Editura Sfântul Ierarh Nicolae
ISBN 978-606-577-071-3 MICROSCOPIE GENERALÃ
Examinarea microscopicã a produselor alimentare şi furajere
Examinarea microscopicã este o metodã aplicatã pentru identificarea, pe baza
caracterelor microscopice caracteristice sau prin compararea cu o mostrã de
referinţã, a componentelor normale sau strãine din produsele alimentare sau
furajere. Aceste produse pot fi materii prime, adjuvanţi sau produse finite.
Prin component strãin se înţelege orice material diferit de structura normalã a
produsului, şi a cãrui prezenţã este condiţionatã de deficienţe de prelucrare,
depozitare sau transport a produsului respectiv. In aceastã categorie intrã materiale
de contaminare, rezultate în urma fenomenelor de descompunere (texturi degradate
în urma unor acţiuni de naturã parazitarã sau a unor fenomene fizico-chimice,
paraziţi sau fragmente ale acestora, etc.), materiale din mediul de prelucrare (nisip,
pamânt, fragmente de sticlă, ruginã, lemn, plastic, textile, metal, etc.) sau alte
corpuri organice sau anorganice (fragmente de insecte, fire de pãr, dejecţii ale
insectelor, pasãrilor sau animalelor, oase, pene, cristale, etc.).
Examinarea microscopicã are ca scop identificarea acestor componente prin
comparatie sau pe baza unor caractere identificabile la microscop. Acest mod de
examinare este facilitat de efectuarea unor teste suplimentare bazate pe reacţii
chimice şi care pot ajuta la confirmarea identitãţii structurilor examinate.
GHID DE EXAMINARE
MICROSCOPIC Ă
Florenţa Albu
Editura Sfântul Ierarh Nicolae
ISBN 978-606-577-072-0
- 2 -
Aparaturã si echipament de laborator
1.1 Microscopul de laborator
Existã o mare varietate de microscoape cu diferite destinaţii. Complexitatea
şi precizia cresc de la microscopul didactic la microscopul universal. Pentru
metodele de examinare microscopicã este utilizat microscopul compus echipat cu
luminã transmisã şi cu putere de mãrire de pânã la 1200 x. În figura 1 sunt
prezentate componentele principale ale unui microscop de laborator de
complexitate medie.
Fig. 1. Componentele principale ale microscopului de laborator
- 3 -
În general, microscopul de laborator este alcãtuit dintr-un suport (talpă) pe
care este fixat un braţ (sau stativ) care susţine tubul binocularului, revolverul
rotativ în care sunt montate obiectivele, o carcasã cu masa port-obiect şi
condensatorul. Carcasa conţine dispozitivele de deplasare fină, micrometrică, şi de
deplasare grosierã a obiectivului faţã de micropreparat (obiect). Cele două
dispozitive sunt controlate de verniere şi pot fi coaxiale sau separate. În funcţie de
tipul microscopului, deplasarea faţã de obiect se poate realiza prin deplasarea
verticalã a stativului (masa fixă) sau a mesei portobiect (stativul fix).
Deplasarea orizontalã a mesei, pe două planuri, se realizează cu ajutorul unui
dispozitiv solidar cu masa portobiect. În talpa microscopului sunt montate, de
regulã, sursa de lumină şi oglinda care direcţioneazã lumina la 900 spre
condensator (fig. 1). La partea superioarã a stativului se gãseşte un corp de legătură
care conţine o prismã deviatoare. Aceastã prismã modificã traseul fluxului
luminos pentru a face legătura între obiectiv şi ocular. La corpul de legãturã este
ataşat tubul binocular şi un ghidaj prismatic sau cu elemente de rostogolire în care
intrã revolverul cu obiectivele (fig. 1).
Preparatul pentru examinare care mai este denumit şi obiect, este aşezat de
regulã, pe o lamă portobiect din sticlă. Preparatul poate fi examinat direct sau poate
fi acoperit cu o lamelă din sticlă, de indice de refracţie (n) şi grosime standardizate
(d)1. Pentru acurateţea examinării este recomandatã numai utilizarea lamelor şi
lamelelor standardizate.
1 Valorile standard sunt d= 0,17 mm şi ni= 1,524 pentru lamele iar pentru lame d = 1 mm.
- 4 -
Fig. 2. Schema de principiu a dispozitivului optic al microscopului
1.1.1. Sisteme de iluminare cu câmp luminos (CL)
Preparatul microscopic (obiectul) poate fi examinat prin luminã transmisã
sau diascopică (în care obiectul este examinat prin transparenţă) sau prin luminã
reflectatã sau episcopică (în care obiectul este examinat prin lumina reflectatã de
cãtre acesta). Aceste metode de iluminare constituie sistemul de iluminare cu
câmp luminos. Dispozitivul de iluminare al microscopului este alcãtuit în
principiu, dintr-o sursã de luminã (S), condensatorul (C), diafragma de câmp (DC),
oglinda (O) şi diafragma de apertură (DA) care se gãseşte în tubul condensatorului.
Schema de principiu a dispozitivului de iluminare al microscopului este prezentată
în figura 2.
Elementele de focalizare a luminii primite de la sursa de iluminare sunt
oglinda (fig. 2) şi condensatorul (vezi fig. 1). Condensatorul este constituit dintr-un
ansamblu de lentile şi poate fi deplasat pe verticală cu ajutorul unui vernier.
Lumina care strãbate condensatorul poate fi reglată ca diametru al fluxului cu
ajutorul unei diafragme reglabile situate la nivelul condensatorului şi care este
denumitã diafragmã de apertură. Condensatorul, la unele microscoape, poate fi
reglat şi prin înclinarea axei verticale, iar de acest lucru se va ţine cont la reglarea
microscopului.
- 5 -
1.1.2. Obiective
Obiectivele (fig. 1) sunt fixate în revolver câte patru sau cinci (în funcţie de
tipul constructiv) şi au puteri de mărire diferite. Puterea de mărire este notatã pe
partea exterioară a tubului obiectivului, alături de apertura numerică
corespunzãtoare (spre exemplu un obiectiv de imersie are notaţia 100 x / 1.25).
Conform standardelor DIN/ISO, puterea de mărire a obiectivelor este codificată
pe tubul extern al obiectivului, sub forma unui inel de o anumită culoare. Codul
culorilor corespunzãtoare claselor de obiective este prezentat în tabelul 1.
Obiectivele pot fi de putere micã sau medie (2-43 x ) sau pot fi obiective de putere
mare (50-120 x). Obiectivele care necesită un mediu lichid între obiectiv si
preparat sunt denumite « obiective de imersie » iar cele obişnuite sunt cunoscute ca
« obiective uscate » (fig. 4). Obiectivele de imersie au un al doilea inel colorat în
funcţie de tipul mediului lichid care poate fi utilizat (sau recomandat) (vezi fig. 4 şi
tab. 1).
Fig. 4. Schema de comparaţie între obiective uscate şi de imersie şi
marcajele acestora.
Pe suprafaţa externã a tubului obiectivului se găsesc marcate indicative
referitoare la tipul obiectivului, lungimea acestuia, distanţa de lucru sau, la unele
tipuri, grosimea lamelei care poate fi utilizată. In tabelul 1 sunt indicate
proprietãţile obiectivelor în funcţie de tipul de corecţie. Acestea pot fi acromate,
- 6 -
semi-apocromate sau apocromate, în funcţie de gradul de corecţie cromaticã.
Lentilele obiectivelor acţioneazã asemănător cu un set de prisme cumulate, astfel
că la trecerea luminii spectrul este divizat în culorile componente. Acest fenomen
conduce la apariţia aberaţiilor cromatice şi implicit la scăderea calitãţii imaginii.
Calitatea imaginii este influenţatã şi de aberaţia sfericã produsã de lentilele care
compun obiectivele
Tipul obiectivului Aberaţie sfericã Aberaţie cromaticã
Pentru corectarea acestor aberaţii existã obiective cu combinaţii diverse de
lentile2 cu grad mãrit de dispersie. Cele mai simple sunt obiectivele plan acromate,
apoi obiectivele fluorit3 (sau semi-apocromate) şi apocromate. Gradul de corecţie
este notat pe tubul obiectivului, sub formã de indicativ (Achro, Apo, Plan, Plan
Apo, etc.).
1.1.3. Puterea de rezoluţie
Performanţele unui microscop sunt apreciate pe baza puterii totale de mãrire
şi a capacitãţii de rezoluţie a obiectivelor. Rezoluţia este un parametru care indicã
capacitatea de vizualizare distinctã a două puncte situate la distanţa invers
proporţionalã cu rezoluţia. Modul de calcul al rezoluţiei are la bazã urmãtoarea
formulã :
2 Aceste lentile sunt construite din sticlă cu compoziţie specialã. 3 Denumirea a fost pãstratã de la fluoritul care a fost utilizat iniţial ca material constructiv al lentilelor.
- 7 -
d = NA)2/1(
(1)
Unde : d = limita rezoluţiei = lungimea de unda a luminii transmise NA = apertura numerica
În tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile unor obiective mici, medii şi mari
(uscate şi de imersie). Pe tubul extern al unui obiectiv de 10 x , spre exemplu, se va
putea vedea notaţia 10 x/0.25 (cu inel galben) care indicã puterea de mãrire şi
apertura numericã corespunzãtoare. Din acelaşi tabel se poate observa distanţa
minimã dintre două puncte separate care pot fi vizualizate (puterea de rezoluţie).
Odatã cu creşterea puterii de mãrire, scade proporţional şi distanţa de lucru dintre
obiectiv şi lama portobiect. Din formula (1) de calcul a limitei rezoluţiei d, se poate
observa cã rezoluţia este invers proporţionalã cu lungimea de undã a luminii
transmise prin obiectul examinat. In acest fel, devine evident cã pentru obţinerea
unei rezoluţii cât mai bune, lungimea de undã a luminii transmise trebuie sã fie cât
mai micã (fig. 5).
Fig. 5. Relaţia dintre capacitatea de rezoluţie şi lungimea de undă
Lungimea de undã a luminii obţinutã de la becurile microscoapelor se
situeazã în jurul valorii de 550 nm. De regulã, pentru examinarea la microscop, se
utilizeazã un filtru albastru (ex. BG 33-BG 38) aşezat în calea fluxului luminos
înainte ca lumina sã ajungã la condensator. Utilizarea unui astfel de filtru ajutã
- 8 -
ochiul observatorului sã perceapã mai detailat
structurile observate la microscop. Existã şi alte
tipuri de filtre care au scopuri diferite. Astfel, filtrul
gri (ex. N 16) atenueazã intensitatea luminii
transmise fara a influenţa temperatura culorii (în
exemplul de mai sus codul filtrului indica capacitatea de reducţie N 16 = 100/16 =
6.3 %). Filtrul verde (ex. VG 9) mãreşte contrastul color al imaginii, ceea ce duce
la obţinerea unor detalii mai bune în special pentru microfotografii sau la
examinarea în fluorescenţã. Tab. 1
OBIECTIVE PENTRU MICROSCOAPE
Tipul de corecţie
Putere de mãrire (magnificaţie)
Apertura numericã (NA)
Distanţa de lucru (mm)
Codul de culoare al
obiectivului
Codul de culoare
suplimentar (imersie)
4 x 0.10 30.00 Rosu - 10 x 0.25 6.10 Galben - 20 x 0.40 2.10 Verde - 40 x 0.65 0.65 Albastru deschis - 60 x 0.80 0.30 Albastru cobalt -
Acromat
100 x 1.25 0.18 Alb - 0.5 x 0.02 7.00 - - 1 x 0.04 3.20 Negru - 2 x 0.06 7.50 Maron - 4 x 0.10 30.00 Rosu - 10 x 0.25 10.50 Galben - 20 x 0.40 1.30 Verde - 40 x 0.65 0.57 Albastru deschis -
50 x (ulei) 0.90 0.40 Albastru deschis Negru 100 x (ulei) 1.25 0.17 Alb Negru
40 x 0.65 0.48 Albastru deschis -
Plan acromat
100 x 0.90 0.26 Alb - 4 x 0.13 17.10 Rosu - 10 x 0.30 16.00 Galben - 20 x 0.50 2.10 Verde - 40 x 0.75 0.72 Albastru deschis -
40 x (ulei) 1.30 0.20 Albastru deschis Negru 60 x 0.85 0.30 Albastru cobalt -
100 x 0.90 0.30 Alb -
Plan fluorit
100 x (ulei) 1.30 0.20 Alb Negru 2 x 0.10 8.50 Maron - 4 x 0.20 15.70 Rosu - 10 x 0.45 4.00 Galben -
Plan apocromat
20 x 0.75 1.00 Verde -
- 9 -
40 x 0.95 0.14 Albastru deschis - 40 x (ulei) 1.00 0.16 Albastru deschis Negru
60 x 0.95 0.15 Albastru cobalt - 60 x (ulei) 1.40 0.21 Albastru cobalt Negru 60 x (apa) 1.20 0.22 Albastru cobalt Alb 100 x (ulei) 1.40 0.13 Alb Negru
1.1.4. Microscopul cu contrast de fazã (CF)
Pentru identificarea structurilor componentelor examinate este util
microscopul echipat cu contrast de fazã (fig. 6). In principiu, dispozitivul de
contrast de fazã introduce un inel de fazã, în calea fluxului luminos care ajunge la
preparat. In acest caz obiectul nu mai este iluminat prin transparenţă iar obiectul
apare iluminat intens pe un fond întunecat. Principiul contrastului de fazã prevede
cã lumina directã capãtã un defazaj
de 900 , intensitatea luminii directe
este micşoratã aproape comparabil
cu intensitatea luminii difractate şi
lumina difractatã interfereazã cu
lumina directã a cãrei intensitate
este micşoratã şi deplasatã în fazã.
La microscopul de acest tip,
condensatorul poate fi reglat şi ca
înclinaţie, în aşa fel încât lumina ajunge la obiect sub un anumit unghi de
incidenţã.
