1
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE DIN CRAIOVA
FACULTATEA DE MEDICINA
TEZA DE DOCTORAT
Dinamica şi semnificaţia citokinelor în cele 3 faze ale evoluţiei marilor arşi
Coordonator Stiinţific, Prof.Univ. Dr. Florea Purcaru
Doctorand, Novac Marius Bogdan
Craiova 2010
2
CUPRINS DATE GENERALE. Stadiul cunoaşterii. Pag.
I.Evaluarea şi definirea categoriei marilor arşi. 3
II.Fiziopatologia şocului la marii arşi în cele 3 faze evolutive. 3
III.Proprietăţle citokinelor pro-inflamatorii şi antiinflamatorii 5
IV.Imunomodularea adaptativă la marii arşi 6
V.Evoluţie.Prognostic 7
PARTEA SPECIALĂ. Studiul Personal
I.Scopul si obiectivele studiului 8
II.Material şi metodă 8
III.Studiul clinic. Analiza statistică 10
Rezultatele studiului clinic si a analizei statistice
IV.Studiul imunologic 11
Rezultatele studiului imunologic
V.Studiul Imunohistochimic 15
Rezultatele studiului imunohistochimic şi histopatologic
Concluzii finale. 17
Bibliografie selectivă 19
3
DATE GENERALE. Stadiul cunoaşterii. I. Evaluarea şi definirea categoriei marilor arşi Arsurile ramân o importantă cauză de mortalitate şi morbiditate pe plan mondial. Complicaţiile infecţioase care includ sepsisul, şocul septic şi insuficienţa organică multiplă reprezintă o patologie comună la pacienţii cu arsuri moderate şi severe. În 1992 a fost stabilit un consens al definiţiilor pentru diagnosticul SIRS şi MODS (7).În anul 2001, The International Sepsis Definitions Conference care a avut loc la Washington D. C., prin întâlnirea a 29 participanţi din Europa şi America de Nord, a revizuit şi actualizat definiţiile referitoare la SIRS, sepsis, MODS. Scopul acestei conferinţe a fost de a identifica metodologia pentru creşterea acurateţii, a reabilitării şi/sau a utilizării clinice a definiţiei sepsisului. În ianuarie 2007, American Burn Asociation a organizat o Conferinţă de consens pentru definirea unui consens al sepsisului şi infecţiei la arşi. Utilizând sistemul acestei clasificări, la Conferinţa de Consens din 2001 s-a implementat o schemă de clasificare numita PIRO: condiţii Predispozante, natura şi extensia Injuriei, natura şi magnitudinea Răspunsului organismului, şi gradul disfuncţiei Organelor. Statusul inflamator postagresional a fost definit clinic ca SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome). SIRS poate duce la sindromul de disfuncţie organică multiplă (MODS) şi moarte, în special dacă apar complicaţiile infecţioase Evaluarea leziunilor de arsură Clasificare: în raport cu agenţii vulneranţi arsurile se clasifică în:
termice: produse în urma acţiunii căldurii; chimice: rezultat al acţiunii unor substanţe chimice; electrice: apărute sub acţiunea curentului electric.
Clasificarea leziunilor de arsură Arsura este o boală care debutează în momentul lezării tegumentelor, are o
evoluţie sistemica , afectează toate sistemele şi organele arsului şi se continuă mult timp după ce leziunile locale au fost vindecate. Toate aceste elemente necesită o supraveghere a bolnavului ars cu evaluarea leziunilor şi stabilirea unui prognostic. În acest sens s-a propus o clasificare a arsurilor ţinându-se seama de două repere histologice: joncţiunea dermo-epidermică delimitată de stratul bazal al epidermului (epiteliu germinativ) şi anexele cutanate, reprezentate de foliculul pilos, glandele sebacee şi sudoripare, elemente deosebit de importante, deoarece ele sunt tapetate de un epiteliu germinativ, esenţial în vindecare. II. Fiziopatologia şocului la marii arşi în cele 3 faze evolutive Trigger-ul răspunsului sistemic
Leziunea locală de arsură este rezultatul unui transfer de caldură asupra ţesuturilor şi reprezintă o entitate dinamică. Sistemul imunitar de apărare acţionează împotriva infecţiei, prin ambele mecanisme de apărare, înnăscută sau naturală şi dobândită. Apărarea adaptativă implică o rearanjare a genelor, produce celule T şi B înalt specializate pentru recunoaşterea antigenilor. Apărarea prin imunitate înnăscută, în contrast, este rapid mobilizabilă şi este bactericidă.
Citokinele proinflamatorii (TNF-alfa, IL-1beta, IL-12, interferon) şi chemokinele (IL-8 şi altele) joacă un rol esenţial în apărarea locală. Anticorpii naturali, alternativa căii complementului şi inflamaţia locală sunt mecanisme de apărare înnăscută (9). Răspunsul sistemic al organismului la stresul termic
4
Ţesuturile devitalizate acţionează ca un self-antigen şi reprezintă un puternic activator al sistemului complementului. În acelaşi timp, limfokinele stocate în ţesuturi sau produse de celulele lezate stimulează invazia monocitelor şi le potenţează maturizarea, acestea fiind celulele responsabile cu devitalizarea şi curăţarea arsurii prin procesul de fagocitoză sistemică, ceea ce agravează cea de a doua insultă. Teoria „two-hit“ (63), se referă la faptul că două evenimente secvenţiale activatoare pot determina un răspuns maxim care poate provoca o inflamaţie sistemică.
Răspunsul organismului la injuria termică se manifestă prin multiple modificări care acţionează în sens constructiv sau distructiv, în funcţie de managementul cazului. Aspecte fiziologice ale răspunsului la injuria termică Faza I sau faza de iniţiere a inflamaţiei
Injuria ţesuturilor duce la activarea a cinci iniţiatori ai inflamaţiei, iniţiatori care sunt interactivi şi provoacă elaborarea mediatorului secundar sau a semnalului efector. Faza a II-a sau răspunsul fagocitar De la nivelul epicentrului leziunii spre site-urile receptoare ale celulelor endoteliale vasculare are loc difuziunea chemokinelor, cu activarea neutrofilelor şi a chemokinelor cu specificitate pentru neutrofile.
Răspunsul sistemic are o serie de acţiuni pozitive creşte concentraţia serică a unor molecule (leucocite, macrofage) pentru
recunoaşterea microbilor invadanţi, mobilizează leucocitele în circulatie şi creşte fluxul sanghin la nivelul locului de infecţie.
Răspunsul sistemic previne inflamaţia la nivelul altor ţesuturi prin neutralizarea moleculelor care induc inflamaţia, ca de exemplu citokinele, proteazele şi oxidanţii, care intră în sistemul sanghin, prin diminuarea răspunsului proinflamator al leucocitelor circulante.
Chiar dacă răspunsul local al ţesutului distrus este predominant proinflamator, multe celule antiinflamatoare sau modulatoare sunt produse la nivel local. S-a constatat că deşi se produc în general mediatori proinflamatori locali, concentraţia celulelor antiinflamatoare este mai mare la nivelul inflamaţiei locale decât concentraţia lor sanghină. Răspunsul sistemic normal poate fi imunosupresiv !
In ATI se ştie că trauma poate induce imunosupresie. Intensa activare a răspunsului sistemic normal, instalat posttraumă, poate induce un status de paralizare a imunităţii, aşa numita „imunosupresie endogenă” (100). La pacienţii traumatizaţi, nivelul sanghin al mediatorilor proinflamatori ca TNF-alfa, IL-1beta şi IL-12 poate fi nedetectabil sau neschimbat, în timp ce concentraţia de IL-4, IL-6, IL-10, prostaglandina E2 este crescută. Imunosupresia indusă de traumă poate perturba funcţia limfocitară şi inhiba reacţia întârziată de hipersensibilitate. Fiziopatologia manifestărilor sistemice la marii arşi
Evoluţia clinică la marii arşi se caracterizează secvenţial prin SIRS, sepsis, şocul septic, MODS, manifestări care depind de stadiul în care se intervine terapeutic. Manifestările sistemice generate de leziunea de arsură apar atunci când arsura acoperă peste 25% din suprafaţa corporală în cazul unui adult sănătos, dar sunt frecvente şi în suprafeţe mai mici (10-15%) în cazul copiilor, al bătrânilor şi adulţilor taraţi sau cu leziuni inhalatorii.
5
Din punct de vedere fiziopatologic, manifestările sistemice generate de leziunea de arsură parcurg două etape esenţiale, parţial suprapuse peste cele clinice:
A) etapa de şoc hipovolemic; B) etapa sindromului inflamator acut sistemic.
Mecanismul de apărare al organismului agresat acţionează iniţial prin intermediul imunităţii naturale şi anume prin recunoaşterea receptorilor (TLR-tool-like receptors) care interacţionează cu moleculele prezente în microorganisme. Citokinele proinflamatorii reglează adeziunea moleculară între neutrofile şi celulele endoteliale . Subgrupele celulelor T sunt modificate în sepsis: celulele Th (CD4+) pot fi împărţite în celule Th1 sau Th2. Celulele Th1 secretă în special citokine proinflamatorii, iar Th2 citokine antiinflamatorii (178). III. Proprietăţile citokinelor pro-inflamatorii şi antiinflamatorii
Termenul de citokine sau imunocite a fost folosit iniţial pentru separarea unui grup de proteine imunomodulatoare, denumite de asemenea imunotransmiţători, de un alt grup de factori de creştere, sau factori peptidici regulatori care modulează proliferarea şi bioactivitatea celulelor non-imune. Conceptul iniţial ”o celulă producătoare - o citokină -o celula ţintă” a fost invalidat de studierea mai atentă a fiecarei citokine în parte. Citokinele acţionează pe un spectru foarte larg asupra celulelor, mai larg decât hormonii. Poate cea mai importantă caracteristică a citokinelor care le deosebeşte de hormoni, este că acestea nu sunt produse de celule specializate organizate în ţesuturi glandulare.
