APLICAREA GENOMICII IN STABILIREA PROGNOSTICULUI. IMPLICATII ASUPRA SELECTIEI TERAPIEI

Curs- C11

CUPRINSUL CURSULUI FACTORI DE PROGNOSTIC SI DE PREDICTIE

EFICIENTA TERAPEUTICA

CLASIFICAREA HISTOLOGOCA STANDARD

TESTE GENOMICE IN PROGNOSTIC SI IN PREDICTIA RASPUNSULUI TERAPEUTIC

FACTORI DE PROGNOSTIC SI PREDICTIE

GENOMICAC11

PROGNOSTICUL EVOLUTIEI BOLII (Henry and Hayes)

Factorul de prognostic permite segregarea in subpopulatii de pacienti cu rezultate predictibile (supravietuire, perioada de evolutie naturala a bolii) mai precise decat cel ale totalitatii pacientilor

In acest fel, tratamentul poate fi mai tintit si pune mai bine in balanta riscurile cu beneficiile.

Evaluarea markerilor tumorali este importanta in stabilirea prognosticului.

Evolutia bolii, in cazul tumorilor maligne, este data de: estimarea capacitatii de crestere in volum a tumorii (capacitatea proliferativa), capacitatea de a migra din site-ul de origine si de a-si mentine cresterea la distanta (potentialul

metastatic) sensibilitatea sa relativa si respectiv rezistenta la chimioterapie.

Prognosticul (in sens restrans legat de boala specifica) = perioada de supravietuire fara boala Prognosticul (in sens mai larg legat de conditiile specifice ale individului bolnav cum ar fi existenta simultana a mai multor boli) = supravietuirea in general

PROGNOSTICUL EVOLUTIEI BOLII (Henry and Hayes)

Factor de prognostic de obicei se refera la o proprietate

care confera o sansa de recidiva daca unicul tratament utilizat este extirparea tumorii. (exclude efectul medicatiei sau radioterapiei asupra evolutiei cancerului).

Influenteaza atat capacitatea proliferativa cat si pe cea metastatica si implica riscul de deces in absenta unei alte terapii inafara inlaturarii chirurgicale a tumorii.

Factor de predictie marker tumoral care ajuta la selectarea

pacientilor pentru o terapie mai tintita care are sanse mai mari sa fie eficace asupra acelei tumori particulare.

Un factor de predictie poate fi: factorul molecular tinta al terapiei

respective o molecula sau o cale metabolica care

modifica eficacitatea terapiei o alterare care este un epifenomen legat

de tinta sau de calea metabolica a terapiei respective (cum ar fi poliferarea accelerata sau co-amplificarea genelor de vecinatate).

DIFERENTIEREA FACTOR DE PROGNOSTIC FACTOR DE PREDICTIE

De obicei exista un amestec de factori de prognostic cu factori de predictie. Un factor de prognostic pur: Cu o aceeasi terapie aplicata, existenta factorului de prognostic negativ va face ca evolutia sa fie mai mica spre vindecare in grupului celor cu factor de prognostic negativ prezent. Terapia poate fi eficace dar este in mod egal eficace (in termeni relativi) atat pentru cei cu factor de prognostic prezent cat si in cei cu factor de prognostic absent si de aceea curbele grupului tratat fata de cel ne tratat sunt paralele.

Un factor de predictie pur: Prognosticul in absenta terapiei este acelasi pentru pacientii cu factorul pozitiv (prezent) ca si la cei la care factorul este absent (negativ). Dar pacientii cu factorul pozitiv prezent au un prognostic mai bun decat cei cu factorul negativ in prezenta tratamentului pentru care factorul respectiv este un factor de predictie.

EXEMPLU DE FACTOR DE PREDICTIE - PROGNOSTIC (Henry and Hayes)

Receptorul estrogenic (ER) din tesutul mamar malign este pozitiv legat de raspunsul la terapia antiestrogenica (ablatia ovariana, tamoxifen, inhibitori de aromataza) pentru ca estrogenii joaca un rol in cresterea tumorii estrogen dependenta.

Prin contrast, continutul in -glicoproteina este un factor predictiv negativ pentru rezistenta la mai multe medicamente, pentru ca aceasta proteina moduleaza rezistenta multidrug prin cresterea efluxului de agent antineoplazic din celula canceroasa.

In realitate acesti factori sunt si prognostici si predictivi. De ex in cancerul de san ER este un factor predictiv puternic si un slab factor prognostic. Cancerele la san cu continut mare de ER au in general un potential de crestere mai mic si deci pacientii au un prognostic mai bun, chiar daca nu primesc tratament.

