Date post: | 21-Dec-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | alexandra-laura |
View: | 118 times |
Download: | 11 times |
GENETICA MEDICINA DENTARA
CURS 2 14 octombrie 2013
AUTOR: PROF.DR. EMILIA SEVERIN
UMF “Carol Davila” Bucuresti
GENETICA MD
CURS 1 - A nu se copia sau distribui fara copyright
ADN este molecula EREDITATII !
2
Experimentele de identificare si descriere a materialului genetic la Ek au demonstrat rolul genetic al ADN:
Principiul transformarii genetice si transferul
experimental de material genetic intre specii diferite
stau la baza unei BIOTEHNOLOGII
denumita:
ADN este molecula EREDITATII
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT Ansamblul de metode si mijloace folosit pentru obtinerea
moleculelor de ADN recombinant. (ADN in VITRO si “era ingineriei genetice”)
3
ADN RECOMBINANT (rDNA)
Se obtine prin utilizarea
tehnicilor de laborator,
tehnici prin care se
“manipuleaza” informatia genetica.
Este o molecula ADN care rezulta
din unirea unor fragmente ADN
cu origini diferite
(o molecula ADN, artificial creata,
care poate modifica genomul si schimba
fenotipul unui organism).
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT
4
1. Obtinerea fragmentelor ADN de interes (gene) prin sectionarea moleculei ADN cu enzime de RESTRICTIE (endonucleaza) la nivelul situsului de recunoastere;
2. Inserarea fragmentului ADN de interes intr-un
VECTOR pentru a fi introdus in celula gazda unde va fi multiplicat;
3. Fragmentele ADN sunt legate intre ele pentru a
forma o secventa continua cu ajutorul enzimei
LIGAZA.
Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT
ETAPE
5
SITUS de RESTRICTIE
ADN specia A
SECTIONARE
Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT - ETAPE
ADAUGAREA FRAGMENTULUI ADN
de la specia B
ADN specia B
enzima de restrictie
Capete “adezive”
UNIREA celor doua fragmente ADN
enzima LIGAZA
Molecula de ADN RECOMBINANT GENETICA MD
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 7
ADN bacterian PLASMIDA
CELULA BACTERIANA
PLASMIDA = molecula ADN circulara, extracromozomiala, prezenta in mod natural in
celula bacteriana; se replica autonom.
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Enzime de RESTRICTIE
Enzime de RESTRICTIE
ADN exogen
Fragmente ADN
Unirea capetelor cu LIGAZE
ADN recombinant
PLASMID
Constructia moleculelor de ADN RECOMBINANT
8
Genetica MD
ADN RECOMBINANT
Molecula de ADN RECOMBINANT este introdusa in celule gazda: - celule vii in culturi celulare
(E.coli, Drojdia de bere, celule de mamifer) - in zigoti - in celule stem embrionare SCOP: transfer de caractere noi, peste
barierele naturale, celulelor sau organismelor.
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 9
Molecula de ADN RECOMBINANT incorporata in celula gazda este capabila
sa se replice si sa se exprime; De regula, ADN RECOMBINANT este
inserat intr-un VECTOR . Vectorul este o molecula naturala de ADN utilizata pentru: - transportul secventelor ADN exogen intr-o celula gazda;
- abilitatea de a se replica independent, formand clone moleculare.
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 10
ADN RECOMBINANT
Genetica MD
ADN RECOMBINANT Aplicatii practice in MEDICINA
PROTEINE TERAPEUTICE
Produse de ANIMALE TRANSGENICE
VACCINURI
MEDICAMENTE Obtinute prin sinteza
bacteriana
ANIMALE KNOCK-OUT utilizate pentru studiul
functiei unor gene umane si modelarea unor boli
umane
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 11
Sunt organisme transformate genetic prin introducerea in momentul
fertilizarii a unei noi informatii genetice (gena);
Animalul transgenic exprima fenotipic noua informatie genetica si o
transmite descendentilor sai.
ANIMALE TRANSGENICE
SOARECELE URECHE*
*Sunt respectate drepturile animalelor ??
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 12
Obtinerea animalelor transgenice
A D N
1. Secventa de ADN exogen (transgena)
2. Zigot recent fertilizat
3. Microinjectia in pronucleul
masculin al unui zigot recent
fertilizat 4. Animal
transgenic cu un mozaic de
celule transformate/
netransformate 5. Animal
transgenic complet: celulele
transformate contribuie la
formarea liniei germinale si
transgena este transmisa in
generatia urmatoare
Genetica MD
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
13
ANIMALE TRANSGENICE
Genetica MD
Gena umana* a anti-trombinei III : determina sinteza unei proteine care previne si regleaza coagularea excesiva a sangelui.
Necesara persoanelor cu deficienta ereditara de anti-trombina.
