Date post: | 26-Nov-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | mirela-petrescu |
View: | 71 times |
Download: | 10 times |
DIFICULTATI ALE DIAGNOSTICULUI DE
LABORATOR IN BOALA LYME
Daniela Badescu, Ani Ioana Cotar, Cornelia Ceianu,
Raluca Ioana Gatej
INCDMI Cantacuzino
Ixodes ricinus: in stanga stadiul de larva si adult femela ;
in dreapta stadiul de nimfa si adult mascul. Sursa:
Institut de Zoologie,Neuchâtel, Switzerland.
1 patrat mic = 1mm2
Aspecte clinice
Boala Lyme este in emisfera nordica una dintre cele mai frecvente boliinfectioase transmise de capusa.
Agentul patogen: Borrelia burgdorferi sensu lato - un complex de genospecii
dintre care frecvent intalnite in Europa sunt 3: B.b. sensustricto, B. afzelii, B. garinii.
Vectorii: capuse din genul Ixodes.
Evolutie multistadiala:
-stadiul I (borrelioza localizata cu manifestari precoce) debut 3-4 zile →6saptamani: ∙ eritem migrator (EM)
∙ limfocitom borreliozic (rar, mai ales la copii)
-stadiul II (borrelioza diseminata cu manifestari precoce) debut 6-12saptamani → cateva luni:
∙neuroborrelioza acuta - complicatia majora (~ 10% cazuri)
→ paralizie nerv facial→ meningita limfocitara→ radiculonevrita
∙ eritem migrator multiplu
∙ artrita recurenta
∙ cardita recurenta (tulb de cond-bloc AV)
Eritem migrator
Aspecte clinice (continuare)
-stadiul III (borrelioza diseminata cu manifestari tardive la cei netratati) debut
cateva luni → cativa ani;
∙ neuroborrelioza cronica (encefalomielita)
∙ acrodermatita cronica atrofica (ACA)
∙ artrita Lyme
Infectia cu B.b . poate fi asimptomatica!
Acrodermatita cronica atrofica
Diagnosticul in boala Lyme (I)
Diagnostic complex:
EM : diagnostic clinic + date epidemiologice (muscatura de capusa,
preferabil certificata de un medic ± zona endemica pt boala Lyme)
Testele de laborator nu sunt necesare. Se pot efectua:
− cultura din biopsii tegumentare pe medii speciale pentru borrelia
(dificil )
− testare serologica (IgM poate fi +/-)
Limfocitom borreliozic : diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste
de laborator (obligatorii pentru confirmare)
− teste serologice (IgM + )
− frotiuri din tesut pentru examen histologic
− cultura din biopsii tegumentare → vizualizare spirochete la
microscopul cu camp intunecat /PCR (dificil)
Diagnosticul in boala Lyme (II)
Neuroborrelioza acuta : diagnostic clinic +/- date epidemiologice +
teste de laborator (obligatorii pentru confirmare)
− detectie de anticorpi in probe de ser si lcr recoltate simultan
cu evidentierea producerii intratecale de anticorpi IgM si IgG
(index de anticorpi)
− detectie de benzi oligoclonale in lcr
− detectie de anticorpi in probe duble de ser cu modificarea
semnificativa in dinamica a titrului de anticorpi
− cultura din lcr
Cardita : diagnostic clinic +/- date epidemiologic + teste de laborator
(obligatorii pentru confirmare)
− modificarea semnificativa in dinamica ( pe probe duble de ser)
a titrului de anticorpi specifici IgG
− cultura din biopsii endomiocardice (+) → vizualizare
spirochete la microscopul cu camp intunecat /PCR
Diagnosticul in boala Lyme (III)
Artrita: diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste de laborator
(obligatorii pentru confirmare)
− teste serologice (IgG +++)
− cultura din lichidul sinovial sau/si tesut → vizualizare spirochete la
microscopul cu camp intunecat , IF /PCR
ACA : diagnostic clinic +/- date epidemiologic + teste de laborator
(obligatorii pentru confirmare)
− teste serologice (IgG +++)
− ex histologic
− cultura din biopsie tegumentara → vizualizare spirochete la
microscopul camp intunecat , IF /PCR
Diagnosticul in boala Lyme (IV)
Neuroborrelioza cronica: diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste
de laborator (obligatorii pentru confirmare)
− pleiocitoza limfocitara in lcr
− productie intratecala de anticorpi specifici (IgM si IgG prezenti
in probe de ser si lcr recoltate simultan)
− IgG specifici +++ in ser
− detectia de benzi oligoclonale specifice in lcr
Nivelul seric al anticorpilor poate creste ca urmare a evolutiei bolii sau a
instituirii tratamentului antibiotic si poate descreste in cursul procesului de
vindecare → recoltarea probelor biologice trebuie facuta la un interval de
minimum 3 luni pentru a observa descresterea nivelului IgG.
Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (I)
Metode directe
Microscopie - fara valoare diagnostica mare datorita numarului mic de
spirochete din probele clinice
- se utilizaeaza in corelatie cu cultura
Cultura - test de confirmare; mediu BSK II, BSK-H;
- in EM, ACA → biopsii de tegument → sensibilitate crescuta, in
absenta tratamentului; rata pozitivitate ~ 80%
→ sange → rata pozitivitate 10 - 40%
- in localizari extracutanate ale bolii → sange, lcr, lichid sinovial
→ sensibilitate scazuta
- durata mare in timp (1-12 saptamani)
- crestere lenta
- costuri ridicate
Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (II)
Teste de biologie moleculara (PCR)
- tintesc gene cromozomale si plasmidiale
- in EM si ACA sensibilitate mai crescuta (aprox 64% si respectiv
54%) pe probe de tegument
- in boala Lyme sensibilitate scazuta pe probe de sange (10-18%)
- in neuroborrelioza pe probe de lcr sensibilitate mai buna in forma
precoce acuta decat in cea tardiva
- in artrita Lyme sensibilitate de aprox 80-90% pe lichid sinovial
/membrana sinoviala mai ales la cei netratati (OspA)
- per ansamblu sensibilitate scazuta
Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (III)
Metode indirecte
Detectie de anticorpi in ser si lcr
Imunofluorescenta indirecta (IFA)
▪ Teste imunoenzimatice (ELISA si western blot) → cele mai utilizate
▪ Imunoprecipitare → un test foarte specific (100%) si sensibil (98%):
Luciferase Immunoprecipitation system (LIPS) care utilizeaza un antigen
obtinut prin tehnici de recombinare (VOVO =VlsEOspCVlsEOspC).
Diagnosticul serologic este utilizat in mod curent in boala Lyme.
In stadiul initial al bolii: predomina IgM, care se poate secreta in toate etapele
bolii in absenta tratamentului; tinte antigenice: flagelina (p41), OspC, VlsE,
p39
In stadiul II: IgM + IgG predominant; tinte antigenice : p39, p58, p83, VlsE, etc.
In stadiul III: IgG titruri mari; IgM foarte rar detectabil; tinte antigenice: p83/100,
p30, p39, p21, p58, p43, Osp17, etc
Dificultatile diagnosticului serologic:
Sunt legate in principal de :
a) raspunsul imun particular al gazdei din cadrul bolii Lyme si
b) dificultatea dezvoltarii de teste fata de multiplele antigene care se exprima
diferentiat in cursul bolii
a) Raspunsul imun al gazdei:
In faza initiala a bolii serologia poate fi negativa;
Anticorpii de tip IgM pot fi absenti/nedetectabili prin metodele curente;
IgM pot persista luni de zile;
IgG pot persista si dupa remisiunea clinica a bolii;
Existenta unor reactii incrucisate cu alte microorganisme→diagnostic diferential
Importanta interpretarii testelor de laborator in context clinic si epidemiologic!
Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (IV)
b) Dificultati ale dezvoltarii de teste fata de tintele antigenice mentionate:
- expresia unor antigene diferite in functie de gazda (OspA la capusa
nehranita → OspC la cea care a avut o masa de sange pe mamifer)
si de ciclul de evolutie al bolii
- expresia unor antigene exclusiv in vivo la mamifere (VlsE,BBK32)
- pierderea prin cultivare (pasaje multiple) a unor antigene codificate in
plasmide
Sensibilitatea si specificitatea truselor → functie de tipul antigenelor si de
stadiul de evolutie al bolii.
• SENSIBILITATE 20-50% in stadiul I
70-95% in stadiile II si III
• SPECIFICITATE 90-95% ELISA si WB cu antigene obtinute
prin recombinare (obligatoriu ≥ 95%
pentru WB)
Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (V)
Antigenele utilizate in truse ELISA :
- lizate celulare → reactii incrucisate ale proteinelor flagelare si heat-shock
(famHSP60 si HSP70 omologie cu GroEL si DNaK de la E.coli)
- antigene purificate si recombinate
- ELISA avantaje: automatizare,exprimare cantitativa /semicantitativa
Antigenele utilizate pentru WB:
- sunt separate prin greutatea moleculara
- utilizarea lor a permis identificarea celor imunodominante, cu specificitate
inalta
- dezavantaje: apreciere subiectiva a benzilor;
- in prezent exista posibilitatea evaluarii automatizate (scanner)
Algoritm de diagnostic in boala Lyme (I)
• ECDC, CDC, EUCALB (European Union Concerted Action on Lyme
Borreliosis) si alte organizatii propun un algoritm de diagnostic serologic
pentru boala Lyme in “doi pasi” (doua etape):
• Un test ELISA cu sensibilitate crescuta urmat de un test WB cu
specificitate mare pentru IgM si IgG.