Exista insa si situatii in care avem un marker de prognostic rezervat, dar care este un predictor de rezultat bun al tratamentului sau doar a anumitor tratamente. Un astfel de marker este proto-oncogena erB-2 (HER-2, c-neu).

erB-2 - HER 2

HER2 face parte din familia EGFR (epidermal growth factor receptor). Este amplificat sau exprimat in exces in 15-30% din cancerele nou diagnosticate si se asociaza cu un comportament mai agresiv. Dupa legarea ligandului de acest receptor glicoproteic, receptorul devine

activat prin homo sau heterodimerizare, ducand la o cascada de evenimente ce implica activarea domeniului tirozinkinazei, a caii Ras/Raf/MAPK (mitogen activated protein kinase), si fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K)/Akt/tinta rapamicinei la mamifere (mTOR).

Aceste mecanisme duc la crestere celulara rapida, diferentiere, supravietuire si migrare, fenomene asociate cu cancerele mamare HER2-positive. Prin aceasta prognosticul (perioada de supravietuire fara boala si supravietuirea in general) sunt diminuate

erB-2 - HER 2

HER2 prezice o relativa rezistenta la terapia hormonala si agentii alchilanti, dar o sensibilitate la antracicline.

erB-2 serveste drept tinta pentru un anticorp monoclonal (trastuzumab); raspunsul este strans legat de amplificarea erB-2 sau de expresia in exces sau de ambele aceste fenomene.

Poate fi masurat:

- in tesuturi prin teste pentru: - exprimare, cel mai frecvent de imunohistochimie sau - amplificare genica, cel mai frecvent hibridizare in situ.

- in ser sau plasma prin metode ELISA.

Este crescut la 30% din pacientii cu cancer metastazat.

EFICIENTA TERAPEUTICA

GENOMICAC11

EFICIENTA TERAPEUTICA

Doza de substanta activa necesara pentru a produce un anume efect la 50% din populatie este doza efectiva mediana. Eficacitatea unei molecule creste odata cu cresterea dozei; reactiile adverse pe care aceasta le determina cresc odata cu cresterea dozei.

fereastra terapeutica populationala reprezinta concentratiile stabile in care sansa de aparitie a efectului terapeutic este mare si a efectelor adverse este mic.

Harrison: Principles of Clinical Pharmacology

Cu cat aceasta fereastra este mai larga, cu atat dozele pot fi mai usor adaptate pacientului. In cadrul acestei ferestre de concentratii (dependente de doza, dar influentate de calea de administrare si de absorbtie ) se pot compara doua medicamente si se poate stabili corect eficacitatea clinica si indicatia terapeutica.

ETAPE IN STABILIREA EFICIENTEI TERAPEUTICE

In introducerea unei indicatii terpeutice in portofoliul unui medicament sunt mai multe etape de parcurs, dupa identificarea si testarea lui experimentala. Acest lucru se realizeaza prin studii clinice prin care se completeaza intregul tablou al influentei medicamentului asupra organismului uman.

Marimea lotului studiat, definirea clara a obiectivelor si a parametrilor masurati pentru atingerea lor, stabilirea regulilor de intrerupere a studiilor precum, modalitatea de selectie a cazurilor control precum si reproductibilitatea observatiei influenteaza acuratetea concluziei.

In stabilirea eficientei unui medicament se parcurg 4 faze, fiecareia corespunzandu-i un anumit tip de studiu.

Studii de faza I reprezinta primul stadiul de testare la om avand ca scop: Evaluarea sigurantei medicamentului (farmacovigilenta) si a Tolerabilitatii Evaluarea farmacocineticii (modul in care organismul il absoarbe, il transporta spre anumite tesuturi

distributia- il metabolizeaza sau nu si rata cu care il elimina) Evaluarea farmacodinamicii : efectul medicamentului asupra organismului Identificarea reactiilor adverse pe masura cresterii treptate a dozei. Pentru aceasta se alege un grup mic de invidizi sanatosi (in jur de 20-50); mai rar sunt utilizati direct

pacienti in stadii terminale de boala incurabila.

ETAPE IN STABILIREA EFICIENTEI TERAPEUTICE

Studii de faza II Sunt studii controlate randomizate (substanta terapeutica/placebo) cu scopul de a defini

efectele clinice ale medicamentului intr-o indicatie clinica particulara si a stabilirii dozei terapeutice si a eficacitatii cat de bine actioneaza medicamentul pentru doza prescrisa intr-o situatie particulara a unei boli, cu ce reactii adverse si cu ce riscuri.

Studii de faza III Sunt studii randomizate controlate multicentrice, desfasurate pe grupuri largi de pacienti (3003,000 sau mai multi) in functie de boala si

au scopul de a stabili eficacitatea noului medicament comparativ cu tratamentele existente.

In general sunt necesare cel putin 2 astfel de studii clinice cu rezultate pozitive pentru a obtine aprobarea de introducere pe piata a unui nou medicament.

