+ All Categories
Home > Documents > elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

Date post: 31-Jan-2017
Category:
Upload: vannga
View: 223 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
34
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ܇I FARMACIE „GRIGORE T. POPA” IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE Rezumatul tezei de doctorat ELABORAREA UNOR NOI METODE DE DETERMINARE A ENALAPRILULUI ܇I OPTIMIZAREA CARACTERISTICILOR ACESTUIA PRIN COMPLEXARE CU POLIMERI BIO-MUCOADEZIVI CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. DORNEANU Vasile DOCTORAND: Asist. Univ. MOGLAN (căs. GHERMAN) Simona Petronela 2014
Transcript
Page 1: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

UNIVERSITATEAăDEăMEDICIN ă IăFARMACIE „GRIGOREăT.ăPOPA”ăIAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

Rezumatul tezei de doctorat

ELABORAREA UNOR NOI METODE DE DETERMINARE AăENALAPRILULUIă IăOPTIMIZAREAă

CARACTERISTICILOR ACESTUIA PRIN COMPLEXARE CU POLIMERI BIO-MUCOADEZIVI

CONDUC TORăŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. DORNEANU Vasile

DOCTORAND: Asist.ăUniv.ăMOGLANă(c s.ăGHERMAN)ăSimonaăPetronela

2014

Page 2: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...
Page 3: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

Prin decizia Rectorului Universită ii de Medicină i Farmacie „GRIGORE T. POPA” IA I nr. 23631/21.10.2014, a fost numită comisia pentru sus inerea publică a tezei de doctorat intitulată „Elaborarea unor noiă metodeă deă determinareă aă enalapriluluiă iă optimizareaăcaracteristicilor acestuia prin complexare cu polimeri bio-mucoadezivi”, elaborată de asist. univ. Simona Petronela Moglan (Gherman), conducător tiin ific Prof. Univ. Dr. Vasile Dorneanu, în vederea conferirii titlului de Doctor în tiin e Medicale, domeniul Farmacie.

PRE EDINTE:

DecanăProf.ăUniv.ăDr.ăMonicaăH ncianu Universitatea de Medicină i Farmacie „Grigore T. Popa” Ia i

CONDUC TORă TIIN IFIC:

Prof. Univ. Dr. Vasile Dorneanu Universitatea de Medicină i Farmacie „Grigore T. Popa” Ia i

REFEREN IăOFICIALI:

Prof. Univ. Dr. Romeo Iulian Olariu Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” din Ia i

Prof.ăUniv.ăDr.ăIgorăCre escuă

Universitatea Tehnică „Gheorghe Asachi” din Ia i

Conf.ăDr.ăL cr mioaraăOchiuză Universitatea de Medicină i Farmacie „Grigore T. Popa” Ia i

Page 4: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

Teza de doctorat cuprinde:

179 pagini (anexe - 1 pagină) 71 figuri 100 tabele 251 indica ii bibliografice 2 articole publicate din tematica tezei

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins,

tabele i figuri. Bibliografia inclusă în rezumat este selectivă. Cuvinte cheie: enalapril maleat, metode analitice UV-VIS,

HPLC i electroforeză capilară de determinare din forme farmaceutice, film polimeric, test de dizolvare in vitro.

Page 5: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

CUPRINS

STADIULăCUNOA TERII ....................................................................... 1

CAPITOLUL 1 HIPERTENSIUNEAă ARTERIAL ă Iă INHIBAREAăFARMACOLOGIC ă Aă SISTEMULUIă RENIN ă ANGIOTENSIN ăALDOSTERON .......................................................................................... 1

1.1. Generalită i i defini ii ...................................................................... 1

1.2. Clasificarea valorilor tensiunii arteriale ........................................... 2

1.3. Clasificarea hipertensiunii arteriale .................................................. 3

1.3.1. Clasificarea hipertensiunii arteriale în func ie de afectarea organelor intă .................................................................................... 3

1.3.2. Clasificarea etiologică a hipertensiunii arteriale ...................... 3

1.4. Controlul hipertensiunii arteriale ...................................................... 4

1.5. Managementul terapeutic al hipertensiunii arteriale......................... 5

1.6. Strategii terapeutice ale tratamentului antihipertensiv ..................... 6

1.6.1. Strategii nefarmacologice ......................................................... 6

1.6.2. Strategii farmacologice ............................................................. 7

1.7. Sistemul renină angiotensină aldosteron .......................................... 7

1.8. Inhibarea farmacologică a sistemului renină angiotensină aldosteron ............................................................................................................... 10

1.9. Tratamentul cu inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei 11

1.10. Eficien a tratamentului cu inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei .......................................................................................... 12

1.11. Efectele secundare ale inhibitorilor enzimei de conversie ai angiotensinei .......................................................................................... 13

CAPITOLUL 2 ENALAPRILUL.ăPROFILăANALITICă IăTERAPEUTIC ................. 15

2.1. Nomenclatură, structură chimică i sinteză .................................... 15

2.2. Proprietă i fizico-chimice ............................................................... 16

2.3. Metode de determinare calitativă i cantitativă .............................. 23

2.3.1. Metode titrimetrice ................................................................. 23

2.3.2. Metode poten iometrice .......................................................... 23

2.3.3. Metode spectrofotometrice ..................................................... 24

2.3.4. Metode cromatografice ........................................................... 26

2.3.4.1. Cromatografia pe strat sub ire ........................................ 26

2.3.4.2. Cromatografia de lichide de înaltă performan ă ............. 27

2.3.5. Metode electroforetice. Electroforeza capilară ....................... 29

2.4. Aspecte farmacologice ................................................................... 30

2.4.1. Proprietă i farmacologice ....................................................... 30

2.4.2. Indica ii i doze ...................................................................... 30

2.4.3. Efecte secundare ..................................................................... 30

CAPITOLUL 3

Page 6: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

POLIMERI BIO-MUCOADEZIVI UTILIZA I IN FORME FARMACEUTICE ORALE ................................................................... 31

3.1. Considera ii generale asupra muco/bioadeziunii ............................ 31

3.2. Teoriile bioadeziunii la nivel bucal ................................................ 32

3.3. Caracteristicile ideale ale unui polimer mucoadeziv ...................... 32

3.4. Polimeri mucoadezivi utiliza i în forme farmaceutice orale ........... 33

3.5. Pululanul ......................................................................................... 33

3.5.1. Generalită i, structură i proprietă i ........................................ 33

3.5.2. Aplica iile farmaceutice ale pululanului ................................. 35

3.6. Chitosanul ....................................................................................... 36

3.6.1. Generalită i, structură i proprietă i ........................................ 36

3.6.2. Aplica iile farmaceutice ale chitosanului ............................... 37

CONTRIBU IIăPERSONALE................................................................ 38

CAPITOLUL 4 MOTIVA IAă IăOBIECTIVELEăCERCET RILORăPERSONALE 38

CAPITOLUL 5 DATE PRIVIND METODOLOGIA DE LUCRU ................................. 40

5.1. Metode de analiză i tehnici de lucru ............................................. 40

5.1.1. Metode cromatografice de lichide de înaltă performan ă (HPLC) ............................................................................................. 40

5.1.2. Metode de electroforeză capilară............................................ 41

5.1.3. Metode spectrofotometrice UV-VIS ...................................... 41

5.1.4. Tehnica de preparare a filmelor .............................................. 42

5.2. Analiza datelor experimentale ........................................................ 42

5.2.1. Validarea metodelor de analiză .............................................. 42

5.2.2. Tehnici de evaluare a unor posibile interac iuni medicament-polimer ............................................................................................. 44

CAPITOLUL 6 ELABORAREA,ă VALIDAREAă Iă DETERMINAREAăCANTITATIV ă Aă ENALAPRILULUIă PRINă CROMATOGRAFIEăDEăLICHIDEăDEăÎNALT ăPERFORMAN ..................................... 47

