicitatea aminei cu atacirct se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot

Aminele alifatice sunt baze mai tari decacirct amoniacul datorită grupelor alchil cu efect respingător de electroni (+I s) efect ce măreşte bazicitatea Aminele secundare sunt baze mai tari decacirct aminele primare deoarece conţin două grupări alchil cu efect (+I s) dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică produs de cele trei grupe alchil Aminele aromatice sunt baze mai slabe decacirct amoniacul Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării electronilor neparticipanţi de la atomul de azot icircntr-o conjugare

cu electronii ai nucleului benzenic Pentru aminele studiate icircn prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I11

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că pentru aminele secundare care au pK a gt 5 vitezele reacţiilor de formare a N-nitrozoaminelor calculate după consumul total de amine şi ioni nitriţi au o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximum pentru amine la pH ~ 34 iar pentru aminoacizi ~ 25 [3]

Această dependenţă reflectă influenţa acidităţii mediului reactant asupra concentraţiilor de oxid de azot (III) şi amine neprotonate Totuşi mărimea vitezelor de nitrozare icircn funcţie de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa) care determină partea de amină neprotonată ce participă icircn reacţie

Icircn intervalul de pH2-5 icircn absenţa catalizatorilor (de ex ioni de tiocianat Cl- I-) reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon

Aminocompuşii slab bazici (de ex amidele derivaţii ureei) nu se nitrozează atacirct de activ prin intermediul N2O3 Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu micşorarea pH-ului datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO astfel nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat după următoarea ecuaţie

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I19)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă după cum s-a menţionat mai sus o valoare maximă la pH 3-34

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I110)Viteza de nitrozare a N-alchilureelor N-alchilcarbamaţilor amidelor este proporţională cu

concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec I19) astfel viteza de nitrozare nu manifestă un maxim icircn funcţie de pH dar creşte cu scăderea pH-ului

Se poate constata că icircn general aminele secundare slab bazice N-alchilureele N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid Aminele primare terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai icircncet cu excepţia compusului aminoterţiar aminopiridina care este nitrozată extrem de rapid Viteza de nitrozare depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi

I12 Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc icircn rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu protonii (H + sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO) Icircn soluţii apoase se stabileşte un echilibru icircntre acidul azotos şi oxidul de azot (III) conform ecuaţiei (I16) [5]

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ordmC iar mai tacircrziu prin metoda potenţiometrică spectrofotometrică şi cinetică de către Markovits şi col a cărei valoare este de 30middot10-3 lmiddotmol-1

Reacţia (I16) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atacirct in vivo cacirct şi in vitro icircn particular icircn mediul ambiant produse alimentare şi icircn stomac Protonarea ionilor nitriţi este doar una icircn şirul mare de reacţii ce au loc deoa rece icircn afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare ca ionul acidului azotos (H 2O+ NO) tetraoxidul de azot (N2O4) şi al Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de aciditatea mediului icircnsă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi detectaţi spectrofotometric (Fig I12) [7]

Fig I11 Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor

mdashmdash 7 mdashmdash

(I17)

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 2: Gonta 1 _ mac.

V1 Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitriţi şi alte xenobiotice 145V11 Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriţi 146V12 Participarea altor xenobiotice icircn oxidarea hemoglobinei 148

V2 Metode de inhibiţie icircn procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitriţi 150V21 Descompunerea peroxidului de hidrogen 150V22 Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenului 151V23 Captarea radicalilor NO2

153V24 Reducerea methemoglobinei 154

V3 Noi metode de inhibiţie icircn procesul de oxidare a hemoglobinei cu nitriţi 155V31 Metode experimentale de cercetare 156V32 Legităţile cinetice icircn sistemele HbO2 ndash NO2

- şi HbO2 ndash NO2- ndash H2O2

156V33 Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2

- icircn prezenţa inhibitorilor 159V331 Utilizarea acidului ascorbic icircn inhibiţia procesului

de oxidare a HbO2 160V332 Influenţa dihidroxifumaratului acid de sodiu

asupra oxidării HbO2 cu NO2 161

Capitolul VI Mecanismul procesului de reducere a ionilor nitriţi

icircn prezenţa antioxidanţilor 165VI1 Efectul protector al unor reducători naturali icircn apariţia cancerului

Transformarea nitriţilor icircn prezenţa compuşilor reducători 165VI2 Reducerea ionilor nitriţi cu polifenoli acid ascorbic acid dihidroxifumaric

şi derivaţii lui 168VI21 Reducerea ionilor nitriţi sub acţiunea acidului ascorbic 169VI22 Reducerea nitriţilor icircn prezenţa acidului dihidroxifumaric

şi a derivaţilor lui 170VI3 Reducerea ionilor nitriţi cu polifenoli 174

VI31 Efectul reducerii ionilor nitriţi cu rezveratrol 174VI32 Efectul reducerii nitriţilor cu (+)-catehină şi cvercetină 179VI33 Gradul de reducere a ionilor nitriţi cu reducători icircn funcţie de diferiţi parametri ai mediului 181

Capitolul VII Determinarea activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor 185VII1 Activitatea antioxidantă a reducătorilor naturali 185VII2 Metode de evaluare a activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor

prin testul cu radicalul DPPH˙ 190VII21 Studiul activităţii antioxidanteantiradicalice a inhibitorilor naturali

prin utilizarea testului cu radicalul DPPH˙ 192

Capitolul VIII Metode electrochimice de reducere a nitraţilor şi nitriţilor din apă 197VIII1 Metode biologice de reducere a compuşilor minerali ai azotului 197VIII2 Metode fizico-chimice de icircnlăturare a ionilor de NO3

- din apă 199VIII3 Metode electrochimice de icircnlăturare a ionilor de NO-

3 din apă 201VIII4 Reducerea electrochimică a nitraţilor şi nitriţilor cu anozi solubili 203

VIII41 Metode şi materiale 203VIII42 Reducerea concentraţiei de NO3

- din soluţii-model şi ape naturale la tratarea lor electrochimică cu anozi solubili de aluminiu 205VIII421 Reducerea concentraţiei ionilor nitraţi icircn sisteme-model 205VIII422 Tratarea electrochimică a apelor naturale de NO3

-

cu anozi solubili de aluminiu 213VIII423 Reducerea electrochimică a ionilor nitraţi din sisteme-model

şi ape naturale cu anozi solubili de magneziu şi fier 215VIII43 Reducerea concentraţiei ionilor nitriţi din soluţii-model şi ape naturale

la tratarea lor electrochimică cu anozi solubili de aluminiu 217VIII431 Tratarea electrochimică 217VIII432 Reducerea electrochimică a ionilor nitriţi

cu anozi insolubili 220

Concluzii 222

Bibliografie 225

Anexe 255

mdashmdash 4 mdashmdash

Introducere

Icircn ultimele decenii s-au efectuat multiple investigaţii urmărindu-se estimarea riscului pentru om al substanţelor cancerigene care persistă icircn mediul ambiant Printre numărul mare de astfel de substanţe un loc deosebit icircl ocupă N-nitrozo compuşii (NNC) dintre care ~ 80 posedă acţiune cancerigenă şi induc apariţia tumorilor maligne practic icircn orice organe ale omului şi animalelor

N-nitrozocompuşii se formează destul de uşor icircn organismul uman mediul ambiant produsele alimentare şi icircn fumul de ţigară Sinteza acestor compuşi se realizează preponderent din amine secundare şi nitriţi sau oxizi de azot

Cercetările ştiinţifice icircn domeniul cancerogenezei acestor compuşi se dezvoltă icircn cacircteva direcţii (1) ndash identificarea noilor cancerigeni activi (2) ndash monitorizarea surselor de NNC cunoscuţi icircn mediul ambiant (3) ndash determinarea mecanismelor de formare a cancirigenilor şi (4) ndash elaborarea metodelor de prevenire a apariţiei şi răspacircndirii agenţilor cancerigeni

Pentru profilaxia şi inhibiţia apariţiei tumorilor pot fi utilizaţi diferiţi antimutageni şi anticancerigeni Cu toate acestea pacircnă icircn prezent rămacircn neclare unele aspecte ale proceselor date la care etape ale procesului de cancerogeneză este posibilă inhibiţia reală ce grupe ale inhibitori chimici sunt mai cu perspectivă pentru utilizarea icircn practică şi studiul anticancerogenezei care sunt mecanismele de acţiune inhibitoare icircn cancerogeneză ce sisteme de testare pot fi recomandate pentru selectarea anticancerigenilor care sunt gradele de corelare a efectelor antimutagenelor şi anti-cancerigenelor şi cum este posibilă extrapolarea rezultatelor experimentale asupra populaţiei Cunoaşterea mecanismelor de formare a N-nitrozocompuşilor elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei agenţilor de nitrozare şi de inhibiţie a procesului de nitrozare a diferitelor substraturi in vitro şi in vivo ar permite stabilirea mecanismelor de formare a substanţelor cancerigene şi elaborarea unui sistem de profilaxie şi de preicircntacircmpinare a dezvoltării diferitelor boli oncologice

Scopul prezentei lucrări rezidă icircn stabilirea mecanismelor de nitrozare icircn sistemele-model şi reale a procedeelor de inhibiţie prin utilizarea diferitelor substanţe obţinute din produse secundare vinicole şi icircn elaborarea metodelor de diminuare a poluării mediului ambiant

Pentru realizarea scopului au fost propuse următoarele sarcini stabilirea mecanismelor de nitrozare a aminelor secundare alifatice heterociclice a amidelor şi determinarea legităţilor cinetice de nitrozare icircn

funcţie de diferiţi parametri cercetarea procesului de formare a NNC la diferite etape de prelucrare şi determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului şi fumului de

ţigară cercetarea proceselor de transformare a nitraţilor nitriţilor şi de formare a N-nitrozoaminelor icircn diferite produse alimentare stabilirea particularităţilor de nitrozare enzimatică şi neenzimatică a unor amine şi peptide icircn sucul gastric determinarea legităţilor cinetice de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriţi in vitro şi in vivo şi a mecanismelor de acţiune a unor inhibitori

naturali icircn aceste procese elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei nitriţilor şi nitraţilor ca predecesori ai procesului de nitrozare icircn sisteme-model şi ape

naturale elaborarea metodelor de inhibiţie icircn procesul de formare al N-nitrozocompuşilor prin utilizarea unor reductoni naturali obţinuţi din produse

secundare vinicole şi determinarea activităţii lor antioxidanteantiradicalice

Icircn rezultatul studiilor experimentale pentru prima dată s-a determinat mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse

secundare vinicole pentru prima dată s-a constatat efectul inhibitor al acidului dihridroxifumaric icircn procesul de formare a N-nitrozonornicotinei in vitro şi in vivo s-a stabilit că gradul de inhibiţie icircn procesul de nitrozare a aminelor secundare depinde de natura inhibitorului şi bazicitatea aminei s-a stabilit că tartratul de dipotasiu este un inhibitor mai efectiv icircn procesul de nitrozare a nicotinei comparativ cu acizii citric şi tartric iar

utilizarea lui icircmbunătăţeşte calitatea tutunului aroma fumului şi acţionează pozitiv asupra duratei de ardere a tutunului analiza conţinutului substratului proteic nehidrolizat la proteoliza cazeinei a arătat că hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu utilizat icircn calitate de

inhibitor la nitrozarea metaboliţilor formaţi nu influenţează asupra activităţii enzimelor specifice s-a determinat mecanismul de acţiune a hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra procesului de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni

nitriţi care se bazează pe interacţiunea cu radicalul OH şi HO2

Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn procesul de formare a substanţelor cancerigene prin utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole (acidul dihidroxifumaric hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu rezveratrol esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric) S-a stabilit mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice şi ciclice cu ioni nitriţi Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn oxidarea oxihemoglobinei cu ioni nitriţi cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole şi s-a stabilit mecanismul acestor procese

Valoarea aplicativă a lucrării este determinată de metodele elaborate pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi nitriţi şi N-nitrozocompuşi icircn apă produse alimentare sacircnge suc gastric tutun şi fum de ţigară

Icircn acest context s-au optimizat condiţiile de utilizare a reducătorilor obţinuţi din produse secundare vinicole pentru inhibiţia proceselor de formare al N-

nitrozocompuşilor s-a stabilit posibilitatea utilizării reducătorilor studiaţi pentru diminuarea concentraţiei NNA din sucului gastric eliminarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului la fermentarea şi arderea tutunului s-a efectuat prin utilizarea tartratului de potasiu şi folosirea

diatomitelor din Republica Moldova s-a constatat că utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a acidului tartric icircn dieta alimentară diminuează conţinutul de N-nitrozonornicotină care

se formează la nitrozarea nornicotinei cu ioni nitriţi in vivo s-a stabilit rolul inhibitor al acidului dihidroxifumaric la nitrozarea diureticelor (hidroclortiazida) cu ioni nitriţi icircn sistemele sucului gastric prin

diminuarea concentraţiei nitrozohipotiazidei s-au optimizat condiţiile de tratare a apelor naturale pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi şi nitriţi prin metoda electrochimică icircn celula

cu anozi solubili de aluminiu şi anozi insolubili de fier şi magneziu icircn funcţie de concen traţia lor timpul tratării intensitatea curentului electric şi pH-ul soluţiei

introducerea hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu icircn tehnologia de fabricare a salamurilor a micşorat concentraţia ionilor de nitriţi şi nitraţi iar indicele ascorbat care determină proprietatea de reducere a nitriţilor icircn diferite produse creşte odată cu mărirea concentraţiei reducătorilor

mdashmdash 5 mdashmdash

Cuvinte cheie N-nitrozoamine N-nitrozoamide agenţi de nitrozare mecanisme de nitrozare inhibiţia nitrozării reductoni activitate antioxidantăantiradicalică constante de viteză methemoglobină ioni nitriţi şi nitraţi amine amide tutun fum de ţigară N-nitrozoamine specifice tutunului suc gastric metode electrochimice produse alimentare

Lista abrevierilorNNC ndash N-nitrozocompuşi DFH4 ndash acidul dihridroxifumaric DMA ndash dimetilamina DEA ndash dietilamina NDEA ndash N-nitrozodietilamina NDMA ndash N-nitrzodimetilamina NNA ndash N-nitrozoamine DFH3Na ndash hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu MOR ndash morfolina NMOR ndash N-nitromorfolina EDMT ndash esterul dimetilic al acidului tartric EDMD ndash esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric MU ndash N-metilureea NMU ndash N-nitrozometilureea (+)ndashCat ndash (+)ndashcatehina NNN ndash N-nitrozonornicotina NNK ndash 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-1-butanona NNAL ndash acidul 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-butiric NNAC ndash acidul [4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-but-1-il]-β-O-D-glucoziduronic NAST ndash N-nitrozoamine specifice tutunului NPJP ndash N-nitrozopiperidina AAs ndash acid ascorbic AGl ndash acid galic NOCP ndash predecesorii N-nitrozoaminelor ATE ndash analiza termo-energetică PC ndash pigment caratenoidic Alb ndash albumina MetHb ndash methemoglobina HbO2 ndash oxihemoglobina RedH2 ndash compuşi cu proprietăţi reducătoare Red ndash produs de oxidare al RedH2 Rezv ndash rezveratrol DPPHbull ndash 22-difenil-1-picrilhirazil PAR ndash puterea antiradicalică CE50 ndash concentraţia eficientă Cv ndash cvercetina Eneox ndash extract de enotanine din seminţe de struguri ENOXIL - extract de enotanine din seminţe de struguri modificat NVNC ndash N-nitrozoamine volatile SG ndash suc gastric GI ndash grad de inhibiţie EC ndash epicatehina ECG ndash epicatehină galat EGCG ndash epigalocatehingalat EGC ndash epigalocatehină ABTS+bull ndash 22 azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-6-acid sulfonic

mdashmdash 6 mdashmdash

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă

I1 Procese de nitrozare a aminelor

I11 Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine amide) şi acidul azotos Răspacircndirea largă a acestei grupe de compuşi icircn mediul ambiant proprietatea evidenţiată de a provoca tumori icircn diferite organe efectele cancerigen mutagen transplacentar şi alte particularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale şi om Principala primejdie a NNC comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice aflatoxinele bifenilii policloruraţi) este proprietatea de a se forma uşor din predecesori icircn organisme vii şi icircn mediul ambiant

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N) amidelor secundare (RCONHR1O) şi terţiare (RCONR1R2) N-substituenţii ureei (R1HNCONH2) guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) şi uretanii (RR1NCOR) Cei mai răspacircndiţi NNC derivă de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1]

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate icircn ecosistem dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări dar icircn unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii Introducerea excesivă a icircngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu nitraţi uree) poluarea mediului cu oxizi de azot formaţi icircn industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului astfel icircn biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se formează aceşti cancerigeni

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis Rid Mirvish şi Williams) Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la pHlt 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează direct cu aminosubstratul Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează icircn rezultatul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y- care este de exemplu NO2

- Cl- SCN-) cu acidul azotos protonat icircntr-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre (I11 I12 şi I13) [1]

NO2- + H3O+ HNO2 + H2O (I11)

HNO2 + H3O+ H2O + NO+ (I12)

H2O + NO+ + Y- Y-NO + H2O (I13)

R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+ (I14)

R2NH + Y-NO rarr R2NNO + HY (I15)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I14) reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I15) [5] Astfel icircn şirul echilibrelor prezentate direcţia procesului va depinde de pH bazicitatea aminosubstratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y -) Icircn absenţa altor nucleofili ionul nitrit acţionează icircn calitate de catalizator Y- şi icircn acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3 format icircn reacţia chimică

2HNO2 N2O3 + H2O (I16)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I17 [2]

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi de la azot astfel icircn soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec I18) iar constanta de echilibru

reprezintă constanta de bazicitate (kb)

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO- (I18)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi Cu cacirct mai scăzută este bazicitatea aminei cu atacirct se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot

Aminele alifatice sunt baze mai tari decacirct amoniacul datorită grupelor alchil cu efect respingător de electroni (+I s) efect ce măreşte bazicitatea Aminele secundare sunt baze mai tari decacirct aminele primare deoarece conţin două grupări alchil cu efect (+I s) dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică produs de cele trei grupe alchil Aminele aromatice sunt baze mai slabe decacirct amoniacul Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării electronilor neparticipanţi de la atomul de azot icircntr-o conjugare

cu electronii ai nucleului benzenic Pentru aminele studiate icircn prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I11

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că pentru aminele secundare care au pK a gt 5 vitezele reacţiilor de formare a N-nitrozoaminelor calculate după consumul total de amine şi ioni nitriţi au o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximum pentru amine la pH ~ 34 iar pentru aminoacizi ~ 25 [3]

Această dependenţă reflectă influenţa acidităţii mediului reactant asupra concentraţiilor de oxid de azot (III) şi amine neprotonate Totuşi mărimea vitezelor de nitrozare icircn funcţie de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa) care determină partea de amină neprotonată ce participă icircn reacţie

Icircn intervalul de pH2-5 icircn absenţa catalizatorilor (de ex ioni de tiocianat Cl- I-) reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon

Aminocompuşii slab bazici (de ex amidele derivaţii ureei) nu se nitrozează atacirct de activ prin intermediul N2O3 Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu micşorarea pH-ului datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO astfel nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat după următoarea ecuaţie

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I19)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă după cum s-a menţionat mai sus o valoare maximă la pH 3-34

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I110)Viteza de nitrozare a N-alchilureelor N-alchilcarbamaţilor amidelor este proporţională cu

concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec I19) astfel viteza de nitrozare nu manifestă un maxim icircn funcţie de pH dar creşte cu scăderea pH-ului

Se poate constata că icircn general aminele secundare slab bazice N-alchilureele N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid Aminele primare terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai icircncet cu excepţia compusului aminoterţiar aminopiridina care este nitrozată extrem de rapid Viteza de nitrozare depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi

I12 Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc icircn rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu protonii (H + sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO) Icircn soluţii apoase se stabileşte un echilibru icircntre acidul azotos şi oxidul de azot (III) conform ecuaţiei (I16) [5]

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ordmC iar mai tacircrziu prin metoda potenţiometrică spectrofotometrică şi cinetică de către Markovits şi col a cărei valoare este de 30middot10-3 lmiddotmol-1

Reacţia (I16) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atacirct in vivo cacirct şi in vitro icircn particular icircn mediul ambiant produse alimentare şi icircn stomac Protonarea ionilor nitriţi este doar una icircn şirul mare de reacţii ce au loc deoa rece icircn afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare ca ionul acidului azotos (H 2O+ NO) tetraoxidul de azot (N2O4) şi al Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de aciditatea mediului icircnsă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi detectaţi spectrofotometric (Fig I12) [7]

Fig I11 Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor

mdashmdash 7 mdashmdash

(I17)

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 3: Gonta 1 _ mac.

