Despre gene si caracteristicile lor

structurale si functionale

Dr. LIGIA BĂRBĂRII

Facultatea de Medicina Curs Genetica – anul I, ian 2015

CLASIFICAREA BOLILOR GENETICE

Morfologice

Genice

Cromozomiale

► survin in meioza, dar si in alte etape ale dezvoltarii gametilor.

Spermatozoizi anormali (~10%) Foliculi ovarieni anormali

Consecinta: nu isi indeplinesc functia - determina infertilitate

► Observabile la MO sub forma unor defecte ale celulelor

Anomaliile morfologice

CELULELE GAMETICE

Anomaliile cromozomiale ◄ Mecanismul de producere:

◄ Tipul cromozomului implicat:

- prin non-disjunctie; de cromosomi/ cromatide - alte mecanisme: vizeaza segmente → brate intregi ale cromosomilor

- mutarea unui segment de pe un cromosom pe altul

- repetarea unui segment

- pierderea unui segment

Anomalii cromozomiale somatice /sexuale

- schimbarea ordinii secventelor pe un segment de cromosom

Anomalii cromozomiale prin non-disjunctie meiotica

◄ meioza I – prin nesepararea cromozomilor omologi

◄ meioza II – prin nesepararea cromatidelor surori

Eroarea de distributie poate surveni in ambele etape ale meiozei ovogoniilor / spermatogoniilor:

Anomalii ale cromosomilor prin non-disjunctie meiotica

2n

n n

TRISOMII 2n+1

MONOSOMII 2n-1

autosomali sexuali

Non -viabile

Consecinte:

► Majoritatea alterarilor cromozomiale sunt extrem de grave si conduc la avorturi spontane a embrionilor sau fetilor

►Exista si anomalii viabile care se recunosc dupa un set de simptome caracteristice = SINDROAME CROMOZOMIALE

Trisomiile autosomale – date cunoscute

- 21 e cel mai mic cromozom uman, insa consecintele surplusului de material genetic sunt majore -Mecanismul de producere a trisomiei 21 libere: 92% - nondisjunctie materna in meioza I 5% - nondisjunctie paterna in meioza II 3% - nondisjuntii in mitozele de dupa formarea zigotului -Frecventa sdr. se coreleaza cu varsta gravidei; de retinut insa ca doar 25% din cazuri se nasc din femei > 35 ani -Singura trisomie autosomala compatibila cu viata pana la varsta adulta

Aneuploidii ale cromosomilor sexuali - „Femeile imature” - Statura foarte mica, gat scurt - Inteligenta normala/deficit

usor-mediu - Aspect particular al mainilor

- „Superfemei” - Clinic normale

- Barbati cu statura inalta dar caractere feminine

- Inteligenta normala, sterili

- „Superbarbatii”, „Y- criminalitatii” - Statura inalta, hiperactivitate - Inteligenta normala - Dizabilitati de invatare - Dezvoltare sexuala normala

Concluzie: Sunt mai bine tolerate erorile numerice ale cr. sexuali existand o varietate mare de sdr.

Anomalii ale cromozomilor produse prin deletii / translocatii

▼ Deletia terminala a unui segment din bratul p al cromozomului 5 = Sdr. Cri-du Chat

▼ Microdeletie pe bratul q al cromozomului 7 (zona genei elastinei) = Sdr. Wiliams

▼ Translocatie 14-21 = Sdr. Down 47,XX sau XY (14,t14/21;21,21)

normal: 46,XX sau XY(14,14;21,21)

► Erori de recombinare produse in crossing-over Anomaliile genice

► Boli genice: Defectul testicular 46,XX (tX/sry+)

Sindromul Charcot Marie Tooth Daltonismul

Normal Anomalii schimb reciproc si egal de material genetic intre cromozomii omologi

crossing-over inegal = imperechere incorecta a secventelor de ADN de pe cromozomii omologi (profaza I) – schimbul de material genetic se face incorect si/sau inegal

Sindromul 46,XX SRY+ - Gena SRY „masculinitatii” – localizata pe bratul scurt al cr. Y - Translocatia genei SRY se produce in cursul spermatogenezei in etapa de crossing-over