Faptul că citokinele sunt secretate ca şi proteinele, înseamnă că locul unde se formează nu prezice locul unde vor acţiona (36).
Tipul, durata, şi de asemenea aria activităţilor celulare induse de o anumită citokină poate fi influenţată considerabil de microclimatul celulei, depinzând, de exemplu, de stadiul de maturare al celulei, de tipul de celule ce o înconjoară, de concentraţia de citokine, de combinaţia de celule prezentă în momentul respectiv şi chiar de secvenţa temporală a multiplelor citokine ce acţionează pe aceeaşi celulă (62). Citokinele sunt reglatori pozitivi sau negativi ai ciclului celular, ai diferenţierii, ai migrării, ai supravieţuirii celulare, ai apoptozei, ai transformării.
Citokinele sunt nişte arme puternice cu două tăişuri care pot fi triggerul unei cascade de reacţii şi pot avea reacţii secundare dincolo de efectul terapeutic aşteptat. Receptorii citokinici
Receptorii şi citokinele corespondente au fost subdivizate în câteva familii bazate pe structură şi activitate, citokinele acţionând asupra celulelor ţintă prin legarea lor de receptorii de membrană specifici.
Familia receptorilor hematopoietinelor sunt dimeri sau trimeri care conservă secvenţaTrp-Ser-X-Trp-Ser sequence.
Familia receptorilor Interferonului conservă cysteina şi include receptorii IFNα, IFNβ, şi IFNγ.
Familia receptorilor Tumor Necrosis Factor cuprinde câteva domenii extracelulare: receptori pentru TNFα şi TNFβ, ligandul membranar CD40 (important pentru celulele B şi activarea macrofagelor), Fas (care semnalează apoptoza celulelor).
Familia chemokinelor interacţionează cu proteina G. Această familie include receptorii pentru IL-8, MIP-1.
6
IV. Imunomodularea adaptativă la marii arşi Sistemul imun al pielii Ţesutul limfoid asociat pielii cuprinde keratinocite, celule Langerhans epidermale, celule T, celule endoteliale ale vaselor cutanate şi ganglioni limfatici regionali (14). Acest complex poartă denumirea de sistem imun al pielii (SIS-skin imun system).
In urma unei arsuri, reacţia care apare este caracterizată de hipermetabolism şi catabolism, care compromit sistemul imun şi duce la apariţia MODS. Mediatorii fazei acute sunt citokinele proinflamatorii, ca IL-1, IL-6, IL-8, TNF, sau a citokinelor antiinflamatorii ca IL-10, creşterea sintezei citokinelor pro-inflamtorii contribuind la instalarea hipermetabolismului şi a catabolismului (75). Limfocitele T există în număr mare la nivel tegumentar, aproximativ 90% din aceste celule găsindu-se la nivelul unităţii perivasculare dermice. Majoritatea sunt reprezentate de fenotipul celulelor T de memorie (CD45RO), cealaltă izoformă (CD45RA) fiind reprezentată de fenotipul celulelor T naive. Sepsisul şi insuficienţa multiorganică reprezintă cea mai importantă cauză de deces în terapia intensivă a arsului. Pacienţii cu sepsis prezintă o masivă apoptoză în organele limfoide. Limfocitele T dispar rapid după injuria termică, o creştere a acestora fiind observată abia după 48 de ore. Această lezare severă a limfocitelor este considerată a fi strâns legată de imunosupresia severă care apare după injuria termică. Limfocitele T de la nivelul pielii, datorită localizării superficiale şi stimulării antigenice permanente, determină un răspuns imun caracteristic (184). Injuria termică este frecvent asociată cu o supresie a imunităţii şi o pierdere a subpopulaţiilor limfocitare sanghine şi de la nivelul organelor limfoide. Limfocitele T reprezintă principalele celule ale sistemului imunitar.
Creşterea neadecvată a apoptozei celulelor T pe parcursul sau urmând injuria termică sau sepsisul, poate contribui la pierderea potenţialului responsiv al celulelor T. După instalarea SIRS, răspunsul imun scade în mod drastic. În primul stadiu al SIRS, citokinele proinflamatorii (IL-1, TNF-alfa) sunt produse ca răspuns la injurie. Dacă injuria originală este severă, mediatorii proinflamatori apar în circulaţia sistemică, astfel că citokinele antiinflamatorii pot interveni rapid pentru a regla inflamaţia iniţială. Dacă mecanismele de reglare ale răspunsului inflamator nu sunt funcţionale, o reacţie masivă inflamatorie poate determina o multiplă insuficienţă organică. Imunopatogenia răspunsului imun la marii arşi Citokinele în răspunsul imun postarsură Prezenţa citokinelor produse de monocite, macrofage, neutrofile, implică o amplificare importantă a răspunsului imun la infecţie şi determină o implicare directă în patogenia sepsisului postarsură. TNF-α şi IL-1 sunt produse precoce în raport cu activarea celulară şi reprezintă un stimul potent de activare a altor celule la nivel local sau la distanţă. Cascada citokinică. Cascada citokinică este alcătuită din 4 trepte: Treapta I (dependentă de macrofag)
Celulele responsabile de realizarea treptei I sunt macrofagele, iar citokinele implicate la acest nivel sunt IL-1 şi TNF-. Treapta II (Th 1-dependentă)
Celulele responsabile sunt limfocitele CD4 Th1, iar citokinele principale implicate sunt reprezentate de IL-2 şi IFN , şi în mai mică măsură de IL-12. Treapta III (Th 2-dependentă)
7
Treapta a III-a se realizează de către limfocitele CD4 Th2, prin citokinele aferente: IL-4, IL-10, IL-13. Treapta IV (inhibitoare)
Această treaptă se realizează, prin inhibinele complexului citokinic TGF-, care are o componentă inhibitoare asupra celulelor limfoide CD4 Th1, CD8 şi B, precum şi asupra celulelor NK. Celulele B sunt activate de celulele Th2 la nivel ganglionar.
Citokinele reprezintă o componentă a sistemului imun. Citokinele proinflamatorii sunt produse în mare parte de monocite şi macrofage, TNF-α şi IL-1ß sunt reglatori precoce ai răspunsului imun şi ambii determină eliberarea secundară a altor citokine, Il-6, IL-8. IL-10 este o citokină antiinflamatoare care reduce sinteza mediatorilor proinflamatori. Evaluarea precoce a pacienţilor cu traume majore şi prognosticul precoce al acestora este dificil de efectuat, tocmai din cauza multiplelor variabile existente .
Arsurile severe determină un răspuns imun adaptativ prin producerea de citokine eliberate sub influenţa celulelor Th 2. În cele mai multe cazuri, creşterea răspunsului de tip Th2 nu apare imediat după producerea injuriei termice, ci s-a remarcat că răspunsul Th2 este precedat de un răspuns tip Th 1. Celulele Th1 joacă un rol major în iniţierea răspunsului celular imun, iar celulele Th2 determină producerea de anticorpi şi joacă un rol în producerea de citokine. De altfel, răspunsul celulelor Th2 a fost legat de supresia imunităţii celulare. Imunosupresia şi dezvoltarea ulterioară a sepsisului sunt recunoscute ca o complicaţie majoră a injuriei termice (21). V. Evoluţie, prognostic Prognostic vital
Ambele tipuri de citokine, pro şi antiinflamatoare, apar în circulaţia sistemică în caz de şoc septic, MODS şi imunosupresie, contribuind la creşterea mortalităţii. Alterarea precoce a nivelului seric al IL-6 şi IL-10 poate constitui un marker predictiv pentru identificarea pacienţilor cu risc crescut de mortalitate după trauma arsurii.
Aceste citokine, alături de TNF pot fi utilizate ca factori predictivi ai mortalităţii, dar numai în interiorul a 24 ore, aceşti parametri nu pot fi consideraţi predictivi, dacă decesul survine mai târziu, după 6-15 zile. Aceste date demonstrează că răspunsul inflamator iniţial se corelează direct cu mortalitatea precoce şi nu cu cea tardivă. Calitatea vieţii
Vindecarea plăgilor este un proces dinamic, interactiv care implică mediatori solubili, celule sanghine, matrix extracelular şi celule parenchimale. Procesul de vindecare al plăgilor are trei faze: inflamaţia, formarea ţesutului şi remodelarea tisulară.
