Endotoxine bacteriene conform FE 6
1. GeneralitiExist dou mari categorii de toxine bacteriene:-
Exotoxinele sunt secretate n exterior de ctregermeniGram pozitivi i
difuzeaz norganism; servesc la preparareavaccinurilorsub form
deanatoxine(toxinecare i-au pierdut toxicitatea, dar care i-au
pstrat proprietile imunogene).Exemple: neurotoxinele botulinic
(produs de Clostridium botulinum), tetanic (tetanospasmina- produs
de Clostridium tetani), toxinele produse de Corynebacterium
diphtheriae;- Endotoxinele sunt produse n interiorul
unorbacteriiGram negative i sunt eliberate n cursul distrugerii
acestora. Sunt practic componente structurale ale peretelui celular
al bacteriilor din care provin (ex.: Escherichia coli, Klebsiella,
Shigella, Salmonella) i sunt din punct de vedere chimic
lipopolizaharide i lipooligozaharide. Odat eliberate n organism,
aceste endotoxine vin n contact cu celulele sistemului imunitar,
provocnd eliberarea IL-1 i TNF-, care vor genera rspunsul
inflamator. Ca urmare a activrii limfocitelor B i a diferenierii
lor la plasmocite, se vor forma anticorpi anti-toxin. ns, n cazul n
care cantitatea de endotoxine eliberat depaete capacitatea de
aprare a organismului, se produce ocul endotoxic, caracterizat prin
hipotensiune, tahicardie, acidoz metabolic, coagulare intravascular
diseminat, cu evoluie grav.Este foarte important, aadar, testarea
prezenei toxinelor n preparatele farmaceutice cu administrare
parenteral (ex.: injectabile, perfuzabile) sau n preparate cu
administrare local, dar care pot fi absorbite n circulaia sistemic
(ex.: colire, unguente oftalmice), dar nu numai, deoarece
endotoxinele bacteriene nu sunt distruse de enzimele digestive.
2. Specificaiile FE6FE6 dedic un subcapitol entoxinelor
bacteriene, i anume: 2.6.14 Bacterial endotoxins (pg.
182-189).Testul pentru endotoxine bacteriene este utilizat n
vederea detectrii sau cuantificrii endotoxinelor provenite de la
bacterii gram-negative, utiliznd lizat amoebocitic din Limulus
polyphemus sau Tachypleus tridentatus (specii de crabi-potcoav sau
crevei).FE6 specific 6 metode de lucru:Capitolul descrie urmtoarele
ase metode: Metoda A. Metoda gel-cheag (Gel clot method): test
limit Metoda B. Metoda gel-cheag: test semi-cantitativ Metoda C.
Metoda turbidimetric cinetic (Turbidimetric kinetic method) Metoda
D. Metoda cromogen cinetic (Chromogenic kinetic method) Metoda E.
Metoda punctului final Cromogen (Chromogenic end-point method)
Metoda F. Metoda punctului final Turbidimetric (Turbidimetric
end-point method)Pentru a efectua testul se poate folosi oricare
din cele ase metode. n cazul n care exist ndoieli sau dezacorduri,
decizia final se va lua n baza metodei A, cu excepia situaiilor n
care n monografii se indic o alt metod. Reactivi i aparaturToat
sticlria i vasele termorezistente utilizate pentru acest test
trebuie depirogenizate ntr-un sterilizator cu aer cald uscat,
folosind un proces validat, minim, 30 minute la 250C. n cazul n
care se utilizeaz vase din plastic, cum ar fi plcile pentru
microtitrare, vrfurile de pipete, acestea nu trebuie s conin
endotoxine detectabile i alte materiale ce pot interfera cu testul
efectuat.
Prepararea soluiei stoc standard de endotoxinSoluia stoc
standard de endotoxin este preparat dintr-un standard de referin
care a fost verificat n conformitate cu Standardul Internaional, de
exemplu standardul BRP (biological reference preparations) pentru
endotoxine. Cantitatea de endotoxine prezent n prob este exprimat n
Uniti internaionale (UI). Echivalena n Uniti Internaionale a
Standardului Internaional este stabilit de Organizaia Mondial a
Sntii. NOT: O Unitate Internaional (UI) de endotoxin este egal cu o
Unitate de Endotoxin (U.E.).
Prepararea soluiilor standard de endotoxinDup agitarea energic a
soluiei stoc standard de endotoxin, se prepar diluiile seriale
corespunztoare acestei soluii, folosind ap de calitate
corespunzatoare testului pentru endotoxine bacteriene (ap pentru
TEB). Soluiile trebuie folosite n cel mai scurt timp posibil,
pentru a evita pierderea activitii lor prin adsorbie.
Prepararea soluiilor-test FE6 recomand prepararea soluiilor-test
prin dizolvarea sau diluarea substanelor active sau a produselor
medicinale, folosind ap pentru TEB. Unele substane sau compoziii
pot fi mai bine dizolvate sau diluate n alte soluii apoase. Dac
este necesar, se va ajusta pH-ul soluiei-test (sau diluiei
acesteia) astfel nct pH-ul amestecului de lizat i de soluie-test s
fie situat n intervalul de pH specificat de productorul lizatului.
Valorile pH-ului sunt de obicei cuprinse ntre 6.0 i 8.0. pH-ul
poate fi ajustat prin folosirea unui acid, a unei baze sau a a unui
tampon potrivit, dup cum este recomandat de productorul lizatului.
Acizii i bazele pot fi preparate din substane concentrate sau
solide i ap pentru TEB n recipiente fr endotoxine detectabile.
Amestecurile tampon trebuie s fie lipsite de endotoxine detectabile
i alte substane care pot da interferene. Determinarea Diluiei
maxime valide Diluia maxim admis (DMA) este diluia maxim admis a
unei probe, la care poate fi determinat limita de endotoxin.