Un aspect deosebit de important pentru acurateţea observaţiilor la microscop,
este reglarea sau centrarea fluxului luminos care trebuie sa ajunga la obiectiv
perfect centrat. Aceasta se realizeaza prin ajustarea inclinaţiei oglinzii din talpa
microscopului cu ajutorul şuruburilor de ajustare.
- 10 -
Fig. 6. Reprezentare schematică a dispozitivului de contrast
Centrarea fluxului luminos se realizează prin îndepãrtarea geamului mat din calea
luminii şi vizualizarea4 filamentului (la becuri cu incandescenţã) sau a reţelei (la
becuri cu halogen sau fluorescente) (fig.7) :
a b
Fig. 7. a) Diferite tipuri de lãmpi : A-halogen B–Hg 50 C- Hg 100
b) Imaginea filamentului (bec cu incandescenţã) Oc 7 x –Ob 10 x
Pentru centrarea cu dispozitivul CF se regleazã condensatorul pentru
înclinaţie în plan vertical. In acest scop se foloseşte în locul unuia dintre oculare o
lunetã specialã cu care se poate vizualiza poziţia inelului de fazã. Reglarea se face
pânã la fixarea acestui inel în centrul câmpului vizual.
4 Aceasta reglare se efectueazã cu un ocular de 7 x şi un obiectiv de 10 x
- 11 -
1.1.5. Microscopul cu dispozitiv polarizant
În anumite situaţii, este necesarã examinarea cu luminã polarizatã. Faţã de
microscopul obişnuit, microscopul polarizant
simplu conţine un dispozitiv polarizor situat în
faţa condensatorului şi o lamă compensatoare ().
Cu ajutorul luminii polarizate se pot observa
materiale anisotrope organice sau anorganice, se
pot diferenţia cristale (fig. 8 A) sau fragmente de
sticlă (fig. 8 B). Substanţele anisotrope se caracterizeazã prin apariţia în câmpul de
examinare a culorilor de polarizare iar cele isotrope prezintã transparenţă
(extincţie) completã. De notat cã examenul cu lumina polarizatã se poate combina
cu observarea în contrast de fazã.
Fig. 8. A) Cristal în luminã polarizatã, B) Fragment de sticlă
- 12 -
1.2 Stereomicroscopul
1.3
Stereomicroscopul este compus, în principiu, din aceleaşi piese ca şi
microscopul, cu deosebirea cã examenul obiectului se face prin iluminare
reflectatã. Practic, este o lupã de examinare dar care are capacitatea de mãrire
mult mai mare.
Fig. 9 Stereomicroscopul de tip Wild
- 13 -
Stereomicroscopul poate avea o putere de mãrire de la 10 la ~250 x în funcţie de
aplicaţia la care este folosit. Puterea totalã de mãrire se calculeazã în mod identic
prin multiplicarea puterii ocularului cu cea a obiectivului. In cazul în care sunt
montate obiective suplimentare, puterea de mãrire a acestora se multiplicã cu
puterile ocularului şi obiectivului principal. La stereomicroscop, spre deosebire de
microscopul compus, piesa care este schimbatã este ocularul (10-32 x) în timp ce
puterea obiectivului este, în general, fixă5 (0.5-5.0 x). Ca şi în cazul microscopului,
obiectivele stereomicroscoapelor pot fi codificate color6 dupã puterea de mãrire a
acestora. Codurile si specificaţiile obiectivelor sunt prezentate în tabelul 2 : Tab. 2
OBIECTIVE PENTRU STEREOMICROSCOAPE7 Tipul de corecţie
Putere de mãrire (magnificaţie)
Apertura numericã (NA)
Distanţa de lucru (mm)
Codul de culoare al obiectivului
0.5 x 0.045 155 Roşu 0.75 x 0.68 117 Galben
1 x 0.09 84 Alb 1.5 x 0.14 50 Verde
Plan acromat
2 x 0.18 40 Albastru 0.5 x 0.066 136 - 1 x 0.13 54 - Plan apocromat
1.6 x 0.21 24 -
În figura 9 este reprezentată structura principală a stereomicroscopului de tip
Wild. La unele stereomicroscoape este prevãzutã şi posibilitatea iluminãrii
obiectului prin transparenţă, situaţie în care sursa de luminã este aşezatã sub masa
portobiect, într-un sistem asemãnãtor celui de la microscop. În acord cu cele
prezentate mai sus referitor la capacitatea de rezoluţie, la dispozitivul de iluminare
externã se va ataşa un filtru albastru care va facilita observarea detaliilor de pe
suprafaţa obiectului de examinat. Pentru examenul pe placa de sticlă este de
preferat sã se aşeze sub placã o hârtie de culoare neagrã pentru componente
deschise la culoare, sau una de culoare albã în cazul componentelor colorate sau
5 Existã stereomicroscoape la care se obţin magnificaţii în trepte prin rotirea unui cursor. 6 Existã şi producãtori care nu folosesc sistemul de codificare al obiectivelor. 7 Sunt prezentate specificaţii pentru obiective obişnuite, folosite în laboratoarele biomedicale.
- 14 -
negre8. Iluminarea se face de preferinţã cu o sursã de cel mult 30 W iar sursa poate
fi configuratã lateral, frontal sau combinat. Rezultate optime se obţin la iluminare
simultanã lateralã şi frontalã (fig. 10) :
Fig. 10. Schema de configurare a surselor de iluminare externã (combinatã)
Identificarea microscopicã
2.1 Pregãtirea examinării
Este esenţialã omogenizarea foarte atentã a probei de analizat. Examinarea
pentru identificare microscopică se realizează în câteva etape. Într-o prima etapă
are loc separarea fragmentelor pe baza dimensiunii acestora. Aceasta se realizează
prin separarea mecanicã prin filtrare, sitare, flotaţie sau selectarea vizualã. În cazul
în care este necesarã mãrunţirea mecanicã a unor granule sau conglomerate, se
poate face mojararea manualã sau mãcinarea în moara electricã. În acest caz,
trebuie însã ţinut cont de turaţia aplicatã pentru a nu fragmenta prea fin
componente care pot fi recunoscute macroscopic (se începe cu o turaţie micã
~1000-2000 r.p.m. timp de 5-10”). Fragmentele mai mari sunt apoi examinate la 8 Stereomicroscoapele sunt prevãzute cu un disc opac cu două suprafeţe (alb/negru) care acoperã masa. portobiect
- 15 -
stereomicroscop unde vor fi observate caracterele macroscopice (detalii de
suprafaţã, texturã) consistenţã (se încearcã fragmentarea prin presare), culoarea
particulelor, dimensiunile acestora, etc., aspecte care vor fi notate alãturi de
dimensiunea fracţiei analizate (ex. nr. sitei pe care s-a facut separarea).
2.1.1 Sitarea
Pentru separarea diferitelor componente prin sitare se folosesc două tehnici :
sitarea uscatã şi sitarea umedã. In primul caz se face sitarea amestecurilor uscate,
alcãtuite din componente de dimensiuni
diferite sau a amestecurilor obţinute prin
mãcinare şi uscare. In cazul sitãrii umede
se folosesc site cu diametrul de cel puţin
15-20 cm (cu ochiuri de 60, 100, 150
m)9. Sitarea se efectueazã sub curent de
apã caldã (50-600 C) menţinând sita la
~300 înclinaţie. In funcţie de natura componentelor separate, este opţionalã
adãugarea de detergent10, caz în care spãlarea se efectueazã pânã la îndepãrtarea
completã a spumei rezultate. Reziduul rãmas pe sitã este uscat şi apoi transferat
cantitativ cu o soluţie alcoolicã într-un pahar curat. Dupã separarea şi uscarea
reziduului obţinut, acesta poate fi supus unei etape de hidrolizã acidã sau bazicã.
2.1.2 Filtrarea
Filtrarea este utilizatã pentru separarea
suspensiilor fine din soluţii sau rezulate prin
umectarea reziduului rãmas la sitare. Pentru filtrare
se foloseşte hârtie de filtru de porozitate medie,
corespunzãtoare pentru majoritatea aplicaţiilor. In pentru iluminare externã şi un disc din sticlă matã, semitransparent, pentru iluminare transmisã. 9 Vezi Anexa 3. 10 In mod uzual se foloseşte un detergent anionic.
- 16 -
anumite cazuri, când sedimentul este foarte fin iar filtrarea dureazã prea mult, se
poate aplica filtrarea sub vid în pâlnie Hirsch sau în filtru ceramic. In situaţiile
când conţinutul de substanţe grase sau coloizi îngreuneazã filtrarea, se foloseşte
apa fierbinte pentru spãlarea filtrului11, iar în situaţiile când amestecul conţine
substanţe amidonoase se foloseşte soluţie fierbinte de HCl 1-2%.
2.1.3 Sedimentarea şi flotaţia
Separarea fragmentelor pe baza densitãţii acestora, se face utilizând tehnica
sedimentului de concentrare. Aceasta constã în separarea fragmentelor prin
suspendarea amestecului într-un volum de solvent cu densitate mare (cloroform,
clorura de metilen, tetracloretan). Pentru separarea sedimentului, proba este
suspendatã în solvent într-o pâlnie de separare. Dupã omogenizare fragmentele
uşoare (cu densitate mai micã) vor flota iar fragmentele mai grele vor rãmâne în
sediment. Prin îndepãrtarea solventului cu elementele flotante va ramâne
sedimentul concentrat care va examinat sistematic pentru identificarea
componentelor sale. Partea flotantã este examinatã dupã îndepãrtarea solventului
prin uscare. În general componentele pãrţii flotante sunt reprezentate de structuri
cu densitate micã : ţesuturi vegetale, fire de pãr, ţesut muscular deshidratat,
fragmente de elitre ale unor insecte, etc. Separarea
fragmentelor pe baza dimensiunii se poate face atât
din proba ca atare sau din fracţiile de la
sedimentarea cu solvent. Aceastã separare se
efectueazã cu ajutorul sitelor standard cu
dimensiuni diferite ale ochiurilor. Numerotarea
sitelor poate fi fãcutã dupã standardul ISO sau
standardul USA. În Anexa 3 sunt prezentate
11 In funcţie de metoda utilizatã se pot folosi şi solvenţi organici care dizolvã grãsimile şi uşureazã filtrarea.
- 17 -
deschiderile nominale ale sitelor standard corespunzãtoare celor 2 standarde de
numerotare12.
2.2 Examinarea microscopica13
Dupã obţinerea fracţiilor prin diverse metode de separare, pentru completarea
observaţiilor, se va face apoi examinarea la stereomicroscop şi/sau la microscop.
Pentru obţinerea unui preparat microscopic obiectul trebuie secţionat sau
fragmentat la dimensiuni de ~0.1-0.3 mm. Fragmentele astfel obţinute pot necesita
apoi un tratament chimic pentru clarificarea structurii.
Fig. 11. Sigilarea lamelei peste preparatul microscopic.
Agenţii de clarificare utilizaţi au proprietăţi diferite (vezi Anexa 2- reactivi),
cei mai utilizaţi fiind cloralhidratul, glicerina sau parafina. Aceste substanţe au în
general densitate şi vâscozitate mare, ceea ce face ca porii şi canaliculele sã nu
poata fi penetrate prin capilaritate, devenind astfel mai vizibile (rãmân umplute cu
aer şi apar negre) fapt care ajutã la identificare. Pentru clarificarea texturilor mai
dure (ex. cu celuloza, lignina) este necesar un tratament prin hidrolizã acidã iar în
cazul substraturilor proteice, un tratament prin hidrolizã bazicã. Dupã clarificare se
executã preparatul între lamă şi lamelă şi care poate fi apoi examinat la microscop.
12 Vezi pagina 37. 13 Aplicatia nu se refera la examenul histologic cu preparat obtinut la microtom
- 18 -
Pentru fixarea14 lamelei atunci când se efectueazã examinarea repetatã, se poate
prepara un amestec15 de ulei de parafina cu parafină solidã (1 :1) se încãlzeşte la
700 C pe baie de apã pânã la lichefiere şi apoi se aplicã pe marginile lamelei (vezi
figura 11). Pe o lamă pot fi delimitate 2 câmpuri la care se pot aplica agenţi de
clarificare sau colorare diferiţi (de exemplu un câmp pentru reacţia cu iod, etc.) sau
unul dintre cãmpuri va fi cu un preparat de referinţã.
2.3 Reacţii chimice de confirmare
În foarte multe situaţii este utilă colorarea preparatului (vezi Anexa 2 şi
metodele de lucru). Colorarea16 se face pentru deosebirea matricelor cu proprietăţi
diferite, cum sunt grăsimile, cerurile, glucidele complexe, ţesuturi osoase. Pentru
sãrurile minerale existã o serie de teste chimice ale cãror rezultate sunt reacţii
vizibile sau coloraţii specifice ionilor care reacţioneazã. Rezultatul unui singur test
chimic nu va putea fi considerat aplicabil decât în corelaţie cu alte teste şi cu
caracterele microscopice observate. Pentru maximã acurateţe, un reactiv nu va fi
aplicat unui grup de fragmente şi reacţiile vizibile sunt urmãrite sub
stereomicroscop pentru observare imediatã. În acest scop, se pune pe o lamă de
sticlă o picatura de reactiv şi apoi sub stereomicroscop se împinge particula în
picãtura de reactiv (fig. 12) cu ajutorul unei spatule sau pense. Reacţia se noteazã
şi se comparã cu un rezultat cunoscut.
