DIAGNOSTICUL CITOGENETICDIAGNOSTICUL CITOGENETICDIAGNOSTICUL CITOGENETICDIAGNOSTICUL CITOGENETIC

PRIN CARIOTIPAREPRIN CARIOTIPAREPRIN CARIOTIPAREPRIN CARIOTIPARE

Surse de celule pentru cariotip

TEORETIC: Orice celulă cu nucleu

(PRACTIC: cele rezistente la culturi in vitro)

pentru adulţi: celulele albe din sânge,

celule canceroase (din măduva osoasă / leucemii – cromozomul Philadephia / LMC )

celule fetale

Solicitarea cariotipului

Anomalii cromozomiale în istoricul familiei În caz de infertilitate La vârste înaintate ale părinţilor Pentru nou-născuţi cu dismorfisme Pentru membrii unei populaţii expuse la factori

de mediu cu potenţial mutagen (radiaţii, factori chimici)

Informaţii oferite de cariotip

Aberaţii numerice

- care afectează întregul set haploid

POLIPLOIDII ( exemplu: 3n = triploidie)

- care afectează perechea de cromozomi omologi

ANEUPLOIDII trisomii (cromozom în plus)

monosomii (cromozom în minus) Aberaţii de structură care implică secvenţe mari de

nucleotide(deleţii, duplicaţii, inversii, translocaţii, circularizări, situsuri fragile)

Cariotipul fetal

METODE INVAZIVE 1. Amniocenteză 2. Biopsie de vilozităţi coriale 3. Sânge fetal

MET. NEINVAZIVĂ Sortarea celulor fetale din sângele matern

PRINCIPIUL DIAGNOSTICULUI PRENATAL

CARIOTIPUL ESTE DETERMINAT ÎN MOMENTUL CONCEPŢIEI,

MITOZA COPIAZĂ FIDEL ACEST GENOM ÎN TOATE ŢESUTURILE,

ATÂT ÎN ŢESUTUL FETAL

CÂT ŞI ÎN ŢESUTURILE EXTRAEMBRIONARE (CORION, AMNION,ETC)

AMNIOCENTEZA1956 – identificarea sexului fetal1967 – diagnosticul bolilor genetice în trimestrul al II-lea de sarcină (hemoglobinopatii: anemia falciformă şi thalasemia)Perfecţionarea ulterioară a tehnicilor a permis diagnosticul prenatal al cromozomopatiilor, prin stabilirea cariotipului fetal.

Constă în puncţionarea cavităţii amniotice pe cale abdominală,sub ghidaj ecografic,cu prelevarea lichidului amniotic de analizat

AMNIOCENTEZA- INDICAŢII

Vârsta mamei peste 35 de ani Antecedent personal de naştere a unui copil cu aneuploidie Anomalie genetică în antecedentele familiale Anomalie cromozomială la unul din părinţi Semne de apel ecografic Screening seric în zona de risc crescut La dorinţa progenitorilor La sarcini obţinute după tehnici de procreere asistată

medical: fecundaţie in vitro (FIV), injecţie intracitoplasmatică cu sperma partenerului (ICSI)

Vizualizarea, pe traiectul acului de puncţie, a unei mase digestive, a vezicii urinare sau a unui fibrom

Vizualizarea dificilă a cavităţii amniotice (exemplu: obezitate)

Paciente infectate cu virusul HIV, hepatită B sau C (risc de contaminare fetală)

Infecţii de diferite etiologii (dificultăţi în efectuarea culturilor, creşterea riscului de avort spontan)

AMNIOCENTEZA- CONTRAINDICAŢII

Între 15 – 18 săptămâni de amenoree Înainte de 13 săptămâni (amniocenteza precoce)

EXPUNERE LA AVORTURI

ŞI DEFORMĂRI ALE MEMBRELOR INFERIOARE În orice moment al sarcinii, cu riscul de a nu

obţine celule în diviziune (după 26 de săptămâni celulele fetale cresc foarte greu în culturi)

AMNIOCENTEZA- MOMENT OPTIM DE PRELEVARE A LICHIDULUI AMNIOTIC

DIMENSIUNEA PROBEI

- la 15 săptămâni: 20 ml de lichid,

în 2 probe egale

- la 12 – 14 săptămâni: până în 10 ml,

în 2 probe egale TRANSPORT

- în tuburi de centrifugă sterile, conice

- la distanţă: NU SE AMBALEAZĂ ÎN GHEAŢĂ!