Introducere

Icircn ultimele decenii s-au efectuat multiple investigaţii urmărindu-se estimarea riscului pentru om al substanţelor cancerigene care persistă icircn mediul ambiant Printre numărul mare de astfel de substanţe un loc deosebit icircl ocupă N-nitrozo compuşii (NNC) dintre care ~ 80 posedă acţiune cancerigenă şi induc apariţia tumorilor maligne practic icircn orice organe ale omului şi animalelor

N-nitrozocompuşii se formează destul de uşor icircn organismul uman mediul ambiant produsele alimentare şi icircn fumul de ţigară Sinteza acestor compuşi se realizează preponderent din amine secundare şi nitriţi sau oxizi de azot

Cercetările ştiinţifice icircn domeniul cancerogenezei acestor compuşi se dezvoltă icircn cacircteva direcţii (1) ndash identificarea noilor cancerigeni activi (2) ndash monitorizarea surselor de NNC cunoscuţi icircn mediul ambiant (3) ndash determinarea mecanismelor de formare a cancirigenilor şi (4) ndash elaborarea metodelor de prevenire a apariţiei şi răspacircndirii agenţilor cancerigeni

Pentru profilaxia şi inhibiţia apariţiei tumorilor pot fi utilizaţi diferiţi antimutageni şi anticancerigeni Cu toate acestea pacircnă icircn prezent rămacircn neclare unele aspecte ale proceselor date la care etape ale procesului de cancerogeneză este posibilă inhibiţia reală ce grupe ale inhibitori chimici sunt mai cu perspectivă pentru utilizarea icircn practică şi studiul anticancerogenezei care sunt mecanismele de acţiune inhibitoare icircn cancerogeneză ce sisteme de testare pot fi recomandate pentru selectarea anticancerigenilor care sunt gradele de corelare a efectelor antimutagenelor şi anti-cancerigenelor şi cum este posibilă extrapolarea rezultatelor experimentale asupra populaţiei Cunoaşterea mecanismelor de formare a N-nitrozocompuşilor elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei agenţilor de nitrozare şi de inhibiţie a procesului de nitrozare a diferitelor substraturi in vitro şi in vivo ar permite stabilirea mecanismelor de formare a substanţelor cancerigene şi elaborarea unui sistem de profilaxie şi de preicircntacircmpinare a dezvoltării diferitelor boli oncologice

Scopul prezentei lucrări rezidă icircn stabilirea mecanismelor de nitrozare icircn sistemele-model şi reale a procedeelor de inhibiţie prin utilizarea diferitelor substanţe obţinute din produse secundare vinicole şi icircn elaborarea metodelor de diminuare a poluării mediului ambiant

Pentru realizarea scopului au fost propuse următoarele sarcini stabilirea mecanismelor de nitrozare a aminelor secundare alifatice heterociclice a amidelor şi determinarea legităţilor cinetice de nitrozare icircn

funcţie de diferiţi parametri cercetarea procesului de formare a NNC la diferite etape de prelucrare şi determinarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului şi fumului de

ţigară cercetarea proceselor de transformare a nitraţilor nitriţilor şi de formare a N-nitrozoaminelor icircn diferite produse alimentare stabilirea particularităţilor de nitrozare enzimatică şi neenzimatică a unor amine şi peptide icircn sucul gastric determinarea legităţilor cinetice de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriţi in vitro şi in vivo şi a mecanismelor de acţiune a unor inhibitori

naturali icircn aceste procese elaborarea metodelor de diminuare a concentraţiei nitriţilor şi nitraţilor ca predecesori ai procesului de nitrozare icircn sisteme-model şi ape

naturale elaborarea metodelor de inhibiţie icircn procesul de formare al N-nitrozocompuşilor prin utilizarea unor reductoni naturali obţinuţi din produse

secundare vinicole şi determinarea activităţii lor antioxidanteantiradicalice

Icircn rezultatul studiilor experimentale pentru prima dată s-a determinat mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse

secundare vinicole pentru prima dată s-a constatat efectul inhibitor al acidului dihridroxifumaric icircn procesul de formare a N-nitrozonornicotinei in vitro şi in vivo s-a stabilit că gradul de inhibiţie icircn procesul de nitrozare a aminelor secundare depinde de natura inhibitorului şi bazicitatea aminei s-a stabilit că tartratul de dipotasiu este un inhibitor mai efectiv icircn procesul de nitrozare a nicotinei comparativ cu acizii citric şi tartric iar

utilizarea lui icircmbunătăţeşte calitatea tutunului aroma fumului şi acţionează pozitiv asupra duratei de ardere a tutunului analiza conţinutului substratului proteic nehidrolizat la proteoliza cazeinei a arătat că hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu utilizat icircn calitate de

inhibitor la nitrozarea metaboliţilor formaţi nu influenţează asupra activităţii enzimelor specifice s-a determinat mecanismul de acţiune a hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu asupra procesului de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni

nitriţi care se bazează pe interacţiunea cu radicalul OH şi HO2

Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn procesul de formare a substanţelor cancerigene prin utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole (acidul dihidroxifumaric hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu rezveratrol esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric) S-a stabilit mecanismul de inhibiţie a nitrozării aminelor secundare alifatice şi ciclice cu ioni nitriţi Au fost elaborate noi metode de inhibiţie icircn oxidarea oxihemoglobinei cu ioni nitriţi cu utilizarea reductonilor obţinuţi din produse secundare vinicole şi s-a stabilit mecanismul acestor procese

Valoarea aplicativă a lucrării este determinată de metodele elaborate pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi nitriţi şi N-nitrozocompuşi icircn apă produse alimentare sacircnge suc gastric tutun şi fum de ţigară

Icircn acest context s-au optimizat condiţiile de utilizare a reducătorilor obţinuţi din produse secundare vinicole pentru inhibiţia proceselor de formare al N-

nitrozocompuşilor s-a stabilit posibilitatea utilizării reducătorilor studiaţi pentru diminuarea concentraţiei NNA din sucului gastric eliminarea N-nitrozoaminelor specifice tutunului la fermentarea şi arderea tutunului s-a efectuat prin utilizarea tartratului de potasiu şi folosirea

diatomitelor din Republica Moldova s-a constatat că utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a acidului tartric icircn dieta alimentară diminuează conţinutul de N-nitrozonornicotină care

se formează la nitrozarea nornicotinei cu ioni nitriţi in vivo s-a stabilit rolul inhibitor al acidului dihidroxifumaric la nitrozarea diureticelor (hidroclortiazida) cu ioni nitriţi icircn sistemele sucului gastric prin

diminuarea concentraţiei nitrozohipotiazidei s-au optimizat condiţiile de tratare a apelor naturale pentru diminuarea concentraţiei ionilor nitraţi şi nitriţi prin metoda electrochimică icircn celula

cu anozi solubili de aluminiu şi anozi insolubili de fier şi magneziu icircn funcţie de concen traţia lor timpul tratării intensitatea curentului electric şi pH-ul soluţiei

introducerea hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu icircn tehnologia de fabricare a salamurilor a micşorat concentraţia ionilor de nitriţi şi nitraţi iar indicele ascorbat care determină proprietatea de reducere a nitriţilor icircn diferite produse creşte odată cu mărirea concentraţiei reducătorilor

mdashmdash 5 mdashmdash

Cuvinte cheie N-nitrozoamine N-nitrozoamide agenţi de nitrozare mecanisme de nitrozare inhibiţia nitrozării reductoni activitate antioxidantăantiradicalică constante de viteză methemoglobină ioni nitriţi şi nitraţi amine amide tutun fum de ţigară N-nitrozoamine specifice tutunului suc gastric metode electrochimice produse alimentare

Lista abrevierilorNNC ndash N-nitrozocompuşi DFH4 ndash acidul dihridroxifumaric DMA ndash dimetilamina DEA ndash dietilamina NDEA ndash N-nitrozodietilamina NDMA ndash N-nitrzodimetilamina NNA ndash N-nitrozoamine DFH3Na ndash hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu MOR ndash morfolina NMOR ndash N-nitromorfolina EDMT ndash esterul dimetilic al acidului tartric EDMD ndash esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric MU ndash N-metilureea NMU ndash N-nitrozometilureea (+)ndashCat ndash (+)ndashcatehina NNN ndash N-nitrozonornicotina NNK ndash 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-1-butanona NNAL ndash acidul 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-butiric NNAC ndash acidul [4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-but-1-il]-β-O-D-glucoziduronic NAST ndash N-nitrozoamine specifice tutunului NPJP ndash N-nitrozopiperidina AAs ndash acid ascorbic AGl ndash acid galic NOCP ndash predecesorii N-nitrozoaminelor ATE ndash analiza termo-energetică PC ndash pigment caratenoidic Alb ndash albumina MetHb ndash methemoglobina HbO2 ndash oxihemoglobina RedH2 ndash compuşi cu proprietăţi reducătoare Red ndash produs de oxidare al RedH2 Rezv ndash rezveratrol DPPHbull ndash 22-difenil-1-picrilhirazil PAR ndash puterea antiradicalică CE50 ndash concentraţia eficientă Cv ndash cvercetina Eneox ndash extract de enotanine din seminţe de struguri ENOXIL - extract de enotanine din seminţe de struguri modificat NVNC ndash N-nitrozoamine volatile SG ndash suc gastric GI ndash grad de inhibiţie EC ndash epicatehina ECG ndash epicatehină galat EGCG ndash epigalocatehingalat EGC ndash epigalocatehină ABTS+bull ndash 22 azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-6-acid sulfonic

mdashmdash 6 mdashmdash

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă

I1 Procese de nitrozare a aminelor

I11 Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine amide) şi acidul azotos Răspacircndirea largă a acestei grupe de compuşi icircn mediul ambiant proprietatea evidenţiată de a provoca tumori icircn diferite organe efectele cancerigen mutagen transplacentar şi alte particularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale şi om Principala primejdie a NNC comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice aflatoxinele bifenilii policloruraţi) este proprietatea de a se forma uşor din predecesori icircn organisme vii şi icircn mediul ambiant

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N) amidelor secundare (RCONHR1O) şi terţiare (RCONR1R2) N-substituenţii ureei (R1HNCONH2) guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) şi uretanii (RR1NCOR) Cei mai răspacircndiţi NNC derivă de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1]

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate icircn ecosistem dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări dar icircn unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii Introducerea excesivă a icircngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu nitraţi uree) poluarea mediului cu oxizi de azot formaţi icircn industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului astfel icircn biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se formează aceşti cancerigeni

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis Rid Mirvish şi Williams) Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la pHlt 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează direct cu aminosubstratul Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează icircn rezultatul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y- care este de exemplu NO2

- Cl- SCN-) cu acidul azotos protonat icircntr-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre (I11 I12 şi I13) [1]

NO2- + H3O+ HNO2 + H2O (I11)

HNO2 + H3O+ H2O + NO+ (I12)

H2O + NO+ + Y- Y-NO + H2O (I13)

R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+ (I14)

R2NH + Y-NO rarr R2NNO + HY (I15)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I14) reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I15) [5] Astfel icircn şirul echilibrelor prezentate direcţia procesului va depinde de pH bazicitatea aminosubstratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y -) Icircn absenţa altor nucleofili ionul nitrit acţionează icircn calitate de catalizator Y- şi icircn acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3 format icircn reacţia chimică

2HNO2 N2O3 + H2O (I16)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I17 [2]

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi de la azot astfel icircn soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec I18) iar constanta de echilibru

reprezintă constanta de bazicitate (kb)

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO- (I18)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi Cu cacirct mai scăzută este bazicitatea aminei cu atacirct se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot

Aminele alifatice sunt baze mai tari decacirct amoniacul datorită grupelor alchil cu efect respingător de electroni (+I s) efect ce măreşte bazicitatea Aminele secundare sunt baze mai tari decacirct aminele primare deoarece conţin două grupări alchil cu efect (+I s) dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică produs de cele trei grupe alchil Aminele aromatice sunt baze mai slabe decacirct amoniacul Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării electronilor neparticipanţi de la atomul de azot icircntr-o conjugare

cu electronii ai nucleului benzenic Pentru aminele studiate icircn prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I11

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că pentru aminele secundare care au pK a gt 5 vitezele reacţiilor de formare a N-nitrozoaminelor calculate după consumul total de amine şi ioni nitriţi au o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximum pentru amine la pH ~ 34 iar pentru aminoacizi ~ 25 [3]

Această dependenţă reflectă influenţa acidităţii mediului reactant asupra concentraţiilor de oxid de azot (III) şi amine neprotonate Totuşi mărimea vitezelor de nitrozare icircn funcţie de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa) care determină partea de amină neprotonată ce participă icircn reacţie

Icircn intervalul de pH2-5 icircn absenţa catalizatorilor (de ex ioni de tiocianat Cl- I-) reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon

Aminocompuşii slab bazici (de ex amidele derivaţii ureei) nu se nitrozează atacirct de activ prin intermediul N2O3 Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu micşorarea pH-ului datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO astfel nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat după următoarea ecuaţie

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I19)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă după cum s-a menţionat mai sus o valoare maximă la pH 3-34

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I110)Viteza de nitrozare a N-alchilureelor N-alchilcarbamaţilor amidelor este proporţională cu

concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec I19) astfel viteza de nitrozare nu manifestă un maxim icircn funcţie de pH dar creşte cu scăderea pH-ului

Se poate constata că icircn general aminele secundare slab bazice N-alchilureele N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid Aminele primare terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai icircncet cu excepţia compusului aminoterţiar aminopiridina care este nitrozată extrem de rapid Viteza de nitrozare depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi

I12 Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc icircn rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu protonii (H + sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO) Icircn soluţii apoase se stabileşte un echilibru icircntre acidul azotos şi oxidul de azot (III) conform ecuaţiei (I16) [5]

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ordmC iar mai tacircrziu prin metoda potenţiometrică spectrofotometrică şi cinetică de către Markovits şi col a cărei valoare este de 30middot10-3 lmiddotmol-1

Reacţia (I16) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atacirct in vivo cacirct şi in vitro icircn particular icircn mediul ambiant produse alimentare şi icircn stomac Protonarea ionilor nitriţi este doar una icircn şirul mare de reacţii ce au loc deoa rece icircn afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare ca ionul acidului azotos (H 2O+ NO) tetraoxidul de azot (N2O4) şi al Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de aciditatea mediului icircnsă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi detectaţi spectrofotometric (Fig I12) [7]

Fig I11 Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor

mdashmdash 7 mdashmdash

(I17)

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 4: Gonta 1 _ mac.

Cuvinte cheie N-nitrozoamine N-nitrozoamide agenţi de nitrozare mecanisme de nitrozare inhibiţia nitrozării reductoni activitate antioxidantăantiradicalică constante de viteză methemoglobină ioni nitriţi şi nitraţi amine amide tutun fum de ţigară N-nitrozoamine specifice tutunului suc gastric metode electrochimice produse alimentare

Lista abrevierilorNNC ndash N-nitrozocompuşi DFH4 ndash acidul dihridroxifumaric DMA ndash dimetilamina DEA ndash dietilamina NDEA ndash N-nitrozodietilamina NDMA ndash N-nitrzodimetilamina NNA ndash N-nitrozoamine DFH3Na ndash hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu MOR ndash morfolina NMOR ndash N-nitromorfolina EDMT ndash esterul dimetilic al acidului tartric EDMD ndash esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric MU ndash N-metilureea NMU ndash N-nitrozometilureea (+)ndashCat ndash (+)ndashcatehina NNN ndash N-nitrozonornicotina NNK ndash 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-1-butanona NNAL ndash acidul 4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-butiric NNAC ndash acidul [4-(metilnitrozoamina)-1-(3-piridil)-but-1-il]-β-O-D-glucoziduronic NAST ndash N-nitrozoamine specifice tutunului NPJP ndash N-nitrozopiperidina AAs ndash acid ascorbic AGl ndash acid galic NOCP ndash predecesorii N-nitrozoaminelor ATE ndash analiza termo-energetică PC ndash pigment caratenoidic Alb ndash albumina MetHb ndash methemoglobina HbO2 ndash oxihemoglobina RedH2 ndash compuşi cu proprietăţi reducătoare Red ndash produs de oxidare al RedH2 Rezv ndash rezveratrol DPPHbull ndash 22-difenil-1-picrilhirazil PAR ndash puterea antiradicalică CE50 ndash concentraţia eficientă Cv ndash cvercetina Eneox ndash extract de enotanine din seminţe de struguri ENOXIL - extract de enotanine din seminţe de struguri modificat NVNC ndash N-nitrozoamine volatile SG ndash suc gastric GI ndash grad de inhibiţie EC ndash epicatehina ECG ndash epicatehină galat EGCG ndash epigalocatehingalat EGC ndash epigalocatehină ABTS+bull ndash 22 azinobis-3-etilbenzo-tiazolin-6-acid sulfonic

mdashmdash 6 mdashmdash

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă

I1 Procese de nitrozare a aminelor

I11 Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine amide) şi acidul azotos Răspacircndirea largă a acestei grupe de compuşi icircn mediul ambiant proprietatea evidenţiată de a provoca tumori icircn diferite organe efectele cancerigen mutagen transplacentar şi alte particularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale şi om Principala primejdie a NNC comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice aflatoxinele bifenilii policloruraţi) este proprietatea de a se forma uşor din predecesori icircn organisme vii şi icircn mediul ambiant

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N) amidelor secundare (RCONHR1O) şi terţiare (RCONR1R2) N-substituenţii ureei (R1HNCONH2) guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) şi uretanii (RR1NCOR) Cei mai răspacircndiţi NNC derivă de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1]

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate icircn ecosistem dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări dar icircn unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii Introducerea excesivă a icircngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu nitraţi uree) poluarea mediului cu oxizi de azot formaţi icircn industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului astfel icircn biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se formează aceşti cancerigeni

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis Rid Mirvish şi Williams) Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la pHlt 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează direct cu aminosubstratul Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează icircn rezultatul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y- care este de exemplu NO2

- Cl- SCN-) cu acidul azotos protonat icircntr-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre (I11 I12 şi I13) [1]

NO2- + H3O+ HNO2 + H2O (I11)

HNO2 + H3O+ H2O + NO+ (I12)

H2O + NO+ + Y- Y-NO + H2O (I13)

R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+ (I14)

R2NH + Y-NO rarr R2NNO + HY (I15)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I14) reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I15) [5] Astfel icircn şirul echilibrelor prezentate direcţia procesului va depinde de pH bazicitatea aminosubstratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y -) Icircn absenţa altor nucleofili ionul nitrit acţionează icircn calitate de catalizator Y- şi icircn acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3 format icircn reacţia chimică

2HNO2 N2O3 + H2O (I16)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I17 [2]

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi de la azot astfel icircn soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec I18) iar constanta de echilibru

reprezintă constanta de bazicitate (kb)

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO- (I18)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi Cu cacirct mai scăzută este bazicitatea aminei cu atacirct se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot

Aminele alifatice sunt baze mai tari decacirct amoniacul datorită grupelor alchil cu efect respingător de electroni (+I s) efect ce măreşte bazicitatea Aminele secundare sunt baze mai tari decacirct aminele primare deoarece conţin două grupări alchil cu efect (+I s) dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică produs de cele trei grupe alchil Aminele aromatice sunt baze mai slabe decacirct amoniacul Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării electronilor neparticipanţi de la atomul de azot icircntr-o conjugare

cu electronii ai nucleului benzenic Pentru aminele studiate icircn prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I11

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că pentru aminele secundare care au pK a gt 5 vitezele reacţiilor de formare a N-nitrozoaminelor calculate după consumul total de amine şi ioni nitriţi au o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximum pentru amine la pH ~ 34 iar pentru aminoacizi ~ 25 [3]

Această dependenţă reflectă influenţa acidităţii mediului reactant asupra concentraţiilor de oxid de azot (III) şi amine neprotonate Totuşi mărimea vitezelor de nitrozare icircn funcţie de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa) care determină partea de amină neprotonată ce participă icircn reacţie

Icircn intervalul de pH2-5 icircn absenţa catalizatorilor (de ex ioni de tiocianat Cl- I-) reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon

Aminocompuşii slab bazici (de ex amidele derivaţii ureei) nu se nitrozează atacirct de activ prin intermediul N2O3 Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu micşorarea pH-ului datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO astfel nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat după următoarea ecuaţie

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I19)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă după cum s-a menţionat mai sus o valoare maximă la pH 3-34

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I110)Viteza de nitrozare a N-alchilureelor N-alchilcarbamaţilor amidelor este proporţională cu

concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec I19) astfel viteza de nitrozare nu manifestă un maxim icircn funcţie de pH dar creşte cu scăderea pH-ului

Se poate constata că icircn general aminele secundare slab bazice N-alchilureele N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid Aminele primare terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai icircncet cu excepţia compusului aminoterţiar aminopiridina care este nitrozată extrem de rapid Viteza de nitrozare depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi

I12 Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc icircn rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu protonii (H + sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO) Icircn soluţii apoase se stabileşte un echilibru icircntre acidul azotos şi oxidul de azot (III) conform ecuaţiei (I16) [5]

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ordmC iar mai tacircrziu prin metoda potenţiometrică spectrofotometrică şi cinetică de către Markovits şi col a cărei valoare este de 30middot10-3 lmiddotmol-1

Reacţia (I16) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atacirct in vivo cacirct şi in vitro icircn particular icircn mediul ambiant produse alimentare şi icircn stomac Protonarea ionilor nitriţi este doar una icircn şirul mare de reacţii ce au loc deoa rece icircn afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare ca ionul acidului azotos (H 2O+ NO) tetraoxidul de azot (N2O4) şi al Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de aciditatea mediului icircnsă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi detectaţi spectrofotometric (Fig I12) [7]

Fig I11 Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor

mdashmdash 7 mdashmdash

(I17)

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 5: Gonta 1 _ mac.

Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă

I1 Procese de nitrozare a aminelor

I11 Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine amide) şi acidul azotos Răspacircndirea largă a acestei grupe de compuşi icircn mediul ambiant proprietatea evidenţiată de a provoca tumori icircn diferite organe efectele cancerigen mutagen transplacentar şi alte particularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale şi om Principala primejdie a NNC comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aromatice policiclice aflatoxinele bifenilii policloruraţi) este proprietatea de a se forma uşor din predecesori icircn organisme vii şi icircn mediul ambiant

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi ce includ majoritatea aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N) amidelor secundare (RCONHR1O) şi terţiare (RCONR1R2) N-substituenţii ureei (R1HNCONH2) guanidinele (R1HNC(=NH)NH2) şi uretanii (RR1NCOR) Cei mai răspacircndiţi NNC derivă de la aminele secundare (RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1]

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate icircn ecosistem dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări dar icircn unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii Introducerea excesivă a icircngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu nitraţi uree) poluarea mediului cu oxizi de azot formaţi icircn industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului astfel icircn biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se formează aceşti cancerigeni

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro (Challis Rid Mirvish şi Williams) Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la pHlt 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează direct cu aminosubstratul Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează icircn rezultatul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y- care este de exemplu NO2

- Cl- SCN-) cu acidul azotos protonat icircntr-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre (I11 I12 şi I13) [1]

NO2- + H3O+ HNO2 + H2O (I11)

HNO2 + H3O+ H2O + NO+ (I12)

H2O + NO+ + Y- Y-NO + H2O (I13)

R2NH2+ + H2O R2NH + H3O+ (I14)

R2NH + Y-NO rarr R2NNO + HY (I15)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I14) reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I15) [5] Astfel icircn şirul echilibrelor prezentate direcţia procesului va depinde de pH bazicitatea aminosubstratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y -) Icircn absenţa altor nucleofili ionul nitrit acţionează icircn calitate de catalizator Y- şi icircn acest caz speciile reactive sunt oxidul de azot N2O3 format icircn reacţia chimică

2HNO2 N2O3 + H2O (I16)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg iar mecanismul general de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I17 [2]

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi de la azot astfel icircn soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec I18) iar constanta de echilibru

reprezintă constanta de bazicitate (kb)

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO- (I18)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi Cu cacirct mai scăzută este bazicitatea aminei cu atacirct se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot

Aminele alifatice sunt baze mai tari decacirct amoniacul datorită grupelor alchil cu efect respingător de electroni (+I s) efect ce măreşte bazicitatea Aminele secundare sunt baze mai tari decacirct aminele primare deoarece conţin două grupări alchil cu efect (+I s) dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică produs de cele trei grupe alchil Aminele aromatice sunt baze mai slabe decacirct amoniacul Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării electronilor neparticipanţi de la atomul de azot icircntr-o conjugare

cu electronii ai nucleului benzenic Pentru aminele studiate icircn prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I11

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că pentru aminele secundare care au pK a gt 5 vitezele reacţiilor de formare a N-nitrozoaminelor calculate după consumul total de amine şi ioni nitriţi au o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximum pentru amine la pH ~ 34 iar pentru aminoacizi ~ 25 [3]

Această dependenţă reflectă influenţa acidităţii mediului reactant asupra concentraţiilor de oxid de azot (III) şi amine neprotonate Totuşi mărimea vitezelor de nitrozare icircn funcţie de pH depinde de bazicitatea aminei (pKa) care determină partea de amină neprotonată ce participă icircn reacţie

Icircn intervalul de pH2-5 icircn absenţa catalizatorilor (de ex ioni de tiocianat Cl- I-) reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon

Aminocompuşii slab bazici (de ex amidele derivaţii ureei) nu se nitrozează atacirct de activ prin intermediul N2O3 Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu micşorarea pH-ului datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O+ NO astfel nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat după următoarea ecuaţie

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I19)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă după cum s-a menţionat mai sus o valoare maximă la pH 3-34

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I110)Viteza de nitrozare a N-alchilureelor N-alchilcarbamaţilor amidelor este proporţională cu

concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec I19) astfel viteza de nitrozare nu manifestă un maxim icircn funcţie de pH dar creşte cu scăderea pH-ului

Se poate constata că icircn general aminele secundare slab bazice N-alchilureele N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid Aminele primare terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai icircncet cu excepţia compusului aminoterţiar aminopiridina care este nitrozată extrem de rapid Viteza de nitrozare depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi

I12 Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc icircn rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu protonii (H + sau H3O+) cu formarea acidului azotos (HONO) Icircn soluţii apoase se stabileşte un echilibru icircntre acidul azotos şi oxidul de azot (III) conform ecuaţiei (I16) [5]

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ordmC iar mai tacircrziu prin metoda potenţiometrică spectrofotometrică şi cinetică de către Markovits şi col a cărei valoare este de 30middot10-3 lmiddotmol-1

Reacţia (I16) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atacirct in vivo cacirct şi in vitro icircn particular icircn mediul ambiant produse alimentare şi icircn stomac Protonarea ionilor nitriţi este doar una icircn şirul mare de reacţii ce au loc deoa rece icircn afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare ca ionul acidului azotos (H 2O+ NO) tetraoxidul de azot (N2O4) şi al Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de aciditatea mediului icircnsă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi detectaţi spectrofotometric (Fig I12) [7]

Fig I11 Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor

mdashmdash 7 mdashmdash

(I17)

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 6: Gonta 1 _ mac.

Fig I12 Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protoniiLa pHle2 este important cationul H2O+NO care este predominant icircn reacţia de nitrozare Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil icircn mediul bazic (ec I111)

NO+ + OHoline HNO2 NO2oline + H+ (I111)

Icircn mediul acid echilibrul (I112) este deplasat icircn dreapta şi N2O3 se transformă icircn ionul de nitrozoniu

N2O3 + 2H+ 2NO+ + H2O (I112)

Acest echilibru a fost determinat icircn baza studierii absorbţiei icircn UV a ionului nitrit la diferite pH-uri La valori ale pHlt7 icircn soluţia de ioni nitriţi icircn regiunea UV = 225 nm absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului pacircnă la pH 2 absorbţia HNO2 scade deoarece are loc formarea N2O3 care nu absoarbe icircn regiunea dată Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pHlt2) absorbţia creşte fapt cauzat de apariţia icircn sistem a NO+ care absoarbe icircn regiunea dată a spectrului Icircn acelaşi timp apariţia NO+ a fost depistată icircn sistem deja de la pH 30 Pentru reacţiile ce decurg la pH moderat (pH 3) N2O3 apare ca reagent principal icircn procesul de nitrozare Oxidul de azot (III) este instabil şi se descompune la icircncălzire la un amestec de oxid de azot (II) şi oxid de azot (IV) (Fig 1I2 etapa VI) [8]

Acidul azotos poate fi oxidat pacircnă la ion nitrat (ec I113) icircn rezultatul diferitelor procese chimice sau redus la oxid de azot (II) (I114) [1]HNO2 + H2O rarr NO3oline + 3H+ + 2 eoline (E = -094 V) (I113)HNO2 + H+ + eoline rarr NO + H2O (E = -10 V) (I114)Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan sau clorul iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi icircn mediul alcalinNO2

- + 2OHoline rarr NO3oline + H2O + 2 eoline (E =001 V) (I115)Acidul azotos poate fi uşor redus pacircnă la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto rilor anorganici aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+) fier (Fe2+) (Ioline) şi bisulfit (HSO3oline) şi al compuşilor

organici ca acidul ascorbic polifenolii tiolii şi al Comportarea acidului azotos icircn prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor pH-ul mediului şi temperatură Astfel icircn reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se produce NO şi sulfură icircn soluţii acide ndash amoniac şi sulfură icircn soluţie-tampon de bicarbonat şi amoniac ndash sulfură şi tiosulfat [8]

Mai mult ca atacirct acidul azotos poate fi redus pacircnă la azot liber icircn prezenţa amoniacului aminelor primare (RNH2) amidelor (RCONH2) hidrazinei (H2NNH2) ureei (H2NCONH2) acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec I116)

XNH2 + HNO2 rarr N2 + H2O + XOH (I116)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro cesul de fotoliză sau radioliză icircn rezultat obţinem amestec de NO bull şi NO2bull care icircn continuare este

icircn echilibru cu N2O3 [8]

(I117)

Oxidul de azot (III) generat din acidul azotos atacă substratul (S) conform reacţiei (I118) iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I119) unde K este constanta de echilibru

N2O3 + S S+ - NO + NO2oline (I118)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I119)Pentru concentraţii mari ale substratului (S) viteza reacţiei I118 este cu mult mai mare decacirct viteza de hidroliză a N2O3 Astfel etapa limită devine formarea N2O3 icircn reacţia (I110) unde expresia vitezei va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi Pentru concentraţia substratului ndash de ordinul zero

[510]W = kprime [HNO2]2 (I120)

Constanta kprime a fost calculată pentru diferite substraturi N-metilanilină 12-dimetilindol acid ascorbic hidroxilamină Valoarea kprime este aproximativ constantă şi egală cu 91 l∙mol -1∙s-

1 la 25ordmC şi cu 081 l∙mol-1∙s-1 la 0ordmC [11]Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a acidului azotos care la racircndul său reacţionează rapid cu anionul B - formacircnd BNO iar ultimul la

interacţiunea cu ionul nitrit duce la formarea N2O3 [11]

(I121)

(I122)

(I123)

O schemă similară poate fi prezentată şi icircn cazul cacircnd este implicat ionul de nitrizoniu

I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii de animale şobolani şoareci epuri păsări peşti icircn diferite organe precum vezica urinară rinichi ficat esofag sau stomac [91213] N-alchilnitrozoaminele pot induce tumori tot atacirct de uşor şi icircn organismul uman Icircn primul racircnd expunerea la N-alchil nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric colon vizicei urinare [14-16] Icircn al doilea racircnd biotransformarea şi activitatea biolo gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17] Agenţia Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA şi aşa cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om) Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19] Icircn acest context legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită Studiul procesului de nitrozare a DMA a fost iniţiat icircn 1972 de către Taylor şi Price dar a fost studiată mai icircntacirci descompunerea NDMA icircnsă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de pH nu a fost studiată Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost studiată de Mirvish [10] la pH 34 t = 25ordmC icircn prezenţa soluţiei-tampon după formarea NDMA Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3 sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 (I124)unde constanta de viteză (k) este independentă de pH icircnsă concentraţia DMA şi HNO2 trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului Concentraţia de NaNO2 utilizată icircn sistem a fost variată icircn intervalul 002 ndash 0125M iar concentraţia DMA ndash 002M

Pentru a simplifica calculele viteza procesului a fost determinată după concen traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant cacircnd raportul icircntre amină şi HNO 2 ionizat şi neionizat nu variază

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I125)

mdashmdash 8 mdashmdash

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Procesul de nitrozare s-a studiat timp de 90 min pacircnă cacircnd icircn sistem s-a instaurat un echilibru Dacă calculăm concentraţia NMU la echilibru constatăm că icircn funcţie de pH concentraţia NMU creşte cu micşo rarea pH-ului de la 0045times10-4M (pH 4) pacircnă la 035times10-4M (pH 1) S-a calculat conţinutul format de NMU (icircn ) faţă de concentraţia totală a amidei S-a constatat că cota-parte a NMU creşte de la 45 pentru pH 4 pacircnă la 35 (pH 1) (Tab I31)

Tabelul I31

Dependenţa concentraţiei NMU formate şi constanta de viteză (k1) icircn funcţie de pHpH [NO2

-]x104 M [MU] x104 M [NMU]Ex104 M NMU k1 M-2min-1

10 10 10 035 350 4166

2010 10

017 170 1923

3010 10

009 90 75times103

4010 10

0045 45 705times104

Fig I32 Viteza de formare a NMU icircn funcţie de pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M

Viteza de formare a NMU la fel s-a studiat icircn funcţie de concentraţia [NO 2-]0 şi [MU]0 Rezultatele experimentale indică la faptul că viteza de nitrozare a MU creşte icircn intervalul

(278-747)times10-8M∙s-1 odată cu mărirea [NO2-]0 de la 5middot10-5 M pacircnă la 1middot10-4 M [102] Nitrozarea s-a efectuat la pH 1 Rezultatele obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I32

Tabelul I32

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU icircn funcţie de [MU]0 şi [NO2-]0

V = f [MU] [NO2-]0 = 1x10-4M pH 10 V = f [NO2

-] [MU]0 = 1x10-4M pH 10

[MU]0x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M [NO2-]0 x104M Vx108Mmiddots-1 [NMU]times105M

100 313 193 050 278 167

065 260 156 500 503 302

030 208 125 1000 747 448

Procesul de nitrozare a MU s-a studiat la fel după variaţia [NO2-] icircn sistem icircn funcţie de pH-ul mediului icircn următoarele condiţii [NO2

-] = 1times10-4M [MU] = 1times10-4M pH 10-40 t = 37ordmC Prin metoda Griess [88] s-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn procesul de nitrozare Icircn rezultatul acestui studiu experimental s-a confirmat că viteza procesului de nitrozare calculată după variaţia [NO2

-] la fel scade cu creşterea pH-ului (Tab I33)Tabelul I33

Dependenţa [NO2-] la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M pH 10-40 t = 37ordmC

mdashmdash 29 mdashmdash

pH[NO2

-]x105M (la echilibru)

[NO2-]x105M

(consumat)

10 05 95

20 25 75

30 65 35

40 70 30

Datele experimentale obţinute cuprinse icircn Tabelul I33 corelează cu cele prezentate icircn Tabelul I31 icircn care viteza a fost calculată după variaţia [NMU] cu cacirct este mai mare [H +]0

icircn sistem cu atacirct este mai mică [NO2-] neconsumat adică viteza de nitrozare creşte cu creşterea [H+]

Viteza de nitrozare a MU (după variaţia [NO2-]) icircn funcţie de [MU]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M şi [NO2

-]0 icircn intervalul (10ndash75)times10-5M este o linie dreaptă ce trece prin centrul de coordonate Astfel constatăm icircncă o dată că reacţia de nitrozare este de ordinul unu după [NO2

-]0 şi [MU]0Mecanismul de nitrozare a MU Din datele experimentale de mai sus s-a obţinut expresia pentru viteza experimentală de nitrozare a MU

Vex = χ [NO2-] [CH3-NH-CO-NH2] [H+] (I33)

După cum am menţionat (ec I11-I13) icircn sistem se pot forma diferiţi agenţi de nitrozare (N 2O3 şi NO+) al căror conţinut conform ecuaţiilor (I11) (I12) (I16) depinde de pH-ul mediului

[N2O3] = K4 [HNO2]2 [H2O] (I34)[NO+] = K5 [HNO2] [H+] [H2O] (I35)

Nitrozarea MU poate avea loc după următoarele reacţii

CH3-NH-CO-NH2 + N2O3 CH3-N(NO)-CO-NH2 + HNO2 (I36)

CH3-NH-CO-NH2 + NO+ CH3-N(NO)-CO-NH2 + H+ (I37)

Pentru a determina mecanismul de nitrozare a MU la pHlt2 determinăm expresia vitezei reacţiei de nitrozare Viteza experimentală pentru reacţia de nitrozare a MU poate fi redată prin expresia

VNMU = χ1 [MU] [NO2-] [H+] (I38)[MU] ndash concentraţia totală a MU

VNMU = χ2 [CH3NHCONH2] [NO2-] [H+] (I39)

[CH3NHCONH2] ndash concentraţia formei neprotonate a MULa nitrozarea MU icircn funcţie de pH poate participa NO+ sau N2O3 Pentru a determina care este agentul de nitrozare pentru condiţiile date scriem ecuaţia vitezei de nitrozare a MU

cu N2O3 şi cu NO+ V6 = k6 [N2O3] [CH3NHCONH2] (I310) V7 = k7 [NO+] [CH3NHCONH2] (I311)

Viteza sumară a procesului de nitrozare a MU poate fi determinată ca suma V6 + V7

WNMU = + V7NO+ = k6 [N2O3] [MU] + k7 [NO+] [MU] (I312)

Icircnlocuind din (I34) şi (I35) expresia pentru concentraţia N2O3 şi NO+ obţinem expresia vitezei din care calculăm constantele de viteză pentru nitrozarea cu N2O3 (k6) şi NO+ (k7)

(I313)

unde K4 = 3 middot 10-3 dm3 M-1 K6 = 837 middot 106 M-1 s-1

K5 = 3 middot 10-7 dm3 M-1 K7 = 436 middot 108 M-1 s-1

Astfel constatăm [133134] că la procesul de nitrozare a MU cu NO2- icircn intervalul de pH1-2 icircn calitate de agent de nitrozare participă cationul de nitrozoniu (NO +) deoarece K7

gtgtK6 iar cu micşorarea pH-ului are loc creşterea [NO+]

Reacţia de nitrozare a MU decurge după mecanismul caracteristic compuşilor slab bazici Conform proprietăţilor acestor compuşi ei nu sunt atacirct de activi ca să se combine cu

oxidul de azot N2O3 La pHlt2 MU se nitrozează prin interacţiunea substratului neprotonat cu cationul de nitrozoniu (NO+) sau cu cationul hidratat H2ONO+ adică procesul de nitrozare a MU are loc icircn rezultatul catalizei acide [135136]

I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureeiIcircn lucrările experimentale s-a studiat influenţa compuşilor de natură reducătoare asupra procesului de formare a N-nitrozometilureei icircn sistemul NO 2

- şi MU Icircn procesul de nitrozare a MU icircn prezenţa hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu s-au utilizat diferite concentraţii de inhibitor icircn intervalul (5times10-5 - 1times10-4) M şi controlul (fără inhibitor) Curbele cinetice de formare a NMU s-au obţinut la pH 1 [NO2

-] = 1x10-4M [MU] = 1x10-4M (Fig I33)Din datele obţinute constatăm [134137] că DFH3Na are un efect inhibitor icircn sistemul dat şi cu creşterea concentraţiei lui scade conţinutul de NMU formată adică se micşorează

viteza procesului de nitrozare (Tab I34) Dacă calculăm cota-parte de MU nitrozată reieşind din concentraţia totală iniţială (adică forma protonată şi nepro tonată) constatăm că conţinutul de NMU formată scade de la 33 la 16 la creşterea [DFH3Na]0 pacircnă la 1times10-4M (Tab I34)

Tabelul I34Dependenţa vitezei de nitrozare a MU şi [NMU] la echilibru

icircn funcţie de [DFH3Na]0 pH 10 t = 37ordmC[DFH3Na] x104M

[MU]x104M

[NMU]x104M

[NMU] Vx108M s-1 k

M-2s-1

10 10 016 16 1875 14705 10 021 21 240 12501 10 029 29 3125 7000 10 033 33 354 55

mdashmdash 30 mdashmdash

(I314)

0

05

1

15

2

25

3

35

4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

timp min

[NM

U]

10^

-5 M

[DFHNA]o= 0 M [DFHNA]o= 110 -5 M

[DFHNA]o= 510 -5 M [DFHNA]o= 110 -4 M

Fig I33 Curbele cinetice de formare a NMU icircn funcţie de [DFH4]0[NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10

Icircn acelaşi mod a fost studiată cinetica procesului de inhibiţie sub acţiunea (+)-Ct utilizacircnd metoda extracţională ndash spectrofotometrică (la λ = 235 nm) concentraţiile substratului şi agentului de nitrozare au fost egale cu 1x10 -4M Rezultatele experimentale obţinute au demonstrat că cantitatea formată de NMU la echilibru şi viteza iniţială scade odată cu creşterea concentraţiei de inhibitor (Fig I34 Tab I35)

Tabelul I35

Dependenţa vitezei de nitrozare a MU de [Ct]0 pH 10 t = 37ordmC

[NO2-] = 10ndash4M [MU] = 10ndash4M

Fig I34 Randamentul reacţiei de nitrozare a MU icircn funcţie de [Ct]0 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-4M pH 10 t = 37ordmC

Mecanismul de inhibiţie ce are loc icircn prezenţa (+)catehinei sau DFH3Na icircn procesul de nitrozare a MU include interacţiunea agenţilor de nitrozare cu inhibitorii Icircn rezultat are loc transformarea agentului de nitrozare (NO+) icircn oxid de azot II care nu posedă astfel de proprietăţi (ec I315)

[Ct]x105M [NMU] Vx108M s-1

0 100 350

10 92 247

50 80 190

100 50 161

mdashmdash 31 mdashmdash

50

30

8

15

3545

167

6

0

10

20

30

40

50

60

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

[NO2-] remanentă WNO2-

Dacă comparăm vitezele pentru aceiaşi parametri icircn prezenţa DFH3Na şi (+)-Ct (Tab I34 I35) constatăm că viteza de nitrozare a MU icircn prezenţa (+)-Ct este mai mică Cota-parte de NMU formată icircn sistem scade odată cu creşterea pH-ului icircn intervalul 1-4 datorită creşterii vitezei de nitrozare a MU odată cu creşterea [H+]0 iar NMU la echilibru scade odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I34)

Inhibiţia procesului de formare a NMU a fost studiată la fel după consumul nitriţilor icircn sistem icircn funcţie de natura reducătorilor S-a constatat că concentraţia remanentă de ioni nitriţi este minimă icircn cazul DFH4 iar viteza de consum NO2

- este minimă icircn cazul cacircnd [Inh]0 = 0

Fig I35 Viteza de consum a NO2

-

şi [NO2-]

reman icircn funcţie de natura

Inh [MU]0 = 1x10-

4M [NO2-]0 =

1x10-4M pH 26 t = 37ordmC

Viteza de consum a ionilor nitriţi este mai mare ca viteza de formare a NMU Icircn sistemul NO2

- ndash MU activitatea inhibitoare creşte icircn şirul

DFH3

Na lt (+) ndash Ct lt DFH4

mdashmdash 32 mdashmdash

Wx1

07 M

s-1

[NO

2- ] re

m

(I315)

I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei

Proprietăţile cancerigene ale alchilnitrozoureelor sunt cunoscute timp de peste douăzeci de ani Majoritatea N-nitrozoureelor se supun descompunerii hidrolitice icircn mediul apos Există un şir de mecanisme de hidroliză care determină viteza proceselor şi compoziţia produselor Realizarea acestor mecanisme depinde de factori ca pH-ul compoziţia ionică şi organică a mediului structura chimică a compusului prezenţa grupelor hidroxile Hidroliza este catalizată de prezenţa atacirct a acizilor cacirct şi a bazelor

Pentru mono- şi bisubstituenţi ai ureei ca primă etapă a descompunerii hidroli tice se consideră ruperea protonului amidic de la atomul de azot de către bază (B -) iar anionul format se rupe formacircnd diazotat şi izocianat [140141]

Diazotaţii formaţi la hidroliza N-nitrozoureelor au o mare importanţă deoarece icircn rezultatul unor transformări au loc procese ce duc la transferul compuşilor alchil for maţi asupra

centrelor nucleofile Icircn calitate de intermediari electrofili alchilici formaţi sunt posibili diazocianii acizii alchilcarbonici şa [140] care icircn continuare pot interacţiona cu ADNIzocianaţii formaţi la fel sunt reagenţi electrofili dar ei sunt mai stabili şi nu interacţionează cu ADN Ei mai des interacţionează cu proteinele decacirct cu acizii nucleiciIcircn medii acide principala cale de descompunere hidrolitică este denitrozarea catalizată de prezenţa acizilor şi care are loc conform unui mecanism ionic [141] Etapa limitativă

care determină viteza procesului este protonarea substratuluiDescompunerea N-nitrozometilureei catalizată de acizi are loc cu formarea NO+ şi metilureei după următorul mecanism [142]

H3O+ + CH3N(NO)CONH2 H2O + CH3N+H(NO)CONH2 (I317)

CH3N+H(NO)CONH2 + X XNO+ + CH3NHCONH2 (I318) NO+ + CH3NHCONH2

Icircn cercetările cinetice experimentale ale procesului de descompunere fotochimică a NMU a fost utilizată lampa cu mercur DRSH-50 Fotoliza NMU a fost studiată la lungimi de undă monocromatice diferite (λ = 235 nm λ = 360 nm) şi la iradiere totală Investigaţiile cinetice ale descompunerii NMU icircn funcţie de

diferiţi parametri fizico-chimici au fost efectuate icircn următoarele intervale de concentraţie [NMU]o = 1middot10-5-2middot10-4 moll T = 10-60ordmC pH 10-100