Studii de faza IV (post marketing) Presupun supravegherea din punctul de vedere al sigurantei si efectelor adverse

(farmacovigilentei) si se desfasoara practic pe toata durata de comercializare a medicamentului.

Au ca scop detectarea efectelor adverse rare sau a celor ce apar in timp, dupa o utilizare indelungata sau la distanta afata de utilizarea lui. Efectele adverse aparute in aceasta faza au dus la retragerea de pe piata a cerivastatin (Baycol and Lipobay), troglitazone (Rezulin) si rofecoxib (Vioxx).

Pentru interpretarea corecta a studiilor clinice precum si a tuturor articolelor si a concluziilor acestora aplicabile in medicina, s-a dezvoltat o metodologie de abordare a acestor publicatii in sensul identificarii unor criterii de rigurozitate stiintifica care sa clasifice calitatea informatiei obtinute prin cercetare. In acest fel s-a nascut conceptul de medicina bazata pe dovezi.

FAZELE UNUI STUDIU CLINIC

Faza a studiului clinic

Obiectiv Nr aprox de pacienti

Faza I Explorarea efectelor toxice posibile si determinarea tolerantei interventiei (si a doze tolerate). Evaluarea sigurantei.

10 to 30

Faza II Determina daca tratamentul are efecte terapeutice sau daca exista sanse ca beneficiile sa depaseasca riscurile.

20-50

Faza III Compararea noilor tratamente cu tratamentul standard sau cu un control sau placebo (daca nu exista tratament standard).

100-1000

Faza IV Obtinerea de informatii pe termen lung, pe o scara larga privind morbiditatea si efectele tardive (studii postmarketing).

mii

VALIDITATEA EVIDENTELOR Categorie Descriere Ia Evidente din meta analize si studii clinice randomizate si

controlate Ib Evidente din cel putin un studiu clinic randomizat si controlat IIa Evidente din cel putin un studiu clinic controlat, dar fara

randomizare IIb Evidente din cel putin un alt studiu clinic cvasi-experimental III Evidente din studii descriptive, cum sunt studiile

comparative, studiile de corelatie si studiile caz control IV Evidente din rapoartele comisiilor de experti sau opinii sau

experienta clinice ale autoritatilor in domeniu

Elementele esentiale in sustinerea validitatii unui studiu in special terapeutic sunt: randomizarea, alocarea prin metoda dublu orb a pacientilor in grupele de studiu (necunoscuta nici de investigatori, nici de pacienti), similaritatea initiala a grupurilor, parcurgerea intregului proces de catre cei inrolati in studiu si claritatea obiectivul tratamentului

MEDICINA BAZATA PE DOVEZI Medicina bazata pe dovezi (Evidence-based medicine) este procesul de revizuire

sistematica, evaluare critica (appraising) si de folosire a rezultatelor cercetarii clinice pentru a le utiliza in funizarea optimului de ingrijire pacientilor

Principul pe care se bazeaza MBD este acela ca trebuie sa tratam daca exista evidente ca tratamentul are un beneficiu si ca nu trebuie sa tratam daca nu exista evidente ale beneficiului. Aceasta are importanta la toate nivelele: Strategic: in stabilirea politicilor publice prin evaluarea tehnologiilor Tactic: Organizatiile de servicii medicale formuleaza si implementeaza ghiduri si pattern-uri de

ingrijire (care pathways) care permit clinicienilor sa adapteze tratamentul la circumstantele si profilul de risc specific al fiecarui pacient.

Problemele specifice ale pacientului sunt transpuse de clinician intr-o intrebare care are un raspuns in bazele de date de studii clinice, pornind de la: caracteristicile pacientului, tipul de interventie propus, comparatia intre diferite interventii posibile si rezultatele dorite.

Dupa identificarea problemei, ea trebuie rafinata in intrebari foarte precise a caror raspuns este apoi cautat.

Sursele de informare sunt: experienta personala, rationamentul si intuitia, colegii si datele publicate. Primele sunt caile traditionale de informare care sunt mai putin riguroase.

CLASIFICAREA PUBLICATIILOR Clasificarea surselor de publicatii in functie de gradul lor de evidenta:

1++ Meta-analize de inalta calitate, revizii sistematice ale studiilor clinice controlate si randomizate, sau ale studii clinice controlate si randomizate cu un grad foarte mic de bias

1+ Meta-analize bine alcatuite, revizii sistematice sau studii clinice controlate si randomizate cu un grad foarte mic de bias

1 Meta-analize, revizii sistematice sau studii clinice controlate si randomizate cu un risc mare de bias

2++ Revizii sistematice de inalta calitate ale studiilor caz-control sau ale studiilor de cohorta

2 ++Studii caz-control sau studii de cohorta de inalta calitate cu un risc mic de factori de confuzie sau bias si cu o mare probabilitate ca relatia sa fie una de tip causal