SURSA: GTC BIOTHERAPEUTICS
Gena umana*
ADN de la capra
ADN de la capra
ZIGOT
ADN RECOMBINANT - Aplicatii practice in MEDICINA
ADN recombinant Microinjectia in celula gazda (in nucleul ZIGOTULUI) implantata in uterul unei femele gestante
Selectarea descendentilor modificati
(animale transgenice)
Prezenta proteinei umane (antitrombina) in laptele de capra
Antitrombina III
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 14
ANIMAL KNOCK-OUT – animal model de laborator, obtinut prin introducerea in celulele
stem embrionare a unei informatii genetice (gena) modificata (se inactiveaza
expresia acelei gene).
ANIMALE KNOCK-OUT
Genetica MD CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 15
EREDITATE
ADN
EXPRIMARE REPLICARE
CODON
TRANSCRIPTIE ARN
TRANSLATIE PROTEINA
TRANSMITERE
Diviziune celulara
STOCARE
INFORMATIA GENETICA
Genetica MD
16
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
CUM ESTE ORGANIZAT ADN PENTRU A INDEPLINI
URMATOARELE FUNCTII?
1. STOCAREA informatiei genetice
2. EXPRIMAREA informatiei genetice
3. REPLICAREA si TRANSMITEREA informatiei genetice
4. VARIATIA informatiei genetice
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
1953 F.CRICK si J.WATSON
Propun un model al structurii fizice si chimice
molec. ADN (Double Helix).
1952/1953 WILKINS si FRANKLIN
arata ca molecula ADN are o structura regulata, helicala,
care se repeta.
1952 E. CHARGAFF descopera principiul echivalentei si
raportul de asimetrie.
1944 AVERY et al. explica
“Principiul transformarii” si arata ca ADN este
material genetic.
1928 F.GRIFFITH descopera din
intamplare “fenomenul transformarii”.
1909 - 1929 P.A.LEVENE identifica riboza si dezoxiriboza
afirmand ca ADN este un polimer.
1869 F.MISCHER – izoleaza din
nucleu: NUCLEINA
ISTORIA DESCOPERIRII STRUCTURII ADN :
evenimentele majore
1952 A.HERSHEY si M.CHASE demonstreaza ca ADN
are rol in ereditate si nu proteina.
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
E.CHARGAFF arata ca, indiferent de specie, in molecula ADN:
Totalul bazelor purinice = Totalul bazelor pirimidinice
Raportul dintre suma adeninelor si suma timinelor este unitar; Raportul dintre suma guaninelor si suma citozinelor este unitar;
(“PRINCIPIUL ECHIVALENTEI”)
Raportul de asimetrie :
DESCOPERIREA STRUCTURII ADN
REGULILE LUI CHARGAFF (REGULILE IMPERECHERII BAZELOR AZOTATE)
A + G = T + C
A / T = G / C
A + T G + C = 1*
*este diferit de la o specie la alta, dar caracteristic pentru fiecare specie. La specia umana este ~ 1,6.
Genetica MD
19
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
TIMINA
CITOZINA GUANINA
ADENINA
M.H.WILKINS si R.FRANKLIN studiaza
structura moleculelor ADN folosind o tehnica bazata pe difractia cu raze X.
Concluzia: Molecula ADN are o structura ordonata
care se repeta, elicoidala.
DIFRACTIA CU RAZE X a MOLECULEI ADN
Genetica MD
20
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
DESCOPERIREA STRUCTURII ADN
CARACTERISTICILE MOLECULEI ADN
1. Molecula ADN este alcatuita din 2 lanturi polinucleotidice legate intre ele prin punti de H care se formeaza la nivelul bazelor azotate
(b.a.).
2. Imperecherile intre b.a. se
realizeaza in mod complementar.
3. Diametrul moleculei ADN este
de 2 nm.
MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”
Genetica MD
21
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
CARACTERISTICI MOLECULEI ADN
4. Catenele se infasoara una in jurul celeilalte (plectonemic) printr-o rotatie spre dreapta ; intre perechile de b.a. succesive exista o distanta de 0,34 nm, iar un tur complet de spira (3600) are 3,4 nm (pasul elicei), deci 10 b.a. /tur de spira.
6. Spatiul dintre coloana fosfoglucidca a unei catene si a celeilalte catene nu este uniform ocupat de b.a., astfel ca, prin rasucirea catenelor apar depresiuni (santuri) inegale ca marime; la nivelul depresiunii mari se fixeaza factorii proteici implicati in transcriptie iar in depresiunea mica se fixeaza histonele.