Determinai DMA folosind urmtoarea expresie: DMA = , unde: Limita de
endotoxin= limita de endotoxin pentru substanele active
administrate parenteral, definit n baza dozei; este egal cu ,
unde:K = valoarea maxim admis de endotoxin per kilogram corp pentru
o perioad de o or, M = doza maxim recomandat a produsului testat
per kilogram corp pentru o perioad de o or. n monografii limita de
endotoxin pentru substanele active administrate parenteral este
exprimat n UI/ml, UI/mg, UI/Unitate de activitate biologic,
etc.
Concentraia soluiei-test- se exprima:- n mg/ml dac limita de
endotoxin este exprimat n uniti de mas (UI/mg). - n Uniti/ml dac
limita de endotoxin este exprimat n uniti de activitate biologic
(UI/Unitate),- n ml/ml dac limita de endotoxin este exprimat n
uniti de volum (UI/ml). = sensibilitatea lizatului n tehnica
gel-cheag (UI/ml) sau cel mai jos punct, folosit n curbele standard
ale tehnicilor turbidimetric sau cromogen.
TEHNICA GEL- CHEAG (METODELE A I B) Tehnica gel-cheag permite
detectarea sau cuantificarea endotoxinelor i este bazat pe
coagularea lizatului n prezena endotoxinelor. Concentraia de
endotoxine, necesar pentru a produce coagularea lizatului n condiii
standard, se numete sensibilitatea lizatului i se noteaz cu lambda
(). Pentru a asigura att precizia, ct i validarea testului, FE6
recomand testarea sensibilitii lizatului, nscrise pe specificaiile
produsului, i testarea prezenei factorilor de interferen dup cum
este descris mai jos.Teste preliminareConfirmarea sensibilitii
lizatului nainte de a folosi soluia de lizat pentru testare,
trebuie verificat sensibilitatea , exprimat n UI/ml, n 4 replicate.
Confirmarea sensibilitii lizatului se efectuaz dup deschiderea unui
lot nou de lizat sau la oricare modificare a condiiilor
experimentale, ce pot influenta rezultatele testului. Se prepar
soluiile standard de cel puin patru concentraii, corespunzatoare 2
, , 0.5 i 0.25 , prin diluarea soluiei stoc standard de endotoxin
cu ap pentru TEB. Se amestec n proporie de 1:1 (v/v) soluie de
lizat cu fiecare soluie standard (spre exemplu, se pot amesteca
alicoturi de cte 0,1 mL). Se va incuba apoi amestecul de reacie o
perioad constant conform recomandrilor productorului lizatului (de
obicei la 37 1C timp de 60 2 min). Se testeaz integritatea gelului
format astfel: se ia pe rnd fiecare vas de reacie (pot fi chiar
tuburi Eppendorf) direct din incubator i se ntoarce cu o micare
lent la aproximativ 180. Dac s-a format un gel ferm, care rmne n
loc la ntoarcerea tubului, se consider rezultatul pozitiv. Dac nu
se formeaz un gel intact, rezultatul este negativ. Testul nu este
considerat valabil dect dac cea mai joas concentraie a soluiilor
standard d un rezultat negativ n toate testele replicate. Punctul
final al testului este reprezentat de ultimul rezultat pozitiv n
seriile cu concentraii descresctoare de endotoxin. Se calculeaz
apoi valoarea medie a logaritmilor punctului final de concentraii,
apoi antilogaritmul valorii medii, folosind urmtoarea expresie:
Media geometric a concentraiei punctului final = , unde: e = suma
logaritmilor concentraiilor corespunztoare punctului final din
diluiile folosite, f = numrul de replicate. Media geometric a
concentraiei punctului final reprezint sensibilitatea msurat a
soluiei de lizat (UI/ml). Dac aceasta nu este mai mic de 0.5 i nu
mai mare de 2, sensibilitatea nscris n specificaiile produsului se
consider confirmat i soluia este folosit n testele efectuate cu
acest lizat.
Testul la factori de interferenSe prepar soluiile A, B, C i D
conform tabelului de mai jos i se folosesc soluii-test la o diluie
mai mic dect DMA, care nu conin endotoxine detectabile. Media
geometric a concentraiilor punctului final al soluiilor B i C este
determinat folosind expresia descris mai sus, n cadrul
subpunctulului Confirmarea sensibilitii lizatului. Testul la
factori de interferen este repetat la oricare modificare a
condiiilor experimentale, care poate influena rezultatul testului.
Testul nu este valabil dect dac toate replicatele soluiilor A i D
dau rezultat negativ, iar soluia C trebuie s confirme valoarea
nscris pe eticheta produsului n privina sensibilitii lizatului. Se
va considera c soluia-test nu conine factori de interferen n
condiiile experimentale folosite dac rezultatele obinute pentru
soluia B sunt cuprinse intre 0.5 i 2 . n caz contrar, soluia
interfereaz cu testul. Media geometric a concentraiilor punctului
final al soluiilor B i C este determinat folosind expresia descris
mai sus, n cadrul subpunctulului Confirmarea sensibilitii
lizatului. Testul la factori de interferen este repetat la oricare
modificare a condiiilor experimentale, care poate influena
rezultatul testului. Testul nu este valabil dect dac toate
replicatele soluiilor A i D dau rezultat negativ, iar soluia C
trebuie s confirme valoarea nscris pe eticheta produsului n privina
sensibilitii lizatului. Se va considera c soluia-test nu conine
factori de interferen n condiiile experimentale folosite dac
rezultatele obinute pentru soluia B sunt cuprinse ntre 0.5 i 2 . n
caz contrar, soluia interfereaz cu testul. SoluieConcentraia
deendotoxin/Soluia la care seadaug endotoxinaSolventFactorul
dediluie
Concentraia iniialde endotoxin
Numrul dereplicate
A0 / Soluie-test diluat---4
B2 / Soluie-test diluatSoluie-test12 4
21 4
40.5 4
80.25 4
C2 / Ap pentru TEBAp pentruTEB12 2
21 2
40.5 2
80.25 2
D0 / Ap pentru TEB---2
Soluia A= soluie a preparatului examinat, fr endotoxine
detectabile. Soluia B= soluie-test pentru interferene. Soluia C=
control pentru sensibilitatea lizatului. Soluia D= control negativ
(Ap pentru TEB). n cazul n care proba analizat interfereaz cu
testul la o diluie mai mic de DMA, trebuie repetat testul la
factori de interferen, folosind o diluie mai mare, care nu depete
DMA. Folosirea unui lizat cu o sensibilitate superioar permite o
diluie mai mare a probei analizate i aceasta poate contribui la
eliminarea interferenei. Interferena poate fi eliminat prin
tratarea adecvat a soluiei, cum ar fi filtrarea, neutralizarea,
dializarea sau tratament la cald. Pentru a stabili dac tratamentul
selectat elimin efectiv interferena fr eliminarea eventualelor
endotoxine, repetai testul la factori de interferen folosind proba
analizat, la care s-a adugat endotoxin standard i care apoi a fost
supus tratamentului selectat.