2+ Studii caz-control sau studii de cohorta bine conduse cu un risc mic de factori de confuzie sau bias si cu o probabilitate moderata ca relatia sa fie una de tip causal

2 Studii caz-control sau studii de cohorta cu un risc mare de factori de confuzie sau bias si un risc significativ ca relatia sa fie una non cauzala

3 Studii non analitice: de exemplu, cazuri raportate, serii de cazuri

4 Expert opinion

RCT: randomised controlled trial; SIGN: Scottish Intercollegiate Guidelines Network

APRECIEREA RASPUNSULUI LA TRATAMENT

varsta sexul Sarcina efortul fizic expunerea profesionala variatii circadiene si sezoniere Dieta stres-ul Fumatul Consumul de alcool

Raspunsul la tratament este considerat, din punctul de vedere al farmacogenomicii, un raspuns fenotipic gena mediu. (Drug response is considered to be a gene-by-environment phenotype), ceea ce echivaleaza cu a spune ca raspunsul unui individ la medicatia administrata este dat de interrelatia intre multipli factori de mediu si cei genetici.

Pentru diferite reactii neobisnuite la tratamente au fost identificate substraturi genetice: de exemplu, se stie ca toxicitatea celulara a izoniazidei este datorata unei metabolizari mai lente la unii indivizi, care favorizeaza acumularea acesteia in organism; metabolizarea lenta este datorata unei izoenzime a citocromului P450.

prezenta infectiilor functia cardio-

vasculara functia gastro-

intestinala functia imunolologica functia hepatica functia renala febra

contaminanti ai medicamentului

Modul de prezentare al medicamentului

Interactiuni cu alte medicamente administrate simultan

suplimente de dieta (nutritive)

FACTORI INDIVIDUALI

FACTORI PATOLOGICI MEDICAMENT

INTREBAREA FUNDAMENTALA A CHIMIOTERAPIEI

Raspunsurile se regasesc in identificarea profilelor genice diferite.

Metodele genomice pot face divizarea pe criterii de exprimare genica a tumorilor aparent identice (tumori care au aceeasi provenienta tisulara, cu un acelasi grad de malignitate identificat prin metodele histologice clasice, cu aceeasi invazivitate constata la momentul diagnosticului estimata prin numarul metastazelor, si a gradului de invazivitate ganglionara).

Bronchud Principles of Molecular Oncology: In testarea noilor terapii este importanta tinta celulara, nu doar tintele moleculare atinse de terapie si conformatia moleculara precisa (cum ar fi un receptor, e.g., EGFRs) ci si intreaga matrice de tinte ale tumorii respective. Selectia pacientilor pentru studiile de faza II ar trebui sa se bazeze pe criteriile de includere/excludere conventionale (tip tumoral, grad histologic, stadiu TNM, starea generala a pacientului, varsta si sex), si pe o matrice specifica, numita matrice a tintelor pentru una sau (preferabil) chiar mai multe cai de reglare.

1. ce protocol de tratament da rezultate optime in ceea ce priveste supravietuirea si calitatea vietii pacientului depistat cu cancer inca de la momentul depistarii bolii? 2. de ce tumori aparent identice la care s-a utilizat protocolul clasic de terapie duc la rezultate diferite la diferiti pacienti?

CLASIFICAREA HISTOLOGICA STANDARD

Genomica C11

CLASIFICAREA HISTOLOGICA Nottingham Grading system (NGS) masoara gradul de diferentiere a tumorii

printr-o metoda semi-cantitativa de evaluare a caracteristicilor morfologice Se evalueaza 3 caracteristici morfologice:

(a) gradul de formare a tubulilor si a glandelor (b) pleomorfismul nuclear (c) numaratoarea mitotica

este o metoda relativ simpla si ieftina Dezavantajul: este greu de standardizat, depinde de experienta anatomopatologului.

RELATIA INTRE GRADUL DE DIFERENTIERE HISTOLOGICA SI SUPRAVIETUIRE

Din graficul alaturat se constata diferenta intre evolutia pacientelor care au nu primit fata de cele care au primit chimioterapie pentru cele 3 tipuri de diferentiere celulara.

In studiul din Nottingham recaderea (re-aparitia unei tumori noplazice de acelasi tip dupa o perioada in care nu au existat manifestari clinice de boala) la pacientele cu cancer gradul 1 a fost rara (4%).

Maximum de beneficiu a fost obtinut pentru pacientele in stadii incipiente, ER pozitive si fara metastaze.

Pentru tumorile cu grade avansate (2 si 3) stadializarea NGS are valoare limitata in stabilirea deciziilor terapeutice.

EARLY STAGE BREAST CANCER Stage 0 Ductal carcinoma in situ (DCIS) is very early breast cancer that has not spread beyond the duct.