Fig. 12. Efectuarea reactiilor chimice pe lama de examinare
14 Existã mai multe tipuri de montanţi disponibili comercial. 15 Un alt amestec util este combinaţia de glicerina –gelatina. 16 Sunt excluse aici coloratia vitala sau alte tipuri de colorare utilizate în histopatologie
- 19 -
2.4 Numãrãtori efectuate la microscop (stereomicroscop)
Numãrarea presupune trecerea sistematicã peste preparat. În microscopie
acest lucru se realizeaza prin utilizarea lamelor care au câmpuri delimitate pentru
numãrare. Aceste câmpuri au forma de pãtrat (sau câmpuri dreptunghiulare) la
care se cunoaşte exact dimensiunea laturilor. Numãrarea începe de regulã de la
colţurile câmpului şi se face o trecere succesivã în zig-zag pentru evitarea
numãrãrii repetate a aceleiaşi particule (fig. 13) :
Fig. 13. Numãrarea prin trecerea succesivã prin fiecare câmp
2.5 Mijloace de mãsurare
Mãsurarea structurilor, vizualizate la microscop sau la stereomicroscop, este
utilã atât pentru caracterizarea acestora, cât şi
pentru compararea cu preparate de referinţă. Pentru
mãsurare existã oculare care au prevăzut un
micrometru de mãsurare a cãrui scalã gradatã este
vizualizatã prin ocular. Pentru calibrarea acestor
micrometre oculare se utilizeaza micrometrele de masă (sau de câmp). Un astfel de
micrometru este construit sub forma unei plãcuţe metalice (pentru
stereomicroscop) sau din sticlă transparentã (pentru microscopul cu luminã
- 20 -
transmisã) pe care se gãseşte o scalã de 10 mm gradatã la 0.1 mm. Privind prin
ocularul cu micrometru se suprapune imaginea micrometrului peste cea a
micrometrului de masã. Prin comparare se mãsoarã echivalenţa în gradaţii a
micrometrului ocular (fig. 14). Dacã, spre exemplu, s-au numãrat 3 gradaţii de 0,1
mm de pe micrometrul de masã corespunzătoare prin suprapunere la 1 gradaţie pe
micrometrul ocular, rezultã cã pentru fiecare gradaţie de pe micrometrul ocular
corespund 0,3 mm în câmpul vizual.
Fig. 14. Ajustarea micrometrului ocular cu micrometrul de masã
Pentru microscop, o modalitate simplã de calibrare a micrometrului ocular
este utilizarea unei camere de numãrare, care poate fi gãsitã în majoritatea
laboratoarelor medicale. Camerele de numãrare sunt prevãzute cu o reţea de
precizie, la care se cunosc exact dimensiunile orizontale ale ochiurilor reţelei ( de
la 0,05 la 0,25 mm) şi adâncimea (de la
0,1 la 1 mm) ceea ce asigurã
posibilitatea de numãrare pe unitatea
de volum. Cele mai cunoscute camere
de numãrare sunt hemocitometrele
utilizate pentru numãrarea celulelor
sanguine. Hemocitometrele sunt utilizate, în general, pentru mãsurarea şi
numãrarea de particule cu dimensiuni mai mici de 50-100 m. In figura de mai jos
sunt prezentate reţelele de la trei modele de camere de numãrare utilizate pentru
- 21 -
numãrarea şi mãsurarea celulelor, bacteriilor, granulelor de polen, sau a altor
particule de mici dimensiuni.
Fig. 15. Aspectul şi dimensiunile reţelelor la diferite tipuri de hemocitometre
Ocularele de microscop specializate pot fi cu micrometru simplu sau cu reţea.
Micrometrul ocular, la majoritatea modelelor, constã dintr-o scalã de 10 mm
subdivizatã în 8, 10 sau 100 diviziuni. Micrometrele specializate pentru mãsurarea
particulelor sau fibrelor pot avea marcaje ajutãtoare pentru mãsurãtori
bidimensionale. In lipsa micrometrelor se
poate utiliza dimensiunea relativã a câmpului
vizual observat de utilizator, ţinând cont de
puterea de mãrire a obiectivului ales. Cu un
obiectiv de 10 x şi un ocular de 10 x ( total 100
x) diametrul câmpului vizual este de
aproximativ 1600 m (fig. 16). În cazul în care vom trece la un alt obiectiv se
poate face un calcul rapid : spre exemplu la un obiectiv de 40 x (400 x) se va
calcula 100/400 x 1600 = 400 m. În acest caz diametrul câmpului vizual va fi de
~400 m.
- 22 -
Fig. 16. Diametrul aproximativ al câmpului vizual la microscop. Mãsurarea poate fi efectuatã şi pe verticalã (în adâncime) pentru aprecierea
grosimii sau înãlţimii structurii examinate. În acest caz trebuie însã ca partea cea
mai înaltã şi partea cea mai joasã a preparatului sã poatã fi bine focalizate.
Diferenţa de înãlţime se apreciazã pe baza gradaţiilor de pe viza fină ( ~ 3 m)
(vezi fig. 16). Pentru mãsurarea exactã (realã) trebuie cunoscut şi indicele de
refracţie al obiectului, folosind formula de mai jos :
n0
d (real) = d’ (2)
ni
unde : d (real) = grosimea realã a obiectului d’= diferenţa de focalizare (gradaţia de pe viza fină) n0= indicele de refracţie al obiectului ni = indicele de refracţie al mediului dintre lama portobiect şi obiectiv (aer= 1)
Fig. 16. Elementele de mãsurare pe orizontalã şi în adâncime (la două modele de microscop).
- 23 -
În mod particular, structuri de mai mari dimensiuni pot fi mãsurate şi cu
ajutorul vernierelor gradate ( 0,01-0,02 mm) care sunt dispuse pe cele două axe ale
mesei port obiect (fig. 16). Pentru stabilirea reperului vizual în câmpul microscopic
trebuie folosit un ocular cu scalã. Prin deplasarea reperului faţã de obiectul
examinat, se stabilesc puncte pe vernierele gradate ale mesei port-obiect, obţinând
astfel valori de mãsurare.
2.5.1 Mãsurarea microfotograficã
În cazul microscoapelor la care se pot realiza imagini digitale ale preparatelor,
existã posibilitatea efectuãrii de mãsurãtori cu ajutorul programelor dedicate
acestui scop. Atunci când se utilizeazã imaginile digitale trebuie sã se ţinã cont de
puterea de mãrire a ocularului şi respectiv a obiectivului dar mai ales de valoarea
de zoom optic sau digital utilizatã. De preferat este sã se utilizeze capturi de
imagine direct, fără a utiliza capacitatea de mãrire a camerei. In figura 17 este
exemplificat modul de obţinere al imaginii digitale utilizate pentru mãsurare.
Microscoapele la care se ataşeazã camere foto digitale sunt prevãzute cu un un al
treilea tub ocular configurat pentru acest scop. Existã diverse programe pentru
captura şi prelucrarea microfotografiilor. Pentru obţinerea imaginilor utile este
esenţialã stabilirea raportului contrast/luminozitate iar în cazul în care imaginile
trebuie sã fie color este necesar un obiectiv de tip apocromat (vezi tab. 1).
Fig. 17. A –imagine corectã ; B -imagine la care s-a utilizat puterea de mãrire a obiectivului camerei de luat vederi.
- 24 -
2.6. Etapele examinării simple la microscop
Pentru utilizarea mai facila a microscopului, sunt recomandaţi urmatorii pasi de
execuţie :
1. ALEGEREA OCULARULUI ( 7 x 10 x 16 x )
2. ALEGEREA OBIECTIVULUI ( se începe cu un obiectiv mic - obiectiv de 10 x )
3. FIXAREA LAMEI CU PREPARAT PE MASA PORT-OBIECT
4. FIXAREA CONDENSORULUI LA PUTERE MAXIMA
5. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA ¾
6. PRIVIND IN BINOCULAR SE APROPIE OBIECTIVUL CU VIZA GROSIERA
7. IMAGINEA APARUTA SE CLARIFICA CU VIZA FINA
8. SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA 1/1 (COMPLET)
9. SE REGLEAZA INTENSITATEA LUMINII DIN CONDENSOR (VERTICAL)
10. SE SCHIMBĂ OBIECTIVELE PE RÂND LA 20 x, 40 x
11. IMAGINEA SE CLARIFICĂ CU VIZA FINĂ
- 25 -
GHID DE IDENTIFICARE MICROSCOPICĂ
3.1 Identificarea seminţelor de buruieni şi plante toxice
3.1.1. Cereale şi seminţe furajere întregi
Seminţele de buruieni şi plante toxice constituie impuritãţi botanice
care pot constitui un risc pentru producţia şi sãnãtatea animalelor, atunci
când se gãsesc în dieta acestora. După standardele de stat17, impurităţile sunt
catalogate ca şi corpuri strãine care sunt clasificate în corpuri inerte
(pãmânt, praf, paie, pleavã, etc.) şi amestec de alte seminţe de culturã şi
seminţe de diferite buruieni, etc. Corpurile strãine se determinã cantitativ,
trecând proba printr-un sistem de cel puţin 4 site cu ochiurile de 3.0-2.0-1.0-
0,5 mm în diametru, cantitãţile obtinute prin sitare se cântãresc şi se
exprimã procentual, ca total corpuri strãine şi separat pe tipuri şi mărimi.
Proba luatã în analizã depinde de mãrimea seminţelor (grãunţelor):
pentru cele mari (porumb, mazãre, soia, etc.), proba va fi de 100-200 g,
pentru cele mijlocii (orz, ovãz, secarã, etc.) de 50 g, iar pentru cele mici
(mei, in, etc.) de 10-25 g. Pentru a determina semintele (grãuntele) atacate
de dãunãtori, se asazã proba pe o coala de hârtie, examinând integritatea lor
(cu ochiul liber sau cu stereomicroscopul); cu aceastã ocazie se constatã si
17 Vezi Anexa 5 –Standarde pentru seminte.
- 26 -
prezenta insectelor (si fragmente ale acestora) sau a diferitelor larve in
probã.
Cereale atacate de dãunãtori
In general, se admit urmãtoarele proporţii de corpuri strãine (%), pe clase de
puritate, în functie de tipul seminţelor : Ovaz Orz Porumb Secara
Clasa de
puritate
Corpuri
inerte
Al t e
seminte
Corpuri
inerte
Alte
seminte
Corpuri
inerte
Al te
seminte
Corp uri
inerte
Al t e
seminte
I
1
2
2
2
1
2
1
2
II
1-3
2—4
2—4
2-5
1—2
2-3
1-2
2—3
III
3
4
Article I.
5
2
3
2
3
Seminţele speciilor de plante toxice sau dãunãtoare nu sunt acceptate decât
- 27 -
în limitele maxime indicate in Anexa DC 32/2002/EC. Semintele de
buruieni se vor indica procentual, dupa felul lor (se indicã specia) ca si
proportia de seminţe seci, sistave, sparte, etc., care aparţin culturii de
provenienţã a probei. Acestea din urmã au caracter limitativ ca impuritãţi
vegetale (organice).
3.1.2. Uruieli si amestecuri mãcinate
În general, uruielile au aceleasi însuşiri ca si grãunţele (seminţele) din
care provin, dar uneori survin cauze care le depreciazã, de exemplu, în
timpul uruirii pot pãtrunde în ele corpuri strãine (praf, corpuri metalice,
etc.), pot fi pãstrate in conditii necorespunzatoare, sau chiar pot fi falsificate
prin adãugare de produse calitativ inferioare18. Corpurile strãine (%) indică
puritatea probei. Corpurile metalice pot fi separate şi cu ajutorul
electromagnetilor. In general, suspendarea probei măcinate într-un solvent
(cloroform, tetracloretan) cu densitate mare conduce la separarea sedimentului
concentrat constituit in principal din partea grea a probei care contine corpurile
straine minerale, metalice şi ţesuturile vegetale lignificate. Seminţele de
buruieni, de plante toxice, sporii de mucegai (scleroti, etc.) se identificã prin
examinarea directã, la stereomicroscop, a probei asezatã pe un fond alb.
18 Spre exemplu, adaosul de tarâte sau coji mãcinate.
- 28 -
Mod de lucru general
Domeniu de aplicare
Aceasta procedurã se poate utiliza acolo unde detectarea si identificarea
semintelor, fragmentelor acestora si a altor componente vegetale din amestecuri
furajere, se efectueaza prin examen macro/microscopic pe baza caracterelor tipice.
Echipament si accesorii (Vezi Anexa 1).
Reactivi (vezi Anexa 2).
A. Pregătirea probei
Este necesarã, în prealabil, o foarte bunã omogenizare a probei. Se iau cel putin
500 g de probã care se omogenizeazã cu ajutorul omogenizatorului-divizor.
Din cantitatea omogenizată, o fractie de 5-10 g se întinde în strat subţire pe o foaie
de hârtie si se examineazã cu ochiul liber (de preferinţã in lumină naturalã). Pentru
o examinare mai atentă, se poate utiliza o lupã de birou. În cazul dispersiei de
componente foarte diferite (corpuri străine foarte mari) se efectuează sitarea probei
pe site cu ochiuri cu Ø de la 3-0,1 mm. Fragmentele mari (vizibile cu ochiul liber),
de forme sau culori diferite se selecteazã cu penseta pentru examinarea ulterioara la
stereomicroscop19. Fracţiile de pe site se cântaresc (0.001g) si se noteazã alãturi
de numãrul sitei corespondente (diametrul ochiurilor) pentru a putea fi exprimate
19 Aparatura este listata in Anexa 1.
- 29 -
procentual. În lipsa omogenizatorului20, se iau 200 g proba care se întinde în strat
uniform de cel mult 1 cm înãlţime, pe o coalã de hârtie albã. Proba se
uniformizează cu ajutorul unei rigle sau spatule şi se formatează în formã de pãtrat.
Cu ajutorul riglei se împarte în 16 pãtrăţele aproximativ egale. Se aleg 8 pãtrate în
« sah » care se separã de restul grãmezii si se amestecã. Se repetã operaţiunea pânã
la obţinerea unei probe de aproximativ 200 g.
B. Examinare generalã
Proba omogenizatã se întinde în strat subţire21 pe o tãviţã şi se examinează cu
ajutorul lupei. Seminţele identificate sunt apoi examinate la stereomicroscop unde
se noteazã dimensiunile, culoarea, forma şi aspectul capsulei. La foarte multe
specii ornamentaţia capsulei permite identificarea. Este utilã secţionarea seminţei
longitudinală/transversalã cu ajutorul unui bisturiu sau lame şi separarea stratului
aleuronic ataşat capsulei. Examinarea la microscop22 a capsulei poate da indicaţii
asupra speciei in funcţie de forma şi dispunerea celulelor în straturi. Pentru
fragmentele de seminţe, o micã porţiune de probã (sau fracţia de pe sită) se
amestecă cu puţină apã şi se examinează la stereomicroscop in lumină normală. 20 Sau in prezenta corpurilor straine mari. 21 Stratul nu trebuie sa fie mai gros decât inaltimea a trei seminte suprapuse.