- Gena SRY se transloca cel mai frecvent pe bratul p al chr X

- Individul dezvolta organe genitale masculine (+/- ambiguitati), talie submedie, infertilitate - Incidenta: 1:20000 de indivizi ce se prezinta un aspect masculin (inregistrati de la nastere ca NN baieti)

cariotip FISH Sonda fluorescenta ptr SRY

Sonda fluorescenta ptr X – zona centromerica

- Meioza masculina este sensibila la infectii virale , radiatii, toxice

TBC

Phenylketonuria Galactosemia

Contributia factorilor genetici si de mediu in patologia umana

Rare Unifactoriale

Genetica simpla Rata de recurenta inalta

Comune Multifactoriale Genetica complexa Rata de recurenta scazuta

GENETICI MEDIU

Distrofia musculara Duchenne

Haemophilia Osteogenesis imperfecta

Piciorul stramb congenital Dislocatia sold

Ulcerul peptic Diabetul adultului

Spina bifida Ischemiile cardiace Spondilita ankilopoietica

Scorbut Rahitism

100% genetic

100% mediu

Genotip

= totalitatea materialului genetic al unui individ = ia nastere la momentul fecundarii – zigot = regasit in toate celulele organismului

Fenotip = totalitatea caracterelor genetice exprimate la un individ = un caracter se exprima in grade variate = EXPRESIVITATE

Factorii ce interfera/conditioneaza expresivitatea caracterelor genetice

= raportul functional dintre alelelor unei gene: dominanta, codominanta, recesivitate = raportul functional intre mai multe gene = CARACTERE POLIGENICE = raportul functional al materialului genetic cu factorii de mediu

Classificarea maladiilor genetice

Variante ale genelor

alteraari numerice si/sau de structura a cromosomilor

Single-Gene (monogenice)

Multifactoriale (multigenice/epigenetice)

Cromosomiale

+/- factori de mediu

chr. Y

AD AR GR

Genice

Complexe

Gena

= un segment/fragment din molecula de ADN - detine informatia necesara sintezei unui lant polipeptidic, cu structura si fuctie specifica = asigura o functie = UNITATE FUNCTIONALA - ocupa o pozitie bine determinata, fixa pe cromozom = LOCUS (sau situs genic) - fragmentul de cromozom ce reprezinta o gena poate fi schimbat in crossing-over = prin RECOMBINARE - isi poate modifica structura, cu afectarea de regula si a functiei = fenomenul este denumit MUTATIE

Total Gene pe Cromosomul 17: ~1200 [1]

Total Gene in regiunea marcata: 373 din care 20 gene redate in imagine [2]

FZD2 AKAP10 ITGB4 KRTHA8 WD1 SOST MPP3

MLLT6

STAT3 BRCA1 BReast CAncer 1 (cancer mamar cu debut precoce) GFAP NRXN4 NSF NGFR CACNB1 HOXB9 HTLVR ABCA5 CDC6 ITGB3

Chromosomul 17

Genele sunt aranjate pe cromosom de o maniera liniara.

Genele – distributia pe cromosom

[1] Genetic Home Reference - http://ghr.nlm.nih.gov/chromosome/17 [2] Human Genome Project - NCBI Human Genome Resources www.ncbi.nlm.nih.gov › Genomes & Maps

Relatiile dintre GENE

intre ALELELE aceleasi gene

intre ALELELE diferitelor gene

Relatiile intre ALELELE GENICE

CARACTERUL CARE SE EXPRIMA ESTE CEL DOMINANT ! Exista uneori diferente (+/-sesizabile) intre caracterele exprimate fenotipic de genele dominante atunci cand acestea sunt in stare homozigota (DD) si cele in stare heterozigota (Dd).