AMNIOCENTEZA

Eşecul puncţiei – rar uter fibromatos, paciente obeze, operator neexperimentat (20 % din cazuri, anii ’80) Risc de avort spontan şi pierdere fetală, consecutive manevrei moarte fetală in utero sau avort spontan în primele 2 săptămâni postpuncţie (până în 1.7 %); riscul creşte la gravidele peste 35 de ani, în cazul puncţiei transplacentare, al sângerărilor din primul trimestru de sarcină şi al sarcinilor gemelare) Risc de metroragii post-puncţie, cu continuarea sarcinii Rănirea fătului Zgărieturi, hematoame, leziuni oculare sau cerebrale Pierdere de lichid amniotic – risc de pierdere fetală 40%! Infecţii materno-fetale Traume materne lezarea arterei epigastrice, hematom de perete, plagă de vezică urinară sau

digestivă

AMNIOCENTEZA- RISCURI ŞI COMPLICAŢII

Constă în prelevarea,

pe cale transabdominală

sau transcervicală,

a vilozităţilor coriale

cu aspect caracteristic

de anemone de mare

la examenul cu lupa binoculară

Alegerea căii de abord este

funcţie de poziţia placentei

(transcervical pt. placentă jos

inserată sau uter retrovers)

BIOPSIA DE VILOZITĂŢI CORIALE (VILI CORIONICI, TROFOBLAŞTI) CVS (Chorionic Villus Sampling)

Implantarea

Vilii corionici(funcţie de formare a placentei)

BIOPSIA DE VILOZITĂŢI CORIALE- CONTRAINDICAŢII

o Pentru calea abdominală, contraindicaţiile amniocentezei (obezitate, infecţii virale sau bacteriene, cu efect asupra embrionului sau asupra dezvoltării celulare în cultură)o Pentru calea transcervicală: - infecţii cervico-vaginale - sarcina la o pacientă purtătoare de sterilet - malformaţii uterine - fibrom uterin - canal cervical inaccesibil

MOMENT OPTIM DE PRELEVARE

- între săptămânile 10 – 12 DIMENSIUNEA PROBEI

- cel puţin 10 g vili (5 – 30 mg trofoblast) TRANSPORT

- în mediu heparinat (contaminare cu sânge matern), cu antibiotice (prevenirea infecţiei cu flora vaginală)

CARIOTIPUL SE EXECUTĂ DIRECT DIN CELULE (rezultatul în 2-3 zile)

BIOPSIA DE VILOZITĂŢI CORIALE

Metroragii 30 % pentru calea transvaginală

Corioamniotita profilaxie cu antibiotice, preoperator

Ruptura precoce a membranelor (consecinţa traumatismului mecanic al corionului)

Avort spontan postmanevră 1 – 2 % din cazuri, 6% pentru operator debutant; riscul creşte cu vârsta

mamei (peste 37 ani) şi în sarcinile multiple

Rănirea fătului Infecţii materno-fetale Traume materne MOZAICISMUL CROMOZOMIAL ( diferenţe între

cariotipul vilar şi cel embrionic)

BIOPSIA DE VILOZITĂŢI CORIALE- RISCURI ŞI LIMITĂRI

Se obţine prin: - puncţionarea venei ombilicale la nivelul cordonului ombilical (cordocenteza) - puncţionarea venei intrahepatice

- puncţie intracardiacă sub ghidaj ecografic. DIMENSIUNEA PROBEI: 1 – 3 ml MOMENT OPTIM DE PRELEVARE - după săptămâna a 18 - a

SÂNGE FETAL

SÂNGE FETAL

o CONTRAINDICAŢII - obezitate maternă - vizualizare dificilă a cordonului ombilical - uter polifibromatos

o RISCURI - moarte fetală in utero, avort sau naştere prematură (1 – 5 %) - eşecul manevrei - bradicardie fetală cu retracţia cordonului ( 9 % din cazuri, se injectează atropină) - complicaţii la locul puncţiei (hemoragie, tromboză) - corioamniotită

SORTAREA CELULELOR FETALE DIN SÂNGELE MATERN

1957: o femeie insărcinată moare ca urmare a obstrucţiei unui vas pulmonar cu celule aparţinând fătuluiLa 70% din femeile insărcinate, celulele fetale trec de bariera materno-fetală şi intră în circulaţia maternă. Prin tehnici citogenetice (cariotip, colorare cu quinacrină) a fost evidenţiat cromozomul Y în celulele din sângele matern.

METODĂ NEINVAZIVĂ

- anularea riscului de pierdere a sarcinii

SORTAREA CELULELOR FETALE DIN SÂNGELE MATERN

PRINCIPIUL METODEI : separarea celulelor în funcţie de antigenii de suprafaţă

FACS = Fluorescence-activated cell sortingCelulele sunt marcate cu anticorpi de suprafaţă fluorescenţi şi apoi separate în baza diferenţelor date de - intensitatea semnalului fluorescent - dimensiunea celulelor - viabilitatea celulară

FACS

SORTAREA CELULELOR FETALE DIN SÂNGELE MATERN

MACS = Magnetic-activated cell sorting Amestecul de celule se pune în contact cu sfere magnetice cu anticorpi ataşaţi pe suprafaţă. În baza reacţiei antigen-anticorp, celulele care au antigenii specifici sunt reţinute pe o coloană magnetică, celelalte trecând liber prin coloană.

PRINCIPIUL METODEI : separarea celulelor în funcţie de antigenii de suprafaţă