forme farmaceutice topice aplicate în afecţiuni cervico-vaginale

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

„GRIGORE T. POPA“ IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

FORME FARMACEUTICE TOPICE

APLICATE ÎN AFECŢIUNI

CERVICO-VAGINALE

Rezumatul Tezei de doctorat

Doctorand

Farm. COJOCARU (PALADE)

LAURA MIHAELA

Conducător ştiinţific

PROF. DR. IULIANA POPOVICI

2014

Conform Deciziei Rectorului Universităţii de Medicină şi Farmacie

”Gr. T. Popa” Iaşi nr. 23312 din 20.10.2014 a fost numită comisia de doctorat.

PREŞEDINTE

Decan Prof.Dr. Monica Hăncianu Universitatea de Medicină şi Farmacie „ Gr. T. Popa “ Iaşi

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

Prof. univ. dr. Iuliana Popovici

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa“Iaşi

REFERENŢI OFICIALI

Prof. univ. dr. Dumitru Lupuleasa Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ Bucureşti

Prof. univ. dr. Victoria Hîrjău

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ Bucureşti

Prof. univ. dr. Cătălina Lupuşoru Universitatea de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa“Iaşi

Prezenta teză de doctorat cuprinde 190 pagini, 119 figuri şi 127 tabele.

Numerotarea figurilor, tabelelor şi cuprinsului, din cadrul rezumatului se păstrează în aceeaşi

formă ca în teză.

1

CUPRINS STADIUL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL I

SISTEME BIOADEZIVE VAGINALE DE CEDARE A SUBSTANŢEI

ACTIVE

I.1 Generalități

I.2.Avantajele sistemelor mucobioadezive

I.3.Bioadeziune, mucoadeziune

I.3.1.Mucusul, compoziție și funcție

I.3.2.Mecanismul mucoadeziunii

I.3.3.Teoriile mucoadeziunii

I.3.4.Factori care influențează mucoadeziunea

I.4. Forme bioadezive intravaginale

I.5. Polimeri indicaţi pentru formele vaginale mucobioadezive

I.5.1.Metolose ®, Hipromeloză și Metilceluloză

I.5.2.Carbopolii, Carbomers

1

1

1

2

2

4

4

9

10

12

12

15

CAPITOLUL II

ASPECTE FIZIOPATOLOGICE SI STRUCTURALE ALE CĂII VAGINALE DE

ADMINISTRARE A FORMELOR FARMACEUTICE

II.1. Anatomia şi fiziologia vaginului

II.1.1.Mucoasa vaginală

II.1.2. Structura histologică a epiteliului vaginal

II.1.3.Vascularizaţia vaginului

II.1.4.Inervaţia vaginului

II.2. Biochimia mucoasei vaginale

II.3.Absorbţia medicamentelor pe calea intravaginală

II.4.Displaziile cervico-vaginale

II.4.1 Clasificare

II.4.2.Factori de risc în producerea displaziilor cervico-vaginale

II.4.3.Tratamentul medicamentos al displaziei cervico-vaginală

19

19

19

20

22

22

22

23

23

24

28

29

CAPITOLUL III

5- FLUOROURACIL (5-FU) SUBSTANŢA MEDICAMENTOASĂ UTILIZATĂ ÎN

STUDIU

III.1.Structură chimică

III.2. Proprietăţi fizico-chimice

III.3. Proprietăti biofarmaceutice si farmacocinetice

III.4. Mecanism de acţiune

III.5. Interactiuni

III.6.Toxicitate

III.7. Efecte secundare

III.7.1.Efectele adverse la administrare sistemică

III.7.2.Efectele adverse la administrare topică

III.8.Contraindicaţii

III.9. Cercetări privind stabilirea dozei terapeutice

III.10. Utilizăririle 5-fluorouracilului

31

31

32

32

32

36

37

37

38

38

38

38

39

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL IV

MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL

VI.1. Motivația

VI.2. Scopul și obiectivele

40

40

41

2

CAPITOLUL V

FORMULAREA, PREPARAREA ȘI CARACTERIZAREA FARMACEUTICO-

TEHNOLOGICĂ A UNOR COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE CU

5- FLUOROURACIL

V.1. Materiale şi metode

V.1.1.Determinarea parametrilor de curgere şi compresibilitate a amestecurilor de

pulberi

V.1.2.Prepararea comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare modificată cu 5-

FU

V.1.3. Controlul farmaceutico-tehnologic al comprimatelor bioadezive

V.1.4. Determinarea caracteristicile bioadezive ale comprimatelor

V.2. Rezultate

V.3. Discuţii

V.4. Concluzii

43

43

44

45

45

45

47

50

52

CAPITOLUL VI

OPTIMIZAREA FORMULĂRII COMPRIMATELOR BIOMUCOADEZIVE

VAGINALE CU 5 – FLUOROURACIL

VI.1. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra proprietăţilor de curgere şi

compresibilitate a amestecurilor de pulbere

VI.1.1. Materiale şi metodă

VI.1.1.1.Planul experimental

VI.1.1.2.Matricea planului experimental

VI.1.1.3.Fitarea datelor şi validarea planului experimental

VI.1.1.4.Analiza influenţei factorilor de formulare asupra parametrilor de curgere

şi compresibilitate conform planului experimental

VI.1.2.Rezultate

VI.1.3.Discuții

VI.2. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor

farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor

VI.2.1. Materiale şi metodă

VI.2.1.1. Planul experimental

VI.2.1.2. Matricea planului experimental

VI.2.1.3.Fitarea datelor şi validarea planului experimental

VI.2.1.4.Analiza influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor

farmaceutico-tehnologice

VI.2.2.Rezultate

VI.2.3. Discuții

VI.3. Determinarea formulei optime de preparare

VI.3.1 Material și metodă

VI.3.1.1 Metodă

VI.3.2.Rezultate

VI.3.3.Discuții

VI.4.Concluzii

53

56

56

57

59

60

64

67

77

78

78

78

79

81

82

83

93

94

94

94

95

98

98

CAPITOLUL VII

ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI NOI METODE DE DOZARE A 5-FU DIN

COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE

VII.1.Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-FU

VII.1.1. Material și metode

VII.1.1.1.Realizarea studiului de validare

VII.1.1.2.Analiza statistică

VII.1.1.3.Studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză

VII.1.1.4.Estimarea limitelor de detecţie şi de cuantificare

99

99

99

101

101

102

102

3

VII.2. Determinarea cantitativă a 5-fu din formulările de comprimate mucobioadezive

vaginale

VII.3.Rezultate

VII.4.Discuţii

VII.5.Concluzii

102

103

109

110

CAPITOLUL VIII

EVALUAREA DISPONIBILITĂȚII IN VITRO A 5-FU DIN COMPRIMATE

BIOADEZIVE VAGINALE VIII.1.Material şi metodă

VIII.1.1.Materiale

VIII.1.2. Metode

VIII.1.3.Analiza statistică

VIII.2.Rezultate

VIII.3.Discuții

VIII.4.Concluzii

111

112

112

112

112

113

121

122

CAPITOLUL IX

ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODEI DE DETERMINARE A 5-FU

DIN PROBE BIOLOGICE

IX.1.Material și metodă

IX.2.Realizarea studiului de validare

IX.2.1.Identificarea picurilor

IX.2.2.Studiul compatibilităţii sistemului cromatografic

IX.2.3.Studiul liniarităţii şi intervalului de liniaritate pentru 5-fluorouracil

IX.2.4.Studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză

IX.2.5.Estimarea limitelor de detecţie şi de cuantificare

IX.3.Rezultate

IX.3.Determinarea gradului de regăsire

IX.3.1.Acuratețea metodei

IX.4.Discuții

IX.5.Concluzii

123

123

125

125

125

125

125

125

126

133

134

135

136

CAPITOLUL X.

STUDII FARMACOLOGICE COMPARATIVE PRIVIND ADMINISTRAREA

ORALĂ ŞI VAGINALĂ DE 5-FLUOROURACIL

X.1. Motivaţia, scopul şi obiectivele studiului

X.2. Material şi metodă

X.2.1.Material

X.2.1.1. Selecţia comprimatelor de 5-fluorouracil

X.2.1.2. Selecţia speciei de animale

X.2.2. Condiţiile de lucru

X.2.3. Etica experimentelor şi recoltarea probelor biologice

X.2.4.Metode

X.2.4.1. Metodologia cercetării farmacologice comparativă privind administrarea

orală şi vaginală de 5-fluorouracil

X.3. Rezultate

X.4. Discuţii

X.5.Concluzii

137

137

137

137

137

138

138

138

138

138

140

160

162

CAPITOLUL XI

CERCETAREA IN VIVO A FARMACOCINETICII 5-FLUOROURACILULUI

XI.1. Material şi metodă

XI.1.1.Substanțe

XI:1.2.Animale de experiență

XI.1.3. Protocol experimental

XI.1.4. Analiza farmacocinetică a datelor

XI.1.5. Analiza statistică a datelor

X.2. Rezultate privind farmacocinetica 5-FU

XI.2.1. Rezultatele analizei vizuale a datelor experimentale și analizei globale a datelor

pentru 5-FU

XI.2.2. Analiza principalilor parametri farmacocinetici pentru 5-FU

XI.2.2.1. Analiza coordonatelor punctului maxim (Cmax şi Tmax)

163

163

163

163

163

164

165

166

166

166

168

4

XI.2.2.2. Rezultatele ariilor de sub curbă (AUC0 t, AUC0-oo, AUC extra) pentru

5-FU pe căile de administrare studiate

XI.2.2.3. Rezultatele timpului rezidual mediu (MRT) pentru 5-FU pe căile de

administrare studiate

XI.2.2.4. Rezultatele ke pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

XI.2.2.5. Rezultatele t1/2 pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

XI.4. Discuții

XI.5. Concluzii

170

173

174

175

175

177

CAPITOLUL XII

CONCLUZII GENERALE

178

BIBLIOGRAFIE

ANEXE

Lista lucrărilor științifice

Lucrări publicate in extenso

181

191

5

ABREVIERI ADN acid dezoxiribonucleic

ALT (ALAT) alanin aminotransferază

ARN acid ribonucleic

ARNm acid ribonucleic mesager

AST (ASAT) aspartat aminotransferaza

AUC aria de sub curbă

AUMC aria de sub curba momentelor

CAS engl: contact angle surface (Unghiul de contact cu suprafaţa )

CIN engl: cervical intraepithelial neoplasia (neoplazie cervicală intraepitelială)

CYP Cytochrome 450 P

ºC grade Celsius

DES dietilstilbestrol

DPD dihidropirimidin dehidrogenază

DMSO dimetil sulfoxid

ºF grade Fahrenheit

FdUDP fluorodeoxiuridină difosfat

FdUMP fluorodeoxiuridină monofosfat

FdUTP fluorodeoxiuridină trifosfat

FUDP fluorouridină difosfat

FUDR fluorodeoxiuridină

FUMP fluorouridină monofosfat

FUTP fluorouracil trifosfat

5-FU 5-fluoro-uracil

GP glutation peroxidază

GSH glutation redus

HIV Human Imunodeficiency Virus

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPMC hidroxipropilmetil celuloză

HPV Human papiloma virus

Ic Indice Carr

LOQ Limit of quantification

LQD Limit of detection

MDA Malondialdehida

MRT Mean Residual Time

N Newton

PO Per os

PMN Polimorfonucleare

RH Raport Hausner

TCA Acid tricloracetic

6

MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL

Tehnologia farmaceutică a cunoscut în ultimele decenii o dezvoltare impetuoasă, iar

sfârșitul secolului XX a oferit imaginea unor succese spectaculoase în terapia

medicamentoasă, prin descoperirea de noi substanțe active, dar și a unor forme farmaceutice

moderne și eficace. Cercetarea farmaceutică abordează în prezent obiective importante ca:

dezvoltarea de noi forme farmaceutice;

cinetica cedării substanțelor active controlată și reproductibilă;

obținerea unei absorbții optime, distribuție sistemică în compartimentul vascular și pătrunderea la locul de acțiune specific;

biodisponibilitate corespunzătoare și reproductibilă;

toleranță bună locală și generală.

În acest context cercetările din teza de doctorat au fost direcționate spre un domeniu

foarte important al terapiei medicamentoase și anume medicația antineoplazică, utilizată în

tratamentul afecțiunilor cervico-vaginale, care să folosească forme farmaceutice moderne

biomucoadezive.