TESTUL LIMIT (METODA A) Tehnica de lucru Se prepara soluiile A,
B, C i D dup cum este artat n tabelul de mai jos, i efectuai testul
cu aceste soluii, urmnd procedura descris n cadrul subpunctulului
Confirmarea sensibilitii lizatului.
SoluieConcentraia de endotoxin/ Soluia la care se adaug
endotoxinaNumrul de replicate
A0/ soluie-test diluat2
B2/ soluie-test diluat2
C2/Ap pentru TEB2
D0/Ap pentru TEB2
Se prepara soluiile A i B (controale pozitive ale produsului)
folosind o diluie de concentratie mai mica sau cel mult egala cu
DMA i se analizeaza conform procedurii descrise n cadrul
subpunctului Testul la factori de interferen. Soluiile B i C
(controale pozitive) conin standardul de endotoxin la o concentraie
corespunzatoare dublului valorii sensibilitii lizatului. Soluia D
(control negativ) contine ap pentru TEB. Interpretarea
rezultatelorTestul este concludent doar n cazul n care ambele
replicate ale celor dou soluii de control pozitiv B i C dau
rezultat pozitiv, iar soluia D da rezultat negativ. Proba analizata
ndeplinete condiiile testului atunci cnd pentru ambele replicate
ale soluiei A rezultatul este negativ. Atunci cand rezultatul
pentru ambele replicate ale soluiei A este pozitiv: - daca proba
analizata este diluat la DMA, atunci aceasta nu satisface condiiile
testului, - daca proba analizata este diluat la o diluie mai mic
dect DMA, testul se va repeta la o alta diluie care sa nu
depaseasca DMA.Dac pentru un replicat al soluiei A rezultatul este
pozitiv, iar pentru altele rezultatul este negativ, se va repeta
testul. Compoziia examinat ndeplinete condiiile testului atunci cnd
la repetarea testului pentru ambele replicate ale soluiei A
rezultatul este negativ
TESTUL SEMI-CANTITATIV (METODA B) Tehnica de lucru Testul
cuantific endotoxinele bacteriene n soluia-test prin titrare pn la
un punct final. Se prepara soluiile A. B, C i D dup cum este artat
n tabelul de mai jos i se analizeaza aceste soluii conform
procedurii descrise n cadrul subpunctului Confirmarea sensibilitii
lizatului. Calculul i interpretarea rezultatelorTestul este valabil
doar atunci cnd sunt ndeplinite urmtoarele trei condiii: (a) ambele
replicate ale soluiei D (control negativ) sunt negative, (b) ambele
replicate ale soluiei B (control pozitiv) sunt pozitive, (c) media
geometric a concentraiei punctului final al soluiei C se ncadreaz n
intervalul 0.5 - 2.
SolutieConcentraia deendotoxin/Soluia la care seadaug
endotoxinaSolventFactorul dediluie
Concentraia iniialde endotoxin
Numrul dereplicate
A0 / Solutie-test Ap pentruTEB1-2
2-2
4-2
8-2
B2 / Soluie-test -12 2
C2 / Ap pentru TEBAp pentruTEB12 2
21 2
40.5 2
80.25 2
D0 / Ap pentru TEB---2
Soluia A = soluie-test la o diluie care nu depete DMA, cu care a
fost efectuat testul la factori de interferen. Diluia consecutiv a
soluiei-test nu trebuie s depeasc DMA. Folosii ap pentru TEB pentru
a obine diluii de 1,1/2,1/4 i 1/8, corespunztoare diluiei cu care a
fost efectuat testul la factori de interferen. La nevoie pot fi
folosite alte diluii. Soluia B = soluie A, coninnd endotoxin
standard la o concentraie de 2 (control pozitiv), Soluia C = dou
solutii coninnd endotoxin standard la concentraii de 2, , 0.5 i
0.25 n apa pentru TEB. Soluia D = ap pentru TEB (control negativ).
Pentru a determina concentraia de endotoxin n soluia A, se
calculeaz concentraia corespunzatoare punctului final pentru
fiecare replicat, respectiv fiecare diluie prin nmulirea factorului
de diluie aferent punctului final cu . Concentraia de endotoxin n
soluia-test este media geometric a concentraiei punctului final a
replicatelor (vezi subpunctul Confirmarea sensibilitii lizatului).