- 30 -
Aceasta examinare poate da informaţii generale despre compoziţia amestecului. De
multe ori se pot identifica astfel fragmente de ţesuturi vegetale, seminţe întregi mai
mici, fragmente lemnoase, etc. În cazul unor componente care necesită
identificare, se face la stereomicroscop caracterizarea generalã prin notarea
dimensiunilor, culorii, texturii şi a consistenţei. Este esenţială cunoaşterea
caracterelor seminţelor plantelor de culturã pentru a putea face diferenţierea între
acestea şi seminţele nedorite.
Teste chimice orientative23
Prezenţa seminţelor toxice se poate stabili şi prin probe de culoare
orientative: o probã mãcinatã (sau uruialã) se introduce intr-un balon
Erlenmeyer, iar peste ea se introduce un amestec de 100 parti alcool etilic
(70°) si 5 parti acid clorhidric; amestecul se fierbe, se agitã si se lasa apoi în
repaus pentru sedimentare ; culoarea lichidului se va modifica dupa felul
semintelor de plante toxice continute; dacã proba nu contine seminte toxice,
lichidul de deasupra este incolor sau slab gãlbui, dacã contine cornul secarii,
lichidul are culoarea cãrnii, dacã conţine seminte de Agrostema githago, sau de
Lolium temulentum, lichidul de extracţie are culoarea oranj. Se mai poate
efectua şi examenul de flotaţie cu cloroform, în care semintele se stratificã
diferit, dupã greutatea lor. Pentru aceasta, se introduce o cantitate de 2-5 g
proba într-o eprubetã, se trateazã cu cloroform, se agitã eprubeta, apoi se lasã
pentru sedimentare; neghina (Agrostema githago), fiind grea, cade la fundul
eprubetei sub formã de particule de culoare neagrã; cornul secãrii (Claviceps
spp.) rãmâne la suprafatã, tot sub formã de particule de culoare neagrã; alte
seminte se situeaza la nivele diferite, avind culori diferite, astfel cã pot fi
separate si identificate.
22 Cu coloratie sau pentru examen in lumina polarizata. 23 Vezi Anexa 3.
- 31 -
Pentru a determina nisipul, praful sau alte particule de origine mineralã, se
trateazã proba, într-o eprubetã, cu solutie de clorura de zinc, apoi se agitã.
Corpurile inerte vor cadea la fundul eprubetei, iar particulele organice rãmân la
suprafata ; dupa decantare se separã depozitul de nisip, se usuca, se cântãreste
si se exprimã procentual. Nisipul se mai poate determina astfel : se ia o.proba
de circa 20 g uruieli, se introduc într-un pahar înalt si îngust, se trateazã cu apã,
pâna la înãltimea de 3/4 din pahar; se agita apoi continutul cu o baghetã de
sticlã si dupã decantare se îndepãrteazã cu atentie apa tulbure; se repetã
operatia de spãlare pânã se obtin ape limpezi, reziduul mineral se usuca, se
cântãreste si se exprimã procentual.
În cazul particulelor de mici dimensiuni sau a celor rezultate din fragmentarea
unei piese mai mari se fac preparate pe lama pentru examenul la microscop. In
acest caz dimensiunea particulelor trebuie sa fie ajustata la mai putin de 0.1-0.3
mm. Examenul la microscopul compus se face în luminã normalã (filtru albastru)
si cu dispozitivul de contrast. Textura observată (celule, formaţiuni structurale,
etc.) se poate caracteriza suplimentar prin teste chimice efectuate pe preparat.
Pentru identificarea amidonului, pe lama de examinare la microscop se aşează la
una dintre margini (la nivelul îmbinării cu lamela) o picătură de soluţie de iod(5) si
se examinează din nou preparatul. Granulele de amidon vor fi colorate in albastru-
albastru inchis, celuloza din fragmente in galben iar proteinele in galben –maroniu.
Identificarea amidonului, spre exemplu, intr-o probă mãcinatã de seminţe de
oleaginoase24, indicã prezenţa altor seminţe. Toate detaliile observate sunt notate.
În acelasi mod se face testul cu solutie de KOH(10). Tratamentul alcalin produce
gelatinizarea granulelor de amidon, dizolvă proteinele şi saponifică grăsimile. În
acelaşi timp accentuează coloraţia roşietică produsă de taninul din ţesuturi şi
clarifică preparatul. Dacă acest tratament nu este suficient pentru clarificarea
preparatului, se utilizează tratamentul cu agent de clarificare I (3) pentru 2-3 ore sau
o cantitate redusă de probă se amestecă cu agentul de clarificare II (4) se încãlzeşte 24 Semintele de oleaginoase nu contin amidon.
- 32 -
uşor pe lamã şi apoi se examineazã. Pentru separarea substanţelor celulozice, se
macerează proba cu amestec de clorat de potasiu-acid azotic (11) şi se încălzeşte
timp de 20-30’. Celuloza brută se deosebeşte de substanţele de infiltrare (lignina,
suberina) prin adãugare de soluţie proaspãt preparată de iod (13) unei fracţii de
probă umezită in prealabil. Substratul celulozic se va colora în albastru iar
substanţele de infiltrare in galben.
Substantele grase, răşinile, uleiurile, cerurile din componenţa celulelor
vegetale, vor fi colorate în roşu prin tratarea probei cu soluţie de Sudan IV(14) si 2-
3 picături de soluţie de cloral-hidrat(4) urmată de o uşoară încălzire. Un test
suplimentar constă in tratarea separată a probei cu eter de petrol şi cu alcool etilic.
Eterul dizolvă grasimile, cerurile sau răşinile. Alcoolul dizolva, de regula, uleiurile
esentiale si rasinile dar are efect redus asupra grasimilor si cerurilor. Pentru
evidentierea taninurilor sau a tesuturilor impregnate cu tanin, se efectueaza testul
cu acetat de fier(12) sau clorura ferica(12). In ambele cazuri culorile dezvoltate sunt
verde sau albastru.
Examenul în fluorescenţă
Pentru examenul în fluorescenţă se utilizează stereomicroscopul şi
microscopul compus. Tehnica de iluminare a preparatului poartă numele de epi-
fluorescenţă şi se rezumă la observarea culorii fluorescente după excitarea
preparatului cu o lumină ultravioletă incidentă. Utilizarea tehnicii de examinare in
fluorescenţă poate fi foarte utilă pentru stabilirea originii ţesuturilor examinate sau
identificarea tipurilor de seminţe. Foarte multe structuri ale ţesuturilor vegetale, în
special cele de depozitare, prezintă fenomenul de autofluorescentă la tratamentul
cu reactiv Schiff25. Este foarte importantă alegerea corecta a colorantilor utilizati
tinând cont de structurile care vor fi evidentiate. Astfel, pentru colorarea
proteinelor sunt utilizate safranina, eozina, fucsina acida, acridin orange,
acriflavina, pentru colorarea lipidelor se utilizeaza Rosu si Albastrul de Nil, Sudan, 25 Col. PAS -Vezi anexa cu reactivi.
- 33 -
verde luminos, iar pentru colorarea amidonului Rosu de Congo, acidul periodic,
solutia Lugol, etc. Culorile obtinute la colorarea acestor structuri trebuie sa fie bine
cunoscute pentru a putea face caracterizarea corectă a preparatului.
Porumb- sectiune endosperm colorata PAS-Verde luminos (CL26, 200 x)
Detalii -structura endospermului (in stanga) are colorate granulele de amidon (fuchsia) intr-o
matrice proteica (verde inchis) in timp ce embrionul (dreapta) contine majoritatea lipidelor
miezului si foarte putine proteine
26 CL= examen in câmp luminos
- 34 -
Ovãz - secţiune endosperm colorată Roşu de Congo (FL27, 200 x)
Detalii -se remarcă autofluorescenţa compuşilor fenolici în stratul aleuronic (dreapta-albastru) si
coloraţia roşie a endospermului datorată ß-glucanilor (stânga)
Ovãz - secţiune endosperm colorata acriflavina-HCl (FL, 200 x)
Detalii -acidul fitic care se găseşte predominant în stratul aleuronic generează coloraţia roşie-
portocalie (stânga)
27 FL =examen in fluorescenta
- 35 -
Orz - secţiune endosperm colorată PAS-albastru Evans (CL, 400 x)
Detalii -granulele de amidon din endosperm sunt colorate în roşu-închis iar pereţii celulari sunt
coloraţi în albastru
- 36 -
Caractere morfologice identificabile
În cazul seminţelor întregi, nedecorticate, este esenţială compararea
caracterelor morfologice generale. Aceste caractere sunt: dimensiunea (lungime,
latime, diametru), forma seminţei, aspectul şi tipul ornamentatiilor28 de pe
suprafaţa cuticulei. După stabilirea atentă a acestor caractere se poate face
compararea cu mostre sau imagini ale preparatelor de comparaţie29.
Dacă se lucrează cu fragmente de seminţe trebuie stabilit gradual dacă este
vorba de un ţesut vegetal30 şi nu de un artefact, apoi se face şi examinarea la
microscop. Pentru examinarea la microscop este utilă examinarea în lumina
polarizată sau, ca alternativă, efectuarea unei coloraţii. Cele mai multe informaţii
sunt obţinute de la fragmentele de cuticulă, respectiv din epidermă, mezocarp şi
stratul aleuronic. Distribuţia şi forma celulelor care constituie aceste straturi oferă
28 La unele specii datorita ornamentatiilor caracteristice identificarea poate fi facuta direct. 29 Ghid de identificare a semintelor de buruieni (CD-R). 30 Vezi si testele chimice
- 37 -
mai multe informaţii decât examinarea structurilor, de cele mai multe ori amorfe,
ale endospermului sau cotiledonului.
Structura seminţei la monocotiledonate - în dreapta imagine la microscop a
endospermului şi a embrionului (200 x , CL, PAS - Verde luminos)
- 38 -
Structura seminţei la dicotiledonate – in dreapta secţiune transversală a seminţei la
stereomicroscop (12,5 x)
Bob de orz– aspectul in secţiune transversală si detaliu al endospermului şi
stratului epidermic (col. PAS)
- 39 -
Bob de orez– aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi
stratului epidermic (col. PAS)
Bob de grâu – aspectul in secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi
stratului epidermic (col. PAS)
- 40 -
Bob de ovãz – aspectul în secţiune transversală şi detaliu al endospermului şi
stratului epidermic (col. PAS)
- 41 -
Examen în lumină polarizată (100 x)-cuticula (familia Euphorbiaceae) Stânga –Ricinus communis dreapta – Jatropha curcas
Examen în lumină polarizată (200 x)-cuticulă (şi strat aleuronic) Stânga –Crotalaria spp. dreapta – Camelina sativa
Examen in lumina polarizata (100 x)-cuticula (fam. Brassicaceae)
- 42 -
Stânga –Brassica juncea dreapta – Brassica nigra
Examen microscopic -cuticula si strat aleuronic
Stânga –lolium temulentum (200 x) dreapta – Lolium remotum (100 x)
Examen in lumina polarizata (400 x)-Claviceps purpurea
(Periteciu cu asce)
- 43 -
Speciile de buruieni si plante toxice (impuritati botanice) din Anexa DC
2002/32/EC1
1. Ricinul (Ricinus communis L.)
Ricinul este o plantă originara din India şi face parte din familia Euphorbiaceae.
Are o mare variabilitate de areal si aspect, astfel cã poate fi gãsit sub formã de
arbore, de 10-12 m înãltime în zone
tropicale sau de 3-5 m în ţările
mediteraneene, în timp ce în zonele
nordice, unde este cultivat mai mult ca
plantã de ornament, are aspect de arbust.
Fructele sunt trilobate, cu suprafata
tepoasã, de culoare verde sau rosie. In
fiecare lob se dezvolta o samânta mare cu
suprafata cu aspect marmorat. Ricinul
1 Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n° L 140 of 30/5/2002,
- 44 -
este cultivat si in scop comercial pentru uleiul nevolatil (90% acid ricinoleic)
extras prin extractie cu solventi din seminte sau prin presare.
Producţia de seminţe de ricin în scopuri industriale (1,05 Mt) este
preponderentă în
India şi China şi
mai puţin
importantă in
Brazilia. Uleiul2 de
ricin este folosit de
foarte mult timp ca
purgativ dar are si multe alte utilizări comerciale, cum sunt fabricarea maselor
plastice, textile, vopsele sau cosmetice. Ricinul are toxicitate ridicata din cauza
continutului în ricin, o glicoproteină hidrosolubilă foarte concentrată in
endospermul semintelor3 dar prezenta in cantitati mai mici si in celelalte portiuni
ale plantei. Este considerat unul dintre cele mai puternice toxice naturale4. Există o
mare variabilitate în privinţa sensibilitătii la toxină.
2 Uleiul ca atare nu este foarte toxic, semintele macinate intregi contin toxina. 3 Insotita de un alcaloid (ricinina). 4 Actioneaza prin inactivarea ribozomilor .
- 45 -
Cabalinele prezintă cea mai mare sensibilitate, cu
doza letală (p.o5) de 0.1 g/kg mc, apoi celelalte
specii de fermă cu doza letalã de 1-2 g/kg mc
(p.o) cu exceptia caprinelor la care aceastã dozã
ajunge la 5,5 g/kg mc. Toate animalele de fermã
si cele de companie, sunt vulnerabile. Seminţele
sunt toxice numai dacă învelişul extern (cuticula)
este îndepărtată. Seminţele înghiţite intacte trec prin tubul digestiv, în general, fără
incidente. Simptomele pot apare chiar şi după 18-24 ore de la ingerare. Acestea
debutează cu stare depresivă, uşoară hipertermie, după care predominã tulburãrile
gastrointestinale, voma, diaree profuzã, colica abdominalã. Animalele afectate
manifestă apoi convulsii, colaps circulator si apoi moartea la aproximativ 36 ore de
la consum. Mecanismele principale sunt iritatia gastrointestinala, anafilaxia şi
socul.