DOMINANTA

RECESIVITATE

CODOMINANTA

- unele variante structurale ale aceleasi gene sunt mai potente decat altele din punct de vedere functional = “se impun”

- alelela recesiva nu poate intra in concurenta cu alela dominata = determina sinteza unei proteine deficitare sau nule, sau intr-o cantitate insuficienta ptr a asigura functia organismului

- alela dominanta se impune si determina sinteza unei proteine active, intr-o cantitate suficienta si care asigura functia organismului

- doua alele ale aceleasi gene isi exercita functia fara a interfera intre ele, fiind active in acelasi timp si fara a exercita vreo dominanta asupra celeilalte = “egalitate perfecta”

LETALE = alela mutanta activa ce interfera brutal cu produsul elaborat de gena normala - produsul genei mutante predomina

Relatiile dintre ALELEL diferitelor GENE

- vizeaza genele implicate in acelasi angrenaj functional Ex.: o mutatie a unei gene implicata in morfogeneza poate deregla intreaga morfogeneza

- interactiunea dintre gene in care o gena influenteaza exprimarea altei gene (sau numai unei anumite alele de la nivelul altei gene)

Tipuri de gene ● Genele structurale → transcriu informatia in structura unui ARNm care apoi serveste la sinteza unui polipetid → proteina ● Gene promotoare, operatoare si regaltoare → pe acelasi chr/chr dif → contr./regl. activitatea genelor structurale

- permit astfel transferul de gene intre eukariote, de la o specie la alta -la bacterii – transpozomii sunt responsabili de rezistenta la antibiotice

Gene fixe

Gene mobile (“saritoare” = transpozomi)

– fragm. de ADN ce se deplaseaza de la un situs la altul – introduse intr-un anumit situs pot activa sau inactiva genele inserate/vecine

Alela - Genele pot prezenta mai multe variante/versiuni structurale denumite ALELE (gr.- reciprocitate intre membrii uni grup)

-Existenta alelelor multiple pentru un anumit locus genic/ din genom = POLIMORFISM ALELIC

Pentru a exista alele in celula trebuie sa avem material genetic in cantitate dubla (o perche de gene) – la eukariote La procariote nu vorbim de gene alelice ptr ca materialul genetic e reprezentat de “un cromozom” .

Cum au luat nastere alelele?

Consecinta evolutiei biologice Toate genele provin de la o gena ancestrala. Caracterul exprimat de gena ancestrala s-a modificat de-a lungul timpului - au aparut gene noi si variante structurale ale acestora= alelele

Polimorfismul ADN - Genele pot avea alele multiple (variante multiple) pentru un anumit locus = POLIMORFISM

- SNP = single nucleotide polymorphism – apare o diferenta de o singura nucleotida intr-o anumita pozitie;

- Minisatelitii si microsatelitii = blocuri formate din secvente de ADN care se repeta (ADN repetitiv codant sau non-codant);

Polimorfismul de tip SNP -in genomul uman frecventa este de 1 SNP la fiecare 1000 de baze nucleotidice - genomul uman are >1.5 mil. de SNPs, fiecare cu o localizare bine definita pe chr. (Hinds et al., 2005). - servesc pentru a caracteriza fiecare din lanturile de ADN. - detectia lor prin metode moleculare

-Intr-oanumita pozitie -3 posibilitati se disting: - (1) (A) e prezent in acest situs pentru ambii chr. matern si patern - (2) (A) e pe chr patern si (G) pe chr. matertn; - (3) (G ) pe ambii chr,

Polimorfismele ADN de tip repetitiv - Fragmente de ADN in care secventele de nucleotide se repeta in tandem (in blocuri repetitive) - Unitatea reptitiva poate fi de 2, 3, 4, 5, ... nucleotide – dinucleotidice, trinc, tetranc, pentanc - Alelele sunt definite dupa numarul de repetitii.

Ex.: secventa reptitiva –(CA)- 3 repetitii - CACACA - 5 repetitii – CACACACACA -

-Minisatelitii = NTRs variable number of tandem repeats -Microsatelitii = STR short tandem repeats

– extrem de abundent in genom - utilizati pentru alcatuirea hartilor genetice si studierea mecanismelor de transmitere a informatiei genetice - numarul si tipul repetitiilor pot fi determinate prin tehnici PCR - considerate multa vreme regiuni inactive, insa se pare ca joaca rol important in stabilizarea portiunilor codante din genom si in diviziunea celulara - atunci cand repetitiile se grupeaza in tandemuri (blocuri repetitive, precum vagoanele unui tren) = formeaza repetitii de tip minisateliti si microsateliti

ADN non-codant de tip repetitiv

• > 500000 in genomul uman

STR • loci polimorfi, cu structura de tetrarepetii/pentarepetiti • Standardul de aur in identificari de persoane si testarea paternitatii

Microsateliti

• putere dicriminatorie datorat polimorfismului locilor (heterozigozitate inalta ≥ 0.67 si ≥ 8 alele/per locus) • probabilitatea unei corespondente pentru 13 loci STR ≥ 6x1014

• eficienta si rapiditate in testarea de laborator • arhivarea profilelor ADN in format digital in baze de date • structura lor este in general foarte stabila, desi sunt observate si fenomene mutationale

Ce este o MUTATIE ADN ?