Stage I Tumor is < 2 cm and has not spread outside the breast.

Stage IIA No tumor is found in the breast, but cancer is found in the axillary lymph nodes, or tumor is 2 cm and has spread to the axillary lymph nodes, or tumor is 2-5 cm but has not spread to the axillary lymph nodes.

Stage IIB Tumor is 2-5 cm and has spread to the axillary lymph nodes or is > 5 cm but still confined to the breast.

Source: National Cancer Institute

ADVANCED BREAST CANCER

Stage IIIA The tumor in the breast is smaller than 5 centimeters and the cancer has spread to underarm lymph nodes that are attached to each other or to other structures, OR the tumor is more than 5 centimeters across and the cancer has spread to the underarm lymph nodes.

Stage IIIB Tumor has spread to tissue near the breast (i.e. the skin or chest wall) and may have spread to lymph nodes within the breast area or under the arm.

Stage IIIC Tumor has spread to the lymph nodes beneath the collarbone and near the neck, and may have spread to the lymph nodes within the breast area or under the arm and to the tissues near the breast.

Stage IV Tumor has spread to other organs of the body (i.e. lungs, liver, or brain).

Source: National Cancer Institute

TESTE GENOMICE IN PROGNOSTIC SI IN PREDICTIA RASPUNSULUI

TERAPEUTIC

Genomica C11

GENETICA AJUTA LA IDENTIFICAREA PATIENTILOR CU RISC CRESCUT DE A DEZVOLTA CANCER LA SAN

Genetica este studiul ereditatii

genetica influenteaza genomica, dar genetica este responsibila doar pentru 5-10% din cancerele la san

Genetica se concentreaza in special pe sansa de a aparitie a unui cancer

Testele genetice gasesc mutatii, nu boli

Source: Understanding Cancer Series: Gene Testing,National Cancer Institute

EXEMPLE DE TESTE GENETICE SI GENOMICE

Teste Genetice

BRCA1 si BRCA2 Conformatia genetica este testata pentru anumite mutatii ale BRCA1 si BRCA2. Pacientii care prezinta acele mutatii au sanse mai mari sa dezvolte cancer la san.

Teste Genomice

Oncotype DX Breast Cancer Assay

Nivelul de exprimare a 21 de gene este masurat in tesutul tumoral al pacientilor care sunt deja diagnosticati cu cancer la san. Acest test evalueaza daca un pacient va avea o recadere (prognostic) si prezice beneficiul chemioterapiei sau a terapiei hormonale (predictiv).

PREMIZELE TEORETICE PENTRU TESTELE GENOMICE 2 Premize esentiale:

programele variate de transcriptie ale celulelor maligne sunt responsabile de diversitatea biologica a celulelor maligne, de evolutia lor naturala si de raspunsul la tratament.

tumorile prezinta acelasi profil genic de-a lungul evolutiei lor, in toate fazele clinice si ca profilul genic nu este influentat de tratament. Acest lucru este extrem de important pentru ca el implica faptul ca prognosticul si selectia

tratamentului poate fi facuta din momentul depistarii.

De asemeena, acelasi profil genic s-a regasit in celulele metastazate din tumora primara.

Traducerea semnalelor de transcriere si a sistemelor de reglare celulara de la mediu extern celulei in interiorul celulei controleaza nivelul de expresie a genelor in genom.

Utilizand microsonde de ADN complementar, s-a realizat un adevarat portret molecular al fiecarei tumori.

Diversitatea fenotipica a tumorilor de san este sustinuta de o diversitate a exprimarii genice si cunoasterea acesteia duce la o noua taxonomie a tumorilor.

Dupa identifiarea profilului genic al tumorilor analizate, s-a folosit metoda clustering-ului hierarhic pentru a grupa rezultatele individuale in categorii pe baza similaritatii exprimarii genice

CLASIFICAREA PERROU: CRITERII Au fost utilizate 2 criterii de baza:

Tipul de celula de origine: celule basale (si/sau mioepiteliale) care exprima genele keratina 5, keratina 17, integrina

b4 si laminina celule luminale care exprima in mod caracteristic: estrogen receptor 1, human

endogenous retrovirus envelope pl1, x-box binding protein 1, hepatocyte nuclear, factor 3alpha, gata-binding protein 3, gata-binding protein 3, gata-binding protein 3, gata-binding protein 3, annexin.

prezenta sau nu a a receptorului pentru receptorul estrogenic (ER).

Pe baza acestor criterii, au concluzionat ca pot imparti celulele epiteliale mamare in: celule normale, celule ER+/luminal like celule bazal-like celule Erb-B2+.