Cancerul de col uterin este o afecțiune malignă care afectează anual peste 500 000 de

mii de femei, având o frecvență care variază de la 0,009 % în țările dezvoltate, până la 0,087

% în țările slab dezvoltate (fig. 2) (74,75). Romania are una dintre cele mai înalte rate de

incidență a cancerului de col uterin, 20-30 cazuri noi/100 000 femei. Îngrijorator este însă

faptul ca rata mortalității prin acest tip de cancer este în continuă creștere. Conform datelor

furnizate de Organizația Mondială a Sănătății, cancerul de col uterin se află pe primul loc ca

prevalență între cancerele la femei, fiind a doua cauză de moarte între cancerele la femei. (134)

Fig. IV.1. Incidența anuală a cancerului de col uterin la nivel modial

(nr. diagnostice noi/100 000 paciente) (75)

7

Cercetările au fost axate pe 5-fluorouracil (5-FU), un chimioterapic derivat de

fluoropirimidină, un antimetabolit analog structural cu metaboliții implicați în sinteza ADN și

ARN. În prezent în terapia afecţiunilor cervico-vaginale, se utilizează forme farmaceutice

clasice cu 5-FU ca: geluri, creme, supozitoare (124,125) sau forme farmaceutice moderne

ca: lipozomi, niozomi, nanoparticule, microemulsii şi filme vaginale (126-132). Formulările

tradiționale folosite în tratamentul local, în special creme, geluri, supozitoare, nu sunt

potrivite pentru a asigura permanența pe suprafața mucoasei vaginale un timp suficient pentru

eradicarea patologiei. Pentru acest motiv și în scopul de a evita terapia orală sau sistemică cu

5-FU, ce prezintă efecte adverse (109,110), este util să se proiecteze noi forme farmaceutice

destinate administrării pe mucoasa vaginală, pentru a controla atât eliberarea cât și timpul de

remanență la locul de aplicare.

În scopul atingerii obiectivelor de lucru propuse în teza de doctorat am efectuat un

studiu complex, interdisciplinar:

farmaceutico-tehnologic, privind formularea și stabilirea tehnologiei de preparare, condiționare și depozitare;

fizico – chimic, de control a parametrilor caracteristici amestecurilor de

pulberi folosite în procesul de formulare a comprimatelor (proprietățile de

curgere și compresibilitate a pulberilor) și specifice formei farmaceutice

(caractere macroscopice,friabilitate, timp de dezagregare, rezistență

mecanică,unghi de umectare,timp de mucoadeziune ex vivo);

analitic, de elaborare și validare a unor metode analitice de dozare 5-FU din

forma farmaceutică, dar și din produse biologice;

farmacologic, în vederea evaluării avantajelor administrării topice intravaginale a 5-FU într-o nouă formulare farmaceutică (comprimate

biomucoadezive vaginale) comparativ cu administrarea pe cale orală, a unor

doze echivalente;

biofarmaceutic, în vederea determinării principalilor parametri farmacocinetici și determinarea comparativă a profilului în timp a 5-FU administrat vaginal

din noua formulare farmaceutică realizată, comparativ cu administrarea pe cale

orală.

Scopul final și noutatea cercetărilor din cadrul tezei de doctorat sunt reprezentate de

dezvoltarea unei forme farmaceutice noi și moderne, comprimate biomucoadezive vaginale

cu 5-fluorouracil, care să corespundă condițiilor de calitate impuse de normele actuale, să fie

sigură și eficace în tratamentului afecțiunilor cervico-vaginale.

8

CAPITOLUL V

FORMULAREA PREPARAREA ȘI CARACTERIZAREA FARMACEUTICO-

TEHNOLOGICĂ A UNOR COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE CU 5-

FLUOROURACIL

Pentru formularea și prepararea unor comprimate biomucoadezive cu cedare

modificată cu 5-FU am selectat patru sorturi de polimeri, încadraţi în principalele categorii de

polimeri hidrofili cu aplicare pe mucoasa vaginală: doi derivaţi celulozici, cu viscozitate

diferită, Metolose 90 SH 4000 şi Metolose 90 SH 100 000; două sorturi de poliacrilaţi, cu

grad de reticulare diferită, Carbopol 71 cu grad redus de reticulare şi Carbopol 974 cu grad

mare de reticulare.

Au fost formulate douăsprezece formule de amestecuri de pulberi folosite ulterior

pentru prepararea de comprimate bioadezive vaginale cu 100 mg 5-FU/comp.: trei formule

pe bază de C 71 notate F1, F2, F3; trei formule pe bază de C 974 notate F4, F5 şi F6; trei

formule pe bază de M 4000 notate F7, F8, F9 şi trei formule pe bază de M 100 000 notate

F10, F11 şi F12. Procentul polimerului formator de matriţă a fost variat pentru fiecare serie

de formulări în intervalul 20 şi 50 % (tabelul V.1.).

Tabelul V.1. Formulările comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare modificată

cu 5-FU

Substanțe

(mg%)

Formula (F)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C 71 60 90 150 - - - - - - - - -

C 974 - - - 60 90 150 - - - - - -

M 4000 - - - - - - 60 90 150 - - -

M 100 000 - - - - - - - - - 60 90 150

Microcelac 140 110 50 125 95 35 140 110 50 140 110 50

5 FU 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Stearat de Mg - - - 6 6 6 - - - - - -

Aerosil - - - 3 3 3 - - - - - -

Talc - - - 6 6 6 - - - - - -

Pulberile au fost cernute prin sistemul de site TGL 7354/TGLO 4188 (150-400 μm) şi

ulterior amestecate, la o viteză constantă, timp de 15 minute.

Comprimatele au fost preparate prin comprimarea directă a amestecului de pulberi la o maşină Korsch EK0 monopost (dimensiunea poansonului plat φ = 12 cm), la o presiune de

comprimare de 7 - 8 kN.

V.1.1.Determinarea parametrilor de curgere şi compresibilitate a amestecurilor de pulberi

s-a făcut urmărind parametrii caracteristici, timp de curgere (t), coeficient de fricţiune (tg α),

unghiul de repaus (α), raportul Hausner (RH), indicele Carr (IC)

9

V.1.3. Controlul farmaceutico-tehnologicic al comprimatelor bioadezive vaginale cu 5-FU a fost efectuat prin determinarea următoarelor caracteristici de calitate: uniformitatea masei,

grosime, diametru, friabilitate, rezistenţă mecanică, timp de dezagregare.

V.1.4. Determinarea caracteristicile bioadezive ale comprimatelor s-a făcut prin determi-

narea unghiului de contact şi evaluarea timpului de mucoadeziune ”ex vivo”.

V.2. Rezultate şi discuţii

Tabelul V.2 Parametrii de curgere şi compresibilitate a formulărilor F1 – F12.( Tabel V.1)

FORMULA PARAMETRU

t (g/s) α (º) tg α RH IC (%)

F1 0,142 29,5 0,56 1,17 14,70

F2 0,125 34 0,67 1,1 9,09

F3 0,115 32 0,62 1,93 48,38

F4 →∞ 46,4 1,05 1,65 39,70

F5 →∞ 47,8 1,10 1,61 38,23

F6 →∞ 50,2 1,20 1,71 41,66

F7 1 25,2 0,47 1,32 23,94

F8 1,25 34,7 0,69 1,32 23,94

F9 1,35 36,2 0,73 1,39 28,16

F10 0,1 30,1 0,58 1,29 22,72

F11 0,1 29,7 0,57 1,32 23,52

F12 0,35 34,6 0,69 1,50 32,81

Indicele Carr mai mare de 25 determinat la amestecul de pulberi F4, F5, F6 și F12

indică o curgere deficitară, între 18 și 25 pentru F7, F8, F9, F10 și F11 o curgere

satisfăcătoare și o fluiditate foarte bună pentru F1 și F2, care au valori sub 15.

Raportul Hausner mai mare de 1,6 determinat la F4, F5 și F6 indică o curgere proastă,

cuprins între 1,25-1,5 determinat la F7, F8, F9, F10, F11 și F12 o curgere satisfăcătoare, iar

sub 1,2, determinat la F1 și F2 ,o curgere bună.

Tabelul V.3 Caracteristicile farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor cu 5-FU

FOMULA

PARAMETRU

Uniformitatea

masei(% +)

Uniformitatea

masei(% -)

Grosime

(mm)

Diametru

(mm)

F1 1,32 0,99 1,92 12,03

F2 1,66 1,00 2,19 12,04

F3 2,32 2,65 2,15 12,03

F4 3,03 1,68 1,99 12,03

F5 2,67 3,34 2,35 12,03

F6 3,37 1,01 2,72 12,05

F7 2,29 1,68 1,92 12,03

F8 1,67 1,33 1,94 12,02

F9 1,34 1,34 2,03 12,03

F10 3,67 3,34 1,94 12,02

F11 0,99 1,32 1,94 12,02

F12 1,67 2,34 2,03 12,03

10

Tabelul V.4. Caracteristicile farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor cu 5-FU:

rezistență mecanică, friabilitate, timp de dezagregare, pH

FORMULA

PARAMETRII

Rezistență

mecanica

(N)

Friabilitate

(%)

Timp de

dezagregare

(min)

pH

F1 94,96 0,09 99 3,98

F2 92,52 0,16 165 3,96

F3 85 0,38 196 3,87

F4 60,56 0,61 76 4,06

F5 56,42 0,68 79 4,97

F6 52,16 0,72 67 4,82

F7 95,20 0,33 133 4,26

F8 100,92 0,20 158 4,56

F9 102,24 0,22 188 4,75

F10 100,15 0,28 141 4,62

F11 108,64 0,26 232 4,60

F12 111.38 0,25 282 4,89

Comprimatele analizate prezintă caractere macroscopice (aspect, miros, culoare) și

dimensionale (diametru și grosime) corespunzătoare. Diametrul și grosimea variază în limite

foarte mici față de dimensiunile poansonului ales pentru comprimare.

Friabilitatea s-a încadrat în limitele impuse de normativele în vigoare sub 1%, fiind

sub 0,26% pentru formulările F1, F2 și F8, F9, F10, F11, și F12 crescând odată cu creșterea

cantitătii de polimer în cazul Carbopolului și variind nesemnificativ în cazul hidroxipropil

metilcelulozei

Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12). În cazul

C71 M 4000 și M100000, timpul de dezagregare creste odată cu creșterea procentului de

polimer, în timp ce în cazul C974, variațiile sunt nesemnificative la creșterea cantitătii de

polimer din formulare.

Rezistenţa mecanică a comprimatelor prezintă variaţii dependente de natura şi

procentul polimerului din formulă.

pH-ul comprimatelor studiate este cuprins în intervalul 3,82 – 4,89, fiind compatibil

cu pH-ul fiziologic.

Timpul de mucoadeziune ”ex vivo” a comprimatelor prezintă o creştere a valorilor în

funcţie de concentraţia polimerului din formulă, cea mai mare valoare fiind înregistrată

pentru formula F12 de 27,13 ore ( Fig.V.4).

11

Fig.V.4. Reprezentarea grafică a timpului de mucoadeziune ”ex vivo”

a comprimatelor vaginale cu 5-FU

V. 4. Concluzii

Caracteristicile farmaceutico – tehnologice ale comprimatelor mucobioadezive

vaginale cu 5-FU obţinute se încadrează în limitele admise de normativele de calitate în

vigoare. Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12).

Timpul de mucoadeziune ”ex vivo” variază astfel: M 100 000 > M 4000 > C 71 > C

974, nefiind observate variaţii foarte mari în funcţie de concentraţia polimerului.

Rezultatele obținute la determinarea unghiului de umectare arată că formulările F2, F6

și F7 prezintă cel mai puternic caracter hidrofil şi cea mai bună adeziune la mucoase.

0

5

10

15

20

25

30T

imp

ul

de m

ucoad

eziu

ne e

x

viv

o

Formula

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

12

CAPITOLUL VI

OPTIMIZAREA FORMULĂRII COMPRIMATELOR BIOMUCOADEZIVE

VAGINALE CU 5 – FLUOROURACIL

Optimizarea reprezintă, pe lângă o tehnică de screening, o metoda de alegere a celei

mai bune asocieri de materii prime şi a procesului tehnologic corespunzător, permițând, în

concluzie, formularea optimă a produsului.

Tehnicile de optimizare specifice sistemelor farmaceutice se referă îndeosebi la

formulare şi procedee tehnologice.

Utilizarea planurilor experimentale şi a metodelor de optimizare, care asigură

achiziţia progresivă de informaţie, permite reducerea numărului de experimente cât mai mult

posibil, fără a pierde însă din calitatea rezultatelor.

VI.1.1.1.Planul experimental

Pentru efectuarea studiului s-a ales un plan experimental cu 9 variabile şi mai mult de

trei nivele. Pentru optimizarea formulării s-a utilizat un plan experimental de tip D-optimal,

care oferă o flexibilitate mare, permite studierea factorilor pentru care există constrângeri

lineare în setare, studierea unui spaţiu experimental neregulat şi studierea factorilor calitativi

la mai mult de două nivele.