Denitrozarea NMUDin rezultatele cinetice prezentate icircn Figura I37 constatăm că procesul de denitrozare a NMU se intensifică odată cu creşterea temperaturii Viteza procesului de denitrozare

depinde de intensitatea razelor UV şi de concentraţia ionilor de hidrogenConform [142143] momentul de dipol al unui şir de NNA alifatice este de 39ndash44 D Fapt ce atestă polaritatea acestor molecule determinată de delocalizarea perechii de electroni de

la azot ceea ce atrage după sine capacitatea de dislocare a perechilor de electroni comuniR R

R R

Structura şi mobilitatea relativ icircnaltă a π-electronilor icircn moleculele de NNC determină reactivitatea lor icircnaltă Icircn condiţii acide viteza de descompunere a NMU se măreşte datorită deplasării echilibrului (ec I320) icircn dreapta

CH3 CH3 CH3

Icircn rezultatul formării cationului de nitrozoniu care este un agent de nitrozare poate avea loc procesul invers de nitrozare şi icircn consecinţă odată cu creşterea [H+] viteza de reacţie suferă o variaţie neicircnsemnată (Fig I36)

Icircn condiţii bazice reacţia devine ireversibilă şi viteza de descompunere a NMU se măreşte brusc Cationul NO + (icircn forma H2NO2+) este legat de particulele icircncărcate negativ B -

conform reacţiei H2NO2

+ + B- rarr NO+B- + H2O (I321)

Aceste circumstanţe pot fi evidenţiate la examinarea relaţiei dintre pH şi viteza de descompunere a NMU ( Fig I36) După cum se observă viteza minimă de descompunere corespunde pH 34 Dacă la pH lt 4 viteza de descompunere a NMU suferă o variaţie neicircnsemnată la micşorarea pH atunci la pH gt 5 viteza creşte exponenţial [115 127130]

Fig I36 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de pH [NMU] = 1x10-4 moll t = 25ordmC

Fig I37 Viteza de descompunere a NMU icircn funcţie de temperatură [NMU] = 1x10-4 moll pH 57

Ecuaţia vitezei de descompunere a NMU pentru diferite valori ale pH este determinată de relaţia W = -d[NMU]dt = (kn + kH [H]+ + kOH [OH] bull [NMU]o (I322)

unde kn- este constanta de viteză pentru descompunerea NMU la pH 57 egală cu 02x10 -5 s-1 kH

- ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu acid egală cu 272middot10 -9 lmol∙s

kOH ndash constanta de viteză pentru descompunerea NMU icircn mediu bazic egală cu 535middot10-2 lmol∙s [115130] Influenţa temperaturii asupra vitezei de descompunere a NMU este ilustrată icircn Figura I37 iar valorile calculate ale constantelor vitezei de descompunere pentru diferite valori ale temperaturii sunt prezentate icircn Tabelul I36

Tabelul I36

mdashmdash 33 mdashmdash

(I316)

(I319)N ndash N = 0 N+ ndash N =

(I320)

Constantele vitezei de descompunere a NMU icircn f(to)t degC 1 15 25 40 50 60

ko x105 s-1 01 068 159 256 418 636

Rezultatele prezentate icircn Figura I37 şi icircn Tabelul I36 demonstrează creşterea vitezei şi a constantei de viteză pentru procesul de descompunere a NMU odată cu mărirea temperaturii Energia de activare calculată Ea este de 5980 kJmol Descompunerea NMU sub acţiunea radiaţiei UV are loc cu mult mai rapid decacirct sub acţiunea luminii solare obişnuite Aceasta este cauzată de ruperea legăturii gtN-Nlt sub acţiunea razelor UV Folosind ecuaţia lui Arenius la construirea dependenţei k n icircn funcţie de t (oC) icircn coordonatele ln kn icircn f(1t) a fost calculată energia de activare (Ea) pentru iradierea cu raze UV care este de 4761 kJmol [130]

Este cunoscut că N-nitrozoureele se supun uşor descompunerii fotochimice Icircn medii aprotonate prima etapă icircn procesul de denitrozare fotochimică este ruperea ho molitică a legăturii icircntre atomii de azot cu formarea oxidului de azot (II) şi a radicalului ureei [140] Icircn lipsa luminii nu are loc denitrozarea spontană

Calculele cuanto-mecanice efectuate pentru NMU şi alţi derivaţi denotă că icircn forma redusă anion-radicalică legătura icircntre atomii de azot este mai slabă decacirct icircn starea de bază Ţinacircnd cont de acest fapt s-a presupus că reducerea monoelectronică trebuie să ducă la ruperea grupării nitrozo- ceea ce a fost constatat prin metodele RES şi RMN [143]

Viteza de descumpunere a NMU icircn funcţie de concentraţia acesteia icircn cazul ira dierii cu raze UV (spectru complet) cu raze λ = 360 nm şi cu raze λ = 235 nm este pre zentată icircn Figura I38

N-nitrozoaminele pot produce NO la ruperea homolitică a legăturii N-NO şi la ruperea heterolitică produc NO + Realizarea acestor produşi formaţi la descompunere din NNA icircn soluţii poate fi stabilită cu utilizarea metodei Griess [143] Icircn spectrul vizibil (λ = 535 nm) are loc formarea diazocompuşilor la interacţiunea reagentului Griess cu NO 2

- ultimul formacircndu-se la oxidarea speciilor NO şi NO+

Fig I38 Viteza de transformare fotochimică a NMU sub influenţa razelor UVicircn funcţie de [NMU]0 pH 57 t = 20ordmC

Astfel denitrozarea NMU a fost studiată după acumularea ionilor nitriţi care se pot forma icircn rezultatul oxidării NO cu oxigen Valorile vitezelor de descompunere a NMU stabilite pentru diferite tipuri de iradieri icircn aceleaşi condiţii experimentale (concentraţii de NMU pH şi temperaturi) pot fi aranjate conform şirului [130]

W1 gt W2 gt W3 gt Wo (I324)unde W1 ndash viteza de descompunere sub acţiunea spectrului UV complet W 2 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nm W3 ndash viteza de descompunere sub acţiunea razelor UV cu λ = 360 nm Wo ndash viteza de descompunere icircn lipsa iradierii Icircn Tabelul I37 sunt prezentate constantele de viteză pentru procesul de descompunere a NMU sub acţiunea razelor UV [130]

Tabelul I37

Constantele de viteză icircn procesul de descompunere a NMU

Constantele transformării NMU Condiţiile experimentale Valoarea constantei

ko 1s Lipsa iradierii 159∙10-5

k1 1s Spectrul UV complet 230middot10-5

k2 1s λ = 235 nm 91middot10-5

k3 1s Λ = 360 nm 24middot10-5

Din rezultatele prezentate icircn acest Tabel constatăm că NMU se descompune mai rapid sub acţiunea razelor UV cu λ = 235 nmPrin analogie cu procesul de nitrozare s-a studiat influenţa diferitelor adaosuri asupra denitrozării NMU şi anume a ionilor metalelor Fe(II) Cu(II) Mn(II) a redu cătorilor (acidul

ascorbic dehidroxifumaratul de sodiu reductonul trioză) a oxidanţilor (peroxidul de hidrogen reagentul Fenton) Concentraţiile ionilor metalelor au fost variate icircn limitele 10middot10 -7ndash50middot10-5

moll Efectul reducătorilor şi al oxidanţilor a fost investigat icircn limitele 10middot10-6ndash50middot10-4 moll [116]

mdashmdash 34 mdashmdash

(I323)

Icircn limitele concentraţiilor descrise nu s-a observat nici o schimbare a vitezei de descompunere a NMU S-a constatat că icircn absenţa catalizatorilor (acizi baze) NMU nu se reduce cu astfel de reducători cum este ascorbatul ditionitul Icircn organismele vii rolul principal icircn denitrozarea alchilureelor icircl are NADP-H citocrom-P450-reductaza enzimă (transfer monoelectronic) ce posedă activitate de reductază iar icircn calitate de donor de electroni este NADP-H

Concluzii Principala contribuţie icircn procesul de nitrozare a metilureei o are reacţia ce implică ionul de nitrozoniu NO+ Agentul de nitrozare N2O3

reacţionează mai lent Constantele experimentale de viteză ale interacţiunii NO+ şi N2O3 cu metilureea sunt egale cu 436middot108 M-1s-1 şi 835middot106 M-1s-1 respectiv Viteza de formare a NMU se măreşte (spre deosebire de aminele secundare) odată cu mărirea concentraţiei H + Icircn diapazonul de pH de la 10 la

40 viteza are valoarea maximă la pH 10 Utilizarea acidului dihidroxifumaric şi a (+)catehinei icircn procesul de nitrozare a MU cu NO2

- duce la micşorarea cantităţii de NMU formată Activitatea inhibitoare a acidului dihidroxifumaric este mai icircnaltă decacirct cea a (+)catehinei

La descompunerea NMU are loc procesul de delocalizare a electronilor ce aparţin atomului de azot cu rupere ulterioară a legăturii gtN-Nlt sub influenţa temperaturii şi iradierii cu raze UV

Au fost calculate constantele de descompunere a NMU icircn funcţie de pH temperatură şi pentru diferite domenii de iradiere S-a constat că constanta vitezei de descompunere a NMU icircn procesul fotochimic este mai icircnaltă decacirct icircn procesul ce are loc icircn lipsa iradierii Acest fapt demonstrează influenţa benefică exercitată de razele UV asupra procesului de distrucţie a N-nitrozoamidelor puternic cance rigene Un efect similar asupra descompunerii NNA exercită mărirea pH-ului şi mărirea temperaturii

Icircn baza datelor cinetice au fost calculate mărimile energiei de activare a proceselor chimice de descompunere (Ea = 598 kJmol) şi fotochimice (Ea = 4761 kJmol)

Datele cinetice obţinute pot fi utilizate pentru prognozarea toxicităţii mediului apos şi a produselor alimentare cauzată de prezenţa N-nitrozoaminelor

mdashmdash 35 mdashmdash

  • Introducere
  • Capitolul I Formarea N-nitrozoaminelor icircn apă
    • I1 Procese de nitrozare a aminelor
      • I11 Nitrozarea aminelor secundare
      • I12 Formarea agenţilor de nitrozare
      • I13 Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice
      • I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice
      • I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
          • K1 = iar (I144)
            • Tabelul I14
              • Amine nitrozate
                • Tabelul I15
                • Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1 şi a componentelor vectorului Z
                  • I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice
                    • Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA
                    • I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA
                    • I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei
                        • I2 Nitrozarea aminelor ciclice
                          • I21 Nitrozarea morfolinei
                            • I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismului
                            • I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi
                            • I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei
                                • I3 Nitrozarea amidelor
                                  • I31 Precursori ai N-nitrozometilureei
                                  • I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureei
                                  • I33 Inhibiţia procesului de nitrozare a metilureei
                                  • I34 Denitrozarea N-nitrozometilureei
Page 7: Gonta 1 _ mac.

(I127)

Icircn acest caz valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) icircn ecuaţia (I125) variază odată cu variaţia pH-ului [10] Valoarea k a fost calculată utilizacircnd ecuaţia (I126)

(I126)

Produsul mediu de NDMA format icircn condiţii standard la pH 34 este de 158 iar valoarea k este 99 ∙ 10-2 mol-2min-1l2 [10] Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi calea exogenă şi calea endogenă [20-22] Expunerea exogenă poate avea loc icircn rezultatul consumului alimentelor

inhalării fumului de tutun (0-140 ngţigară) utilizării articolelor din cauciuc a produselor cosmetice acţiunii mediului ambiant (aer apă) [23-26] Expunerea endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor icircn organismul uman cu formarea lor icircn condiţii acide care prevalează icircn special icircn stomac [1627]

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO) indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decacirct expunerea exogenă [29]

N-nitrozodimetilamina este prezentă icircn alimente (icircn special bere) [30] peşte şi icircn produse din peşte icircn produse din carne [31] pesticide (190-640 mgl) icircn apa potabilă clorurată (002-082 μgl) [32] şi se formează la poluarea industrială Concentraţia NDMA icircn produse alimentare variază icircn intervalul 0-85 μgkg La fel NDMA a fost detectată icircn medicamente ce sunt formate cu aminopirină de la 10 pacircnă la 371 μgkg

Aminele secundare sunt constituenţi normali icircn urină care derivă din degradarea proteinelor aminoacizilor fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice sub influenţa enzi melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale

Dimetilamina care este principala amină secundară detectată icircn urină este prezentă icircn condiţii normale icircn jur de 05 mM Ionul nitrit este depistat icircn urină de asemenea icircn concentraţii variabile dependente de dietă şi concentraţia lui icircn apa potabilă Astfel prezenţa NDMA icircn urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii coliforme ( Proteus Escherichia coli) care transformă ionul nitrat icircn nitrit formacircnd icircn rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a apelor naturale şi s-a constatat că icircn procesul de potabilizare se pot produce potenţiali cancerigeni ndash NDMA (ec I127) şi NDEA icircn concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ngl respectiv [32]

La acest pH fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 048 iar concentraţia de HN(CH 3)2 neionizată este de 479 x 10 -8 (calculat din valoarea pka 337 şi 1072 respectiv) Utilizacircnd aceste date a fost calculată valoarea constantei de viteză (k) egală cu 894 x 10 6 mol-2min-1l2 care nu se deosebeşte cu mult de valoarea k calculată de Ridd egală cu 24 x 107 mol-2min-1l2 [11]

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ordmC Icircn aceste condiţii la incubare prelungită şi pH scăzut ionul nitrit este instabil iar viteza maximă de nitrozare nu este la pH 34 ci la pH 45 Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului Procesul de nitrozare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor care se caracterizează prin proprietăţi mutagene şi cancerigene Icircn acest context studiul legităţilor cinetice ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes

I14 Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitrozoamine N-nitrozodimetilamină ndash compania SIGMA No 7756 puritatea 998 N-nitrozodietilamină ndash compania SIGMA No 0756 puritatea 996

Inhibitori acid dihidroxifumaric ndash Sigma-Aldrich Germania rezveratrol ndash Fluka (+)-catehina ndash Fluka cvercetina ndash Sigma-Aldrich Germania ester dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) acid ascorbic ndash importator SRL Ecochimie Moldova extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49] dihidroxifumarat de sodiu ndash sintetizat icircn Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică Pentru analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină acid sulfanilic acid acetic glacial ndash importator SRL Ecochimie Moldova reagent Griess ndash Fluka Germania

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection Inc SUA) spectrofotometrul SF-46 spectofotometrul UVVIS pH-metrul Cecher lonomerul 120-2 (Gomel Bielorusia)Termostatul U-190 (Germania)

Metodica experimentului Procesul de nitrozare a fost efectuat icircntr-o celula cu termostatare Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic Soluţiile sub stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la temperatura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-tampon citrat-fosfat Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost separate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp La determinarea NNA procesul de nitrozare icircn partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (110) a amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu icircn l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9) Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter care include tratarea NNC cu HBr [6] Icircn rezultatul procesului de denitrozare a NNC se formează NO care reacţionează cu ozonul formacircnd NO2 icircn stare excitată şi apoi se descompune prin emanarea unui foton Emisia chemiluminescentă este detectată de un fotomultiplicator instalat icircn analizatorul de energie termică (AET)

R1R2NNO R1R2NH + NOBr (I128)

NOBr rarr Br2 + NO (I129)NO + O3 rarr NO2 + O2 (I130)NO2 rarr NO2 + hν (I131)

Limita de detecţie este de 100 pmol Sistemul analitic pentru determinarea conţinutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie termică (model 610 sau model 402 Thermedics Waltham MA) şi un integrator (Hewlett-Packard Avondale PA) Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de 500 ml cu trei gacircturi 2440 un gacirct No7 (bdquoAce-thredrdquo) pentru introducerea probei fiind plasat icircntr-o manta de icircncălzire (Fig I13) [6] Unul din gacircturile 2440 a fost conectat la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon icircn al doilea se introduce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi icircn al treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux răcit cu o pompă imersabilă icircn circulaţie Gacirctul Nr7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experiment) Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet de admisie a aerului şi la un tub de icircnlăturare a gazului (NO) Gazul NO trece prin şapte vase de spălare dintre care icircn primele 1-4 se conţin cacircte 60 ml de 15 N NaOH 5 N NaOH 99 NaOH (solid) şi 99 NaOH granulat anhidru Vasele de spălare 5 (cu 20 ml EtOAc) 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate icircntr-un congelator la -30ordmC (Cryfridge Baxter McGraw Park IL)

Metoda analizei NNC cu HBr Icircn vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 mlmin) şi fluxul de argon (40 mlmin) Atunci cacircnd vidul icircn ATE atinge 05 mm se introduce mantaua de icircncălzire pentru a da o viteză de reflux de 1 picsec şi o temperatură de 28degC pentru vasul de reacţie

Se injectează cu seringa HCl concentratacid acetic glacial (595 15 mL) iar mai tacircrziu 75 ml de HBr icircn acid acetic glacial (33) şi se lasă pe 15-30 min după fiecare adaos pentru ca răspunsul ATE să se icircntoarcă la linia de bază Mostrele de analizat (de obicei 100 microL) sunt injectate cu seringa icircn gacirctul Nr7 atunci cacircnd răspunsul inte gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min) obţinem picuri ascuţite Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (01 nmol 100 microL de 10 microM NPRO) şi sunt injectate la icircnceputul mijlocul şi la sfacircrşitul fiecărei serii a experimentului

mdashmdash 9 mdashmdash

Pentru icircnlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor secundare cu NO 2-) se introduce acid sulfamic (AS)

proaspăt pregătit (soluţie saturată) şi HCl de 2N [35]

Fig I13 Schema metodei grup-selective pentru determinarea conţinutului total de NNC [6]

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 microL probă se adaugă 50 microL AS saturat şi 50 microL HCl de 1N se agită şi după 15 min se analizează introducacircnd de regulă 100 microL de probă din acest amestec icircn vasul pentru extracţia NNC icircn EtOAc şi descompunerea lor cu HBr (I128-I129) Această metodă de analiză a NNC este de o selectivitate icircnaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10) sensibilă (detecţia limită este de 001 micromolL şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă) Legătura N ndash NO icircn N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale precum şi din căldura standard de formare a produşilor de reacţie Pentru N-nirozodimetilamină

D[(CH3)2N ndash NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] ndash ΔHf0[(CH3)2N ndash NO] (I132)

(CH3)2N ndash NO rarr (CH3)2Nmiddot + middotNO (I133)D[(CH3)2N ndash NO] = 521 kcalmiddotmol-1 (I134)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi prin urmare nu poate servi ca sursă de interferenţă

Nitrozarea DMA şi DEADin studiile bibliografice s-a constatat că icircn cercetări procesul de nitrozare a DMA şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC Icircn lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC adică după variaţia nitritului aminelor şi după formarea NNC Nitrozarea aminelor s-a studiat icircn diferite sisteme-model şi sisteme reale icircn condiţiile cacircnd concentraţia NO2

- este cu mult mai mică (1bull10-5 - 5bull10-4M) decacirct cea studiată icircn literatură (002-02M) concentraţia substratului fiind de ordinul mM [2635] iar raportul [NO2

-][Amină]1 Aceste studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc icircn sisteme reale

Nitrozarea DMA Peştele conţine o cantitate mare de DMA care icircn continuare poate fi nitrozată Această amină este cea mai răspacircndită icircn produsele alimentare Astfel studiul pro cesului de nitrozare

a DMA are o importanţă deosebită Icircn sistemele reale (produse alimentare apă sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu mult mai mici de exemplu icircn apă sunt de ordinul 10-5-10-3M Reieşind din aceste considerente procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat icircn soluţii apoase ce conţineau DMA (1∙10-3M) NaNO2 (005∙10-3 -1∙10-3M) şi icircn soluţie-tampon citrat-fosfat procesul a fost studiat la 37ordmC Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi NDMA şi DMA icircn sistem icircn funcţie de diferiţi parametri [5455]

Cinetica procesului de nitrozare a DMA studiată după variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn sistem icircn funcţie de [NO2-]0 este prezentată icircn Tabelul I11

Tabelul I11

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA icircn funcţie de [NO2

-]0 pH 26 t = 37ordmC [DMA]0 = 1middot 10-3M

[NaNO2]0 Winiţ107 [NO2-]105M de NO2

-

105M Ms la 30 min reacţionat

05 05 009 8210 12 039 6150 75 132 73100 89 460 55

Din rezultatele experimentale obţinute icircn Tabelul I11 constatăm că viteza procesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi Raportul [NO2

-]0 [DMA]o icircn sistemul-model este mai mic de 1 Au fost utilizate concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare Icircn cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2

-]0 este doi la fel cum se prezintă icircn literatură [3536] pentru intervalul concentraţiilor mari

mdashmdash 10 mdashmdash

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori (pentru intervalul studiat de NO 2-) Astfel ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH constant icircn felul

următor

(I135)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului dar [DMA] şi [HNO 2] trebuie calculată pentru fiecare valoare de pH Icircn toate cazurile viteza reacţiei depinde de concen traţia aminei neionizate Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule de HNO 2 Icircn cazul dat conform ordinului doi după [NO2

-]0 la nitrozare participă N2O3 icircn calitate de agent de nitrozare

Dacă utilizăm icircn ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor atunci constanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH

(I136)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor icircn f(pH) icircn sistemul-model (CH 3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 34 (Fig I14) ce corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 337) La pH lt34 ionul nitrit se transformă aproape totalmente icircn HNO2 (ec I11) Astfel am constatat că pentru intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor icircn procesul de nitrozare maximul vitezei icircn funcţie de pH este situat la pH 34 la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100 de ori mai mari [38]

Fig I14 Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH [NO2-]0 = 1middot10-4M [DMA]0 = 1middot10-3M t = 37ordmC

Icircn procesul de nitrozare concentraţia aminosubstratului neprotonat care este icircn echilibru cu acidul lui conjugat (ec I137) este dependentă de pH-ul mediului (pentru DMA pK a = 1072) [35]

(CH3)2NH2+ + H2O (CH3)2NH + H3O+ (I137)

Astfel viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici tatea substratului care determină proporţia de amină neprotonată Cu cacirct mai mic este pH-ul cu atacirct mai mare este concentraţia aminei protonate iar cu cacirct mai mare este pH-ul cu atacirct mai mică este concentraţia agentului de nitrozare

Pentru viteza de formare a NDMA studiată după concentraţia produsului format şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec I136) s-a obţinut o dependenţă caracteristică de pH atingacircnd maximul la pH aproximativ 34

Tabelul I12Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA

[NO2-]0

= 1∙10-4M [DMA]0 = 1∙ 10-3M t = 37ordmC

Nitrozarea DMA icircn funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ [NO2