Dac testul este efectuat cu o soluie-test diluat, se calculeaz
concentraia de endotoxin n soluia original prin nmulirea
rezultatului cu factorul de diluie. Dac niciuna din diluiile
soluiei-test nu este pozitiv ntr-un test valid, se consider
concentraia de endotoxin mai mic de (sau, dac a fost testat o prob
diluat, ca fiind mai mic de x cel mai mic factor de diluie al
probei). Dac toate diluiile sunt pozitive, concentraia de endotoxin
este considerat a fi egal sau mai mare dect cel mai mare factor de
diluie nmulit cu (ex. n tabelul de mai sus, factorul de diluie
iniial x 8 x ). Prepararea corespunde cerinelor testului dac
concentraia de endotoxin este mai mic de cea specificat n
monografia individual. TEHNICILE FOTOMETRICE (METODELE C, D, E I F)
TEHNICA TURBIDIMETRIC (METODELE C i F) Aceast tehnic reprezint un
test fotometric de msurare a creterii intensitii opalescenei. n
funcie de principiile metodelor ce stau la baza testelor efectuate,
tehnica turbidimetric poate presupune un test al punctului final
turbidimetric sau un test turbidimetric cinetic. Testul punctului
final turbidimetric (Metoda F) este bazat pe relaia de dependen
cantitativ dintre concentraia de endotoxin i opalescena (masurat ca
absorban sau transmitan) amestecului de reacie la fritul perioadei
de incubare. Testul turbidimetric cinetic (Metoda C) este o metod
de msurare fie a timpului necesar pentru ca amestecul de reacie s
ating o absorban predeterminat, fie a vitezei de apariie a
opalescenei. Testul este efectuat la temperatura de incubare
recomandat de productorul lizatului (de obicei 37 1C). TEHNICA
CROMOGEN (METODELE D I E)Aceast tehnic este folosit pentru a msura
cantitatea de cromofor eliberat dintr-un peptid cromogenic n timpul
reaciei endotoxinelor cu lizatul. n funcie de principiile aplicate
n test, aceast tehnic este clasificat ca fiind un test al punctului
final cromogen sau test cromogen cinetic. Testul punctului final
cromogen (Metoda E) este bazat pe dependena cantitativ dintre
concentraia de endotoxin i cantitatea de cromofor, eliberat la
fritul perioadei de incubare. Testul cromogen cinetic (Metoda D)
msoar fie timpul necesar pentru ca amestecul de reacie s ating o
absorban predeterminat, fie viteza de apariie a culorii. Testul
este efectuat la temperatura de incubare recomandat de productorul
lizatului (de obicei 37 1C). Teste preliminaren cazul testelor
turbidimetric i cromogen, se efectueaz teste preliminare pentru
asigurarea realizrii criteriilor pentru curba standard i a lipsei
interferenelor dintre soluia-test i proba analizat. Validarea
metodei de testare este necesar la oricare modificare a condiiilor
experimentale ce poate influena rezultatul testului. Asigurarea
criteriilor curbei standard FE6 recomand prepararea a cel puin trei
concentraii de endotoxine, folosind soluia standard de endotoxin,
pentru realizarea curbei standard. Se efectueaz testul,
folosindu-se cel puin trei replicate din fiecare soluie standard de
endotoxin, dup cum este recomandat de productorul lizatului
(proporii volumetrice, timp de incubare, condiii de temperatur, pH
etc.). Dac n metodele cinetice intervalul dorit este mai mare de 2
log, este necesar includerea unor concentraii standard suplimentare
pentru ca fiecare unitate logaritmic din intervalul de valori
corespunztor s aib corespondent n valorile ncadrate n curba
standard. Valoarea absolut a coeficientului de corelaie | r |
trebuie s fie mai mare sau egal cu 0.980, pentru intervalul de
concentraii de endotoxine, indicat de productorul lizatului. Testul
la factori de interferenSe va selecta o concentraie de endotoxin
din mijlocul curbei standard (sau din apropierea valorii
corespunztoare). Se prepar soluiile A, B, C i D dup cum este artat
n tabelul de mai jos. Testul trebuie s conin cel puin dou replicate
ale acestor soluii dup procedeul recomandat de productorul
lizatului (volumul soluiei-test i soluiei de lizat, raportul
volumelor de soluie-test i soluie de lizat, timpul de incubare,
etc.). SoluiaConcentraia de endotoxin Soluia la care se adaug
endotoxinaNumrul de replicate
A0Soluia-testNu mai puin de 2
BConcentraia corespunztoare mijlocului curbei
standardSoluia-testNu mai puin de 2
CCel puin 3 concentraii (dintre care cea mai mic este de dorit s
fie egal cu )Ap pentru TEBNu mai puin de 2 (pentru fiecare
concentraie)
D0Ap pentru TEBNu mai puin de 2
Soluia A = soluie-test din proba analizat, ce poate fi diluat
(fr a depi DMA). Soluia B = soluie ce conine proba analizat, la
aceeai diluie ca soluia A, creia i se adaug o concentraie de
endotoxin echivalent valorii corespunztoare mijlocului curbei
standard.Soluia C = soluie standard de endotoxin n concentraii
folosite la validarea metodei, dup cum este descris n cadrul
subpunctului Asigurarea criteriilor curbei standard (control
pozitiv). Soluia D = ap pentru TEB (control negativ). Se calculeaz
apoi rata medie de recuperare a endotoxinei adugate, prin scderea
concentraiei medii de endotoxin din soluia-test (dac exist) din cea
a soluiei ce conine endotoxin adugat. Soluia-test este considerat a
nu conine factori de interferen dac, n condiiile testului,
concentraia msurat a endotoxinei adugate (valoarea rezultat n urma
calculului de mai sus) este de 50-200% din concentraia cunoscut de
endotoxin adugat, dup extragerea concentraiei de endotoxine
detectate n soluia-test. Dac rata de recuperare a endotoxinei este
n afara intervalului specificat mai sus, factorii de interferen
trebuie nlturai dup cum este descris n cadrul subpunctului Testul
la factori de interferen detaliat pentru TEHNICA GEL- CHEAG .
Eficiena tratamentului este verificat prin repetarea testului la
factori de interferen.