Tabel VI.3. Variabilele independente (factorii de formulare)

Factori Simbol NIVELE

0 1 2 3

C 71 X1 0 60 90 150

C 974 X2 0 60 90 150

M 4000 X3 0 60 90 150

M 100 000 X4 0 60 90 150

Microcelac X5 35-140

5 FU X6 100

Stearat de Mg X7 0 6 - -

Aerosil X8 0 3 - -

Talc X9 0 6 - -

Tabel VI.5. Variabilele dependente (răspunsurile folosite pentru evaluarea proprietăţilor

amestecului – parametrii de curgere şi compresibilitate)

Factori Simbol

Timp de curgere (s) Y1

Coeficient de fricţiune Y2

Unghiul de repaus α (°) Y3

Raport Hausner Y4

Indice Carr (%) Y5

13

Tabel VI.6. Matricea planului experimental (N1-N12, plan experimental redus)

Exp. No. Run

Order

Variabila independentă

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9

N1 8 0 0 90 0 110 100 0 0 0

N2 4 0 60 0 0 125 100 6 3 6

N3 2 90 0 0 0 110 100 0 0 0

N4 3 150 0 0 0 50 100 0 0 0

N5 5 0 90 0 0 95 100 6 3 6

N6 11 0 0 0 90 110 100 0 0 0

N7 9 0 0 150 0 50 100 0 0 0

N8 12 0 0 0 150 50 100 0 0 0

N9 7 0 0 60 0 140 100 0 0 0

N10 1 60 0 0 0 140 100 0 0 0

N11 10 0 0 0 60 140 100 0 0 0

N12 6 0 150 0 0 35 100 6 3 6

Influenţa celor nouă parametrii stabiliţi prin planul experimental asupra parametrilor

de curgere şi compresibilitate ai amestecurilor propuse pentru comprimare este precizată în

matricea răspunsurilor (tabelul VI.7.).

14

Tabel VI.7. Matricea răspunsurilor planului experimental (N1-N12)

Exp.

No.

Run

Order

Timpul

de curgere

Coeficient de

fricţiune

Unghi

de repaus

Raport

Hausner

Indice

Carr

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

N1 8 1.25 34.7 0.69 1.32 23.94

N2 4 100 46.4 1.05 1.65 39.7

N3 2 0.125 34 0.67 1.1 9.09

N4 3 0.115 32 0.62 1.93 48.38

N5 5 100 47.8 1.1 1.61 38.23

N6 11 0.1 29.7 0.57 1.32 23.52

N7 9 1.35 36.2 0.73 1.39 28.16

N8 12 0.35 34.6 0.69 1.5 32.81

N9 7 1 25.2 0.47 1.32 23.94

N10 1 0.142 29.5 0.56 1.17 14.7

N11 10 0.1 30.1 0.58 1.29 22.72

N12 6 100 50.2 1.2 1.71 41.66

Tabel VI.8. Rezultatul obţinut în urma fitării datelor în vederea validării planului experimental

Validarea răspunsului

R2 R2 –

ajusted Q2

SDY Deviaţia standard

RSD Deviaţia Standard reziduală

Model Validity

Reproducibility

Timp de curgere (s) 0.987821 0.955342 0.97102 45.0013 9.50977 0.141855 0.592439

Coeficient de fricţiune 0.90471 0.650602 0.888205 8.01083 4.73519 0.135784 0.952423

Unghiul de repaus α (°) 0.942392 0.788771 0.934854 0.237657 0.1099227 0.0348448 0.848697

Raport Hausner 0.625852 0.371875 0.260271 0.242379 0.283892 0.0751735 0.95904

Indice Carr (%) 0.589346 0.30352 0.30352 11.5689 14.196 0.0969723 0.952417

Fig. VI.9. Rezultatul obţinut în urma fitării datelor în vederea validării planului experimental

Rezultatele fitării datelor experimentale şi interpretarea parametrilor statistici calculaţi

în cadrul planului experimental propus demonstrează că modelul ales este corespunzător cu

datele experimentale, iar capacitatea de prevedere a planului este corectă. Rezultate foarte

15

bune s-au obţinut în cazul raportului Hausner care are o valoare a validităţii modelului foarte

aproape de 1. Rezultate bune s-au întâlnit şi în cazul celorlalţi parametri: coeficientul de

fricţiune, unghiul de repaus, viteza de curgere şi respectiv indicele Carr.

VI.1.2. Rezultate

Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere (Y1)

În cadrul planurile experimentale reduse efectele medii ale factorilor se confundă cu

interacţiunile de ordin doi, aspect ce duce la imposibilitatea verificării interacţiunilor dintre

factori.

Rezultatele obţinute pe baza testului ANOVA, cât şi în urma analizei curbelor de

dependentă, indică o fitare corespunzătoare a modelului.

Fig.VI.2. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus

pentru timpul de curgere

Fig. VI.3. Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere

Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere este reprezentată în

fig.VI.3. Coeficienţii scalaţi ai ecuaţiei cu ajutorul căreia s-a efectuat fitarea planului

experimental indică faptul că cea mai mare influenţă asupra timpului de curgere o are

16

variabila independentă X2 (C 974). Variabila X5 (Microcelacul) a prezentat o influenţă mai

puţin semnificativă şi negativă, în sensul diminuării valorii timpului de curgere ceea ce

corespunde din punct de vedere tehnologic la o îmbunătăţire a proprietăţilor de curgere a

amestecurilor.

Variabila de formulare X1 prezentă o influenţă semnificativă negativă asupra timpului

de curgere (creşterea concentraţiei determină scăderea timpului de curgere), ceea ce confirmă

proprietăţile bune de curgere ale sortului C71, recomandat pentru comprimarea directă.

Variabila X2 are o influenţă semnificativă asupra variabilei Y1, pozitivă ca valoare,

dar negativă din punct de vedere tehnologic, deoarece creşterea concentraţiei acestei variabile

în formulă va determina o creştere a valorii Y1.

De asemenea, conform rezultatelor obţinute se observă că variabilele independente

X3 (M 4000) şi X4 (M 100000) determină o diminuare a valorii variabilei dependente Y1,

fiind confirmate astfel proprietăţile optime de curgere ale acestor sorturi de hidroxipropil

metilcelluloză.

Influenţa factorilor de formulare asupra coeficientului de fricţiune (tg )

Fig. VI.4. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus

pentru coeficientul de fricţiune

Fig. VI.5. Influenţa factorilor de formulare asupra coeficientului de fricţiune

Dintre factorii de formulare analizaţi, cea mai mare influenţă asupra coeficientului de

fricţiune, în sensul creşterii valorii acestui parametru de curgere, o are variabila X2 (C974).

Variabilele X1, X3 şi respectiv X4 au influenţă nesemnificativă (fig. VI.5).

17

Influenţa factorilor de formulare asupra unghiului de repaus (Y3)


pentru unghiul de repaus

Fig. VI.7. Influenţa factorilor de formulare asupra unghiului de repaus

Variabila dependentă Y3 este influenţată semnificativ pozitiv, în sensul creşterii

valorii, de variabila X2 (C974) (fig. VI.6).

Variabilele dependente X1, X3 şi X4 nu prezintă o influenţă semnificativă asupra

variabilei dependente Y3.

18

Influenţa factorilor de formulare asupra raportului Hausner (Y4)


pentru raport Hausner

Fig. VI.9. Influenţa factorilor de formulare asupra raportului Hausner

Raportul Hausner este influenţat semnificativ de X2 (C974) în sensul creşterii valorii

acestui parametru, în timp ce variabila X5 exercită o influenţă semnificativă în direcţia

diminuării valorii raportului Hausner (fig. VI.8). Influenţa variabilei X5 va conduce la

îmbunătăţirea proprietăţilor de curgere a amestecurilor, fiind confirmat astfel faptul că în

procesul de formulare a fost selectat un diluant optim.

19

Influenţa factorilor de formulare asupra indicelui Carr (Y5)


pentru indice Carr

Fig. VI.11. Influenţa factorilor de formulare asupra indicelui Carr

Rezultatele obţinute evidenţiază influenţa semnificativă şi pozitivă a X1 şi X2 asupra

Y5, în timp ce X5 are o influenţă semnificativă dar în sensul diminuării valorii indicelui Carr.

Variabila X3 şi X4 nu influenţează semnificativ Y5 (fig.VI.10.).

Fig. VI.12. Valoarea coeficienţilor normalizaţi scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul

experimental propus pentru factorii de formulare

20

Fig .VI.13. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus

pentru factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi)

În fig. VI.12 sunt prezentaţi pentru variabilele dependente Y1, Y2, Y3, Y4, Y5

coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus pentru

factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi).

VI.2. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor farmaceutico-

tehnologice ale comprimatelor a urmat aceeaşi paşi. Pentru optimizarea formulării s-a utilizat

un plan experimental de tip D-optimal, care permite studierea factorilor de formulare ce

prezintă mai mult de două nivele.

În cadrul studiului influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor farmaco-

tehnice sau calculat coeficienţii scalaţi ai ecuaţiei cu ajutorul căreia s-a efectuat fitarea

planului experimental. Valoarea pozitivă a coeficientului indică o creştere a valorii

răspunsului, în timp ce o valoare negativă indică o diminuare a răspunsului. Coeficienţii

corespunzători factorilor multipli (termenii produs) reprezintă efectul de interacţiune al

factorilor respectivi, iar coeficienţii termenilor pătratici reprezintă evoluţia neliniară a

răspunsului în funcţie de factorul respectiv.

Fig.VI.21. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus pentru

caracteristicile farmaceutico-tehnologice

21

Tabel VI.21. Valoarea coeficienţilor normalizaţi scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind

planul experimental propus pentru factorii de formulare

Coeficienţii

Normalizaţi

Coeff.N:

Uniformitatea

masei minus

(%)

Uniformitatea

masei plus

(%)

Grosime

(mm)

Diametru

(mm)

Rezistenţă

Mecanică

(N)

Friabilitate

(%) pH

Timp de

Dezagregare

(min)

Timp de

Mucoadeziune

„ex vivo”

(ore)

C 71 0.147115 0.200587 8.81153 0.028148 0.138601 0.0914357 0.386509 0.129724 0.413968

C 974 0.455984 0.65289 0.734468 0.938045 0.199258 0.10329 0.465457 0.555283 0.22004

M 4000 0.251676 0.0699775 1.08475 0.275902 0.0964908 0.0404297 0.377987 0.13364 0.336033

M 100 000 0.174605 0.4041 0.319051 0.377246 0.261988 0.0711596 0.552147 0.596914 0.408672

Microcelac 0.146127 0.0172751 0.313593 0.352277 0.0134258 0.133675 0.100419 0.379178 0.172528

Stearat de Mg 0.0169883 0.302662 0.434652 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676

Aerosil 0.0169883 0.302662 0.434652 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676

Talc 0.0169883 0.302662 0.208581 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676


pentru factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi)

Fig.VI.32. Importanţa factorilor de formulare în funcţie de coeficienţii ecuaţie de fitare a planului

experimental

În concluzie, C974, stearatul de mg, aerosilul şi talcul prezintă cea mai mare influenţă

asupra caracteristicilor farmaco-tehnice comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare

modificată cu 5 – fluorouracil.

22

Timpul de dezagregare (min) şi timpul de mucoadeziune „ex vivo” (ore) au fost

influenţați semnificativ de M100 000, în timp ce C71 a influenţat valorile pH-ului, iar

microcelacul a avut impact semnificativ asupra uniformităţii masei minus (%) şi M100 000

asupra uniformităţii masei plus, asupra rezistenţei mecanice, a timpului de dezagregare (min)

şi a timpului de mucoadeziune „ex vivo” (ore).

VI.3. Determinarea formulei optime de preparare

Metoda Prediction - Design Space arată setările factorilor pentru optimizarea

selectată şi variabilitatea acceptată în jurul acestor setărilor (a factorilor) care se menţin

conform predicţiei în regiunea acceptată pentru răspunsuri. Se poate face o estimare a unei

zone sigure (Design Space) cu simularea Monte Carlo a factorilor. Aplicaţia face o căutare

pentru a găsi cea mai largă regiune (limite maxime) pentru fiecare factor, care poate fi

utilizată şi care respectă toate cerinţele pentru răspunsuri.