Procesul de cicatrizare ajunge la numai 20% în momentul închiderii plăgii, în primele 3 săptămâni, după care începe procesul de cicatrizare şi asuplizare a plăgii. Niciodată cicatricea nu va avea aceeaşi supleţe ca pielea intactă, maximul care se poate atinge este de 70% din supleţea pielii intacte (14). Epidermul are capacitatea de cicatrizare graţie celulelor suşe. Celulele suse cutanate reprezintă aproximativ 10% din keratinocitele stratului bazal epidermic. Aceste keratinocite din jurul ţesutului lezat, migrează şi proliferează la nivelul marginilor epidermice şi dermice pe care le acoperă în întregime cu un strat monocelular.
Rezultatele cercetărilor în domeniul vindecării plăgilor de arsură rămân limitate, datorită unei înţelegeri încă incomplete a mecanismelor fundamentale celulare ale procesului de cicatrizare.
8
PARTEA SPECIALĂ. I.Scopul si obiectivele studiului
Pornind de la dorinţa şi necesitatea de a identifica o posibilă rezolvare a problemelor ridicate de aspectul complex al modificărilor sistemice care intervin la pacienţii cu arsuri severe, s-a născut ideea realizării lucrării de faţă, cu titlul “Dinamica şi semnificaţia citokinelor în cele 3 faze ale evoluţiei marilor arşi”.
Complexitatea şi importanţa deosebită a problematicii analizate m-au dirijat în intenţia de a realiza un studiu de profunzime în această direcţie, deoarece combaterea complicaţiilor determinate de arsură reprezintă un deziderat major.
Scopul urmărit a fost acela de a preciza implicaţiile fiziopatologice şi importanţa practică a determinării şi monitorizării nivelurilor serice ale citokinelor în cele trei faze ale evoluţiei marilor arşi, corelate cu aspectul morfologic şi imunohistochimic local.
In acest sens, mi-am propus să studiez în dinamică nivelul seric al unor citokine proinflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-α) şi antiinflamatorii (IL-10), în funcţie de o serie de parametri clinici (suprafaţa corporală arsă, gradul arsurii, vârstă, sex, comorbidităţi, indice prognostic, etc.).
Luând în considerare interacţiunile şi legătura strânsă care există între factorul local şi cel sistemic, mi-am propus să realizez un studiu imunohistochimic al leziunii locale de arsură, corelat cu reacţia sistemică care, în ultimă instanţă pleaca tot de la nivel local.
Citokinele, ca polipeptide de semnalizare intercelulară produse de către celulele activate pe parcursul inflamaţiei şi care participă la producerea acesteia, sunt cel mai important stimulator al reacţiei sistemice, astfel că prin evaluarea lor în dinamică mi-am propus să monitorizez curba de evoluţie a citokinelor la cazurile cu arsuri severe, în vederea depistării momentului care anunţă decompensarea, în acest scop propunându-mi şi stabilirea unui cut-off specific pentru fiecare citokină studiată.
Obiectivele propuse a fi atinse sunt următoarele
Implicaţiile fiziopatologice şi implicaţiile practice ale determinării şi monitorizării nivelelor serice ale citokinelor în principalele faze evolutive ale bolnavilor cu arsuri severe.
Corelarea nivelului citokinelor cu aspectul imunohistochimic local. Corelarea măsurării gravităţii arsurilor severe şi a evoluţiei cazurilor, evidenţiată
prin utilizarea unor scoruri de gravitate (indicatori prognostici), cu evoluţia în dinamică a citokinelor.
Obţinerea unui scor prognostic cât mai exact la marii arşi, atât în ceea ce priveşte prognosticul, cât şi conduita terapeutică, în vederea studierii fiabilităţii lor şi aplicabilitatea asupra prognosticului mortalităţii la marii arsi, prin stabilirea unui cut-off, în cazul nostru o valoare, de la care se poate stabili dacă există probabilitatea sau nu a unui deces.
Obţinerea unor date noi în ceea ce priveşte „calitatea vieţii”, deoarece arsurile severe sunt urmate,de cele mai multe ori, de formarea unor cicatrici sechelare, inestetice şi afuncţionale.
II.Material si metoda Studiul prospectiv efectuat a cuprins un lot de 92 pacienţi cu arsuri severe în
perioada ianuarie 2005 – martie 2009. Studiul s-a desfăşurat în serviciul ATI şi Clinica de Chirurgie Plastică şi Recuperatorie din cadrul Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă
9
din Craiova în perioada ianuarie 2005 – decembrie 2008, analizând 92 pacienţi cu arsuri severe (35-67% suprafaţă corporală) internaţi în aceste servicii, care au reprezentat 14,30 % din numărul total al pacienţilor arşi internati si care au prezentat arsuri < 35% sau peste 67 % suprafaţa corporala.
Pacienţii au fost selecţionaţi dintr-un număr de 643.pacienţi adulti arşi admişi în cadrul Departamentului de Arşi din Clinica de Terapie Intensivă şi Clinica de Chirurgie Plastică şi Recuperatorie a Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Craiova, în această perioadă.
Au fost selecţionaţi pacienţii care prezentau arsuri severe întinse pe 35-67% suprafaţă corporală, cazurile sub 35% suprafaţă corporală şi peste 70% suprafaţă corporală fiind excluse, deoarece am considerat că la un procent de arsură sub 35% riscul vital este mai mic şi recuperarea este satisfacătoare, iar la un procent de arsură peste 70%, riscul vital este foarte mare, iar evoluţia locală şi sistemică este grevată de multiple complicaţii
S-a stabilit iniţial protocolul de investigare şi setul de parametri cuantificabili şi a unor parametri specifici de urmărire a cazurilor. S-a avut în vedere evaluarea clinică, evaluarea de laborator şi managementul fiecărui caz.
S-a avut în vedere evaluarea clinică cu întocmirea unei fişe specifice a arsului, cu evaluarea suprafeţei arse.
În vederea stabilirii corecte a severităţii evoluţiei arşilor şi a evaluării obiective a prognosticului, am utilizat scoruri prognostice bazate pe date clinice şi paraclinice obiective, cât mai rapid şi uşor de obţinut.
In acest sens am utilizat scoruri de prognostic ca indicele prognostic (IP),scorul Baux, scor ABSI (Abbreviated Burn Severity Index) -Tobiasen, scorul Blot, scor MODS (Multiple Organ Disfunction Scores), scorul Apache II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II), MPM (Mortality Probability Model).
Loturile de pacienţi incluse în studiu au fost structurate în funcţie de suprafaţa corporală arsă,gradul arsurii, ţinând cont de patologia asociată. Am exclus din studiu pacienţii care au prezentat la admisie comorbidităţi , realizând astfel un lot omogen de studiu.
Facem precizarea că o serie dintre aceste scoruri sunt utilizate în terapie intensivă, pentru calcularea unui scor prognostic al mortalităţii, la toţi pacienţii, nu numai la pacienţii arşi. Am folosit şi aceste scoruri de prognostic, deoarece evoluţia generală din primele ore a arsului în Terapia Intensivă este similară cu cea a pacienţilor cu traume de altă natură, încercând în acest fel să cuantificăm patologia sistemică indusă de arsură.
Pentru realizarea studiului imunologic s-a recoltat sânge periferic, care a fost prelucrat în vederea utilizării probei pentru evaluarea prin metoda ELISA, probele fiind recoltate în momentul admisiei în Departamentul de Arşi, apoi recoltarea a fost efectuată în zilele 3, 5, 7, 14 iar la unele cazuri recoltarea s-a efectuat şi în ziua a 21-a, la pacienţii care au supravieţuit până în această zi. La cazurile soldate cu deces, recoltarea nu a putut urma aceeaşi procedură de evaluare în dinamică, dar a fost sugestivă pentru evoluţia cazurilor.
Pentru studiul imunohistochimic, materialul cercetat a fost reprezentat de fragmente de tegument (ce conţineau atât zonă de ţesut sănătos cît şi zonă lezională) recoltate de la un număr de 92 pacienţi care au prezentat arsuri de gradul IIa,IIb,IIb/III şi
10
gradul III în zile diferite de la producerea arsurii, probele tisulare fiind recoltate în zilele 1, 5, 7 şi 14 din momentul producerii injuriei termice.
Pentru prelucrarea statistică a datelor s-au folosit pachetele software EPI2000, distribuit de OMS, SPSS, specializat în calcule statistice ştiinţifice, produs de firma SPSS şi modulul Data Analysis al programului MICROSOFT EXCEL, impreuna cu suita XLSTAT pentru MS Excel. III. STUDIUL CLINIC. ANALIZA STATISTICĂ Rezultatele studiului clinic si a analizei statistice
Pentru a cauta caracteristicile diferite ale pacienţilor cu arsuri, am divizat lotul de subiecţi în 3 subloturi :
lotul 1: pacienţi cu arsuri pe suprafaţa<45%, dar > 35% lotul 2: pacienţi cu arsuri pe suprafaţa≥45%, dar <55% lotul 3: pacienţi cu arsuri pe suprafaţa≥55%, dar < 65%
Deasemeni, am mai folosit un lot martor,numit Lot 0 de pacienţi cu arsuri pe suprafaţa corporală de < 10%.
Am stabilit iniţial protocolul de investigare şi setul de parametri cuantificabili şi a unor parametri specifici de urmărire a cazurilor. In evaluarea clinică am luat în considerare o serie de parametri clinici generali : suprafaţa arsă, gradul arsurii, vârsta, mediul de provenienţă, tipul agentului cauzant, interesarea căilor aeriene superioare, evoluţia.