Algoritm de diagnostic in boala Lyme (II)
Consideratii asupra rezultatelor serologice 2009-2010
• Activitatea de testare serologica pentru cazurile cu suspiciune de boala
Lyme se desfasoara in Laboratorul Infectii Transmise prin Vectori (ITV) din
INCDMI Cantacuzino din anul 2006.
• Incepand cu anul 2010 laboratorul participa la programul de supraveghere a
bolii Lyme in Romania, pentru zona de sud si est.
• Materiale si metode
• In anul 2009 (ianuarie-septembrie) s-au primit in Laboratorul ITV 615 probe
de ser si lcr provenind de la 582 cazuri cu suspiciune de boala Lyme .
• In anul 2010 in aceeasi perioada s-au primit 696 probe provenind de la 652
cazuri cu aceeasi suspiciune de boala .
• Probele au fost trimise de DSPJ, spitale, laboratoare si clinici private.
Repartitia probelor (ser, lcr) in functie
de provenienta
Probele clinice (ser si lcr) au fost testate cu trusele de diagnostic in vitro
ELISA (IgM / IgG Mikrogen si Euroimmun) si Western blot (IgM / IgG Line
Immunoblot Virotech) .
Trusele ELISA au o sensibilitate >95%, iar cele WB au o specificitate de
97,2%
Antigenele purificate si recombinate din WB sunt : OspC, VlsE, BmpA
(p39), p83, BBA36 (iv1), BBO323 (iv2), Crasp3 (iv3), PG (iv4), EBV.
(iv 1-4)→ antigene exprimate in vivo.
Criterii de interpretare a testelor WB
IgM Nici o banda / benzi < cut-off
Sau Negativ
IgG Nici o banda /benzi < cut-off / 1 banda IgG (nu VlsE)
IgM 1 banda (nu OspC)
Sau Echivoc
IgG VlsE
IgM OspC / ≥ 2 benzi IgM
Sau Pozitiv
IgG ≥ 2 benzi
Rezultate
• Lunile I-IX 2009: 615 probe (ser, lcr) testate
• → 84 pozitive testate exclusiv prin ELISA 126
→ 42 pozitive testate exclusiv prin WB total
• → 12 cazuri pozitive (ELISA +WB)
• Din 615 probe testate 465 au fost negative (75%).
• Lunile I-IX 2010: 696 probe (ser, lcr) testate
• → 99 pozitive testate exclusiv prin ELISA 128
• → 29 pozitive testate exclusiv prin WB total
• → 14 cazuri pozitive (ELISA+WB)
• Din 696 probe testate 540 au fost negative (77%).
• 11 cazuri din 12 pozitive in 2009 si 12 din cele 14 pozitive in 2010 au fost de la DSPJ!
• De ce?
• Necunoasterea algoritmului de diagnostic si a definitiei de caz de catre unii
• medici din sistemul sanitar public si privat
• Recoltare de seruri prematur fata de momentul debutului bolii
• Dificultati financiare
Repartitia cazurilor pozitive in functie
de respectarea algoritmului de
diagnostic
1 2 3 4 5 6 7 81 2 3
1-8 seruri pacienti;
IgM pozitiv nr.3, 4, 7
Teste western blot IgM si IgG
1-3 seruri pacienti;
IgG pozitiv nr.1si 2
Concluzii
Implementarea supravegherii pentru boala Lyme a determinat:
– o crestere de 3 x in anul 2010 fata de 2009 a numarului de probe
clinice (ser si lcr) trimise de catre DSPJ pentru testare/confirmare la
Institutul Cantacuzinocresterea sanselor de diagnosticare a acestei
boli cu potential ridicat de cronicizare in absenta unui tratament corect.
- orientarea diagnosticului unor pacienti spre alte entitati clinice cu
evolutie potential grava, care constituie diagnosticul diferential al bolii
Lyme (boli autoimune, sifilis, infectii cu EBV).
Se impune ca o necesitate cunoasterea definitiei de caz si a algoritmului
de diagnostic pentru boala Lyme de catre toti cei implicati in activitatea de
sanatate, atat in sistemul public cat si in cel privat (medici de familie,
medici de diferite specialitati-infectionisti, dermatologi, neurologi,etc)
Concluzii
Dificultatile legate de testarea serologica in doua etape a probelor
clinice trebuie sa constituie un stimul pentru gasirea si
implementarea de modalitati noi de testare/confirmare, intr-o
singura etapa, a cazurilor de suspiciune de boala Lyme (vezi testul
LIPS).
Extinderea testarii cazurilor pentru care se infirma diagnosticul de
boala Lyme si pentru alte infectii transmise prin vectori.
Initierea unui program la scara nationla cae sa studieze circulatia
spirochetei Borrelia burgdorferi la nivelul vectorului Ixodes.
Cea mai importanta concluzie:
SUPRAVEGHEREA BOLII LYME IN ROMANIA TREBUIE
CONTINUATA!