-]105M [NO2-] pH Winiţ [NDMA]104M [NDMA]

107 la 30 min react 30 min 108 la 90 min la 90 min Ms MS-1

15 25 60 40 168 50 14 14 20 45 40 60 356 183 18 18 25 53 30 70 401 133 16 16 30 78 20 80 686 83 15 15 35 87 10 90 40 63 15 85

Nitrozarea DEAN-nitrozodietilamina se formează icircn diferite produse alimentare icircn produse vegetale marinate ndash 069 microgkg şi icircn moare ndash 49 microgkg [39] icircn bere ndash icircn medie 022 microgl maximum ndash

22 microgl [40] icircn carne [41]

mdashmdash 11 mdashmdash

La fel NDEA a fost depistată icircn produse de cauciuc (92 microgkg) produse cosmetice (15-5 microgkg) [42] aer poluat cu fum de ţigări (001-01 ngm 3) [43] apă deionizată (003-034 microgl) [44] şi icircn ape reziduale (pacircnă la 5 microgl) [45]

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată icircn funcţie de diferiţi parametri (pH [NO2-]0 [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA determinată prin metoda

extracţională-spectrofotometrică [46] după variaţia concentraţiei de nitriţi şi variaţia [DEA] [53-55] Rezultatele experimentale sunt prezentate icircn Tabelul I13

Tabelul I13

Viteza iniţială de nitrozare a DEA icircn dependenţă de pH [NO2-]0 şi [DEA]0

[NO2-]0 = 1middot10-4M DEA]0 = 1middot10-3 pH 35 t = 37ordmC

Nitrozarea DEA

Icircn f (pH) Icircn f [NO2-]0 Icircn f [DEA]0

pH Winiţ 108 M s-1 [NO2-]0 Winiţ 108 M s-1 [DEA]0 Winiţ 108 M s-1

după variaţia 104M după variaţia 104M după variaţia

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2-] [NDEA]

168 40 13 01 35 21 01 50 001 26 45 29 05 40 28 03 20 20356 50 64 10 50 62 10 120 36401 45 55 50 61 71 50 220 50686 11 47 100 72 80 100 520 63

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a DMA creşte Astfel variaţia concentraţiei ionului nitrit icircn intervalul 1middot10 -5 - 1middot10-3moll duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 21middot10-8 M s-1 pacircnă la 80middot10-8 M s-1 iar viteza de consum a ionului nitrit icircn acest interval variază de la 35middot10-7 mollmiddots pacircnă la 72middot10-7 mollmiddots

Cota-parte calculată de NDEA formată icircn funcţie de [NO2-] variază icircn limitele 22-89 (Fig I15a) Calculele cinetice efectuate după consumul [NO 2

-] pentru diferite concentraţii de DEA (01-100) middot10-4 moll indică (Tab I13) creşterea vitezei de nitrozare icircn intervalul (5-52) middot10 -8 mollmiddots Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi creşte pentru intervalul dat de concentraţii cota-parte de NDEA formată (la concentraţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig I15a) Astfel icircn sistemul NO 2

- ndash DEA cota-parte de NDEA formată din DEA variază icircn

intervalul 78-400 pentru intervalul 01middot10-4 - 1middot10-3 moll de DEA

(a)(b)

Fig I15 Cota-parte de NDEA formată icircn funcţie de (-lg [NO2-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi icircn funcţie de pH (b) [NO2-]0 = 1x10-4M [DEA]0 = 1x10-3M t = 37ordmC

Pentru raportul [DEA]0[NO2]0 = 1 icircn sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcătuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare deoarece raportul stoechiometric icircntre NO2

- şi DEA este de 21 Astfel constatăm că ordinul după concentraţia NO2- este doi

Viteza procesului de nitrozare a DEA icircn f(pH) atacirct după variaţia [NO 2-]0 cacirct şi după formarea NDEA0 trece prin maximum la pH 34 (Fig I15b) [3334] Icircn toate cazurile viteza

de consum a nitritului este cu mult mai mare decacirct viteza de formare a NDEA ( Tab I13) deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC dar suferă o serie de transformări (ec I11 I12 I13) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul lor participă icircn procesul de nitrozare

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA constatăm că formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [5355]Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei astfel pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA Icircn rezultat DEA are

proprietăţi bazice mai puternice decacirct DMA şi forma protonată este mai stabilă Icircnsă aminele protonate nu se supun nitrozării astfel viteza procesului de nitrozare a DEA este mai mică decacirct a DMA

I15 Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Mecanismul procesului de nitrozare a aminelor şi icircn particular a aminelor secundare alifatice (DMA şi DEA) include formarea agenţilor de nitrozare care la racircndul său icircn continuare interacţionează cu substratul de nitrozare (ec I11-I15) Icircn baza valorilor cunoscute ale constantei de echilibru ka K 1 K2 deducem expresia teoretică pentru viteza de nitrozare reieşind din faptul că icircn calitate de agenţi de nitrozare participă NO+(H2O+NO) şi N2O3

NO2- + H+ HNO2 ka = 4 middot 10-4 [47] (I138)

HNO2 + HNO2 N2O3 + H2O K1 = 3 middot 10-3 [47] (I139)

HNO2 + H+ H2ONO+ K2 = 3 middot 10-7 [47] (I140)

(CH3)2NH + N2O3 (CH3)2 N ndash NO + HNO2 (I141)

(CH3)2 NH + NO+ (CH3)2N ndash NO + H+ (I142)

mdashmdash 12 mdashmdash

Cot

a-pa

rte

ND

EA

Cot

a-pa

rte

ND

EA

(CH3)2NH + H+ ((CH3)2NH2)+ (I143)

Din ecuaţia (I139)

K1 = iar (I144)

Pentru determinarea concentraţiei HNO2 utilizăm expresia pentru partea de masă a formei protonate ( )

de unde

(I145)Expresia pentru viteza reacţiei (I141) este următoarea

= k3[N2O3][(CH3)2NH] (I146)

(I147)

Expresia vitezei de nitrozare a DMA cu NO+(H2O+NO) o determinăm icircn acelaşi modDin ecuaţia (I140) constanta de echilibru K2 este egală cu

(I148) (I149)

Expresia vitezei reacţiei de nitrozare a DMA cu NO+ pentru reacţia (I142) este

(I150)

Viteza generală a procesului de nitrozare a DMA cu NO2- poate fi redată prin expresia

(I151)

Exprimăm

(I152)

Expresia vitezei totale va fi

(I153)

unde KA şi KB ndash constante ce caracterizează participarea N2O3 şi NO+ corespunzător icircn procesul de nitrozare Utilizacircnd datele obţinute din studiile experimentale au fost calculate mărimile constantelor de viteză (k3 k4) pentru procesul de nitrozare a diferitelor amine (Tab I14) [50]

Tabelul I14Constantele vitezelor de nitrozare ale aminelor KA şi KB

Constanta de viteză M-1s-1Amine nitrozate

DMA DEA MOR Pip

k3

k4

KA

KB

168x105

118x108

3555

512

126x104

184x106

1055

85

121x107

768x109

230427

005

97x104

674x107

2023

1330

Din comparaţia mărimilor obţinute pentru constantele de viteză constatăm că NO + este un agent de nitrozare cu mult mai activ decacirct N 2O3 (k4gtgtk3) [5053] Dar icircn rezultatul studiilor experimentale s-a constatat că KAgtKB (Tab I14)

Această neconcordanţă icircntre constantele de viteză şi KA KB poate fi determinată de concentraţia agenţilor de nitrozare ce se formează icircn mediul de reacţie Pentru a concretiza această presupunere calculăm concentraţiile teoretice ale NO+ şi N2O3 la diferite pH-uri Icircn acest scop a fost elaborat un model matematic iar calculele s-au efectuat pentru sistemul amine

secundare ndash

Modelarea matematică a procesului de nitrozare a aminelor

mdashmdash 13 mdashmdash

Modelarea matematică s-a realizat icircn baza experimentului real al nitrozării meti luree Procesul de nitrozare s-a studiat la temperatură constantă Probele din ambele celule cu

şi substrat (1 şi 2 corespunzător) au fost aduse la pH-ul necesar şi termostatate cu termostatul U-10 După termostatare soluţia din celula 1 se trece icircn celula 2 Momentul

omogenizării (t = 0) se consideră momentul iniţial al reacţiei caracterizat prin vectorul Z ai cărui componenţi reprezintă concentraţiile tuturor speciilor recalculate icircn volumul reactantZ[MU]0 [NMU]0 [H3O+]0 [NO2

-]0 [HNO2]0 [N2O3][NO+]0t = 0La evaluarea computaţională a vectorului Z a fost aplicată metoda numerică Newton-Rafson al cărei algoritm este expus icircn limbajul de programare TP70La soluţionarea modelului static prin experimentul computaţional s-au determinat condiţiile iniţiale (concentraţiile speciilor icircn soluţia 1) la timpul τ = 0 şi la momentul cacircnd se

atinge echilibrul chimic τ = τe unde valoarea τe este necunoscută (Tab I15)

Tabelul I15

Determinarea computaţională a concentraţiilor speciilor din soluţia 1

şi a componentelor vectorului ZDeterminarea computaţională a concentraţiilor speciilor icircn soluţia 1

specia H3O+ HNO2 NO+ N2O3

C10M

C1eM

20010-4

78310-6

10010-2

98010-3

000+00

19210-4

000+00

56510-12

000+00

1110-10

Determinarea computaţională a componentelor vectorului Z

specia H3O+ HNO2 N2O3 MU NMU

Ct=0 M 39210-6 99010-3 96110-5 55410-11 10010-3 000+0

Icircn Figura I16 se prezintă dependenţa concentraţiei speciilor la echilibru icircn funcţie de aciditatea soluţiilor (-lg[H3O+]1e) evaluate computaţional cu ajutorul programului NITRITPAS la valoarea fixată a [NO2

-]10 = 210-4M Experimentul computaţional indică (Fig I16) că la echilibru concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 (10-10M) este cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu (~10 -12M) şi variază icircn funcţie de pH Icircn Figura I17 este prezentată dependenţa raportului [NO +]1e[N2O3]1e icircn funcţie de aciditatea

soluţiei din care constatăm că acest raport creşte mai intens icircncepacircnd cu pHlt2 (Fig I17)

Fig I16 Concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

mdashmdash 14 mdashmdash

Fig I17 Raportul concentraţiilor agenţilor de nitrozare icircn funcţie de pH [NO2

-]0 = 2middot10-4M t = 25degC

Pentru optimizarea constantelor de viteză s-a asamblat un program OPTIMKPAS unde concentraţiile teoretice au fost determinate cu ajutorul algoritmului metodei Euler implicite de integrare numerică

Icircn Figura I18 sunt prezentate icircn scară semilogaritmică curbele cinetice evaluate computaţional prin soluţionarea modelului dinamic la t = 25ordmC şi la valorile cunoscute ale vectorilor Z şi g Concentraţiile tuturor speciilor icircn afară de produsul de reacţie la timpul t = 10 -10s (t rarr 0) nu sunt nule mulţimea lor alcătuieşte elementele vectorului Z Conform experimentului computaţional procesul de nitrozare poate fi icircmpărţit icircn patru etape Prima etapă este cuprinsă icircn limitele 10 -10 le t le 10-7s şi icircn această perioadă sistemul se află icircntr-o stare staţionară Etapa a doua cuprinsă icircn segmentul de timp 10-7 le t le 10-4s icircncepe odată cu consumul cationului de nitrozoniu (10-7 le t le 10-65s) consumarea parţială a agetului de nitrozare N2O3

se observă puţin mai tacircrziu icircn intervalul 10-6 le t le 10-4s Icircn continuare procesul trece iarăşi icircntr-o stare staţionară ce durează pacircnă la t = 1s (etapa III) Ultima etapă este cuprinsă icircn intervalul 1 le t le 5s icircn care se observă consumul speciilor HNO2 NO2

- N2O3 MU şi formarea produsului reacţiei ndash NMU Din concentraţiile speciilor prezentate icircn sistem (Fig I18) constatăm că concentraţia NO2

- la intervalul de pH 10-20 este cu mult mai mică (de ordinul 10 -7-10-6M) decacirct a HNO2

(de ordinul 10-5M) Astfel s-a demonstrat că icircn sistem specia principală la pHlt2 este HNO2 astfel NO2- este transformat icircn HNO2 Concentraţia agentului de nitrozare N2O3 este de ordinul ~10-

11M iar concentraţia NO+ este de ordinul aproximativ 10-15-10-12MDin Figura I17 constatăm că icircn cazul cacircnd pHlt2 raportul [NO+][N2O3] creşte brusc astfel principalul agent de nitrozare este NO+ iar la pHgt2 icircn procesul de nitrozare participă

preponderent N2O3 Dar deoarece produsul k4[NO+]asympk3[N2O3] la pH 25 am putea presupune că icircn procesul de nitrozare participă ambii agenţi de nitrozare

Fig I18 Curbele cinetice determinate computaţionalpH = 125 [NO2

-]0 = 1middot10-4M [MU]0 = 1middot10-3M

Folosind mărimile concentraţiilor agenţilor de nitrozare calculate prin metoda computaţională se pot explica variaţiile densităţii optice la λ = 230 nm Studiind va riaţia concentraţiei NO2

- la λmax = 230 nm icircn funcţie de pH constatăm că la pHle35 absorbţia este determinată de HNO2 iar icircn mediul puternic acid ndash de ionul NO+(H2O+NO) Astfel diminuarea absorbţiei A230 icircn sectorul I poate fi explicată prin micşorarea concentraţiei HNO2 cu transformarea lui icircn N2O3 (Fig I19)

Din datele calculate (Fig I17) observăm că la pH2 practic se stopează acumularea N2O3 icircn sistem şi concentraţia lui rămacircne aproape constantă De aici reiesă că creşterea A 230 icircn sectorul II este determinată de acumularea NO+ Variaţia concentraţiei NO+ a fost determinată după formarea complexului NOSCN (Fig I110) care absoarbe la λ = 490 nm

mdashmdash 15 mdashmdash

Fig I19 Variaţia densităţii optice

a diferitelor specii icircn soluţiile de ioni nitriţi icircn funcţie de pHFig I110 Variaţia densităţii optice

a compusului NOSCN icircn funcţie de pH pentru diferite [NO2-]

I16 Influenţa inhibitorilor asupra procesului de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Pentru a diminua concentraţia NDMA şi NDEA au fost utilizaţi diferiţi inhibitori acidul dihidroxifumaric (DFH 4) dihidroxifumaratul de sodiu DFH3Na (+)-catehina esterul dimetilic al acidului tartic (EDMT) rezveratrolul (Rezv) şi extractul enotaninic

Fig I111 Formule de structură a inhibitorilor utilizaţi icircn procesul de nitrozare a DMA şi DEA

I161 Influenţa derivaţilor acidului tartric asupra nitrozării DMA şi DEA

Pentru a micşora concentraţia NNA formate icircn diferite sisteme in vivo şi in vitro este necesar de a fi elaborate noi metode de inhibiţie Icircn acest scop s-a cercetat viteza procesului de formare a NNA şi de consum a NO2

- icircn prezenţa derivaţilor acidului tartric icircn funcţie de concentraţia reducătorilor icircn intervalul 1∙10-5 - 1∙10-3M [5256]

Procesul de inhibiţie s-a studiat icircn condiţiile cacircnd concentraţia ionilor nitriţi a fost mai mică decacirct concentraţia substratului de nitrozare ([NO 2-]0 = 1∙10-4 M [DMA]0 = = 1∙10-3 M)

iar pH-ul mediului 34 şi temperatura de incubare 37ordmCRezultatele experimentale prezentate icircn Figura I112(a) cu privire la procesul de inhibiţie studiat după viteza de formare a NDMA indică la faptul că odată cu creşterea

concentraţiei hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu (DFH3Na) (I) are loc micşorarea vitezei de nitrozare şi creşterea vitezei de consum a ionului nitrit (II) [52]Concentraţia NDMA formate icircn sistemul DMA ndash NO2

- ndash DFH3Na scade la mărirea concentraţiile inhibitorului (Fig I112(b)) Pentru intervalul de concentraţii ale DFH3Na 10-500 microM concentraţia NDMA peste 90 min scade de la 180 microM pacircnă la 40 microM (Fig I112(b)) Icircn aceleaşi condiţii experimentale a fost studiat procesul de inhibiţie pentru formarea NDEA (Fig I113) Rezultatele experimentale obţinute pentru ambele amine (DEA DMA) atacirct după concentraţia NNA formate cacirct şi după consumul de ioni nitriţi icircn prezenţa DFH3Na sunt prezentate icircn Tabelul I16 şi icircn Figura I113(a) Concentraţia NDMA formate la nitrozare icircn absenţa inhibitorului este aproximativ de trei ori mai mare decacirct a NDEA Cota-parte de NDMA se micşorează de 45 ori (de la 18 pacircnă la 40) cu creşterea [DFH3Na]0 icircn intervalul dat iar pentru NDEA ndash de ~ 3 ori (de la 63 la 22) Viteza de consum a nitriţilor icircn procesul de nitrozare a ami nelor creşte şi icircn ambele cazuri cota-parte de ion nitrit redus la [DFH3Na]0 de 5x10-4M este de asymp 100

mdashmdash 16 mdashmdash

C(NO2minus) = 1∙10-4M

C(NO2minus) = 1∙10-3M

C(NO2minus) = 5∙10-4M

C(NaNO2minus) = 5∙10-4M

Fig I112(a) Viteza de formare a NDMA (I) şi de consum a NO2- (II)

icircn f[DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Fig I112(b) Curbele cinetice de formare a NDMA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

Din rezultatele cinetice s-a determinat gradul de inhibiţie (GI) la formarea NDEA şi NDMA icircn funcţie de [NFH3Na]0 şi s-a constatat că GI creşte cu creşterea [DFH3Na]0 (Fig I113) iar icircn cromatogramă se observă scăderea [NDEA]

Tabelul I16

Nitrozarea DMA şi DEA icircn f [DFH3Na]0 [DMA]0 = [DEA]0 = 1∙ 10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 35 t = 37ordmC

a) b)

Fig I113 Dependenţa gradului de inhibiţie icircn f [DFH3Na]0 la nitrozarea DEA şi DMA (a)(b) ndash cromatograma variaţiei concentraţiei NDEA (metoda ATE) icircn funcţie de [DFHNa]0

Pentru a micşora viteza procesului de nitrozare a aminelor de racircnd cu DFH 3Na s-a utilizat şi DFH4 Procesul de nitrozare s-a efectuat icircn următoarele condiţii [NO2-]0 = = 59 mM

[DEA]0 = 59 mM [NaCl] = 11810-2 M pH = 28 soluţiei-tampon citrat-fosfat t = 37ordmC Timpul de incubare a alcătuit 60 min Concentraţia de DFH 4 a variat icircn felul următor

= 025 mM = 075 mM = 100 mM = = 125 mM = 15 mM şi = 0 Pentru determinarea NDEA s-a utilizat

metoda ATE

Tabelul I17

Variaţia concentraţiei NDEA icircn funcţie de [DFH4]0 [NO2- ] = 59 mM pH

28 t = 37ordmC

DMA DEAFormarea NDMA Consumul

NO2-

Formarea NDEA Consumul NO2

-

[DFH3Na]0 104M [NDMA] la 90 min

104M

Winiţ

107M∙s-1

de

NDMA

format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min[NDEA] la 90

min

104M

Winiţ

107 Ms-1

de NDEA format

Winiţ

107 M∙s-1

NO2- redus la

90 min

00

01

05

10

50

180

110

08

058

040

15

09

04

03

01

180

110

80

58

40

033

050

066

116

188

50

55

62

80

98

063

052

044

033

022

083

072

050

025

008

63

52

44

33

22

033

058

075

10

133

40

55

60

78

95

mdashmdash 17 mdashmdash

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GI

01 05 10 50

[DFH3Na]o x10^-4 M

NDEA

NDMA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GI

025 075 100 150

[DFH4]o mM

Fig I114 Dependenţa GI de [DFH3Na]

Din datele experimentale prezentate icircn Tabelul I17 constatăm că concentraţia NDEA determinată după 60 min de incubare a DMA cu NO 2

- scade odată cu creşterea concentraţiei de DFH4 Gradul de inhibiţie a fost determinat după următoarea formulă

GI = (A-B)A middot 100 unde A ndash concentraţia NDEA fără inhibitor B ndash concentraţia NDEA icircn prezenţa lui

La variaţia concentraţiei DFH4 icircn intervalul 025-15 mM GI creşte de la 714 pacircnă la 85 Din rezultatele experimentale s-a constatat că cota-parte de DEA trans formată icircn NDEA icircn aceste condiţii (timp de 60 min) este destul de mică şi se micşorează cu creşterea [DFH4]0 de la 0019 (fără inhibitor) pacircnă la 0003

Influenţa esterului dimetilic al acidului tartric asupra procesului de nitrozare a DMAEsterul dimetilic al acidului tartric a fost sintetizat din acid tartric care la racircndul său a fost obţinut din produse secundare vinicole Acest inhibitor a fost utilizat icircn siste mul DMA-

NO2- la pH 34 t = 37oC icircn intervalul de concentraţii 110-5 ndash 110-3M Efectul reducerii ionilor nitriţi sub acţiunea EDMT variază de la 155 la 525 pentru un interval de [EDMT]o destul de

larg (01-10010-4M) (Tab I18) Dacă comparăm efectul reducerii NO2- icircn prezenţa Ent DH3Na (+)-catehina cu efectul reducerii icircn prezenţa EDMT constatăm că ultimul are cel mai mic

grad de reducere a ionilor nitriţi (Fig I115) Tabelul I18

Variaţia parametrilor cinetici icircn sistemul DMA-NO2- icircn f[EDMT]0 şi [SCN-]0

[NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

[EDMT]obull104M

Winiţ

107Ms-1

[NO2-]bull

105M (20 min)

Efectulreducerii NO2

-

Icircn prezenţa [SCN-]Icircn sistemul NO2

- - DMA

[SCN-]bull103M

Winiţ

107Mmiddots-1 Reducerea NO2-

01051050100

0510112023

7668645343

155244288414522

005011050

008025033053

176200313406

Fig I115 Efectul total de reducere a NO2- icircn funcţie de natura reducătorului la [Red]0 = 110-4M [NO2

-] = 110-4M [DMA]0 = 110-3M t = 37ordmC pH 35I162 Influenţa (+)-catehinei asupra nitrozării DMA şi DEA