Calculând repartiţia deceselor în funcţie de agentul de arsură, am remarcat că în cazul agentului termic decesele au fost cele mai frecvente (32,14%), acest lot fiind şi cel care a prezentat cele mai multe cazuri.
In ceea ce priveşte evoluţia pacienţilor arşi am corelat rata de deces cu o serie de parametri clinici, constatând că în cazul deceselor diferenţa dintre cele doua sexe a fost minimă (2 cazuri), pe când la lotul de supravieţuitori a predominat sexul masculin.
Am remarcat un număr mai mare de decese la grupele de vârstă 60-70 ani şi peste 70 ani, dar am remarcat că totuşi diferenţa dintre cele două categorii (deces şi supravieţuire) nu a fost mare ca număr absolut, doar de 3 şi respectiv 2 cazuri. In această situaţie nu putem trage o concluzie fermă, referitor la decesele produse si vârsta pacienţilor, ci doar numărul mai mare de decese produse la aceste categorii de pacienţi care poate fi datorat tarelor asociate şi a insuficientului răspuns imun.
Pacienţii arşi s-au prezentat având mai multe grade de arsură , cel puţin 2 tipuri de leziuni, în unele cazuri două tipuri de leziuni grave, de un grad înalt şi doar la puţine cazuri, 8,69% am avut arsuri de gradul 1 şi 2a, iar la 13,04% am întâlnit pacienţi care aveau numai arsuri de gradul 3. Restul pacienţilor arşi au prezentat arsuri de diferite grade, combinate, arsuri severe alternând cu zone cu arsuri de un grad mai mic. Rezultatele analizei statistice a indicilor prognostici
Semnificativ pentru analiza statistică a cazurilor au fost Testul t al lui Student, de comparare a mediilor pentru 2 loturi, testul Chi pătrat, testul exact al lui Fisher, Odds Ratio (“raportul şanselor”) şi Relative Risk (“riscul relativ”).
Menţionăm că pentru o analiză statistică riguroasă, am luat în calcul şi lotul martor, analiza statistică efectuându-se pe întreg lotul de pacienţi în număr de 112.
Realizand curba ROC şi , implicit, tabelul cu senzitivitatea şi specificitatea, când indicii prognostici iau diverse valori, se remarcă următoarele rezultate, ca limite utile în folosirea prognostică a valorii indicatorilor prognostici pentru probabilitatea de deces.
11
Astfel, pentru IP, propunem ca nivel limită, cut-off, valoarea de 120 şi putem afirma că valoarea IP>120 arată o posibilitate semnificativ statistic mai mare de deces.
Pentru Indicele Baux valoarea Indicelui Baux>100 arata un risc semnificativ statistic mai mare de deces.
Analiza Indicelui ABSI ne-a arătat că valoarea Indicelui ABSI >9 arata un risc semnificativ statistic mai mare de deces.
Rezultatele analizei statistice pentru Scorul MODS, au arătat că valoarea scorului MODS>9 arată o posibilitate semnificativ statistic mai mare de deces.
Rezultatele analizei statistice pentru Scorul de mortalitate Blot au arătat că valoarea scorului de mortalitate Blot>3 arata un risc semnificativ statistic mai mare de deces.
Analiza statistică pentru scorul APACHE II a arătat un cut-off de 25 pentru scorul APACHE II.
Rezultatele analizei statistice pentru Scorul MPM (Mortality Prediction Models), a arătat un cut-off de 55 pentru scorul MPM0, un cut-off de 40 pentru MPM24 şi un cut-off de 43 pentru MPM48 . Deoarece în Departamentul de arşi al ATI, au fost spitalizaţi pacienţi şi peste cele 48 ore, am calculat şi scorul MPM over time, pentru a vedea care este predicţia pe termen lung a pacienţilor. Am constatat că valoarea MPMOT >53 arata un risc semnificativ statistic mai mare de deces.
Din studiul statistic al indicilor prognostici, s-au remarcat ca markeri care pot fi utilizaţi pentru supravegherea evoluţiei pacienţilor arşi, indicele ABSI şi scorul de mortalitate Blot, ca fiind cei mai fideli markeri de prognostic ai decesului, în studiul nostru.
Prin stabilirea valorilor cut-off a indicilor şi scorurilor studiaţi, putem afirma că există o diferenţă statistic semnificativă în distribuţia deceselor în funcţie de valoarea cut-off, deoarece valorile au depăşit pragul de încredere de 95% (p<0.05) şi pe cel de încredere de 99% (p< 0,01). IV. STUDIUL IMUNOLOGIC Rezultatele studiului imunologic
Am considerat reprezentativ şi ne-am propus să studiem, ca metodă neinvazivă şi uşor de abordat în practica medicală, care este nivelul seric al unor citokine proinflamatorii (factor de necroză tumoral TNF, 6-IL 6) şi antiinflamatorii (interleukina-10) prin tehnica imunoenzimatică ELISA, utilizând kituri pentru interleukine umane. Am luat în considerare aceste investigaţii având în vedere că nivelul plasmatic al interleukinelor, citokinele pro sau anti-inflamatorii sunt specifice severităţii răspunsului inflamator şi infecţiei, pot fi corelate cu evoluţia sau prognosticul pacienţilor.
Evoluţia fiecărei citokine a fost interpretată corelând nivelul şi dinamica acesteia în funcţie de timpul scurs de la momentul injuriei termice, agentul vulnerant, sepsis, supravieţuire sau deces,suprafaţa corporală arsă, instalarea complicaţiilor care pot duce la deces, propunându-mi realizarea unui tablou clar al dinamicii celor trei citokine la pacientii cu arsuri severe. Dinamica citokinelor proinflamatorii şi antiinflamatorii la pacienţii arşi
Modificările dinamice care apar la nivelurile circulante al IL-6,IL-10 şi TNFα implică aceste citokine în răspunsul timpuriu postinjurie termică. O creştere moderată a acestor citokine este deci benefică, dar în momentul în care balanţa dintre citokinele proinflamatorii şi cele antiinflamatorii se rupe, fenomen asociat cu un răspuns inflamator
12
exagerat şi hipermetabolism, evoluţia clinică a pacienţilor devine nefavorabilă, fapt evidenţiat clinic după primele 7 zile postinjurie termică.
În ceea ce priveşte dinamica TNFα , aparent, şocul este elementul esenţial de care se leagă producerea şi eliberarea de TNFα. TNFα reprezintă o citokină de alarmă, ea fiind printre primele care se eliberează pentru activarea fagocitelor şi care apare la începutul cascadei citokinelor, inducând apoi eliberarea altor citokine.
În studiul de faţă, corelaţiile efectuate şi urmărirea evoluţiei pacienţilor arşi , ne fac să afirmăm că aceasta citokină este importantă nu atât ca diagnostic, ci mai ales ca urmărire a severităţii şi prognosticului evoluţiei pacienţilor arşi la care s-a suprapus o infecţie şi trebuie corelat cu IL 6 în supravegherea pacienţilor, deoarece se pare ca TNFα poate stimula, pe căi secundare, sinteza de IL 6.
Coreland dinamica şi nivelul TNFα cu supravieţuirea sau decesul şi de asemenea cu rolul TNFα în prognozarea sepsisului am constatat că această citokină prezintă o creştere importantă a concentraţiei încă din primele ore ale aplicării injuriei termice la pacienţii decedaţi ulterior. La subgrupele de supravieţuitori, la care fie sepsisul s-a dezvoltat ulterior , fie nu s-a dezvoltat , am constatat că dinamica TNFα a fost lentă în primele 24 ore, pentru ca apoi, nivelul plasmatic să crească brusc, creştere care a prezentat un peak în ziua a 5-a , pentru pacienţii care nu au dezvoltat sepsis şi un peak în ziua a 7-a pentru pacienţii care au dezvoltat sepsis. După acest peak, valorile plasmatice au început să scadă pe o pantă bruscă până în ziua a 14-a şi apoi mai lent până în ziua a 21-a, dar fără să revină la valorile normale până în această zi.
Deşi valorile TNFα se menţin ridicate la pacienţii care decedează, nu putem totuşi considera că putem folosi TNFα ca predictor al mortalitatii, deoarece la toţi pacienţii, valorile absolute au fost ridicate.
Comparând loturile de pacienţi care au decedat cu cei care au supravieţuit , prin prisma evaluării dinamicii TNFα , am remarcat că o creştere precoce şi progresivă a TNFα este asociată cu un risc mare de deces la pacienţii cu arsuri severe.
Referitor la aceasta citokină şi indicatorii prognostici, se poate constata că scorul ABSI a avut cea mai bună corelare cu această citokină în ziua a 5-a, înainte de peak-ul TNFα, această citokină putând să fie un indicator al severităţii şi prognosticului pacienţilor arşi. Acest scor a fost urmat îndeapropape de IP şi indicele Baux.
TNFα pare să fie un indicator al severităţii şi prognosticului pacienţilor arşi iar creşterea precoce şi progresivă a TNFα se asociază cu un risc mai mare de deces la marii arşi.
În urma acestor determinări pe care le-am efectuat, am demonstrat că IL 6 nu apare numai ca urmare a endotoxinelor circulante, ci în special ca urmare a răspunsului inflamator.