Fig. VI.38. Predicţia spaţiului de estimare şi validitatea modelului (DPMO)

Fig. V.11. Formula optimă a comprimatului privind parametrii de curgere şi caracteristicile

farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu cedare modificată cu 5 – fluorouracil

23

Tabel VI.24. Nivelul optim al factorilor de formulare a comprimatului privind parametrii de curgere

şi caracteristicile farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu cedare modificată

cu 5 – fluorouracil

Factori Simbol Nivel optim 1

F2

Nivel optim 2

F1

C 71 X1 90 60

C 974 X2 0 0

M 4000 X3 0 0

M 100 000 X4 0 0

Microcelac X5 110 140

5 FU X6 100 100

Stearat de Mg X7 0 0

Aerosil X8 0 0

Talc X9 0 0

VI.3.3. Discuţii

Etapa de optimizare a utilizat o metodă dependentă de model în cadrul căreia s-au

realizat un număr de experimentări. Pe baza acestora s-a realizat modelarea matematică care a

permis prin metode de analiză factorială găsirea formulării optime. Analiza factorială a

definit clar relaţia ce există între variabilele de intrare, interacțiunile lor (factorii de

formulare) şi variabilele dependente (răspunsuri), realizându-se în acest fel suprafaţa de

răspuns a sistemului sau planul factorial. La baza metodelor de optimizare stă realizarea

planurilor experimentale ce permit identificarea condiţiilor optime după un model matematic

bine stabilit. Procesul de optimizare permite stabilirea unor constrângeri ce pot fi uneori

impuse în cadrul formulării. Nivelul optim al factorilor de formulare privind parametrii de

curgere şi caracteristicile farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu

cedare modificată cu 5 – fluorouracil este definit de tabel VI.24., în care nivelul optim 1 îl

reprezintă formularea F2 cu un conţinut de 30% Carbopol 71, iar nivelul optim 2 este

reprezentat de formularea F1, care conţine acelaşi polimer formator de matriţă, dar în

cantitate de 20%.

VI.4.Concluzii

În urma analizei rezultatelor fitării datelor experimentale putem afirma că există o

bună corelaţie între condiţiile experimentale şi răspunsuri. Variaţia răspunsurilor în funcţie de

modificările concentraţiilor factorilor de formulare, ca variabile independente ale planului,

sunt determinate de condiţiile experimentale.

În urma realizării planului experimental şi pe baza modelului matematic stabilit s-a

identificat formula optimă de formulare şi anume F2 la nivel optim 1, respectiv F1 la nivel

optim 2, și s-au estimat valorile teoretice ale variabilelor dependente prevăzute pe baza

modelului. Rezultatele au fost calculate pentru in interval de încredere de 95%, cu alte

cuvinte se admite o abatere de ±5%, faţă de rezultatele prevăzute teoretic. Valorile DPMO

(Defects Per Million Opportunities) ce constituie un criteriu de delimitare a spaţiului de

estimare, confirmă validitatea modelului.

24

CAPITOLUL VII

ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI NOI METODE DE DOZARE A 5-FU DIN

COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE

Pentru a putea determina cantitativ concentrația în 5-FU a comprimatelor

mucobioadezive vaginale și pentru a evalua disponibilitatea in vitro a 5-FU din acestea,

următorul obiectiv al cercetării propuse cuprinde studii privind elaborarea şi validarea unei

metode de analiză cantitativă a 5-FU prin cromatografia de lichide de inaltă performanţă,

folosind un sistem cromatografic HPLC Thermo Surveyor, echipat cu Surveyor LC –Pump,

Autosampler Surveyor LC-Plus şi detector UV-VIS. Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-fluorouracilului (5-FU) ca

monosubstanţă (condiţii preliminare, mod de lucru, criterii de acceptare) prin cromatografia

de lichide de înaltă performanţă (HPLC) presupune investigarea următorilor parametrii:

compatibilitatea sistemului, specificitatea, liniaritatea, exactitatea metodei, limita de detecţie

şi limita de cuantificare.

Pentru determinarea cantitativă a 5-fluorouracilului s-a folosit metoda standardului

intern. Piridin 3-carbohidrazidă (P3C) a fost ales pentru a juca rolul standardului intern, pe

baza caracteristicilor fizico-chimice similare prezentate în Tabelul VII.1

Tabelul VII.1 Valorile pKa si logP ale 5-FU si P3C

Compus pKa logP

5-fluorouracil(5-FU) 13,0 -1,0

Piridin-3-carbohidrazida(P3C) 11,2 -1,8

VII.3.Rezultate şi discuţii

Metoda se bazează pe separarea HPLC a celor doi compuşi, cu detecţie UV la 270 nm.

a

b

Figura VII.1 a. blanc b. Picuri corespunzatoare celor doua probe amestec 5-FU cu P3C

si proba cu 5-FU

Tabelul VII.2. Caracteristicile solutiilor injectate

Soluţia

injectată

Concentraţia

5FU (mg/ml)

Concentraţia

P3C (mg/ml)

Tr 5FU

(minute)

Tr P3C

(minute)

Aria

5FU

Aria

P3C

SI1 0,01 0,01 2,90 2,0 2046079 977435

SI2 0,01 - 2,903 1998566 -

Minutes

0 1 2 3 4 5 6

mA

U

-10

0

10

20

mA

U

-10

0

10

20

pda-Scan-270 nm

blanc-fm

Minutes

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

2.0

75

10

14

81

7

si

2.9

08

18

54

03

1

5fu

pda-270nmp1

Retention Time

Area

Name

25

Se observa ca timpul de retenţie al 5-FU este de aproximativ 2,9 minute, iar timpul de

retenţie pentru P3C este de 2 minute.

Tabel VII. 5. Ariile picurilor pe intervalul de concentratie 0,00005-0,012 mg/ml 5-FU

C5FU

Aria 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.001 0.0005

Seria 1 2554905 2122582 1687026 1242723 811793 364297 158536 102013

Seria 2 2540549 2146008 1683366 1245170 820066 370410 161257 103253

Seria 3 2542362 2136564 1692365 1246569 820125 368566 160236 102564

media 2545939 2135051 1687586 1244821 817328 367757.7 160009.7 102610

Figura VII.2. Dreapta de calibrare a 5- FU

Metoda este exactă pe intervalul de concentratie cercetat 0,0005-0,012mg/ml, având

procentul de regăsire mediu 103.4854, deviaţia standard individuală 0,0148, deviaţia standard

relativă 1,4127, iar valoarea maximă a abaterilor procentuale este 4.16.

Tabel VII. 10 Evaluarea exactitatii metodei HPLC

Rap

ort

con

cen

trat

ii

Teo

reti

ce X

a

Rap

ort

ari

i

5F

U/P

3C

Rap

ort

con

cen

trat

ii

Reg

ăsit

e

Xr

Reg

ăsir

ea

pro

cen

tual

ă

Co

nce

ntr

atii

5F

U

(mg

/ml)

Ab

ater

i

ind

ivid

ual

e

Ab

ater

i

pro

cen

tual

e

SP1 1.021 2.2513 1.060194 103.8388 0.010602 0.039194 3.919417

SP2 1.016 2.2459 1.057698 104.1041 0.010577 0.041698 4.169764

SP3 1.008 2.1932 1.033333 102.5132 0.010333 0.025333 2.533333

y = 216112946.6699x - 42476.4392

R2 = 0.9996

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014

concentratii 5FU (mg/ml)

ari

i (m

Au

)

Liniaritate 5FU Linear (Liniaritate 5FU)

26

Figura VII.5. Distribuția concentrațiilor regăsite de 5-FU

Rezultatele obţinute la determinarea cantitativă a 5-FU din cele 12 formulări folosind

noua metoda elaborată şi validată se înscriu în intervalul de 95-105%, cu excepţia probelor

F8, F10, F11 şi F12.

VII.5.Concluzii

A fost elaborată o metodă de dozare cantitativă prin HPLC a 5- FU din comprimate

bioadezive vaginale care a dovedit compatibilitate, liniaritate, precizie si exactitate.

Compatibilitatea sistemului este definită de repetabilitatea injectării (RSD%5FU =

1,1006 , RSD%P3C = 1,9053), determinarea intervalului de încredere la un nivel de siguranţă

de 95%, repetabilitatea timpului de retenţie (RSD%5FU = 1,8117 , RSD%P3C = 1,8694), gradul

de separarea a două picuri consecutive ( Rs5FU/P3C= 5,38, numărul de talere teoretice ale

coloanei (N5FU = 3757 , NP3C = 3110).

Metoda este exactă pe intervalul de concentratie cercetat 0,0005-0,012mg/ml, având

procentul de regăsire mediu 103.4854, deviaţia standard individuală 0,0148, deviaţia standard

relativă 1,4127, iar valoarea maximă a abaterilor procentuale este 4.16.

Intervalul de concentraţii regăsit în studiul cuantificării conţinutului de 5-fluorouracil

în cele 12 formulări de comprimate mucobioadezive vaginale este cuprins într 93,46 şi

110,28%.

85.00

90.00

95.00

100.00

105.00

110.00

115.00

p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12

proba

determinarea concentratiilor de 5-fluorouracil

27

CAPITOLUL VIII

EVALUAREA DISPONIBILITĂȚII IN VITRO A 5-FU DIN COMPRIMATE

BIOADEZIVE VAGINALE

Testul de dizolvare „in vitro” este un parametru de calitate important pentru

comprimate care, la rândul său, poate fi un criteriu pentru prognozarea biodisponibilităţii

substanţei medicamentoase din forma farmaceutică.

Evaluarea cineticii de cedare a 5-FU va sta la baza stabilirii protocolului experimental,

în vederea evaluării biodisponibilităţii 5-FU din comprimatele mucobioadezive vaginale cu

cedare modificată.

În altă fază a cercetărilor (Capitolul VI) am elaborat şi validat o metodă de analiză

prin comatrografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) pentru determinarea cantitativă a

5-FU ca monosubstanţă. Metoda a fost utilizată pentru determinarea cantitativă a 5-FU din

comprimatele bioadezive vaginale, cât şi pentru determinarea cedării „in vitro” a acestuia

prin testului de dizolvare.

VIII.2.Rezultate şi discuţii

Figura VIII.1. Profilurile vitezei de cedare a 5-FU din comprimate (Formulele 1- 12.)

0

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

80.000

90.000

100.000

110.000

0,50 1,50 2,50 3,50 4,50 5,50 6,50 7,50 8,50 9,50 10,50 11,50

Co

nc

en

tra

tio

ns [

mg

/co

mp

]

Time [h]

P1

P2

P4

P5

P6

P7

P8

P9

P10

P11

P12

P3

28

Tabel VIII.14. Prelucrare statistică

ANOVA

Sursa variaţiei SS df MS F P-value F crit

În acelaşi grup 38959.79819 11 3541.799835 3.934629054 6.97281E-05 1.869290423

Intre grupuri diferite 108019.3264 120 900.1610537

Total 146979.1246 131

Tabel VIII.15. Factorul de diferenţă f1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12

P1 - 37.30 20.16 16.12 11.22 7.46 34.96 43.75 43.20 33.74 49.18 55.34

P2

- 32.42 74.66 67.79 57.47 27.41 26.92 27.47 29.07 30.48 32.65

P3

- 36.00 29.98 22.56 24.06 32.82 31.98 24.30 38.93 45.90

P4

- 12.27 17.28 39.00 47.22 47.36 37.46 52.67 58.75

P5

- 9.02 37.73 46.12 46.27 36.20 51.68 57.89

P6

- 33.51 42.56 42.22 31.98 48.16 54.72

P7

- 13.51 13.71 4.05 22.41 32.38

P8

- 5.85 18.48 10.33 21.85

P9

- 18.81 12.21 21.64

P10

- 24.32 34.04

P11

- 12.85

P12

-

Tabel VIII.16. Factorul de similaritate f2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12

P1 - 20.34 31.29 32.72 46.73 55.24 23.96 19.72 19.72 25.13 17.39 15.12

P2

- 31.36 16.61 18.71 22.29 42.08 38.93 39.17 40.86 34.60 31.35

P3

- 24.02 28.88 36.33 35.02 28.79 28.56 35.35 24.90 22.08

P4

- 44.01 34.39 21.01 17.68 17.62 21.75 15.84 13.66

P5

- 49.09 22.58 18.56 18.54 23.57 16.38 14.09

P6

- 26.20 21.46 21.37 27.30 18.80 16.28

P7

- 54.51 54.56 75.50 43.75 36.90

P8

- 69.89 50.39 62.45 48.34

P9

- 51.21 57.99 48.19

P10

- 41.51 35.40

P11

- 60.40

P12

-

29

În ceea ce priveste cedarea in vitro a 5-FU din comprimatele mucobioadezive vaginale pe

unitatea de timp se observă următoarele:

- formulele P1, P4, P5 şi P6 cedează după 3 ore între 80-99%, după care urmează o cedare

relativ constantă, sub formă de platou pe perioada de timp urmărită, de 10 ore;

- formulele P7, P8, P9, P10,P11şi P12 cedează mai lent, atingând la 6 ore concentraţii de 35-

60%, iar la 10 ore de 60-80%;

- formulele cu un profil de cedare diferit sunt formula P3, care cedeaza la 6 ore 100% 5-FU,

şi formula P2, care cedează la 6 ore 40% 5-FU, continuând să cedeze pe timpul celor 10 ore,

atingând concentraţia de 100%.