TESTAREA Procedura Se va urma procedura descris n cadrul
subpunctului Testul la factori de interferen detaliat pentru
TEHNICA GEL-CHEAG. Calculul Se calculeaz concentraia de endotoxin a
fiecrui replicat al soluiei A, folosind curba standard generat de
rezultatele obinute pentru soluia C (control pozitiv). Testul este
valid doar dac sunt ndeplinite urmtoarele trei condiii: (a)
rezultatul obinut cu soluia D (control negativ) nu depete limita
valorii de referin, specificat n descrierea lizatului folosit.(b)
rezultatele obinute pentru soluia C corespund cerinelor de
validare, definite n cadrul subpunctului Asigurarea criteriilor
curbei standard. (c) rata de recuperare a endotoxinei, calculat ca
diferena dintre concentraia de endotoxin n soluia B i concentraia
de endotoxin n soluia A, se ncadreaz n intervalul precizat mai sus.
Interpretarea rezultatelorProba analizat satisface condiiile
testului n cazul n care concentraia medie de endotoxin a
replicatelor soluiei A, dup corectarea diluiei i concentraiei, este
mai mic dect limita specificat n monografie pentru acest
produs.
REACTIVISoluia de lizat Se dizolv prin amestecare uoar lizatul
de amibocite n ap pentru TEB sau ntr-un buffer, dup cum este
recomandat de productorul lizatului. Se pstreaza lizatul
reconstituit, la rece sau la congelator, dup cum este indicat de
productor. Lizat de amibocite Lizatul de amibocite este un produs
liofilizat, obinut din lizat de amibocite din crevete (Limulus
polyphemus sau Tachypleus trideniatus). n afar de endotoxine,
lizatul de amibocite reacioneaz cu unii -glucani. Sunt disponibile
i preparate de lizat de amibocite, care nu intr n reacie cu
glucanii; ele se prepar prin nlturarea din lizatul de amibocit a
factorului G, care d reacie cu glucanii, sau prin inhibarea
sistemului de reacie a factorului G al lizatului de amibocit.
Aceste compoziii pot fi folosite la testarea endotoxinelor n
prezena glucanilor.
Ap pentru TEB (ap pentru testele pentru endotoxine bacteriene).
Apa pentru TEB este ap pentru preparate injectabile R sau ap obinut
prin alte metode, care nu reacioneaz cu lizatul folosit ca limit de
detecie a reactivilor. TESTAREA ENDOTOXINELOR BACTERIENE
Endotoxinele bacteriilor gram-negative reprezint cauza cea mai
frecvent a reaciilor toxice ce rezult din contaminarea produselor
farmaceutice cu pirogeni; activitatea lor pirogenic este mult mai
nalt dect cea a majoritii altor substane pirogene. Aceste
endotoxine sunt din punct de vedere structural, lipopolizaharide.
Dei exist un numr mic de pirogeni de alt structur, n general este
justificat concluzia c absena endotoxinelor bacteriene ntr-un
produs implic absena componentelor pirogene, i c prezena
substanelor pirogene provenite din alte surse poate fi neglijat.
Prezena endotoxinelor ntr-un produs poate fi mascat de factorii
care interfereaz cu reacia dintre endotoxine i lizatul de
amibocite. De aceea, dac analistul dorete s nlocuiasc testul pe
iepuri pentru substane pirogene, recomandat de farmacopee,
printr-un test pentru endotoxine bacteriene, el trebuie s
demonstreze c este posibil efectuarea unor teste valide pentru
produsul respectiv; acest lucru poate presupune o procedur de
nlturare a factorilor de interferen.Dup cum este indicat n testul
pentru endotoxinele bacteriene, nainte de validarea testelor,
analistul trebuie s dispun de informaii cu privire la urmtoarele
dou aspecte:1) Trebuie s se fac teste preliminare care s confirme o
calitate adecvat a reactivilor care urmeaz s fie folosii; trebuie,
aadar, confirmat absena endotoxinelor n apa pentru TEB i n ali
reactivi, iar sensibilitatea lizatului de amibocite trebuie s
corespund sensibilitii indicate de productor. 2) Deoarece produsul
care urmeaz a fi examinat poate interfera cu testul, sensibilitatea
lizatului de amibocit este determinat n prezena i n absena
produsului supus examinrii. Nu trebuie s fie o diferen semnificativ
ntre cele dou valori de sensibilitate. Testul la endotoxinele
bacteriene indic metodele de nlturare a factorilor de interferen; n
caz de interferen, dup aplicarea unei asemenea metode se va repeta
testul pentru a verifica dac interferena a fost intr-adevar
neutralizat sau nlturat. Substituia testului la pirogeni pe iepuri,
indicat de farmacopee, printr-un test cu lizat de amibocite
presupune folosirea unei metode alternative de analiz i prin urmare
necesit validare. Metoda standard pentru endotoxine bacteriene este
indicat n monografia fiecrui produs n parte; dac nu exist nicio
referire la acest aspect, se va folosi metoda A. Dac urmeaz a fi
folosite alte metode dect cea de referin, analistul trebuie s
demonstreze c metoda este adecvat produsului analizat i c
rezultatul este comparabil cu cel obinut prin metoda de
referin.
Metoda Adugarea endotoxinelor la lizatul de amibocite poate
produce opalescen, precipitare sau gelaie (nchegare); doar metoda
de gelaie a fost folosit n Farmacopee drept criteriu de evaluare n
primul tip de test pentru endotoxine bacteriene. Avantajul era
datorat simplitii metodei, cu privire la uurina argumentrii
rezultatelor (pozitive sau negative) prin examinarea (cu ochiul
liber) a absenei sau prezenei cheagului. Metodele cantitative,
descrise ca metodele C, D, E i F au fost elaborate mai trziu: ele
necesit aparatur mai complex, dar sunt mai uor de adaptat pentru
testarea pe scar larg a unui numr mare de probe ale aceluiai
produs. Endotoxinele pot fi adsorbite pe suprafaa vaselor sau
pipetelor, confecionate din anumite tipuri de plastic sau sticl.