În studiul efectuat, creşterea IL 6 în primele 3 zile a fost strict datorată fenomenului inflamator postinjurie termică, din datele clinice şi paraclinice pe care le deţinem referitoare la pacienţii din lotul de studiu, neavând motive să credem că ar fi survenit o infecţie în această perioadă.
În ceea ce priveşte dinamica IL 6 în funcţie de evoluţia pacienţilor arşi, către deces sau supravieţuire, am constatat că valorile concentraţiei IL 6 la pacienţii care au dezvoltat sepsis şi la cei care au decedat ,dar nu au avut sepsis, au fost crescute. La pacienţii care au decedat şi care au prezentat şi sepsis, s-a remarcat o creştere constantă a
13
concentraţiei IL 6 până în ziua a 7-a, când a prezentat un peak de 610,5 pg/ml, după care valorile au scazut până în ziua a 21-a, fără a reveni însa la valorile normale, 128,5 pg/ml.
IL 6 a fost crescută la cazurile cu sepsis, mai mult decât la cei fără sepsis şi la lotul martor, dar după ziua a 14 aceste valori nu au prezentat o diferenţiere semnificativă la supravieţuitori faţă de cei decedaţi, dinamica IL 6 fiind aceeaşi, de scădere.
În studiul efectuat am găsit o creştere precoce importantă a IL 6, dar numai la pacienţii care au dezvoltat sepsis şi care au supravieţuit, dinamica IL 6 în aceasta situaţie fiind bifazica, lucru pe care nu l-am întâlnit în literatura de specialitate . Probabil că prima creştere a IL 6 este dată de eliberarea precoce a IL 6 de la nivelul leziunii arse, mai ales la pacienţii cu arsuri severe, iar a doua creştere este dată de sistematizarea răspunsului inflamator. Aici trebuie avut în vedere şi faptul ca TNFα ar putea juca un rol cheie, deoarece aceasta citokină are capacitatea şi rolul de a amplifica eliberarea altor citokine. De asemenea pacienţii arşi eliberează concentraţii mari de IL 6 imediat postinjurie, aceste date sugerând că producerea de IL 6 este mult mai legată de distrugerea tesuturilor moi decât alte citokine.
În concluzie o creştere precoce, progresivă şi valori constant ridicate ale IL 6 pot face din această citokină un marker al sepsisului pentru ca recoltarea şi determinarea IL 6 s-au efectuat înainte de apariţia sepsisului.
Dintre pacienţii care au dezvoltat sepsis, ziua a 5-a considerăm că poate fi considerată ca discriminatorie între pacienţii care au supravieţuit şi cei care au decedat, deoarece în aceasta zi, la pacienţii supravieţuitori cu sepsis valorile plasmatice au început să scadă, pe când la cei cu sepsis care au decedat, valorile plasmatice ale IL 6 au continuat să crească.
In aceasta situaţie, scorul MODS este cel care ne-a dat indiciile prognostice cu senzitivitatea cea mai mare, dar în zilele precedente peak-ului de IL-6, ceea ce îl situează printre factorii prognostici care anunţă creşterea citokinei IL-6. Acest lucru este important, deoarece menţinerea unui nivel constant crescut al IL-6 încă din primele zile postinjurie termică, ar putea fi un factor de agravare pentru evoluţia arsului,în special la pacienţii care vor deceda şi mai ales la pacienţii cu sepsis .
IL-10 ca citokină antiinflamatorie, reglează producerea citokinelor proinflamatorii, previne activarea celulelor T antigen-specifice şi inhibă proliferarea celulelor T.
Urmărind evoluţia loturilor de pacienţi arşi şi corelarea nivelului IL 10 cu evoluţia cu/fără sepsis, am remarcat o diferenţă în evoluţia IL 10 la pacienţii care au supravieţuit faţă de cei care au decedat. La toate cazurile nivelul IL 10 a prezentat un peak în ziua a 5-a, indiferent de evoluţia cazurilor, chiar şi la lotul martor, valorile absolute fiind cele care au făcut diferenţierea, valorile plasmatice fiind cuprinse între 19,05 pg/ml la lotul martor, până la 64,3 la pacienţii cu sepsis care au decedat.
Un comportament deosebit al concentraţiei plasmatice a IL 10 a fost prezent la pacienţii care au decedat şi anume : după o valoare iniţială de 40,2 pg/ml la pacienţii decedaţi care au prezentat sepsis şi o valoare plasmatica de 45,6 pg/ml la pacienţii care au decedat fără a prezenta sepsis, a urmat o uşoară scădere a nivelului plasmatic în ziua a 3-a. Peak-ul din ziua a 5-a la pacienţii decedaţi a fost mult mai mare decât la pacienţii care au supravieţuit (valoare maxima de 65.3 pg/ml la decedaţi faţă de 50,4 pg/ml la supravieţuitori).
14
În acest fel, curba evoluţiei IL 10 a capatat un aspect bifazic, lucru pe care nu l-am întâlnit în alte studii. Afost descrisă o corelare a creşterii nivelului plasmatic a IL-10 cu un prognostic infaust a fost descrisă chiar şi această creştere care se produce la pacienţii care mor, dar un profil preletal nu a fost realizat.
Putem considera că o creştere a producţiei de IL-10 la pacienţii atât cu sepsis sever dar şi cu arsuri grave cu factori agravanti asociati, poate fi considerată ca relevantă pentru un fînal fatal, deoarece o creştere a IL-10 este asociată cu o imunosupresie severă. Un răspuns persistent compensator al citokinelor antiinflamatoare se caracterizează printr-o evoluţie severă fatală a sepsisului.
Se poate preciza că orice producere în exces a IL 10 este patognomonică pentru evoluţia arsului. Se pare că eliberarea IL 10 este dată predominent de TNFα , în vederea reglării şi inhibării sintezei citokinelor inflamatorii în vederea realizării unui răspuns imun corect.
Calcularea indicatorilor prognostici corelat cu IL-10,în primele 24 ore, ne-a arătat cea mai bună specificitate şi senzitivitate de 0,97 şi respectiv 0,89 la scorul APACHE II. O senzitivitate de peste 0,80 au mai prezentat si IP de 0,83, scorul ABSI, MPM la admisie şi MODS de 0,82.
Pentru a observa variaţiile care există între concentraţia citokinelor proinflamatoare şi cele antiinflamatoare în scopul relaţionării acestor variaţii cu apariţia şi dezvoltarea MODS, am urmărit corelaţia care există între nivelul plasmatic al TNFα , IL 6, IL 10 şi MODS.
Caracteristica dar şi diferenţa dintre TNFα şi IL 6 a fost ca în timp ce la TNFα creşterea s-a produs lent ca şi scăderea, la IL 6 creşterea şi scăderea nivelului plasmatic au urmat o pantă ascendentă şi descendentă bruscă, diferenţa dintre valorile intermediare fiind mare. Creşterea prelungită şi concentraţia crescută a IL 6 la pacienţii arşi poate fi luată în considerare atunci când apare precoce şi este progresivă, ca un element de prognostic şi de evoluţie către instalarea MODS.
Un răspuns inflamator persistent care prin creşterea concentraţiei IL 10 determină o imunosupresie, predispune pacientul la sepsis şi/sau MODS.
Corelarea indicatorilor prognostici cu dinamica celor 3 citokine studiate, a arătat că IP se corelează pozitiv cu dinamica TNFα şi IL-6, considerând din datele studiate că IP poate fi un indicator bun pentru decesele precoce.. IP nu se corelează cu dinamica IL-10 decât la pacienţii care au decedat, la cei care au supravieţuit, valorile IP fiind neconcordante cu dinamica IL-10.
Referitor la Indicele Baux, am remarcat că valorile sale sunt aproximativ constante la pacienţii care au decedat, fără a putea face astfel o diferenţiere între decesele precoce şi cele tardive, dar evoluţia sa arată că indicele Baux o corelare pozitivă cu dinamica TNFα, IL-6 şi IL-10.
Scorul ABSI poate fi un indicator bun pentru decesele precoce, el se corelează pozitiv cu dinamica TNFα, IL-6 şi IL-10, atât la pacienţii care au supravieţuit, cât şi la pacienţii care au decedat fiind un bun indicator prognostic al evoluţiei pacienţilor arşi.
Scorul MODS poate fi un indicator precoce pentru evoluţia cazurilor către MODS, având o corelare pozitivă şi cu dinamica TNFα, IL-6 şi IL-10.
Indicele de mortalitate Blot se corelează pozitiv cu dinamica TNFα şi a IL-6, fiind un bun indicator prognostic al evoluţiei pacienţilor arşi. Am putea spune ca Indicele de mortalitate Blot poate fi un indicator bun pentru deces în general. Nu am stabilit o
15
corelare semnificativă statistic între dinamica IL-10 şi evaluarea pentru Indicele de mortalitate Blot.
Scorul APACHE II se corelează pozitiv cu dinamica TNFα, IL-6 şi IL-10, fiind un bun indicator prognostic al evoluţiei pacienţilor arşi, mai ales dacă este efectuat la fiecare 24-48 ore.