2. Purghera (Jatropha curcas L.)
Jatropha curcas este o plantă din familia
Euphorbiaceae, ca şi ricinul, cunoscută
pentru potentialul toxic. Este originara
din America centrala dar este cultivata pe
scara larga in tarile tropicale. Creşte sub
formă de arbust sau arbore de 5-6 m
înaltime. Fructele uscate complet se desfac
in trei valvule dintre care cel putin doua
contin câte o singura samanta alungita, de
culoare neagra. Planta, inclusiv semintele,
este utilizata pe scara larga pentru diferite
5 Administrare orala (per os)
- 46 -
scopuri casnice si in medicina traditionala. Utilizarea comerciala a uleiului prezinta
un interes mai scazut, desi proprietatile sunt similare celui de palmier. Semintele
contin ca principiu activ, curcina, care este o glicoproteina similara ricinului si are
un mod de actiune asemanator. La om
simptomatologia consecutiva ingerarii semintelor
este asemanatoare celei asociate iritatiei
gastrointestinale. Debutul este brusc cu dureri
abdominale puternice, senzatii de arsura la circa
30 minute dupa ingerare, urmate de diaree
(uneori hemoragica) si deshidratare accentuata. In unele cazuri apar si tulburari
cardiovasculare si ale sistemului nervos central. Se considerã cã 2 seminte pot avea
un puternic efect purgativ in timp ce 4-5 seminte pot produce moartea subiectului.
Intoxicatiile produse la animale sunt cunoscute în practica veterinara in zonele
unde creste planta. Studiile efectuate asupra toxicitatii orale ale J. curcas au aratat
ca exista diferente de sensibilitate între speciile de rumegatoare. Vacile care au
primit 0.25-1 g/kg furaj au murit in interval de 19 ore de la administrare, in timp ce
caprele care au primit aceeasi doza au murit in intreval de 7-21 zile. Nu a fost
stabilita o relatie directa cu capacitatea citotoxica in aceste cazuri sau posibilitatea
de metabolizare a substantei active, continuta de seminte, in metaboliti mai mult
sau mai putin toxici. Furajarea pasarilor cu seminte fierte de J. curcas produce
întârziere in crestere, pierdere in greutate, modificari metabolice (cresterea
nivelului de creatinina serica) si mortalitate proportionala cu cresterea procentului
de seminte în dietã.
3. Croton (Croton tiglium)
Este o planta din familia Euphorbiaceae, cu un areal larg, din India pânã în Noua
Guinee, nordul Indoneziei si China. Poate fi gasita sub forma de arbust sau arbore
de peste 12 m. Fructele au forma triangulatã (trilobata) si contin 3 seminte. Este
mai putin toxica decât genurile descrise mai sus.
- 47 -
Substanta toxica majoritara din compozitie este reprezentata de crotin6 cu un mod
de actiune asemanator cu cel al ricinului. Simptomatologia este determinata de
actiunea iritanta gastrointestinala si purgativa. Uleiul de croton este produs
comercial în cantitãti reduse, în special in India, sursa principala de seminte
comercializate fiind regasita în nordul Indiei.
Planta are si unele proprietati terapeutice folosite în medicina traditionala. In
Europa poate fi gãsita ca plantã ornamentalã.
6 Nume generic pentru un grup de glicoproteine cu toxicitate variabila.
- 48 -
4. Crotalaria spp7. (Crotalaria spectabilis, Crotalaria giant)
Denumita şi buruiana „plesnitoare”8, este o
plantă anuală, perenã, de 1,5-2 m, cu fructe
asemănătoare cu mazãrea, cu multe seminţe
care, atunci când sunt uscate, produc zgomotul
de unde şi denumirea plantei. La începutul
secolului trecut, mai multe specii9 de
Crotalaria au fost duse din Africa în SUA
pentru a fi utilizate pentru controlul eroziunii
solului, ca îngrasamânt vegetal, ca sursa de
azot, etc10.
Aceasta activitate a fost discontinuă dar în acest mod plantele au fost diseminate pe
teritoriul tãrii, iar semintele care patrund in culturile de cereale pot produce
intoxicatii animalelor de ferma.
Dintre acestea, cel mai puternic afectate sunt pãsãrile. Crotalaria spp. nu creste in
Europa decât ca rezultat al cultivarii. Posibilitatea de a contamina soia (respectiv
fãina de soia) importata din SUA in Europa este motivul includerii acestui gen in
anexa Directivei.
7 Laur porcesc (pop.) 8 In engleza rattlebox sau rattleweed (rattle=sunãtor, zanganit) 9 De fapt peste 600 de specii dintre care au fost identificate 6-7 specii cu potential toxic pentru animale. 10 In India sunt folosite in medicina traditionala pentru tratarea scabiei
- 49 -
Dintre speciile existente, Crotalaria giant striata si Crotalaria spectabilis au un
potential toxic mai ridicat. Plantele si semintele sunt toxice in egalã mãsurã prin
continutul de monocrotalinã11, un alcaloid hepatotoxic prezent în întreaga plantã.
Consumul de C. spectabilis de catre gãinile ouãtoare duce la scaderea rapida a
ouatului si cresterea mortalitatii
Clinic, intoxicaţia se manifestă prin mişcări dezordonate şi dezorientare. La
examenul necropsic se constată rupturi hepatice (sau hemoragii de suprafaţă în
stadiile incipiente), hemoragie internă şi acumulare de lichid în cavitatea
abdominală12. In cazul hrănirii experimentale cu seminţe măcinate s-au putut
11 Este alcaloidul (pirozilidinic) majoritar alaturi de fulvina si crispatina 12 In unele cazuri apare ciroza hepatica.
- 50 -
observa efecte adverse la un conţinut de 0.01-0.1 % în dietã, în timp ce la un
continut de 0.3 % apare mortalitate. Procente in dietă mai mici de 0.05 % reduc
sever ouatul şi procentul de eclozionare.
5. Camelina sativa (L.) Crantz (in fals, lubit)
Camelina este o plantă din familia Brassicaceae, cultivata in Europa încã din epoca
bronzului pentru uleiul extras din seminte si ca sursa de fibra vegetala. A fost
cultivata pe scara larga dar productia comerciala a fost înlocuitã cu introducerea
uleiului de rapita. Uleiul are proprietati asemanatoare cu ale uleiului de in13 si are
un continut mai scazut de glucozinolat14 decât speciile de Brassica. Acest din urma
aspect favorizeaza chiar utilizarea semintelor (faina) in hrana animalelor15. Nu este
foarte clar motivul pentru care aceasta planta, tinând cont de cele de mai sus, a fost
inclusa in anexa Directivei. Unul din motive ar putea fi faptul că atunci când inul
(Linum usitatissimum) era cultivat pe scară largă in Europa, această plantă era o
buruiana comună atât în culturile de in cât si in cele de cereale. In consecintă,
Camelina sativa a fost considerată nedorită in amestecurile de cereale si probabil
acesta este unul dintre motivele includerii in anexă.
13 Contine acid linolenic 30-40%, acid eicosenic 15% si acid erucic <4% compozitie asemanatoare celui de in 14 Referitor la speciile alimentare. 15 In afara glucozinolatilor (care se gasesc in mai multe specii de Brassica) nu contine alte substante cu potential toxic pentru animale.
- 51 -
6. Semintele de mustar16
Familia de plante cunoscute sub numele generic de „mustar” cuprinde mai multe
specii si subspecii17 ale acestora. In aceasta grupa sunt incluse rapita18 (canola) si
mustarul dar acestea sunt denumiri comerciale si nu stiintifice. Familia
„mustarului” este de fapt Brassicaceae19 (Cruciferae) si este una dintre cele mai
bogate, cu peste 40 de genuri si peste 200 de specii salbatice si cultivate.
Taxonomia speciilor listate in anexa a fost revizuitã, astfel cã în prezent, nu existã
distinctie între diversele subspecii de Brassica juncea. In consecinta, subspeciile
denumite „Indian”, „brun”, „chinezesc” sunt considerate simple varietati de
Brassica juncea iar mustarul „sareptian” apare ca un termen a cãrui existentã este
legatã doar de contextul directivei.
6.1. Brassica juncea (L.) –(mustar indian, chinezesc sau brun)
16 In directiva : „mustard seeds” 17 Unele dintre acestea sunt considerate varietati in cadrul speciei. 18 Brassica rapa.( sin. B. campestris) si Brassica napus 19 Genul reprezentativ este Brassica spp.(spre exemplu mustarul salbatic Sinapis arvensis face parte din aceeasi familie)
- 52 -
Este o plantă perenã de 1-1,5 m provenită din incrucisarea Brassica nigra cu
Brassica rapa. Locul de origine este considerat sud-vestul Indiei si Asia unde
distributia naturala a celor doua specii s-a suprapus. Inainte de 1940 B. juncea a
fost considerata inferioara B. nigra pentru obtinerea mustarului dar din 1940 a fost
importata din China o noua varietate20 de B. juncea care a devenit larg cultivata21.
Continutul de substante toxice este reprezentat, ca importantă, de sinigrina (2-
propenil-glucozinolat) care după hidroliza enzimatică (mirozinaza) se transformă
în alil-izotiocianat22. Sinigrina se regãseste în întreaga plantã cu variaţii de continut
in timpul diferitelor faze de vegetatie si culminând cu acumularea in seminte pe
timpul formării si maturării acestora.
Conţinutul mediu de alil-izotiocianat din B. juncea este de 0,9 % (0,25-1.4 %). In
urma hidrolizei enzimatice rezultã şi alti compuşi volatili (metil, butil, benzil) dar
20 Cu seminte galbene 21 Spre deosebire de B. nigra, aceasta putea fi recoltata mecanizat. 22 Lichid volatil cunoscut ca “ulei de mustar”
- 53 -
în concentratii foarte mici. Alil-izotiocianatul este foarte iritant si are efect
rubefiant si vezicant asupra tesuturilor. In experientele pe celule ovariene (linie
celulara de hamster chinezesc) s-a demonstrat un efect citotoxic de 1000 de ori mai
mare23 decât glucozinolatul. Izotiocianatii produc hipotiroidism24 la animalele de
experienta iar sinigrina induce aberatii cromozomiale in vitro. In exeperientele de
furajare, efectuate pe oi, cu concentratii de 10 mmol/ zi, administrate in furaje
granulate la discretie, s-a constatat reducerea consumului dietei si cresterea
nivelului de -glutamil-transpeptidazã, ceea ce indicã leziuni hepatice.
6.2. Brassica nigra (mustar negru)
Este o plantã cu crestere rapida, atingând dimensiuni de pânã la 4 m care produce
seminte de culoare brun închis pânã la negru (~1 mm ). Originea speciei nu este
cunoscutã exact dar se presupune cã provine dintr-un nucleu mediteranean. Este
larg rãspânditã în sudul si centrul Europei si este o buruianã frecventã atât în
culturi cât si în locuri virane. O treime din masa semintelor de mustar negru este
constituitã din ulei al cãrui continut mediu de acid erucic este de 40%.
Ca si celelalte specii, contine sinigrinã si implicit alil-izotiocianat ca principii
toxice. In afara sinigrinei contine si o proteina termostabila cu rol de factor
antitriptic.
23 Are activitate citotoxica semnificativa la mai putin de 1 g/ mL 24 Gusa endemica sau hipotiroidismul se manifesta prin hipertrofia tiroidei.
- 54 -
6.3. Brassica carinata (mustar etiopian)
Este un hibrid natural rezultat din B. nigra si B. oleracea25, originarã din Etiopia
unde este cunoscutã ca sursa verde si pentru uleiul obtinut din seminte. Este o
plantã foarte rezistenta la seceta si temperaturi înalte. Ca si celelate specii descrise
anterior, semintele au un continut important de glucozinolat. Planta a reprezentat la
un moment dat o sursa de ulei de uz nealimentar, în Europa si Canada. Uleiul din
semintele de B. carinata are un continut ridicat (~50 %) de acid erucic.
7. Madhuca26 (Madhuca longifolia (L.) Machr.)
Madhuca longifolia este un arbore cu coroana largã si foarte densã, cultivat în zone
cu clima caldã pentru uleiul continut de semintele sale. Din punct de vedere
taxonomic, nu se mai face distinctie, conform
anexei din directiva, între Madhuca longifolia
si Madhuca indica, astfel cã, acum, acestea
sunt considerate sinonime. Uleiul din seminte,
care este un ingredient uzual în grasimile
hidrogenate utilizate în India, contine acid oleic
(46.3 %) si acid linoleic (17.9 %) ca si acizi
grasi nesaturati alãturi de acid palmitic (17.8
%) si acid stearic (14.0 %) dintre cei saturati.
Semintele degresate contin 29.4 % proteina si
9.8 % saponine27. La acest nivel de
concentratie, saponinele sunt componenta toxicã actionând iritant asupra mucoasei
digestive si prin hemolizã. Detoxifierea prin tratament termic reduce foarte mult
digestibilitatea, nefiind o metodã practicã. In schimb, prin macinare si extractie cu
solventi (2-propanol) se reduce foarte mult concentratia de saponine iar fãina astfel
25 B. oleracea – exista 3 varietati : varza, conopida si gulia. 26 Alte denumiri : Mahua, mowrah, bassia. 27 Termenul este derivat de la Saponaria officinalis plantã utilizata din vechime pentru calitãtile sale de sãpun. Saponinele sunt glicozizi care se gãsesc în multe alte plante (Agrostema githago, Helleborus niger, Aesculus hippocastanum, Asparagus officinalis, etc.)
- 55 -
rezultatã constituie o valoroasã sursã proteicã28. Includearea turtelor neprocesate în
proportie de 20 %29 în hrana vacilor lactante nu afecteazã consumul hranei,
digestibilitatea, productia de lapte, compozitia acestuia.
Fãina de seminte neprocesate este de asemenea bine toleratã de cãtre vacile
lactante. Nu existã suficiente date despre furajarea cu seminte netratate sau fãina
acestora, a altor specii de fermã în afara rumegãtoarelor. In orice caz, prezenta
saponinelor toxice este nedoritã si ca atare si prezenta semintelor de Madhuca
longifolia nu trebuie sa depãseasca nivelele de tolerantã ale rumegãtoarelor.