5. Cele doua catene sunt antiparalele avand polaritati opuse.
MODELUL WATSON&CRICK: “DUBLA ELICE”
5’
3’
3’
5’
22
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
2 nm
Genetica MD
DEZOXIRIBONUCLEOTID
Unitatea structurala a moleculei ADN este DEZOXIRIBONUCLEOTIDUL, format din trei elemente distincte:
1.BAZA AZOTATA
2. PENTOZA (dezoxiriboza)
3.GRUP FOSFAT PO4
OH
CH2
1’
2’
3’
4’
5’
BAZA
23
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Genetica MD
BAZA AZOTATA + DEZOXIRIBOZA =
NUCLEOZID
NUCLEOZID + GRUP FOSFAT =
NUCLEOTID
DEZOXIRIBONUCLEOTID - nomenclatura
Cele 3 elemente distincte (b.a., pentoza si grupul fosfat) se asambleaza intre ele prin legaturi covalente formand:l
24
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Genetica MD
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright 25
DEZOXIRIBONUCLEOTID
ADENOZINA NUCLEOZID
ADENOZIN-MONOFOSFAT (AMP)
NUCLEOTID
ADENOZIN-MONOFOSFAT (AMP)
NUCLEOTID
ADENOZIN-DIFOSFAT (ADP)
NUCLEOTID
Genetica MD
Polimerizarea nucleotidelor prin legaturi 3’ – 5’ fosfodiester
formeaza o CATENA ADN (lant polinucleotidic), liniara si
neramificata. Sensul de “citire” a informatiei
genetice este determinat de polaritatea 5’ – 3’ a catenei ADN:
5’ TACG– 3’
Legatura FOSFODIESTER
CATENA (LANTUL) ADN (STRUCTURA PRIMARA)
Capatul 3’
Capatul 5’
NUCLEOTID 1
NUCLEOTID 2
NUCLEOTID 3
NUCLEOTID 4
Legatura FOSFODIESTER
T
A
C
G
26
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Genetica MD
T
A
C
G
NUCLEOTID
D-riboza
Grup fosfat
COLOANA FOSFOGLUCIDICA BAZELE AZOTATE
asezate perpendicular pe coloana fosfoglucidica
27
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Genetica MD
CATENA (LANTUL) ADN (STRUCTURA PRIMARA)
Punti de HIDROGEN
Molecula ADN este formata din doua catene polinucleotidice legate
intre ele prin b.a., in mod complementar.
Perechea de baza G – C se leaga prin trei punti de hidrogen slabe.
Perechea de baza A – T se leaga prin doua punti de hidrogen slabe.
Genetica MD
28
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
5’
3’
5’
3’
MOLECULA ADN (STRUCTURA SECUNDARA)
STRUCTURA MOLECULEI ADN
Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
COMPLEMENTARITATEA BAZELOR AZOTATE
NUCLEOTIDE
GRUP FOSFAT
DEZOXIRIBOZA
29
Genetica MD
30 CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Coloana fosfoglucidica
Șanț mare
Șanț mic
Perechi de b.a. complementare
Cele doua catene se
înfășoară una în jurul
celeilalte și impreună se rotesc spre
dreapta în jurul unui ax central
imaginar.
MOLECULA ADN
Conformatia adoptata
depinde de:
- conditiile de umiditate
- concentratia ionica - inclinarea bazelor azotate fata de ax
- modificarea pasului elicei si
nr.de baze/tura de elice
- tipul de orientare a rotatiei, spre
dreapta sau spre stanga
1.B-ADN (conformatia biologica principala,
caracteristica celulelor vii)
2.A-ADN
3.Z-ADN
( coloana fosfo-glucidica in zig-zag)
Genetica MD
31
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN
Molecula ADN poate avea conformatii diferite;
Genetica MD
32 CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN
CONFORMATIA
A B Z Orientarea dublei
elice spre dreapta (dextrogir)
spre dreapta (dextrogir)
spre stanga (levogir)
Diametrul elicei 2,3 nm 2,0 nm 1,8 nm
Numarul de baze/tura elice
11
10
12
Distanta intre p.b
0,26 nm
0,34 nm
0,38 nm
Pasul elicei
2,82 nm
3,32 nm
4,56 nm
Santul mare
Ingust si foarte
adanc
Larg si adanc
Ingust si adanc (similar santului
mic)
Santul mic
Larg si putin adanc
Ingust si adanc
Ingust si adanc
CONFORMATII STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN
Genetica MD
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
33
ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN
Genetica MD
34
URS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
ALTERNATIVE STRUCTURALE ALE MOLECULEI ADN
Vedere de sus Vedere laterala
Tranzitia conformationala a moleculei de ADN
Genetica MD
35
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
Molecula ADN este flexibila,
dinamica.
B-ADN Z-ADN
Pentru ilusrarea experimentelor si a mecanismelor moleculare prezentate s-au preluat imagini din domeniul public (internet).
SURSE http://images.google.com www.google.com http://www.juliantrubin.com/bigten/dnaexperiments.html http://nucleus.cshl.org/CSHLlib/DNAinNY/Case5/Case_5.htm http://www.allometric.com/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html https://wikispaces.psu.edu/display/230/DNA+and+Chromosomes https://deltawire.delta.ncsu.edu/around-campus/making-metabolism-easier-to-digest/ http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/CB19.html
Pentru clarificarea unor probleme legate de tematica predata la curs se pot trimite intrebari la adresa:
Genetica MD
36
CURS 2 - A nu se copia sau distribui fara copyright
http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/transcription.swf
REFERINTE ELECTRONICE
NE REVEDEM PESTE 10’ !
Luni 14
octombrie