Scorul MPM cu variantele sale, nu a prezentat o corelare pozitivă cu dinamica citokinelor decât pentru MPM-admisie şi MPM-24 ore, restul variabilelor fiind scazute şi fără semnificaţie statistică. V. STUDIUL IMUNOHISTOCHIMC Rezultatele studiului imunohistochimic şi histopatologic
Luând în considerare interacţiunile şi legătura strânsă care există între factorul local şi cel sistemic, mi-am propus să realizez un studiu imunohistochimic al leziunii locale de arsură, corelat cu dinamica citokinelor şi reacţia sistemică care, în ultimă instanţă pleacă tot de la nivel local. Eliberarea locală de citokine pro- şi antiinflamatoare în urma unor traume majore, indică potenţialul lor de a induce alterarea sistemică imunologică, în funcţie de balanţa care există între diferitele tipuri de citokine. Citokinele reprezintă o componentă a sistemului imun, factorul local fiind implicat în evoluţia arsului. Bazându-mă pe aceste elemente, am considerat necesar şi un studiu al leziunii locale, pentru a putea corela dinamica sistemică a citokinelor cu modificările locale, deoarece complexul care cuprinde keratinocite, celule Langerhans epidermale, celule T, celule endoteliale ale vaselor cutanate şi ganglioni limfatici regionali, poartă denumirea de sistem imun al pielii (SIS-skin imun system).
Obiectivul acestui studiu a fost găsirea unei legături între răspunsul sistemic al citokinelor şi caracteristicele locale ale leziunii de arsură, leziune care are o evoluţie dinamică , deoarece arsurile severe determină un răspuns imun adaptativ prin producerea de citokine eliberate sub influenţa celulelor Th1 şi Th 2.
În cele mai multe cazuri, creşterea răspunsului de tip Th2 nu apare imediat după producerea injuriei termice, ci s-a remarcat că răspunsul Th2 este precedat de un răspuns tip Th 1. Celulele Th1 joacă un rol major în iniţierea răspunsului celular imun, iar celulele Th2 determină producerea de anticorpi şi joacă un rol în producerea de citokine. De altfel, răspunsul celulelor Th2 a fost legat de supresia imunităţii celulare.
Injuria tisulară determină la nivelul pielii iniţierea unui răspuns inflamator, cu eliberarea de citokine la nivel local de către keratinocite, fibroblaste, celule endoteliale. Rolul secretor al epidermului este în mod special interesat, deoarece keratinocitele, prin secreţia suplimentară de proteine autocrine mai secretă şi citokine în spaţiul intercelular, influenţând la nivel local funcţiile de creştere , funcţia metabolică, inflamatorie şi imunologică.
Analiza imunomarcajului la CD45 RO, în cadrul studiului efectuat, a pus în evidenţă izolate celule inflamatorii marcate membranar cu acest anticorp în prima zi. Analiza imunomarcajului la CD45 RO în zilele următoare, a pus în evidenţă un număr mai mare de celule inflamatorii marcate membranar cu acest anticorp, sugerând faptul că intensificarea procesului inflamator s-a realizat pe seama creşterii numărului de limfocite T, au fost dispuse predominant la periferia stucturilor nodulare având astfel o distribuţie similară cu cea din foliculii limfoizi.
Corelând aceste date cu dinamica citokinelor, constatăm ca o creştere din prima zi, se corelează pozitiv cu IL 6 ale cărei valori au fost uşor crescute, dar mai ales cu IL
16
10, care a prezentat valori de 10 ori mai mari decât valorile maxime standard. Corelaţia este negativă pentru acest marker cu TNFα în primele 24 ore. Pentru zilele următoare, corelarea expresiei cu citokinele este negativă pentru citokinele proinflamatoare şi pozitivă pentru cele antiinflamatoare
Un mare număr de celule T exprimă o glicoproteina membranară, CLA-antigen asociat limfocitelor cutanate. După 5 zile de la injuria termică, analiza imunomarcajului la CLA, a evidenţiat o uşoară creştere a numărului de celule inflamatorii marcate membranar cu acest anticorp, dispuse predominant perivascular.
Limfocitele T se pare că dispar rapid după injuria termică, o creştere a acestora fiind observată abia după 48 de ore, confirmând producerea imunosupresiei aproape imediat după acţiunea agentului termic.
Tot în cadrul studiului sistemului imun al pielii am mai urmărit şi celulele B mature, cele care produc imunoglobulinele. În sepsis, celulele B (CD20), reprezintă o reducere dramatică la nivelul foliculilor limfoizi, faţă de altă traumă majoră.
Urmărirea şi analiza imunomarcajului la CD20 a fost negativă, sugerând absenţa limfocitelor B în primele 7 zile. Abia după 2 săptămâni analiza imunomarcajului la CD20 a pus în evidenţă prezenţa unui marcaj membranar în celulele inflamatorii dispuse de această dată în centrul structurilor nodulare din dermul superficial şi profund, demonstrând că imunosupresia din arsurile severe, se întinde pe o lungă perioadă de timp, faţă de lotul martor la care imunosupresia a fost pasageră şi fără complicaţii.
Există multiple populaţii celulare care sunt implicate în imunosupresia care apare după injuria termică, dar celulele CD8 ramân principalul factor implicat în răspunsul imun post arsură.
La pacienţii cu arsuri severe, sursa predominantă de interleukine antiinflamatorii este reprezentată de celulele CD8, care sunt capabile de o creştere de peste 5 ori a acestora după a 5-a zi. Expresia slabă a CD8 şi în ziua a 5-a, arată că arsurile severe induc o modificare semnificativă a răspunsului citokinelor în direcţia Th1 şi nu spre Th 2, adică în direcţia producerii de citokine antiinflamatoare. Expresia CD 8 începând din ziua a 7-a a inceput să crească; în ziua a 7-a se secretă mult mai multe citokine , realizându-se peak-ul citokinelor proinflamatoare, demonstrând că CD8 este implicată în creşterea expresiei citokinelor proinflamatoare IL 6 şi TNFα.
Reducerea masiva a CD8 se produce spre ziua a 14-a, aşa cum am gasit şi în acest studiu, vizualizat printr-un imuno marcaj slab pozitiv in această zi. Scăderea tardivă a CD8 poate fi o consecintă a apoptozei induse de leziunea de arsură.
Colagenul reprezintă substanţa fundamentală necesară cicatrizării plăgii, iar rata de epitelizare este parţial dependentă de prezenţa MMP. Determinarea expresiei MMP-2 a aratat în prima zi un imunomarcaj slab pozitiv în toate straturile epidermului, mai intens focal doar în keratinocitele stratului bazal. In studiul nostru, imunomarcajul pentru MMP-2 a devenit intens pozitiv încă din a 5-a zi, ceea ce ne face să emitem ipoteza că o expresie a MMP-2 marcată şi precoce, ar putea fi asociată cu o cicatrice de o calitate mai bună.
Analiza imunomarcajului la MMP 9 în prima zi, a evidenţiat un imunomarcaj pentru MMP-9 negativ la cazurile luate în studiu. In stadiile precoce ale traumei termice, nu se regaseşte activarea proMMP-9, în condiţiile în care TNF-α este un activator al proMMP-9.
17
Corelarea MMP9 cu nivelul TNF-α a fost pozitivă, deoarece în ziua a 5-a nivelul TNF-α a fost ridicat, TNF-α determinând transformarea proMMP-9 în MMP-9 matur, valorile TNF-α în această zi fiin de peste 11 ori mai mari decât valorile maxime standard.
Analiza imunomarcajului la MMP 9 în ziua a 14-a, a evidenţiat un marcaj pozitiv în epiteliul scuamos, predominant în straturile bazale, în glandele sebacee şi sudoripare, precum şi în celulele inflamatorii (limfocite, plasmocite, rare polimorfonucleare) , evidenţiind astfel implicarea sistemului MMP în procesul de cicatrizare.
Rolul pe care apoptoza îl are în sindromul septic şi dezvoltarea CARS şi MODS nu a fost încă suficient explorat, dar s-a sugerat că procesul apoptotic poate juca un rol determinant în complicaţiile din statusul septic. Creşterea apoptozei, mai ales în ţesutul limfoid şi unele ţesuturi parenchimatoase, poate contribui la asocierea MODS la sepsis şi poate reprezenta un target pentru o intervenţie terapeutică.
Studiind în continuare influenţa apoptozei, am constatat că imunomarcajul pentru Bcl-2 în ziua a 5-a, a relevat o expresie slab pozitivă în celulele stratului bazal şi mediu al epidermului şi slab pozitiv focal la nivelul anexelor pielii.
Analiza imunomarcajului din ziua a 7-a pentru Bcl-2, a arătat modificări faţă de etapele anterioare, care ne-a permis sa conchidem ca în timp ce populaţia celulară proliferează rapid pentru reconstrucţia tisulară, creşterea celulară este balansată de către apoptoză. Analiza imunomarcajului la Bcl-2 efectuat înziua a 14-a, a arătat aceeaşi caracteristică a exprimării, urmând evoluţia expresiei din ziua a 7-a. In acest sens expresia Bcl-2 a fost intens pozitivă pe toată grosimea epidermului şi la nivelul anexelor pielii.
Având în vedere că în această perioadă ar fi trebuit să avem o apoptoză scăzută şi deci o expresie marcată a Bcl-2 pentru o cicatrizare normală, prezenţa doar focală a expresiei Bcl-2, ar putea indica un defect de cicatrizare. Dar acest aspect nu a fost întâlnit la toate cazurile cu cicatrici keloide, deci nu putem trage o concluzie certă.