Pot aprea, aadar, interferene cauzate de eliberarea unor substane,
n special materiale plastice, din care sunt confecionate
recipientele folosite n timpul analizei. Prin urmare, materialele
folosite trebuie verificate; loturi diferite de tuburi sau pipete
pot avea o compoziie uor diferit, i de aceea analistul trebuie s
repete aceste teste nainte de a folosi un lot nou. Decizia de a
folosi testul pentru endotoxine bacteriene drept test limit implic,
n primul rnd, cunoaterea concentraiei maxime admise de endotoxin
pentru produsul analizat i n al doilea rnd, c scopul testului este
de a afla dac valoarea concentraiei de endotoxin n produsul
analizat este mai mic sau mai mare dect concentraia limit. Metodele
cantitative C, D, E i F ofer posibilitatea de a determina
concentraia de endotoxin n proba examinat, ns n cele din urm
rezultatele vor fi raportate fa de concentraia limit de endotoxine.
La stabilirea concentraiei maxime admise de endotoxin pentru
produsul analizat, o atenie deosebit trebuie s se acorde dozelor de
produs folosite n terapie: concentraia limit trebuie s fie stabilit
astfel nct s se asigure faptul c produsul nu va conine suficient
endotoxin pentru a cauza o reacie toxic, chiar la administrarea n
doz maxim per or. Atunci cnd concentraia de endotoxin n produs este
egal exact cu valoarea concentraiei limit, va avea loc formarea
cheagului, la fel ca i n cazul n care concentraia de endotoxin este
mult mai mare, iar produsul nu va ndeplini condiiile de trecere a
testului, deoarece acest test este de tipul totul sau nimic, fr a
putea diferenia ntre o concentraie exact egal cu limita admis i una
mai mare dect aceasta. Doar n cazul n care nu se produce formarea
cheagului, analistul poate conchide c valoarea concentraiei de
endotoxin este mai mic dect concentraia limit. Deoarece testul
poate fi efectuat doar pe soluii, pentru produsele n stare solid,
concentraia limit de endotoxin per unitate de mas sau per Unitate
Internaional (UI) a produsului, urmeaz a fi transformat n
concentraie de endotoxin per mililitru de soluie. Cazul substanelor
care se prezint n stare lichid (cum ar fi soluiile infuzabile) este
discutat mai jos.
Concentraia limit de endotoxin: limita de endotoxin pentru
substane active administrate parenteral, apreciat n baza dozei este
egal cu: , unde: K = doza maxim de endotoxin per kilogram corp
ntr-o perioad de o or, M = doza maxim recomandat a produsului per
kilogram corp ntr-o perioad de o or. Limita de endotoxin depinde de
produs i calea lui de administrare i este indicat n monografii.
Valorile pentru K sunt indicate n tabelul de mai jos.Calea de
administrareK (UI endotoxin per kg corp per or)
Intravenoas5.0
Intravenoas, pentru produse radiofarmaceutice2.5
Intratecal0.2
n continuare, se va pune ntrebarea ce diluie din produsul
analizat trebuie testat pentru a oferi sigurana c rezultatul
negativ al testului se traduce printr-o concentraie de endotoxin n
produs mai mic dect limita de endotoxin i c rezultatul pozitiv
semnific detectarea unei concentraii de endotoxin egale sau mai
mari. Aceast diluie depinde de limita de endotoxin i de
sensibilitatea lizatului: ea se numete Diluia maxim admis (DMA),
iar valoarea ei poate fi calculat aa cum a fost artat mai sus. Dac
valoarea diluiei maxime admise nu este un numr ntreg, n scopuri
practice poate fi folosit un numr potrivit ntreg, mai mic dect DMA
(ceea ce nseamn c se va prepara o soluie de produs mai puin diluat
dect DMA). n acest caz, un rezultat negativ indic faptul c valoarea
concentraiei de endotoxin din produs este mai mic dect valoarea
limit. Totui, atunci cnd concentraia de endotoxin din produs este
mai mic dect limita admis, dar suficient de nalt pentru a intra n
reacie cu lizatul, formnd un cheag, testul poate fi considerat
pozitiv. Prin urmare, atunci cnd un test cu acest factor de diluie
"rotunjit" este pozitiv, produsul trebuie s fie diluat la DMA i
testul trebuie s fie repetat. n cazul oricror ndoieli, se va folosi
DMA. Exemplu Este necesar testarea unei soluii de 50 mg/ml de
fenitoin de sodiu (destinat uzului parenteral). Trebuie determinat
DMA, cunoscnd urmtoarele variabile: M = doza maxim folosit la om =
15 mg per kilogram corp per or, c = 50 mg/ml, K = 5 UI de endotoxin
per kilogram corp per or, = 0.4 UI de endotoxin per mililitru. DMA=
x = 41.67Pentru efectuarea unor teste de rutin, s-ar putea s fie
mai practic diluarea unui ml de soluie analizat pn la 20 ml (DMA/ 2
rotunjit pn la numrul ntreg mai mic). Totui, dac rezultatul acestui
test este pozitiv, analistul va trebui s dilueze 1 ml pn la 41.67
ml i s repete testul. Substana de referinStandardul de Endotoxin
BRP (biological reference preparation) este destinat pentru a fi
folosit drept substan- standard. El a fost comparat cu Standardul
Internaional de Endotoxin al OMS i potena lui este exprimat n Uniti
Internaionale de endotoxin per flacon. Unitatea Internaional de
endotoxin este definit ca activitatea specific a unei anumite
cantiti (exprimat n uniti de mas) din Standardul Internaional.