Valoarea testului statistic F=3,94 prezintă o valoare de mai mare decât valoarea critic

statistică.Valoarea varianţelor standard individuale indică o diferenţă statistic semnificativă

între ratele de cedare a 5-fluorouracil în cazul celor 12 sisteme studiate.

Profilurile de cedare diferite ale formulărilor cu 5-FU sunt confirmate şi de rezultatele

obţinute la analiza statistică, prin determinarea factorul de diferenţă f1 (Tabel VIII.15) și

factorul de similaritate f2 (Tabel VIII.16.).

VIII.4.Concluzii

Din rezultatele obținute se observă influența tipului de polimer, folosit la formularea

comprimatelor mucobioadezive, asupra cedării 5-FU. Comprimatele care conțin Carbopol

cedează cantităti mai mari de 5-FU (93,85-105,73) după 10 ore, în timp ce formulările F6-

F12, ce conțin Metolose, cedează o cantitate mai mică de 5-FU, concentrațiile variând între

57,11-82,92% din concentrația declarată, după 10 ore.

Profilurile de cedare sunt similare la formulările F1-F6 ce conțin carbopol, precum și

la F7-F12, formulări ce conțin metoloză.

30

CAPITOLUL IX

ELABORAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A 5-FU

DIN PROBE BIOLOGICE

Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-fluorouracil din probe biologice prin

cromatografia de lichide de înaltă performanță cuplată cu detecție de spectrometrie de masă

presupune investigarea următorilor parametrii: compatibilitatea sistemului, specificitatea,

liniaritatea, exactitatea metodei, limita de detecţie şi limita de cuantificare.

Pentru determinarea cantitativă a 5-fluorouracil s-a folosit metoda standardului extern.

Metoda se bazează pe separarea HPLC a analitului de interes de matricea biologică prin

utilizarea de tehnici cromatografice și detecție spectrometrie de masă.

Conţinutul în 5-fluorouracil se calculează pe baza ecuaţiei regresiei liniare şi raportate

la concentraţia standardului intern cu ajutorul formulei:

% 5fu=

unde:

- AST= aria picului corespunzător 5-fluorouracil în soluţia de analizat SA

- ASI= aria picului corespunzător standardului intern în soluţia de analizat

SA

- CSI = concentraţia standardului intern în soluţia de analizat SA

- FST = factorul de diluţie corespunător soluţiei de analizat

- b = panta dreptei de calibrare

- a= intreceptul la origine a dreptei de calibrare

IX.3.Rezultate şi discuţii

Figura IX.4. Cromatograma 5-FU în solutie de concentrație 1000PPB

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

CHROMATOGRAM

31

În urma studiului de elaborare a unei noi metode de dozare a 5-FU din probe

biologice s-a stabilit că timpul de retenţie al 5-fluorouracil prin această metodă este de

aproximativ 1,34 minute (Fig.IX.4.)

Tabel IX.2. Repetabilitatea injectării

Proba

5FU 0.01 mg/ml 5FU 0.01 mg/ml

Aria Abateri

individuale

Abateri

relative

Tr 5FU

(minute)

Abateri

individuale

Abateri

relative

SC1 3595 17.1 0.477934 1.344 0.004 0.298507

SC2 3566 11.9 0.332597 1.334 0.006 0.447761

SC3 3578 0.1 0.002795 1.341 0.001 0.074627

SC4 3568 9.9 0.276699 1.344 0.004 0.298507

SC5 3588 10.1 0.282288 1.335 0.005 0.373134

SC6 3576 1.9 0.053104 1.34 2.22E-16 1.66E-14

SC7 3566 11.9 0.332597 1.344 0.004 0.298507

SC8 3587 9.1 0.254339 1.338 0.002 0.149254

SC9 3600 22.1 0.617681 1.342 0.002 0.149254

SC10 3555 22.9 0.64004 1.338 0.002 0.149254

Media 3577.9 1.34

SD 14.43337 0.003682

RSD 0.403403 0.27476

Repetabilitatea injectării, reflectată în invariabilitatea atât a ariilor picurilor, cât şi a

timpilor de retenţie, defineşte precizia sistemului.

Figura IX.5. Dreapta de calibrare a 5-FU (raportul ariilor/raportul concentrațiilor)

y = 3,404xR² = 0,9963

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0

LINIARITATE

32

Corelograma (dreapta de calibrare) din figura IX.5 evidenţiază o variaţie liniară a ariei

picului în funcţie de concentraţia probei. Prin urmare, estimarea arei picurilor se va face cu

ajutorul ecuaţiei de regresie liniară: Aria = 3.404 * Concentraţia

Pentru studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză se calculează: concentraţia

regăsită (Cregăsit), randamentul de regăsire (R%) al 5-fluorouracil din probele reconstituite,

abaterea procentuală (Xd%) şi oblicitatea experimentală.

O metodă este considerată exactă dacă randamentul de regăsire (regăsirea

preocentuală) este cuprins în intervalul 95– 105 % faţă de concentraţia teoretică introdusă

(Tabel IX.6).

Tabel IX.6. Randamentul de regăsire

Probă Concentrație

Teoretica -Xa

Regăsirea

procentuală

Concentratii 5FU

(ng/ml)

SP1 250 99.62 249.04

SP2 500 99.51 497.53

SP3 1000 95.66 956.62

Celelalte valori obținute în studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză:

- Procentul de regăsire mediu= 98,26

- Deviaţia standard individuală este 0.014

- Deviaţia standard relativă 1.41

arată că metoda elaborată este exactă şi reproductibilă.

IX.5.Concluzii Ţinând cont de valorile experimentale obţinute la studiul compatibilităţii sistemului

cromatografic, care se încadrează în limitele prevăzute de standardele în vigoare, se poate

afirma că sistemul este compatibil.

Analiza statistică prin testul ANOVA indică corectitudinea modelului liniar

determinat, existând o legătură liniară, semnificativă statistic, între concentraţia probei şi aria

picului pentru un prag de certitudine de 95%. Variabila independentă influenţează

semnificativ comportarea variabilei dependente, deci raportul de corelaţie este semnificativ

statistic. Deviaţiile valorilor reziduale şi media sumelor pătratelor prezintă valori apropiate de

0, deci valorile prezise sunt similare valorilor determinate.

Metoda a arătat o relație bună liniară în intervalul de concentrație cuprins între 0,0001

şi 1 ng/ml 5-fluorouracil (R2 = 0,999), cu limite de cuantificare (LOQ) la 138ng / ml ser

uman Regăsirile medii de diferite concentrații de 5-FU în ser au fost de 88,80%.Acuratețea și

precizia datelor sunt acceptabile de-a lungul intervalului de concentrație investigat.

33

CAPITOLUL X.

STUDII FARMACOLOGICE COMPARATIVE PRIVIND ADMINISTRAREA

ORALĂ ŞI VAGINALĂ DE 5-FLUOROURACIL

Datele din literatură evidenţiază faptul că agentul chimioterapic antitumoral

5-fluorouracil (5-FU), administrat pe cale sistemică (orală sau intravenoasă), prezintă atât

efecte citocide, cât şi efecte radiosensibilizatoare la nivelul celulelor canceroase (170). Pe de

altă parte, uneori este necesară reducerea dozelor sau chiar renunţarea la terapia cu 5-FU din

cauza apariţiei efectelor adverse severe, cum ar fi: diaree severă, anorexie, greţuri, vărsături,

atrofii, ulceraţii şi hemoragii la nivel gastrointestinal, leucopenie, anemie, trombocitopenie,

afectare hepatică severă, ischemie miocardică, tromboflebite, tulburări vizuale, fotofobie,

stări confuzionale, dezorientare, euforie, ataxie, cefalee şi nefrotoxicitate (171-173).

Toate aceste aspecte au condus la numeroase cercetări pe modele animale şi

investigaţii clinice privind posibilitatea administrării topice a 5-FU la nivelul mucoasei

rectale (169-170), la nivel ocular (174), la nivel tegumentar (175), la nivelul mucoasei

vaginale sub formă de unguent tip cremă (176) sau gel (177.).

În acest context, scopul studiului a constat în evaluarea avantajelor administrării

topice intravaginale a 5-FU într-o nouă formulare farmaceutică (comprimate biomucoadezive

vaginale) comparativ cu administrarea pe cale orală, a unor doze echivalente.

Obiectivele studiului au fost:

- selecţia unei noi formulări farmaceutice, comprimate biomucoadezive vaginale cu 5-

FU pentru administrare pe cale intravaginală;

- administrarea la şobolani Wistar, femele, de 5-FU, pe cale orală şi pe cale

intravaginală, în două doze echivalente;

- evaluarea biochimică şi hematologică la animalele de laborator cărora le-au fost

administrate 5-FU, pe cale orală, respectiv, pe cale intravaginală în cele două doze.

Pentru studiile farmacologice comparative privind administrarea orală şi vaginală de

5-FU s-a selectat formularea F2 care, în urma testărilor farmacotehnice şi in vitro, a dovedit

că îndeplineşte conditiile de calitate necesare comprimatelor mucobioadezive.

În desfăşurarea experimentelor au fost respectate recomandările Comisiei de Etică a

Universităţii „Gr.T. Popa“, Iaşi, în strictă concordanţă cu reglementările etice internaţionale,

privind lucrul pe animale de laborator.

X.2.4.1. Metodologia cercetării farmacologice comparativă privind administrarea

orală şi vaginală de 5-fluorouracil

Animalele au fost repartizate în 5 loturi de câte 7 şi au primit substanţele zilnic, în

doză unică, la orele 9.00 a.m., timp de 5 zile, după următoarea schemă:

Lotul 1 (Martor, codificat SF): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp şobolan, pe cale orală;

Lotul 2 (codificat V5FUD1):, comprimat vaginal echivalent a 6 mg/kgc/zi, 5-FU;

Lotul 3 (codificat V5FUD2): comprimat vaginal,echivalenta 20 mg/kgc/zi, 5-FU;

Lotul 4 (codificat O5FUD1): 6 mg/kgc/zi, 5-FU pe cale orală;

Lotul 5 (codificat O5FUD2): 20 mg/kgc/zi, 5-FU pe cale orală.

După 5 zile de tratament, animalele au fost anesteziate cu eter etilic şi s-a recoltat sânge, pentru următoarele determinări:

- hematologice: hemoleucograma;

- biochimice:

o alaninaminotransferaza (ALAT) - denumită şi transaminaza glutampiruvică

(TGP);

34

o aspartat aminotransferaza (ASAT) - denumită şi transaminaza glutamică

oxalacetică (TGO);

o fosfatază alcalină;

o uree serică;

o creatinină serică;

o acid uric seric;

- cortizol seric;

- parametri de stres oxidativ:

o glutation peroxidaza (GPx);

o glutation redus (GSH);

o malondialdehida (MDA).

Datele au fost centralizate şi prelucrate statistic utilizând testul t-student din

programul Windows EXCEL. Rezultatele au fost exprimate sub forma mediei valorilor ±

deviaţia standard a mediei valorilor determinate pentru fiecare parametru determinat şi pentru

fiecare substanţă studiată în parte. Acestea au permis aprecierea semnificaţiei diferenţelor

constatate între loturile tratate cu 5-FU şi lotul martor. Valorile p < 0,05 sunt considerate

semnificative din punct de vedere statistic.

X.3. Rezultate și discuţii

Toate datele obținute au fost prelucrate după acelaşi algoritm.

TABEL X.1. Numărul total de globule albe (K/μL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil

SF V5FUD1 V5FUD2 O5FUD1 O5FUD2 L1 L2 L3 L4 L5

1 11,02 9,58 9,85 9,75 9,58 2 9,94 10,01 9,61 9,71 9,01 3 10,56 10,42 9,87 9,85 9,42 4 10,93 9,61 9,56 9,62 9,61 5 10,08 10,34 9,78 9,53 9,34 6 11,84 9,65 9,91 9,38 9,65 7 11,76 10,55 9,94 9,67 9,55

Media= 10,88 10,02 9,79 9,64 9,45 Dev. std.= 0,75 0,42 0,15 0,15 0,22

TABEL X.1b. Semnificaţia statistică a rezultatelor. Comparaţie între loturi.