Ceea ce am remarcat este faptul că expresia Bcl-2 la nivelul fibroblastelor ar putea fi elementul cel mai semnificativ, deoarece o expresie intens pozitivă am întâlnit atât la nivelul epidermului cât şi la nivelul anexelor pielii.
Apoptoza este însă un proces local, care nu este influenţat semnificativ de starea generală a pacientului, ci mai ales de hipoxia dermala.
CONCLUZII FINALE
1. Evaluarea cât mai exactă a gravităţii şi prognosticului la marii arşi se poate face prin corelarea scorurilor clinice de gravitate cu dinamica plasmatică a citokinelor şi studiul imunohistochimic al leziunii locale.
2. Studiul clinic. In acest studiu, pacienţii au fost evaluaţi prin diverse scoruri de gravitate,
a relevat că cea mai bună sensibilitate şi specificitate s-a înregistrat la indicele Baux, ABSI şi scorul de mortalitate Blot. Scorul APACHE II este, de asemenea, fidel dacă este repetat la fiecare 24-78 ore.
Prin stabilirea valorilor cut-off a indicilor şi scorurilor studiaţi, putem afirma că există o diferenţă statistic semnificativă în distribuţia deceselor în funcţie de valoarea cut-off, deoarece valorile au depăşit pragul de încredere de 95% (p<0.05) şi pe cel de încredere de 99% (p< 0,01).
18
3. Studiul imunologic. Dinamica plasmatică a citokinelor studiate a arătat următoarele date: 3.A. TNFα
TNFα este o citokină ale cărei valori plasmatice cresc precoce încă din primele 24 ore de la debutul agresiunii termice. Creşterea a fost explozivă ( de 15-20 ori) în principal la pacienţii care au decedat ulterior. Creşterea a fost mult mai lentă la pacienţii care au supravieţuit. Se poate spune că are o valoare prognostică la anumite cazuri şi în special când se corelează şi cu alţi factori prognostici.
TNFα se corelează în dinamică cu scorul Baux, ABSI, APACHE II şi indicele de mortalitate Blot.
3.B. IL-6 pentru IL-6 cel mai semnificativ element este că a apărut o creştere a
valorilor plasmatice mai ales ca urmare a răspunsului inflamator şi ca urmare a complicaţiilor septice, putând fi astfel un indicator prognostic.
La pacienţii care au dezvoltat sepsis şi au supravieţuit, creşterea plasmatică a IL-6 a apărut precoce şi a avut o dinamică bifazică.
La pacienţii complicaţi cu sepsis şi MODS, creşterea plasmatică a IL-6 a apărut precoce, a fost progresivă, iar la cazurile soldate cu deces, s-a menţinut crescută până la deces.
Corelarea IL-6 cu indicii clinici prognostici, a fost pozitivă pentru IP, indicele Baux, scorul ABSI, indicele de mortalitate Blot, scorul APACHE II (repetat la fiecare 21-48 ore), MPM-admisie şi MPM la 24 ore.
3.C. IL-10 IL-10 a fost asociat cu o puternică imunosupresie Valorile plasmatice ale IL-10 au fost ridicate iniţial, în primele 24-48 ore,
indiferent de suprafaţa corporală arsă. Ulterior, dinamica IL-10 a fost diferenţiată în funcţie de suprafaţa corporală arsă, complicaţiile septice şi MODS, când poate fi considerată un marker prognostic.
Un răspuns inflamator persistent, însoţit de creşterea concentraţiei plasmatice a IL-10, induce imunosupresia care predispune la sepsis şi MODS.
Corelarea dinamicii IL-10 cu indicii clinici prognostici studiaţi a fost pozitivă pentru indicele Baux, scorul ABSI, scorul MODS şi APACHE II (repetat la fiecare 21-48 ore).
4. Studiul imunohistochimic al leziunii locale Acest studiu aduce argumente serioase despre legătura care există între
factorul local şi cel sistemic Dinamica sistemică a citokinelor a fost corelată cu modificările locale Limfocitele T care reprezintă principalele celule ale sistemului imun la
nivelul leziunii, au avut un comportament diferit la nivelul tegumentelor arse. Studiul a inclus modificările produse în zilele 1, 5, 7, 14 postarsură ale
anticorpilor IHC CLA, CD45RO, CD20, CD8, MMP-2, MMP-9, Bcl 2, corelate cu dinamica plasmatică a citokinelor studiate
CLA este implicată în sistemul imun al pielii. Imunomarcajul positiv a reprezentat existenţa unei leziuni inflamatorii şi s-a corelat pozitiv cu dinamica citokinelor proinflamatorii (TNFα, IL-6) şi negativ cu citokinele antiinflamatorii (IL-10).
19
CD45 RO care provine de la nivelul celulelor endoteliale, a fost stimulată de citokinele proinflamatorii studiate (TNFα, IL-6), pînă în ziua a 14-a, când concentraţia plasmatică a citokinelor proiinflamatorii a fost în scădere, căpătând apoi un imunomarcaj pozitiv corelat cu citokinele antiinflamatorii (IL-10), după această zi.
CD20 este implicată în reglarea şi expresia limfocitelor B. Analiza imunomarcajului a fost negativă, sugerând absenţa limfocitelor B, ceea ce s-a corelat cu imunosupresia dată de creşterea imediată a IL-6, IL-10 şi de creşterea lentă a TNFα.
CD 8 care reprezintă un factor important al sistemului imun, a reprezentat o sursă importantA de stimulare a producerii de citokine dupA ziua a 5-a, a 7-a.
Din studiul efectuat, scăderea tardivă a CD8 pare a fi consecinţa apoptozei induse de leziunea de arsură.
MMP-2 corelată cu dinamica citokinelor, a fost negativă în prima zi, dar intens pozitivă în zilele următoare în toate straturile epidermului.
Prezenţa precoce a expresiei imunohistochimice a MMP-2 poate fi asociată cu o cicatrice de calitate.
MMP-9 a avut o corelare pozitivă a expresiei sale cu dinamica IL-6 şi IL-10 ş negativă cu TNFα, având rol în modelarea colagenului.
Citokinele care pot controla mecanismele de interacţiune celulară au un rol esenţial în vindecarea plăgilor.
Modularea secretiei citokinelor este extrem de importantă, astfel încât
monitorizarea citokinelor poate da o imagine a evaluării reacţiei inflamatorii generalizate, lucru care poate clinic susţine un diagnostic şi poate reprezenta o metodă prognostică.
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA
1. Abraham E.,Matthay M.A.,Dinarello C.A.,Vincent J.L.,Cohen J., Opal S.M., Glauser M., Parsons P., Fisher C.J.Jr, Repine J.E., Consensus conference definitions for sepsis, septic shock, acute lung injury, and acute respiratory distress syndrome: time for a reevaluation,Crit.Care Med.;2000;28:232–235
2. Agay D, Andriollo-Sanchez M, Claeyssen R, Touvard L, Denis J, Roussel AM, Chancerelle Y., Interleukin-6, TNF-alpha and interleukin-1 beta levels in blood and tissue in severely burned rats., Eur. Cytokine Netw.; 2008 ;19(1):1-7
3. American College of Chest Physicians: Society of Critical Care Medicine Consensus Conference. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit. Care Med. 20:864-875, 1992
4. Apostolidou E, Grosomanidis V, Mouzaki V, Xenou E, Rodi M, Gogos C, Skourtis C, Vassilakos D, Giala M.,Proinflammatory versus anti-inflammatory cytokine profiles as an early predictor of outcome in severe multiple trauma, Critical Care; 2008; 12(Suppl 2):P195
5. Bandyopadhyay G, De A, Laudanski K, Li F, Lentz C, Bankey P, Miller-Graziano C. Negative signaling contributes to T-cell anergy in trauma patients. Crit. Care Med.; 2007; 35(3):794–801.
6. Baue A,Faist E,Fry DE, Multiple Organ Failure: Pathophysiology, Prevention, and Therapy,Ed. Springer, 2000;ISBN 0387987339, 9780387987330
20
7. Belgian Outcome in Burn Injury Study Group; Blot S, Brusselaers N, Monstrey S, Vandewoude K, De Waele JJ, Colpaert K, Decruyenaere J, Malbrain M, Lafaire C, Fauville JP, Jennes S, Casaer MP, Muller J, Jacquemin D, De Bacquer D, Hoste E., Development and validation of a model for prediction of mortality in patients with acute burn injury, Br J Surg.; 2009;96(1):111-7
8. Benelli R, Lorusso G, Albini A, Noonan DM., Cytokines and chemokines as regulators of angiogenesis in health and disease, Curr. Pharm. Des.;2006; 12(24): 3101-15
9. Blot S., Development and validation of a model for prediction of mortality in patients with acute burn injury: The Belgian Outcome in Burn Injury Study Group., Br. J. Surg.; 2008; 96(1): 111-117
10. Calvano S.E.,Xiao W., Richards D.R.,Felciano R.M.,Baker H.V., Cho R.J.,Chen R.O., Brownstein B.H., Cobb J.P., Tschoeke S.K.et al, A network-based analysis of systemic inflammation in humans,Nature; 2005;437:1032-1037
11. Cohen M.J., Carroll C., He L.K., Muthu K., Gamelli R.L., Jones S.B., Shankar R., Severity of burn injury and sepsis determines the cytokine responses of bone marrow progenitor-derived macrophages, J. Trauma.; 2007;62(4):858-67
12. Duan H, Chai J, Sheng Z, Yao Y, Yin H, Liang L, Shen C, Lin J., Effect of burn injury on apoptosis and expression of apoptosis-related genes/proteins in skeletal muscles of rats., Apoptosis. 2009 Jan;14(1):52-65
13. Economides AN, Carpenter LR, Rudge JS, Wong V, Koehler-Stec EM, Hartnett C, Pyles EA, Xu X, Daly TJ, Young MR, Fandl JP, Lee F, Carver S, McNay J, Bailey K, Ramakanth S, Hutabarat R, Huang TT, Radziejewski C, Yancopoulos GD, Stahl N. Cytokine traps: multi-component, high-affinity blockers of cytokine action. Nat. Med.; 2003;9:47–52.