• Def = alterare/modificare a structurii moleculei de ADN – Mostenita ereditar – Aparuta pe parcursul vietii prin erori de reparea/replicare a ADN

• expunere la agenti mutageni • erori ce apar “spontan” • fenomene de imbatranire

• In uzul clinic = ceva ce produce un efect “nociv” Muatiile ADN sunt de regula descoperite atunci cand produc efecte noive = determina boli (ereditare, comune, degenerative, diferite forme de cancer).

Efectele mutatiilor genice la nivel molecular

proteina functionala

Mutatie

absenta

proteina

defecta (nefunctionala)

Codonul CAT codifica aminoacidul Histidina

Structura si functie normala a proteinei distrofina

…

Deletia nucleotidelor AT recompune succesiunea codonilor din exonul 55 al genei distrofinei

Structura si functia proteinei distrofina afectate

CAT AGA TTA CTG

CAG ATT ACT

GCA

CODON STOP

c.8064_8065del; p.(His2688Glnfs*21)

Mutatia genica produce o proteina defecta (nefunctionala)

Codonul CGA codifica aminoacidul Arginina

Apare codonul TGA →tradus UGA= STOP CODON

Substitutia nucleotidului C cu T in codonul CGA din exonul 6 al genei distrofinei

Structura si functie normala a proteinei distrofina

Structura si functia proteinei distrofina afectate

c.433C>T; p.(Arg145*)

Mutatia genica nu mai produce o proteina (proteina absenta)

Mecanisme prin care apar mutatiile la nivel de ADN genic si extra-genic

A. Erori de replicare B. Slippage (prin alunecare) C. Instabilitate (prin

expansionarea sau contractarea secventelor de ADN repetitiv)

Mutatii survenite prin ERORI DE REPLICARE

rata erorilor: 1 la 10000 de baze incorporate rata scade la 1 la 1.000.000 – 1.000.000.000 prin

interventia mecanismelor de reparare a replicarii in functie de locatie: mutatia poate avea consecinte de

ordin functional prin modificarea unui codon

Mutatii survenite prin SLIPPAGE

- alinierea incorecta a secventelor de ADN la momentul replicarii

- catenacea noua (replicata) va fi mai scurta datorita alunecarii decat catena matrita (va prezenta o deletie de 2 nc)

Mutatiile INSTABILE

- Tripletele normale se intalnesc in grupuri de 5–35 repetitii - Expansionarea anormala a unor triplete de nucleotide

considerate structuriinstabile (bolile tripletelor) – efecte pe SNC

- Fenomenul de instabilitate se amplifica (expansionarea ia proportii de la o generatie la alta) → consecinta: debut precoce / forma agravata a boliii la descendentii pers. afectate (fenomenul de anticipatie)

Huntington chorea Other neurological diseases

X-Fragil

•Mecanism de producere - slippage - prin alunecarea polimerazei in timpul replicarii moleculei de ADN (Levinson & Gutman, 1987) • Expansiuni sau contractii ale tandemurilor repetitive - generatoare de alele noi “in trepte”.

Mutatiile la nivelul microsatelitilor

GATA GATA GATA

CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT CTAT 3’ 5’ 5’

1 2 3 4 5 6

1 2 3

GATA GATA

CTAT CTAT CTAT CTAT CT CTAT 3’ 5’

5’

1

1

GATA GATA GATA

CTAT CTAT CTAT 3’

5’ 5’

1 2 3 CTAT CTAT

1 2 3 GATA

4 C T A

T

Mutatii ale microsatelitilor STR observate in analiza pedigree-urilor

•

Locus investigat: D18S51

Confirmarea paternitatii, neconcordanta detectata fiind catalogata fenomen mutational

32 de evenimente mutationale detectate la nivelul a 12 loci STR (10 - autosomali si 2 - cromozomiali Y) (testari de inrudire biologica 2000-2009)

incidenta detectarii unui eveniment mutational pe un locus STR: 1 din 40 de cazuri de paternitate

Fenomenele mutationale ale STR in cazuistica medico-legala investigata in

Laboratorul de Genetica al INML

Mutatii non-germinale ale microsatelitilor

M= {22} T = {25,26,27}

Copil= {22,26}

Alelea aditionala in profilul patern

Profil trialelic

Profil multialelice

Patternurile trialelice pun probleme de interpretare a rezultatelor in identificarile de persoane.