Carcinoamele mamare receptor estrogen negative reprezinta doua tipuri tumorale ce trebuie tratate separat: basal-like ErB-B2 positiv,

CLASIFICAREA PERROU TUMORILOR MALIGNE ALE SANULUI FATA DE CONSENSUL St GALLEN

tumori luminal B, tumori ER + cu o exprimarea inalta a

genelor de proliferare

tumori ER exprimare inalta a genelor de proliferare

tumori luminal A, tumori ER + cu o exprimarea redusa a genelor de proliferare, ssb

la trat.anti-estrogenic

tumori basallike, tumori triplu negative

Risk Category Endocrine-Responsive

Endocrine-Nonresponsive

Minimal/low risk ER-and/or PgR-posi 35 years

Average/high risk ER-and/or PgR-posi

DESCRIEREA STUDIULUI PROFILULUI GENIC AL TUMORILOR MAMARE

Institutul National de Cancer din Olanda a initiat un studiu care in final a creat instrumentul folosit actual in diferentierea prognosticului pe baza de profil genic ducand la identificarea a doua categorii: categoria cu risc crescut de prognostic negativ si cea cu probabilitate mare de prognostic pozitiv,

Aceste riscuri sunt estimari ale frecventei sansei de recadere.

Initial au fost monitorizate 98 de femei cu cancer de san fara metastaze ganglionare, sub 55 ani, si cu tumori < 5 cm media de urmarire 8.7 ani. folosind o metoda statistica de frecventa de asociere a imaginii numita clasificare

supervizata s-au identificat 273 de gene care pareau sa se coreleze cu exprimarea clinica a prognosticului (prezenta de metastaze ganglionare in intervalul de 5 ani).

Aceste gene au fost ierarhizate pe baza puterii corelatiei, selectandu-se in final 70 de gene pe baza carora tumora devine clasificata in tumora cu prognostic buna sau rau.

Toate tumorile au fost clasificate pe baza acestui criteriu, prin compararea profilului de expresie genica cu cel mediu al tumorilor care nu au metastazat

O prima validare a fost facuta pin aplicare acestei metode pe un alt grup de tumori, cu rezultate corecte in sensul clasificarii adecvate in 17 din 19 cazuri.

DESCRIEREA STUDIULUI PERROU Reluand studiul pe un numar mai mare de cazuri (234), autorii au stabilit un prag de corelatie

(r>0.4) intre profilul tumorii si profilul mediu al tumorilor cu prognostic favorabil care a fost verificat apoi prin monitorizarea evolutiei pacientelor timp de 10 ani: supravietuirea celor cu prognostic favorabil a fost de 95%, iar a celor cu prognostic nefavorabil de 55%. Aceasta evaluare se coreleaza cu o parte din factorii de prognostic descrisi anterior (varsta, gradul de

malignitate al tumorii si status-ul receptorilor estrogenici, dar este independenta de invadarea ganglionilor limfatici).

Profilul genic a indicat un hazard ratio de 4.6 (95% CI, 2.3 to 9.2; P< 0.001).

Comparand metodele de clasificare a tumorilor, (clasificarea St Gallen si clasificare NIH), profilul genic s-a dovedit: la fel de bun in a identifica pacientele cu risc crescut si superior in identificarea pacientelor cu risc scazut, care nu necesitau chimioterapie.

Diferenta a fost destul de mare: prin tehnica profilului genic s-au identificat 40% dintre paciente ca fiind cu prognostic bun, in timp ce prin clasificarea St gallen numai 15%, iar prin clasificarea NIH numai 7%.

DESCRIEREA STUDIULUI PERROU

Pacientele identificate cu risc scazut prin aceasta tehnica s-au dovedit a fi mai multa vreme in remisiune clinica decat cele identificate cu prognostic bun pe baza altor clasificari.

Testul a avut o valoare predictiva foarte buna: 96% .

valoarea predictiva negativa a fost mult mai mica (38%) datorit faptului ca pragul testului a fost stabilit in asa fel incat sa omita cat mai putine cazuri cu evolutie negativa.

De aceea, se poate afirma ca si aceasta metoda de clasificare va face sa fie tratate in exces unele cazuri, desi reuseste sa scada rata de tratament inutil de la 30% la 25%. Valoarea prognostica a testului a aratat un OR de 15.3 (CI= 1.8-127, p=0.00 3)

DESCRIEREA TESTARII

1. Prepararea probei: extractia ARN-ului si, prin reverse transcriptie, sintetizarea ADNc din ARN extras din proba si din proba de referinta.

2. Marcarea fragmentelor de de ADN astfel obtinute cu fluorocromi, astfel incat sa fie detectate in momentul combinarii cu chip-ul cu microsonde.