Din grupa polifenolilor icircn calitate de inhibitori ai procesului de nitrozare a ami nelor secundare s-a studiat (+)-catehina [18] cvercetina rezveratrolul enotatina solubilă şi insolubilăViteza iniţială de interacţiune a DMA cu NO2

- se micşorează odată cu creşterea concentraţiei (+)-catehinei icircn intervalul 0 - 510-4M iar viteza de consum al ionilor nitrit creşte Icircn acest caz are loc concurenţa pentru agentul de nitrozare icircntre substrat şi (+)-catehină

Tabelul I19Acţiunea (+)-catehinei icircn procesul de nitrozare a DMA cu NO2

- [DMA] = 110-3M [NO2

-] = 110-4M pH 35 t = 37oC

După variaţia [NDMA] După consumul [NO2-]

[(+)-Ct]105 M

Winiţ107 Ms-1 de NDMA

[NDMA]104M la

t = 90 min

GI

Winiţ107 Ms-1

[NO2-]

104M la t = 90 min

Reducerea NO2- la

90 min

0010

146080

180100

180108

0040

053066

058033

4267

mdashmdash 18 mdashmdash

[DFH4]0 mM Concentraţia NDEAGrad deinhibiţie

mM

000 098 0019 0

025 091 0018 714

075 072 0014 265

100 020 0004 796

150 014 0003 857

50100500

030016005

483010

078030010

738394

0861420

036010001

749099

Din Tabelul I19 constatăm că gradul de inhibiţie icircn procesul de formare a NDMA creşte icircn intervalul 00-94 pentru domeniul dat de concentraţie a (+)-catehinei iar efectul reducerii nitriţilor creşte de la 42 (pentru sistemul fără (+)-catehină) pacircnă la 99 (pentru C(+)-ct=510-4M)

Icircn cazul raportului dintre [(+)-Ct][NO2-] = 1 GI atinge 83 iar pentru raportul [(+)-Ct]o [NO2

-]o 1 icircn sistemul dat procesul de nitrozare se inhibă aproape complet (94) [56]Dacă comparăm GI la formarea NDMA icircn prezenţa DFH3Na cu GI al (+)-Ct şi DFH4 observăm că efectul inhibitor al DFH4 şi (+)-catehinei este mai icircnalt decacirct al DFH3Na (Fig

I116) icircn aceste condiţii

Fig I116 Dependenţa GI icircn funcţie de [RedH2]

Fig I117 Dependenţa vitezei de consum a [NO2] icircn f [RedH2] icircn sistem DMA-NO2--RedH2 pH

34 t = 37ordmC [DMA]0 = 110-3M [NO2-]0 = 110-4M

Viteza de consum a [NO2-] icircn prezenţa (+)-Ct este mai mare ca viteza de consum icircn prezenţa DFH3Na şi (DFH4) (Fig I117) Astfel constatăm că DFH4 are o capacitate de inhibiţie

mai mare comparabilă cu (+)-Ct şi este mai activ decacirct DFH3Na

I163 Influenţa enoxilului asupra nitrozării dimetilaminei

Enotaninele se găsesc icircn poamă şi reprezintă un amestec complex de catehine şi epicatehine care conţin icircn compoziţia lor forme monomerice pacircnă la oligomerice [48] Lanţul de polimeri se formează icircn rezultatul condensării grupelor funcţionale la atomul de carbon C4 icircn ciclul C şi atomul C8 icircn ciclul A Aceşti compuşi se caracterizează prin solubilitate scăzută icircn apă astfel utilizarea lor icircn diferite domenii este dificilă Enoxilul este un produs obţinut la oxidarea enotaninelor cu H 2O2 [49] care produce depolimerizarea formelor condensate de catehine şi epicatehine cu formarea derivaţilor monomerici ce conţin grupe hidroxile [48]

Scopul principal al acestor investigaţii rezidă icircn cercetarea procesului de formare a NNA icircn prezenţa enoxilului Luacircnd icircn consideraţie prezenţa grupelor hidroxile icircn compoziţia enoxilului am presupus rolul lui icircn calitate de inhibitor icircn procesul de nitrozare a aminelor alifatice secundare cu NO2

- Procesul de nitrozare s-a studiat după viteza de consum a NO2-

Concentraţia enoxilului ce reprezintă extractul (din seminţe de struguri) de enotanine solubilizate (Ent) a fost variată icircn intervalul 0-03 gl pentru a studia inhibiţia procesului de nitrozare a DMA cu NO2

- la pH 26 t = 37ordmCDin rezultatele experimentale s-a constatat că enotaninele interacţionează cu ionii nitriţi şi viteza de consum a ionilor nitriţi creşte odată cu mărirea concentraţiei lor Efectul

reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul NO2- ndash Ent icircn funcţie de diferite concentraţii de reducător (0003-03 gl) variază icircn intervalul 154-680 (Tab I110) [57]

Icircn prezenţa DMA icircn sistemul NO2- ndash Ent ndash DMA are loc o reducere a NO2

- mai mare faţă de sistemul NO2- ndash Ent Icircn acest caz efectul reducerii ionilor nitriţi creşte pacircnă la 79

(Tab I110) Astfel constatăm că icircn prezenţa aminei efectul diminuării NO 2- sub acţiunea Ent este mai mare decacirct icircn absenţa ei La concentraţia Ent de 012 gl efectul reducerii ionilor nitriţi

este prezentată icircn Figura I118 Icircn concurenţă pentru nitriţi enotaninile interacţionează cu o viteză mai mare icircn prezenţa a DMA = = 20810-7 Ms

= 1710-7 Ms = 34310-7 Ms pentru [Ent]o = = 01gl (Fig I119)

Icircn sistemul Ent ndash NO2- ndash DMA Winiţ creşte semnificativ icircn intervalul concentraţiilor de Ent icircntre 003-012 gl iar efectul maxim de reducere al NO2

- atinge 657 Mărirea icircn continuare a concentraţiei de Ent de 3 ori nu duce la o creştere proporţională a vitezei iniţiale (Fig I119) Icircn sistemul Ent ndash NO 2

- viteza iniţială a reacţiei creşte icircn intervalul 02510-7ndash55810-7 Ms-1 odată cu creşterea concentraţiei reducătorului [5758] Aceste rezultate sunt determinate de raportul dintre agentul de nitrozare şi substratul nitrozat

Viteza de consum a ionilor nitriţi icircn prezenţa Ent depinde de pH-ul mediului S-a constatat că W i de consum a ionilor nitriţi icircn intervalul de pH 15-26 este maximă iar cu creşterea ulterioară a pH-ului viteza scade brusc La pH-uri mai icircnalte viteza de in teracţiune a Ent cu ionii nitriţi scade datorită transformărilor ce au loc icircn structura lor G rupele hidroxile ce se găsesc icircn structura acestor compuşi odată cu creşterea pH-ului ar putea să se oxideze formacircnd compuşi chinonici La fel asupra vitezei reacţiei influenţează concentraţia agenţilor de nitrozare care scade cu mărirea pH-ului (pH34)

Tabelul I110

Variaţia parametrilor cinetici icircn f[Ent]0 icircn sistemul NO2- ndash Ent şi NO2

- ndash DMA ndash Ent [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3M pH 26 t = 37oC

Sistemul NO2- ndash Ent Sistemul DMAndashNO2

- ndash Ent

[Ent]0

glWiniţ

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

- Winit

107Ms-1

[NO2-]

105M(20 min)

Efectulreducerii NO2

-

0000030015003006009012015030

025036045085136175208300558

846844826750723627603540320

154156174250277373397460680

17319720622555362659702752

683674658652405375343324210

317326342368595625657676790

mdashmdash 19 mdashmdash

Fig I118 Efectului de reducere al [NO2-]

la interacţiunea lor icircn sistem cu DMA Ent DMA + Ent [Ent]0 = 012gl [NO2

-] = 110-4M [DMA] = 110-3 M pH 26 t = 37ordmC

Fig I119 Variaţia WI de consum a NO2-

icircn funcţie de concentraţia inhibitorului [NO2-] = 110-4M [DMA] = 110-3M

pH 26 t = 37ordmC Astfel constatăm că enotaninele obţinute din seminţe de struguri şi supuse solubilizării icircn intervalul de concentraţii 0003-03 gl micşorează conţinutul ionilor nitriţi icircn sistem

astfel manifestacircnd proprietăţi de antioxidant Efectul reducerii ionilor nitriţi icircn sistemul EntndashNO2- pentru concentraţia maximă (03 gl) de Ent utilizată atinge 68 Icircn prezenţa DMA

concentraţia ionilor nitriţi se micşorează semnificativ datorită participării lor icircn procesul de nitrozare a substratului dat iar pentru intervalul de [Ent]o = = 0003-01gl atinge 625 Creşterea de mai departe a [Ent]0 nu influenţează semnificativ asupra efectului reducerii [NO2

-] astfel mărirea [Ent]0 de 3 ori (de la 01 la 03 gl) duce la creşterea efectului reducerii cu 11 Icircn sistemul Ent ndash NO2

- ndash DMA viteza maximă de reducere a ionilor nitriţi este la pH 26

ConcluziiIcircn baza datelor cinetice obţinute experimental icircn procesul de formare a NDMA şi NDEA studiat după variaţia concentraţiei NNA şi consumul ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare

a DMA şi DEA constatăm

viteza de consum a ionilor nitriţi aminelor şi acumularea NNA formate creşte cu mărirea [DMA]0 şi [DEA] Viteza procesului trece prin

maximul la pH 35 viteza procesului de formare a NDMA este mai mare decacirct a NDEA pentru ace leaşi condiţii de reacţie Această diferenţă este condiţionată de structura lor

care conferă o bazicitate mai icircnaltă pentru DEA şi astfel o viteză mai mică de nitrozare viteza procesului de nitrozare determinată după formarea NNA este mai mică ca viteza de consum a reactanţilor iar neegalitatea vitezelor indică asupra

formării intermediarilor icircn sistem

lt lt

Ionii nitriţi icircn mediul acid formează diferiţi agenţi de nitrozare (NO+ H2NO2+ N2O3) care participă la nitrozarea aminelor secundare alifatice

apariţia maximului vitezei de formare a NDMA şi NDEA icircn funcţie de pH la pH 35 este determinată de faptul că icircn sistem la pHgt35 are loc micşorarea con centraţiei N2O3 care este agentul principal de nitrozare iar la pHlt35 concentraţia lui N2O3 se micşorează şi icircncepe să crească concentraţia NO+ Dar cu toate că NO+ este un agent de nitrozare mai activ decacirct N 2O3 viteza procesului de formare a NNA se micşorează Această micşorare a vitezei este condiţionată de protonarea aminelor la pH scăzut

s-au determinat prin evaluarea computaţională concentraţiile speciilor agenţilor de nitrozare la echilibru icircn funcţie de pH icircn sistemul NO2- ndash H3O

soluţionat icircntr-un model static şi s-a constatat că concentraţia agentului de nitrozare N 2O3 este aproximativ cu două ordine mai mare decacirct concentraţia cationului de nitrozoniu şi că odată cu creşterea acidităţii soluţiei icircn sistemul dat creşte brusc concentraţia NO+

prin soluţionarea modelului dinamic s-a constatat la fel că cationul de nitrozoniu este un agent de nitrozare mai activ astfel cu mărirea pH-ului icircn sistem icircncepe să crească aportul agentului N2O3

procesul de nitrozare a aminelor secundare alifatice poate fi inhibat prin utilizarea următorilor reductoni DFH 4 DFH3Na (+)-catehină enoxil esterul dimetilic al DFH4 şi al acidului tartric După efectul reducerii ionilor nitriţi inhibitorii pot fi aranjaţi icircn următorul şir

EDET ENOXIL EDMD DFH3Na (+)-Ct DFH4

gradul de inhibiţie a reducătorilor determinat după formarea NNA depinde de natura inhibitorului de raportul [Inh] 0 [NO2-] şi de natura

substratului de nitrozare S-a constatat că cu cacirct aminele alifatice sunt mai slab bazice cu atacirct mai mic este gradul de inhibiţie

I2 Nitrozarea aminelor ciclice

I21 Nitrozarea morfolinei

I211 Formarea agenţilor de nitrozare şi efectele toxice asupra organismuluiExpunerea profesională şi a mediului ambiant la NNC este considerată a fi un potenţial pericol pentru sănătatea populaţiei [59-61] Precursorii NNC ionii nitriţi şi aminele

secundare se conţin icircn multe alimente şi pot interacţiona icircn condiţii acide icircn stomac Morfolina ca amină secundară este utilizată pe larg icircn producerea cauciucului şi poate fi convertită la N-nitrozomorfolină (NMOR) (Fig I21) icircn prezenţa nitritului deopotrivă in vivo şi in vitro [60] N-nitrozomorfolina a fost depistată ca o impuritate icircn morfolină (08 mgkg) icircn gazele de evacuare din industria cauciucului Icircn solul din icircmprejurimile fabricilor de producere a cauciucului NMOR s-a depistat icircn concentraţie de 44 mgkg Este posibil ca NMOR să se formeze şi icircn rezultatul transnitrozării din N-nitrozodifenilamină care se formează la producerea anvelopelor icircmpreună cu morfolina N-nitrozomor folina este prezentă icircn aerul atmosferic al uzinelor de producere a chimicalelor (10-40 mgm3) [20] La fel populaţia poate fi expusă la morfolină şi NMOR prin alimentaţie produse cosmetice şi fumul de ţigări [6263] Produsele alimentare pot fi contaminate la tratarea directă de exemplu a fructelor acoperite cu ceară (care conţine morfolină) icircn scopuri de conservare la utilizarea ambalajului (0098-84 mgkg) la tratarea cu aburi icircn timpul procesării

N-nitrozomorfolina este un cancerigen hepatic iar icircn prezenţa N-nitrozodietilaminei produce carcinomă celulară hepatică cu răspacircndirea metastazelor icircn plămacircni (100) [64] Mecanismele efectelor citotoxice şi genotoxice ale diferitelor NNC sunt diverse Alchilnitrozoamidele sunt agenţi de alchilare directă a ADN prin mecanismul SN1 şi nu necesită activare metabolică (metilează toţi atomii de oxigen şi aproape toţi atomii de azot) Leziunea mutagenică principală formată de alchil-nitrozoamide este la O 6-metilguanina [6566] Alchilarea icircn poziţia O6 este responsabilă de mutagenitatea şi cancerigenitatea agenţilor de alchilare NMOR este un cancerigen cu acţiune indirectă care acţionează asupra ADN ducacircnd la ruperi mono- şi dicatenare [67] Acest tip de NNA sunt activate prin reducerea nitrogrupărilor la N-hidroxilaminele din ADN [6869]

Icircn acord cu Appel şi Graf [70] acţiunea indirectă are loc prin ruperea N-nitrozoaminelor (NMOR) icircn rezultatul transferului unui electron de la fierul citocromului P450 rezultacircnd amina secundară şi ˙NO care la racircndul său ar putea ataca ADN

mdashmdash 20 mdashmdashFig I21

Structura NMOR

Efectul genotoxic şi clastogenic al NMOR a fost detectat nu doar pentru celulele hepatocite primare ale şoarecilor [71] şi Hep62 [72] dar şi pentru celulele V79 şi VH10 [7273] cu un nivel scăzut de metabolizare enzimatică

N-nitrozoaminele se formează icircn rezultatul procesului de nitrozare a aminelor cu diferiţi agenţi de nitrozare care se pot forma in vivo Este cunoscut faptul că monoxidul de azot (˙NO) poate fi generat icircn organism de o largă varietate de celule din αndasharginină icircn prezenţa unor enzime Icircn organism ˙NO este un important mediator fiziologic icircn relaxarea muşchilor neurotransmisie şi reglarea presiunii sangvine [74] Deşi icircn majoritatea sistemelor biologice conţinutul de ˙NO este de ordinul nanomolilor el poate reacţiona eficient cu radicalii superoxizi (O2

-˙) icircntr-un proces controlat de difuzie [k (˙NO+ O2-˙) = (39-19)x109 M-1s-1 (75-77)] formacircnd specii citotoxice de peroxinitrit (ONOO-ONOOH) [7879] icircnsă icircntr-o concentraţie mică

Icircn condiţii patologice concentraţia ˙NO creşte şi poate atinge 30 microM [8081] formacircnd icircn continuare diferiţi agenţi de nitrozare [82]

2 ˙NO + O2 rarr 2 NO2˙ k1 = 29 middot106 M-2s-1 (I21)

˙NO + NO2˙ N2O3 k2 = 11middot109 M-1s-1 (I22)

k -2 = 503 middot104 s-1

2 NO2˙ N2O4 2k3 = 9 middot108 M-1s-1 (I23)

k -3 = 138 middot104 s-1

După cum am menţionat mai sus macrofagii activaţi produc ˙NO care poate reacţiona cu O2 sau O2 şi forma agenţi de nitrozare (N2O3) [82] De racircnd cu N2O3 NO poate reacţiona

extracelular cu O2 formacircnd NO2- şi NMOR icircn prezenţa morfolinei [85-87]

2NO + O2 rarr 2 NO2 (I24) NO + NO2 rarr N2O3 (I25)

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 NO2- + 2H+ (I26)

N2O3 + MOR rarr NMOR + NO2- + 2H+ (I27)

N2O3 + X- + H2O rarr HX + 2 NO2- + 2H+ (I28)

La pH fiziologic cacircnd echilibrul icircn reacţia (I26) este deplasat spre dreapta produsul este NO2- Reacţia (I28) este icircn esenţă o hidroliză icircn prezenţa diferiţilor anioni (X- = Cl- I-

Br- CN- şa) S-a stabilit că ionii de Cl- participă icircn astfel de reacţii la pH fiziologic şi constantele de viteză au fost deja determinate [85]Formarea NO3

- la oxidarea NO cu O2 nu are loc Determinarea concentraţiilor de NO format icircn sistem a permis de a constata că numai 47plusmn6 din cantitatea de NO 2- revine NO

eliminat Deci autorii [86] constată că schema redată mai sus este respon sabilă numai pentru jumătate din cantitatea de NO 2- format şi că este posibilă prezenţa unor alte căi de formare a

NO2-

Ionii nitriţi se pot forma la fel icircn rezultatul interacţiunii NO cu O2- care se formează concomitent icircn mediile de cultură [8769] Produsul reacţiei dintre NO şi O2

- este ONOO- care icircn continuare reacţionează cu NO şi icircn rezultat are loc formarea NO2

- şi NO2 [8674]

NO + O2- ONOO- (I29)

NO + ONOO-rarr NO2- + NO2 (I210)

Icircn schema generală ce include reacţiile (I24)-(I210) stoechiometria generală de formare a NO2- icircn prezenţa superoxiddismutazei (SOD) este

3NO + O2- + H2O 3 NO2

- + 2H+ (I211)

Astfel numai un mol de O2- este consumat pentru formarea a trei moli de NO2

- Interacţiunea peroxinitritului cu NO este demonstrată prin capacitatea lui NO de a inhiba parţial hidroxilarea benzoatului mediată de peroxinitrit Constanta de viteză pentru formarea ONO2

- este k9 = 67x109 M-1s-1 [86] Icircn prezenţa O2- au loc la fel reacţii adăugătoare ce descriu formarea

NO3-

ONOO- rarr NO3- (I212)

O2- + H2O frac12O2 + frac12 H2O2 +OH- (I213)

Constantele de viteză sunt pentru k11 = 1s-1 şi pentru k12 = 25x109 M-1s-1 Astfel viteza de formare a NO3- este proporţională cu [ONO2

-] (reacţia I212) care este aproximativ proporţională cu raportul [NO][O2

-] (reacţia I29) Valorile raportului [NO3-][NO2

-] pentru culturi de macrofagi variază icircntre 067 şi 10 [86]Apariţia NO icircn fluidul extracelular a coincis cu formarea NO2

- şi NO3- care au fost formaţi cu viteze aproximativ egale Adăugarea superoxiddismutazei icircn mediul de reacţie reduce

vizibil raportul dintre [NO3-] şi [NO2

-] datorită micşorării [O2-] (reacţia I213) [86]

Adăugarea morfolinei icircn acest sistem a rezultat cu formarea NMOR concurentă cu ceilalţi produşi Astfel formarea NMOR poate avea loc şi la pH fiziologic (74) iar concentraţia ei corelează cu concentraţia NO care apare icircn fluidul extracelular icircntr-o cultură icircn suspensie de macrofagi

Luacircnd icircn consideraţie că NMOR este un cancerigen care produce carcinomă hepatică cu inducerea metastazelor icircn diferite organe studiul procesului de nitrozare şi inhibiţie a formării N-nitrozomorfolinei are o icircnsemnătate deosebită Elaborarea unor noi metode de inhibiţie a procesului de nitrozare a MOR ar diminua concentraţia NMOR ce se poate forma in vivo şi in vitro

Icircn acest scop s-a studiat procesul de nitrozare a MOR pentru intervale de concentraţii ale reactanţilor similare celor ce se găsesc icircn sistemele reale şi icircn condiţiile date s-a determinat influenţa unor noi inhibitori ai procesului de nitrozare a MOR

I212 Legităţi cinetice icircn procesul de nitrozare a morfolinei cu nitriţi

Nitrozarea morfolinei cu ioni nitriţi s-a studiat icircn sisteme-model după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi şi după formarea NMOR [106107] Iniţial s-a studiat pro cesul de nitrozare după variaţia concentraţiei ionilor nitriţi icircn sistem la pH 26 (soluţie-tampon citrat-fosfat) la t = 37ordmC Cinetica procesului de nitrozare a morfoli nei s-a studiat icircn funcţie de concentraţia NO2

- a morfolinei şi de mărimea pH-ului Rezultatele cercetărilor experimentale icircn funcţie de [NO2-]0 şi [MOR]0 sunt prezentate icircn Tabelul I21

mdashmdash 21 mdashmdash

Tabelul I21

Consumul nitriţilor la nitrozarea MOR t = 37ordmC pH 26 = 520 nm [MOR]0 = 1x10-3M [NO2

-]0 = 1x10-4M

Nrcrt

[NO2-]o moll NO2

- consumat (30 min)

W x 106 M∙s1

Constanta de viteză M-1s-1

[MOR]o moll NO2- consumat (30 min)