8. Prunus armeniaca (cais, zarzãr) si Prunus dulcis var. Amara (migdal)30
28 Pentru alimente si furaje. 29 Din total substanta uscata 30 Inclusiv Prunus virginiana
- 56 -
Familia Rosaceae include multi copaci fructiferi inclusiv caisul si migdalul, la a
cãror sâmburi face referire anexa. Plantele din aceasta familie contin în frunze,
seminte si radacini, glicozide cianogenice, dintre care, amigdalina31 este cel mai
frecvent si mai important din punct de
vedere cantitativ. Amigdalina are o
toxicitate proprie destul de redusã. Aceasta
se manifestã numai când sâmburii fructelor
sunt zdrobiti pentru ca sã fie posibilã
activitatea enzimelor care hidrolizeaza
amigdalina. In prima fazã a hidrolizei, care
este efectuatã de o ß-glicozidazã specificã,
rezultã prunasina32 iar apoi prin
intermediul altei ß-glicozidaze specificã prunasinei, rezultã mandelonitril si
glucozã. Mandelonitrilul (aglicon) este mai apoi metabolizat cu o liazã specificã la
4-hidroxi-benzaldehidã si HCN33. Nu s-a putut încã stabili un nivel sigur pentru
cantitatea de glicozide cianogenice34 ingeratã, în mare parte datoritã lipsei de
informatii toxicologice, cu exceptia HCN pentru care existã mai multe studii
efectuate si informatii. In principal, HCN conduce la scãderea nivelului de
utilizare a oxigenului tisular, provocând anoxia histotoxicã35. Toate mamiferele
sunt sensibile la intoxicatia cu HCN, doza minimã letalã fiind de ~ 2 mg/kg mc36.
In general rumegatoarele sunt mai sensibile decât monogastricele.
31 D-mandelonitril- gentobiozid (agliconul este mandelonitrilul) 32 D-mandelonitril-D-glucozid 33 Migdalele pot contine peste 250 mg HCN/100 g seminte. 34 Aceste substante (inclusiv acidul cianhidric) se gasesc de altfel si in multe nutreturi care compun obisnuit dieta animalelor de ferma (anumite furaje verzi, leguminoase, sorg, etc.). In acest sens, in anexa este mentionat un nivel permis de concentratie pentru HCN in anumite materii prime si nutreturile combinate. 35 Anoxia rezultã din inactivarea citocromoxidazei de cãtre HCN, care se combinã cu Fe3+/Fe2+ din enzimã. 36 Unitate de masã corporalã.
- 57 -
Subprodusele industriale de la prepararea
fructelor uscate, conservate, producerea de
gemuri, erau utilizate pentru adaus în hrana
animalelor. Crescãtorii, nutritionistii si
producãtorii de nutreturi combinate cunosc
riscurile utilizãrii de astfel de subproduse
la care, s-a renuntat în prezent.
9. Fagus silvatica37 – (ghindã si jir)38
In aceastã categorie sunt incluse fructele si semintele arborilor de pãdure cum sunt
fagul (Fagus silvatica) sau stejarul (Quercus robur) utilizate pentru hrana
traditionalã a porcilor. Aceste produse erau folosite prin administrare în ratie sau
pãsunare directã, în sistem de crestere traditional, pentru porcii la îngrasat, pentru
pãsãri sau cãprioare.
Resturile rãmase dupã extragerea uleiului din ghindã erau utilizate pentru
fabricarea de turte pentru furajarea animalelor. Semne de intoxicatie au fost
raportate atunci când s-au utilizat turte cu un continut ridicat de coji, administrate
la discretie.
37 In anexa directivei apare doar Fagus silvatica dar pentru ca se mentioneaza ghinda si jirul împreunã, am facut referire si la Quercus robur (stejar). 38 In anexa sunt mentionate fructele întregi (nedecorticate)
- 58 -
Cauza realã a intoxicatiilor nu este cunoscutã dar se presupune a fi datoratã
prezentei saponinelor. In mod special, caii sunt mai sensibili, dar majoritatea
cazurilor semnalate au implicat rumegãtoare. In amestecurile furajere se verificã
existenta fructelor nedecorticate.
10. Lolium temulentum L. (raigras, zâzanie)
Intoxicatia cu aceasta specie este cunoscutã la animale39 încã din secolul XIX prin
contaminarea fãinii. Extractele de seminte administrate experimental pe cale oralã
si intraperitonealã la soareci produc sindrom de depresie gradualã a sistemului
nervos central, cu comã si moarte prin sincopã respiratorie. Semintele de Lolium
temulentum contin lolina40 (alcaloid pirolizidinic), 6-metil lolina si lolinina41.
39 Se cunosc cazuri si la om 40 In 1985 a fost identificata temulina care s-a dovedit mai târziu un artefact de izolare. 41 Studiile de toxicitate individualã asupra alcaloizilor au demonstrat o slabã toxicitate iar efectele asupra SNC se obtin prin efect cumulat al mai multor alcaloizi.
- 59 -
Partea aerianã a plantei contine lolina si un alcaloid cu nucleu fenantrenic,
perlolina. Originea alcaloizilor a fost un timp necunoscutã dar acum se stie cã
lolina (alcaloid insecticid) este invariabil produsã în simbiozã42 cu fungi din genul
Neotyphodium. Astfel, a fost demonstrat cã Neotyphodium uncinatum produce, în
mediu minimal si în absenta plantei, lolina, N-acetil-norlolina si N-formil-lolina si
cã acesti alcaloizi nu sunt sintetizati ca rãspuns al plantei la infestare43.
11. Lolium remotum Schrenk
Introducerea acestei specii în anexa se datoreazã unui sindrom de pãsunat,
predominant neurologic, care apare în sudul si vestul Australiei. Acesta debuteazã
ca urmare a consumului de cantitãti mari de seminte cu gale44 de L. remotum
infestat cu un nematod (Anquina agrostis) si o specie de bacterie Clavibacter
toxicus45. Amestecul de toxine cuprinde 8 glicolipide a cãror actiune se manifestã
si exeprimental, la miei, cu simptome clinice si leziuni ale creierului. Dozele mai
mici, care nu produc intoxicatia, au efect asupra productiei oilor, în special asupra
dezvoltãrii lânii. L. remotum în absenta semintelor infestate nu prezintã pericol
pentru animale iar relevanta in Europa a sindromului
australian este nedemonstratã.
12. Datura stramonium (ciumãfaie)
Aceastã specie este cunoscutã de foarte mult timp pentru
proprietãtile sale toxice46,47. Principalele substante active
din compozitia plantei sunt alcaloizi tropanici: atropina,
hiosciamina si scopolamina48. Continutul maxim de
alcaloizi se regãseste în tulpinã si frunzele plantei
(majoritar hiosciamina) si mai putin în seminte. Actiunea 42 Valabil pentru genurile Lolium spp. si Festuca spp. 43 Un exemplu similar este cazul Festuca spp. in cazul infestãrii cu Acremonium coenophialum 44 Noduli infestanti formati pe suprafata semintelor 45 Initial a fost descrisã ca o tulpina de Corynebacterium. 46 Una dintre denumirile traditionale americane face referire la moartea unor soldati britanici in sec XVII intoxicati cu D. stramonium. 47 Si datorita proprietatilor halucinogene (sunt mentionate si cazuri de delir datorate consumului de miere toxicã provenitã din specii de Rhododendron, Datura stramonium şi Hyoscyamus niger ) 48 Se gasesc si în Atropa belladonna si Hyoscyamus niger.
- 60 -
toxicã este datoratã antagonismului competitiv cu acetilcolina la nivelul
receptorilor muscarinici centrali si periferici. Receptorii periferali sunt la nivelul
glandelor exocrine, muschilor netezi si cardiac. In urma intoxicatiei se produc
paralizii iar consecutiv efectului asupra sistemului nervos central (ca amine
tertiare) rezultã sindromul anticolinergic central, manifestat cu psihozã acutã si
delir. Aceste substante se absorb rapid prin mucoasa gastricã si intestinalã. Timpul
de înjumãtãtire al atropinei este de ~ 4 ore, prin metabolizarea hepaticã (hidrolizã)
se reduce jumãtate din cantitatea initialã iar restul este eliminat nemodificat prin
urinã. Intoxicatia prin pãsunare directã este mai rar întâlnitã la animale pentru cã
din cauza gustului neplãcut, rareori animalele consumã suficient material vegetal
ca sã producã intoxicatia. La rumegãtoare mari se manifestã prin excitabilitate
nervoasã, tremor si dezorientare. La rumegãtoarele mici (oaie si capra) pe lângã
simptomele de la rumegãtoarele mari, se mai constatã instabilitatea trenului
posterior si cãderi bruste.
Cele mai multe cazuri de intoxicatie se produc prin administrarea de fân sau alte
furaje cultivate pentru masa verde, care contin D. stramonium.
- 61 -
Ocazional a fost detectatã ca si contaminant în soia49 din recolte provenite din
America de Sud.
13. Claviceps purpurea (ergot50, cornul secarei)
Genul Claviceps51 cuprinde specii de fungi foarte specializati care paraziteazã
partea floralã a unor pãioase. Pe timpul parazitãrii, ovarul52 florii este înlocuit cu o
structurã fungalã numita sfacelã din care în timp se dezvoltã sclerotul53. In timpul
dezvoltãrii acestuia, sporii, denumiti conidii, sunt amestecati cu un lichid de
secretie siropos, cu continut ridicat de zaharuri, asemanator cu mierea, care atrage
insectele si poate realiza în acest fel diseminarea sporilor. Majoritatea speciilor de
Claviceps paraziteazã specific o specie de plantã cu exceptia C. purpurea care se
poate dezvolta pe mai mult de 200 specii de plante. Sclerotii multor specii de
Claviceps contin alcaloizi toxici pentru om si animale. Unele substante sunt
utilizate si in scop farmaceutic54 (ergotamina, ergometrina) datoritã efectelor
exercitate asupra vaselor sanguine, asupra musculaturii netede, etc. Este larg
rãspândit în lume, în special în zonele temperate unde sclerotii se pot dezvolta mai
bine55. Impactul economic asupra culturilor este de mai micã importantã. Dintre
toate speciile cel mai bine cunoscut este C. purpurea cu denumirea comunã de 49 Se mai poate întâlni Datura ferox L. care are acelasi continut toxic. 50 Ergot este un termen general utilizat pentru toate speciile de Claviceps. 51 Claviceps purpurea, Claviceps africana, Claviceps sorghi, etc. 52 Ovarul se afla situat la partea inferioara a pistilului (pistilul are doua componente :stigmatul si ovarul) 53 Sclerotul este un tesut fungic dur si compact (dimensiunile sale sunt de câteva ori mai mari decât samânta gazdã (dimensiunea sclerotului este diferentiata in functie de dimensiunile semintelor).. 54 Inaintea obtinerii de culturi pure in scopuri industriale, ergotul a fost cultivat pe secarã (Secale cereale) 55 Sclerotii nu se dezvoltã bine in zone cu clima foarte caldã (nu germineaza).
- 62 -
ergot (cornul secarei). Limita toleratã în culturile de cereale variazã de la 0.3 %
pentru secarã, la 0.1 % în grâu sau ovãz. Concentratii mai mari influenteazã
calitatea recoltelor. Sclerotii de C. purpurea au aspect alungit, drept sau curbat, de
1-4 ori dimensiunea semintei gazdã, cilindrici pe sectiune si cu capete rotunjite.
Culoarea tipicã la exterior este neagrã, cu variatii de la rosu-închis la negru. In
interiorul sclerotului culoarea peretilor este de la alb la gri cu aspect rugos. Pe
suprafatã se pot observa conidii uscate de culoare gri deschis. Conidiile sunt ovale,
hialine si au dimensiuni de 4-6 x 2-3 m.
- 63 -
- 64 -
- 65 -
14. Seminte de buruieni, fructe nemãcinate si nedecorticate
Aceastã categorie, care poate cuprinde multe specii de plante, este inclusã în anexa
directivei si oferã o anumitã flexibilitate în cuprinsul listei impuritãtilor botanice,
dar este deschisã unor interpretãri. Asa cum am mentionat anterior, spre exemplu,
în cazul saponinelor56 sau acidului cianhidric57, chiar unele ingrediente obisnuite
ale nutreturilor contin astfel de substante iar în altã ordine de idei, toate plantele
vasculare contin „glicozide”. In consecintã, în aceastã categorie generalã se pot
include buruieni si plante toxice care sunt specifice florei locale58. In acest scop,
trebuie întocmitã o listã de plante care se pot regãsi în mod obisnuit printre furajele
verzi si semintele de culturã si care pot constitui un factor toxic sau un factor
limitativ pentru sãnãtatea si nutritia animalelor. Aceastã listã trebuie sã fie la
dispozitia fiecãrui laborator oficial care executã analiza botanicã sau decelarea
impuritãtilor botanice microscopic identificabile. La punctele 1-13 sunt descrise o
serie de specii, cu continut toxic, specii dintre care unele exotice. Pe plan local
existã însã si unele buruieni, unele nocive, altele nedorite (necomestibile) ca
impuritãti în culturi sau furaje verzi si care vor fi incluse la acest punct.
Plantele necomestibile sunt cele cu tulpini lignificate, cu diametru de peste 5
mm, aspre, cu ghimpi, cu ariste, etc., cum sunt: Xanthium spinosum, Cyrsium
56 Vezi si pct. 7 –Madhuca longifolia si notele de subsol 57 Vezi si pct. 8 –Prunus armeniaca si notele de subsol 58 In afara impuritatilor listate in anexa directivei exista si alte plante (intregi sau seminte ale acestora) specifice tarii, care sunt considerate nedorite in standardele de calitate interne.
- 66 -
arvense, Sonchus oleraceus, Rumex sp., Salvia sp., Lepidium sp., Equisetum sp.,
ca si cele care provoacã leziuni sau ulceratii, cum sunt Bromus tectorum, Setaria
verticillata, Holcus lanatus, Stipa pennata, Stipa capillata, etc.