Fenomene de instabilitate genomica.

MSI

Instabilitatea microsatelitilor in cancere - Microsatelitii difera in celulele tumorale fata de restul celulelor din organism - MSI observat in 15% CRC: repetitii de tip di- si mono-nucleotidic

Tumorile CRC de tip MSI sunt mai slab diferentiante, dar populatiile de celule tumorale sunt omogene, cu intens infiltrat limfocitar peritumoral. Prognostic mai bun datorita eficientiei crescute e chimioterapiei.

Statusul MSI nu e investigat in prezent de o maniera sistematica la pacientii cu CRC

Testarea genetica moleculara a microsatelitior in practica oncologica din Romania

•Neinvaziva •Grad inalt de acuratete •Costuri in descrestere •Rapida

Modest incorporata in practica curenta, pentru ca nu e finantata de

serviciile publice de sanatate.

Microsatelitii in monitorizarea statusului chimeric postransplant medular

documentarea grefarii reducere a morbiditatii posttransplant

Prezice fenomenele negative din etapa preclinica permitand interventii terapeutice precoce

Reprezinta o cerinta a monitorizarii pacientilor transplantati cu alogrefa CSH

Chimerismul sangvin in transplantul medular = se refera la prezenta la pacientul ce a suferit un transplant allogenic a celulelor limfo-hematopoietice apartinand donorului

HIMERA – creatura mitica tricefala

Descrisa de Homer in Iliada

Un monstru hibrid cu cap de leu, capră si dragon, scuipand flacari si terorizand tinutul antic al Lyciei (sud-estul Turciei).

Aparitia monstrului era un semn rau, aducator de mari catastrofe: furtuni sau eruptii vulcanice devastatoare.

(CSI – episodul Bloodlines)

CHIMERISMUL – subiect “senzational” ?

• Fenomen rar • Numarul indivizilor himera nu este cu adevarat cunoscut. • Identificarea unei himere e ocazionala: atunci cand se fac analize genetice pentru gasirea unui donator pentru un transplant sau la derularea unor anchete judiciare. • Subiectul himerelor e reluat periodic: seriale TV populare precum CSI, NCSI sau House au gazduit episoade despre chimerism.

Clasificarea chimerismelor hematologice

• tranzitor • progresiv • stabil

Chimerism complet sau de tip”full donor” – definit atunci cand 100% din celulele sangvine ale pacientului transplantat apartin ca origine donatorului (>95%) Chimerism mixt (partial) – definit atunci cand intre 5–95% din celulele sangvine ale pacientului transplantat provin de la donator

Microchimerism - < 1-2.5% din celule apartin receptorului

Profile ADN de referinta pre-transplant

Profilul chimeric molecular a fost monitorizat prin testari succesive intr-un interval de 1 an de zile

Chimerism hematologic complet stabil

Donor Receptor

Marker STR de referinta D8S1179

Interval testari - luni

Chimerism hematologic complet stabil (continuare)

D8S1179 Marker STR de referinta

T

Donor Receptor

Chimerism mixt cu evolutie spre respingere grefa

Profile ADN de referinta pre-transplant

Marker STR de referinta D8S1179

Profilul chimeric molecular a fost monitorizat prin testari succesive intr-un interval de 184 zile

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

T 42 57 70 106 119 127 134 143 150=RT 174 184

Interval testari (zile)

Chimerism mixt cu evolutie spre respingere grefa (continuare)

T T

Caz de chimerism complet comparativ cu un caz cu chimerism mixt stabil

Va multumesc !

Contact: ligia.barbarii@legmed.ro ligia.barbarii@gmail.com Laboratorul de Genetica - INML Bucuresti