Pentru teste de rutin, poate fi folosit i un alt standard de
endotoxin, cu condiia ca acesta s fi fost comparat cu Standardul
Internaional de Endotoxin sau BRP, iar potena s fie exprimat n
Uniti Internaionale de endotoxin. NOT: o Unitate Internaional (UI)
de endotoxin este egal cu o Unitate de Endotoxin (U.E.). Ap pentru
TEB Testarea absenei endotoxinelor n acest reactiv printr-o tehnic
asemntoare testului pentru substane pirogene pe iepuri a fost
respins din urmtoarele motive: 4.1. Testul pe iepuri nu este
suficient de sensibil pentru detectarea endotoxinei n apa pentru
TEB, destinat testrii produselor cu o limit foarte joas de
endotoxin; 4.2. Precizia relativ joas a rspunsului febril la iepuri
va necesita multe replicate; 4.3. Termenii "pirogeni" i
"endotoxine" denot grupuri de entiti care nu coincid n totalitate.
pH-ul amestecului n cadrul testului pentru endotoxine bacteriene,
procesul optim de formare a cheagului are loc ntr-un amestec cu un
pH cuprins intre 6.0 - 8.0. Totui, adugarea lizatului peste prob
poate determina scderea pH-ului.
Validarea lizatului Pentru prepararea soluiilor de lizat este
important respectarea instruciunilor productorului. Factorii de
diluie pozitivi ai punctului final n metodele gel-cheag A i B sunt
transformai n logaritmi. Motivul este c dac se reprezint grafic
distristribuia frecvenelor acestor valori logaritmice, aceasta se
apropie mult mai mult de curba normal de distribuie dect curba
distribuiei frecvenelor corespunztoare factorilor de diluie; de
fapt, ea este att de similar, nct este acceptat utilizarea
distribuiei normale a frecvenelor ca model matematic i calculul
intervalului de confiden cu ajutorul testului T-student. Testul
preliminar la factori de interferenUnele produse nu pot fi testate
pentru prezena endotoxinelor n mod direct deoarece nu sunt
miscibile cu reactivii utilizai, nu sunt compatibile cu intervalul
de pH 6.0 - 8.0 sau inhib ori activeaz formarea gelului. De aceea,
pentru a verifica prezena factorilor de interferen, este necesar
efectuarea unui test preliminar; dac n urma acestor teste sunt
identificai factori de interferen, analistul trebuie s demonstreze
c procedura de nlturare a lor a fost eficient. Scopul testului
preliminar este de a testa ipoteza nul (H0: sensibilitatea
lizatului n prezena produsului analizat nu difer semnificativ de
sensibilitatea lizatului n absena acestuia). n metodele A i B se
folosete un criteriu simplu: ipoteza nul este acceptat dac
sensibilitatea lizatului n prezena produsului se afl n intervalul
50-200% din valoarea sensibilitii lizatului n sine. Abordarea
clasic este de a calcula mediile factorului de diluie logaritmat
pentru sensibilitatea lizatului cu i fr produs i de a testa
diferena dintre cele dou medii prin testul T-student. Testul la
factori de interferen n metodele gel-cheag A i B necesit folosirea
unei probe de produs n care endotoxinele nu sunt detectabile.
Aceasta reprezint o problem teoretic n cazul n care urmeaz a fi
testat un produs totalmente nou. Prin urmare, pentru metodele
cantitative C, D, E i F a fost elaborat o abordare diferit.
nlturarea factorilor de interferenProcedurile de nlturare a
factorilor de interferen nu trebuie s mreasc sau s micoreze (de
exemplu, prin adsorbie) cantitatea de endotoxin n produsul
examinat. Modul corect de a verifica acest lucru este de a aplica
procedurile date unei probe contaminate (cu o concentraie cunoscut
de endotoxin) de produs, cu msurarea ulterioar a ratei de
recuperare a endotoxinei. Metodele C i D. Dac produsul care urmeaz
a fi analizat, conine factori de interferen, ce nu pot fi nlturai
prin metodele clasice, se poate crea o curb standard folosind un
produs similar, care s nu conina endotoxine. Apoi se efectueaz
testul la endotoxine prin comparaie cu aceast curb standard. S-a
dovedit c n majoritatea cazurilor, ultrafiltrarea prin filtre cu
membran asimetric din triacetat de celuloz reprezint o metod
adecvat pentru ndeprtarea interferenelor. Filtrele utilizate
trebuie s fie validate n mod corespunztor, deoarece n unele
circumstane derivaii celulozei (-D-glucanii) pot da rezultate fals
pozitive. Filtrele din polisulfon nu sunt adecvate pentru acest
test, deoarece unii utilizatori au obinut rezultate fals pozitive.
Scopul verificrilor Scopul verificrilor, efectuate cu ap pentru TEB
i cu standardul de endotoxin la o concentraie dubl a sensibilitii
lizatului fa de cea nscris n ambalajul produsului, este de a
verifica activitatea lizatului n timpul i n condiiile testului
respectiv. Scopul reaciei cu controlul negativ este de a verifica
absena unei concentraii detectabile de endotoxin n apa pentru TEB.
Controlul pozitiv, care conine produsul analizat, la concentraia
folosit n test, se folosete cu scopul de a demonstra absena oricror
factori inhibitori n timpul i n condiiile testului respectiv.
Aprecierea i interpretarea rezultatelor Cantitile mici de endotoxin
n apa pentru TEB, sau n oricare alt reactiv sau material, cu care
ia contact lizatul n timpul testului, pot s nu fie detectate dac nu
ating limita de sensibilitate a lizatului. Totui, ele pot crete
concentraia de endotoxin n proba analizat fa de concentraia real,
depind limita de sensibilitate a lizatului, determinnd o reacie
pozitiv. Acest risc poate fi redus prin testarea apei pentru TEB i
a altor reactivi i materiale cu cel mai sensibil lizat disponibil,
sau cel puin cu un lizat mai sensibil dect cel folosit la testarea
produsului. Chiar i n aceste condiii, riscul de a obine un
"rezultat fals pozitiv" nu poate fi complet eliminat. Trebuie,
totui, subliniat faptul c testul nu permite nregistrarea unui
rezultat fals negativ, fapt care ar putea duce la admiterea unui
produs nesatisfctor, punnd n primejdie sntatea pacientului.
