GENETICA MD - Curs 2 14 Octombrie2013

GENETICA MEDICINA DENTARA

CURS 2 14 octombrie 2013

AUTOR: PROF.DR. EMILIA SEVERIN

UMF “Carol Davila” Bucuresti

GENETICA MD

CURS 1 - A nu se copia sau distribui fara copyright

ADN este molecula EREDITATII !

2

Experimentele de identificare si descriere a materialului genetic la Ek au demonstrat rolul genetic al ADN:

Principiul transformarii genetice si transferul

experimental de material genetic intre specii diferite

stau la baza unei BIOTEHNOLOGII

denumita:

ADN este molecula EREDITATII

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT Ansamblul de metode si mijloace folosit pentru obtinerea

moleculelor de ADN recombinant. (ADN in VITRO si “era ingineriei genetice”)

3

ADN RECOMBINANT (rDNA)

Se obtine prin utilizarea

tehnicilor de laborator,

tehnici prin care se

“manipuleaza” informatia genetica.

Este o molecula ADN care rezulta

din unirea unor fragmente ADN

cu origini diferite

(o molecula ADN, artificial creata,

care poate modifica genomul si schimba

fenotipul unui organism).

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

4

1. Obtinerea fragmentelor ADN de interes (gene) prin sectionarea moleculei ADN cu enzime de RESTRICTIE (endonucleaza) la nivelul situsului de recunoastere;

2. Inserarea fragmentului ADN de interes intr-un

VECTOR pentru a fi introdus in celula gazda unde va fi multiplicat;

3. Fragmentele ADN sunt legate intre ele pentru a

forma o secventa continua cu ajutorul enzimei

LIGAZA.

Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT

ETAPE

5

SITUS de RESTRICTIE

ADN specia A

SECTIONARE

Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT - ETAPE

ADAUGAREA FRAGMENTULUI ADN

de la specia B

ADN specia B

enzima de restrictie

Capete “adezive”

UNIREA celor doua fragmente ADN

enzima LIGAZA

Molecula de ADN RECOMBINANT GENETICA MD

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 7

ADN bacterian PLASMIDA

CELULA BACTERIANA

PLASMIDA = molecula ADN circulara, extracromozomiala, prezenta in mod natural in

celula bacteriana; se replica autonom.

Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright

Enzime de RESTRICTIE

Enzime de RESTRICTIE

ADN exogen

Fragmente ADN

Unirea capetelor cu LIGAZE

ADN recombinant

PLASMID

Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT

8

Genetica MD

ADN RECOMBINANT

Molecula de ADN RECOMBINANT este introdusa in celule gazda: - celule vii in culturi celulare

(E.coli, Drojdia de bere, celule de mamifer) - in zigoti - in celule stem embrionare SCOP: transfer de caractere noi, peste

barierele naturale, celulelor sau organismelor.

CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 9

Molecula de ADN RECOMBINANT incorporata in celula gazda este capabila

sa se replice si sa se exprime; De regula, ADN RECOMBINANT este

inserat intr-un VECTOR . Vectorul este o molecula naturala de ADN utilizata pentru: - transportul secventelor ADN exogen intr-o celula gazda;

- abilitatea de a se replica independent, formand clone moleculare.


ADN RECOMBINANT

Genetica MD

ADN RECOMBINANT Aplicatii practice in MEDICINA

PROTEINE TERAPEUTICE

Produse de ANIMALE TRANSGENICE

VACCINURI

MEDICAMENTE Obtinute prin sinteza

bacteriana

ANIMALE KNOCK-OUT utilizate pentru studiul

functiei unor gene umane si modelarea unor boli

umane


Sunt organisme transformate genetic prin introducerea in momentul

fertilizarii a unei noi informatii genetice (gena);

Animalul transgenic exprima fenotipic noua informatie genetica si o

transmite descendentilor sai.

ANIMALE TRANSGENICE

SOARECELE URECHE*

*Sunt respectate drepturile animalelor ??


Obtinerea animalelor transgenice

A D N

1.  Secventa de ADN exogen (transgena)

2.  Zigot recent fertilizat

3.  Microinjectia in pronucleul

masculin al unui zigot recent

fertilizat 4.  Animal

transgenic cu un mozaic de

celule transformate/

netransformate 5.  Animal

transgenic complet: celulele

transformate contribuie la

formarea liniei germinale si

transgena este transmisa in

generatia urmatoare

Genetica MD


13

ANIMALE TRANSGENICE

Genetica MD

Gena umana* a anti-trombinei III : determina sinteza unei proteine care previne si regleaza coagularea excesiva a sangelui.

Necesara persoanelor cu deficienta ereditara de anti-trombina.

