Dr. Ariela OLTEANUSCJU SibiuFrotiul de sange periferic

Frotiul de sange perifericreprezinta modalitatea de studiere a morfologiei elementelor sanguine si a parazitilor sanguini; orienteaza asupra cantitatii de hemoglobina si a numarului de leucocite, trombocite din sange;

face parte integranta din investigarea incipienta, obligatorie a oricarui bolnav pentru ca furnizeaza informatii importante asupra tuturor celulelor sangvine.;

poate sa indice fie direct diagnosticul, fie sa sugereze investigatii suplimentare;

Frotiul de sange perifericProba biologica primara:sangele venos recoltat pe EDTA sau sange capilar recoltat prin punctie capilara din pulpa degetului la adult sau calcai la sugar;Se executa un frotiuri pe lame de sticla speciale;Frotiul bine executat trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: a. sa fie mai ingust decat lama (doua margini); b. sa nu acopere toata lama, sa aiba margini drepte si franjuri la extremitatea terminala; c. sa aiba o grosime potrivita; d. celulele sa fie distribuite uniform, intr-un singur strat celular, sa nu fie deformate sau distruse.

Frotiul de sange perifericSemnele unui frotiu impropriu : eritrocitele suprapuse sau deformate, leucocitele distruse, zone rotunde necolorate sau eritrocitele cu contur dublu (indicand ca lama este nedegresata), zone intinse cu eritrocitele mari prea etalate, poligonale sau sferoidale, cu pierderea palorii centrale etc.;

Daca frotiul nu este satisfacator, pentru a evita obtinerea de informatii eronate se recomanda examinarea unui alt frotiu sau efectuarea unui nou preparat

Frotiul de sange perifericErori la efectuarea formulei leucocitare: 1. eroare mecanica, data de modul de efectuare al frotiului si, mai ales, de distributia neomogena a diferitelor tipuri de leucocite pe suprafata frotiului; 2. eroare de interpretare, care depinde de calitatea examinatorului; 3. eroare de esantionaj (poate fi atenuata prin cresterea numarului de celule inregistrate). Cu cat este mai mare numarul de celule inregistrat, cu atat limitele de siguranta sunt mai apropiate de valoarea reala; rezultate satisfacatoare se obtin numai cand formula leucocitara se bazeaza pe numaratori facute pe cel putin 200 de celule, examinand in zig-zag marginile si centrul frotiului.

Frotiul de sange perifericMateriale si echipamente Reactivi, consumabileManusi de protectie pentru executant;Cronometru;Sursa lumina; Lame de sticla degresate;Lama slefuita mai ingusta;Doua baghete de sticla si o tavita de colorat;Microscop optic cu obiectiv uscat si imersie;Pipeta automata 0,5-10 microL cu varfuri corespunzatoare;Pipeta automata 200-1000 microL cu varfuri corespunzatoare; kit de coloraie rapid May-Grnwald Giemsa; alcool metilic; apa distilata neutral; ulei de cedru; alcool sanitar.

Frotiul de sange perifericSolutia May-Grunwald: eozinat de albastru de metilen 1g glicerina neutra puritate absoluta (p.a) 50ml alcool metilic p.a 100ml Solutia Giemsa: eozinat de azur de metilen 3g azur de metilen 0.8g glicerina neutra p.a 250ml alcool metilic 200mlApa distilata neutra pH 7-7,2 ( 500ml AD + cateva picaturi dintr-o solutie slaba alcalina de Na2 CO3 1% sau tampon fosfat pH 6,8

Frotiul de sange perifericTehnica executarii frotiului :

se aplica o picatura de sange cu lama (pentru sange capilar)/pipeta automata (pentru sange venos din tub vidat) pe o lama (curata si degresata) se intinde rapid cat mai subtire si uniform, cu ajutorul lamei slefuite, careia, tinand-o usor inclinata sub un unghi de aproximativ 45 grade - i se imprima o usoara miscare de translatie in lungimea lameise va usca apoi foarte repede, prin agitare in aer; acest timp reprezinta o prima fixarerecomandabil sa se recolteze doua frotiuri; unul se pastreaza ca rezerva. Se scrie numarul CA al bolnavului cu creionul special/ se lipeste eticheta cu CA si se pune la colorat.

Frotiul de sange periferic

Coloratia May Grnwald-Giemsa: se aseaza lama pe doua baghete deasupra unei tavite si se acopera cu alcool metilic pentru fixare, 3-5 minute. se scurge alcoolul metilic. se acopera apoi lama cu solutia de colorat May Grnwald timp de 2 minute; se adaug peste lamele acoperite cu soluia de colorat May Grnwald ap de robinet i se mai las la colorat 2 minute; se nltur colorantul de pe lam i se acoper lama cu soluie de colorant Giemsa (diluata 1/10 : o parte solutie nediluata livrata de producator se amesteca cu 9 parti apa distilata) si se lasa 20 minute la colorat. se scurge solutia Giemsa se spala cu apa distilata sub jet slab pana se inlatura tot colorantul. se sterge cu grija dosul lamei pentru ca frotiul sa ramana clar se lasa sa se usuce in stativ.

Frotiul de sange periferic

Coloratia May Grnwald-Giemsa rapida: se fixeaza frotiurile in reactivul 1 al kitului de coloratie rapid, 10 secunde (fixator); se trec frotiurile fara splare in reactivul 2, timp de10 secunde (eozina); se trec frotiurile fara splare in reactivul 3 al kitului de coloratie 10 secunde (methylen blue); se spala frotiurile cu apa de robinet; se terge dosul lamei; se lasa sa se usuce lamele in stativ.