6.1. Scop i obiective ............................................................................. 47

6.2. Material i metodă .......................................................................... 47

6.2.1. Aparatură i materiale ............................................................ 47

6.2.2. Stabilirea condi iilor cromatografice optime .......................... 48

6.2.2.1. Selectarea fazei sta ionare (coloanei cromatografice) .... 48

6.2.2.2. Selectarea fazei mobile................................................... 49

6.2.2.3. Selectarea debitului fazei mobile ................................... 49

6.2.2.4. Stabilirea lungimii de undă de detec ie .......................... 49

6.2.2.5. Identificarea picului corespunzător enalaprilului ........... 49

6.2.2.6. Studiul stabilită ii solu iei de enalapril ........................... 50

6.2.3. Validarea metodei cromatografice ......................................... 50

6.2.3.1. Selectivitatea metodei .................................................... 50

6.2.3.2. Studiul liniarită ii metodei .............................................. 50

Page 7: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

6.2.3.3. Limita de detec ie i limita de cuantificare .................... 51

6.2.3.4. Precizia sistemului (Repetabilitatea injec iei) ................ 51

6.2.3.5. Precizia metodei (Repetabilitatea analizei) .................... 52

6.2.3.6. Precizia intermediară ...................................................... 52

6.2.3.7. Exactitatea metodei (acurate ea) .................................... 52

6.2.4. Dozarea enalaprilului din comprimate ................................... 53

6.3. Rezultate ......................................................................................... 54

6.3.1. Rezultatele condi iilor cromatografice ................................... 54

6.3.2. Rezultatele validării metodei cromatografice ......................... 57

6.3.3. Rezultatele dozării enalaprilului din comprimate ................... 62

6.4. Discu ii ........................................................................................... 63

6.5. Concluzii ........................................................................................ 65

CAPITOLUL 7 ELABORAREAă ŞIă VALIDAREAă UNEIă METODEă DEăELECTROFOTEZ ă CAPILAR ă PENTRUă DETERMINAREAăENALAPRILULUI ................................................................................... 67

7.1. Scop i obiective ............................................................................. 67

7.2. Material i metodă .......................................................................... 67

7.2.1. Aparatură i materiale ............................................................ 67

7.2.2. Stabilirea condi iilor electroforetice optime ........................... 69

7.2.2.1. Condi ionarea capilarei .................................................. 69

7.2.2.2. Stabilirea lungimii de undă de detec ie .......................... 69

7.2.2.3. Selectarea pH-ului optim al electrolitului ...................... 69

7.2.2.4. Influenţa concentra iei electrolitului .............................. 70

7.2.2.5. Stabilitatea enalaprilului în solu ie ................................. 70

7.2.2.6. Caracteristicile metodei electroforetice .......................... 71

7.2.3. Validarea metodei electroforetice........................................... 71

7.2.3.1. Studiul liniarită ii metodei .............................................. 71

7.2.3.2. Limita de detec ie i limita de cuantificare .................... 72

7.2.3.3. Precizia sistemului ......................................................... 72

7.2.3.4. Precizia metodei ............................................................. 73

7.2.3.5. Precizia intermediară ...................................................... 73

7.2.3.6. Exactitatea (acurate ea) .................................................. 73

7.3. Rezultate ......................................................................................... 74

7.3.1. Rezultatele condi iilor electroforetice .................................... 74

7.3.2. Rezultatele validării metodei electroforetice .......................... 77

7.4. Discu ii ........................................................................................... 82

7.5. Concluzii ........................................................................................ 85

CAPITOLUL 8 METODE SPECTROFOTOMETRICE ÎN UV-VIS DE DETERMINAREăCANTITATIV ăAăENALAPRILULUIăMALEAT 86

8.1. Determinarea spectrofotometrică a enalaprilului utilizând tropeolina 00 ........................................................................................................... 86

8.1.1. Scop i obiective ..................................................................... 86

Page 8: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

8.1.2. Material i metode .................................................................. 86

8.1.2.1. Principiul metodei .......................................................... 86

8.1.2.2. Aparatură i materiale .................................................... 87

8.1.2.3. Stabilirea condiţiilor optime de lucru ............................. 87

8.1.2.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detec ie .................. 87

8.1.2.3.2. Stabilirea acidită ii necesare reac iei ...................... 88

8.1.2.3.3. Studiul influen ei acetonei ...................................... 88

8.1.2.3.4. Stabilirea concentraţiei i volumului de tropeolină 00 ............................................................................................ 88

8.1.2.3.5. Studiul solventului de extracţie i a numărului de extrac ii................................................................................... 89

8.1.2.3.6. Studiul stabilită ii compusului tip perechi de ioni .. 89

8.1.2.4. Procedura de lucru .......................................................... 89

8.1.2.5. Validarea metodei spectrofotometrice............................ 90

8.1.2.5.1. Liniaritatea metodei ............................................... 90

8.1.2.5.2. Limita de detec ie i limita de cuantificare ............ 90

8.1.2.5.3. Precizia sistemului ................................................. 91

8.1.2.5.4. Precizia metodei (repetabilitatea analizei) ............. 91

8.1.2.5.5. Precizia intermediară .............................................. 91

8.1.2.5.6. Exactitatea metodei (acurate ea) ............................ 91

8.1.2.5.7. Selectivitatea metodei ............................................ 92

8.1.2.6. Dozarea enalaprilului din comprimate ........................... 92

8.1.3. Rezultate ................................................................................. 93

8.1.3.1. Rezultatele optimizării condi iilor de lucru .................... 94

8.1.3.2. Rezultatele validării metodei .......................................... 96

8.1.3.3. Rezultatele dozării enalaprilului din comprimate ........ 100

8.1.4. Discu ii ................................................................................. 101

8.1.5. Concluzii .............................................................................. 103

8.2. Determinarea spectrofotometrică a enalaprilului utilizând albastru de bromtimol i clorura de cupru (II) .................................................. 105

8.2.1. Scop i obiective ................................................................... 105

8.2.2. Material i metode ................................................................ 105

8.2.2.1. Principiul metodei ........................................................ 105

8.2.2.2. Aparatură i materiale .................................................. 105

8.2.2.3. Stabilirea condiţiilor optime de lucru ........................... 106

8.2.2.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detec ie ................ 106

8.2.2.3.2. Stabilirea acidită ii necesare reac iei .................... 106

8.2.2.3.3. Stabilirea concentraţiei clorurii de cupru (II) ....... 107

8.2.2.3.4. Stabilirea concentra iei de albastru de bromtimol 107

8.2.2.3.5. Studiul solventului de extracţie ............................ 107

8.2.2.3.6. Influenţa ordinii de adăugare a reactivilor ........... 107

8.2.2.3.7. Studiul stabilităţii complexului ternar .................. 108

8.2.2.4. Procedura de lucru ........................................................ 108

8.2.2.5. Validarea metodei spectrofotometrice.......................... 108

Page 9: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

8.2.2.5.1. Liniaritatea metodei ............................................. 108

8.2.2.5.2. Limita de detec ie i limita de cuantificare .......... 109

8.2.2.5.3. Precizia sistemului ............................................... 109

8.2.2.5.4. Precizia metodei (repetabilitatea analizei) ........... 110

8.2.2.5.5. Precizia intermediară ............................................ 110

8.2.2.5.6. Exactitatea metodei (acurate ea) .......................... 110

8.2.3. Rezultate ............................................................................... 111

8.2.3.1. Rezultatele optimizării condi iilor de lucru .................. 111

8.2.3.2. Rezultatele validării metodei ........................................ 113

8.2.4. Discu ii ................................................................................. 117

8.2.5. Concluzii .............................................................................. 119

8.3. Determinarea spectrofotometrică în UV a enalaprilului ............... 120

8.3.1. Scop i obiective ................................................................... 120

8.3.2. Material i metodă ................................................................ 120

8.3.2.1. Principiul metodei ........................................................ 120

8.3.2.2. Aparatură i materiale .................................................. 120

8.3.2.3. Stabilirea condiţiilor optime de lucru ........................... 121

8.3.2.3.1. Stabilirea pH - ului optim ..................................... 121

8.3.2.3.2. Stabilirea solventului optim pentru enalapril ....... 121

8.3.2.3.3. Stabilirea lungimii de undă de detec ie ................ 122

8.3.2.3.4. Studiul stabilită ii enalaprilului în tampon fosfat pH = 4,0 ..................................................................................... 122