5 zile

L1/L2 L1/L3 L1/L4 L1/L5 0,01 0,00 0,00 0,00

L2/L3 L2/L4 L2/L5

0,10 0,03 0,01

L3/L4 L3/L5

0,05 0,00

L4/L5

0,04

Legendă:

L1 = SF = ser fiziologic (0,5 ml/100 g corp şobolan, pe cale orală)

L2 = V5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, comprimate vaginale)


L4 = O5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, pe cale orală)


35

Fig. X.1. Numărul total de globule albe (K/μL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil

TABEL X.12. Valorile cortizolului (µg/dL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil.

SF V5FUD1 V5FUD2 O5FUD1 O5FUD2

L1 L2 L3 L4 L5

1 1,00 2,30 2,61 2,00 2,84

2 1,29 1,57 2,52 2,56 2,02

3 1,00 1,26 2,93 1,87 3,06

4 1,30 1,48 2,10 1,96 2,91

5 1,23 1,00 2,14 1,74 3,10

6 0,92 1,29 2,00 2,52 2,46

7 1,41 1,61 1,80 2,50 2,18

Media= 1,16 1,50 2,30 2,16 2,65

Dev. std.= 0,19 0,41 0,40 0,35 0,43

TABEL X.12b. Semnificaţia statistică a rezultatelor. Comparaţie între loturi.

5 zile

L1/L2 L1/L3 L1/L4 L1/L5

0,04 0,00 0,00 0,00

L2/L3 L2/L4 L2/L5

0,00 0,00 0,00

L3/L4 L3/L5

0,26 0,07

L4/L5

0,02

Legendă:

L1 = SF = ser fiziologic (0,5 ml/100 g corp şobolan, pe cale orală)





0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Loturi

Glo

bu

le a

lbe

(K/μ

L)

L1

L2

L3

L4

L5

36

Fig. X.12. Valorile cortizolului (µg/dL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil.

Rezultatele obţinute în urma determinării numărului de globule albe la şobolanii

trataţi cu 5-FU sunt prezentate în tabelul X.1 şi graficul corespunzător. În ambele doze

utilizate, 5-FU a determinat scăderea semnificativă statistic a acestui parametru, atât în cazul

administrării orale, cât şi în cazul administrării pe cale intravaginală, comparativ cu lotul

martor (p<0,05). Leucopenia indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la

animalele cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile

obţinute pentru acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale

intravaginală. În ambele forme de administrare, scăderea numărului total de globule albe a

fost semnificativ statistic mai puternică la doza mai mare (20 mg/kgc/zi).

Rezultatele obţinute în urma determinării hemoglobinei au arătat că în ambele doze

utilizate, 5-FU a determinat scăderea acestui parametru, atât în cazul administrării orale, cât şi

în cazul administrării pe cale intravaginală, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind

asigurate statistic (p<0,05) la toate loturile, cu excepţia animalelor din lotul care a primit doza

mică (6 mg/kgc/zi), pe cale intravaginală.

Trombocitopenia indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la

animalele cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile

obţinute pentru acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale

intravaginală.

Creşterea AST indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la animalele

cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile obţinute pentru

acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală.

Creşterea ALT indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la animalele


acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală.

Rezultatele obţinute în urma determinării ureei, creatininei şi acidului uric seric la

şobolanii trataţi cu 5-FU au arătat că în ambele doze utilizate, 5-FU a determinat creşterea

acestor parametri, atât în cazul administrării orale, cât şi în cazul administrării pe cale

intravaginală, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind asigurate statistic (p<0,05) doar în

cazul analizei comparative L1/L3 şi L1/L5 pentru ureea serică şi, respectiv, L1/L4, L1/L5,

L2/L4 şi L3/L5 pentru acidul uric seric.

Rezultatele obţinute în urma determinării cortizolului seric la şobolanii trataţi cu 5-

FU au arătat că în ambele doze utilizate, 5-FU a determinat creşterea acestui parametru, în

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Loturi

Cort

izol

(µg/d

L)

L1

L2

L3

L4

L5

37

ambele forme de administrare, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind acoperite statistic

(p<0,05) doar în cazul analizei comparative L1/L3, L1/L4, L1/L5, L2/L3, L2/L4 şi L4/L5.

Creşterea fosfatazei alcaline indusă de 5-FU a fost mai accentuată la animalele


acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală, rezultatele

fiind asigurate statistic doar în cazul analizei comparative L2/L4.

X.5. Concluzii

Cercetările experimentale efectuate au condus la următoarele concluzii:

- administrarea pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat leucopenie cu

neutropenie, anemie, trombocitopenie, efectele cele mai puternice înregistrându-se la

doza mai mare (20 mg/kgc/zi);

- administrarea sub formă de comprimate vaginale a 5-FU a determinat aceleaşi efecte

hematologice, dar mai reduse comparativ cu valorile obţinute în cazul administrării pe

cale orală;

- administrarea pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat creşterea AST, ALT,

a fosfatazei alcaline, a acidului uric, a ureei şi a creatininei serice, efectele fiind

ameliorate în cazul administrării pe cale intravaginală;

- modificările cortizolului seric şi ale parametrilor de stres oxidativ induse de

administrarea orală a 5-FU au fost îmbunătăţite în cazul administrării vaginale, în

ambele doze.

38

CAPITOLUL XI

CERCETAREA IN VIVO A FARMACOCINETICII 5-FLUOROURACILULUI

O etapă importantă din dezvoltarea unui medicament o reprezintă cercetarea in vivo a

acestuia s-a considerat necesară efectuarea de studii preliminare de evaluare in vivo, pe

animale de laborator, a biodisponibilității 5-FU sub formă de comprimate mucobioadezive

vaginale, comparativ cu forma de administrare orală.

Obiectivele specifice au avut în vedere determinarea principalilor parametri

farmacocinetici și determinarea comparativă a profilului în timp a 5-FU din formularea

farmaceutică vaginală nou realizată, comparativ cu administrarea clasică pe cale orală a unei

doze echivalente de 5-FU, pentru a demonstra avantajelor acestei noi formulări.

Administrarea substanțelor. Animalele au fost grupate în două loturi a câte 7

șobolani, la care s-a administrat o doză unică de 5 mg/kg 5-FU (într-un volum de 0,2ml/100g

corp). La primul lot s-a administrat substanța prin sondă eso-gastrică, iar la al doilea lot pe

cale intravaginală, astfel:

- Lot 1 (administrare vaginală): lot la care s-a administrat dispersia obținută din

cantitatea de comprimat mucobioadeziv corespunzătoare dozei de 5-FU;

- Lot 2 (administrare per os): lot la care s-a administrat dispersia de 5-FU în

carboximetilceluloza sodică.

Recoltarea probelor de sânge s-a realizat în vacutainere cu heparină, pentru fiecare

punct din schema de recoltare fiind necesară recoltarea a câte 0,3 mL de sânge. Pentru studiul

farmacocineticii 5-FU din formulările administrate, recoltarea probelor de sânge s-a

desfăşurat într-un interval de 24 de ore, conform următoarei scheme:

- proba 0 – momentul 0 (înainte de administrare),

- proba 1 – la 5 min după administrare,

- proba 2 – 10 min,



- proba 5 – 1 oră,

- proba 6 – 2 ore,




- proba10 – 8 ore,

- proba11 – 24 ore.

Prelucrarea probelor de sânge a constat în centrifugarea imediat după recoltare, timp

de 10 min, la 4000 rpm, iar plasma a fost transferată în eprubete separate tip Ependorff şi

stocată la congelator, la temperatura de -20ºC, până în momentul analizei cantitative HPLC.

Analiza probelor s-a realizat prin HPLC, conform metodei validate în capitolul VII. Limita de

cuantificare a 5-FU în probele biologice a fost stabilită la 0,14pg / ml ser uman.

Metoda analizei vizuale a datelor experimentale permite evaluarea aspectului

individual şi general al nivelelor plasmatice din graficele concentraţiilor plasmatice în funcţie

de timp.

O serie de parametri farmacocinetici pot fi evaluați direct din datele experimentale,

deoarece sunt independenţi de modelul de reprezentare a cineticii medicamentului în

organism. Alți parametri farmacocinetici depind de modelul cinetic, astfel încât trebuie să se

ţină cont, la calcularea lor, de modelul farmacocinetic ales.

Analiza statistică a datelor de farmacocinetică a fost realizată cu ajutorul programului

KINETICA (InnaPhase, USA). S-a utilizat testul parametric ANOVA pentru compararea

diferenţelor dintre loturi pentru Cmax şi pentru AUC.

39

XI.2. Rezultate și discuții privind farmacocinetica 5-FU

XI.2.1. Rezultatele analizei vizuale a datelor experimentale și analizei globale a

datelor pentru 5-FU

Metoda analizei vizuale a datelor experimentale evaluează aspectul individual şi

general al nivelelor plasmatice din graficele concentraţiilor plasmatice în funcţie de timp.

Fig. XI.3. Concentraţiile plasmatice medii de 5-FU, în funcţie de timp,

comparativ între căile de administrare

Analiza graficelor concentrațiilor plasmatice medii de 5-FU, în funcție de timp, ale

cele două căi de administrare studiate, arată o similaritate a profilurilor farmacocinetice, fiind

aproape superpozabile, pentru unele perioade. Profilul farmacocinetic al formulării

administrate vaginal este caracterizat printr-o valoare mult mai mare a Cmax comparativ cu

administrarea per os, iar valorile concentrațiilor plasmatice, începând cu 8 ore, la valori

similare cu ale administrării orale, până la 24 de ore după administrare.

XI.2.2. Analiza principalilor parametri farmacocinetici pentru 5-FU

Figura XI.4. Reprezentarea grafică a concentraţiilor plasmatice maxime individuale

pentru 5-FU, comparativ între căile de administrare studiate

Din analiza concentrațiilor plasmatice maxime de 5-FU se observă următoarele

valori: media Cmax = 4.84 ± 1.8 mg/mL la administrarea vaginală și media Cmax = 3.15 ±

1.4 mg/mL la administrarea per os. Analiza statistică a datelor Cmax nu a arătat diferențe

semnificative între concentrațiile Cmax măsurate în cadrul fiecarui lot (factor GROUP: F1,11

0

1

2

3

4

5

6

0 4 8 12 16 20 24

mg/

mL

ore

Farmacocinetica 5-FU

VAGPO

0

2

4

6

8

mg/

mL

vaginal per os

Cmax

40

= 3.312, P = 0.099), ceea ce poate fi echivalent cu eficiență clinică similară prin administrare

pe 2 căi diferite.

Figura XI. 7. Reprezentarea grafică a Tmax pentru 5-FU, comparativ

pe căile de administrare studiate

Din analiza timpului Tmax pentru obținerea concentrațiilor plasmatice maxime de 5-

FU se observă valori apropiate: pentru formularea administrată vaginal Tmax = 0.21 ± 0.05

h, iar pentru administrarea per os Tmax = 0.43 ± 0.77 h. Valorile obținute de noi pentru

Tmax sunt în concordanță cu valorile din alte studii de farmacocinetică a 5-FU la șobolani.

Figura XI. 8. AUC0-t pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

Din analiza ariilor AUC0-t și AUC0-oo de sub curba concentrațiilor plasmatice de 5-

FU în timp până la momentul ultimei recoltări, respectiv până la infinit ale loturilor, se

observă valori apropiate: media AUC0-t = 25.31 ± 8.16 mg/mL*h la formularea administrată

vaginal și media AUC0-t = 20.29 ± 3.71 mg/mL*h la administrarea per os, media AUC0-oo

= 29.92 ± 8.58 mg/mL*h la administrsre vaginală și media AUC0-oo = 21.58 ± 3.77

mg/mL*h la administrare per os.

0,0

1,0

2,0

3,0

ore

vaginal per os

Tmax

0

10

20

30

40

50

mg/

mL

* h

vaginal per os

AUC

41

XI.2.2. 3. Rezultatele timpului rezidual mediu (MRT) pentru 5-FU pe căile de


Tabelul XI .7. Valorile individuale şi medii ale MRT (h-1

) pentru 5-FU pe căile de


vaginal per os

1 6.12 6.16

2 6.49 6.02

3 8.90 6.61

4 7.77 6.52

5 7.01 6.02

6 7.79 6.50

media 7.35 6.31

dev std 1.01 0.27

min 6.12 6.02

max 8.90 6.61

CV 13.81 4.22

Din analiza timpului rezidual mediu MRT se observă valori apropiate: media MRT =

7.347 ± 1.014 h la formularea administrată vaginal și media MRT = 6.305 ± 0.269 h la

administrarea per os.