Frotiul de sange periferic Tehnica executarii formulei leucocitare: cu obiectivul cu imersie, pentru o corecta identificare morfologica, se parcurge frotiul deplasand preparatul intr-un singur sens si in zig-zag, pentru a se surprinde atat elementele marginale cat si cele din mijlocul lamei (limfocitele au tendinta de a se grupa spre centru, polimorfonucleatele si monocitele se disperseaza spre margine si in franjuri)pe masura ce se intalnesc leucocitele, ele se noteaza pe categorii in grupe de cate 5 elemente se examineaza in total cel putin 100 de elemente si se stabileste procentul fiecarui tip de leucocit.

Frotiul de sange perifericExaminarea cu obiectiv cu imersie:Eritrocitele. Limita dintre 1/3 medie si 1/3 terminala a frotiului reprezinta zona optima, cu grosimea corespunzatoare pentru studiul eritrocitelor la care se urmareste:marimea: anizocitoza, normocitoza,macrocitoza, microcitoza;forma: poichilocitoza, sferocitoza, ovalocitoza, drepanocitoza, eritrocite fragmentate sau schizocite, eritrocite in picatura;culoarea: normocromie, hipocromie, eritrocite in semn de tras la tinta, policromatofilie;incluzii eritrocitare: punctatii bazofile, inele Cabot, corpi Jolly, eritrocite parazitate, eritroblasti;dispozitia: in rulouri, aglutinate.

Frotiul de sange perifericLeucocitele. Distributia leucocitelor pe frotiurile efectuate pe lama nu este uniforma: celulele mari (monocitele si polinuclearele) au tendinta sa se concentreze pe marginile frotiului si in franjuri. In studiul leucocitelor se urmareste:formula leucocitara (numaratoarea diferentiata);anomalii morfologice: de talie: gigantocite, granulocite poliploide;nucleare: hipersegmentare, anomalie Pelger- Huet, nuclei picnotici;citoplasmatice: hipo sau agranularitate a neutrofilelor, granulatii toxice, prezenta de vacuole, de granulatii gigante etc.

Frotiul de sange perifericTrombocitele. evaluarea numerica. Evaluarea semicantitativa se face cel mai bine pe frotiuri de sange fara anticoagulant, unde numarul si mai ales marimea grupelor de trombocite estimate pe marginile frotiului si in franjuri poate sa indice numarul lor. Gasirea pe margini si in franjuri a unor grupe de 15- 30 trombocite indica un numar normal; prezenta de trombocite rare, izolate sau grupe mici de 2-8 trombocite denota trombocitopenie, in timp ce existenta unor grupe mari de peste 80-100 trombocite indica un numar crescut.anomalii morfologice: anizocitoza trombocitara, modificari ale glomerulului, vacuolizari etc.aglutinabilitatea.

Frotiul de sange periferic

Componente celulareCuloareNucleupurpuriuCorpi JollypurpuriuCorpi AuerpurpuriuCitoplasma limfociteloralbastruCitoplasma monociteloralbastru-griCitoplasma bogata in ARNalbastru inchisGranulatii specifice neutrofilepurpuriu deschis spre rozGranulatii specifice eozinofileportocaliuGranulatii specifice bazofilepurpuriu inchisGranulatiile limfocitelorpurpuriu deschisGranulomerul trombocitelorRoz-lilaeritrocitecaramiziu

Frotiul de sange perifericValori normale ale formulei leucocitare la diferite varste

NOU-NASCUTSUGARCOPIL (6 ANI)ADULTNumar leucociteNL15000-30000 9000-130004000-100004000-10000Nesegmentate neutrofileN5-10%1-5%5%1-4%Segmentate neutrofileS30-70%30-25%30-60% 60-70%EozinofileE2-5%7%4%1-4%BazofileB0-1%1%1%0-1%LimfociteL20-40%50-70%30-60%25-35%MonociteM2-8%6-8%4-8%4-8%

Modificari sugestive pentru diagnostic

hipocromie + microcitoza = anemie feriprivahipocromie + normo(macro)citoza = anemie sideroblasticahipocromie + macrocitoza + policromatofilie = HPNhipocromie + punctatii bazofile = anemie saturninahipocromie + punctatii bazofile + poikilocitoza (picatura, schizocite) = talasemiehipocromie + eritrocite in rulouri = anemie cronica simplasferocite + policromatofilie = sferocitoza ereditarasferocite + policromatofilie + aglutinare + deviere la stanga = AHAI (criza de hemoliza)schizocite + policromatofilie + trombocite rare, izolate = anemie microangiopatica, CIDschizocite + policromatofilie + trombocite izolate +/- neutropenie = LEDeritrocite in picatura + bazofilie + granulocite imature + eritroblasti + trombocite anormale = MMMrulouri + tablou leucoeritroblastic +/- plasmocite atipice = mielom multiplueritroblasti binucleati = anemie diseritropoieticamacromegalocitoza + neutrofile hipersegmentate = anemie megaloblasticaneutrofile cu nucleu pelgeroid si hipo- sau agranulare = mielodisplazieleucocitoza + bazofilie + deviere la stanga a FL = LMCleucocitoza + limfocitoza = LLCcelule hairy+ monocitopenie +/ - neutropenie = HCLcelule blastice + bazofilie + deviere la stanga a FL = LMC in puseu blasticcelule blastice + hiatus leucemic = leucemie acuta