8.3.2.4. Validarea metodei spectrofotometrice.......................... 122

8.3.2.4.1. Liniaritatea metodei ............................................. 122

8.3.2.4.2. Limita de detec ie i limita de cuantificare .......... 123

8.3.2.4.3. Precizia sistemului ............................................... 123

8.3.2.4.4. Precizia metodei (repetabilitatea analizei) ........... 123

8.3.2.4.5. Precizia intermediară ............................................ 124

8.3.2.4.6. Exactitatea metodei (acurate ea) .......................... 124

8.3.2.4.7. Selectivitatea metodei .......................................... 125

8.3.2.5. Dozarea enalaprilului din comprimate ......................... 125

8.3.3. Rezultate ............................................................................... 126

8.3.3.1. Rezultatele optimizării condi iilor de lucru .................. 126

8.3.3.2. Rezultatele validării metodei ........................................ 127

8.3.3.3. Rezultatele dozării enalaprilului din comprimate ........ 132

8.3.4. Discu ii ................................................................................. 133

8.3.5. Concluzii .............................................................................. 135

CAPITOLUL 9 OPTIMIZAREA CARACTERISTICILOR ENALAPRILULUI ÎN VEDEREA INCLUDERII ÎN FORME FARMACEUTICE CU CEDAREăMODIFICAT ...................................................................... 137

9.1. Realizarea complexului enalapril-pululan .................................... 137

λ.1.1. Scop i obiective ................................................................... 137

9.1.2. Material i metode ................................................................ 137

Page 10: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

λ.1.2.1. Procedeul de ob inere al complexului enalapril-pululan ................................................................................................... 138

9.1.2.2. Caracterizarea fizico-chimice a complexului enalapril-pululan ....................................................................................... 138

9.1.2.3. Determinarea gradului de încorporare a enalaprilului în film i evaluarea uniformită ii con inutului ............................... 140

9.1.2.4. Testul de dezagregare ................................................... 140

9.1.2.5. Testul de dizolvare in vitro ........................................... 140

9.1.3. Rezultate ............................................................................... 141

λ.1.4. Discu ii ................................................................................. 147

9.1.5. Concluzii .............................................................................. 150

9.2. Realizarea complexului enalapril-pululan-chitosan ..................... 151

λ.2.1. Scop i obiective ................................................................... 151

λ.2.2. Material i metode ................................................................ 151

λ.2.2.1. Procedeul de ob inere a sistemului transportor tip film bioadeziv pe bază de chitosan-pululan ...................................... 152

λ.2.2.2. Procedeul de ob inere a sistemului polimeric chitosan-pululan, tip film bioadeziv încărcat cu enalapril ....................... 152

9.2.2.3. Caracterizarea fizico-chimică a sistemelor CS-PU i CS-PU-EM ...................................................................................... 152

9.2.2.4. Determinarea gradului de încorporare a enalaprilului în film i evaluarea uniformită ii con inutului ............................... 153

9.2.2.5. Testul de dezagregare-hidratare a filmului polimeric CS-PU-EM ...................................................................................... 153

9.2.2.6. Testul de dizolvare in vitro ........................................... 153

9.2.3. Rezultate ............................................................................... 154

λ.2.4. Discu ii ................................................................................. 158

9.2.5. Concluzii .............................................................................. 160

CONCLUZII GENERALE .................................................................... 162

PERSPECTIVE DE CERCETARE ...................................................... 164

BIBLIOGRAFIE .................................................................................... 165

ANEXE .................................................................................................... 178

Diseminareaărezultatelorăob inute......................................................... 178

Lucrări tiin ifice ................................................................................. 178

Comunicări de tip poster ..................................................................... 178

Page 11: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

1

MOTIVA IAă IăOBIECTIVELEă CERCET RILORăPERSONALE

Alegerea temei este dată de problematica bolile cardiovasculare

care sunt responsabile de mai multe decese în lume decât o serie de afec iuni cumulate, cum ar fiμ cancerul, insuficien a renală cronică i diabetul zaharat. Se estimează că 17 milioane de oameni mor anual din cauza bolilor cardiovasculare, iar la fiecare două secunde survine un deces ca rezultat al acestor boli. S-a calculat că în 2020 numărul total de decese cauzate de bolile cardiovasculare să ajungă la aproximativ 25 milioane.

În acest context, medicamentele cardiovasculare suscită un larg interes în comunitatea tiin ifică, ocupând un loc primordial în cercetarea, experimentarea i lansarea de noi produse farmaceutice.

Clasa inhibitorilor enzimei de conversie ai angiotensinei este considerată tratament de primă linie în tratarea bolilor cardiovasculare, având totodată un efect renoprotectiv. Eficien a tratamentului cu această clasă de medicamente în controlul hipertensiunii arteriale este asemănătoare sau u or superioară altor clase de medicamente antihipertensive.

Un medicament foarte utilizat din această clasă terapeutică, este enalaprilul. Cu toate că acest medicament a fost aprobat de United States

Food and Drug Administration din 1983 este în continuare foarte utilizat în terapia cardiovasculară la pacien ii de diferite vârste, inclusiv copii. În urma realizării studiului TOMHS (Treatment of Mild Hypertension Study) pe o perioadă de patru ani, s-a stabilit că enalaprilul este la fel de eficient în reducerea tensiunii arteriale ca al i agen i din patru clase diferite. În urma acestui studiu s-a constatat că enalaprilul realizează scăderi ale tensiunii arteriale la valori normale, în 50-70 ș din cazuri atât la tineri cât i la vârstnici.

La baza acestui studiu au stat proprietă ile farmacologice ale enalaprilului, în scopul realizării de noi metode de determinare cantitativă, atât pentru substan a medicamentoasă standard de referin ă cât i pentru substan a medicamentoasă ce se află în diverse forme farmaceutice. S-a avut în vedere ca metodele instituite să fie în concordan ă cu normele impuse de controlul analitic al medicamentului.

Scopul cercetărilor din prezenta teză de doctorat a constat în realizarea de noi metode analitice pentru determinarea cantitativă a maleatului de enalapril precum i realizarea de complec i cu polimeri bio-

Page 12: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

2

mucoadezivi în vederea includerii în forme farmaceutice cu cedare modificată.

Argumentele ce au stat la baza cercetărilor personale sunt date de faptul că nu toate metodele din literatură pot fi aplicate, mai ales la determinarea enalaprilului din produsele farmaceutice, unde influen a excipien ilor creează probleme i nu poate fi evitată. Un alt argument este dat de biodisponibilitatea redusă a enalaprilului, de aproximativ 40-60 %, ceea ce a impus realizarea de noi sisteme transportor, care să aibă o altă rută de administrare fa ă de cea orală.

Principalele obiective ale cercetărilor intreprinse au fostμ

elaborarea unor metode analitice pentru determinarea enalaprilului substan ă de referin ă cât i determinarea acestuia din comprimate, obiectiv în cadrul căruia s-au realizat trei metode spectrofotometrice UV-VIS, o metodă de cromatografie de lichide de înaltă performan ă i o metodă de electroforeză capilară;

validarea i evaluarea statistică a performan elor instrumentelor de analiză i a metodelor de analiză dezvoltate în conformitate cu normativele na ionale i europene;

realizarea, caracterizarea fizico-chimică i evaluarea in vitro a unor sisteme de transport tip film pentru eliberarea enalaprilului la nivel de mucoasă.

Page 13: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

3

PARTEAăPERSONAL

Capitolul 6. Elaborarea,ăvalidareaă iădeterminareaăcantitativ ăaăenalapriluluiăprinăcromatografieălichid ădeăînalt ăperforman

6.1.ăMaterială iămetod Metoda constă în separarea i determinarea cantitativă a

enalaprilului prin HPLC utilizând un cromatograf de lichide tip HP 1090 echipat cu detector UV cu multidiode. S-a urmărit stabilirea parametrilor cromatografici optimi (faza sta ionară, faza mobilă i debitul acesteia, lungimea de undă pentru detec ie, identificarea picului corespunzător enalaprilului după timpul de reten ie i după spectrul de absorb ie, stabilitatea enalaprilului în solu ie), validarea metodei (selectivitate, liniaritate, limită de detec ie i de cuantificare, precizia sistemului i a metodei, exactitate) i determinarea enalaprilului din comprimate.