nlocuirea testului pentru pirogeni pe iepuri printr-un test la
endotoxine bacterieneMonografiile produselor farmaceutice pentru uz
parenteral, care pot conine cantiti mici de endotoxine bacteriene,
prevd necesitatea testrii acestora pentru endotoxine bacteriene sau
printr-un test pe iepuri pentru determinarea eventualelor impuriti
pirogene.Aspecte generale: n orice monografie individual, este
specificat un singur test, fie cel pentru pirogeni, fie cel pentru
endotoxine bacteriene; n absena unor indicaii contrare, testul la
endotoxinele bacteriene se va prefera testului la pirogeni,
deoarece de obicei se consider c el asigur pacientului o protecie
egal sau mai mare; nainte de a include un test la endotoxine
bacteriene ntr-o monografie, trebuie dovedit faptul c una din
metodele descrise mai sus poate fi aplicat, cu rezultate
satisfctoare asupra produsului specificat n monografie; Informaia
necesar este obinut de la productori. Companiile sunt rugate s
ofere toate datele disponibile, privitoare la aplicabilitatea
testului la endotoxine bacteriene asupra substanelor i preparatelor
care urmeaz a fi analizate. Aceste date includ detalii despre
prepararea probei i a oricror proceduri necesare pentru a elimina
factorii de interferen. n plus, se vor oferi toate datele
disponibile despre testul pe iepuri pentru decelarea prirogenilor,
fapt care va contribui la asigurarea faptului c nlocuirea
testulului pe iepuri prin testul la endotoxine bacteriene este
adecvat. Folosirea unui test pentru endotoxine bacteriene diferit
de cel prevzut n monografie n caz c monografia recomand efectuarea
unui test la endotoxine bacteriene, dar nu specific nici una din
cele ase metode (A - F) descrise n capitolul 2.6.14, atunci nseamn
c pentru acest produs a fost validat metoda A, metoda gel-cheag:
test limit. Dac este specificat una din celelalte metode (B - F),
atunci nseamn c metoda indicat care a fost validat pentru
respectivul produs i aceea va fi folosit pentru testarea
produsului. Validarea metodelor alternative nlocuirea unui test
pentru pirogeni pe iepuri prin testul la endotoxine bacteriene sau
nlocuirea unei metode stabilite sau implementate la endotoxinele
bacteriene prin alt metod, trebuie calificat drept folosire a unei
metode alternative n nlocuirea unui test farmacopeic, dup cum este
descris mai jos: "Testul i analizele descrise sunt metode oficiale,
pe care se bazeaz standardele Farmacopeei. n scopuri de verificare,
cu acordul autoritilor competente, pot fi folosite metode
alternative de analiz, asigurnd faptul c metodele folosite permit
luarea unei decizii univoce, asemntoare celei care ar fi fost luat
n complian cu standardele monografiilor la folosirea metodelor
oficiale. n caz de ndoieli sau dispute, unicile metode de referin
pentru analiz sunt cele din Farmacopee." Pentru validarea unei alte
metode la endotoxine bacteriene dect cea prescris sau indicat n
monografie sunt sugerate urmtoarele proceduri: Procedura,
materialele i reactivii, folosite n metod trebuie s fie validate
dup cum este descris n testul respectiv; Prezena factorilor de
interferen (i, dac este necesar, procedura de nlturare a lor)
trebuie s fie testat pe probe din cel puin trei loturi. Se va ine
cont c metodele D i E, care folosesc o peptid cromogenic, necesit
reactivi, ce nu sunt folosii n metodele A, B, C i F, i prin urmare
compliana metodelor A, B, C sau F cu cerinele pentru factorii de
interferen nu pot fi extrapolate asupra metodei D sau metodei E fr
testare suplimentar. Validarea testului la produse noi Procedurile
descrise mai sus trebuie s fie aplicate tuturor produselor noi,
destinate pentru uz parenteral, care urmeaz a fi testat pentru
prezena de endotoxine bacteriene conform cerinelor Farmacopeei.
Five simple models for interfering factors test of bacterial
endotoxins testPei Yusheng,Cai Tong,Gao Hua,Tan Dejiang,Zhang
Yuchen, Zhang GuolaiChinese Medical Journal
2014;127(18):3344-3346:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.20140611Conform
articolului mentionat mai sus, endotoxinele reprezint cauza a peste
50% din cazurile de sepsis, cu o rat crescut de mortalitate.
Majoritatea testelor pentru detecia factorilor de interferen i
pentru detecia endotoxinelor bacteriene ntr-un preparat folosesc
lizatul de amibocite. Resursele de Limulus n China sunt reduse,
motiv pentru care articolul se axeaz pe prezentarea a 5 noi metode
de detecie a factorilor de interferen, care folosesc un numr de
replicate mai mic dect cel considerat necesar in USP36 (la fel ca i
n FE6).
SoluiaConcentraie de endotoxine/soluia la care se adaug
endotoxinaSolventFactor de diluieConcentraie de endotoxinUSP36Numr
de replicateModel 1Numr de replicateModel 2Numr de replicate
A0/soluia test---422
B2 /soluia testSoluia-test12 432
21 432
40.5 432
80.25 432
C2 /ap pentru TEBAp pentru TEB12 222
21 222
40.5 222
80.25 222
D0/ap pentru TEB---222
Tabel 1.Prepararea soluiilor pentru testul pentru factori de
interferen din USP36, pentru modelul 1 i 2 (modele propuse n
articol)A: soluie-test a probei analizate, ce nu conine endotoxine
detectabile; B: test pentru factori de intereferen; C: control
pentru sensibilitatea lizatului; D: control negativ.
SoluiaConcentraie de endotoxinModel 3Numr de replicateModel
4Numr de replicateModel 5Numr de replicate
A-222
B2 432
0.25 432
C2 222
0.25 222
D-222
Tabel 2. Prepararea soluiilor pentru testul pentru factori de
interferen pentru modelele 3,4 i 5. Soluiile A, B, C i D au aceeai
compoziie ca i cele din tabelul 1.