W x 107M∙s-1

1 510-5 5614 017

K =

06

5

510-6 M 3816 113

2 110-4 6519 035 110-5 M 4638 185

3 210-4 6925 129 110-4 M 652 35

4 310-4 7009 18 110-3 M 7427 495

Odată cu variaţia [NO2-]0 icircn sistem icircn intervalul 5x10-5 ndash 3x10-4M cota-parte de ioni nitriţi consumaţi creşte icircn intervalul 5614-7009 iar viteza iniţială variază de la 017x10 -6

Ms-1 pacircnă la 18 x10-6 Ms-1 Din rezultatele prezentate icircn Figura I22 constatăm că viteza creşte liniar icircn funcţie de [nitrit total] 02 Această dependenţă liniară a W de [NO2

ˉ]2 indică faptul că

specia care reacţionează cu MOR este N2O3 deoarece se formează din doi moli de HNO2 (ec I22 I25) Raportul dintre concentraţia ionului nitrit şi a substratului creşte (cu creşterea [NO2

-]0) de la 005 pacircnă la 03 dar rămacircne mai mic decacirct 1

Fig I22 Dependenţa vitezei de consum a NO2- icircn funcţie de [NO2

-]0 şi [NO2-]0

2 la nitrozarea MOR t = 37degC pH 26 [MOR]0 = 110-3M

Icircn cazul icircn care [NO2-]0 nu este egală cu [MOR]0 şi [MOR]0gtgt[NO2

-]0 pentru a determina constanta de viteză utilizăm ecuaţia redată icircn [108]

sau (I214)

(I215)

Constanta de viteză calculată pentru reacţia de nitrozare a morfolinei determinată după consumul de NO2- este k1 = 065 M-1s-1 iar expresia vitezei de nitrozare se exprimă icircn modul

următorW = k1 [MOR][NO2

-]2 (I216)Icircn expresia vitezei [MOR] reprezintă concentraţia totală de substrat care indică concentraţia molară a MOR ionizate plus MOR liberă iar [NO2

-] ndash concentraţia totală de ioni nitriţi care alcătuieşte suma concentraţiilor molare de NO2

- şi HNO2 Viteza procesului de consum a ionului nitrit icircn funcţie de [MOR]0 variază icircn intervalul 113x10-7ndash 495x10-7 M∙s-1 (Tab I21)

mdashmdash 22 mdashmdash

Fig I24 Dependenţa de valoarea pH

[MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M t = 37ordmC

Fig I23 Determinarea constantei de viteză la nitrozarea MOR ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC unde a ndash [MOR]0 b ndash [NO2-]0)

Icircn acest interval de concentraţii efectul concentraţiei NO2- este predominant deoarece icircn expresia pentru viteză ionul nitrt este la puterea a doua Din Tabelul I21 observăm că

creşterea concentraţiei NO2- de şase ori duce la creşterea vitezei de nitrozare de şapte ori Icircnsă creşterea [MOR]o de 200 de ori măreşte viteza iniţială numai de 43 ori [107]

Viteza de formare a NMOR calculată din concentraţiile totale de substrat şi ion nitrit depinde de pH-ul mediului Datele experimentale obţinute sunt prezentate icircn Tabelul I22 şi icircn Figura I24

Tabelul I22

Cinetica nitrozării MOR cu nitrit-ion după consumul de NO2- icircn funcţie de pH

(t = 37ordmC [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M = 520 nm)

Nrcrt

pH Nitritul consumat timp de 30 min W x 107

M∙s-1k1

M-1s-1

1 10 4975 141 0372 20 5442 178 0523 30 8421 27 1144 34 8989 40 1235 40 7105 233 071

Viteza iniţială icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34 (egală cu valoarea pKa pentru HNO2) iar consumul de NO2- la acest pH este cel mai icircnalt (8989) Această dependenţă

reflectă influenţa acidităţii mediului asupra concentraţiei agenţilor de nitrozare şi a morfolinei neprotonateAgenţii de nitrozare formaţi se consideră cancerigeni şi mutageni datorită capacităţii de a nitroza morfolina cu formarea NMOR Icircn procesul de reacţie ionii nitriţi se consumă iar

viteza de consum depinde cum a fost constatat de diferiţi factori fizico-chimiciNumai morfolina neprotonată participă icircn procesul de

nitrozare şi formează N-nitrozomorfolina Notacircnd concentraţia morfolinei totale ca [MOR] şi forma neionizată ndash [MORo] atunci concentraţia formei neprotonate a morfolinei poate fi determinată din relaţia [86]

(I217)

unde pk la 37ordmC este 823 Pentru a studia procesul de nitrozare a MOR după variaţia concentraţiei de NMOR formată s-a utilizat metoda de analiză termoenergetică (ATE) [101] Nitrozarea MOR cu ioni nitriţi s-a efectuat icircn soluţie-tampon citrat-fosfat (~pH 25) icircn funcţie de concentraţia NO2

- icircn intervalul (137-55)x10-3M S-a constatat (Tab I23) că concentraţia NMOR creşte de la 129 microM la 259 microM iar cota-parte de NMOR formată la nitrozare variază icircn limitele (308-620) pentru intervalul dat al [NO2

-]0 (Fig I25)Astfel cu creşterea [NO2

-]0 icircn sistem observăm creşterea [NMOR] Cantitatea iniţială de MOR este de 25 micromol iar icircn procesul de nitrozare se transformă de la 077 micromol pacircnă la 155 micromol icircn proba analizată (Tab I23) Randamentul scăzut al reacţiei de nitrozare este determinat de protonarea aminelor la pH 25 care nu se supun nitrozării

Tabelul I23

Determinarea NMOR prin ATE icircn f[NO2-]0 şi influenţa unor

inhibitori asupra procesului de nitrozare pH 25 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [MOR]0 = 5 mM

[NO2-]0

mMStandard Proba NO-Amina

Aria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

55 NO2- MF 279 10 100 723 100 259 100 259 155416 NO2- MF 279 10 100 523 100 210 100 210 126275 NO2- MF 279 10 100 444 100 159 100 159 095137 NO2- MF 279 10 100 359 100 129 100 129 077DMA+DFH4 279 10 100 013 100 005 10 1 000DEA+DFH4 279 10 100 0 100 0 1 0 000MF etanol 65 279 10 100 094 100 034 100 34 02MF 234 spir 279 10 100 083 100 03 100 30 018MF234 rezv 279 10 100 228 100 082 100 82 049

spir SA 279 10 100 0 100 0 1 0 0

Dacă comparăm datele obţinute la nitrozarea morfolinei (Tab I24) la un pH mai ridicat (pH 28) la aceeaşi concentraţie de NO 2- egală cu 5 mM (dar mai introducem icircn sistem

NaCl de 005 M) cu datele din Tabelul I23 la aceeaşi [NO 2-]0 atunci constatăm că concentraţia NMOR formate icircn sistem creşte de la 269 microM pacircnă la 416 microM Icircn prezenţa ionilor de Cl -

viteza procesului de nitrozare creşte (Tab I24) deoarece se formează clorura de nitrozil NOCl care este un catalizator al procesului de nitrozare

Fig I25 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR icircn funcţie de [NO2-]0

şi cromatograma obţinută [MOR]0 = 5 mM pH 25 t = 37ordmC

Din rezultatele experimentale prezentate icircn [110] s-a constatat că procesul de nitrozare a MOR decurge cu formarea NMOR Prin metoda ATE s-a determinat formarea NMOR la nitrozarea cu ioni nitriţi După viteza de consum a ionilor nitriţi icircn sistem am constatat că acest proces depinde de [NO2

-]0 pH şi [MOR]0 I213 Metodele de inhibiţie icircn procesul de formare a N-nitrozomorfolinei

Diminuarea efectelor citotoxice genotoxice şi clastogenice ale NNC este obiectivul principal icircn cercetările ştiinţifice icircn acest domeniu Proprietăţile mutagenice şi cancerigenice ale NNC pot fi inhibate pe mai multe căi [69] (1) inhibiţia formării NNC (2) inhibiţia reacţiei dintre NNC sau a altor specii reactive cu ADN şi (3) inhibiţia mutagenicităţii NNC prin activarea reparării leziunilor induse de NNC icircn ADN

mdashmdash 23 mdashmdash

0

1

2

3

4

5

6

7

Ran

dam

en

t

137 275 416 55

[NO2-]o mM

Ran

da

me

nt

[NO2-]0 mM

Fig I26 Formarea aminocarbamaţilor

Pentru a reduce efectele citotoxice ale NMOR au fost selectaţi diferiţi antioxidanţi ca vitaminele C şi E [72] Au fost optimizate concentraţiile acestor inhibitori [89] uti lizacircnd testarea pe celulele V79 ale hamsterilor şi celulele carcinomei colonului uman Caco-2 Citotoxicitatea a fost evaluată utilizacircnd tehnica excluziei cu tripan albastru (care indică prezenţa celulelor moarte) icircn celulele Caco-2 şi testul eficienţei de icircnsămacircnţare icircn celulele hamsterilor V79 (care determină mărirea sau pierderea capacităţii de reproducere)

După cum s-a evidenţiat icircn [89] vitamina C a micşorat semnificativ efectul genotoxic al NMOR de la 60 la 40 icircn celulele Caco-2 şi de la 56 la 20 icircn celulele V79 S-a micşorat şi efectul citotoxic icircn prezenţa vitaminei C icircn ambele sisteme Vita mina E a redus citotoxicitatea indusă de NMOR numai icircn celulele Caco-2 care se gă sesc icircn colon

Astfel s-a constatat că vitamina C este un reducător mai puternic care inhibă formarea NNC prin reducerea ionului nitrit [5990] Acţiunea antimutagenică a vitaminei C poate fi corelată cu capacitatea acesteia de a bloca legarea covalentă a unor NNC de ADN celular [91] Prin compararea acţiunii efectului inhibitor al acestor două vitamine la reducerea efectelor toxice icircn prezenţa NMOR şi N-metil-Nprime-nitro-N-nitrozoguanidinei (MNNG) s-a constatat că ambele vitamine nu prezintă nici un efect protector icircmpotriva citotoxicităţii induse de MNNG [93] Astfel s-a presupus că nici una din aceste vitamine nu a afectat metilarea ADN indusă de MNNG sau repararea acestor modificări ale ADN confirmacircnd faptul că deşi atacirct NMOR cacirct şi MNNG aparţin aceluiaşi grup de NNC mecanismul efectelor lor citoxice este diferit

Un alt inhibitor testat icircn procesul de nitrozare a morfolinei la pH fiziologic este dioxidul de carbon S-a presupus acelaşi mecanism de inhibiţie icircn formarea NMOR ca şi icircn cazul vitaminei C adică icircn primul racircnd diminuarea concentraţiei agentului de nitrozare care se poate forma printr-un amestec de ˙NO şi O2 [85] Studiind N-nitrozarea morfolinei cu compuşi donori de ˙NO (PAPA NONOate şi MAMA NONOate) icircn funcţie de pH Kirsch şi col [94] au ajuns icircnsă la o altă concluzie

Icircn rezultatul studiilor experimentale [94] s-a constatat că HCO 3- nu poate să protejeze morfolina icircn procesul de nitrozare la pH-ul fiziologic (pH 74) icircnsă CO 2 inhibă nitrozarea

pacircnă la pH 89 Acest efect protector al lui CO2 se explică prin formarea carbamatului de morfolină (Fig I26) dar nu prin diminuarea concentraţiei agenţilor de nitrozare [95] Se presupune că formarea aminocarbamaţilor in vivo este o ulterioară posibilitate de a inhiba N-nitrozarea aminelor atacirct de către ˙NOO2 cacirct şi de către ˙NOO2˙- Icircntrucacirct nucleofilitatea aminelor are un rol decisiv icircn reacţiile de nitrozare provocate de N2O3 factorii care micşorează densitatea electronilor la atomul de azot trebuie să diminueze reactivitatea aminelor faţă de N2O3 Icircn [94] s-au

efectuat calcule chimico-cuantice ale distribuţiei sarcinii la morfolină anionul carbamatului de morfolină şi al acidului corespunzător şi s-a obţinut micşorarea sarcinii de la -071 la -059 şi -051 corespunzător Astfel atomul de azot al carbamatului de morfolină sau al acidului corespunzător este un nu cleofil mai slab decacirct atomul de azot al morfolinei şi astfel carbamaţii formaţi sunt mai puţin susceptibili atacului oxidativ al N2O3

Gradul de inhibiţie a procesului de nitrozare a aminelor cu CO2 practic nu depinde de tipul sistemului de nitrozare (˙NOO2 sau ˙NOO2˙-) dar depinde strict de proprietăţile chimice ale aminelor de a produce carbamaţi

Valorile pKa ale aminelor frecvente icircn organismele vii se află icircn limitele 9-12 Icircn general ele vor fi protejate de atacul agenţilor de nitrozare deoarece la pH 74 ele sunt aproape complet prezente icircn formă protonată Icircn condiţii acide nitritul este capabil să nitrozeze substratele generacircnd două specii de agenţi de nitrozare şi anume N2O3 şi ionul H2NO2

+ care este icircn echilibru cu NO+ şi care trebuie să nitrozeze direct aminele protonate [96] Totuşi există substrate pentru care pKa scade mai jos de 8 (aminoacidul

terminal al peptidelor proteinelor şi αndashaminogrupările hemoglobinei (pKa = 61 ndash 71) [96]La fel s-a studiat inhibiţia N-nitrozării morfolinei prin inducerea icircn dietă a vitaminelor C şi E [9798] a catehinelor a ceaiului verde şi a sucului din fructe [99] Se constată că

efectul protector este legat de reducerea ionului nitrit din dietă [98109] Este necesar a constata că efectul genotoxic al NMOR sintetizate icircn condiţii de labo rator icircn prezenţa antioxidanţilor este similar pre-tratării celulelor cu vitaminele A C şi E ce se conţin icircn dietă [100] Produsele dezaminării cum ar fi uracilii hipoxantinele şi xantinele sunt mutageni puternici şi ele

Pentru a micşora viteza acestui proces am studiat influenţa diferiţilor inhibitori acid DFH4 DFH3Na pigment carotenoidic extras din spirulină EDMT EDMT (+)-CtDatele prezentate icircn Tabelul I24 (obţinute atacirct după formarea NMOR cacirct şi după consumul de NO2

-) indică la faptul că odată cu creşterea [DFH4]0 concentraţia de NMOR se

micşorează de la 416 microM pacircnă la 70 microM pentru concentraţiile mM mM

mM mM (Tab I24) Icircn intervalul dat al concentraţiei inhibitorului randamentul reacţiei de nitrozare scade de la 10 pentru [DFH 4]0 = 0 pacircnă la 17 la [DFH4]0

= 30 mM (Fig I27)

Tabelul I24

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [DFH4]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 28 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat [NaCl]0 = 005 M[DFH4]0 mM

Standard Proba NO-MorfolinaAria Conc Vol Aria Vol Conc Diluţia Conc Total10 M uM uL 10 M uL uM uM umol

000 DHF 407 10 100 847 50 416 100 416 250

05 DHF 407 10 100 626 50 308 100 308 185

15 DHF 407 10 100 548 50 269 100 269 162

200 DHF 407 10 100 355 50 174 100 174 105

300 DHF 407 10 100 143 50 070 100 70 042

Fig I27 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a activităţii inhibitoare ( faţă de control) de [DFH4]0 şi cromatogramele obţinute pH 28 [NO2-]0 = 5 mM

[MOR]0 = 5 mM [NaCl]0 = 005 M timp de reacţie 60 min

Raportul [DFH4][NO2-]0 este lt1 pentru toate concentraţiile de DFH4 utilizate icircn sistem icircnsă reacţia dată este inhibată aproape complet Cu creşterea acestui raport [DFH 4] [NO2

-]gt1 obţinem o inhibiţie totală chiar şi icircn cazul MOR care are o viteză de nitrozare destul de icircnaltă (k 1 = 065 M-1s-1) comparativ cu DMA (k1 = 00017 M-1s-1) sau cu atacirct mai mult DEA (Tab I23) care icircn condiţiile date nu formează NDEA [110]

S-a studiat la fel procesul de formare a NMOR icircn prezenţa extractului carote noidic din Spirulină Este cunoscut [102] că Spirulina conţine un şir de compuşi importanţi pentru menţinerea proceselor vitale ale organismului uman printre care sunt peste 50 de principii bioactive care exercită o acţiune terapeutică benefică şi care intervin icircn reglarea tuturor funcţiilor organismului [102] De racircnd cu toate vitaminele (excepţie face vitamina D) Spirulina conţine carotenoizi dintre care o mare pondere o are beta-carotenul precursor al vitaminei A

mdashmdash 24 mdashmdash

Icircn cercetările experimentale s-a utilizat pigmentul carotenoidic obţinut din Spiru lină [102] Din extractul de Spirulină icircn concentraţie de 6 mgml s-au pregătit diferite concentraţii de pigment carotenoidic (PC) C1

PC = 01 mgml C2PC = 05 mgml C3

PC = 075 mgml C4PC = 15 mgml şi C5

PC = 25 mgml Randamentul reacţiei de nitrozare este maximal icircn absenţa spirulinei (η = 161) şi scade pacircnă la 15 pentru [Spir]0 = 25 mgml (Fig I28)

Din datele prezentate icircn Tabelul I25 şi icircn Figura I28 se observă că cantitatea de NMOR formată scade brusc de la 444 mol pacircnă la 071 mol icircn intervalul (0-05) mgml de PC iar creşterea [PC]0 icircn continuare influenţează mai puţin asupra efectului inhibitor

Tabelul I25

Determinarea NMOR prin ATE icircn f [PC]0 [NO2-]0 = 5 mM pH 26 t = 37ordmC

soluţie-tampon citrat-fosfat

[PC]o mgml Standardconcentraţia 10 uM vol 100 uL

Probavol 100 uL diluţia 1000

NO-Morfolina NMOR form

Grad de inh

Aria Aria Conc Conc Total

10 M 10 M uM uM umol

000 459 340 074 672 403 1612 00

010 459 278 061 606 363 1452 100

050 459 055 012 120 072 288 8224

075 459 682 149 149 089 356 7792

075 459 067 015 146 088 352 7820

150 459 038 008 83 050 200 8760

250 459 033 007 57 034 136 9160

Din datele experimentale obţinute am constatat că viteza procesului de nitrozare a MOR cu nitriţi sub acţiunea DFH 4 şi a pigmentului carotenoidic se micşorează Concentraţia NMOR determinată prin metoda ATE scade icircn prezenţa DFH4 icircn intervalul de concentraţie (00-30) mM cu 852 faţă de cantitatea de NMOR formată faţă de control

Icircn cazul procesului de inhibiţie cu PC icircn intervalul (00-25) mgml are loc o diminuare a conţinutului de NMOR cu 916

Consumul de NO2- la inhibiţia procesului de nitrozare a MOR

La fel s-a studiat efectul inhibitorilor al diferiţilor antioxidanţi icircn procesul de nitrozare a morfolinei după viteza de consum a ionilor nitriţi Unii antioxidanţi cum sunt acidul ascorbic vitamina E şi acidul 5-aminosalicilic inhibă reacţiile de N-nitrozare icircn procesul de cataliză acidă [104]

Icircn Tabelul I26 sunt prezentate rezultatele experimentale obţinute icircn inhibiţia procesului de nitrozare a MOR icircn prezenţa diferiţilor reducători DFH 3Na DFH4 (+)-catehină la pH 26 şi EDET EDMD DFH4 la pH 34 La pH 26 DFH4 s-a dovedit a fi foarte eficient icircn inhibiţia reacţiei de nitrozare a MOR comparativ cu DFH3Na şi (+)-catehină

Concentraţia de DFH4 necesară pentru a diminua aproape total concentraţia de NO2- icircn sistem este de 1x10-3 M Conform datelor prezentate icircn Tabelul I26 constatăm că DFH3Na

este un inhibitor mai puţin eficient icircn procesul de nitrozare a MOR decacirct (+)-Ct şi DFH4Concentraţia de nitrit (icircn ) calculată din diferenţa Cx-C0 (unde CxC0 ndash concentraţia NO2

- redus icircn prezenţa şi icircn absenţa inhibitorilor corespunzători) creşte odată cu creşterea [Inh]0 (Fig I210a) Derivaţii sintetizaţi (Fig I29) din acidul tartric (EDET) şi DFH 4 (EDMD) au manifestat un efect negativ comparativ cu DFH 4 icircn procesul de reducere a ionilor nitriţi (Fig I210b)

Tabelul I26

Inhibiţia nitrozării morfolinei icircn funcţie de concentraţia iniţială a reducătorului ([MOR]0 = 1∙10-3M [NO2

-]0 = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC)

pH 26

DFH3Na DFH4 (+)-Ct

[Red]oM

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la 30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

0 3334 237

074

3334 237

174

3334 237

1011∙10-4 275 315 18 55 2333 46

5∙10-4 209 428 103 735 1846 527

1∙10-3 897 52 15 973 679 68

pH 34

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

[Red]oM

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

NO2- () rezid la t=30 min

Win x107 Ms-1 KinhM-1s-1

EDET EDMD DFH4

1∙10-4 654 307

025

5∙10-5 633 291

14

4665 396

1845∙10-4 6487 337 1∙10-4 5226 31 2578 80

1∙10-3 637 34 3∙10-4 427 375 033 98

5∙10-4 3116 517 028 121

mdashmdash 25 mdashmdash

Fig I28 Dependenţa randamentului reacţiei de formare a NMOR şi a gradului de inhibiţie de [PC]0 şi cromatograma obţinută (t = 60 min)

Fig I212 Gradul de inhibiţie a reducătorilorfaţă de control pentru [MOR]0 = 1∙10-3M

[NO2-]0 = 1∙10-4M

Fig I29 Structura chimică a esterului dimetilic al DFH4 (a) a esterului dietilic al acidului tartric (b) şi a cetotautomerului EDMD (c)

Viteza de nitrozare a MOR cu NO2- este mai mare comparativ cu nitrozarea DEA şi DMA La concentraţia NO 2

- de 1∙10-4M şi MOR de 1∙10-3M se consumă 60 de ioni nitriţi Icircn prezenţa inhibitorilor (DFH4) consumul total de NO2

- creşte şi alcătuieşte ~ 100 (Tab I26) Icircn cazul EDET pentru aceleaşi condiţii de reacţie con sumul de ioni nitriţi alcătuieşte 346 (Tab I26) ceea ce este mai puţin cu 321 decacirct icircn absenţa inhibitorului (Fig I210) Pentru EDMD la concentraţia de 1 ∙10-4M consumul NO2