6.2. Rezultate iădiscu ii Condi iile cromatografice optime sunt următoareleμ

faza sta ionară - coloană cromatografică Zorbax SB-C 18, 150 x 4,6 mm, cu dimensiunea particulelor de 5 µm;

faza mobilă - CH3CN:KH2PO4 (pH = 3,0 cu H3PO4) raport 70:30; debit fază mobilă - 0,8 mL/min; detec ie la lungimea de undă de absorb ie = 210 nm;

Fig 6.4.ăCromatogrameleăpentruăenalaprilămaleatăstandardă iăprob

Timpul de reten ie pentru enalaprilul standard este 2,345 min iar pentru enalaprilul probă este 2,353 min, aceste valori se încadrează în limita admisă ± 5 ș, astfel timpii pot varia pe intervalul 2,227 - 2,462 min.

identificarea spectrală a enalaprilului

min0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=210,4 Ref=450,80 (SIMONA\ENAL_141.D)

1.7

74

2.3

45

Enalapril maleat standard, 20yg/mL

min0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=210,4 Ref=450,80 (SIMONA\ENAL_130.D)

1.6

60

1.7

56

2.3

53 Enalapril maleat proba, 20yg/mL

DAD1 A, Sig=210,4 Ref=450,80 (SIMONA\ENAL_134.D)

EM probă 20 g/mL

EM standard 20 g/mL

Page 14: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

4

Fig. 6.5.ăSpectreleămaleatuluiădeăenalaprilăstandardă iăprob Prin compararea spectrală a enalaprilului probă cu standardul se

observă că acestea sunt identice, astfel are loc cre terea gradului de încredere referitor la identificarea enalaprilului.

Stabilitatea enalaprilul în solu ie de fază mobilă a fost analizată pe un interval de 48 ore la temperatura camerei iar din ariile cromatogramelor s-a calculat valoarea RSD = 0,8λ43 ș, această valoare indică faptul că enalaprilul este stabil în solu ia de fază mobilă.

S-a dovedit că metoda de determinare a enalaprilului prin HPLC este selectivă, deoarece dintr-un amestec cu mai mul i anali i cu structură asemănătoare, picurile acestora nu interferă i î i păstrează aliura.

Metoda este liniară pe domeniul 1 - 100 g/mL.

Fig. 6.7. Dreapta de calibrare la determinarea EM prin HPLC

nm200 220 240 260 280 300 320 340

Norm

0

25

50

75

100

125

150

175

*DAD1, 2.313 (521 mAU,Apx) of ENAL_065.D*EM in faza mobila STD

Aria picului = 35,6744·Concentra ia + 14,5055 r² = 0,9998

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

0 20 40 60 80 100 120

Ari

a pi

culu

i

Concentra ia,ăμg/mL

EM standard în fază mobilă

EM probă în fază mobilă

Page 15: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

5

După injectarea consecutivă de zece ori a unei probe de enalapril de concentra ie 20 g/mL, datele experimentale ob inute au fost prelucrate statistic i s-a ob inut pentru devia ia standard relativă (RSD) valoarea 0,4588 ș care este mult sub limita admisă de 2 ș i astfel se poate afirma că sistemul de lucru este precis, fapt demonstrat i de valoarea RSD = 0,528λ ș a timpului de reten ie care mult mai mic comparativ cu limita admisă de ± 5 ș.

În urma studierii preciziei metodei s-a stabilit pentru repetabilitate RSD = 1,4361 % iar pentru precizia intermediară RSD = 1,5501 %, valori mai mici 2 % conform recomandărilor ghidurilor de validare. Rezultatele exactită ii metodei denotă că rezultatele analitice sunt apropiate de valoarea adevărată, regăsirea medie a EM este de λλ,72 ș i variază în domeniul 97,48 - 102,13 %.

Metoda HPLC elaborată i validată a fost aplicată la determinarea enalaprilului din comprimate. În studiu au fost luate două tipuri de comprimate, cu concentra ia în enalapril maleat de 10 mg respectiv 20 mg/comprimat.

Tabelul 6.16. Datele experimentale ale determinării EM din comprimate

Tip comprimat

Masa medie

comprimat (g)

Mas ăpulbere

comprimat (g)

Arie pic

Concentra ia comprimat determinat (mg/compr)

Reg sirea (%)

Acceptat ( ± 7,5 %)

P1 (10 mg)

0,1687 0,6748 719,56 9,88 98,82

9,25-10,75 736,41 9,98 99,78 741,52 10,19 101,90

Media 10,2 100,6

P2 (20 mg)

0,1649 0,3298 720,24 19,78 98,91

18,5 -21,5 714,96 19,63 98,17 755,24 20,76 103,82

Media 20,03 100,16

6.3. Concluzii În urma comparării metodei propuse cu alte metode din literatură

s-a constatat că metoda are limita inferioară sub datele din literatură, iar limita de detec ie are valoare mai mică decât o serie de metode (0,3107

g/mL fa ă de 3,λ g/mL) iar timpul de reten ie este considerabil mai scurt, ceea ce sugerează o mai buna separare prin metoda propusă.

Page 16: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

6

Capitolulă 7.ă Elaborareaă iă validareaă uneiă metodeă deăelectroforez ăcapilar ăpentruădeterminareaăenalaprilului

7.1.ăMaterială iămetod Metoda constă în separarea i determinarea cantitativă a

enalaprilului prin electroforeză capilară utilizând sistemul de electroforeză Beckman Coulter P/ACE sistem MDQ, (Fullerton, CA, USA) echipat cu PC software 32 Karat versiunea 5.0. S-a urmărit stabilirea condi iilor cromatografice optime (tipul coloanei i condi ionarea acesteia, stabilirea lungimii de undă pentru detec ie, pH-ul i concentra ia optimă a electrolitului de migrare, tensiunea de la bornele electrozilor, timpul de injectare, presiune, temperatura autosamplerului) i validarea metodei electroforetice (liniaritatea, limita de detec ie i de cuantificare, precizia sistemului i a metodei, exactitatea metodei).

7.2.ăRezultateă iădiscu ii După studierea parametrilor electroforetici s-au stabilit

următoarele condi ii optime: capilara - silice topită (Beckman Coulter, USA) cu lungimea

totală de 67 cm, lungimea efectivă până la detector de 50 cm, i diametrul intern de 50 m;

electrolit de migrare - tampon fosfat pH = 7,0 (KH2PO4 şi Na2HPO4.12H2O, de concentraţie 0,067 M);

detec ie la lungimea de undă de absorb ie = 214 nm; tensiune - 25 kV; presiune - 35 mbar; timp de injectare hidrodinamic - 10 s; timp migrare - 11,9 min.

Fig.7.8. Electroforegrama enalaprilului în sistem tampon fosfat

pHă=ă7,0,ădeăconcentra ieă0,067 M

Page 17: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

7

Stabilitatea enalaprilul în solu ia electrolitului de migrare pH = 7,0 concentra ie 0,067 M, a fost analizată timp de ase zile la 4°C iar din electroforegrame s-au extras ariile picurilor i s-a calculat valoarea RSD = 1,9490 %, ce indică faptul că EM este stabil în electrolitul de migrare.

Metoda a fost validată conform reglementărilor de validare (ICH Harmonised Tripartite Guideline). Metoda este liniară pe domeniul de concentra ie 10 - 100 g/mL iar dreapta de calibrare este redată în fig. 7.λ.

Fig. 7.9.ăDreaptaădeăcalibrareăaădetermin riiăEMăprinăelectroforez ăcapilar

După injectarea consecutivă de zece ori a unei probe de enalapril de concentra ie 50 g/mL, datele experimentale ob inute au fost prelucrate statistic i s-a ob inut pentru devia ia standard relativă (RSD) valoarea 0,3864 ș care este mult sub limita admisă de 2 ș i astfel se poate afirma că sistemul de lucru este precis, fapt demonstrat i de valoarea RSD = 4,1743 % a timpului de migrare care este sub limita admisă de ± 5 ș.

În urma studierii preciziei metodei s-a stabilit pentru repetabilitate RSD = 1,7880 % iar pentru precizia intermediară RSD = 1,8590 %, valori mai mici 2 %. Rezultatele exactită ii metodei denotă că rezultatele analitice sunt apropiate de valoarea adevărată, regăsirea medie este de 100,91 %

7.3. Concluzii În compara ie cu pu inele metode de electroforeză capilară ce se

găsesc în literatura de specialitate, metoda propusă are avantajul unei limite inferioare miciμ 10 g/mL în compara ie cu 80 g/mL (1λ7) i limita de detec ie foarte scăzută (0,588λ g/mL) ceea ce permite determinarea EM din diverse probe. Un alt avantaj major al metodei este timpul de migrare scurtμ 11,8 min în compara ie cu tm = 19,9 min (199).