14. Finnerty CC, Herndon DN, Chinkes DL, Jeschke MG, Serum cytokine differences in severely burned children with and without sepsis, Shock; 2007; 27:4-9.
15. Finnerty CC, Herndon DN, Przkora R, Pereira CT, Oliveira HM, Queiroz DM, Rocha AM, Jeschke MG. Cytokine expression profile over time in severely burned pediatric patients. Shock;2006; 26(1):13-19
16. Finnerty CC, Jeschke MG, Herndon DN, Gamelli R, Gibran N, Klein M, Silver G, Arnoldo B, Remick D, Tompkins RG, Temporal Cytokine Profiles In Severely Burned Patients: A Comparison Of Adults And Children, Mol Med.; 2008; 14(9-10): 553–560.
17. Finnerty CC, Przkora R, Herndon DN, Jeschke MG., Cytokine expression profile over time in burned mice, Cytokine; 2009 ;45(1):20-5.
18. Fram R.Y., Watson V.E., Herndon D.N., Modulatin of the hypermetabolic response after thermal injury, Dialysis Transplantation and Burns; 2006;17(1):1-8
19. Gauglitz GG, Finnerty CC, Herndon DH, Mlcak RP,Jeschke MG, Are serum cytokines early predictors for the outcome of burn patients with inhalation injuries who do not survive?; Critical Care;2008;12(3):1-8
20. Gauglitz GG, Song J, Herndon DN, Finnerty CC, Boehning DF, Barral JM, Jeschke MG, Characterization of the inflammatory response during acute and postacute phases after severe burn, Shock. 2008; 30(5):503-7
21
21. Gomez M, Wong DT, Stewart TE, Redelmeier DA, Fish JS., The FLAMES score accurately predicts mortality risk in burn patients, J.Trauma.;2008;65(3):636-45.
22. Gravante G, Delogu D, Esposito G, Montone A., Analysis of prognostic indexes and other parameters to predict the length of hospitalization in thermally burned patients., Burns; 2007; 33(3):312-5
23. Han Y-P, Yan C, Garner WL, Proteolytic Activation of Matrix metalloproteinase-9 in Skin Wound Healing Is Inhibited by α-1-Antichymotrypsin, J. Invest. Dermatol.; 2008; 128(9): 2334–2342.
24. Ipaktchi K, Mattar A., Niederbichler A.D., Hoesel L.M., Vollmannshauser S., Hemmila M. R.,. Su G.L,Daniel G. Remick D.G., Wang S.C.,Saman Arbabi S., Attenuating Burn Wound Inflammatory Signaling Reduces Systemic Inflammation and Acute Lung Injury,The Journal of Immunology; 2006;177: 8065–8071.
25. Ismail N, Stevenson HL, Walker DH. The role of TNF-a and IL-10 in the pathogenesis of severe murine monocytotropic ehrlichiosis: increased resistance of TNF receptor p55- and p75- deficient mice to fatal ehrlichial infection., Infect. Immun.;2006; 74:1846-1856
26. Jeschke MG, Mlcak RP, Finnerty CC, Norbury WB, Gauglitz GG, Kulp GA, Herndon DN., Burn size determines the inflammatory and hypermetabolic response, Crit Care. 2007;11(4):R90
27. Khwannimit B, Serial evaluation of the Multiple Organ Dysfunction Score,Sequential Organ Failure Assessment and Logistic Organ Dysfunction scores to predict ICU mortality in mixed critically ill patients, Critical Care 2008, 12(Suppl 2):P535
28. Lavrentieva A, Kontakiotis T, Lazaridis L, Tsotsolis N, Koumis J,Kyriazis G, Bitzani M, Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis? Burns;2007; 33(2):189-94.
29. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, et al, SCCM/ESICM/ACP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Intensive Care Med.; 2003; 29:530–538
30. Macedo JLS,Santos JB, Predictive factors of mortality in burn patients, Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo; 2007; 49(6):365-370
31. Maier B, Lefering R, Lehnert M, Laurer HL, Steudel WI, Neugebauer EA, Marzi I., Early versus late onset of multiple organ failure is associated with differing patterns of plasma cytokine biomarker expression and outcome after severe trauma, Shock; 2007;28(6):668-674.
32. Martynoga R,Fried M, APACHE II score may predict mortality in burns patients, Critical Care; 2009; 13(Suppl 1): from 29th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine Brussels, Belgium.
33. Mofikoya BO, Adeyemo WL, Abdus-salam AA., Keloid and hypertrophic scars: a review of recent developments in pathogenesis and management., Nig Q J Hosp Med.; 2007;17(4):134-9.
34. Opal SM, Concept of PIRO as a new conceptual framework to understand sepsis, Pediatr.Crit.Care Med.;2005;Vol. 6, No. 3 (Suppl.)
22
35. Pileri D., Accardo Palombo A., D’Amelio L., D’Arpa N., Amato G., Masellis A.,Cataldo V., Mogavero R., Napoli B., Lombardo C., Conte C., Concentrations of cytokines il-6 and il-10 in plasma of burn patients: their relationship to sepsis and outcome, Annals of Burns and Fire Disasters;2008; vol. XXI (4);182-187
36. Plackett T,Colantoni A,Heinrich S,Messingham K,Gamelli R,Kovacs E, The Early Acute Phase Response After Burn Injury in Mice., Journal of Burn Care & Research.;2007; 28(1):167-172
37. Purcaru Fl,Nicolcescu P,Chiuţu L,Novac M, Calina N, Sosea I, Anestezia la pacienţii cu sepsis sever,şoc septic, Cursul Naţional de Ghiduri si Protocoale în Anestezie Terapie Intensivă şi Medicina de Urgenţă, editia a III-a Timisoara 2005, "Actualităţi în anestezie, terapie intensivă şi medicina de urgenţă", sub redacţia Dorel Sandesc, Timisoara Cosmopolitan Art, 2005: ISBN 973-87539-2-9
38. Remick DG., Bolgos G., Copeland S., Siddiqui J., Role of interleukin-6 in mortality from and physiologic response to sepsis. Infect. Immun.;2005; 73:2751-2757
39. Shu Qiang, SHI Chang-chun, Zhang Xiang-hong, Shi Zhuo, Shi Shan-shan, Fang Xiang-ming, Chen Qi-xing, Stuber F., Interleukin 10.G microsatellite in the promoter region of the interleukin-10 gene in severe sepsis, Chinese Medical Journal, 2006, Vol. 119 No. 3 : 197-201
40. Sikora JP, Chlebna-Sokół D, Andrzejewska E, Chrul S, Polakowska E, Wysocka A, Sikora A, Clinical evaluation of proinflammatory cytokine inhibitors (sTNFR I, sTNFR II, IL-1 ra), anti-inflammatory cytokines (IL-10, IL-13) and activation of neutrophils after burn-induced inflammation, Scand. J. Immunol.; 2008 ; 68(2):145-52
41. The American Burn Association Consensus Conference on Burn Sepsis and Infection Group; Greenhalgh D.G. ;Saffle J.R. , Holmes J.; Gamelli R.L.; Palmieri T.; Horton J.W.. Tompkins R.G. , Traber D.L., Mozingo D.W. , Deitch E.A. ,Goodwin C.W., Herndon D.N. , Gallagher J., Sanford A.P. , Jeng J.C., Ahrenholz D.H., Neely A.N., O'Mara M.S., Wolf S.E. ,Purdue G.F. , Garner W.L., Yowler C.J., American Burn Association Consensus Conference to Define Sepsis and Infection in Burns., Journal of Burn Care & Research; Nov./Dec. 2007; 28(6):776-790
42. van der Veer WM, Bloemen MC, Ulrich MM, Molema G, van Zuijlen PP, Middelkoop E, Niessen FB, Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation, Burns. 2009 Feb;35(1):15-29
43. Wunder C, Eichelbronner O, Roewer N., Are IL-6, IL-10 and PCT plasma concentrations reliable for outcome prediction in severe sepsis? A comparison with APACHE III and SAPS II. Inflamm Res 2004;53:158-163.
44. Xiao H,Siddiqui J,Remick DG, Mechanisms of Mortality in Early and Late Sepsis, Infection And Immunity; 2006; p. 5227–5235
45. Zeng L, Gu W, Chen K, Jiang D, Zhang L, Du D, Hu P, Liu Q, Huang S, Jiang J., Clinical relevance of the interleukin 10 promoter polymorphisms in Chinese Han patients with major trauma: genetic association studies, Crit Care.; 2009; 26; 13(6): R188.