XI.2.2.4. Rezultatele ke pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

Tabelul XI.9. Valorile individuale şi medii ale constantei de eliminare ke (h-1

) pentru 5-FU

pe căile de administrare studiate

vaginal per os

1 0.102 0.107

2 0.092 0.106

3 0.048 0.104

4 0.077 0.106

5 0.083 0.109

6 0.076 0.111

media 0.080 0.107

dev std 0.018 0.003

min 0.05 0.10

max 0.10 0.11

CV 23.08 2.38

Din analiza constantei de eliminare ke se observă valori apropiate: media ke = 0.079 ± 0.018

h-1

la formularea administrată vaginal și media ke = 0.107 ± 0.003 h-1

la administrarea orală.

42

XI.2.2.5. Rezultatele t1/2 pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

Tabelul XI.11. Valorile individuale şi medii ale timpului de înjumătățire plasmatică t1/2

(h) pentru 5-FU pe căile de administrare studiate

vaginal per os

1 6.82 6.48

2 7.50 6.53

3 14.48 6.66

4 8.99 6.54

5 8.34 6.38

6 9.13 6.22

media 9.21 6.47

dev std 2.73 0.15

min 6.82 6.22

max 14.48 6.66

CV 29.65 2.35

Din analiza t1/2 se observă valori apropiate: media t1/2 = 9.21 ± 6.47 h la

administrarea vaginală, respectiv media t1/2 = 6.47 ± 0.15 h la administrarea orală.

XI.4. Concluzii

Între cele două căi de administrare luate în studiu, valorile Cmax obținute după

administrarea formulării pe cale vaginală sunt mai mari comparativ cu administrarea per os,

chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P = 0.099), iar între valorile timpului

Tmax nu au fost observate diferențe semnificative statistic. În mod asemănător, valorile

AUC0-t și AUC0-oo obținute după administrarea vaginală sunt mai mari comparativ

cuadministrarea orală, chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P = 0.2012,

respectiv P = 0.054),

Timpul rezidual mediu MRT la administrare vaginală, respectiv orală prezintă valori

apropiate, dar analiza statistică a relevat diferențe semnificative. Analiza statistică a ke și a

t1/2 a relevat diferențe semnificative între cele două căi de administrare luate în studiu, chiar

dacă valorile lor sunt apropiate.

Se poate considera că administrarea intravaginală a 5-FU prezintă profil farmacocinetic

similar cu administrarea pe cale orală, dar asociată cu mai puține efecte adverse sistemice.

43

CAPITOLUL XII

CONCLUZII GENERALE

Studiul realizat aduce contribuții originale la cercetările efectuate la ora actuală

privind tratamentul diferitelor procese neoplazice. Este cunoscut faptul că 5-FU este un

antimetabolit cu acțiune și la nivelul mucoaselor. Mucoasa vaginală prin specificul ei prezintă

o serie de particularității la administrare, ceea ce a determinat să realizarea unei forme

farmaceutice solide mucobioadezivă, cu reale avantaje la administrare cervico-vaginală.

În urma rezultatelor obținute în cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat se

desprind următoarele concluzii.

Au fost formulate şi preparate prin metoda comprimării directe 12 formule de comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU cu cedare modificată, pe bază de patru

polimeri C 71, C974, M 4000 şi M 100 000.

Rezultatele obţinute la analiza proprietăţilor de curgere şi compresibilitate a

amestecurilor de pulberi folosite la prepararea comprimatelor mucobioadezive vaginale, arată

faptul că formulările pe bază de C 71 prezintă valori optime ale acestor parametrii,

evidențiindu-se formulările F1 și F2.

Caracteristicile farmaceutico – tehnologice ale comprimatelor obţinute se

încadrează în limitele admise de normativele de calitate în vigoare. Formulările pe bază de

derivaţi ai acidului acrilic F1-F6, prezintă o diminuarea a rezistenţei mecanice direct

proporţională cu creşterea concentraţiei de polimer din formulă în timp ce formulările F7 –

F12, pe bază de derivaţi celulozici sunt caracterizate de o creştere a rezistenţei mecanice

direct proporţională cu creşterea polimerului în formulă.Friabilitatea s-a încadrat în limitele

impuse de normativele în vigoare, cele mai bune rezultate obţinându-se pentru formulările

F1, F2 și F8.

Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12).

Caracteristicile bioadezive ale comprimatelor apreciate prin timpul de mucoadeziune ”ex vivo” variază astfel: M 100 000 > M 4000 > C 71 > C 974, nefiind

observate variaţii foarte mari în funcţie de concentraţia polimerului.Rezultatele obținute la

determinarea unghiului de umectare arată că formulările F2,F6 și F7 prezintă cel mai puternic

caracter hidrofil şi cea mai bună adeziune la mucoase.

În etapa de optimizare s-a realizat modelarea matematică care a permis prin metode de analiză factorială găsirea formulării optime. Analiza factorială a definit clar relaţia

ce există între variabilele de intrare, interacțiunile lor (factorii de formulare) şi variabilele

dependente (răspunsuri), realizându-se în acest fel suprafaţa de răspuns a sistemului sau

planul factorial. Rezultatele au fost calculate pentru un interval de încredere de 95%, cu alte

cuvinte se admite o abatere de ±5%, faţă de rezultatele prevăzute teoretic. Valorile DPMO ce

constituie un criteriu de delimitare a spaţiului de estimare confirmă validitatea

modelului.Formula optimă este desemnată ca fiind F2.

Pentru determinarea cantitativă a concentraţiei în 5-FU a comprimatelor mucobioadezive vaginale și a evalua disponibilitatea in vitro a 5-FU din acestea, s-a

elaborarat si validat o nouă metodă de analiză cantitativă a 5-FU prin cromatografia de

lichide de inaltă performanță.Ţinând cont de valorile experimentale obţinute la studiul

compatibilităţii sistemului cromatografic, care se încadrează în limitele prevăzute de

44

standardele în vigoare, se poate afirma că sistemul este compatibil. Intervalul de concentraţii

regăsit în studiul cuantificării conţinutului de 5-fluorouracil în cele 12 formulări de

comprimate mucobioadezive vaginale este cuprins într 93,46 şi 110,28%.

Din rezultatele obținute la evaluarea disponibilității in vitro se observă influența tipului de polimer, folosit la formularea comprimatelor mucobioadezive, asupra

cedării 5-FU. Comprimatele care conțin Carbopol cedează cantităti mai mari de 5-FU (93,85-

105,73) după 10 ore, în timp ce formulările F6-F12, ce conțin Metolose, cedează o cantitate

mai mică de 5-FU, concentrațiile variind înte 57,11-82,92% din concentrația declarată, după

10 ore.Profilurile de cedare diferite ale formulărilor cu 5-FU sunt confirmate şi de rezultatele

obţinute la analiza statistică, prin determinarea factorul de diferenţă f1 și factorul de

similaritate f2.

Pentru determinarea 5- FU din probe de matrice biologice s-a elaborat și

validat o nouă metodă HPLC.Valorile experimentale obţinute la studiul compatibilităţii

sistemului cromatografic se încadrează în limitele prevăzute de standardele în vigoare, deci

,se poate afirma că sistemul este compatibil.Analiza statistică prin testul ANOVA indică

corectitudinea modelului liniar determinat existând o legătură liniară, semnficativă statistic

între concentraţia probei şi aria picului pentru un prag de certitudine de 95%. Metoda a arătat

o relație bună liniară în intervalul de concentrație cuprins între 0,0001 şi 1 ng/ml 5-fluorouracil (R2 = 0,999), cu limite de cuantificare (LOQ) la 0,14pg / ml ser uman, respectiv.

recuperările medii de diferite concentrații de 5-FU în ser au fost de 88,80%

Cercetările experimentale efectuate în studii farmacologice comparative

privind administrarea orală și vaginală de 5-FU au evidențiat faptul că administrarea pe cale

orală în doze de 6 respectiv 20 mg/kgc/zi, a determinat leucopenie cu neutropenie, anemie,

trombocitopenie, efectele cele mai puternice înregistrându-se la doza mai mare;administrarea

sub formă de comprimate vaginale a 5-FU a determinat aceleaşi efecte hematologice, dar,

mai reduse comparativ cu valorile obţinute în cazul administrării pe cale orală;administrarea

pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat creşterea AST, ALT, a fosfatazei alcaline,

a acidului uric, a ureei şi a creatininei serice, efectele fiind ameliorate în cazul administrării

pe cale intravaginală;modificările cortizolului seric şi ale parametrilor de stres oxidativ

induse de administrarea orală a 5-FU au fost îmbunătăţite în cazul administrării vaginale, în

ambele doze;

Cercetarea in vivo a farmacocineticii 5-FU a evidențiat faptul că profilul farmacocinetic al formulării administrate vaginal este caracterizat printr-o valoare mult mai

mare a Cmax comparativ cu administrarea orală, iar valorile concentrațiilor plasmatice se

mențin similare cu administrarea orală până la 24 de ore după administrare. Valorile obținute

de noi pentru concentrațiile plasmatice de 5-FU în plasmă pentru caile de administrare

studiate sunt în concordanță cu valorile din alte studii de farmacocinetică a 5-FU la șobolani,

aceste valori se găsesc în intervalul terapeutic al concentrațiilor plasmatice de la om. În mod

asemănător, valorile AUC0-t și AUC0-oo obținute după administrarea vaginală sunt mai mari

comparativ cu administrarea orală, chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P =

0.2012, respectiv P = 0.054).Timpul rezidual mediu MRT la administrare vaginală, respectiv

orală prezintă valori apropiate, dar analiza statistică a relevat diferențe semnificative. Analiza

statistică a ke și a t1/2 a relevat diferențe semnificative între cele două căi de administrare

luate în studiu, chiar dacă valorile lor sunt apropiate.Se poate considera că administrarea

intravaginală a 5-FU prezintă profil farmacocinetic similar cu administrarea pe cale orală, dar

asociată cu mai puține efecte adverse sistemice.

45

In concluzie toate rezultatele obținute în cadrul tezei de doctorat sunt originale, cu

potențială aplicație biologică și aduc o contribuție la dezvoltarea unei noi forme farmaceutice,

comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU, destinate tratamentului afecțiunilor cervico-

vaginale.

Perspective de cercetare

Cercetările din teza de doctorat pot constitui un model de elaborare a studiilor pentru dezvoltarea de noi forme farmaceutice mucobioadezive, cu alte activităţii terapeutice .

Rezultatele cercetărilor pot fi aplicate pe cale industrială, la fabricarea de

comprimate mucobioadezive vaginale, lărgind astfel gama produselor destinate administrării

în afecţiuni cervico-vaginale, cu rezultate imediate pentru pacientele cu displazii uşoare care

vor beneficia de implementarea acestei noi forme farmaceutice în conduita terapeutică.

Noile preparate formulate , comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU, vor fi propuse pentru brevetare pe baza originalităţii formulelor în corelaţie cu eficienţa

terapeutică.

46

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Ahuja A, Khar RK, Ali J. Mucoadhesive drug delivery systems. Drug Dev Ind Pharm.

1997;23:489–515.

2. Bindu M. Boddupalli, Zulkar N. K. Mohammed, Ravinder A. Nath,David Banji, Mucoadhesive

drug delivery system: An overview,J Adv Pharm Technol Res. 2010 Oct-Dec; 1(4): 381–387.

3. Chickering DE, III, Mathiowitz E. Fundamentals of bioadhesion. In: Lehr CM, editor. Bioadhesive

drug delivery systems-Fundamentals, Novel Approaches and Development. New York: Marcel

Dekker; 1999:1–85.

4. Popovici I., Lupuleasa D., Tehnologie Farmaceutică, vol. 3., Ed. Polirom, Iași, 2009: 30-73

5. Gavin P. A., Thomas P. L., David S.J.: Mucoadhesive polymeric platforms for controlled drug

delivery. Eur. Pharm. Biopharm., 2009; 71: 505 – 518.

6. Accili D.,Menghi G.,Bonacucina G., et al.: Mucoadhesion dependence of pharmaceutical polymers

on mucosa characteristics, Eur. Pharm. Biopharm. 2004; 57: 133 – 143.

7. *** http://www.metolose.jp/e/industrial/application.shtml.

8. .***Pharmaceutical Bulletin 30, Lubrizol Pharmaceutical Polymers for Controlled Release Tablets

and Capsules, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.

9. ***Pharmaceutical Bulletin 31, Formulating Controlled Release Tablets and Capsules with

Carbopol®

Polymers, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.

10. ***Pharmaceutical Bulletin 32, Application of Carbopol® 71G NF Polymer in Controlled Release

Tablets, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.

11. Tatavarti, A.S., Mehta, K.A., Augsburger, L.L., Hoag, S.W., Influence of Methacrylic and Acrylic

Acid Polymers on the Release Performance of Weakly Basic Drugs from Sustained Release

Hydrophilic Matrices, J Pharm. Sci., 2004:93(9):2319-2331.