Arieăpică=ăă1984·ăConcentra iaă- 5635 r² = 0,9997

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 20 40 60 80 100 120

Ari

a pi

curi

lor

Concentra ia (mg/mL)

Page 18: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

8

Capitolul 8. Metode spectrofotometrice în UV-VIS de determinareăcantitativ ăaăenalapriluluiămaleat

8.1.ăMaterială iămetod Pornind de la caracterul analitic al enalaprilului au fost realizate

două metode spectrofotometrice de determinare în VIS, una prin formare de compus tip perechi de ioni cu tropeolina 00 în mediu acid i una prin formare de complex ternar cu albastru de bromtimol i clorura de cupru. Ambele metode se bazează pe extrac ia cantitativă în solven i organici nepolari. O metodă mai simplă de determinare a enalaprilului este reprezentată de analiza în UV a acestuia în sistem tampon fosfat pH = 4,0. Toate metodele s-au realizat la spectrofotometrul UV-VIS tip Hewlett Packard 8453 cu celulă de quartz (l = 1 cm). Pentru stabilirea condiţiilor optime de lucru s-a variat câte un parametru şi s-a observat efectul acestuia asupra absorbanţei produsului de reacţie. Validarea metodelor a fost realizată conform ghidurilor, urmărindu-se parametrii: liniaritatea, precizia sistemului i a metodei, exactitatea i selectivitatea. Aceste metode au fost aplicate la determinarea enalaprilului din comprimate.

8.2.ăRezultateă iădiscu ii La determinarea spectrofotometrică a enalaprilului utilizând

tropeolina 00, după studierea parametrilor care influen ează formarea compusului tip perechi de ioni s-a stabilit următoarea procedură de lucruμ la un volum de 1 mL EM se adaugă 2 mL soluţie tropeolină 00 de concentraţie 0,1ș, 0,5 mL solu ie acid clorhidric 0,01 M i 0,5 mL acetonă urmatǎ de agitare timp de 4 minute i extrac ie de două ori cu 2 mL diclormetan. După 20 minute se citeşte absorbanţa extractului organic reunit la lungimea de undă de 415 nm în cuvă de 1 cm faţă de un martor preparat în aceleaşi condiţii.

CH2

CH2

CH

COOC2H

5

NH CH

CH3

C

O

N

COOH

+NH

N N S

O

O

OH

+ HCl

CH2

CH2

CH

COOC2H

5

NH2

CH

CH3

C

O

N

COOH

+ NH

N N S

O

O

O

-

Fig.ă8.1.ăMecanismulădeăreac ieăpropusăîntreăenalaprilă iătropeolin ă00

Page 19: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

9

Analiza experimentală privind stabilitatea compusului format, indică că produsul este stabil pentru cel pu in 120 minute de la extrac ie.

Metoda este liniară pe domeniul de concentra ie 10 - 90 g/mL i are dreapta de calibrare: Absorbanța = , 4 ∙ Concentrația − , 86 coeficientul de regresie r2 = 0,9996, eroarea standard 0,0069, absorbtivitate molară 5,206·103 (mol/L·cm) i sensibilitatea Sandell 0,0106 ( g/cm2). Limita de detec ie 0,6191 g/mL iar limita de cuantificare 1,8760 g/mL.

Prin valoarea devia ie standard relative a preciziei sistemului (RSD = 0,7886 %) care este mult sub 2 ș ne indică faptul că sistemul are o înaltă precizie. Valori sub 2 ș pentru RSD au fost ob inute i la repetabilitatea metodei dar i la precizia intermediară. Rezultatele exactită ii metodei indică faptul că rezultatele analitice sunt apropiate de valoarea adevărată, regăsirea medie a EM este de 100,28 ș i variază în domeniul 98,20 - 102,37 %. Putem afirma că metoda este selectivă deoarece nu se observă nici un maxim de absorb ie care să interfere la lungimea de undă specifică compusului ob inut, 415 nm.

Metoda spectrofotometrică a fost aplicată la determinarea enalaprilului din comprimate. Au fost analizate două tipuri de comprimate ce con in substan ă activă de 10 mg respectiv 20 mg.

Fig. 8.6.ăSpectrulădeăabsorb ieăalăprobeiă iăalăstandarduluiădeăenalapril

Deoarece maximul de absorb ie al probei coincide cu al standardului (415 nm) i absorban ele sunt propor ionale cu concentra iile, acest fapt ne-a permis efectuarea determinărilor concentra iei EM din comprimate.

Wav elength (nm)350 400 450 500 550 600

Ab

sorb

an

ce (

AU

)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

EM_pr_50yg/mL

EM_std_30yg/mL

Page 20: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

10

Tabelulă8.19.ăDateleăexperimentaleăob inuteălaăanaliza EM din comprimateădeă10ă iă20ămg

Tip compri-

mat

Masa medie

comprimat (g)

Mas ăpulbere compri-mat (g)

Absor- ban a

Concentra ia comprimat determinat (mg/compr)

Reg sirea

(%)

Acceptat ( ± 7,5 %)

P1 (10 mg)

0,1683 1,683 0,5452 10,07 100,70

9,25-10,75 0,5388 9,95 99,54 0,5355 9,90 98,96

Media 9,97 99,74

P2 (20 mg)

0,1652 0,826 0,5365 19,83 99,14

18,5 - 21,5 0,5395 19,93 99,67 0,5241 19,39 96,96

Media 19,72 98,59 La determinarea spectrofotometrică a enalaprilului utilizând

albastru de bromtimol și clorura de cupru după studierea parametrilor care influen ează formarea complexului ternar s-a stabilit următoarea procedură de lucru: la un volum de 1 mL probă enalapril se adaugăμ 2 ml solu ie clorură de cupru 0,2 ș, 2 mL solu ie ABT 0,01 ș i 0,5 mL tampon pH = 8,0. Probele se agită timp de 5 minute apoi se realizează două extrac ii cu câte 1,5 mL cloroform. După 10 minute de la reunirea straturilor cloroformice se determină absorban a la lungimea de undă de 425 nm în cuvă de 1 cm, faţă de un martor preparat în aceleaşi condiţii.

Fig. 8.8.ăSpectreleădeăabsorb ieăpentruăABT,ăCuCl2,ăEMă iăcomplexulăternar

Absorbanţa produsului de reac ie poate fi citită după minutul 10

de la reunirea straturilor cloroformice până la minutul 30, pentru ca apoi complexul începe să se degradeze.

Wav elength (nm)300 400 500 600

Ab

sorb

an

ce (

AU

)

-0.025

0

0.025

0.05

0.075

0.1

0.125

0.15

EM

ABT

CuCl2

425 nm

Page 21: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

11

Metoda este liniară pe domeniul 200 - 500 g/mL, are coeficientul de regresie 0,9994, eroarea standard 0,0109 absorbtivitate molară 0,4442·103 (mol/L·cm) i sensibilitatea Sandell 7,58·10-4 ( g/cm2).

Prin valoarea devia ie standard relative a preciziei sistemului (RSD = 1,4571 %) care este sub 2 ș ne indică faptul că sistemul este precis. Valori sub 2 ș pentru RSD au fost ob inute i la repetabilitatea metodei dar i la precizia intermediară (1,84 % respectiv 1,60 %). Rezultatele exactită ii metodei indică faptul că rezultatele analitice sunt apropiate de valoarea adevărată, regăsirea medie a EM este de 103,1 ș i variază în domeniul λλ,λ2 - 104,85 %.

La determinarea spectrofotometrică în UV a enalaprilului după

stabilirea condi iilor optime s-a stabilit următorul mod de lucruμ la 1 mL probă enalapril preparat în tampon fosfat pH = 4,0 se determină absorban a la lungimea de undă de 208 nm în cuvă de 1 cm faţă de un martor format din solu ie tampon fosfat pH = 4,0.

Fig. 8.12.ăSpectrulădeăabsorb ieăalăenalapriluluiăînătamponăfosfatăpHă=ă4,0

Enalaprilul în tampon fosfat pH = 4,0 este stabil minim 24 ore. Metoda este liniară pe domeniul de concentra ie 1 - 16 g/mLμ Absorban a = , 6 ∙ Concentra ia + , 4

coeficientul de regresie r2 = 0,9996, eroarea standard 0,0069, absorbtivitate molară 3,0λ·104 (mol/L·cm) i sensibilitatea Sandell 0,062λ3 ( g/cm2). Limita de detec ie 0,0188 g/mL iar limita de cuantificare 0,0571 g/mL.