- este mai mare (477) comparativ cu EDET dar la fel este mai mic cu 19 decacirct icircn absenţa inhibitorului iar odată cu creşterea [EDMD]o pacircnă la 5∙10-4M creşte şi consumul NO2

- (pacircnă la 688)

(a) (b)

Fig I210 Concentraţia de ioni nitriţi redusă de inhibitor icircn funcţie de [inh]o (Cx-Co) icircn unde Cx-Co ndash de nitrit redus icircn prezenţa (Cx) şi icircn absenţa (Co) diferiţilor inhibitori

Rezultatele obţinute indică la faptul că icircn cazul EDMD şi EDET reacţia predominantă este interacţiunea acestor inhibitori cu amina şi nu cu agenţii de nitrozare Esterul dimetilic al DFH4 interacţionează rapid cu anilina sau cu substituenţii anilinei icircn cataliza acidă cu formarea produsului de dimetil-bis(arilamino)maleat [103] Am putea presupune că şi morfolina la fel poate interacţiona icircn procesul de cataliză acidă (pH 34) cu inhibitorul dar nu cu ionul nitrit ceea ce duce la micşorarea consumului de NO2

- Teoretic pot avea loc două mecanisme de cataliză

acidă la sinteza produsului icircntre amină şi inhibitor [103] (a) protonarea cetotautomerului EDMD urmată de reacţia cu aminele eliminarea apei formarea celui de-al doilea cetotautomer şi repetarea etapei de mai sus (b) adiţia acid-catalizată a aminei la legătura dublă a EDMD urmată de eliminarea apei şi repetarea acestor etape Mecanismul (a) este mai favorabil [103] deoarece dimetildiacetoxifumaratul nu reacţionează cu amina icircn condiţiile catalizei acide iar EDMD reacţionează uşor

(I218)

Icircn rezultatul reacţiei (I218) icircn sistem are loc diminuarea concentraţiei aminei (MOR) care la fel este un predecesor icircn procesul de formare a NNCDeterminarea constantelor de viteză pentru reacţia dintre nitrit şi inhibitori a fost bazată pe viteza de reacţie cunoscută a substanţei de referinţă

Rezultatele descrise mai sus au indicat că inhibitorii utilizaţi au inhibat N-nitrozarea icircn mod liniar (Fig I211) iar din Figura I23 am constatat că agentul de nitrozare este N2O3 Icircn acest caz constanta de viteză (kR) pentru reacţia dintre inhibitor şi N2O3 poate fi calculată utilizacircnd constanta de viteză determinată pentru reacţia MOR cu N2O3 (065 M-1s-1)

Fig I211 Dependenţa Wi de consum a NO2 ˉ icircn f [Inh]o

pentru [MOR]0 = 1∙10-3M [NO2-]0 = 1∙10-4M

Icircn sistemul dat agentul de nitrozare N2O3 generat icircn mediul acid poate reacţiona icircn trei moduri [104]

(1) interacţiunea cu inhibitorii V = d[Inh]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3]

(I219)(2) interacţiunea cu morfolina d[N2O3]dt = kMmiddot[MOR]middot[N2O3]

(I220)(3) hidroliza N2O3 cu formarea

nitritului d[N2O3]dt = khmiddot[N2O3]

(I221)Hidroliza N2O3 este neglijabilă deoarece această reacţie este prea lentă pentru a fi relevantă (kh = 1000s-1) [105] Astfel viteza de consum a N2O3 este următoarea W = -d[ N2O3]dt = kInhmiddot[Inh]middot[N2O3] + kMmiddot[MOR]middot[N2O3] (I222)Icircn absenţa inhibitorilor viteza de consum a agentului de nitrozare este proporţională vitezei iniţiale de interacţiune a N2O3 cu MOR Prin icircmpărţirea ecuaţiei (I222) la (I219)

obţinem următoarea ecuaţie WV = 1+ kMmiddot[MOR] kInhmiddot[Inh] (I223)

Din concurenţa inhibitorilor şi MOR pentru N 2O3 se calculează constanta de viteză a reacţiei dintre inhibitor şi N2O3 (kInh) Valorile constantelor de viteză a N2O3 cu toţi inhibitorii studiaţi sunt calculate şi prezentate icircn Tabelul I26 Mărimea con stantei vitezei de interacţiune a inhibitorilor cu EDMD (k = 075 M -1s-1) şi cu EDMT (k = 034 M -1s-1) este cu mult mai mică decacirct constanta de viteză pentru nitrozare a MOR cu NO2

- (fără inhibitor la pH 34) Astfel constatăm că aceşti esteri se consumă icircn reacţia nu cu ionii nitriţi dar cu aminele Icircn acest caz consumul NO2

- faţă de control (sistemul NO2- ndash MOR) va fi negativ Efectul inhibitor al compuşilor studiaţi corelează cu constantele de viteză pentru reacţia dintre N2O3 şi inhibitor Gradul

de inhibiţie (icircn ) a reducătorilor este prezentat icircn Figura I212 pentru concentraţia reducătorilor de 1∙10 -4M Din rezultatele prezentate observăm că concurenţa pentru agentul de nitrozare icircn sistemul dat o cacircştigă mai uşor DFH4 apoi urmează (+)-catehina şi DFH3Na La fel a fost testat pigmentul caratenoidic icircn procesul de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-a studiat variaţia concentraţiei NO2

- icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de concentraţia pigmentului carotenoidic C1

PC = 0008 mgml C2PC = 0012 mgml C3

PC = 0016 mgml C4PC = 0024 mgml şi

C5PC = 0032 mgml

Acest interval de concentraţii s-a ales mai icircngust reieşind din datele experimentale obţinute icircn sistemul MOR ndash NO2- ndash PC studiat după formarea NMOR prin metoda ATE

(intervalul a fost (01-25) mgml) (Fig I28) adică s-a studiat intervalul concentraţiilor PC icircn care efectul inhibitor variază semnificativ icircn funcţie de [PC]0 S-a determinat variaţia concentraţiei de ioni nitriţi icircn sistemul NO2

- ndash PC şi MOR ndash NO2

- ndash PC icircn funcţie de pH-ul mediului [PC]0 şi [NO2-]0 Rezultatele

mdashmdash 26 mdashmdash

0

2

4

6

8

10

12

0 05 1[Inh] mM

W10^7 M

s^-1

DFH4 (1) DFH3Na (2) (+)-Ct (3)EDET (4) EDMD (5)

1

2

3

4

5

W1

0^7

Ms^

-1

DFH4

DFH4

DFH3Na

DFH3Na ( 2 ) DFH4 (1)

Consumul de NO2 ndash total Consumul de NO2 ndash comparat cu controlul

DFH3Na DFH4 (+)-Ct EDET EDMD Control

pH 26 pH 26 pH 26 pH 34 pH 34 pH 34

Cl

H2NSO2

N

SNHCH2

H

O O

cinetice obţinute icircn sistemul NO2- ndash PC icircn funcţie de [PC]0 indică la faptul că viteza de consum a NO2

- creşte odată cu creşterea [PC]0 iar timp de 40 minute concentraţia NO2- se micşorează cu

90 la C5PC (Tab I27) Astfel constatăm că icircn sistem PC interacţionează cu NO2

- şi micşorează concentraţia agenţilor de nitrozare

Tabelul I27

Dependenţa parametrilor cinetici icircn funcţie de [PC]0 la nitrozarea MOR[NO2

-] = 1∙10-4M pH 26 t = 37ordmC

Sistemul NO2- ndash PC (I) Sistemul MOR ndash NO2

- ndash PC (II)

[PC]0 Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

- Winiţ [NO2-]middot105M de NO2

-

x102 x107 la 40 min redus la x107 la 40 min redus lamgml Ms-1 40 min Ms-1 40 min

0 0 100 0 0 100 0

08 12 33 67 35 16 84

12 16 24 76 48 13 87

16 20 18 82 53 11 89

24 30 13 87 75 06 94

32 36 10 90 83 055 95

0

20

40

60

80

100Ra

ndam

ent

08 12 16 24 32

[PC]o 10^2 mgmlFig I213 Dependenţa Winiţ de [PC]o[NO2

-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC Fig I214 Dependenţa randamentului reacţiei

de transformare a NO2- icircn f[PC]o icircn sistemele

NO2- ndash PC şi NO2

- ndash PC ndash MOR [NO2-] = 1∙10-4M [MOR] = 1∙10-3M pH 26 t = 37ordmC

Analizacircnd datele din Tabelul I27 observăm că viteza iniţială de consum a NO 2

- la C5PC este de 23 ori mai mare icircn prezenţa MOR decacirct icircn sistemul NO2

- ndash PC (Fig I213) fapt datorat consumului NO2

- icircn procesul nitrozării MOR Concentraţia de NO2- icircn sistemul I timp de 40 min este aproximativ de două ori mai mare decacirct icircn sistemul II (Tab I27)

La determinarea NMOR icircn procesul de nitrozare cu NO2- prin metoda ATE icircn funcţie de [PC] s-a constatat că [NMOR] scade brusc pacircnă la 05 mgml de PC (Fig I28) Aceste

rezultate au fost confirmate prin determinarea concentraţiilor de NO2- după 40 min de reacţie Concentraţia de NO2

- se micşorează brusc de la 10∙10-5M pacircnă la 1∙10-5M icircn intervalul de concentraţii ale PC de 0008-0032 mgml datorită interacţiunii agenţilor de nitrozare formaţi cu inhibitorii

S-a studiat la fel procesul de nitrozare a aminelor secundare ciclice ndash hidroclorotiazida (HCTZ) şi inhibiţia proceselor de formare a NNA icircn sisteme-model S-a deter minat viteza procesului de nitrozare a HCTZ după variaţia concentraţiei nitritului icircn timp icircn prezenţa diferiţilor inhibitori acidul ascorbic(AAs) rezveratrolul (Rez) (+)-ca tehina ((+)-Ct) acidul dihidroxifumaric (DFH4) tanin standardizat (tanin st) enoxil enotanin

Hidroclorotiazida are o icircnaltă activitate diuretică şi hipotensivă şi reprezintă un preparat din grupul derivaţilor benzotiodiazidici care conţine icircn poziţia C (7) gruparea funcţională sulfonamidă avacircnd următoarea structură

Formula de structură Aranjarea spaţială a moleculei

Mecanismul de formare a Nndashnitrozohidroclorotiazidei poate fi urmărit icircn schema ce urmează (I223)

mdashmdash 27 mdashmdash

icircn absenţa MOR icircn prezenţa MOR

SNH

N

O O

Cl

SNH2

O

O

H

+ N O+

SNH

N

OO

N HO

S

Cl

O

O

NH2

- H+ S

NH

NNO

OOS

Cl

O

O

NH2

hidroclorotiazida

Nndashnitrozohidroclorotiazida

Din studiul cinetic cu privire la inhibiţia procesului de formare a NHCTA a fost calculată concentraţia remanentă de ioni nitriţi icircn funcţie de concentraţia utilizată de reducător Reieşind din valorile obţinute a fost determinat gradul de reducere a ionului nitrit la nitrozarea HCTA icircn funcţie de natura şi concentraţia reducătorilor

Din rezultatele obţinute constatăm că reducătorii obţinuţi din produse secundare vinicole demonstrează capacitaţi de inhibiţie icircn formarea NHCTZ

Concluzii Cercetările proceselor de nitrozare a MOR cu utilizarea ionilor nitriţi efectuate pe sisteme-model atacirct după variaţia [NO 2] cacirct şi după

[NMOR] confirmă formarea NMOR Viteza procesului de formare a NMOR creşte odată cu mărirea concentraţiei componenţilor din sistem iar viteza iniţială de nitrozare icircn funcţie de pH trece prin maximum la pH 34

Constanta vitezei de consum a ionilor nitriţi icircn procesul de nitrozare a MOR a fost determinată pentru pH 26 după viteza de consum a nitriţilor icircn sistem (k = 065 M-1s-1) Icircn intervalul de pH1-4 mărimea constantei vitezei de consum a NO2

- icircn sistemul NO2- MOR variază icircn limitele (037-123) M -1s-1 fiind maximă la pH 34 (k =

123 M-1s-1) Constanta vitezei de nitrozare a MOR determinată după viteza de formare a NMOR este de 041 M-1s-1 Această diferenţă este determinată de

transformarea ionilor nitriţi icircn produşi intermediari ndash agenţi de nitrozare care la racircndul lor nitrozează amina iar stadia limită icircn proces este interacţiunea acestor agenţi cu amina Procesul de nitrozare a MOR cu ionii nitriţi (după formarea NMOR determinat prin metoda ATE) a fost studiat icircn prezenţa diferiţilor inhibitori

DFH4 DFH3Na EDMT EDMD pigment caratenoidic din spirulină S-a constatat că aceşti compuşi inhibă procesul de nitrozare a MOR iar gradul de inhibiţie este determinat de natura şi concentraţia inhibitorului

Randamentul reacţiei de formare a NMOR fără inhibitor (icircn condiţiile date) este de 10 şi scade pacircnă la 16 icircn prezenţa DFH 4 de 1 mM iar icircn cazul PC se micşorează pacircnă la 136 pentru [PC] = 25 mgml Activitatea inhibitorului creşte de la 0 (fără inhibitor) pacircnă la 83 iar icircn cazul PC pentru concentraţia maximă (25 mgml) este de 91

S-a studiat influenţa unui şir de inhibitori asupra procesului de nitrozare a MOR după viteza de consum a ionilor nitriţi S-au elucidat particularităţile EDT şi ale EDMD icircn acest proces Calculele efectuate pentru activitatea inhibitoare după consumul ionului nitrit icircn prezenţa EDET indică o activitate mai mică cu 321 iar pentru EDED ndash cu 19 comparativ cu sistemul fără inhibitor Din rezultatele obţinute se constată că icircn prezenţa acestor inhibitori reacţia predominantă este interacţiunea lor cu MOR dar nu cu agenţii de nitrozare Astfel inhibiţia procesului se realizează prin diminuarea concentraţiei substratului de nitrozare icircn rezulta tul protonării cetotautomerului EDMD urmat de interacţiunea lui cu aminele

Icircn baza constantei de viteză a procesului de nitrozare a MOR cu NO2- calculată experimental şi datelor cinetice obţinute la inhibiţie s-au calculat constantele de inhibiţie

pentru diferiţi inhibitori inh = 174 M-1s-1 inh = 074 M-1s-1 kctinh = 101 M-1s-1 (la pH 26) kEDMT

inh = 025 M-1s-1 şi kEDMDinh = 034 M-1s-1 inh = 184

M-1s-1 (la pH 34)

I3 Nitrozarea amidelor

I31 Precursori ai N-nitrozometilureeiN-nitrozometilureea (NMU) aparţine unei clase de compuşi cancerigeni cum sunt N-nitrozoamidele care sunt instabili icircn soluţii apoase la pH gt 5 De aceea este foarte puţin

probabil ca NMU sau alte N-nitrozoamide să fie depistate icircn alimente icircn concentraţii apreciabile Totuşi este posibil ca N-nitrozoureele să se formeze in vivo icircn stomac prin ingestarea precursorilor (amide şi ioni nitriţi) deoarece procesul de nitrozare este favorizat de pH-ul acid al mediului de reacţie Icircn prezent formarea intragastrică a N-nitrozocompuşilor icircn organismul uman este bine stabilită şi are un rol important icircn apariţia cancerului gastric [114118121] De racircnd cu aceasta cancerigenitatea NMU se manifestă asupra sistemului nervos central şi periferic cailor respiratorii pielii rinichilor etc [120]

Cancerul gastric poate fi asociat cu consumarea predecesorilor (nitraţi nitriţi şi substrate de nitrozare) Ca precursori ai formării N-nitrozoamidelor pot fi diferite alchiluree şi alchilguanidine [138] (de ex citrulina arginina NN-metilenbisacrilamida şi metilguanidina) La nitrozarea metilguanidinei (MGD) se formează 35 NMU (Fig I31) [141]

Fig I31 Structura chimică a NMU şi MGD

Produsele din peşte uscat conţin 20-180 mg metilguanidinăkg a cărei nitrozare produce NMU icircnsă cu o viteză mai lentă decacirct nitrozarea metilureei [141] Transfor mările au loc după următoarea schemă

Metilguanidinărarr1-metil-1-nitrozoguanidinărarrN-metilnitrozocianamidărarrrarrN-nitrozometiluree

Principalul precursor al metilguanidinei ce pătrunde icircn organismul uman este creatinina şi creatina care sunt constituenţi caracteristici ai extractului de carne [117 120] Creatina este prezentă icircn carnea şi peştele proaspăt iar creatinina este produsul ei deshidratat (ec I31) şi se formează la prepararea peştelui şi a cărnii icircn timpul proceselor de uscare prăjire afumare

H3C CH3

N ndash CH2 N ndash CH2

HN = C COOH HN = C C = O (I31)

NH2 NH

Creatină Creatinină

Icircn studiile sale anterioare SMirvish [125] a indicat că creatinina ce este prezentă icircn concentraţii destul de icircnalte (30-1400 ppm) icircn carne peşte şi produse de mare poate fi nitrozată cu formarea NMU Pacircnă la 4gkg de creatinină apar icircn carnea prăjită şi peştele sărat uscat care este produsă prin deshidratare [118120]

Icircn rezultatul tratării creatininei cu ioni nitriţi se formează metilureea care icircn con tinuare se nitrozează formacircnd NMU Formarea metilureei are loc conform următoarei scheme [118]

Creatininărarr5-oxo-creatinină ndash 5-oximărarr1-metil-hidantoin-5-oximărarrrarrN-nitrozometiluree

Prima etapă din acest lanţ este limită Unele studii epidemiologice din SUA au presupus că ar fi o legătură icircntre consumarea cărnii tratate cu ioni nitraţi nitriţi şi apa riţia leucemiei la copii şi a tumorilor la creier [126]

Ca substrate de nitrozare cum s-a menţionat mai sus pot servi şi alchilureele Ele pot fi uşor transformate icircn alchilnitrozourei [125126] Icircn China icircn sosurile de peşte s-a constatat prezenţa N-nitrozometilureei care se acumulează la păstrarea icircn timp a produselor [119]

Icircn trecut se considera că pot fi nitrozate doar aminele secundare Studiile efectuate icircn continuare au indicat că N-nitrozoaminele se pot forma şi la nitrozarea aminelor terţiare a compuşilor cuaternari de amoniu care se găsesc icircn mediul icircnconjurător alimente şi droguri

mdashmdash 28 mdashmdash

CH3 NH CNH

NH2

Procesul de nitrozare poate avea loc pe cale chimică sau microbiologică Nitrozarea pe cale chimică depinde de mai mulţi factori bazicitatea aminei pH-ul mediului de reacţie concentraţia substratului şi prezenţa catalizatorilor şi inhibitorilor Unul din tre catalizatorii importanţi icircn procesul de nitrozare a substraţilor sunt tiocianaţii care sunt prezenţi icircn salivă icircn cantităţi de la 12 la 33 mg100 ml [119140] Icircn cantităţi mai mari aceşti ioni se găsesc icircn saliva fumătorilor

Aminocompuşii slab bazici (de exemplu amidele derivaţii ureei şi unele amine aromatice) nu interacţionează cu oxidul de azot N 2O3 Aceşti compuşi interacţionează la pH mai scăzut şi se nitrozează pe altă cale care include interacţiunea substratului neutru cu ionul de nitrozoniu hidratat sau nehidratat

Y-NO + RNHCORrsquo rarr RN(NO)CO Rrsquo + H3O+ (I32) N-nitrozamidaDe obicei aceste reacţii sunt foarte lente la pHgt3 dar ele decurg cu o viteză mai mare cu creşterea acidităţii

I32 Cinetica şi mecanismul nitrozării metilureeiS-a studiat experimental nitrozarea metilureei care se poate forma ca metabolit la transformarea creatininei din produsele din carne şi peşte Ca precursor al agenţilor de nitrozare s-

a utilizat nitritul de sodiu [127-129]Procesul de nitrozare s-a studiat după variaţia concentraţiei de NMU formată utilizacircnd metoda spectrofotometrică-extracţională Icircn calitate de extragent a fost utilizat eterul

dietilic La fel s-a studiat viteza acestei reacţii după variaţia [NO 2-]0 icircn sistem Intervalele de concentraţii icircn sistemele-model au fost următoarele [NO2

-]0 = 005-10 mM [MU]0 = 003-10 mM pH 1-4

Cercetarea procesului de nitrozare s-a efectuat icircn celule termostatate Pentru sinteza N-nitrozometilureei s-a utilizat metilureea şi nitritul de sodiu La fel a fost studiată nitrozarea NN-bisacrilamidei [138] Volumul total de soluţie a alcătuit 20 ml Icircndată după introducerea nitritului se stabileşte timpul reacţiei La intervale de 10 20 30 60 90 min se iau probe a cacircte 3 ml care se trec icircn eter dietilic şi se icircnchid ermetic Extracţia se efectuează de două ori prima dată cu 3 ml de solvent a doua oara ndash cu 2 ml Icircn extractul obţinut a fost determinată concentraţia NMU la λ = 235 nm şi 325 nm

Procesul de nitrozare a MU s-a realizat la t = 37ordmC iar cinetica reacţiei de nitro zare s-a studiat după variaţia densităţii optice (DO) la λ = 235 nm care s-a determinat cu ajutorul spectrofotometrului SF-46 icircn cuve de cuarţ de 10 mm Concentraţia NMU a fost calculată utilizacircnd coeficientul de extincţie pentru NMU a cărei mărime la λ = 235 nm icircn solvent organic este egală cu 8x103 lmolbullcm

Cinetica nitrozării metilureeiDeoarece la modelarea sucului gastric pH-ul este unul dintre parametrii importanţi s-a studiat viteza procesului de nitrozare a MU icircn funcţie de pH-ul mediului S-au modelat următoarele intervale de pH 10 20 30 40 Concentraţia [MU]o = = 01 mM şi [NO2

-]0 = 01 mM S-a observat că concentraţia NMU formate creşte cu micşorarea pH-ului Dacă pentru pH 1 la t = 10 min [NMU] = 188times10 -5M atunci pentru pH 4 [NMU] = 034times10 -5M la acelaşi interval de timp La nitrozarea amidelor viteza procesului nu trece prin maximum dar scade cu creşterea pH-ului (Fig I32) Din datele prezentate se observă că viteza procesului este destul de lentă la pH gt 2 Cu micşorarea pH-ului de la 2 la 1 viteza creşte mai mult de două ori (de la 1383times times10-9 M-1s-1 3133times10-9 M-1s-1) [130131] Pro