SURSA: GTC BIOTHERAPEUTICS

Gena umana*

ADN de la capra

ADN de la capra

ZIGOT

ADN RECOMBINANT - Aplicatii practice in MEDICINA

ADN recombinant Microinjectia in celula gazda (in nucleul ZIGOTULUI) implantata in uterul unei femele gestante

Selectarea descendentilor modificati

(animale transgenice)

Prezenta proteinei umane (antitrombina) in laptele de capra

Antitrombina III


ANIMAL KNOCK-OUT – animal model de laborator, obtinut prin introducerea in celulele

stem embrionare a unei informatii genetice (gena) modificata (se inactiveaza

expresia acelei gene).

ANIMALE KNOCK-OUT


EREDITATE

ADN

EXPRIMARE REPLICARE

CODON

TRANSCRIPTIE ARN

TRANSLATIE PROTEINA

TRANSMITERE

Diviziune celulara

STOCARE

INFORMATIA GENETICA

Genetica MD

16


CUM ESTE ORGANIZAT ADN PENTRU A INDEPLINI

URMATOARELE FUNCTII?

1. STOCAREA informatiei genetice

2. EXPRIMAREA informatiei genetice

3. REPLICAREA si TRANSMITEREA informatiei genetice

4. VARIATIA informatiei genetice


1953 F.CRICK si J.WATSON

Propun un model al structurii fizice si chimice

molec. ADN (Double Helix).

1952/1953 WILKINS si FRANKLIN

arata ca molecula ADN are o structura regulata, helicala,

care se repeta.

1952 E. CHARGAFF descopera principiul echivalentei si

raportul de asimetrie.

1944 AVERY et al. explica

“Principiul transformarii” si arata ca ADN este

material genetic.

1928 F.GRIFFITH descopera din

intamplare “fenomenul transformarii”.

1909 - 1929 P.A.LEVENE identifica riboza si dezoxiriboza

afirmand ca ADN este un polimer.

1869 F.MISCHER – izoleaza din

nucleu: NUCLEINA

ISTORIA DESCOPERIRII STRUCTURII ADN :

evenimentele majore

1952 A.HERSHEY si M.CHASE demonstreaza ca ADN

are rol in ereditate si nu proteina.


E.CHARGAFF arata ca, indiferent de specie, in molecula ADN:

Totalul bazelor purinice = Totalul bazelor pirimidinice

Raportul dintre suma adeninelor si suma timinelor este unitar; Raportul dintre suma guaninelor si suma citozinelor este unitar;

(“PRINCIPIUL ECHIVALENTEI”)

Raportul de asimetrie :

DESCOPERIREA STRUCTURII ADN

REGULILE LUI CHARGAFF (REGULILE IMPERECHERII BAZELOR AZOTATE)

A + G = T + C

A / T = G / C

A + T G + C = 1*

*este diferit de la o specie la alta, dar caracteristic pentru fiecare specie. La specia umana este ~ 1,6.

Genetica MD

19


TIMINA

CITOZINA GUANINA

ADENINA

M.H.WILKINS si R.FRANKLIN studiaza

structura moleculelor ADN folosind o tehnica bazata pe difractia cu raze X.

Concluzia: Molecula ADN are o structura ordonata

care se repeta, elicoidala.

DIFRACTIA CU RAZE X a MOLECULEI ADN

Genetica MD

20


DESCOPERIREA STRUCTURII ADN

CARACTERISTICILE MOLECULEI ADN

1. Molecula ADN este alcatuita din 2 lanturi polinucleotidice legate intre ele prin punti de H care se formeaza la nivelul bazelor azotate

(b.a.).

2. Imperecherile intre b.a. se

realizeaza in mod complementar.

3. Diametrul moleculei ADN este

de 2 nm.

MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”

Genetica MD

21


CARACTERISTICI MOLECULEI ADN

4. Catenele se infasoara una in jurul celeilalte (plectonemic) printr-o rotatie spre dreapta ; intre perechile de b.a. succesive exista o distanta de 0,34 nm, iar un tur complet de spira (3600) are 3,4 nm (pasul elicei), deci 10 b.a. /tur de spira.

6. Spatiul dintre coloana fosfoglucidca a unei catene si a celeilalte catene nu este uniform ocupat de b.a., astfel ca, prin rasucirea catenelor apar depresiuni (santuri) inegale ca marime; la nivelul depresiunii mari se fixeaza factorii proteici implicati in transcriptie iar in depresiunea mica se fixeaza histonele.