Prin valoarea devia ie standard relative a preciziei sistemului (RSD = 0,0564 %) care este mult sub 2 ș ne indică faptul că sistemul are o înaltă precizie. Valori sub 2 ș pentru RSD au fost ob inute i la repetabilitatea metodei dar i la precizia intermediară (1,0731 % respectiv 1,0654 %). Rezultatele exactită ii metodei indică faptul că rezultatele analitice sunt apropiate de valoarea adevărată, regăsirea medie a EM este

Wav elength (nm)200 250 300

Abso

rban

ce (

AU)

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tampon fosfat, pH = 4,0

208 nm, EM 5 yg/mLEM 5 g/mL

Page 22: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

12

de 100,68 ș i variază în domeniul λ8,λ5 - 102,71 ș. Putem afirma că metoda este selectivă deoarece nu se observă nici un maxim de absorb ie care să interfere la lungimea de undă, 208 nm.

Metoda spectrofotometrică a fost aplicată la determinarea enalaprilului din comprimate de concentra ie 10 mg respectiv 20 mg.

S-au trasat spectrele de absorb ie ale EM standard i EM probă.

Fig. 8.16.ăSpectrulădeăabsorb ieăalăprobeiă iăalăstandarduluiădeăenalapril

Deoarece maximul de absorb ie al probei coincide cu al standardului i absorban ele sunt propor ionale cu concentra iile, acest fapt ne-a permis efectuarea determinărilor concentra iei EM din comprimate. Tabelul 8.49.ăDateleăexperimentaleăob inuteălaăanalizaăEMădinăcomprimateădeă

Tip compri

-mat

Masa medie comprimat

(g)

Mas ăpulbere compri-mat (g)

Absor- ban a

Concentra ia comprimat determinat (mg/compr)

Reg sirea (%)

Acceptat ( ± 7,5 %)

P1 (10 mg)

0,1699 1,699 0,6037 9,82 98,15

9,25-10,75 0,5948 10,16 101,60 0,6037 9,98 99,79

Media 9,98 99,85

P2 (20 mg)

0,1687 0,8435 0,5976 19,79 98,95

18,5 - 21,5 0,6149 20,00 99,98 0,6012 20,33 101,67

Media 20,04 100,20 8.3. Concluzii Metodele spectrofotometrice dezvoltate sunt simple, economice i

pot fi aplicate cu u urin ă la proceduri analitice de rutină în vederea determinării enalaprilului din diverse forme farmaceutice.

Wav elength (nm)200 250

Abs

orba

nce

(AU

)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

EM (proba) 10 yg/mL

EM (std) 7 yg/mL

EM proba 10 g/mL

EM standard 7 g/mL

Page 23: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

13

Capitolul 9. Optimizarea caracteristicilor enalaprilului în vedereaăincluderiiăînăformeăfarmaceuticeăceăcedareămodificat

9.1.ăMaterială iămetod Metoda constă în ob inere a două filme polimerice încărcate cu

enalapril, utilizând tehnica de turnare i evaporare a solventului. Pentru a stabili interac iunile dintre polimeri i polimeri-enalapril s-a realizat analiza fizico-chimică (aspect macroscopic, punct de topire, solubilitate, comportament cromatografic, microscopie electronică de baleaj i analiză EDAX, analiza termogravimetrică, spectrometrie în UV, IR i 1H-RMN.). Pentru ambele filme s-a determinat gradul de încărcare a enalaprilului în film cât i uniformitatea filmului. Au fost realizate testele de dezagregare, dizolvare i hidratare in vitro pentru filmele polimerice ob inute.

9.2.ăRezultateă iădiscu ii La realizarea complexului enalapril - pululan în urma analizei

EDAX se observă în spectru prezen a azotului, lucru ce confirmă înglobarea enalaprilului în polimer (fig. 9.2).

Fig. 9.2. Analiza EDAX a complexului enalapril-pululan

Din analiza termogravimetrică a complexului enalapril-pululan se

constată că cel mai semnificativ pic din complex apare la 292, 61 ºC în timp ce în cei doi compu i componen i valorile sunt respectiv de 306, 73 în pululan i 344, 4λ în enalapril. Acest fapt sugerează că între cele două substan e s-au creat legături chimice slabe tip legături de hidrogen (conform datelor FTIR) sau legături fizice care determină labilizarea termică a solidului, acesta descompunându-se la temperaturi cu cca 15 ºC mai mici decât pululanul respectiv peste 50 ºC mai mult decât în cazul enalaprilului.

Page 24: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

14

Fig. 9.10.ăAnalizaătermic ăaăcomplexuluiăpululan - enalapril Deplasarea picului de la 173 ºC din cazul enalaprilului este destul

de puternică, acesta regăsindu-se la 79,59 ºC în complex pe curba DTG. Schimbarea de masă aferentă este de cca 1,2 ș i se poate datora fie descompunerii nucleului de prolină fie existen ei unor urme de solvent în compozit.

Afirma iile sunt sus inute i de analiza IR în care apar deplasări ale benzilor de absorb ie datorate grupării hidroxid din pululan precum i mic orarea considerabilă a picurilor datorate grupărilor tip carboxil, amidă din enalapril.

În fig. 9.11. este prezentată curba de calibrare i concentra ia medie a enalaprilului dintr-un cm2 film.

Fig. 9.11. Determinarea enalaprilului dintr-un cm2 film

Absorban a = 0,0633·Concentra ia - 0,0072 r² = 0,9995

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 4 8 12 16 20 24

Absorbanaă(AU)

Concentra iaă(μg/mL)

11,81

0,7404

Page 25: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

15

Rezultatele testului de dezagregare au eviden iat un timp de 14 secunde necesar dezagregării filmului polimeric. Conform recomandărilor Food and Drug Administration (FDA) acest timp este corespunzător formelor farmaceutice orodispersabile care trebuie să dezagrege în 30 secunde (243).

Rezultatele testului de dizolvare atât în apă distilată cât i la pH fiziologic sunt redate în fig.9.13.

Fig. 9.12. Graficul de cedare a enalaprilului din complexul enalapril-pululan:

Testul de dizolvare in vitro a confirmat rezultatele ob inute la

evaluarea solubilită ii complexului. Eliberarea enalaprilului încorporat în filmul polimeric s-a produs conform unei cinetici accelerate în ambele medii de dizolvare selectate. De altfel, men ionăm faptul că eliberarea i respectiv dizolvarea enalaprilului în apă a fost sensibil mai lentă fa ă de ritmul de desfă urare a acestor procese în mediu tampon fosfat pH = 7,4. Acest comportament poate fi atribuit constantei de disociere pKa a enalaprilului maleat. Practic după primele 5 minute de desfă urare a testului de dizolvare, filmul polimeric a eliberat 100,30 % enalapril în mediu de tampon fosfat i λ8,31 ș în apă. Aceste rezultate validează atât condi iile experimentale de realizare a testului de dizolvare in vitro cât i recomandarea privind oportunitatea utilizării acestor filme ca sisteme orodispersabile cu cedare rapidă pentru administrarea enalaprilului.

Page 26: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

16

La realizarea complexului enalapril - pululan - chitosan , din analiza EDAX putem urmări modificarea procentului de azot din filmul încărcat. Analiza EDAX a sistemului CS-P neîncărcat i încărcat cu enalapril este redată în fig. λ.15.

Fig. 9.14. Fig. 9.15.

Analiza EDAX pentru sistemele: (9.14) CS-PUă iă(9.15)ăCS-PU-EM În fig. λ.20. este prezentată curba de calibrare i concentra ia

medie a enalaprilului dintr-un cm2 film.

Fig. 9.20. Determinarea enalaprilului dintr-un cm2 film

Testul de dezagregare a condus la rezultate oarecum nea teptate.

Filmul polimeric CS-P-EM în contact cu apa, folosită ca mediu de dizolvare, nu a prezentat nici o tendin ă de dezagregare. În acest context am continuat studiul în maniera unui text de hidratare, având în vedere faptul că procesul de hidratare a filmului era vizibil i cu ochiul liber. Rezultatele ob inute au eviden iat o hidratare de peste 200 ș încă din primele 10 minute ale testului. Ulterior ritmul procesului de hidratare s-a diminuat

Absorban = 0,0633 x Concentra ia - 0,0072 r² = 0,9995

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 4 8 12 16 20 24

Absorban

(AU

)

Concentra ieă(μg/mL)

0,7475

11,92

Page 27: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

17

astfel că după primele 60 min am observat o cre tere a mase filmului de 233,33 ș iar după 12 ore de 2λ5,45 ș. Men ionăm că după 12 ore de desfă urare a testului de hidratare integritatea filmului polimeric s-a păstrat.