DESCRIEREA TESTULUI

3. Hibridizarea probei pe microsonda ADN: proba este pusa in contact cu microchip-ul, care este o retea rectangulara de puncte. Aceste puncte corespund oligonucleotidelor reprezentand gene; aceste puncte sunt printed de 9 ori. Fiecare punct are multe copii a unei secvente particulare de ADN, derivate din bazele de date ale Human genome Project. Cand proba este pusa in contact cu microchip-ul, are loc procesul de hibridizare: care inseamna ca proba de ADN se leaga de segmentul micro-chip-ului care are aceeasi secventa complementara de nucleotide.

4. Scanarea microsondei are loc dupa ce hibridizarea este completa si are ca scop detectarea fluorescentei si crearea unei imagini digitale care reflecta unde proba de ADN s-a combinat cu punctele retelei microchip-ului.

5. Normalizarea presupune ajustarea intensitatii semnalului la un standard comun (normal).

6. Etapa finala este cea de analiza computerizata a rezultatelor: Sutele de puncte de date ale microchip-ului sunt comparate cu referinte pentru a putea clasifica proba respectiva intr-o categorie.

COMPARATIE INTRE CARACTERISTICILE CLINICE SI PROFILUL GENOMIC

CHARACTERISTIC

POOR-PROGNOSIS SIGNATURE GOOD-PROGNOSIS SIGNATURE P VALUE

(N=180) no. of pa?ents (%) (N=115) no. of pa?ents (%) Age

CHARACTERISTIC

POOR-PROGNOSIS SIGNATURE GOOD-PROGNOSIS SIGNATURE P VALUE

Vascular invasion 0.38

Absent 108 (60) 77 (67)

13 Vessels 18 (10) 12 (10)

>3 Vessels 54 (30) 26 (23)

Estrogen-receptor status

VALIDAREA TESTULUI

Validarea rezultatelor a fost facuta printr-un studiu retrospectiv european multicentric efectuat pe 302 paciente, monitorizate in medie timp de 13.6 ani;

Pentru a mentine un grad mare de obiectivitate; analiza genomica a fost facuta utilizand profilul celor 70 de gene (testul Mammaprint) in

laboratorul din Amsterdam. reevaluarea histologica a fost facuta de Institutul European de Oncologie din Milano. Datele au fost prelucrate in Belgia, pentru a evita orice interferenta intre evaluarea

genomica si cea histologica.

Rezultatul a fost ca testul genic discrimineaza cu acuratete intre pacientii cu risc mare de metastaze la distanta si moarte si cei cu risc scazut (hazard ratio 2.79, (IC 95%, 1.60-4.87) si respectiv 2.32 (IC 95%, 1.35-4) pentru perioada in care boala nu este prezenta.

Testul are valori predictive mai bune decat alte metode de clasificare a tumorilor.

PARAMETRII DE VALIDARE A TESTULUI Hazard ratio = Parametru utilizat in analiza supravietuirii si care reprezinta

raportul intre rata de supravietuire in unitatea de timp intre populatia studiata si cea de control. Diferenta fata de riscul relativ consta in aceea ca rata de hazard reprezinta un risc de moment in desfasurarea timpului, in timp ce riscul relativ reprezinta un risc cumulat pe durata intreaga de observare. Prin aceasta pot indica riscuri ce apar inainte de finalizarea studiului.

Valoarea predictiva pozitiva = reprezinta numarul de rezultate real pozitive din totalul rezultatelor pozitive.

Valoarea predictiva negativa = reprezinta capacitatea unui test de a identifica corect absenta unei boli sau a unui eveniment biologic (in acest exemplu al metastazarii).

UTILITATEA COMBINARII METODELOR DE STADIALIZARE Daca consideram carcinogeneza ca un proces care se desfasoara in mai multe etape

secventiale ( genetic hits ) probabilitatea matematica e mai mare ca acesta sa apara pe un fond de alterari genetice ale tesutului decat intr-o celula dintr-un tesut normal si invers, probabilitatea ca o singura celula sa acumuleze mai multe modificari independent de celulele din jur care sa duca la aparitia fenotipului malign este mai degraba mica.

De aceea este necesara masurarea background carcinogenesis in diferite parti ale corpului poate duce la implicatii multiple. O problema tehnica potentiala este aceea ca, in tesutul premalign semnalul (e.g., leziunea oncogentica relevanta) poate fi diluata de zgomotul (genomul normal al celor mai multe celule din jur), pana cand clonele premaligne se dezvolta destul pentru a fi mai numeroase decat celulele normale.

De exemplu, dupa o urmarire de 510 ani , ar fi de asteptat ca noi cancere sa se dezvolte in grupul IIIc din Fig. (modificari displazice > 3 mutatii semnificative identificate), decat in grupul Ia (histologic normal fara mutatii identificate). Aplicatia clinica a acestui concept si a tehnologiei ar trebui sa ajute la clasificarea pacientilor in variate grupe de risc relativ inca de la inceputul bolii permitand o abordare personalizata a screening-ului sau a tratamentului.