12. *** Noveon Company Technical Literature, 2005.

13. *** Martindale – The Complete Drug Reference, 33rd

Edition 2002 :1499.

14. Nae H N, Reichert W W: “Rheological Properties of Lightly Cross-linked Carboxy Copolymers in

Aqueous Solutions,” Rheologica Acta, 1992; 31,(4) : 351-360.

15. Sandri G., Rossi S., Ferrari F., Bonferoni M. C., Caramella C. M.: Strategies to improve systemic

and local availability of drugs administrated via vaginal route, cap. 22 in: Touitou E., Barry B. W.:

Enhancement in drug delivery, CRC Press, Boca Raton, Fl. USA, 2007:441 – 470;

16. Cojocaru, Ileana; Braha, Steriana, Tehnologie farmaceutică. Forme farmaceutice omogene, Ed.

„Gr.T.Popa”, Iaşi, 2003

17. Cojocaru, Ileana, Forme farmaceutice vaginale în Popovici, Iuliana, Lupuleasa, D., Tehnologie

farmaceutică, vol. 2, ed. a I-a, Polirom Iaşi, 2008: 976-1013

18. Leucuţa S.E., Tehnologie farmaceutică industrială, Ed. Dacia, Cluj Napoca, 2001:610

19. Corbo, D.C.; Liu, J.C.; Chien, Y.W., Characterization of the Barrier Properties of Mucosal

Membranes. Journal of Farmaceutical Sciences 1990;79(3): 202-206

20. Diamantis A, Magiorkinis E, Androutsos G. Different strokes: Pap-test and Babes method are not

one and the same. Diagn Cytopathol. 2010; 38(11):857-9

21. Diamantis A, Magiorkinis E, Androutsos G. Different strokes: Pap-test and Babes method are not

one and the same. Diagn Cytopathol. 2010; 38(11):857-9

22. Cox J. T.: Human papilloma virus testing in primary cervical screening and abnormal

Papanicolaou management. Obstr. Gyncol. Surv. 2006; 61(1), 15 – 25.

23. Gammon D. C., Reed K. A., Patel M., Balaji K. C., Intraurethral fluorouracil and lidocaine for

intraurethral condiloma acuminata. Amer. J. Health Syst. Pharm., 2008; 65(19): 1232 – 1236.

24. Syed T. A., Qureshi A., Seyed A. H., Shahida M. A.: Management of intravaginal warts in women

with 5-fluorouracil (1%) in vaginal hydrophilic gel: a placebo – controlled double – bind study.

Int. J. STD AIDS, 2000; 11:371 – 374.

25. Gross K., Kircil L., Kricorian G.: 5% 5-fluorouracil cream for the treatment of small superficial

basal cell carcinoma: efficacy, tolerability, cosmetic outcome and patient satisfaction. Dermatol.

Surg., 2007; 33: 433 – 440.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Boddupalli%20BM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mohammed%20ZN%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nath%20RA%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Banji%20D%5Bauth%5D

http://www.metolose.jp/e/industrial/application.shtml

47

26. Arias J. L., Lopez-Voita M., Degado A. V., Riuz M. A.: Iron – ethylcelullose (core shell)

nanoplatform loaded with 5-fluorouracil for cancer targeting. Colloid and Surface B:

Biointerfaces, 2010;77:111-116.

27. Wang D. S., Li J. G., Li H. P., Tang F. Q.: Preparation and drug releasing property of magnetic

chitosan – 5- fluorouracil nano-particles. Trans. Nonferrous Met. Soc. China, 2009; 19:1232–1236.

28. Fang Y., Qin X., Zhou D., et al. In vitro cytotoxicity, in vivo biodistribution and antitumor activity

of HPMA copolymer – 5-fluorouracil conjugate. Eur. Pharm. Biopharm., 2008;70:770 – 776.

29. Paolino D., Cosco D., Muzzalupo R., et al. Innovative bola – surfactant niosomes as topical

delivery systems of 5-fluorouracil for the treatment of skin cancer. Int. J. Pharm., 2008; 353:233 –

242.

30. Zhu L. Z., Ma J. W., Jia N. Q.,et al.: Chitosan coated magnetic nanoparticles as carrier of 5-

fluorouracil: preparation, characterization and cytotoxicity studies. J. Coll. Surf. B.: Biointerfaces,

2009; 61(1):1 – 6.

31. Huang J., Wang J. W., Gong T., Zhang Z. R.: Synthesis and characterization of insulin - 5-

fluorouracil conjugate, enabling insulin as a multi – drug carrier via dendritic approach. Chin.

Chem. Lett., 2007; 18: 244 – 250.

32. *** MODDE 10.1, Software for Design of Experiments and Optimization, User’s Guide and

Tutorial, Umetrics Academy, Umea, 2012.

33. L.V. Boiculese, G. Dimitriu, Mihaela Moscalu, Biostatistica, Ed. PIM, Iaşi, 2007.

34. Ana Cristina de Mattos, Najeh Maissar Khalil, Rubiana Mara Mainardes

Development and

validation of an HPLC method for the determination of fluorouracil in polymeric nanoparticles

Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences 2013vol. 49, n. 1:251-58

35. ***Ghid ICH, -Validation of Analitycal Methods, Definition and terminology ICH Q2A ,2005

36. ***Ghid ICH-Validation of Analitycal Methods,Procedures and Methodology ICH Q2B,2005

37. ***Ghid ICH -Validation of Analitycal Procedures and Methodology Q2(R1)

38. L. Roman, M. Bojita, R. Săndulescu, D. L. Muntean, Validarea Metodelor de Analiza si Control-

bazele teoretice si practice, Editura Medicala, 2007

39. Gavrilovici C. Introducere în bioetică. Iaşi: Junimea, 2007.

40. ***AVMA Guidelines on Euthanasia (Formerly Report of the AVMA Panel on Euthanasia), 2007,

6-7.

41. ***Protocole d’amendement à la convention européenne sur la protection des animaux vertébrés

utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques. Strasbourg, 22.06.1998.

42. González Sánchez JL, Flores Murrieta G, Chávez Brambila J et al. Topical 5-fluorouracil for

treatment of vaginal intraepithelial neoplasms. Ginecol Obstet Mex 2002; 70: 244-247.

43. Anderson JH, Kerr DJ, Setanoians A, Cooke TG, McArdle CS A pharmacokinetic comparison of

intravenous versus intra-arterial folinic acid. Br J Cancer. 1992;65: 133–135

44. Takahashi T, Kohno K, Yamaguchi T, Narisawa T Preoperative use of 5-FUorouracil suppository

for carcinoma of rectum. Am J Surg.1982; 143: 183–185.

45. Takahashi T, Mizusawa H, Kato T, Yamaguchi T. Preoperative irradiation and 5-fluorouracil

suppository for carcinoma of the rectume. Am J surg. 1988;156: 58–62.

46. Galandiuk S, Wrightson W, Marr L, Myers S, LaRocca RV Suppository delivery of 5-fluorouracil

in rectal cancer. Ann surg Oncol. 1996;3(3): 270–276.

47. Nishioka B, Watanabe S, Fijita Y, Kojima O, Morisawa K, et al Clinical studies of intrarectal

administration of 5-FU emulsion as an adjunct to surgical treatment for rectal cancer. Jpn J Surg.

1980;10(2): 110–114

48. Watanabe S, Nishioka B, Fujita Y, Kojima O, Morisawa K, et al. Experimental studies of

intrarectal administration of emulsified 5-FU as an adjuvant to the surgical treatment of

recta,cancer. Jpn J Surg. 1980;10(2): 17–21

49. Rougler P, Nordlinger B. Large scale trial for adjuvant treatment in high risk resected colorectal

cancers. Ann Oncol. 1993;4: 821–828.

50. Rahangdale L1, Lippmann QK2, Garcia K3, Budwit D4, Smith JS5, van Le L2. Topical 5-

fluorouracil for treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2: a randomized controlled trial. Am

J Obstet Gynecol. 2014;210(4):314.e1-8.

48

Lista articolelor publicate

Articole in extenso în cadrul tezei de doctorat

1. Laura Palade, Iuliana Popovici, Gratiela Popa, Ileana Cojocaru, Elaboration and

validation of an HPLC method for the quantitative assay of 5-fluorouracil, Farmacia,

2013; Vol.61:526-532 http://www.revistafarmacia.ro/201303/art.11.palade%20526-

532.pdf IF=0,578

2. Laura Palade, Iuliana Popovici, Ileana Cojocaru, In vitro evaluation of 5-fluorouracil

dissolution profiles from vaginal bioadhesive tablets, Farmacia, 2013, Vol.61, 4,640-

647 http://www.revistafarmacia.ro/201304/art.03.palade%20640-647.pdf IF=0,578

3. Ileana Cojocaru , Laura Palade, Iuliana Popovici , Gabriela Georgescu, Magdalena

Bîrsan: Research on the development of bioadhesive vaginal tablets containing 5-

fluorouracil Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi., 2013 Ian-March;117(1):263-268

4. I. Cojocaru, L. Ochiuz, G. Popa, I. Popovici, M. Voitcu, L. Palade, Development and

characterisation of vaginal bioadhesive tablets with 5-Fluorouracil, 8th World Meeting

on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology,

Istambul,Turkey, 2012

5. Ileana Cojocaru Lăcramioara Ochiuz Gratiela Popa, Laura Palade, Mihaela Moscalu,

Iuliana Popovici: Study on the influence of variables on flow and compressibility

properties of powders for development of bioadhesive vaginal tablets with 5-

Fluorouracil, 38th

Annual Meeting and Exposition of the Controlled Release

Society,Maryland, USA, 2011.

6. Laura Mihaela Palade, Lăcrămioara Ochiuz, Ileana Cojocaru, Iuliana

Popovici,:Formularea si prepararea unor comprimate bioadezive pe baza de polimeri

hidrofili cu 5-fluorouracil, 50 de ani de Invatamant Universitar Farmaceutic la Iasi,

Ed. UMF Gr. T. Popa, Iaşi,2011 p. 138-139,ISBN 978-606-544-073-9

7. Laura Mihaela Palade,Ileana Cornelia Cojocaru,Lacramioara Ochiuz A.

Ionescu,Iuliana Popovici Studii privind dezvoltarea unor comprimate vaginale cu

cedare modificata cu 5-fluorouracil- CNFR 2010 13-16 octombrie ,Tg. Mures

Romania.

Alte lucrări in extenso

1. Magdalena Bîrsan, Iuliana Popovici , Laura Palade , Ileana Cojocaru: Research studies on the quality of bio-mucoadhesive tablets containing miconazole nitrate Rev

Med Chir Soc Med Nat Iasi., 2013 Ian-March;117(1):257-262.

2. Ileana Cojocaru, Gabriela Georgescu, Laura Palade, Factors influencing the content of pharmacist - patient communication related to contraceptive product, CD-ROM -

http://www.revistafarmacia.ro/201303/art.11.palade%20526-532.pdf



http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/41_f_42_cojocaru_ileana_farm_aco_g_263-267.pdf

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/41_f_42_cojocaru_ileana_farm_aco_g_263-267.pdf

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/40_f_41_birsan_m_farm_ao_257-262.pdf



49

Proceedings – 11th

Panhellenic Pharmaceutical Congress, Athens, march, 2003,

European Journal of Drug Methabolism and Pharmacokinetics, 2003,vol. 28,

3. Ileana Cojocaru, Iolanda Elena Blidaru, Daniela Cristina Dimitriu, Laura Palade

Supozitoare vaginale cu clotrimazol - Vol. “Chimioterapia antimicrobiană

antifungică şi antivirală actuală”, Editor M. Nechifor, Cluj Napoca, 2003, ISBN 973-

686-482-2

4. Ileana Cojocaru, Daniela Cristina Dimitriu, Mariana Voitcu, Iolanda Blidaru, Laura

Palade, Criterii în alegerea metodelor contraceptive,Rev. Medico-Chirurgicală, Iaşi,

Vol. 106, nr. 3, supliment, pag. 198-202, 2002.

Membru în proiecte de cercetare

Contract nr. 18775/2010, titlul proiectului Cercetări privind dezvoltarea unei forme

farmaceutice tip comprimat bioadeziv vaginal cu 5-florouracil (Director de proiect:

Cojocaru Ileana, Membri: Lăcrămioara Ochiuz, Gratiela Popa, Palade Laura

Mihaela);

Date post:	28-Jan-2017
Category:	Documents
Upload:	nguyenngoc
View:	249 times
Download:	2 times

forme farmaceutice topice aplicate în afecţiuni cervico-vaginale

Documents