5. Cele doua catene sunt antiparalele avand polaritati opuse.

MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”

5’

3’

3’

5’

22


2 nm

Genetica MD

DEZOXIRIBONUCLEOTID

Unitatea structurala a moleculei ADN este DEZOXIRIBONUCLEOTIDUL, format din trei elemente distincte:

1.BAZA AZOTATA

2. PENTOZA (dezoxiriboza)

3.GRUP FOSFAT PO4

OH

CH2

1’

2’

3’

4’

5’

BAZA

23


Genetica MD

BAZA AZOTATA + DEZOXIRIBOZA =

NUCLEOZID

NUCLEOZID + GRUP FOSFAT =

NUCLEOTID

DEZOXIRIBONUCLEOTID - nomenclatura

Cele 3 elemente distincte (b.a., pentoza si grupul fosfat) se asambleaza intre ele prin legaturi covalente formand:l

24


Genetica MD


DEZOXIRIBONUCLEOTID

ADENOZINA NUCLEOZID

ADENOZIN-MONOFOSFAT (AMP)

NUCLEOTID

ADENOZIN-MONOFOSFAT (AMP)

NUCLEOTID

ADENOZIN-DIFOSFAT (ADP)

NUCLEOTID

Genetica MD

Polimerizarea nucleotidelor prin legaturi 3’ – 5’ fosfodiester

formeaza o CATENA ADN (lant polinucleotidic), liniara si

neramificata. Sensul de “citire” a informatiei

genetice este determinat de polaritatea 5’ – 3’ a catenei ADN:

5’ TACG– 3’

Legatura FOSFODIESTER

CATENA (LANTUL) ADN (STRUCTURA PRIMARA)

Capatul 3’

Capatul 5’

NUCLEOTID 1

NUCLEOTID 2

NUCLEOTID 3

NUCLEOTID 4

Legatura FOSFODIESTER

T

A

C

G

26


Genetica MD

T

A

C

G

NUCLEOTID

D-riboza

Grup fosfat

COLOANA FOSFOGLUCIDICA BAZELE AZOTATE

asezate perpendicular pe coloana fosfoglucidica

27


Genetica MD

CATENA (LANTUL) ADN (STRUCTURA PRIMARA)

Punti de HIDROGEN

Molecula ADN este formata din doua catene polinucleotidice legate

intre ele prin b.a., in mod complementar.

Perechea de baza G – C se leaga prin trei punti de hidrogen slabe.

Perechea de baza A – T se leaga prin doua punti de hidrogen slabe.

Genetica MD

28


5’

3’

5’

3’

MOLECULA ADN (STRUCTURA SECUNDARA)

STRUCTURA MOLECULEI ADN

Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.

COMPLEMENTARITATEA BAZELOR AZOTATE

NUCLEOTIDE

GRUP FOSFAT

DEZOXIRIBOZA

29

Genetica MD

30 CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright

Coloana fosfoglucidica

Șanț mare

Șanț mic

Perechi de b.a. complementare

Cele doua catene se

înfășoară una în jurul

celeilalte și impreună se rotesc spre

dreapta în jurul unui ax central

imaginar.

MOLECULA ADN

Conformatia adoptata

depinde de:

- conditiile de umiditate

- concentratia ionica - inclinarea bazelor azotate fata de ax

- modificarea pasului elicei si

nr.de baze/tura de elice

- tipul de orientare a rotatiei, spre

dreapta sau spre stanga

1.B-ADN (conformatia biologica principala,

caracteristica celulelor vii)

2.A-ADN

3.Z-ADN

( coloana fosfo-glucidica in zig-zag)

Genetica MD

31


ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN

Molecula ADN poate avea conformatii diferite;

Genetica MD

32 CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright


CONFORMATIA

A B Z Orientarea dublei

elice spre dreapta (dextrogir)

spre dreapta (dextrogir)

spre stanga (levogir)

Diametrul elicei 2,3 nm 2,0 nm 1,8 nm

Numarul de baze/tura elice

11

10

12

Distanta intre p.b

0,26 nm

0,34 nm

0,38 nm

Pasul elicei

2,82 nm

3,32 nm

4,56 nm

Santul mare

Ingust si foarte

adanc

Larg si adanc

Ingust si adanc (similar santului

mic)

Santul mic

Larg si putin adanc

Ingust si adanc

Ingust si adanc

CONFORMATII STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN

Genetica MD


33


Genetica MD

34

URS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright


Vedere de sus Vedere laterala

Tranzitia conformationala a moleculei de ADN

Genetica MD

35


Molecula ADN este flexibila,

dinamica.

B-ADN Z-ADN

Pentru ilusrarea experimentelor si a mecanismelor moleculare prezentate s-au preluat imagini din domeniul public (internet).

SURSE http://images.google.com www.google.com http://www.juliantrubin.com/bigten/dnaexperiments.html http://nucleus.cshl.org/CSHLlib/DNAinNY/Case5/Case_5.htm http://www.allometric.com/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html https://wikispaces.psu.edu/display/230/DNA+and+Chromosomes https://deltawire.delta.ncsu.edu/around-campus/making-metabolism-easier-to-digest/ http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html

Pentru clarificarea unor probleme legate de tematica predata la curs se pot trimite intrebari la adresa:

[email protected]

Genetica MD

36


http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf

REFERINTE ELECTRONICE

NE REVEDEM PESTE 10’ !

Luni 14

octombrie

Date post:	21-Dec-2015
Category:	Documents
Upload:	alexandra-laura
View:	118 times
Download:	11 times

GENETICA MD - Curs 2 14 Octombrie2013

Documents