Aceste genuri si specii trebuie identificate si cuantificate ca plante întregi
sau portiuni ale acestora în furajele verzi sau uscate. Ocazional, se pot gãsi si
semintele acestora în cereale59. Unele plante influenteazã negativ calitatea
productiei animalelor, prin modificarea gustului si mirosului normal, cum sunt
Arthemisia absinthium, Matricaria chamomilla, Alliaria officinallis, Lepidium
draba, pentru lapte sau Allium ursinum pentru carne.
Plantele nocive contin substante toxice (alcaloizi, toxalbumine, etc.) care pot
provoca uneori chiar moartea animalelor. Unele dintre acestea contin substanta
activã în tulpini, frunze si flori, cum sunt Veratrum album si V. nigrum, Datura
stramonium, Hyosciamus niger, Solanum nigrum, Xanthium strumarium, Cicuta
virosa, Colchycum autumnale, Euphorbia sp., etc. iar altele au fructe si seminte
otrãvitoare, cum sunt Lolium themulentum, Papaver rhoeas, Agrostemma githago,
Delphinium consolida, etc.
59 De regulã sunt specii care se gãsesc în fânete si nu în culturile de cereale.
- 67 -
ANEXA 1.1
TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI VEGETALE
Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii Agent de clarificare I şi II (3,4)
Prin incalzire uşoara este clarificată structura matricei
Diferenţiere tesut vegetal/osos
Parafina (ulei) (16) Prin flotaţie porii răman umpluţi cu aer Structuri reticulare cu spaţii mari, secţiuni medulare, etc.
Este util pentru retele sau canale capilare
1. coloraţia matricei albastru –violet
Amidon
2. coloraţia matricei galbenă Celuloza
Testul cu iod/iodura(5)
3. coloraţie galben-portocaliu/maron Proteine
Natura proteinelor nu se poate preciza
Hidroliza cu clorat/acid azotic(11) şi testul cu iod(13)
1. Coloraţie albastră 2. Coloraţie galbenă
Celuloza Substanţe de infiltrare –lignina, suberină
Testul cu floroglucinol(20) Coloraţie rosie Lignina
1. Gelatinizarea substructurilor
Granulele de amidon sunt gelatinizate
Favorizează examinarea altor structuri
Hidroliza cu KOH(10)
2. Preparatul se clarifică şi capată coloraţie rosietică
Taninuri din substrat
Testul cu actat sau clorura ferica(12)
Coloraţie verde / albastră Taninuri din substrat
Coloratie cu Sudan IV(14) Coloraţie rosie Substante grase, raşini, ceruri, uleiuri
- 68 -
3.2 ŢESUTURI ANIMALE şi MINERALE DIN FURAJE
Domeniu de aplicare
Acest ghid se va utiliza acolo unde este necesara identificarea şi diferenţierea
componentelor minerale şi animale (fragmente de oase, cristale de sare, fosfaţi,
carbonaţi, etc.) din amestecuri furajere, prin examen microscopic pe baza
caracterelor tipice sau testelor de confirmare.
Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .
Reactivi (vezi Anexa 2)
A. Pregatirea probelor
Este necesara o buna omogenizare a probei globale inainte de examinare. Se
cantăresc cca. 10 g (± 0.001 g) de furaj într-un pahar Berzelius de 100 ml şi se
completeaza la 1/3 cu CHCl3(1). Se amesteca conţinutul cu o bagheta şi se lasă în
repaus 1 minut. Fracţia flotabila (care poate conţine fragmente de ţesuturi, fibre
musculare, păr, pene, etc.) se separă cu o spatulă de pe suprafaţa lichidului intr-o
placa Petri ( Ø = 9 cm) şi se evapora solventul pe o baie de apa. In funcţie de
aspectul probei se poate filtra şi apoi se concentreaza solventul. Dupa uscare se
siteaza reziduul pe site de dimensiuni adecvate dimensiunilor particulelor (0,4, 0,6,
0,8, 1,0). Dupa separarea fracţiei flotabile, sedimentul concentrat (care contine
fragmente de oase, minerale sau fragmente vegetale lignificate) este reluat cu
CHCl3 şi trecut cantitativ pe o hartie de filtru uscata şi tarata în prealabil. Hartia de
filtru cu reziduul se usucă la aer şi apoi la etuva la 103 ±20 C timp de ½ - 1 oră.
Dupa acest interval se răceşte în exsicator şi se cantăreşte ((± 0.001 g). Prin
diferenţa fată de tara hartiei goale se determina masa reziduului.
B. Examinare
B.1. Particule organice
Fracţiile individuale de pe site se examineaza la stereomicroscop (25 x -50 x)
cu iluminare frontală sau laterală la unghi de cca. 450 cu filtru albastru. Suportul
- 69 -
de examinare poate fi sticla mata sau hartie albastră. Se noteaza aspectul
particulelor, forma, culoarea, consistenta, rezistenta la presiune. Pentru comparare
se recomandă folosirea mostrelor de referinţa.
Fragmentele mici din reziduul trecut prin site, se examinează şi la microscop
(100 x -400 x) cu condensatorul reglat la putere mica şi cu filtru albastru. Pe lama
de examinare, cu un strat foarte fin de reziduu se adauga 2 picaturi de agent de
clarificare (I) (3) şi se examineaza sistematic (vezi anexa 2.1). Se adaugă apoi pe
lama 1 picatura sol. iod (5) şi se reexaminează :
- particulele de amidon sunt colorate în albastru-pal pana la negru,
- drojdiile sau alte celule proteice sunt colorate pânã la maro inchis.
Daca este necesar se poate incălzi o mica cantitate din reziduu cu cca. 5 ml agent
de clarificare (II)(4) . Dupa răcire se pun 1-2 picaturi pe o lama microscopica, se
acopera cu lamela şi se examinează la microscop.
B.2. Particule minerale
Din preparatul obţinut la pct. A se colectează fracţia care sedimenteaza (care
conţine particulele minerale), se indepartează solventul prin uscare şi se trece
sedimentul uscat pe site de dimensiuni diferite (pct. A).
Se face examinarea la stereomicroscop (50 x). In general oasele de animale,
peşte, solzi de peşte şi fragmente de cochilii sunt identificabile. Formaţiunile
anorganice (minerale) pot fi recunoscute pe baza formelor acestora.. De exemplu,
cristalele de sare sunt de regula cubice şi pot fi colorate, calcitul (CaCO3) are
forma romboedrică, ( vezi anexa 2.2). Deoarece forma cristalelor nu este
intotdeauna identificabilă (stare amorfa) se efectuează şi teste chimice de
recunoastere.
C. Teste de confirmare60
Particulele de origine necunoscută (neidentificabile vizual) se aşeaza cu o
pensetă pe o placa Petri şi se sparg cu atenţie prin presarea usoară pe o suprafaţă
planã. Lucrând sub stereomicroscop, se separă fragmentele la 1-2 cm distanţa intre 60 în funcţie de natura particulelor pot fi efectuate teste adiţionale de recunoaştere
- 70 -
ele. Lânga fiecare fragment se aşează o picătură de reactiv iar apoi se împinge cu
penseta fragmentul în mijlocul picăturii, urmărind modificările (vezi anexa ) care
au loc la contactul cu reactivul. De preferinţa, sub placa se aşeaza o foaie de
culoare neagra pentru o mai buna vizibilitate. Lumina este preferabil sã fie naturală
sau se utilizează filtrul albastru, în cazul iluminării laterale. Testul preliminar
trebuie efectuat cu AgNO3 (6) care poate indica prezenţa clorurilor şi a fosfaţilor şi
face diferenţa de structurile osoase. Este preferabil ca testele cu soluţii de acizi sã
fie efectuate ca variantă suplimentară.
D. Calcul şi evaluare
In cazul în care estimarea cantitativă este necesară se va proceda conform acestui
punct. Estimarea cantitativă se poate face global (% de oase şi minerale) sau pe
grupe de componente ( ex. % de particule minerale sau % de particule osoase) :
R x 100
(a) Reziduu de …………. ( %) =
M
unde : R = masa fracţiei (g) de reziduu din sedimentul concentrat
M = masa probei (g)
- 71 -
ANEXA 2.1 TESTE DE CONFIRMARE PENTRU MINERALE2
61 ( toti fosfaţii reactionează dar fosfaţii mono- şi dicalcici se evidenţiază cu AgNO3)
Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii
1. Cristalele devin albe şi au tendinţa de
expansiune
probabil sare (clorura)
2. Cristalele capată culoarea galbenă şi apar
excrescenţe aciculare galbene
fosfat dicalcic
3. Se formează ace de culoare albă, solubile
sulfaţi de Mn sau Mg
Testul cu AgNO3 (6)
4. Particulele devin incet negre fragmente de oase
1. Efervescenţa puternică CaCO3 Testul cu HCl (2)
2. Lipsa efervescenţei sau de mica intensitate se efectueaza testele
următoare
Testul cu molibdat (7)
1. Formare de cristale galbene la mica distanţa
de particulã
fosfat tricalcic, orice os sau
roca fosfaticã 61
1. Particulele dezintegrate flotează şi devin de
culoare roz-rosietica
proteine
2. Particulele dezintegrate flotează şi devin de
culoare roz-rosietică şi se decolorează în cca. 5
min.
fosfaţi din os
3. Particulele se umflă dar ramân în partea
inferioară
rocă fosfatica defluorinată
Testul Millon (8)
4. Particulele se dizolva incet rocă fosfatică
Testul cu H2SO4 (9)
1. Se formeaza cristale aciculare, lungi la
adăugare de acid sulfuric la soluţia acidă
(HCl) a particulei
prezenţa calciului.
Testul cu
CH COOH(17)
1. Particulele se dizolva cu efervescenţa CaCO3
2. Particulele nu se dizolva (dar se dizolva în
HCl)
Oxalat de calciu
Testul cu
KOH/KClO3(10,11)
1. Particule rezistente la acţiunea reactivilor Cărbune sau cochilii
calcinate
- 72 -
ANEXA 2.2
MODELE CRISTALINE CaCO3 (Calcit) CaCO3 (Aragonit) NaCl Oxalat de calciu Fosfat monocalcic Fosfat tricalcic
MgSO4 CaSO4
- 73 -
3.3 ŢESUTURI ANIMALE DIN FURAJE Domeniu de aplicare
Această metodă se va utiliza acolo unde detectarea constituenţilor de origine
animală (definiţi ca produse de la procesarea carcaselor sau părţilor acestora, de la
mamifere, pasãri sau peşti) din furaje, se efectueaza prin examen microscopic.
Constituenţii de origine animală sunt identificaţi pe baza caracterelor microscopice
tipice ( ex. fibre musculare, părţi de oase sau cartilaje, fire de păr, sânge, coaja de
ou, oase de peşte ,etc.). In cazul în care se cere şi o apreciere cantitativă a acestor
constituenţi, se vor urma instrucţiunile de la subcapitolul Calcul al acestui material.
Sensibilitate
In funcţie de natura constituenţilor (< 0.1 %)
Echipament şi accesorii (Vezi Anexa 1) .
Reactivi (vezi Anexa 2)
A. Pregătirea probei
Este necesară o foarte bună omogenizare a probei globale. Aglomerarile sau
granulele se mojarează usor sau se mărunţesc în moară cu cuţit la turaţie mică
(1500-2000 r.p.m.) timp de ~10 sec. In funcţie de natura materialului ( numai dacă
este necesar se mărunţeste) se iau cel putin 10 g de probă care se impart în două
fracţii, una de cel puţin 5 g pentru partea filtrată (pe site) şi una de cel putin 5 g
pentru sedimentul concentrat. Colorarea şi clarificarea cu reactivi este
recomandată pentru identificare (vezi anexa 3.1)
B. Examinare:
Identificarea constituenţilor de natură animală în filtrat
O cantitate de min. 5-10 g din probă este trecuta prin site ( 0,1-2 mm) în cel puţin
două fracţii. Fracţia cu dimensiuni >0.5 mm (sau o parte reprezentativa din fracţie)
se intinde în strat subţire pe un suport adecvat şi se cauta componenţii de origine
- 74 -
animală la stereomicroscop cu diferite puteri de mãrire (cel mult 50 x). In stratul(-
urile) cu <0.5 mm se caută componenţii de origine animală la microscopul compus
cu obiective diferite . Preparatul se execută prin fragmentarea şi clarificarea
particulei selectate iar examinarea se face intre lamă şi lamela. Clarificarea se face
iniţial cu parafină lichidă sau glicerină iar daca nu este suficient pentru
identificarea structurilor, clarificarea se efectueaza cu soluţie de cloralhidrat (3-4).
Identificarea constituenţilor din sediment concentrat
Se iau cel puţin 2 g (cântarite cu precizie 0.001 g) din proba se introduc într-un
flacon sau intr-o pâlnie de separare şi se adauga 15 ml de CHCl3. Dupa
omogenizare, se agită conţinutul de mai multe ori şi apoi se lasă în repaus (cel
puţin 1’ şi nu mai mult de 2-3’) pentru depunerea sedimentului.
Se decantează supernatantul şi sedimentul este uscat la etuva şi cântarit repetat
pâna la masa constantă (0.001g). Cântarirea este necesara numai în cazul în care
se face o apreciere cantitativă. Sedimentul se examineaza în intregime sau cota
parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop şi la microscop .
C. Calcul şi evaluare
În cazul în care estimarea cantitativă este necesară, se va proceda conform
acestui punct. Calculul poate fi făcut doar dacă constituenţii conţin fragmente de
oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere şi pasãri)
pot fi deosebite de oasele de peşte prin examen microscopic, pe baza vizualizării
lacunelor tipice. Proporţia de constituenţi de origine animală se poate calcula
ţinând cont de :
-proporţia estimată (masa %) de fragmente osoase din sediment, şi
-proporţia (masa %) de oase în constituenţii de origine animală identificaţi.
Estimarea se face pe bază a cel putin trei (daca este posibil) pâna la cinci câmpuri
pentru un strat. In nutreţurile combinate, de regula, sedimentul nu conţine numai
fragmente de oase, dar şi alte componente cu greutate specifica mare, de exemplu
minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate sau alte componente asemănătoare.