Testul de dizolvare in vitro a confirmat eliberarea enalaprilului încorporat în filmul CS-P-EM i aceste rezultate sunt redate în fig. λ.22.

Fig. 9.22. Eliberarea enalaprilului din filmul polimeric CS-PU-EM

Testul de dizolvare în vitro a confirmat eliberarea rapidă a

enalaprilului încorporat. Astfel după primele 8 minute ale testului, filmul CS-P-EM a eliberat peste 80 ș din cantitatea de enalapril încorporată, indiferent de mediul de dizolvare folosit (apă sau tampon fosfat pH = 7,4). După 15 minute eliberarea enalaprilului a fost de 100 ș pentru ambele medii de dizolvare.

9.3. Concluzii To i ace ti parametri fizico-chimici determina i ne permit să

subliniem eficien a realizării unor sisteme transportor pentru enalapril pe bază de pululan i chitosan-pululan în raport 1:1, utilizând tehnica de turnare i evaporare a solventului.

Page 28: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

18

CONCLUZII GENERALE

Teza de doctorat intitulată „Elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului i optimizarea caracteristicilor acestuia prin complexare cu polimeri bio-mucoadezivi” prezintă cercetările realizate în scopul instituirii i aplicării în practică a unor noi metode de dozare a enalaprilului maleat precum i realizarea, caracterizarea fizico-chimică i testarea unor sisteme transportor pe bază de pululan i chitosan în vederea includerii în forme farmaceutice cu eliberare modificată a substan ei antihipertensive studiate.

După instituirea metodei cromatografice de lichide de înaltă performan ă pentru separarea i dozarea enalaprilului, metoda a fost validată conform reglementărilor de validare recomandate pentru metodele HPLC, dovedindu-se a fi specifică, liniară, exactă, cu aplicabilitate ce a fost demonstrată prin analiza enalaprilului maleat din comprimate. Comparativ cu metodele HPLC din literatură, metoda propusă este mai rapidă i mult mai simplă.

Dezvoltarea i validarea metodei de determinare a enalaprilului prin electroforeză capilară este printre pu inele metode prezentate în literatura de specialitate. Metoda are avantajul utilizării unei coloane simple, neîncărcate i a unor reactivi nepoluan i în cantită i foarte reduse. În urma procesului de validare s-a stabilit că metoda este liniară pe un domeniu vast de concentra ie, este precisă i exactă iar prin valoarea scăzută a limitei de detec ie permite determinarea substan ei din diverse probe.

Performan ele analitice ale metodelor spectrofotometrice au fost comparate cu datele prezentate în literatura de specialitate. S-a constatat că la metoda de determinare spectrofotometrică a enalaprilului cu tropeolina 00, metoda este mai performantă din punct de vedere analitic în compara ie cu metodele ce au la bază principiul de formare al compu ilor tip perechi de ioni, fiind capabilă să detecteze enalaprilul la un nivel mai scăzut (LD = 0,61λ1 g/mL fa ă de LD = 3,07 g/mL). Metoda de determinare a enalaprilului care se bazează pe formarea unui complex ternar cu albastru de bromtimol i clorura de cupru este optimă pentru analiza enalaprilului din comprimate, deoarece este liniară pe un domeniu mare de concentra ie i utilizează reactivi mai pu in costisitori. Metoda spectrofotometrică de

determinare a enalaprilului cu tampon fosfat pH = 4,0 este foarte sensibilă, având cea mai scăzută limită de detec ie ce se găse te în literatura de

Page 29: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

19

specialitate (de 0,37 g/mL fa ă de 1,7 g/mL i 2,81 g/mL). Această metodă este foarte simplă i de rutină, prelucrarea probelor din comprimate este u oară, astfel încât î i poate găsi cu u urin ă aplicabilitate în laboratoarele de control al medicamentelor.

Pe baza structurii polimerilor lua i în studiu, dar i a caracteristicilor enalaprilului au fost ob inu i doi complec i în vederea includerii în forme farmaceutice cu cedare modificată. Din multitudinea de tehnici ce se utilizează în ob inerea de filme, a fost utilizată tehnica de turnare i evaporare a solventului, care s-a dovedit a fi eficientă. Pentru cele două filme ob inute, unul pe bază de pululan i cel de-al doilea pe bază de chitosan i pululan, s-au determinat o serie de parametri fizico-chimici pentru a stabili ce tipuri de interac iuni există i modul în care enalaprilul este dispersat în film. În vederea stabilirii modului de eliberare a enalaprilului din film (accelerat/lent) au fost efectuate teste de dezagregare i dizolvare în vitro. Pentru filmul realizat între enalapril i pululan,

rezultatele ob inute la testul de dezagregare îl recomandă ca film orodispersabil bio-mucoadeziv.

În ceea ce prive te filmul ob inut între enalapril i chitosan-pululan în raport 1:1, prin analiza FT-IR s-a eviden iat apari ia unor legături puternice ce determină o structură rezistentă a filmului, demonstrată i prin păstrarea integrită ii acestuia după realizarea testului de dezagregare. În urma dizolvării in vitro, enalaprilul a prezentat o cedare rapidă, cu o eliberare de 80 ș din cantitatea încorporată în primele 8 minute ale testului, iar eliberarea acestuia este totală după 15 minute. Aceste rezultate indică faptul că sistemul transportor pe bază de chitosan-pululan poate fi utilizat pentru enalapril în scopul de a genera o cedare rapidă i/sau prelungită a medicamentului pe diverse mucoase.

Din punctul de vedere al poten ialelor aplica ii în domeniul farmaceutic, aceste filme au arătat capacitatea de a încorpora, transporta i elibera rapid enalaprilul.

Rezultatele experimentale aduc o contribu ie importantă la analiza enalaprilului cu posibilitatea extinderii studiului la noi substan e din aceea i clasă terapeutică sau din alte clase.

Considerăm că prin studiul întreprins am reu it să atingem obiectivele propuse ini ial, iar prin rezultatele ob inute să aducem o contribu ie reală la analiza enalaprilului maleat din produse farmaceutice sub formă de comprimate, cu posibilitatea de a extinde sfera de aplicare a acestora i la determinarea enalaprilului din medii biologice.

Page 30: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

20

PERSPECTIVE DE CERCETARE 1) Având în vedere faptul că metoda de determinare a

enalaprilului maleat prin cromatografie lichidă de înaltă performan ă este selectivă, având capacitatea de separa atât lisinoprilul cât i benazeprilul, rezultate ob inute ne oferă perspectiva continuării cercetării. Astfel pentru lisinopril i benazepril se pot continua studiile ce ar presupune parcurgerea etapelor de validare pentru metodele HPLC i ulterior determinarea cantitativă din diverse probe. Pe lângă aceste substan ele din clase IECA ce au fost luate în studiu ne propunem introducerea altor medicamente din aceea i clasă antihipertensivă în scopul ob inerii unei metode unice care să furnizeze rezultate viabile pentru un număr crescut de IECA.

2) inând cont de faptul că enalaprilul posedă o grupare carboxil i o grupare amino secundară, cel de-al doilea capitol al păr ii

experimentale (capitolul 7) ne oferă perspectiva de determinare a enalaprilului pe diverse coloane încărcate pozitiv i negativ, continuând cu determinarea cantitativă a acestuia din forme farmaceutice.

3) Pentru toate metode dezvoltate i validate ne propunem analiza enalaprilului maleat din produse farmaceutice în care este asociat cu alte substan e medicamentoase, cum este hidroclorotiazida, lercanidipina sau nitrendipina.

4) Aplicarea metodelor dezvoltate la determinarea cantitativă a enalaprilului din medii biologice (ser, urină, plasmă, lapte matern, etc).

5) Rezultatele ob inute pentru ambele filme ne aduc noi perspective, cum ar fi cre terea concentra iei de enalapril pe unitatea de suprafa ă a filmului conform dozelor zilnice necesare, realizarea studiilor de permiabilitate i multe alte studii care să conducă la îmbunătă ire biodisponibilită ii substan ei medicamentoase.

Page 31: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

21

BIBLIOGRAFIEăSELECTIV

1. Kannel WB. Blood pressure as a cardiovascular risk factor: prevention

and treatment. JAMA 1996; 275(20): 1571-1576. 5. Wolf-Maier K, Cooper RS, Banegas JR, et al. Hypertension prevalence

and blood pressure levels in 6 European countries, Canada and the United States. JAMA 2003; 289: 2363–2369.