OBTINEREA EVIDENTELOR DE TIP 1 Pentru a ajunge la un nivel de evidenta 1, s-a initiat in 2007 un studiu de pe peste 6500 de

paciente, multicentric, prospectiv, randomizat, de faza III care utilizeaza clasificatorul Mammaprint impreuna cu criteriile clinico-histologice pentru selectia paientilor pentru terapie adjuvanta. Ipoteza acestui studiu clinic este aceea ca profilul molecular va fi un mijloc de selectie mai buna decat

celelalte metode, reducand cu 10-20% tratamentul nejustificat prin agresivitatea naturala a tipului de boala.

De asemenea studiul isi propune sa raspunda la intrebarea daca medicatia non anthracyclinica are efecte mai bune fata de tratamentul standard si sa compare strategiile de tratament endocrin initiate de la inceputul bolii.

Intr-o prima faza (primele date publicate in decembrie 2011), s-a desfasurat un pilot pe 800 de paciente. La aceste paciente s-a determinat prognosticul atat prin metoda clasica, cat si prin cea genomica. Pacientele cu rezultate concordante intre cele doua metode au fost tratate conform protocoalelor

actuale de tratament pentru risc crescut sau scazut de evolutie a bolii. Cele cu rezultate discordante au fost randomizate pentru tratament. Toate pacientele care sunt candidate la tratamentul chimioterapic sunt randomizate a doua oara intre un

tratament bazat pe anthraciclen si o combinatie docetaxel/capecitabina. Toate pacientele ER pozitive pot primi o terapie randomizata timp de 7 ani de letronazol si 2 ani de

tamoxifen urmate de 5 ani de fletronazol.

STUDIUL PILOT

Obiectivele studiului pilot au fost de asigura ca: a) studiul clinic este fezabil b) recrutarea pacientelor nu este biased si sunt recrutate un numar suficient de paciente cu risc

crescut c) complianta la schemele de tratament e suficient de buna d) exista o diferenta semnificativa statistic a pacientilor cu risc crescut identificat clinico histologic si

genomic care sa se reflecte apoi intr-o reducere semnificativa numarului celor tratate cu terapie adjuvanta.

De asemenea sa identifice procentul pacientilor candidati la terapie adjuvanta si care urmeaza tratamentul randomizat precum si procentul celor ER pozitivi. Au fost inrolate 800 de paciente; predictie concordata (risc inalt = 198 de pacienti, risc scazut = 386

de pacienti), predictie discordanta (216 pacienti). Dintre acestea 141 au fost cu risc inalt prin metoda clinicohistologica si risc scazut prin metoda

genomica si 75 cu risc scazut clinicohistologic si crescut genomic. Dintre ei 111 au facut chimiterapie si 105 nu au facut (randomizat, alegere aleatorie). Complianta la tratament a fost mare (peste 93%) indiferent de forma aleasa (cu sau fara tratament

chimioterapic).

Rezultatele de etapa arata ca: studiul multicentric in felul in care este conceput este fezabil. Procentul de pacienti incadrati in riscul inalt este ceva mai mic decat cel asteptat initial, dar complianta

este buna.

Concluzia este ca studiul poate continua si ca el reprezinta o implementare a unui proiect de studiu de biomarker stratificat.

INDICATIILE ACTUALE ALE TESTARII DE TIP PROGNOSTIC

Principalele functii biologice ale genelor implicate in testul Mammaprint

Indicatii actuale ale testarii: - cancer la san stadiul 1 sau 2 - carcinom invaziv - dimensiune tumorala< 5 cm - status ganglioni limfactici: negativ sau pozitiv (pana la 3 ganglioni) - ER+ sau ER -

Rezultate: Low risk = 13% risc de recadere si metastaze la 10 ani fara tratament adjuvant High risk = 56% risc de recadere si metastaze la 10 ani fara tratament adjuvant

Figure 95-2 Hierarchical clustering of 115 tumor tissues and 7 nonmalignant tissues using the intrinsic gene set. A, Scaled-down representation of the entire cluster of 534 genes and 122 tissue samples based on similarities in gene expression. B, Experimental dendrogram showing the clustering of the tumors into five subgroups. Branches corresponding to tumors with low correlation to any subtype are shown in gray. C, Gene cluster showing the ERBB2 oncogene and other coexpressed genes. D, Gene cluster associated with luminal subtype B. E, Gene cluster associated with the basal subtype. F, A gene cluster relevant for the normal breast-like group. G, Cluster of genes including the estrogen receptor (ESR1) highly expressed in luminal subtype A tumors. Scale bar represents fold change for any given gene relative to the median level of expression across all samples. (From Sorlie TR, Tibshirani R, Parker J, et al: Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:84188423.)