Calculul procentual al fragmentelor de oase
- 75 -
S x c
(b) Fragmente de oase % =
(animale terestre) W
S x d
(c) Fragmente de oase şi solzi % =
(peşte) W
(S =masa sedimentului [mg], c62= factor de corecţie [%] pentru
estimarea procentului de oase animale în sediment, d= factor de
corectie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi în
sediment, W=masa probei prelucrata pentru sedimentare {mg).
Estimarea valorii pentru constituenţi de origine animală
Proporţia de oase în produsele animale este variabilă. In cazul făinii de oase
procentul este de 50-60% iar în cazul făinii de carne de 20-30%; la făina de peşte
procentul de oase şi solzi este variabil în funcţie de specie, în general de 10-20%.
Daca se cunoaste specia de la care provine produsul, se poate calcula conţinutul
estimat:
Conţinut estimat de constituenţi de la animale terestre (%)
S x c
= x 100
(i) W x f
Conţinut estimat de constituenţi de peşte (%)
S x d
= x 100
- 76 -
(ii) W x f (S =masa sedimentului [mg], c63= factor de corecţie [%] pentru
estimarea procentului de oase animale în sediment, d64= factor de
corecţie [%] pentru estimarea procentului de oase de peşte şi solzi în
sediment, f = factorul de corecţie pentru proporţia de oase din
constituenţii de origine animală din probă, W=masa probei prelucrată
pentru sedimentare [mg]).
Exprimarea rezultatelor :
Pot exista urmatoarele situaţii :
La capacitatea de identificare la microscop, nu există constituenţi de origine
animală (asa cum sunt definiţi la pct. în proba analizată
La capacitatea de identificare la microscop, există constituenţi de origine animală
în proba analizată. In acest caz , raportul examinarii poate fi specificat astfel:
In funcţie de experienţa analistului :
-Exista constituenţi de origine animală. Continuţul de fragmente de oase
(peşte/animale terestre)
-In cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la
pasãri sau mamifere, este estimat un ordin de mãrire de ….%, egal cu ….%
constituenţi animali când se calculeaza în baza a ….% oase în constituenţi animali
utilizând factorul de corecţie f,
-sau, au fost gasiţi constituenţi de origine animală în cantitaţi măsurabile.
Pentru situaţiile când oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie
sa conţină date suplimentare, astfel :
-Posibilitatea ca următorii constituenţi sã fie derivaţi de la mamifere, nu poate fi
exclusă;
Aceasta clauza nu este necesară daca fragmentele de oase de la animale terestre au
fost identificate ca aparţinând pasãri lor sau mamiferelor.
63 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment 64 Factor de corecţie estimat de către analist în sediment
- 77 -
Recomandări
Se recomandă ca, în cazul constituenţilor voluminoşi şi în cantitate mare,
sedimentul obţinut la filtrare sã fie împărţit în doua fracţii (de exemplu utilizarea
unei site cu ochiuri de 250 m [ 0.3]). Fracţiunea cu constituenţi voluminoşi poate
fi examinată ca preparat cu ulei de parafină iar fracţiunea cu particule fine trebuie
examinată la microscop.
Sedimentul concentrat, dacă este necesar, poate fi divizat mai departe utilizând un
agent de concentrare cu densitate mai mare sau poate fi examinat prin spălari
succesive cu apă şi cloroform (sau clorură de metilen).
În funcţie de experienta analistului, identificarea originii poate fi fãcutã utilizând
un preparat specific histologic, prin care se face compararea cu preparatul probei.
ANEXA 3.1
TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI ANIMALE65
Test Reactie vizibila Rezultat posibil Observatii Agent de clarificare I şi II (3,4)
Prin incalzire usoară este clarificata structura matricei
Diferenţiere ţesut vegetal/osos
Parafina (ulei) (16) Prin flotaţie porii raman umpluţi cu aer
Structura osoasa
Testul Bradford(15) Reactiv specific pentru proteine –coloraţie albastră
Structuri proteice (ţesut muscular/osos)
1. coloraţia matricei albastru –violet
Amidon
2. coloraţia matricei galbenă Celuloza
Testul cu iod/iodura(5)
3. coloraţie galben-portocaliu/maron
Proteine
Testul Millon(8) Coloraţie roz la incălzire usoară Componente osoase
Testul pt. cistina(18) Coloraţie neagra/maronie la incălzire usoară
Constituenţi cu cistina –păr, fanere
65 A se compara şi cu Anexele 1.1 , 2.1, şi 2.2 pe timpul lucrului
78
ANEXA 1
APARATURA SI MATERIALE PENTRU MICROSCOPIE
Stereomicroscop cu iluminare ( 15-20 W) laterala/frontală şi transmisă cu filtre pentru
vizualizare –albastru (pentru culoarea naturală), verde (pentru fluorescenţă), alb mat
(antireflexie). Oculare necesare : 10 x (cu rigla de măsurare), 16 x, 32 x. Obiective
stereo: 1 x şi 1,6 x.
Microscop compus, binocular inclinat , lumina transmisă (30-100 W), condensor
reglabil, dispozitiv contrast. Oculare necesare : 7 x, 10 x. Obiective apocromatice : 6 x,
10 x, 20 x, 40 x şi pentru imersie 90-100 x.
Balanţa analitică ( 0,001 g)
Site circulare inoxidabile cu diametrul ochiurilor de la 5 mm – 0,1 mm şi vas de captare.
Moara electrică de laborator cu cuţit ( turaţie utila de la 1000 la 5000 rpm)
Mojar cu pistil pentru omogenizarea probelor cu solvenţi
Placi Petri de Ø = 90-150 mm
Lame de sticla standard pentru microscopie şi lamele
Placi de plastic transparent (55 x 100 mm) pe care se traseaza cu un vârf ascuţit linii
paralele (4,5 mm) la distanţa de 2 mm.
Spatula şi microspatule
Pensete –dreapta şi curba cu vârfuri ascuţite şi plate, bisturiu sau cutter
Micropipete ( volum util 5-200 L)
Pipete cu volum util de 1, 5, 10 mL
Centrifuga de laborator ( 6 x 10 mL) 1000-7000 rpm
Lampa UV -365 nm (15-30 W)
Lampa de examinare (150 W mat).
Sticlărie de laborator : eprubete, pahare Berzelius ( 100, 300, 800 mL), pahare
Ehrlenmeyer (100, 300 mL cu slif şi dop), pâlnii de separare (100-500 mL), pâlnii de
filtrare.
Hârtie de filtru (porozitate medie şi mica) Watman nr. 40-42.
- 79 -
ANEXA 2
REACTIVI66 PENTRU MICROSCOPIE 1) CHCl367 p.a.
2) HCl diluat (1:1) : 1 parte HCl + 1 parte apă
3) Agent de clarificare (I) : amestec de 10 g cloralhidrat/ 10 ml apa/ 10 ml glicerina
4) Agent de clarificare (II) : amestec de 160 g cloralhidrat în 100 ml apa + 10 ml HCl
5) Iod solutie: 0,75 g KI + 0,1 g I2 în 30 ml apă la care se adaugă 0,5 ml HCl (1:1)
6) AgNO3 soluţie 10 % în apă
7) Molibdat de amoniu soluţie : 10 g molibdat + 100 ml HNO3 se completează la 1000 ml.
8) Reactiv Millon (conţine azotat mercuric)
9) H2SO4 diluat (1:1) : 1 parte H2SO4 + 1 parte apa
10) KOH soluţie 5 %
11) KClO3 : se amestecă 0,5 g KClO3 cu HNO3 (diluat 1:1)
12) Fe(CH3COO)3 sau FeCl3 soluţie 1 % în apă (se prepară extempore)
13) Iod soluţie : ZnCl2 100 g se amestecă cu 60 ml apă în flacon cu dop la care se adaugă 20 g
KI şi 0.5 g I2. Se adaugă cateva cristale de I2 în amestec pentru saturare şi se lasă în repaus
14) Sudan IV soluţie alcoolică aprox . 0.09 %
15) Reactiv Bradford (utilizat pentru detectarea proteinelor)
16) Parafina (ulei)
17) CH3COOH diluat (1:1) : 1 parte CH3COOH + 1 parte apa
18) Reactiv pentru cistină ( 2 g acetat de plumb + 10 g NaOH se dizolva în 100 ml apa)
19) Rodamina 6G soluţie alcoolică 0,5 %
20) Floroglucinol soluţie : se amestecă 8 g floroglucinol cu 20 ml HCl concentrat şi se
completeazã la 100 ml cu alcool etilic.
21) Medii utilizate pentru obiectivele de imersie (recomandate glicerina şi uleiul de cedru)
66 In funcţie de natura componentelor identificate se pot folosi şi alţi reactivi care pot servi la identificarea matricei. 67 Se poate utiliza şi tetracloretan (d= 1,62)
Mediu lichid nd Apertura Glicerina 1.47158 1.35 Ulei de cedru 1.51525 1.40 Anisol 1.5163 1.40 Monobrom-naftalena 1.65820 1.60
- 80 -
ANEXA 3
STANDARD
ISO
STANDARD USA
DESCHIDERE NOMINALA
Ø (inch)
DIAMETRU NOMINAL AL FIRELOR SITEI
Ø (mm) 12.5 mm a 68 ½ in.a 0.500 2.67
11.2 mm 7/16 in 0.438 2.45 8.5 mm 3/8 in 0.375 2.27 8.0 mm 3/16 in 0.312 2.07 6.7 mm 0.265 in. 0.265 1.87 6.3 mm ¼ in.a 0.250 1.82 5.6 mm Nr 3½ 0.223 1.68 4.75 mm Nr 4 0.187 1.54 4.00 mm Nr 5 0.157 1.37 3.35 mm Nr 6 0.132 1.23 2.80 mm Nr 7 0.111 1.10 2.38 mm Nr 8 0.0937 1.00 2.00 mm Nr 10 0.0787 0.900 1.70 mm Nr 12 0.0661 0.810 1.40 mm Nr 14 0.0555 0.725 1.18 mm Nr 16 0.0469 0.650 1.00 mm Nr 18 0.0394 0.580 850 m Nr 20 0.0331 0.510 710 m Nr 25 0.0278 0.450 600 m Nr 30 0.0234 0.390 500 m Nr 35 0.0197 0.340 425 m Nr 40 0.0165 0.290 355m Nr 45 0.0139 0.247 300 m Nr 50 0.0117 0.215 250 m Nr 60 0.0098 0.180 212 m Nr 70 0.0083 0.152 180 m Nr 80 0.0070 0.131 150 m Nr 100 0.0059 0.110 125 m Nr 120 0.0049 0.091 106 m Nr 140 0.0041 0.076 90 m Nr 170 0.0035 0.064 75 m Nr 200 0.0029 0.053 63 m Nr 230 0.0025 0.044 53 m Nr 270 0.0021 0.037
68 Aceste dimensiuni nu sunt standardizate dar sunt incluse pentru cã sunt utilizate frecvent
- 81 -
BIBLIOGRAFIE
1. *** Council Directive 1999/29/EC of 22 April 1999 on the undesirable
substances and products in animal nutrition (E.C.O.J. n° L 115 of 04/05/1999,)
2. *** Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7
May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n° L 140 of
30/5/2002, p. 10).
3. Abdel-Fattah, M., Rizk, A.M. and Hussiney H.A. 1991. Chemistry and toxicity
of Lolium species. In: Poisonous Plant Contamination of Edible Plants (eds. Rizk
A.F.M. and Hussiney H.A.), pp. 95-106. CRC Press Inc, Baton Rouge, USA.
4. Adeyemi, O.A., Balogun, M.O. and Fasina, 2001. Response of finishing
broilers to graded levels of boiled Jatropha seeds , Ind. J. Anim. Sci. 71, 800-803.
5. Ahmed, O.M.M. and Adam, S.E.I. 1979. Effects of Jatropha curcas on calves.
Vet. Pathol. 16, 476-482.
6. Astwood E.B., Greer, M.A, Ettlinger, M.G. (1949): J. Biol. Chem. 181, 121.
7. Basu, A.K., Ghosh, A. and Dutta, J. 1973. Fatty acid composition of mustard
(Brassica nigra) seed oil by gas-liquid chromatography. J Chromatogr.86, 232-
233.
8. Berkov, S. and Philipov, S. 2002. Alkaloid production in diploid and
autotetraploid plants of Datura stramonium. Pharm. Biol. 40, 617-621.
9. Blankenship, J.D., Spiering, M.J., Wilkinson, H.H., Fannin, F.F., Bush, L.P.si
Schardl, C.L., 2001. Production of loline alkaloids by the grass endophyte,
Neotyphodium uncinatum, in defined media. Phytochem. 58, 395-401.
10. Budin, J.T., Breene,W.M. and Putnam, D.H. 1995. Some compositional
properties of camelina (Camelina sativa L. Crantz) seeds and oils. J. Am. Oil
Chem. Soc. 72, 309-315.
- 82 -
11. El Dirdiri N.I., Wasfi I.A., Adam S.E.I.. Toxicity of Datura stramonium to
sheep and goats. Vet. Hum. Toxicol. 23, 242-246, (1981)
12. Fenwick, G., Heaney, R. and Mullin, W. 1983. Glucosinolates and their
breakdown products in food and food plants. CRC, Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 18,
123-201.
13. Gao, Z.C., Jiang,Y.X., Li, J.F., Hou, S.S., Li, J. and Liu, X.M. 1989.
Performance of growing-fattening pigs fed with glandless cottonseed meal.
Chinese oeJ.Anim. Sci. 25 , 13-16.
14. Rangkadilok, N., Nicolas, M.E., Bennett, R.N., Premier, R.R., Eagling, D.R.
and Taylor, P.W.J. 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphanin
in three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleracea
var. italica). Scientia Horticulturae, 96, 11-26.
15. Dini Luciana , Food microscopy/microstructure, Dipartimento di Scienze,
Universita de Lecce, 2000.
16. B. Herman and J. J. Lemasters (eds.), Optical Microscopy: Emerging Methods
and Applications. Academic Press, New York, 1993,