9. Franklin SS, Jacobs MJ, Wong ND, et al. Predominance of isolated systolic hypertension among middle-aged end elderly us hypertenives: analysis based on National Health and Nutrition Examination Survey(NHANES) III. Hypertension 2001; 37: 869-874.

16. Mancia G, Fagard R, Narkiewicz K et al. 2013 ESC/ESH Guidelines for the management of arterial hypertension. J Hypertension 2013; 31(7): 1281-1357.

18. Gherasim L, Doroban u M. Actualită i în hipertensiunea arterială. În: Gherasim L, Apetrei E. Actualități în cardiologie, Bucure tiμ Editura Medicală Almatea, 1λλ8.

24. Collins R, MacMahon S. Blood pressure, antihypertensive drug treatment and the risks of stroke and of coronary heart disease. Br Med

Bull 1994; 50(2): 272-298. 29. MacMahon S, Baigent C, Cutler J et al. Blood pressure loweting

treatment trialist's collaboration. Effects of different blood-pressure-lowering regimens on major cardiovascular events: results of prospectively-designed overviews on randomised trials. Lancet 2003; 362: 1527-1535.

35. Chobanian AV, Bakris GL, Black HR et al. Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. Hypertension 2003; 42: 1206-1252

41. Elliott P, Stamler J. Commentary: Evidence on salt and blood pressure is consistent and persuasive. Int J Epidemiol 2002; 31: 316-319.

48. Carrenho Queiroz AC, Kanegusuku H, Moraes Forjaz CL. Effects of resistance training on blood pressure in the elderly. Arq Bras Cardiol 2010; 95(1): 135-140.

57. Fyhrquist F, Saijonmaa O. Renin-angiotensin system revisited. J Intern

Med 2008; 264: 224-236.

Page 32: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

22

64. Wong J, Patel RA, Kowey PR. The clinical use of angiotensin converting enzime inhibitors. Prog Cardiovasc Dis 2004; 47(2): 116-130.

72. Berl T. Renal protection by inhibition of the renin-angiotensinaldosterone system. JRAAS 2010; 10(1): 1-9.

77. Ardeleanu E. Ghid terapeutic al medicamentelor în bolile

cardiace. Timi oaraμ Ed. Mirton, 1λλ7 79. Mallat SG. Dual renin-angiotensin system inhibition for prevention of

renal and cardiovascular events: do the latest trials challenge existing evidence? Cardiovascular Diabetology 2013; 12: 108-120.

88. Paul M, Ganten D. The molecular basis of cardiovascular hypertrophy: the role of the renin-angiotensin system. J Cardiovasc Pharmacol 1992; 19(S 5): S51-S58

95. Hirsch AT, Duprez D. The potential role of angiotensin-converting enzyme inhibition in peripheral arterial disease. Vasc Med 2003; 8(4): 273-278

99. Pitt B. Angiotensin-converting enzyme inhibitors in patients with coronary atherosclerosis. Am Heart J 1994; 128(6), 1328-1332.

112. Vitovec J, Špinar J. First-dose hypotension after angiotensin-converting enzyme(ACE) inhibitors in chronic heart failure: a comparison of enalapril and perindopril. Eur J Heart Fail 2000; 2: 299-304

128. Tauşer RG, Lupaşcu D, Profire L. Aspecte chimico-farmaceutice în

unele clase terapeutice: curarizante şi medicamente indicate în afecţiuni cardiovasculare. Iaşiμ Ed. Junimea 2006, 45-72

134. Lin SY, Wang SL, Chen TF, Hu TC. Intramolecular cyclization of diketopiperazine formation in solid-state enalapril maleate studied by thermal FT-IR microscopic system. Eur J Pharm Biopharm 2002; 54: 249-254.

141. Sakamoto Y, Sakamoto Y, Oonishi I, Ohmoto T. Conformational analysis of enalapril(MK-421) in solution by 1H and 13C NMR. J Mol

Str 1990; 238: 325-334. 157. Dubey SK, Kumar S, Mudakavi RJ. Development and validation of

UV-spectrophotometric method for determination of enalapril maleate. Int J Adv Pharm Sci 2010; 1: 375-380

164. Mallikarjuna S, Anwesh B, Sai BJNN et al. Visible spectrophotometric method for the estimation of enalapril maleate in tablet dosage forms. J Pharm Res 2011; 4(11): 4057-4059.

Page 33: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

23

175. Shah PN, Patel BN, Patel CN, Dave JB. RP-HPLC method of simultaneous estimation of enalapril maleate and lercanidipine HCl in synthetic mixture. Int J Res Pharm Chem 2011; 1(3): 308-314.

182. Hammouda ME, Abu El-Enin MA, El-Sherbiny DT et al. Simultaneous determination of enalapril and hydrochlorothiazide in pharmaceutical preparations using microemulsion liquid chromatography. J Chromatogr Sci 2014; 25.

1λ4. Roškar R,. Simončič Z, Gartner A, Kmetec V. Stability of new potential ACE inhibitor in the aqueous solutions of different pH. J

Pharm Biomed Anal 2009; 49: 295-303. 199. Hillaert S, Van den Bossche W. Optimization of capillary

electrophoretic separation of several inhibitors of the angiotensin-converting enzyme. J Chrom A 2000; 895: 33-42.

210. Mishra V, Vuppu S, Rath K. The role of microbial pullulan, a biopolymer in pharmaceutical approaches: A review. J Appl Pharm

Sci 2011; 1(6): 45-50 217. Jiang L, Li X, Liu L, Zhang Q. Cellular uptake mechanism and

intracellular fate of hydrophobically modified pullulan nanoparticles. Int J Nanomed 2013; 8: 1825-1834

231. Vasilescu M, pac AF, Zavastin D, Gherman S. Chimie fizică. Principii i experimente. Ia iμ Ed. Pim 2003μ 8-16.

243. FDA, Guidance for Industry Orally Disintegrating Tablets (FDA, Rockville, MD),www.fda.gov/cder/guidance/index.htm, December 2008

247. Fiege K, Lünsdorf H, Atarijabarzadeh S, Mischnick P. Cyanoethykation of the glucans dextran and pullulan: Substitution pattent and formation nanostructures and endtrapment of magnetic nanoparticles. Bleistein J Org Chem 2012; 8: 551-566

249. Prasad P, Guru GS, Shivakumar HR, Rai KS. Miscibility, thermal and mechanical studies of hydroxypropyl methylcellulose/pullulan blends. J Appl Polym Sci 2008; 110: 444-452.

251. Thanou M, Verhoef JC, Junginger HE. Chitosan and derivatives as intestinal absorption enhancers. Adv Drug Deliv 2001, 50(1): 91-101.

Page 34: elaborarea unor noi metode de determinare a enalaprilului și ...

24

DISEMINAREAăREZULTATELORăOB INUTE

Lucr riă tiin ifice

1. Gherman S, Zavastin D, pac A, Dorneanu V. Spectrophotometric determination of enalapril using tropaeolin 00. Rev Chim (Bucharest), 2013; 64(11): 1224-1228. (ISI, FI = 0,677).

2. Moglan (Gherman) S, pac A.F., Zavastin D, Dorneanu V. Spectrophotometric determination of enalapril through ternary complex formation. Rev Med Chir Soc Med Nat Iași, 2012, 116(3): 914-919. Comunic ri de tip poster

1. Gherman S, Dorneanu V. Cercetări analitice asupra enalaprilului. „50 de ani de învă ământ universitar farmaceutic la Ia i” 2011, Ia i, România.

2. Suditu AE, Gherman S, Alexa IF, Lutic D. Studiul încorporării unor medicamente antihipertensive în silice mezoporoasă de tip SBA. „Chimia-frontieră deschisă spre cunoa tere”, 2011, ed II, Ia i, România.

3. Gherman S, Zavastin D, pac A, Dorneanu V. UV spectrophotometric determination of enalapril maleate. 1st International U.O.C. - B.E.N.A. - Conference, 2013, Constan a, România.

4. Gherman S, Zavastin D, pac A, Dorneanu V. Contribu ii la dezvoltarea i validarea unei metode spectrofotometrice în vizibil pentru determinarea enalaprilului din comprimate. Congresul Na ional de Farmacie, ed. XV-a, Ia i, România.


Recommended